CN108034744B

CN108034744B - 一组核苷酸序列及其应用

Info

Publication number: CN108034744B
Application number: CN201711317626.5A
Authority: CN
Inventors: 林惠娇; 蒋湘; 杨华卫; 古恒森; 张海磊; 刘昱辰
Original assignee: Jiangsu Huntarray Biotechnology Co ltd; HUANGPU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANINE
Current assignee: Jiangsu Huntarray Biotechnology Co ltd; HUANGPU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANINE
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN108034744A

Abstract

本申请涉及一组核苷酸序列及其应用。所述核苷酸序列包括如SEQ ID No.1所示的上游引物核苷酸序列，如SEQ ID No.2所示的下游引物核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示的第一探针核苷酸序列，如SEQ ID No.4所示的第二探针核苷酸序列，如SEQ ID No.5所示的第三探针核苷酸序列。

Description

一组核苷酸序列及其应用

技术领域

本申请涉及一组核苷酸序列及其应用。

背景技术

褐腐病(Brown Rot)是核果及仁果类水果生产及贮藏期重要的病害，在世界分布较为广泛，为害果树引起枝梢溃疡、花叶枯萎、果实腐烂，导致严重损失(Byrde&Willetts1977；Batra,1991；Ogawa et al.,1995；Berrie&Holb,2014)。褐腐病主要由子囊菌链核盘菌属(Monilinia)中的三个种，即美澳型核果褐腐菌(M.fructicola)、核果褐腐菌(M.laxa)和仁果褐腐菌(M.fructigena)所引起。M.fructicola被认为是其中最具有毁灭性的植物病原菌(Hrustic et al.,2012)，被欧盟、非盟、智利、约旦、以色列和巴林定为检疫性有害生物(EPPO global data base:https://gd.eppo.int/)。该菌也是我国禁止进境的植物检疫性有害生物(农业部，2007)，具有重要的检疫意义。另外两种褐腐病菌，M.fructigena被美国、加拿大、澳大利亚、新西兰和智利列为检疫对象，而M.laxa则是约旦关注的检疫对象(EPPO global data base:https://gd.eppo.int/)。

中国种植核果、仁果类果树历史悠久，种类繁多，分布广泛，是世界主要的苹果、梨和桃产区。褐腐病菌既能在果树生长期和果实储藏期造成为害，也可在果实中潜伏侵染随病果远距离传播，加之其具有很强的环境适应性，对我国水果产业造成严重威胁。由于三种褐腐病菌关系相近，传统依靠菌落特征、分生孢子大小、分生孢子萌发产生的芽管、产孢量等形态和生理特征进行区分非常困难(Sonoda et al.,1982；van Leeuwen&van Kesteren,1998；Lane,2002)，要求鉴定者必须具备丰富的真菌分类学基础与经验。此外，传统检验方法周期长，难以满足口岸水果快速通关的要求，因此建立快速准确的检测方法以防止该类病原真菌的传播尤为必要。

我国每年进口大量核果、仁果类水果，包括李、桃、樱桃、苹果、梨等，有害生物传入的可能性急剧增加。自2005年以来，我国各水果进境口岸检验检疫部门连续每年都从进境水果中多次截获美澳型核果褐腐病菌。2011年的疫情尤为突出，仅当年从美国进境水果中就检出美澳型核果褐腐病菌50批次(国家质检总局植物疫情数据库，内网)。由于水果褐腐病菌寄主范围广、传播途径多、对气候条件的适应性强，其通过水果贸易进行跨国异地传播的风险极高。鉴于褐腐病菌的重大经济意义，许多研究者从多方面寻求更可靠的检测方法，包括普通PCR检测、巢式PCR检测、多重PCR检测、SYBR green实时荧光PCR检测、TaqMan实时荧光PCR检测。

传统的检测方法一般为普通PCR扩增，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳看产物条带大小进行判读，检测时间长，结果不准确；或者将PCR产物外送测序，测序时间长，一般需要3-4天的周期才能出结果。荧光PCR检测成本高，遇到多指标检测时，需要多管扩增检测，并且需要依赖昂贵的荧光PCR仪器，尤其是多通道的仪器更贵。并且，随着水果贸易对货物通关速度的要求不断提高，快速、准确、简便的检测技术越来越为口岸检疫所需要。

发明内容

本申请之一提供了一组核苷酸序列，其包括如SEQ ID No.1所示的上游引物核苷酸序列，如SEQ ID No.2所示的下游引物核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示的第一探针核苷酸序列，如SEQ ID No.4所示的第二探针核苷酸序列，如SEQ ID No.5所示的第三探针核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所示核苷酸序列还包括质控探针。

在一个具体实施方式中，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

在一个具体实施方式中，所述下游引物核苷酸序列用生物素标记。

本申请之二提供了根据本申请之一所述的核苷酸序列在检测水果褐腐病病原菌中的应用。

在一个具体实施方式中，所述水果褐腐病病原菌选自美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)、核果褐腐菌(Monilinia laxa)和仁果褐腐菌(Moniliniafructigena)中的至少一种。

本申请之三提供了一种检测水果褐腐病病原菌的方法，其包括如下步骤：1)获得固定有如本申请之一任意一项所述的核苷酸序列中的第一探针核苷酸、第二探针核苷酸和第三探针核苷酸的检测试纸条，所述第一探针核苷酸、第二探针核苷酸和第三探针核苷酸在检测试纸条上的位置两两不重叠；

2)以待检测样品的DNA作为模板，如权利要求1所述的核苷酸序列中的上游引物和下游引物为引物对进行PCR不对称扩增，得到PCR产物；

3)将所述PCR产物与所述检测试纸条上的探针杂交，当第一探针核苷酸位置处显示为阳性时，说明待检测样品中含有美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)，当第二探针核苷酸位置处显示为阳性时，说明待检测样品中含有核果褐腐菌(Monilinia laxa)，当第三探针核苷酸位置处显示为阳性时，说明待检测样品中含有仁果褐腐菌(Moniliniafructigena)。

在一个具体实施方式中，在步骤1)中，所述检测试纸条中还固定有如权利要求2中所述的核苷酸序列中的质控探针，所述质控探针在检测试纸条上的位置与所述第一探针核苷酸、第二探针核苷酸和第三探针核苷酸不重叠。

在一个具体实施方式中，所述试纸条的形状为矩形或T字形。

在一个具体实施方式中，所述试纸条的材质为硝酸纤维素膜。

在一个具体实施方式在，进行PCR不对称扩增上游引物和下游引物的用量摩尔比为1:10至3:5。

本申请的有益效果：

本申请首次尝试使用可视化试纸对水果褐腐病菌进行快速检测。该技术利用反向点杂交原理，将待测的DNA样本经PCR扩增成为带生物素标记的单链DNA，再与试纸上的探针进行杂交，结合了特异DNA样本的探针点即带有生物素类的标记物，经相应的酶促显色反应就能显出杂交信号，特异性好、灵敏度高。通过单张试纸同时实现三种病菌的多重检测，更是节约了检测成本，提高了检测效率，可有效降低口岸检疫监管和货物通关的检测和时间成本。检测结果免除电泳过程，无需依赖昂贵设备，具有直观、快速、操作简便、可肉眼直接进行结果判读，结果准确等优势，便于向基层口岸推广使用。

本申请开发的水果褐腐病菌可视化检测试纸操作快速简便、准确度高、成本低，符合口岸检测技术的发展方向，能够满足水果病原真菌检测准确快速的需要，可为进境水果的快速通关提供技术支持。

附图说明

图1显示了实施例1中使用之前的T字形核酸试纸(即未使用的)。

图2显示了实施例1中在模板为纯化水单重扩增时，T字形试纸正确检测出阴性结果；

图3显示了实施例1中在美澳型核果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，T字形试纸正确检测出美澳型核果褐腐菌；

图4显示了实施例1中在核果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，T字形试纸正确检测出核果褐腐菌；

图5显示了实施例1中在仁果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，T字形试纸正确检测出仁果褐腐菌；

图6显示了实施例2中使用之前的矩形核酸试纸(即未使用的)。

图7显示了实施例2中在模板为纯化水单重扩增时，矩形试纸正确检测出阴性结果；

图8显示了实施例2中在美澳型核果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增，矩形试纸正确检测出美澳型核果褐腐菌；

图9显示了实施例2中在核果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，矩形试纸正确检测出核果褐腐菌；

图10显示了实施例2中在仁果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，矩形试纸正确检测出仁果褐腐菌；

图11显示了对比例1在模板为纯化水三重扩增时，T形试纸正确检测出阴性结果；

图12显示了对比例1在美澳型核果褐腐菌模板为10fg的浓度下三重扩增时，T形试纸未能检测出美澳型核果褐腐菌；

图13显示了对比例1在核果褐腐菌模板为10fg的浓度下三重扩增时，T形试纸未能检测出核果褐腐菌；

图14显示了对比例1在仁果褐腐菌模板为10fg的浓度下三重扩增时，T形试纸未能检测出仁果褐腐菌；

图15显示了对比例2在模板为纯化水三重扩增时，T形试纸正确检测出阴性结果；

图16显示了对比例2在美澳型核果褐腐菌模板为1pg的浓度下三重扩增时，T形试纸能检测出美澳型核果褐腐菌，但同时也有非特异性点出现；

图17显示了对比例2在核果褐腐菌模板为1pg的浓度下三重扩增时，T形试纸能检测出核果褐腐菌，但同时也有非特异性点出现；

图18显示了对比例2在仁果褐腐菌模板为1pg的浓度下三重扩增时，T形试纸能检测出仁果褐腐菌，但同时也有非特异性点出现；

图19显示了对比例3中在模板为纯化水单重扩增时，T字形试纸正确检测出阴性结果；

图20显示了对比例3中在美澳型核果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，T字形试纸未能检测出美澳型核果褐腐菌；

图21显示了对比例3中在核果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，T字形试纸未能检测出核果褐腐菌；

图22显示了对比例3中在仁果褐腐菌模板为10fg的浓度下单重扩增时，T字形试纸未能检测出仁果褐腐菌。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

引物：

上游引物Mon F1序列如SEQ ID No.1所示。

下游引物Mon R1序列如SEQ ID No.2所示，并在其5’端用生物素标记。

探针：

对美澳型核果褐腐菌特异的探针Mfcl-P序列如SEQ ID No.3所示。

对核果褐腐菌特异的探针Mlx-P序列如SEQ ID No.4所示。

对仁果褐腐菌特异的探针Mfgn-P序列如SEQ ID No.5所示。

质控探针HC序列如SEQ ID No.6所示。

实施例1

采用的试纸为T字形试纸。

核酸提取试剂盒、试纸条反应试剂盒(含扩增反应液、杂交液、清洗液、显色液、终止液、空白T字形检测试纸)购自江苏猎阵生物科技有限公司。其中扩增反应液中含有与质控探针HC能够杂交的核苷酸序列SEQ ID No.7。三种褐腐菌致病菌基因组DNA模板由黄埔出入境检验检疫局提供。

模板一为纯化水(空白对照ck)；模板二为Mlx(核果褐腐菌基因组DNA)；模板三为Mfgn(仁果褐腐菌基因组DNA)；模板四为Mfcl(美澳型核果褐腐菌基因组DNA)。各模板DNA的浓度经测定后，用10倍稀释法稀释到10fg分别作为以下扩增模板。

采用引物Mon F1和Mon R1作为引物对进行PCR不对称扩增。反应体系为20μL：包括13μL扩增反应液、1.2μL正向引物Mon F1和2μL反向引物Mon R1、2μL上述模板DNA，加双蒸水补至20μL。

反应程序为：94℃预变性4min；然后以94℃5s，43℃1s，68℃7s进行40个循环；最后94℃5s，63℃1s，68℃7s结束反应。

将各探针用移液器依次点在四个空白检测试纸上。在同一检测试纸上，点样位置自上往下依次为探针HC，Mlx-P，Mfgn-P，Mfcl-P，然后在干燥箱中60℃烘烤15min，即为检测试纸，如图1所示。

分别各取杂交液600μL加入到4个2mL的反应管中、各取1000μL的清洗液加入到4个2mL的反应管中、再各取1000μL的清洗液加入到另外4个2mL的反应管中、各取显色液600μL加入到4个2mL的反应管中、各取终止液1000μL加入到4个2mL的反应管中。

然后再将以上各反应管依次放到恒温振荡仪上。

设置恒温振荡仪参数为45℃，1500Hz振荡频率。

将各扩增产物20μL分别加入到各已有杂交液的反应管中；

然后将固定有HC、Mlx-P、Mfgn-P和Mfcl-P探针的四个试纸条依次放入混有ck、Mlx-P、Mfgn-P和Mfcl-P扩增产物的杂交液中，杂交5分钟；

然后将各试纸条取出插入到含清洗液的各个反应管中，清洗1分钟；

然后将各试纸条取出再插入到另外的含清洗液的各个反应管中，清洗1分钟；

然后将各试纸条取出再插入到含显色液的各反应管中，显色3分钟；

然后将各试纸条取出再插入到含终止液的各反应管中，终止5秒，即可判读结果。

结果见图2至图5。

从图2至图5的结果中可以看出，在模板为10fg的浓度下，本次扩增的产物均检测结果均正确，说明在本扩增条件下，均能有效检测出各模板为10fg的相关靶标。

实施例2

采用的试纸为矩形试纸。

核酸提取试剂盒、试纸条反应试剂盒(含扩增反应液、杂交液、清洗液、显色液、终止液、空白矩形检测试纸)购自江苏猎阵生物科技有限公司。

三种褐腐菌致病菌基因组DNA模板由黄埔出入境检验检疫局提供。

模板一为纯化水(空白对照ck)；模板二为Mlx(核果褐腐菌基因组DNA)；模板三为Mfgn(仁果褐腐菌基因组DNA)；模板四为Mfcl(美澳型核果褐腐菌基因组DNA)。各模板DNA的浓度经测定后，用10倍稀释法稀释到10fg作为以下扩增模板。

将各探针用移液器依次点在四个空白检测试纸上。在同一检测试纸上，点样位置自上往下依次为探针HC，Mlx-P，Mfgn-P，Mfcl-P，然后在干燥箱中60℃烘烤15min，即为检测试纸，如图6所示。

分部取固定有HC、Mlx-P、Mfgn-P和Mfcl-P探针的四个矩形检测试纸依次放入各检测槽中，向个检测槽中分别加入杂交液600μL，然后依次将ck、Mlx-P、Mfgn-P和Mfcl-P四种扩增产物20μL加入到对应的各检测槽中；

设置恒温振荡器到45℃，振荡频率为1500Hz，杂交5分钟；

然后将各检测槽中的液体吸出弃掉，再分别各加入2000μL的清洗液，振荡清洗1分钟，然后再分别吸取检测槽中的液体弃掉；重复本步骤一次。

然后向各检测槽中分别各加入500μL的显色液，振荡显色3分钟，然后直接分别加入若干自来水到各检测槽中进行终止反应。即可判读结果。

结果见图7至图10。

从图7至图10的结果中可以看出，在模板为10fg的浓度下，本次扩增的产物均检测结果均正确，说明在本扩增条件下，均能有效检测出各模板为10fg的相关靶标。

对比例1

采用三重扩增引物进行PCR扩增。反应体系为20μL：包括13μL扩增反应液、3.2μL三重引物(SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)混合液、2μL模板DNA，加双蒸水补至20μL。

其他同实施例1。结果见图11至14。

从结果中可以看出，在模板为10fg的浓度下，三重引物扩增的产物均检测为阴性，说明三重扩增的灵敏度低，不能在各模板为10fg的条件下正确检测到相关靶标。

对比例2

模板一为纯化水(空白对照ck)；模板二为Mlx(核果褐腐菌基因组DNA)；模板三为Mfgn(仁果褐腐菌基因组DNA)；模板四为Mfcl(美澳型核果褐腐菌基因组DNA)。各模板DNA的浓度经测定后，用10倍稀释法稀释到10pg作为以下扩增模板。

采用三重扩增引物进行PCR扩增。反应体系为20μL：包括13μL扩增预混液、3.2μL三重引物(SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)混合液、2μL模板DNA，加双蒸水补至20μL。

结果见图15至18。

从图15至18的结果中可以看出，在模板为1pg的浓度下，三重引物扩增的产物均检测为阳性，但是有非特异检测点出现，出现检阳性结果。

对比例3

采用引物Mon F2(SEQ ID No.12)和Mon R2(SEQ ID No.13)作为引物对进行PCR扩增。

其他同实施例1。

结果见图19至图22。

从图19至图22的结果中可以看出，在模板为10fg的浓度下，模板一检测结果正确，模板二、模板三、模板四经扩增后检测，均未能在10fg的浓度下检测出对应靶标。

虽然本申请已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本申请的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本申请的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本申请的权利要求的范围内。

序列表

<110> 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局

江苏猎阵生物科技有限公司

<120> 一组核苷酸序列及其应用

<130> LHA1760724

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 1

gaattgacaa gcgtacc 17

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 2

aagaaccctt tccga 15

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 3

ttttttacat cttcatcaac tca 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 4

tttttgatga tgtctccatt ca 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 5

tttttaatct tgatggctta atc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

tgctagtgac catccgagaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

ttctcggatg gtcactagca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 8

tttgttcgtg tatgggttgg 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

cccaatgctt atcgtgctt 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 10

tgtttcacta gcaggttgtt gt 22

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 11

agaacccttt ccgagt 16

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 12

catgaattga caagcgta 18

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 13

gcaagaactc tttccg 16

Claims

1.一组核苷酸，其特征在于，所述核苷酸包括序列如SEQ ID No. 1所示的上游引物核苷酸，如SEQ ID No. 2所示的下游引物核苷酸，如SEQ ID No. 3所示的第一探针核苷酸，如SEQ ID No. 4所示的第二探针核苷酸，如SEQ ID No. 5所示的第三探针核苷酸。

2.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸还包括质控探针。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNo. 6所示。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的核苷酸，其特征在于，所述下游引物核苷酸用生物素标记。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的核苷酸在检测水果褐腐病病原菌中的应用，所述水果褐腐病病原菌选自美澳型核果褐腐菌（Monilinia fructicola）、核果褐腐菌（Monilinia laxa）和仁果褐腐菌（Monilinia fructigena）中的至少一种。

6.一种检测水果褐腐病病原菌的方法，其包括如下步骤：1）获得固定有如权利要求4所述的核苷酸中的第一探针核苷酸、第二探针核苷酸和第三探针核苷酸的检测试纸条，所述第一探针核苷酸、第二探针核苷酸和第三探针核苷酸在检测试纸条上的位置两两不重叠；

2）以待检测样品的DNA作为模板，以权利要求4所述的核苷酸中的上游引物核苷酸和下游引物核苷酸为引物对进行不对称PCR扩增，得到PCR产物；

3）将所述PCR产物与所述检测试纸条上的探针杂交，当第一探针核苷酸位置处显示为阳性时，说明待检测样品中含有美澳型核果褐腐菌（Monilinia fructicola），当第二探针核苷酸位置处显示为阳性时，说明待检测样品中含有核果褐腐菌（Monilinia laxa），当第三探针核苷酸位置处显示为阳性时，说明待检测样品中含有仁果褐腐菌（Moniliniafructigena）。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，当所述检测试纸条中固定有所述质控探针时，所述质控探针在检测试纸条上的位置与所述第一探针核苷酸、第二探针核苷酸和第三探针核苷酸不重叠。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述试纸条的形状为矩形或T字形。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述试纸条的材质为硝酸纤维素膜。