CN112268769A - 一种样本缓冲液和脂溶性物质检测方法 - Google Patents

一种样本缓冲液和脂溶性物质检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种样本缓冲液，并结合电化学方法检测脂溶性相关物质，该发明首次制备并使用含有机碱的缓冲液，利用有机碱良好的稳定性以及与脂溶性物质独特的结合反应能力，极大地提高了脂溶性物质检测的灵敏度和稳定性；而且该缓冲液所使用的有机碱有利于固相检测体系的开发。该样本缓冲液适用范围广，可以检测包括食品、药品、生物样品、农药、化妆品等多种类型样品中的多种脂溶性物质，比如血清样品中的胆固醇，脂溶性维生素，磷脂，糖脂等，化妆品中的脂肪酸，脂肪醇，多元醇等；农药中的六氯化苯、对硫磷、敌敌畏等。

Description

一种样本缓冲液和脂溶性物质检测方法
技术领域
本发明属于脂溶性物质检测技术领域，具体涉及一种样本缓冲液和脂溶性物质检测方法。
背景技术
脂溶性物质普遍存在于食物，生物样品，药品等物品中，部分农药杀虫剂也为脂溶性物质(如有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类等)，一些脂溶性物质比如胆固醇、磷脂、脂溶性维生素、甘油三酯等与机体健康息息相关，这些脂溶性物质在体内过高或过低都可能对机体健康产生不良影响甚至造成疾病，所以定期检测相关脂溶性物质含量对机体健康具有重要意义，与此同时某些脂溶性物质也是诊断疾病(如高脂血症等)的重要指标。脂溶性物质结构一般比较复杂，特别是生物样本中的脂溶性物质，通常和较复杂的基质结合在一起，由于某些脂溶性物质易被光破坏，在含氧环境下不稳定，PH对其影响也较大，因此该类因素增加了脂溶性物质分离和检测的难度。
目前，脂溶性物质的检测方法有高效液相色谱法、质谱法、荧光法、化学发光法、电化学检测法等，其中高效液相色谱法与质谱法的使用最为普遍，但其样品检测前处理较为复杂，涉及有机溶剂较多，不易操作，需要对操作人员进行专业培训。电化学方法检测相关物质灵敏度高，操作简单，但有关于脂溶性物质电化学检测法对样品缓冲液要求较高，目前国内外主要用到的缓冲液主要成分大致分为三类：1、有机溶剂，2、无机溶剂与有机溶剂的混合溶液，3、无机溶剂与表面活性剂。目前使用这些缓冲液主要存在以下问题：灵敏度低、适用范围窄；有机溶剂本身具有挥发性，通常导致检测结果不稳定，且长时间接触会对操作人员健康造成伤害，同时也会对环境造成污染。本发明首次制备含有机碱的样本缓冲液并针对现有脂溶性样本缓冲液的缺点进行改进以满足临床检测及相关电化学检测的需求。
发明内容
本发明针对现有脂溶性样本缓冲液的不足，提供了一种新型脂溶性物质样本缓冲液，利用主要成分有机碱和脂溶性物质的特异性反应，大幅提高脂溶性物质检测的灵敏度，避免了有机溶剂的使用，保证了检测稳定性，且有机碱为固体，有利于固相检测体系的开发。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供了一种样本缓冲液，所述样本缓冲液包含有机碱，所述样本缓冲液用于脂溶性物质检测。。
在一个实施例中，所述样本缓冲液还包含磷酸盐、硼酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化盐中的一种或几种。
在一个实施例中，所述有机碱的含量为0.001～10mol/L；所述硼酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述高氯酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述硫酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述硝酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述氯化盐的含量为0.001～10mol/L。
在一个实施例中，所述磷酸盐为磷酸三钠、磷酸氢二钠、六偏磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的一种或多种。
在一个实施例中，所述硼酸盐为四硼酸钠、十水盐硼酸钠、五水盐硼酸钠、四硼酸钾中的一种或多种。
在一个实施例中，所述高氯酸盐为高氯酸钠、高氯酸钾、高氯酸锂、高氯酸镁、高氯酸钡、高氯酸铵、高氯酸银中的一种或多种。
在一个实施例中，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硝酸铅、硝酸铈中的一种或多种。
在一个实施例中，所述氯化盐为氯化钠、氯化铵、氯化钾、氯化锌、氯化银、氯化钙、氯化铁中的一种或多种。
在一个实施例中，所述样本缓冲液pH范围为1.5～12.5。
本发明还提供了一种脂溶性物质检测方法，包括步骤：
配制如权利要求1-8中任一项所述的样本缓冲液；
待检测样本含量检测：将待检测样本放入样本缓冲液中混匀，用电化学法检测所述待检测样本与所述样本缓冲液混合液中的电流信号值，并根据预先设定的标准曲线得到所述待检测样本的脂溶性物质含量。
通过本发明提供的一种脂溶性物质样本缓冲液和脂溶性物质检测方法，能够实现以下有益效果：
本发明首次制备并使用含有机碱的缓冲液，大幅提高脂溶性物质检测的灵敏度，由于大多数脂溶性物质的缓冲液都含有机溶剂或者表面活性剂，有机溶剂种类繁多，极性与黏度各不相同，找出适用于某种脂溶性物质检测的含有机溶剂的样本缓冲液较为不易，一些含有机溶剂的样本缓冲液黏度较高，导致反应速率慢，不易检测低浓度脂溶性物质；表面活性剂的加入使溶液界面状态发生了明显变化，在电极附近发生的扩散运输相对不均一，使其电流不能维持稳定，影响检测结果的稳定性。该缓冲液避免了有机溶剂和表面活性剂的使用，防止缓冲液挥发过快从而保证了其检测稳定性的同时，还降低了黏度提高了介质的电导率，从而减小了总电阻，提高了反应速率，缩短了检测时间。且有机碱为固体，有利于开发固相检测体系。
该样本缓冲液适用范围广，可以检测包括食品、药品、生物样品、农药、化妆品等多种类型样品中的多种脂溶性物质，比如血清样品中的胆固醇，脂溶性维生素，磷脂，糖脂等，化妆品中的脂肪酸，脂肪醇，多元醇等；农药中的六氯化苯、对硫磷、敌敌畏等。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种样本缓冲液和脂溶性物质检测方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1为一个实施例中以不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值制定的标准曲线图；
图2为另一个实施例中以不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值制定的标准曲线图；
图3为再一个实施例中以不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值制定的标准曲线图；
图4为一个实施例中以不同浓度维生素A标准样品的电流信号值制定的标准曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。
为使图面简洁，各图中只示意性地表示出了与本发明相关的部分，它们并不代表其作为产品的实际结构。另外，以使图面简洁便于理解，在有些图中具有相同结构或功能的部件，仅示意性地绘示了其中的一个，或仅标出了其中的一个。在本文中，“一个”不仅表示“仅此一个”，也可以表示“多于一个”的情形。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一类明显不同于传统三大类脂溶性物质电化学检测缓冲液的溶液，传统脂溶性物质电化学检测缓冲液包括：1、单纯的有机溶剂，2、无机溶剂和有机溶剂混合，3、无机溶剂和表面活性剂混合。这些方法存在灵敏度低、稳定性差、适用范围局限等问题。
本发明提供了一种样本缓冲液的实施例，其组分包含有机碱以及磷酸盐、硼酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化盐中的一种或几种，其中有机碱是必须成分，磷酸盐、硼酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化盐为可选成分。例如有机碱和磷酸盐的混合溶液，有机碱、高氯酸眼、氯化盐的混合溶液。样本缓冲液用于脂溶性物质检测。
本申请中的样本缓冲液的主要成分为有机碱，单独使用或结合盐的使用，在提高灵敏度的同时保证稳定性，可用于血样、药物、食品、农药、化妆品等样品中胆固醇、磷脂、脂溶性维生素、糖脂、甘油三酯等多种脂溶性物质的快速检测。同时，有机碱的使用避免了有机溶剂的使用，防止溶液挥发过快从而影响检测结果，该样品缓冲液的使用大大缩短了待检样品的检测时间，配制简单，无需专门技术人员进行操作，易于推广。
优选的，所述有机碱的含量为0.001～10mol/L；所述硼酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述高氯酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述硫酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述硝酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述氯化盐的含量为0.001～10mol/L。在一个实施例中，可选的，所述磷酸盐为磷酸三钠、磷酸氢二钠、六偏磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的一种或多种。可选的，所述硼酸盐为四硼酸钠、十水盐硼酸钠、五水盐硼酸钠、四硼酸钾中的一种或多种。可选的，所述高氯酸盐为高氯酸钠、高氯酸钾、高氯酸锂、高氯酸镁、高氯酸钡、高氯酸铵、高氯酸银中的一种或多种。可选的，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硝酸铅、硝酸铈中的一种或多种。可选的，所述氯化盐为氯化钠、氯化铵、氯化钾、氯化锌、氯化银、氯化钙、氯化铁中的一种或多种。在一个实施例中，所述样本缓冲液pH范围为1.5～12.5。
本发明还提供了一种脂溶性物质检测方法的实施例，该方法包括步骤：
S1配制某浓度的样本缓冲液；所述样本缓冲液包含有机碱以及磷酸盐、硼酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化盐中的一种或几种；
S2电极片预处理：将N个电极片分别放入所述浓度的样本缓冲液中，用差分脉冲法扫描所述N个电极片，得到预处理后的电极片；待检测样本含量检测：
S3待检测样本含量检测：将待检测样本放入某浓度的样本缓冲液中混匀，用差分脉冲法检测预处理后的电极片在所述待检测样本与所述某浓度的样本缓冲液混合液中的电流信号值，并根据预先设定的标准曲线得到所述待检测样本的脂溶性物质含量。
其中，还可包括步骤：预先制定标准曲线：将N个不同浓度的脂溶性标准样品分别与所述样本缓冲液混匀，得到N个混合液；检测经过预处理后的电极片在所述N个混合液中的电流信号值，制定标准曲线；其中，N为正整数。
本发明还提供了一种利用样本缓冲液检测血样中维生素D3含量的实施例，包括以下步骤：
(1)配制样本缓冲液
将高氯酸盐和有机碱加入超纯水中至高氯酸盐的终浓度为0.001mol/L，有机碱的浓度为0.001mol/L，调pH值为1.5；
(2)一次性电极片预处理
取电极片插入电极基座，加1000μL步骤(1)中样本缓冲液，然后用差分脉冲法扫描电极片5次。
(3)将体积均为80μL浓度分别为20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L的维生素D3标准样品，分别与1000μL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后分别利用差分脉冲法检测各维生素D3标准样品在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值，制定标准曲线，如图1所示，由图1可知，线性回归方程为y＝52.312x-32.92，R2＝0.9965，该方法最低检测浓度为10nmol/L，检测范围为10-1000nmol/L，准确度为3.02％。
(4)取80ul待测血样与1000uL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后利用差分脉冲法检测待测血样在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得待测血样产生的电流信号值，最后根据待测血样产生的电流信号值及步骤(3)中制定的标准曲线，获取待测血样中维生素D3的含量为125nmol/L。
本发明还提供了一种利用样本缓冲液检测血样中维生素D3含量的另一个实施例，包括以下步骤：
(1)配制样本缓冲液
将高氯酸盐和有机碱加入超纯水中至高氯酸盐的终浓度为0.8mol/L，有机碱的浓度为0.5mol/L，调pH值为6.5；
(2)一次性电极片预处理
取电极片插入电极基座，加1000μL步骤(1)中样本缓冲液，然后用差分脉冲法扫描电极片5次。
(3)将体积均为80μL浓度分别为20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L的维生素D3标准样品，分别与1000μL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后分别利用差分脉冲法检测各维生素D3标准样品在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值，制定标准曲线，如图2所示，由图2可知，线性回归方程为y＝48.794x-19.781，R2＝0.9968，该方法最低检测浓度为10nmol/L，检测范围为10-1000nmol/L，准确度为3.43％。
(4)取80ul待测血样与1000uL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后利用差分脉冲法检测待测血样在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得待测血样产生的电流信号值，最后根据待测血样产生的电流信号值及步骤(3)中制定的标准曲线，获取待测血样中维生素D3的含量为127nmol/L。
本发明还提供了一种利用样本缓冲液检测血样中维生素D3含量的再一个实施例，包括以下步骤：
(1)配制样本缓冲液
将高氯酸盐和有机碱加入超纯水中至高氯酸盐的终浓度为10mol/L，有机碱的浓度为10mol/L，调pH值为12.5；
(2)一次性电极片预处理
取电极片插入电极基座，加1000μL步骤(1)中样本缓冲液，然后用差分脉冲法扫描电极片5次。
(3)将体积均为80μL浓度分别为20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L的维生素D3标准样品，分别与1000μL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后分别利用差分脉冲法检测各维生素D3标准样品在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值，制定标准曲线，如图3所示，由图3可知，线性回归方程为y＝54.477x-34.092，R2＝0.9958，该方法最低检测浓度为10nmol/L，检测范围为10-1000nmol/L，准确度为3.22％。
(4)取80ul待测血样与1000uL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后利用差分脉冲法检测待测血样在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得待测血样产生的电流信号值，最后根据待测血样产生的电流信号值及步骤(3)中制定的标准曲线，获取待测血样中维生素D3的含量为121nmol/L。
本发明还提供了一种利用样本缓冲液检测血样中维生素A的含量，包括以下步骤：
(1)配制样本缓冲液
将高氯酸盐和有机碱加入超纯水中至高氯酸盐的终浓度为1mol/L，有机碱的浓度为0.8mol/L，调pH值为3.5；
(2)一次性电极片预处理
取电极片插入电极基座，加1000μL步骤(1)中样本缓冲液，然后用差分脉冲法扫描电极片5次。
(3)将体积均为80μL浓度分别为0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L的维生素A标准样品，分别与1000μL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后分别利用差分脉冲法检测各维生素A标准样品在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得不同浓度维生素D3标准样品的电流信号值，制定标准曲线，如图4所示，由图4可知，线性回归方程为y＝1.4016x+0.0275，R2＝0.9993，该方法最低检测浓度为0.03μmol/L，检测范围为0.06-100um/L，准确度为4.02％。
(4)取80uL待测血样与1000uL步骤(2)中样本缓冲液混匀，然后利用差分脉冲法检测待测血样在维生素检测仪预处理过的电极片上发生氧化还原反应时产生的电流信号，获得待测血样产生的电流信号值，最后根据待测血样产生的电流信号值及步骤(3)中制定的标准曲线，获取待测血样中维生素A的含量为1.26μmol/L。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种样本缓冲液，其特征在于，所述样本缓冲液包含有机碱，所述样本缓冲液用于脂溶性物质检测。
2.如权利要求1所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述样本缓冲液还包含磷酸盐、硼酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化盐中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述有机碱的含量为0.001～10mol/L；所述硼酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述高氯酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述硫酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述硝酸盐的含量为0.001～10mol/L；所述氯化盐的含量为0.001～10mol/L。
4.如权利要求2所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸三钠、磷酸氢二钠、六偏磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述硼酸盐为四硼酸钠、十水盐硼酸钠、五水盐硼酸钠、四硼酸钾中的一种或多种。
6.如权利要求2所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述高氯酸盐为高氯酸钠、高氯酸钾、高氯酸锂、高氯酸镁、高氯酸钡、高氯酸铵、高氯酸银中的一种或多种。
7.如权利要求2所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硝酸铅、硝酸铈中的一种或多种。
8.如权利要求2所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述氯化盐为氯化钠、氯化铵、氯化钾、氯化锌、氯化银、氯化钙、氯化铁中的一种或多种。
9.如权利要求1-8任一项所述的一种样本缓冲液，其特征在于，所述样本缓冲液pH范围为1.5～12.5。
10.一种样本缓冲液结合电化学方法检测，其特征在于，包括步骤：
配制如权利要求1-9中任一项所述的样本缓冲液；
待检测样本含量检测：将待检测样本放入样本缓冲液中混匀，用电化学法检测所述待检测样本与所述样本缓冲液混合液中的电流信号值，并根据预先设定的标准曲线得到所述待检测样本的脂溶性物质含量。
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