CN106442664B - 一种绿脓菌素的生物电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，包括如下步骤：步骤1、将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行菌种活化，离心分离，将得到的活化的希瓦氏菌种沉淀加入到反应缓冲液中，得到溶液A；步骤2、将三电极置于在盛有步骤1得到的溶液A的容器中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；步骤3、在步骤2得到的生物电化学传感器用循环伏安法扫描，待电流输出稳定，向生物电化学传感器体系中加入绿脓菌素样品，检测并记录电流变化值。本发明使用了电活性微生物作为识别元件来进行信号检测，灵敏度高。

Description

一种绿脓菌素的生物电化学检测方法
技术领域
本发明涉及一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，属于生化检测技术领域。
背景技术
绿脓菌素，化学式为C13H10N2O，是耐药性极强的致病微生物--铜绿假单胞菌的标志性产物，已作为铜绿假单胞菌感染的重要临床标志物。同时，绿脓菌素也具有较强的生物毒性，它能够干扰正常离子转运、细胞呼吸链、过量产生氧自由基，从而导致细胞损伤，促进炎症并发。因此，对绿脓菌素的快速痕量检测对临床早期诊断具有重要的应用价值。
现有的绿脓菌素检测方法主要有高效液相色谱法和循环伏安法。
HPLC测定方法是根据物质在色谱柱中分离系数的不同，将其同样品中干扰物分开，并根据检测物不同的分子特性选择对应的检测器进行定性定量分析。绿脓菌素测定通常采用紫外检测器，C18色谱柱，检测波长280nm。Lars E.P.Dietrich等人在《Thephenazine pyocyanin is a terminal signaling factor in the quorum sensingnetwork of Pseudomonas aeruginosa.》一文章中(Molecular Microbiology,61,1308-1321)提及了绿脓菌素含量的HPLC的检测。该方法相对简单、快速、重复性好，但是对仪器有较高要求，样品处理较为繁琐。
循环伏安法是一种常用的电化学研究方法，通过测定电解过程中电压—电流参量的变化来进行定量、定性的电化学分析。Fatima Alzahra Alatraktchi等人在《Fastselective detection of pyocyanin using cyclic voltammetry》一文中(Sensors2016,16(3),408)报道了在-0.1V—0.1V用循环伏安法测定人类唾液中绿脓菌素含量。但是，该方法专一性较低、灵明度低、检测限高，难以进行痕量检测。
生物电化学传感器以生物材料或者生物本身作为识别元件进行信号检测，具有仪器需求简单、灵敏度高、专一性好等优势。同时，一些电活性微生物还能通过细胞代谢连续产生电子，为检测物的生物电化学反应连续提供充足的电子，大幅提高检测灵敏度。本发明基于此构建一种新型的绿脓菌素生物电化学检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的高灵敏的绿脓菌素测定方法，解决现有技术中存在的灵敏度低、操作复杂、专一性差等复杂的问题
本发明的技术方案是：
一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，包括如下步骤：
步骤1、将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行菌种活化，离心分离，将得到的活化的希瓦氏菌种沉淀加入到反应缓冲液中，得到溶液A；
步骤2、将三电极置于在盛有步骤1得到的溶液A的容器中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；
步骤3、在步骤2得到的生物电化学传感器用循环伏安法扫描，待电流输出稳定，向生物电化学传感器体系中加入绿脓菌素样品，检测并记录电流变化值。
步骤1中，所述其中希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC-700550)。
步骤1中，所述反应缓冲液由以下物质组成：LB液体培养基、M9培养基、乳酸钠、CaCl2和MgSO4。
所述反应缓冲液中，所述LB液体培养基的体积分数为5％，LB液体培养基中，含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠；所述M9培养基的体积分数为95％，M9培养基中，含有17.8g/L Na2HPO4·12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/LNaCl、10.5g/L NH4Cl；所述乳酸钠在反应缓冲液中的浓度为18mM，所述CaCl2在反应缓冲液中的浓度为0.1mM，所述MgSO4在反应缓冲液中的浓度为1mM。
步骤1中，所述溶液A中，活化的希瓦氏菌种沉淀的浓度为0.5～2。
步骤2中，所述三电极如下：参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；工作电极为碳毡或碳布；对电极为铂丝电极。
步骤2中，所述的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成，如电化学工作站CHI 660E和CHI 1000E(上海辰华仪器有限公司)。
步骤3中，所述的循环伏安法的扫描电位为-0.7V～0V，所述的循环伏安法的扫描速率为1mv/s～50mv/s。
步骤3中，所述的绿脓菌素样品在生物电化学传感器体系中的浓度范围为400pM～1μM。
有益效果：
本发明使用了电活性微生物作为识别元件来进行信号检测，所以灵敏度高；当同时制备三个及以上的生物电化学传感器时，加入同样浓度的绿脓菌素样品，并使用同样的电流信号记录仪记录电流响应时，检测结果高度一致，变异系数小于10％；当向反应体系添加乳酸钠，葡萄糖，唾液，牛血清干扰物时，检测记录电流输出信号，结果绿脓菌素的回收率都在95％以上，说明该发明对于绿脓菌素检测具有很强的稳定性和专一性。
按照上述实验所使用的装置，测得绿脓菌素的检测浓度线性范围为400pM～100nM。与HPLC和传统电化学检测方法相比具有更低的检测限，可用于生化样品、唾液和牛血清中绿脓菌素的测定。
附图说明
图1为添加不同浓度绿脓菌素标准溶液后的电流输出信号结果；
图2为绿脓菌素检测测得的标准曲线(400pM～100nM)；
图3为当绿脓菌素浓度为1nM和1μM时的电流输出信号结果；
图4为以碳毡为阳极材料时100nM绿脓菌素的电流输出信号结果；
图5为控制不同OD值绿脓菌素(100nM)的电流输出信号结果；
图6为控制不同扫描速率绿脓菌素(100nM)的电流输出信号结果；
图7为添加葡萄糖、乳酸钠、唾液、牛血清干扰物时相对电流输出。
具体实施方式
实施例1：
(1)使用菌种：希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)，购自ATCC美国模式菌种保藏中心，菌种编号ATCC700550。
(2)希瓦氏菌菌液获取：希瓦氏菌菌种接种至LB液体培养基中，于30℃、200rpm摇床培养16h，获得菌液。
(3)配制生物电化学传感器的反应缓冲液：将0.6mL LB液体培养基和11.4mL M9培养基充分混合，另外添加乳酸钠、氯化钙、硫酸镁使其终浓度分别达到18mM、0.1mM和1mM。
(4)将过夜培养的希瓦氏菌液6000rpm离心，取沉淀加入到缓冲溶液中，其OD值控制在1.5。
(5)生物电化学传感器的组装：利用三电极系统，1×2cm碳布作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，并使用电化学工作站CHI660E(上海辰华仪器有限公司)控制，用循环伏安法设置扫描电位-0.7V～0V，扫描速率5mv/s。
(6)绿脓菌素的加入：待生物电化学传感器的输出电流达到稳定后，向生物电化学传感器体系中加入终浓度为100nM的绿脓菌素。
(7)标准曲线绘制：用超纯水配制绿脓菌素标准溶液，加到生物传感器中的终浓度分别为400pM,1nM，10nM，30nM，500nM，700nM，100nM.。将配置的不同浓度的绿脓菌素标准溶液依次加入到同一生物电化学传感器体系中，记录电流的变化曲线(图1)。从图1中即可以看出，随着加入绿脓菌素浓度的提高，相应地电流响应值也越来越大，即二者之间存在一定的线性关系；绿脓菌素的浓度与检测所得的电流响应成正比(R2为0.9994)(见图3)。由图2可知，利用该线性关系式可以计算绿脓菌素含量。
(8)检测含绿脓菌素的样品：按照上述(2)～(5)的步骤，制备5个相同的生物电化学传感器用于绿脓菌素的检测，向这5个传感器中分别加入一种浓度的绿脓菌素样品，记录电流响结果，并根据标准曲线计算绿脓菌素含量，如表1所示。由表1可知，该检测方法可以准确完成对绿脓菌素样品浓度的检测。
表1.在传感器中测试不同绿脓菌素样品的结果
变异系数(n＝3)。
实施例2：
与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极为1×2cm碳毡，得到的检测图如附图4所示。工作电极采用碳毡也能实现对绿脓菌素的检测。
实施例3：
与实施例1基本相同，但有以下改变：控制传感器中菌体的OD值为0.5，得到的检测图如附图5所示。OD值为0.5也能实现对绿脓菌素的检测。
实施例4：
与实施例1基本相同，但有以下改变：控制传感器中菌体的OD值为1，得到的检测图如附图5所示。OD值为1也能实现对绿脓菌素的检测。
实施例5：
与实施例1基本相同，但有以下改变：控制传感器中菌体的OD值为2，得到的检测图如附图5所示。OD值为2也能实现对绿脓菌素的检测。
实施例6：
与实施例1基本相同，但有以下改变：用循环伏安法扫描速率为50mv/s，得到的检测图如图6所示。循环伏安法扫描速率为50mv/s，亦可检测绿脓菌素。
实施例7：
与实施例1基本相同，但有以下改变：用循环伏安法扫描速率为1mv/s，得到的检测图如图6所示。循环伏安法扫描速率为1mv/s，亦可检测绿脓菌素。
实施例8：
与实施例1的步骤(1)～(6)相同，不同的是第(7)步骤中，将相比于绿脓菌素浓度1000倍的葡萄糖，乳酸钠以及唾液和牛血清分别添加到生物电化学传感器体系中，记录电流输出信号，结果绿脓菌素产生的回收率都在95％以上，得到的检测图如图7所示。说明该检测系统能够对绿脓菌素进行专一性检测。

Claims (9)

1.一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行菌种活化，离心分离，将得到的活化的希瓦氏菌种沉淀加入到反应缓冲液中，得到溶液A；
步骤2、将三电极置于在盛有步骤1得到的溶液A的容器中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器；
步骤3、在步骤2得到的生物电化学传感器用循环伏安法扫描，待电流输出稳定，向生物电化学传感器体系中加入绿脓菌素样品，检测并记录电流变化值；
步骤1中，所述溶液A中，活化的希瓦氏菌种沉淀的OD值为0.5~2。
2.根据权利要求1所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤1中，
所述的菌种为希瓦氏菌种。
3.根据权利要求1所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤1中，所述反应缓冲液由以下物质组成：LB液体培养基、M9培养基、乳酸钠、CaCl2和MgSO4。
4.根据权利要求3所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，所述反应缓冲液中，所述LB液体培养基的体积分数为5%，LB液体培养基中，含有10 g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、5 g/L氯化钠；所述M9培养基的体积分数为95%，M9培养基中，含有17.8 g/LNa2HPO4·12H2O、3g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、10.5 g/L NH4Cl；所述乳酸钠在反应缓冲液中的浓度为18mM，所述CaCl2在反应缓冲液中的浓度为0.1mM，所述MgSO4在反应缓冲液中的浓度为1mM。
5.根据权利要求1所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤2中，所述三电极如下：参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极；工作电极为碳毡或碳布；对电极为铂丝电极。
6.根据权利要求1所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成。
7.根据权利要求1或6所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，所述信号检测系统为电化学工作站。
8.根据权利要求1所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤3中，所述的循环伏安法的扫描速率为1mv/s~50mv/s。
9.根据权利要求1所述的一种绿脓菌素的生物电化学检测方法，其特征在于，步骤3中，所述的绿脓菌素样品在生物电化学传感器体系中的浓度范围为400pM~1μM。
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