CN106706747A - 一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法 - Google Patents

一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及循环伏安分析与化学修饰电极领域，具体涉及一种测定玛卡中腺嘌呤含量的电极制作和电化学分析方法。该方法依次用邻苯二胺、β‑环糊精、银‑碳纳米管修饰玻碳电极、制备出了可用于测定玛卡中腺嘌呤含量的电化学传感器。该发明的关键特征是将碳纳米管加入到AgNO3溶液中，然后将修饰过的玻碳电极放入其中并在电化学条件下扫描。结果表明，该修饰电极对腺嘌呤的电催化效果明显。该方法灵敏、简便、重现性好，应用此方法能够准确的测定玛卡中腺嘌呤的含量。与测定腺嘌呤的传统方法相比较，本发明操作简单，测试成本低并且易于操作。该方法也可应用于其他腺嘌呤药物有效成分含量的测定。

Description

一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法
技术领域
本发明涉及循环伏安分析与化学修饰电极领域，具体涉及一种测定玛卡中腺嘌呤含量的电极制作和电化学分析方法。
背景技术
玛卡(学名：Lepidium meyenii Walp)，原产于南美洲秘鲁安第斯山脉4000米左右的一种十字花科植物，数千年来一直是当地印加人的主要食物来源，有着抗疲劳和提高生育力的神奇功效，被土著居民称之为“安第斯山神赐予人类的礼物”，也有着“南美人参”的美誉。
玛卡富含55种活力营养素，独有的玛卡烯、玛卡酰胺是玛卡提取物中具有促进性功能勃起，提高精子数量，并促进其活力的有效物质之一，它可以刺激人体内荷尔蒙分泌平衡，达到修复生理机能的效果，这个功能让玛卡成为全球十大保健品之一，享誉世界。此外玛卡还富含碱基(如腺嘌呤、鸟嘌呤等)、蛋白质、糖类、脂肪酸(含较多α-亚麻酸、亚油酸)、膳食纤维，20种氨基酸(天冬氨酸、精氨酸等)、多种矿物质(铁、锰、铜、锌、钠、钾、钙、磷、硫、镁等)、8种维生素(VB1、VB2、VB5、VB6、VB12、VC、VA、VE)，多种生物碱以及芥子油苷、牛磺酸、植物多酚、皂角苷等生物活性成分。玛卡的生理活性与其化学组成有着密切的关系，其中腺嘌呤等生物碱基是其抗疲劳、抗衰老的主要成分之一，同时，腺嘌呤也是脱氧核糖核酸的重要组成部分，在包括细胞能量转移和酶催化的信号传递等许多生物过程中都有重要的作用。2005年《中国药典》中已经把腺嘌呤核苷的含量作为评价冬虫夏草的质量指标。
目前，常用于中药有效成分含量的测定方法主要有核磁共振波谱法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用法、薄层色谱扫描法等，但上述检测方法往往仪器昂贵、过程复杂、灵敏度差。
发明内容
本发明提供了一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法，该方法与传统方法相比较，具有操作简单、测试成本低、重现性好和灵敏度高等特点。
本发明提供的技术方案为：
一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法，该方法采用邻苯二胺/β-环糊精/银-碳纳米管修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，应用循环伏安法选择性测定玛卡中腺嘌呤的含量。具体包括以下步骤：
一、复杂样品环境下腺嘌呤选择性测定电极的制作
(1)修饰电极预处理
①用砂纸将新玻碳电极(GCE)表面磨平，然后用Al2O3抛光粉抛光电极表面，直至电极表面显像出镜面；
②在蒸馏水中超声清洗GCE后，取出用水洗净，在电解池中加入0.5mol/LH2SO4溶液，连接三电极系统，接通电极连线，设置扫描参数：起始电位-0.2mV，终止电位0.6V，扫描速度为100mV/s，取样间隔2mV，量程100mA，进行循环扫描极化处理，电脑同时记录I-E曲线，至循环伏安(CV)曲线稳定为止；
(2)修饰电极准备
①将电解池中溶液更换为5mmol/L铁氰化钾溶液，将步骤(1)②处理后的GCE置于5mmol/L铁氰化钾溶液中，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，将该电极取出用水冲洗干净后，在红外灯下干燥；
②以步骤(2)①处理过的电极为基本电极，依次在1.00mol/L邻苯二胺溶液、5mmol/Lβ-环糊精溶液中静置，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，将该电极取出用水冲洗干净后，在红外灯下干燥；
③采用HNO3与HCl体积比3:1、回流10～12h的方法将银离子碳纳米管(MWNTs)羧基化，用0.01mol/LNaOH溶液将溶液pH调整至中性，离心干燥；
④取步骤(2)③中处理好的的MWNTs于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中超声分散20～40min，MWNTs与DMF的添加比例为1mg MWNTs加入1～2mL DMF，然后加入0.1～0.5mg/mLAgNO3溶液中混合，得到稳定的黑色分散液；
⑤将电解池中溶液更换为步骤(2)④获得的黑色分散液，将步骤(2)②修饰后的GCE放入上述黑色分散液中，超声5-10min，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，取出电极，红外灯下烘干即得o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，放在PBS缓冲溶液中保存，备用；
二、标准曲线的建立-总碱基标准品的测定
分别配制0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml和1mg/ml的腺嘌呤标准溶液，依次加入电解池中，使用步骤一中修饰好的电极o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，按照步骤(1)②设置的扫描参数分别对腺嘌呤标准溶液进行循环伏安法(CV)扫描至稳定，记录峰高，绘制腺嘌呤标准曲线并得到线性方程；
三、玛卡中腺嘌呤含量测定
①取玛卡样品，粉碎后过筛，得到玛卡粉末；
②取玛卡粉末，用丙酮在90℃条件下索氏提取，玛卡粉末与丙酮的质量比为1:25～35，得到提取液后，经旋转蒸发仪浓缩，过0.45um微孔滤膜，用PBS缓冲溶液将浓缩液稀释5倍，冷藏备用；
③取步骤三②配置好的玛卡样品溶液于电解池中，使用步骤一得到的修饰电极o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描，得到峰电位数值，然后根据标准曲线获取玛卡中腺嘌呤的浓度指数，通过线性方程得到玛卡中腺嘌呤含量的测定结果。
本发明中的溶液配制方法：
(1)邻苯二胺溶液：称取0.06g邻苯二胺于温水中溶解，待全部溶解后，转移到50ml容量瓶中定容，贴上标签备用。
(2)β-环糊精溶液：称取一定量的β-环糊精固体，于室温下达到饱和状态，贴上标签备用。
(3)对照品标准溶液(腺嘌呤标准溶液)：称取0.014g腺嘌呤标准品于烧杯中，用pH＝7.0PBS缓冲溶液溶解，转移到容量瓶中定容至50ml，贴上标签备用。
(4)银离子碳纳米管(MWNTs)分散溶液：首先对MWNTs用量和银离子溶度进行了优化，实验步骤如下：分别称取0g、0.007g、0.013g、0.025g，0.075g MWNTs溶解于0.1mg/ml的AgNO3溶液中，依次修饰电极，然后扫描腺嘌呤标准溶液，实验结果为碳纳米管在0.007g时实验结果最好；分别配制0.001mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml的AgNO3溶液，然后分别加入0.007g的MWNTs，扫描腺嘌呤标准溶液，实验结果为腺嘌呤标准溶液在0.1mg/mlAgNO3溶液的条件下结果最好，因此，实验中称取7.0mg预处理过的MWNTs于7.0mLDMF(N，N-二甲基甲酰胺)中超声分散30min，然后加入10mLAgNO3(0.1mg/mL)溶液，最后得到稳定的黑色分散液。
(5)磷酸盐(PBS)缓冲溶液：取35.8g Na2HPO4，15.6g NaH2PO4分别溶于1L水中，取Na2HPO4 620mL，NaH2PO4 380mL混合，用NaOH调节混合溶液pH至7.0，即得0.1mol/L，pH＝7.0的PBS缓冲溶液，转移到容量瓶中，冷藏备用。
与传统方法相比本发明的有益效果为：
(1)检测方法简单易行，对仪器要求低，检测成本低；
(2)本发明选择性好、检测范围宽，最低检出限低，回收率高。
附图说明
图1为腺嘌呤标准品浓度的标准曲线。
具体实施方式
结合具体实施方式和说明书附图对本发明做进一步说明。
一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法，该方法采用邻苯二胺/β-环糊精/银-碳纳米管修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，应用循环伏安法选择性测定玛卡中腺嘌呤的含量。包括以下步骤：
一、复杂样品环境下腺嘌呤选择性测定电极的制作
(1)修饰电极预处理
①用金相砂纸将新玻碳电极(GCE)表面磨平，然后用Al2O3抛光粉抛光电极表面，直至电极表面显像出镜面；
②在蒸馏水中超声清洗GCE后，取出用水洗净，在电解池中加入0.5mol/LH2SO4溶液，连接三电极系统，接通电极连线，设置扫描参数：起始电位-0.2mV，终止电位0.6V，扫描速度为100mV/s，取样间隔2mV，量程100mA，进行循环扫描极化处理，电脑同时记录I-E曲线，至循环伏安(CV)曲线稳定为止；
(2)修饰电极准备
①将电解池中溶液更换为10mL 5mmol/L铁氰化钾溶液，将步骤(1)②处理后的GCE置于10mL 5mmol/L铁氰化钾溶液中，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，将该电极取出用水冲洗干净后，在红外灯下干燥；
②以步骤(2)①处理过的电极为基本电极，依次在10mL 1.00mol/L邻苯二胺溶液、10mL5mmol/Lβ-环糊精溶液中静置，分别按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描20圈至稳定，将该电极取出用水冲洗干净后，在红外灯下干燥；
③采用HNO3与HCl体积比3:1、回流10-12h的方法将MWNTs羧基化，用0.01mol/LNaOH溶液将溶液pH调整至中性，离心干燥；
④取7mg步骤(2)③中处理好的的MWNTs于7ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中超声分散30min，然后加入10mL 0.1mg/mL AgNO3溶液中混合，得到稳定的黑色分散液；
⑤将电解池中溶液更换为步骤(2)④获得的黑色分散液，将步骤(2)②修饰后的GCE放入上述黑色分散液中，超声5-10min，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，取出电极，红外灯下烘干即得o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，放在PBS缓冲溶液中保存，备用。
二、标准曲线的建立-总碱基标准品的测定
分别配制0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml和1mg/ml的腺嘌呤标准溶液，依次加入电解池中，使用步骤一中修饰好的电极o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，按照步骤(1)②设置的扫描参数分别对腺嘌呤标准溶液进行循环伏安法(CV)扫描至稳定，记录峰高，绘制腺嘌呤标准曲线(见图1)并得到线性方程；
三、玛卡中腺嘌呤含量测定
①取玛卡样品，粉碎后过筛(40目)，得到玛卡粉末。
②取5g玛卡粉末，用150ml丙酮在90℃条件下索氏提取，得到30ml提取液后，经旋转蒸发仪浓缩到10ml，过0.45um微孔滤膜，用PBS缓冲溶液将其配置成50ml溶液，冷藏备用。
③使用步骤一修饰好的电极，分别对标号为1、2、3的三个玛卡平行样品以100mV/s扫描速度，在-0.2～+0.6V电位区间用循环伏安法(CV)对处理好的样品溶液进行扫描，得到峰电位数值，然后根据标准曲线获取玛卡中腺嘌呤的浓度指数，通过线性方程得到玛卡中腺嘌呤含量的测定结果，通过图1中的标准曲线方程，经计算得到三个样品溶液中腺嘌呤含量分别为0.35017、0.35298和0.34979mg/L，所测黄玛卡中腺嘌呤含量分别为3.502、3.530和3.498μg/kg。
④回收率试验：向标号为1、2、3的三个样品溶液中分别加入0.50200mg/L的腺嘌呤标准品，定容至10ml，然后依次测定腺嘌呤含量并计算其回收率。实验结果表明该测定方法的准确度较高，结果见表1。该结果表明了玻碳电极修饰之后适用于本实验的测定，在试验中本方法不但简便快捷而且数据可靠。
表1.玛卡中腺嘌呤含量回收率测定结果
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，按照本领域的普通技术知识和通用方法，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、复杂样品环境下腺嘌呤选择性测定电极的制作
(1)修饰电极预处理
①用砂纸将新玻碳电极(GCE)表面磨平，然后用Al2O3抛光粉抛光电极表面，直至电极表面显像出镜面；
②在蒸馏水中超声清洗GCE后，取出用水洗净，在电解池中加入0.5mol/L H2SO4溶液，连接三电极系统，接通电极连线，设置扫描参数：起始电位-0.2mV，终止电位0.6V，扫描速度为100mV/s，取样间隔2mV，量程100mA，进行循环扫描极化处理，电脑同时记录I-E曲线，至循环伏安(CV)曲线稳定为止；
(2)修饰电极准备
①将电解池中溶液更换为5mmol/L铁氰化钾溶液，将步骤(1)②处理后的GCE置于5mmol/L铁氰化钾溶液中，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，将该电极取出用水冲洗干净后，在红外灯下干燥；
②以步骤(2)①处理过的电极为基本电极，依次在1.00mol/L邻苯二胺溶液、5mmol/Lβ-环糊精溶液中静置，分别按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，将该电极取出用水冲洗干净后，在红外灯下干燥；
③采用HNO3与HCl体积比3:1、回流10～12h的方法将银离子碳纳米管(MWNTs)羧基化，用0.01mol/L NaOH溶液将溶液pH调整至中性，离心干燥；
④取步骤(2)③中处理好的的MWNTs于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中超声分散20～40min，MWNTs与DMF的添加比例为1mg MWNTs加入1～2mL DMF，然后加入0.1～0.5mg/mL AgNO3溶液中混合，得到稳定的黑色分散液；
⑤将电解池中溶液更换为步骤(2)④获得的黑色分散液，将步骤(2)②修饰后的GCE放入上述黑色分散液中，超声5～10min，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描至稳定，取出电极，红外灯下烘干即得o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，放在PBS缓冲溶液中保存，备用；
二、标准曲线的建立-总碱基标准品的测定
分别配制0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml和1mg/ml的腺嘌呤标准溶液，依次加入电解池中，使用步骤一中修饰好的电极o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，按照步骤(1)②设置的扫描参数分别对腺嘌呤标准溶液进行循环伏安法(CV)扫描至稳定，记录峰高，绘制腺嘌呤标准曲线并得到线性方程；
三、玛卡中腺嘌呤含量测定
①取玛卡样品，粉碎后过筛，得到玛卡粉末；
②取玛卡粉末，用丙酮在90℃条件下索氏提取，玛卡粉末与丙酮的质量比为1:25～35，得到提取液后，经旋转蒸发仪浓缩，过0.45um微孔滤膜，用PBS缓冲溶液将浓缩液稀释5倍，冷藏备用；
③取步骤三②配置好的玛卡样品溶液于电解池中，使用步骤一得到的修饰电极o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，按照步骤(1)②设置的扫描参数用循环伏安法(CV)扫描，得到峰电位数值，然后根据标准曲线获取玛卡中腺嘌呤的浓度指数，通过线性方程得到玛卡中腺嘌呤含量的测定结果。
2.根据权利要求1所述的一种测定玛卡中腺嘌呤含量的新方法，其特征在于，所述步骤(2)④中AgNO3溶液浓度为0.1mg/mL，MWNTs与DMF的添加比例为1mg MWNTs加入1mL DMF，超声时间30min。
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