CN105628753A - 一种维生素b2的生物电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种维生素VB2的生物电化学检测方法；该检测方法在于使用希瓦氏菌的电子受体、希瓦氏菌菌液和pH缓冲溶液共同组成反应液体系，采用三电极系统，控制一定的电位，将含有VB2的样品加入到生物电化学传感器的反应液中，检测电流值的变化；根据VB2的浓度变化和电流响应值变化之间的线性关系来计算测定样品中VB2的浓度；该检测方法不依赖大型仪器设备，检测成本低、操作简单、准确性高、专一性强，可应用于生化样品、食品、药品中VB2的检测。

Description

一种维生素B2的生物电化学检测方法
技术领域
本发明涉及一种维生素B2的生物电化学检测方法，属于生化检测技术领域。
背景技术
维生素B2，VB2，即核黄素，化学式为C17H20N4O6。它是一种水溶性B族维生素，在机体的碳水化合物、蛋白质及脂肪的能量转化过程中起着重要作用，对人类健康有着重要意义。
VB2缺乏会引起人体代谢障碍，从而引发多种病变。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等。值得注意的是，人体自身不能合成VB2，只能通过膳食中获取。因此，VB2含量是评估食品营养及其功能性的重要指标。同时，由于VB2缺乏是一种常见病症，所以VB2成为相关药品及保健品的重要成分，其含量也常被作为这类商品的重要质量指标。综上，VB2含量的快速、准确测定在VB2的合成及其相关的食品、药品及保健品行业生产中有重要意义。
现有的VB2检测方法包括微生物法、荧光分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、以及质谱法。
微生物法是国标法中常采用的一种检测VB2方法，其原理即某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素，在一定条件下，该细菌的生长情况及代谢产物与该维生素的含量成正比，以此来测定某一维生素的含量。王光亚在《食物中核黄素测定方法的比较》一文中（生理科学，1988,8:419-420）指出微生物法其特异性和灵敏度较高，但是方法费时，周期较长，给实际测定过程带来不便。
荧光分光光度法是目前应用较广泛的一种VB2检测方法。该方法利用VB2在pH4~9、440~500nm激发光照射下产生黄绿色荧光的特性，根据荧光强度与VB2浓度成正比的原理对VB2进行定量测定。宋吉英在《荧光分光光度法测定枸杞中核黄素含量》一文中（化学世界，2012,12:720-722）报道了使用荧光分光光度法测定了枸杞中的VB2的研究方法。该方法简便、快速,但由于食物中的荧光杂质较多，干扰测定，该方法仅适用于含VB2较高干扰较少的乳类，故局限了其应用发展。
HPLC测定方法是根据样品中各种物质在色谱柱中分离系数的不同，将其同样品中干扰物分开，并根据目标检测物的分子特性选择对应的检测器进行定性定量检测。VB2的测定通常采用荧光检测器，C18色谱柱，激发波长440nm，发射波长在525nm左右。邓洁熊等人在《HPLC测定核黄素磷酸钠中核黄素的含量》文章中（广东药学院学报，2006,2（1）：53-54）报道了核黄素磷酸钠中VB2含量的HPLC测定方法。该方法相对简单、快速、重复性好，但是对仪器有较高要求，样品处理较为繁琐。
质谱法是纯物质鉴定的最有力工具之一，利用电场和磁场将运动的离子，按它们的质荷比分离后进行检测的方法。Mandal等人在《RapiddeterminationofvitaminB2andB12inhumanurinebyisocraticliquidchromatography》一文中（AnalyticaChimicaActa,2009,640:110-113）报道了分别利用高效液相色谱法和基质辅助激光解吸电离质谱法测定人类尿液中的VB2含量。然而在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作，十分麻烦，并且质谱仪属于大型昂贵仪器，检测成本高。
生物电化学传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。
在特定电位控制条件下，希瓦氏菌可以在自身的富马酸还原酶(SelenitereductionbyShewanellaoneidensisMR-1ismediatedbyfumaratereductaseinperiplasm，SCIENTIFICREPORTS，2014,4:3725，DOI:10.1038/srep03735）的催化作用下，利用来源于胞外电极的电子还原富马酸，并在外电路形成电流。而VB2是希瓦氏菌实现该细胞内外电子转移过程的电子中介体，其浓度高低与该过程的电子转移效率即外电路电流强度大小直接相关。因此，可以直接通过反应体系的电流变化来高效、快速检测样品中得VB2并测定其浓度，本发明基于此构建了一种新型的VB2生物电化学检测方法，经过对现有技术的检索，并未发现有利用生物电化学方法检测VB2的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的专一性测定VB2的方法，解决现有技术中存在的检测成本高、检测仪器昂贵、数据重复性差、操作过程（包括制备样品及样品预处理等过程）复杂的问题。
本发明的技术方案是：
一种维生素B2的生物电化学检测方法，按以下步骤进行操作：
(1)将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行培养，活化菌体；
(2)将活化的希瓦氏菌菌液离心，按一定比例将离心后的沉淀加入到反应缓冲溶液中；
(3)将参比电极、工作电极、对电极安装在含有步骤（2）得到的溶液的装置中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；
(4)在步骤（3）得到的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，待电流输出稳定后，向系统中加入希瓦氏菌的电子受体；
(5)待电流输出稳定，向三电极系统中加入VB2样品，检测并记录电流变化值。
其中希瓦氏菌（Shewanellaoneidensis），购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；将保存的希瓦氏菌接种至培养基进行培养，获得活化的菌体。
其中反应缓冲液（参考：Awhole-cellelectrochemicalbiosensingsystembasedonbacterialinwardelectronflowforfumaratequantification.Rong-WeiSi,Dan-DanZhai,Zhi-HongLiao,LuGao,Yang-ChunYong.BiosensorsandBioelectronics68(2015)34–40）由以下物质组成，LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/LpH=7；M9培养基：Na2HPO4.12H2O17.8gL-1、KH2PO43gL-1、NaCl0.5gL-1、NH4Cl10.5gL-1、18mM乳酸钠、0.1mM的CaCl2和1mM的MgSO4。
其中，步骤（2）中所述的希瓦氏菌沉淀加入到反应缓冲溶液中，其OD值控制在1.5-2之间；
步骤（3）中参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；工作电极为碳毡或
碳布；对电极为铂丝电极；
步骤（3）中所述的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成，如电化学工作站CHI660E（上海辰华仪器有限公司）；
步骤（4）中所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液、亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶液、二甲基亚砜、硫代硫酸盐溶液或氧化三甲胺溶液；进一步优选为富马酸溶液，加入富马酸溶液浓度为5mM~饱和浓度。
步骤（4）中所述的生物电化学传感器所加载的外电压为-1.5~0伏特。
本发明还提供一种检测VB2的生物电化学传感器，所述的传感器包括信号检测系统，电极系统和信号发生系统，其中所述的VB2信号发生系统包括希瓦氏菌的电子受体、希瓦氏菌菌液和反应缓冲溶液；
其中所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液、亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶液、二甲基亚砜、硫代硫酸盐溶液或氧化三甲胺溶液，优选为富马酸溶液。
本发明的有益效果：
本发明使用了简单的电化学仪器来实现电压控制和电流信号记录，所以检测的成本低廉；由于VB2形成的电流响应是和电化学反应转移的电子数直接相关的，因此根据电流响应设备的精确度能够达到高的灵敏度、稳定性和重复性（当同时制备三个及以上的生物电化学传感器时，加入同样浓度的VB2样品，并使用同样的电流信号记录仪记录电流响应时，检测结果高度一致，变异系数小于9%）；且该发明对于核黄素检测具有很强的专一性，当向反应体系添加多种维生素及常见阳离子干扰物时，无明显电流变化。
按照上述实验所使用的装置，测得VB2检测的浓度线性范围为5nM到10μM，定性检测下限为1nM。相比HPLC检测法和荧光分光光度计法等具有更宽的测量范围，可用于生化检测、食品检测中VB2的测定。
附图说明
图1为本发明的生物电化学传感器示意图；
图2添加不同浓度VB2标准溶液后的电流输出信号结果；
图3为本发明所提供的VB2检测方法测得的标准曲线；
图4当VB2浓度为5nM和10μM时的电流输出信号结果；
图5以碳毡为阳极材料时的电流输出信号结果；
图6当外加电压为0伏特、-0.2伏特、-0.4伏特和-1.5伏特时的电流输出信号结果；
图7当添加富马酸浓度为5mM、40mM、100mM、饱和浓度时的电流输出信号结果；
图8连续添加多种维生素及常见阳离子干扰物时的电流输出信号结果；
图9希瓦氏菌其余电子受体的电流输出信号结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体描述，其目的在于更好的理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。
实施例1：
（1）使用菌种：希瓦氏菌（Shewanellaoneidensis），购自ATCC美国模式菌种保藏中心，菌种编号ATCC700550。
（2）希瓦氏菌菌液获得：向20mL的LB培养基（含酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L，pH=7.0）中接入希瓦氏菌菌种，于温度30℃、震荡转数200rpm培养16h,获得菌液。
（3）配制生物电化学传感器的反应缓冲液：将0.6mLLB液体培养基（含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠5g/L，pH=7.0）和11.4mLM9培养基（含Na2HPO4.12H2O17.8g/L、KH2PO4g/L、NaCl0.5g/L、NH4Cl1g/L）和充分混合，另外添加乳酸钠、氯化钙、硫酸镁使其终浓度分别达到18mM、0.1mM和1mM。
（4）生物电化学传感器的组装：采用三电极工作方式，以饱和甘汞电极作为参比电极，以钛丝连接的1×2cm碳布作为工作电极，以铂丝电极作为对电极，并使用电化学工作站CHI660E（上海辰华仪器有限公司）控制，在工作电极施加-0.6伏特的外电压。
（5）富马酸溶液的加入：待生物电化学传感器的输出电流达到稳定后（约30min），加入终浓度为5mM-饱和浓度的富马酸溶液，富马酸溶液的加入是能够检测VB2的前提，希瓦氏菌自身的富马酸还原酶在外电压作用下能够对反应体系中的富马酸进行专一性还原，而VB2（电子中介体）的加入，加速富马酸的还原，从而引起电流值的变化。
（6）标准曲线绘制：用超纯水配制VB2（Sigma-Aldrich）的终浓度为5nM，10nM，50nM，100nM，200nM，500nM，800nM，1μM，2μM，6μM，10μM的标准溶液。待生物电化学传感器的输出电流达到稳定后（约5min），将不同浓度的VB2标准溶液依次加入到同一生物电化学传感器体系中，记录电流的变化曲线（图2）。从图2中即可以看出，随着加入VB2浓度的提高，电流响应值相应地也越来越大，即二者之间存在一定的线性关系；VB2的浓度与检测所得的电流响应的峰高成正比(R2为0.9969)（见图3）。由图3可知，利用该线性关系式即可以计算VB2含量。
（7）检测含VB2的样品：按照上述（2）-（5）的步骤，制备6个相同的生物电化学传感器用于VB2检测，向这6个传感器中分别加入一种浓度的VB2样品，记录电流响应图的峰高结果，并根据标准曲线计算VB2含量，如表1所示。由表1可知，该检测方法可以准确完成对VB2样品浓度的检测。
表1.在不同的传感器中分别测试不同VB2样品的结果
变异系数（n=3）
（8）检测限测试：
使用上述（2）-（5）的步骤，制备生物电化学传感器，分别向两个相同的传感器中加入不同浓度的VB2，一个加入VB2浓度为5nM，一个加入VB2浓度为10μM；仪器中的电流信号表明：电流响应为噪声10倍的VB2浓度5nM为最小定量限，VB2浓度为10μM为最大定量限，更高的VB2浓度，电流信号输出不再稳定（见图4）。
由实例可见，仅利用一台电化学工作站以及常见的参比电极、工作电极和对电极即可以完成对VB2的检测，整个操作过程简单，无样品预处理等繁杂的预处理过程，并且可在相差4个数量级的浓度之间进行定量分析。此外，VB2样品加入后，即可出现电流响应，可以实现同一个系统的连续进样，检测效率高效，方便快捷。
实施例2：
与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极为碳毡。得到的检测图如附图5所示。工作电极采用碳毡也可以完成对VB2的检测，工作电极不仅仅局限于碳布。
实施例3：
与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极的外加电压为-0.2伏特。电流信号如图6所示。工作电极的外加电压采用-0.2伏特，亦可检测VB2。
实施例4：
与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极的外加电压为0伏特。电流信号如图6所示。工作电极的外加电压采用0伏特，亦可检测VB2。
实施例5：
与实施例1基本相同，但有以下改变：富马酸溶液分别加入5mM，40mM，100mM，饱和浓度电流信号如图7所示。加入富马酸溶液浓度在5mM-饱和浓度之间均可。
实施例6：
与实施例1的步骤（1）-（4），不同的是第（6）步骤中，将相比于VB2浓度100倍的维生素B1，维生素B3，维生素B6，维生素B9，维生素B12，维生素C，以及相比于VB2浓度1000倍的钙离子，镁离子，铁离子添加到生物电化学传感器体系中，检测记录电流输出信号，结果仅VB2产生明显的电流输出信号，如图8所示。说明该检测系统能够对VB2进行专一性检测。
实施例7：
与实施例1的步骤（1）-（4），不同的是第（5）步骤中，将富马酸溶液换成希瓦氏菌的其它电子受体，将亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶液、二甲基亚砜、硫代硫酸盐溶液和氧化三甲胺溶液（各添加物质浓度均为10mM）分别添加到不同的生物电化学传感器体系中，然后分别加入1μM核黄素，检测记录输出电流信号，如图9所示，由图9可知，除富马酸溶液外，亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶液、二甲基亚砜、硫代硫酸盐溶液和氧化三甲胺溶液这些希瓦氏菌的电子受体都可以代替富马酸溶液参与完成对VB2的检测。

Claims (10)

1.一种维生素B2的生物电化学检测方法，其特征在于，按以下步骤进行操作：
（1）将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行培养，活化菌体；
（2）将活化的希瓦氏菌菌液离心，按一定比例将离心后的沉淀加入到反应缓冲溶液中；
（3）将参比电极、工作电极、对电极安装在含有步骤（2）得到的溶液的装置中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；
（4）在步骤（3）得到的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，待电流输出稳定后，向系统中加入希瓦氏菌的电子受体；
（5）待电流输出稳定，向三电极系统中加入VB2样品，检测并记录电流变化值。
2.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的希瓦氏菌沉淀加入到反应缓冲溶液中，其OD值控制在1.5-2之间。
3.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（3）中参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；工作电极为碳毡或碳布；对电极为铂丝电极。
4.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成。
5.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液、亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶液、二甲基亚砜、硫代硫酸盐溶液或氧化三甲胺溶液。
6.根据权利要求5所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液，加入富马酸溶液浓度为5mM~饱和浓度。
7.根据权利要求1所述的一种VB2的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤（4）中
所述的生物电化学传感器所加载的外电压为-1.5~0伏特。
8.一种检测VB2的生物电化学传感器，其特征在于，所述的传感器包括信号检测系统，电极系统和信号发生系统，其中所述的VB2信号发生系统包括希瓦氏菌的电子受体、希瓦氏菌菌液和反应缓冲溶液。
9.根据权利要求8所述的一种检测VB2的生物电化学传感器，其特征在于，所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液、亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶液、二甲基亚砜、硫代硫酸盐溶液或氧化三甲胺溶液。
10.根据权利要求9所述的一种检测VB2的生物电化学传感器，其特征在于，所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液。
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