JP4679022B2 - 標的塩基配列の検出方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、試料中に存在する特定の塩基配列（以下、標的塩基配列という）の検出方法に関する。
背景技術
核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。またＰＣＲのような塩基配列を増幅する方法が応用できることから、例えば培養のような時間と手間のかかる操作無しでも高感度な検出が可能となる場合もある。
相補的な塩基配列のハイブリダイゼーションを検出するために、様々な方法が報告されている。もっとも基本的な反応原理は、サザンブロットアッセイとして広く利用されている。この方法は、試料ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに固定し、これを標識プローブと反応させる方法である。試料ＤＮＡ中にプローブと相補的な塩基配列が存在すれば、標識プローブはハイブリダイゼーションによってニトロセルロースフィルターに捕捉される。試料ＤＮＡの固定操作を省くために、捕捉用のプローブを利用することもできる。この場合は、固相側から順に［固相］−［捕捉プローブ］−［試料ＤＮＡ］−［標識プローブ］という構成で、標識プローブが捕捉されることになる。いずれの方法を用いるとしても、これらの方法で問題となるのは、標識プローブの標的塩基配列に依存しない固相への吸着である。標識プローブの非特異的な吸着は、感度の低下の最大の要因である。したがって、一般的には、ハイブリダイゼーション反応は、反応とはまったく無関係な塩基配列を持つキャリアーを多量に加えた中で行われる。また、反応後の洗浄を十分に行うことで、非特異的な吸着の影響を抑制するようにしている。しかし、これらの対策は必ずしも十分なものではない。
ハイブリダイズしなかった標識プローブとの分離を必要としない、核酸の分析方法も公知である。たとえば、１本鎖状態と２本鎖状態とでは蛍光標識によるシグナルに変化を生じることを応用したホモジニアスな検出方法が実用化されている。この方法は、バックグランドシグナルの影響を受けるために、高い感度を達成することが難しいという問題点があった。そのため、ＰＣＲなどによって予め増幅されたＤＮＡを分析対象とするのが一般的な利用方法である。
一方ゲノムプロジェクトの進展にともなって、単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰと省略する）の存在が注目されている。副作用を含む薬剤の治療効果の違いや、いろいろな疾患の素因の有無を、ＳＮＰによって説明できる可能性が推測されたためである。たとえば、薬剤の重篤な副作用がＳＮＰに基づく遺伝的な素因によって左右されていることが明らかになれば、副作用と関連しているＳＮＰを解析することでその薬剤の投与による事故を防ぐことが可能になる。ＳＮＰはゲノムの塩基配列における１塩基の多型である。３０億塩基におよぶヒトゲノムには、およそ１０００塩基ごとにＳＮＰが存在するといわれている。ＳＮＰは文字どおりゲノムにおける１塩基の相違を意味する。１塩基の相違を的確に検知するこには実際には高度な技術が求められる。互いに相補的な塩基配列を持つ核酸は、両者の塩基配列が完全に相補的でなくてもハイブリダイゼーションを起こすため、先に述べたようなハイブリダイゼーションアッセイで、１塩基の相違を直接検出することは困難とされている。
現在行われている既知のＳＮＰを検出する方法としては、たとえばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を挙げることができる。この方法は、電気泳動分離を必要とすることから、大量の検体の処理には不向きである。したがって、このような問題点の無い、新たなＳＮＰの検出方法の提供が待たれている。
ところで、特定の構造を持つ核酸が、相補的な塩基配列の間の水素結合とは異なる原理で、タンパク質などと特異的に結合する現象は既に知られている。この親和性を利用して、より親和性の大きい核酸分子をインビトロで選択するＳＥＬＥＸ法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）も公知である（Ｎａｔｕｒｅ ３５５，５６４−５６６，１９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダムな塩基配列を持つＲＮＡのライブラリーをリガンドに接触させ、リガンドに結合したものを回収してＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅精製物を鋳型とするＲＮＡを転写して再びリガンドに接触させる工程を繰り返すことによって、あるリガンドに結合親和性の高い核酸を得る方法である。しかし、このようにして選択された親和性を持つ核酸分子が、各種のハイブリダイゼーションアッセイに利用できることは知られていない。特に、わずかに１塩基の相違を識別することが求められるＳＮＰの検出への応用を示唆する報告はない。
発明の開示
本発明は、特定の塩基配列を持った標的塩基配列の検出において、新規なアイディアに基づいた原理の提案を課題としている。より具体的には、本発明者らが見出した、相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションとは異なる原理に基づいた核酸の結合親和性を標的塩基配列の検出方法に応用することが本発明の課題である。更に本発明は、この新規な原理に基づいて、ＳＮＰの検出方法の提供をも課題とする。加えて本発明は、このような核酸の検出方法に有用な、リガンドとの結合活性をもたらす新規な構造を持つ核酸の提供を課題とする。
本発明者らは、ＤＮＡに代表される核酸の構造とその核酸によってもたらされる種々の生化学的な活性を塩基配列特異的な新たな核酸の検出方法の原理として採用することができるのではないかと考えた。そして、核酸の低分子化合物に対する結合親和性が、特定の構造を構成する核酸の塩基配列に大きく依存し、たとえばわずかに１塩基の置換によって結合親和性が大きく変動することを確認した。本発明者らは、この知見に基づいて、核酸のリガンドに対する結合親和性をハイブリダイゼーションアッセイに応用することにより、より特異的な塩基配列の検出方法が実現できることを見出した。更に本発明者らは、リガンドとの結合活性に基づく核酸の検出方法によって、ＳＮＰの検出が可能となることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の核酸の検出方法、この検出方法のＳＮＰの検出への応用、そしてこれらの検出方法を可能とする新規な構造を持った核酸に関する。
〔１〕次の工程を含む標的塩基配列の存在を検出する方法。
ａ）標的塩基配列とプローブをハイブリダイゼーションさせ、リガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを生成する工程
ｂ）アプタマーの親和性を指標として標的塩基配列の存在を検出する工程
〔２〕標的塩基配列が単塩基多型を含み、プローブが標的塩基配列における単塩基の置換にともなってリガンドとの親和性が変動するものである〔１〕に記載の方法。
〔３〕標的塩基配列とのハイブリダイゼーションによって、リガンドとの結合親和性を獲得するプローブ。
〔４〕標的塩基配列とのハイブリダイズによって３本以上のステムが交差する構造を構成し、このステムが交差する位置でリガンドと結合する〔３〕に記載のプローブ。
〔５〕ステムの数が３本であり、ジャンクションを構成する３組の塩基対のうち少なくとも２組がＧ−Ｃ塩基対である〔４〕に記載のプローブ。
〔６〕各ステムが３塩基対以上の長さを持つ〔４〕に記載のプローブ。
〔７〕３本以上のステムを持ち、このステムが交差する位置でリガンドと結合する核酸アプタマー。
〔８〕〔４〕に記載のプローブからなる、標的塩基配列の検出用試薬。
あるいは本発明は、標的塩基配列とのハイブリダイズによってリガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを構成することができるオリゴヌクレオチドの、標的塩基配列の検出における使用に関する。
更に本発明は、標的塩基配列とのハイブリダイズによってリガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを構成することができるオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の選択方法、およびこの方法を実施するためのプログラムに関する。本発明の塩基配列の選択方法は、まず、標的塩基配列、およびオリゴヌクレオチドの塩基配列に含まれる相補的な塩基配列を探索し、１つめのステムが構成できるかどうかを確認する。１つ目のステムが構成できると判断された場合には、１つ目のステムの構成に必要な塩基配列を除く領域の塩基配列によって、更に２つ目、そして３つ目のステムが構成できるかどうかを評価する工程を含む。一方、本発明のプログラムは、これらのステップを実施するためのアルゴリズムで構成される。
本発明において、リガンドとの結合活性を持つ核酸を核酸アプタマーと記載する。核酸アプタマーとは、分子内、あるいは分子間に少なくとも１組の相補的な塩基配列を備え、この相補的な塩基配列のハイブリダイズによって構成された、リガンドとの親和性を有する核酸分子を言う。本発明における代表的な核酸アプタマーは、前記相補的な塩基配列のハイブリダイズによる２本鎖部分（ハイブリッド）と、ハイブリッドを形成しない１本鎖部分とで構成される。本発明における核酸アプタマーは、通常、前記１本鎖部分が水素結合、スタッキング、あるいは疎水性相互作用により、各アプタマーに固有の高次構造を形成する。高次構造の形成に特に重要な結合様式は、水素結合とスタッキングである。また前記水素結合の中で特に重要なのが、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型、Ｇ−カルテットなどの塩基対形成である。
核酸アプタマーのリガンドに対する結合親和性は、高次構造に依存している。したがって、たとえば核酸ハイブリッドを維持できない条件では、高次構造とならないため、結合親和性を失う。核酸アプタマーの高次構造は、一般に、ステム−ループ、ステム−バルジ、およびシュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）の３つのグループのいずれかに分類される。本発明における核酸アプタマーは、望ましくは相補的な塩基配列の近傍にループ、バルジ、あるいは非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対などの非ステム構造を形成する塩基配列を備え、この非ステム構造がリガンドとの結合部位、またはその一部を構成する。ここで非ステム構造とはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対からなるステム（Ｂ型ＤＮＡ）以外のすべての高次構造を指す。より具体的には、本発明における核酸アプタマーは、望ましくはステム−ジャンクション構造を有し、ジャンクション部分においてリガンドと結合する。ステム−ジャンクション構造は、ステムループとステムバルジの特徴を併せ持つ構造と言うことができる。
一方、本発明におけるリガンドとは、核酸アプタマーが有する立体構造によって結合される、核酸以外のあらゆる成分であることができる。具体的には、タンパク質のほか、様々な低分子化合物に対して結合親和性を有する核酸アプタマーが報告されている。以下にこれまでに報告された核酸アプタマーのリガンドをまとめた。
アミノ酸（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３６８０−３６８４，１９９３）
ヌクレオチド（Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５０−５５３，１９９３；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，６５６−６６５，１９９５）
コエンザイムＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，４６５３−４６６３，１９９８）
テオフィリン（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３，１４２５−１４２９，１９９４）
アミノグリコシド系抗生物質（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１２３３８−１２３４６，１９９６）
有機染料（Ｎａｔｕｒｅ ３５５，８５０−８５２，１９９２）
ポルフィリン誘導体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６９５１−６９２２，１９９６）
なお２本鎖の核酸に結合する蛋白質や色素が公知である。また２本鎖核酸に含まれるミスマッチを認識して結合するＭｕｔＳ等の蛋白質も知られている。本発明のリガンドは、１組の相補的な塩基配列のみによって構成される構造を認識するリガンドを含まない。これらのリガンドを結合する公知の核酸アプタマーは、本発明の核酸の検出方法に利用することができる。この他、後に述べるように本発明者らは核酸で構成されたスリーウエイジャンクションによって、コール酸がリガンドとして捕捉されることを確認した。図２に太字で示した塩基で構成される構造がスリーウエイジャンクション（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ、あるいはｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｍ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）である。「スリーウエイジャンクション」とは、３本の核酸鎖が相互に２本鎖を形成することによって、結果的に３つの２本鎖核酸が１ヶ所で交錯した構造を言う。すなわち、３本のステム（２本鎖）が１ヶ所で交差しており、６つの塩基による３組の相補塩基対がスリーウエイジャンクションを構成する。３本の核酸鎖は、ステムループ構造を伴った１本鎖核酸（図６ｂ）であっても良いし、あるいは３本の独立した核酸鎖によってスリーウエイジャンクションを構成することができる（図６ａ）。
更に１つのステムループを伴った１本鎖と、この鎖とは別の１本鎖とがハイブリダイズすることによって２つのステムを構成する構造（図６ａにおける３本鎖のうちの任意の２本がループを形成している状態）を想定することもできる。ｔＲＮＡなどでも類似の構造を取ることは公知であるが、ジャンクション部分にリガンドを捕捉することは、本発明者によって初めて見出された知見である。この新規な構造を持つ核酸アプタマーは、本発明による核酸の検出方法に利用することができる望ましい核酸アプタマーの一つである。
核酸アプタマーを標的塩基配列の検出に利用するには、標的塩基配列の有無によって核酸アプタマーの構造が変わり、リガンドとの結合親和性が変動するように設計する。たとえば先に述べた本発明者らが新たに見出したスリーウエイジャンクション構造によって構成される核酸アプタマーの場合は、リガンドの結合のためにはジャンクション部分の塩基対結合が３つとも完全に相補的でなければならない。更に、より高度な親和性を得るためには、ジャンクションを構成する３組の塩基対のうち、２組がＧ−Ｃ塩基対であることが望ましい。２組のうちの１組はプローブとして用意することができるので、残る１組を標的塩基配列中のＧ、またはＣに求めることになる。言いかえれば、本発明に基づいて標的塩基配列の検出を行う場合には、標的塩基配列中のＧまたはＣにおいてジャンクションが構成されるようにプローブを設計し、しかもプローブ側のジャンクションに相当する部分がＧ−Ｃ塩基対とするのが望ましいということができる。
あるいは標的塩基配列中のＧとＣが連続した部分、すなわちＧＧ、ＧＣ、ＣＧ、あるいはＣＣをジャンクション構成塩基とすることができる場合には、プローブ側のジャンクション構成塩基は、任意のワトソン−クリック塩基対とすることもできる。もちろん、可能であれば、ジャンクションを構成する３組の塩基対を全てＧ−Ｃ塩基対とすることによって、高度な親和性を確実に達成できることは言うまでも無い。
更に、ステム部分を構成する２本鎖も完全に相補的な方が、より高度な親和性をもたらすことがわかっている。一方、ループ部分の構成塩基は親和性にほとんど影響を与えない。したがって、標的塩基配列の存在によって、親和性の維持に必要な条件が満たされる（または満たされない）ときに、リガンドとの結合活性が標的塩基配列の指標となる。
具体的には、スリーウエイジャンクションを構成する３つのＤＮＡ鎖のいずれか１つを標的塩基配列とし、残る２本をプローブとして提供することにより、両者がハイブリダイズしたときにのみステムジャンクションが構成されるようにすることができる。たとえば１つのステムループと、その両端を構成する１本鎖部分に標的塩基配列とのハイブリダイズに必要な相補的な塩基配列を含むようなプローブは、標的塩基配列とのハイブリダイズによりスリーウエイジャンクションを与える。言いかえれば、１本鎖ＤＮＡの中心部分を構成する相補的な塩基配列が分子内で２本鎖を構成し、その両側に標的塩基配列に対する相補的塩基配列からなる１本鎖部分を持つＴ字型のプローブである。このような構成では、３本ステムループのループはプローブ側の１ヶ所にしか構成されない。しかしながら、実施例で確認しているように、３本ステムループ構造におけるループ部分の塩基はリガンドとの結合親和性に影響を与えない。したがって、リガンドとの結合親和性の獲得にはループは必ずしも必要ではない。
本発明において、標的塩基配列とのハイブリダイズによって核酸アプタマーを構成することができるプローブの望ましい構造を以下に示す。
プローブＡ：−［Ｔ１］＋［Ｃ］−［ｃ］＋［Ｔ２］−
プローブＢ：−［Ｔ１］＋［Ｃ］−、および−［ｃ］＋［Ｔ２］−
［Ｔ１］および［Ｔ２］は、標的塩基配列における隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である。［Ｃ］と［ｃ］とは相補的な塩基配列で構成される。なお＋は、＋の左右に示した領域の間に塩基の介在が許されないことを意味する。他方−で示した部分には任意の塩基配列の介在が許される。プローブＡに対して、プローブＢは、プローブＡにおける［Ｃ］−［ｃ］間の結合が無く、２つの異なるオリゴヌクレオチド分子でプローブを構成している。このような構造を有するプローブは、標的塩基配列の存在下で相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによって３つのステムが交差するジャンクションを構成する。
本発明においては、以下の構造を有するプローブを核酸アプタマーを構成するプローブとして用いることもできる。
−［Ｔ１］＋［Ｔ２］−
［Ｔ１］および［Ｔ２］は、標的塩基配列に含まれる、ステム構造を形成することができる相補的な塩基配列に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である。すなわち、標的塩基配列自身が１組の相補的な塩基配列を含んでおり、分子内でハイブリダイズすることができる構造を有する場合には、この相補的な塩基配列の３’側および５’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を、それぞれ［Ｔ１］および［Ｔ２］がハイブリダイズするための領域として選択することができる。
スリーウエイジャンクション構造の核酸アプタマーを利用して、標的塩基配列におけるＳＮＰの検出を行うには、検出すべきＳＮＰがちょうどスリーウエイジャンクションに相当するように、プローブを設計する。このような構成とすることによって、ＳＮＰの有無によってリガンドとの結合親和性がきわめて明瞭に変化するような反応系を構成することができる。本発明のスリーウエイジャンクション構造の核酸アプタマーの利用により、ジャンクション部分を構成する塩基対が完全に相補的である場合に比べて、ＳＮＰに伴って１組の塩基対にミスマッチが生じた場合のリガンドとの結合親和性が実質的に失われるような特徴的な構造を利用することができる。１塩基の相違によって、大きな結合親和性の違いをもたらす核酸アプタマーによって、高い正確性と感度が期待できる。
本発明においては、標的塩基配列とプローブとのハイブリダイゼーションは、リガンドとの結合親和性を指標として検出される。核酸アプタマーとリガンドとの結合には、公知のあらゆる結合分析の原理を応用することができる。以下に、いくつかの検出原理を具体的に説明する。
不均一系：
標識プローブと標的塩基配列とのハイブリダイズの結果として生じる核酸アプタマーを固相上のリガンドに捕捉することができる。固相に捕捉された（または液相に残った）標識プローブを検出することによって、標的塩基配列の検出が達成される。固相に標識プローブを捕捉する点で公知の核酸ハイブリダイゼーションアッセイと共通するが、固相との結合が相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションとは異なる原理に基づいていることから、より確実な洗浄条件を利用することができる。つまり、相補的塩基対結合には影響を与えない低いストリンジェンシーで洗浄しても、固相やリガンドと非特異的に吸着した標識プローブを十分に除去することができる条件を容易に設定することができる。その結果、バックグランドシグナルの低い特異的な検出が可能となる。
均一系：
蛍光物質と他の分子との結合によって、蛍光偏光が生じる現象が知られている。この現象を利用して、本発明による標的塩基配列の検出方法を均一系で実施することができる。すなわち、プローブまたはリガンドを蛍光標識しておき、核酸アプタマーとリガンドとの結合の結果生じる蛍光偏光を測定することによって、標的塩基配列の検出を行うことができる。蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネートなどが公知である。リガンドとして自身が蛍光を発する化合物を利用することもできる。たとえば核酸アプタマーによって結合される公知のリガンドの一つであるポルフィリン誘導体には、蛍光を発するものが多い。
表面プラズモン共鳴：
物質の結合を光学的に直接検出することができる表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）が公知である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーは金属薄膜近傍の媒質の屈折率の変化を測定することにより、生体分子の相互作用を測定する技術として知られている。ＳＰＲは、表面プラズモンが金属／液体界面（センサー表面）で励起した場合に起こり、試料と接触していない表面の側に光を当てて、そこから光を反射させると、ＳＰＲによって特定の組み合わせの角度および波長で反射光強度が低下する（ＳＰＲシグナル発生）。センサー表面に結合した分子により、表面層近くでの屈折率に変化が生じ、それがＳＰＲシグナルの変化として検出される。生体分子の相互作用により、屈折率とＳＰＲシグナルにさらなる変化が生じ、このシグナルの変化を検出することにより、生体分子の相互作用を測定することができる。本発明における核酸の検出方法では、核酸アプタマーによって捕捉されるリガンドを、チップ上に固定化することにより、標的塩基配列とプローブのハイブリダイゼーションによって生成する核酸アプタマーの量を、ＳＰＲシグナルの変化から測定することができる。標的塩基配列は、ＰＣＲのような増幅法によって得られた増幅生成物であっても良い。チップ上にリガンドを固定化する方法としては、アビジン‐ビオチン反応を利用することができるが、これに限定されない。ＳＰＲによれば、標識物質を用いることなくきわめて高感度な検出が可能となる。
本発明において標的塩基配列となる核酸分子とプローブは、両者のハイブリダイゼーションによって核酸アプタマーを生成することができるものであれば、どのような核酸分子、あるいはその誘導体であることもできる。具体的には、ＲＮＡやＤＮＡのような天然の、あるいは化学的に合成された核酸分子、合成ヌクレオチド誘導体で構成されたＡＡやＤＮＡの誘導体、あるいはバックボーンをペプチド結合やアルキル鎖で構成した誘導体等を示すことができる。これらの核酸分子、あるいはその誘導体は、生物試料に由来するもののほか、試料に由来する核酸分子を鋳型としてＰＣＲやＮＡＳＢＡ法のような核酸の酵素的な増幅反応によって得られた生成物であることもできる。
本発明の標的塩基配列の検出方法に必要なプローブやリガンドは、予め組み合わせてキットとして供給することができる。本発明に基づく標的塩基配列の検出方法には、標識を検出すために必要な試薬や、対照試料などを添えることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。
〔実施例１〕ＳＥＬＥＸ法によるコール酸に結合するＤＮＡアプタマーの選択
（１）コール酸と結合するＤＮＡアプタマーの選択の手順
コール酸と特異的に結合するＤＮＡアプタマーは、６４ヌクレオチドのランダムインサートを持つ１００ｍｅｒの１本鎖オリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−Ｎ６４−ＡＧＡＴＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＧ−３’；配列番号：１）（Ｎ６４は６４ヌクレオチドのランダム配列を示す）から成る１本鎖ＤＮＡプールから、ＳＥＬＥＸ法（Ｎａｔｕｒｅ ３５５，５６４−５６６，１９９０）により選択した。１本鎖ＤＮＡライブラリーには、約９ｘ１０１４の独立した配列が含まれる。１本鎖ＤＮＡはホスホアミデート法により合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製した。１００ｍｅｒのＤＮＡについては、逆相レジンを使用した固層抽出によって精製した。
各ラウンドでの選択は、以下のように行った。まず、６４ヌクレオチドのランダムインサートを持つ１００ｍｅｒの１本鎖オリゴヌクレオチドを、選択バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．６）中で、９５℃５分間により変性させ、徐々に室温まで冷やした。選択バッファー中の折りたたまれた１本鎖ＤＮＡ（最初のサイクルでは４５μｇ、その後のサイクルでは２−３μｇ）を、１０ｍｌ以上の選択バッファーで平衡化した５００μｌのコール酸アガロースカラム（ＳＩＧＭＡ製、２μｍｏｌコール酸／ｇ ｇｅｌ、以下選択カラムと記載する）へロードした。３０分間平衡化した後、カラムを、カラム容量の５から１０倍の選択バッファーで洗浄した。カラムに残った１本鎖ＤＮＡを、５ｍＭコール酸を含む選択バッファー１．５ｍｌで溶出して回収し、２０μｇ／ｍｌのグリコーゲンを含むエタノールで沈殿させた。５ｍＭコール酸で特異的に溶出させた１本鎖ＤＮＡの量は、収集フラクションの２６０ｎｍの波長の吸光度から算出した。この１本鎖ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
１０および１２ラウンドの選択においては、コール酸アガロースに代えてコール酸を結合したＡｆｆｉｇｅｌ １０２を用いた。異なる担体を利用することにより、コール酸アガロースのアミノヘキシルリンカーと結合する１本鎖ＤＮＡを除去することができる。Ａｆｆｉｇｅｌ １０２（ＢｉｏＲａｄ）上にはアミノエチルリンカーを介してコール酸を結合させた。Ａｆｆｉｇｅｌ １０２上にアミノエチルリンカーをコール酸を介して固定化する手順は以下の通りである。
３ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ １０２に対し、２０ｍｇのコール酸を、１０ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で１００ｍｇのＥＤＣを縮合剤として用いて結合させた。混合液を室温で１０時間、ときおり攪拌しながらインキュベーションした。Ａｆｆｉｇｅｌ １０２上のコール酸の濃度（８μｍｏｌ／ｍｌ ｇｅｌ）は、２，４，６−トリニトロベンゼン硫酸との反応によって決定した。コール酸で固定化したＡｆｆｉｇｅｌ １０２は３倍量Ａｆｆｉｇｅｌ １０２と混合し、おおよそ２μｍｏｌ／ｍｌのゲルになるように、カラム中のコール酸の濃度を調整した。
更に、アガロースそのものに結合する１本鎖ＤＮＡの混入を防ぐために、選択ラウンド５、６、７、および１３の後にカウンターセレクションを行った。すなわち、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＳＩＧＭＡ）対照カラムに１本鎖ＤＮＡをロードすることによって、アガロースマトリックスと結合した１本鎖ＤＮＡを除去した。
（２）ＰＣＲによる増幅
ＰＣＲプライマーは、５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＴ−３’（配列番号：２）、および５’−ＧＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−３’（配列番号：３）を用いた。１００μｌのＰＣＲ混合液には、１ｕｎｉｔのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、各々６０ｐｍｏｌのプライマー、各々２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、およびポリメラーゼ反応の精度を増すために０．４−０．８μｇのＰｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（大腸菌１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。ＰＣＲの反応サイクルは、９４℃３０秒、４６℃３０秒、７２℃３０秒で行った。増幅したビオチン化した２本鎖ＤＮＡを、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、１本鎖ＤＮＡを得るために、カラムに固定化したアビジンと結合させた。このようにして得た１本鎖ＤＮＡを、次のラウンドのインプットとして使用した。以上の操作を繰り返して、コール酸との結合親和性を有する１本鎖ＤＮＡを濃縮した。
（３）クローニングおよび塩基配列解析
選択ラウンド１３のライブラリーから増幅した２本鎖ＤＮＡのＰＣＲ産物を、ジデオキシ法によるシーケンシングのために、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製）へクローニングした。配列の相同性解析、および自由エネルギー最小化による１本鎖ＤＮＡの二次構造の推測をＭａｃＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ ｖ１．０プログラム（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）で行った。各配列クローン上で３つのステムを形成することができる相補配列の検索は、Ｃ言語で書いた独自のコンピュータープログラムによって行った。図９−図２１にこのコンピュータープログラムのソースコードを示した。更に、このコンピュータープログラムのアルゴリズムを以下にまとめる。
このアルゴリズムは、与えられた塩基配列が取りうる、全てのスリーウエイジャンクション構造を求めるものである。なおスリーウエイジャンクション構造とは、ステム１、ステム２、およびステム３が１箇所で交差した構造（たとえば図８）であることは先に述べたとおりである。このアルゴリズムは、相補的な塩基配列の検索を繰り返すことによって、まずステム１を構成する塩基配列の存在を明らかにする。次いでもしもステム１を構成できる場合には、残る領域によってステム２を構成しうる塩基配列の存在を探索する。ステム２も構成できた場合には、更に残された領域によってステム３を構成しうる塩基配列の探索を行う。各探索ステップは、以下の工程１）−３）によって行われる。
１）取り得るステム１を求める。
与えられた塩基配列の５’末端側から１塩基ずつ３’末端方向へ選んでいき、その塩基をステム１の開始位置ステム１ｂとみなして、ステム１が形成されうるかどうかを以下によって判断する。すなわち、ステム１ｂと相補的な塩基を、３’末端側から順次検索し、ステム１の終了位置ステム１ｅとする。ステム１ｂから３’末端方向へ「最低ステム長」の長さの塩基配列が、ステム１ｅから５’末端方向へ同じ長さの塩基配列と相補的になっていれば、ステム１は形成されたとみなす。「最低ステム長」は任意の数値であることができる。
２）取り得るステム２を以下のように求める。
ステム１を構成する領域を除く範囲の配列において、ステム２が形成されるかどうかを上記１）と同様に求める。ただし、ステム２のループ部分の長さは「最低ループ長」以上になっていることが条件である。さらに、ステム２の開始位置ステム２ｂとステム１の距離は「ギャップサイズ」以下であるようにステム２ｂを選ぶ。「最低ループ長」と「ギャップサイズ」は任意の数値であることができる。
３）最後に取り得るステム３を以下のように求める。
ステム１とステム２を構成する領域を除く範囲の配列において、ステム３が形成されるかどうかを上記２）と同様に求める。ただし、ステム３の開始位置ステム３ｂとステム２の距離およびステム３の終了位置ステム３ｅとステム１の距離が、前記「ギャップサイズ」以下であるようにステム３ｂおよびステム３ｅを選ぶ。
（４）実験結果
上記のようにして選択した最初のラウンドでは、ロードした１本鎖ＤＮＡの１％以下が、選択カラムに保持された。その後のラウンドでは、コール酸に結合した１本鎖ＤＮＡの量が顕著に増大し、選択の１３ラウンド以後は、ロードした１本鎖ＤＮＡの約７０％がカラムに保持され溶出した（図１）。
１３ラウンドの後、コール酸の結合に関与する共通モチーフ配列を決めるため１９クローンの塩基配列を決定した。１９クローンの配列は全て異なっており、ＭａｃＤＮＡＳＩＳプログラムを利用した一次配列相同性解析からは、はっきりした相同性は見られなかった。しかし、表１で示すように、二次構造であるスリーウエイジャンクションを形成すると推測される配列が見られた。表１中の塩基配列において、３組のスリーウエイ領域（２本鎖を構成する領域）を、それぞれ、アンダーライン、太字、そして中抜きの文字で示した。イタリックで示したのは、ステム領域におけるミスマッチ、あるいはｗｏｂｂｌｅ（Ｔ−Ｇ）を示している。
表１における各塩基配列の配列番号は以下の通りである。
ａ）Ｃｌｏｎｅ−１： 配列番号：８
Ｃｌｏｎｅ−２： 配列番号：９
Ｃｌｏｎｅ−５： 配列番号：１０
Ｃｌｏｎｅ−７： 配列番号：１１
Ｃｌｏｎｅ−９： 配列番号：１２
Ｃｌｏｎｅ−１１： 配列番号：１３
ｂ）Ｃｌｏｎｅ−３： 配列番号：１４
Ｃｌｏｎｅ−４： 配列番号：１５
Ｃｌｏｎｅ−６： 配列番号：１６
Ｃｌｏｎｅ−８： 配列番号：１７
Ｃｌｏｎｅ−１０： 配列番号：１８
Ｃｌｏｎｅ−１２： 配列番号：１９
Ｃｌｏｎｅ−１３： 配列番号：２０
Ｃｌｏｎｅ−１４： 配列番号：２１
Ｃｌｏｎｅ−１５： 配列番号：２２
Ｃｌｏｎｅ−１６： 配列番号：２３
Ｃｌｏｎｅ−１７： 配列番号：２４
Ｃｌｏｎｅ−１８： 配列番号：２５
Ｃｌｏｎｅ−１９： 配列番号：２６
〔実施例２〕各種ＤＮＡアプタマーの欠失変異体を用いた、コール酸との結合モチーフ配列の探索
（１）解離定数の決定法
コール酸の１本鎖ＤＮＡとの親和性を、イクイブリウム フィルトレーション法（ｔｈｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１４２５−１４２９，１９９４）によって解析した。コール酸を、選択バッファー（２００μｌ）中のＤＮＡサンプルへ、終濃度が５０μＭとなるように加えた。各結合混合液を２５℃で５分間インキュベーションした。次に混合液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍｉｃｏｎ）へ移し、８５０ｘｇで１５分間遠心した。この操作によって１本鎖ＤＮＡと結合していないコール酸が濾液として回収される。濾液２０μｌから３０μｌ中のコール酸の濃度を、ｐ−ニトロテトラゾリウム青色色素、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む３αヒドロキシステロイド、ジアホラーゼを利用した診断キット（ＷＡＫＯ ｃｈｅｍｉｃａｌ）で定量的に測定した。各１本鎖ＤＮＡサンプルでは、結合したコール酸の濃度（Ｃｂ）を、濾液および保持液中のコール酸の濃度の違いに基づいて以下の式（式１）により決定した。
Ｃｂ（μＭ）＝Ｃｒ−Ｃｆ＝（１００００−Ｖｆ×Ｃｆ）／（２００−Ｖｆ）−Ｃｆ
Ｖｆ（μｌ）は濾液の容量、ＣｒおよびＣｆ（μＭ）は、濾液および保持液中のコール酸の濃度を表す。更に平衡解離定数（Ｋｄ）を、以下の標準二次結合式（式２）により計算した。
Ｃｂ＝（１／２）｛Ｄｔ＋５０＋Ｋｄ−［（Ｄｔ＋５０＋Ｋｄ）２−２００Ｄｔ］１／２｝
Ｄｔは１本鎖ＤＮＡの全濃度を表す。
（２）各種ＤＮＡアプタマー欠失体の、コール酸との親和性（結合定数）の測定
コール酸との結合に必要な最短配列を決定するために、クローン１、および２について、全長アプタマーの５’末端および３’末端から１以上のヌクレオチドが欠失した、欠失体シリーズを作製した。選択カラムへ、０．５ｎｍｏｌのクローン１、クローン２、およびそれらの各欠失体シリーズを加え、５ｍＭコール酸により選択カラムから特異的に溶出した１本鎖ＤＮＡの量を測定した（クローン１の７５％、クローン２の７７％が特異的に溶出した）。次に、３９ｍｅｒのクローン１の欠失体ｃｈ１−３９（５’−ＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣ−３’；配列番号：４）、および３８ｍｅｒのクローン２の欠失体ｃｈ２−３８（５’−ＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＣ−３’；配列番号：５）を用いた実験から、これらの欠失体が、コール酸との結合に必要な最短配列であることが分かった。ｃｈ１−３９の２２％、ｃｈ２−３８の４０％が選択カラムから溶出したのに対し、さらに配列の短い欠失体では、溶出が見られなかった。興味深いことに、ＭａｃＤＮＡＳＩＳプログラムによって推測したクローン１および２の二次構造は、４ｂｐ以上の３つのステムが結合した構造をしており、ｃｈ１−３９およびｃｈ２−３８は、このスリーウエイジャンクション（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）領域を含んでいた（図２）。
次に、この領域の正常な配列を有するクローン１および２の欠失体を用意し、それぞれｃｈ１−４７（５’−ＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ−３’；配列番号：６）、ｃｈ２−４０（５’−ＡＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＣＴ−３’；配列番号：７）と名付けた。これらの欠失体を用いて、コール酸との親和性を調べた（図３）。その結果、これらの欠失体は、完全長クローンの選択カラムに対する親和性と、ほぼ同じ親和性を示した（それぞれ、７０％および７３％）。式１、２および図３の結果から、コール酸に対する解離定数は、ｃｈ１−４７が３１．０μＭ、ｃｈ２−４０が１９．６μＭと決定した。さらに、完全長の配列を持つ他の１７個のクローンの推定二次配列では、４つのクローン（クローン５、７、９、および１１）についてｃｈ２−４０と類似したスリーウエイジャンクションを含んでいた（図４）。これらの４クローンの正常なスリーウエイジャンクション領域を含む欠失体ｃｈ５−６３、ｃｈ７−６９、ｃｈ９−４８、ｃｈ１１−７６を用意し、コール酸に対する解離定数を測定した（表２）。
クローン５および９のスリーウエイジャンクション領域の５’末端および３’末端から２、３のヌクレオチドの欠失により、完全に選択カラムに対する親和性を失った。
クローン１１の推定二次構造は、他の５つのクローンよりも複雑であった。スリーウエイジャンクション領域以外の領域を欠失したクローン１１の３５ｍｅｒの欠失体を用意し、コール酸に対する解離定数を決定した。その結果、解離定数は７６．８μＭであり、７６ｍｅｒの欠失体の解離定数（５２．１μＭ）に匹敵するものであった。
上記の６つのクローンの推定スリーウエイジャンクション構造を比較することによって、２つの共通点が明らかとなった。すなわち、第一に３つのステムおよび、２つのループはそれぞれ４塩基対および４塩基以上から構成されていることが高い親和性をもたらす。第２に、ジャンクション近傍の３塩基対を、２または３対のＧＣ塩基対で構成することが親和性を高める。
さらに、他の１３のクローンの配列を、前記アルゴリズムに基づくコンピュータープログラムによって解析した。プログラムによる解析条件は次のとおりである。まず最低ステム長２、最低ループ長４、ギャップサイズ０、の条件で各配列を検索した。条件を満たす塩基配列のうち、ジャンクションの部分に２つ以上のＧＣ塩基対を含み、なおかつ各ステム長が３塩基対以上になるスリーウエイジャンクションを目で見て（つまりプログラムを使わずに）選択した。このとき、ステムにはミスマッチが含まれていてもよいものとする。つまり、ｃｈ１−４７の様に、ステム中のジャンクションから３番目以降の塩基対にミスマッチが含まれてもよいものとした。この場合、ミスマッチはステム長としてカウントしない。すなわち、ミスマッチを除いて、各ステム長が３塩基対以上になるものを選び出した。その結果、１２のクローンがスリーウエイジャンクション構造を有する配列を含んでおり、それぞれ３塩基対以上のステムが見られ、さらに２または３対のＧＣ塩基対が、ジャンクションの近傍に存在していた。残りの１クローンも３つのステムのうち１つのステムが、２塩基対ではあるものの、スリーウエイジャンクション構造を有する配列を含んでいた。正常なスリーウエイジャンクション領域を含むこれらの１３クローンの欠失体を作製し、コール酸に対する親和性を調べた。これらの１３クローンの欠失体の塩基配列および前記６クローンの欠失体の塩基配列を、表３に示す。これらの塩基配列は、表１の塩基配列においてアンダーラインではさんだ部分に相当する。
１３クローンの欠失体のコール酸に対する解離定数を表４に示す。すべての欠失体がコール酸と結合した。
結果的に、配列を決定した１９のクローン全てが、共通の二次構造であるスリーウエイジャンクションの形成が推測されるコール酸結合配列を有していた。
〔実施例３〕１塩基および１塩基対変異による、コール酸との結合親和性に及ぼす影響
（１）ステムまたはループ上の置換が親和性に及ぼす影響
選択したクローンの推定スリーウエイジャンクション構造の形成、およびコール酸との結合に必要な、重要な構成要素を決定するために、クローン２のスリーウエイジャンクション領域を有する欠失体ｃｈ２−４０について、変異体解析を行った。１塩基および１塩基対置換、もしくは１塩基欠失または挿入のあるｃｈ２−４０変異体のシリーズを合成し、これらの変異体の、コール酸に対する相対結合親和性を、「ｔｈｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ」によって評価した。図５ａは、欠失体ｃｈ２−４０上の１塩基を、図の矢印で示す塩基に置換した場合の結合親和性を示す。図５ｂは、ｃｈ２−４０上のスリーウエイジャンクションのステム部分を形成する１組の塩基対を、図の矢印で示す塩基対に置換した場合の結合親和性を示す。
図５ａで示すように、３つのステム上の塩基対置換では、Ｇ‐ＣからＡ‐Ｔ塩基対への置換により、相対結合親和性が６５．３％（Ｃ６−Ｇ２１からＴ６−Ａ２１）減少したが、それでも親和性は見られた。対照的に、ジャンクションの周囲のいくつかの１塩基置換では、結合親和性を完全に失った（図５ｂ；Ｇ４からＣ４、Ｃ６からＧ６、Ａ２２からＴ２２、Ｇ３６からＣ３６への置換）。１塩基置換と１塩基対置換との結合親和性への影響を比較すると、推定される二次構造中のワトソン‐クリック塩基対を構成できない１塩基置換では、塩基対置換よりも結合親和性が顕著に減少した。
これらの結果から、推定される二次構造の形成が裏付けられ、スリーウエイジャンクションの形成が、親和性の維持にとって非常に重要であることが示唆された。ｃｈ２−４０欠失体のジャンクションの周囲の１塩基置換および１塩基対置換では、結合親和性が顕著に減少したが、ｃｈ２−４０の５’末端および３’末端、もしくは２つのループ上の１塩基置換および１塩基対置換では、結合親和性の減少は見られなかった。さらに、２つのループ上の１塩基置換、Ａ１２およびＡ２８の欠失、Ａ１２とＣ１３との間、またはＡ２８とＴ２９との間へのアデノシンの挿入では、ほとんど結合親和性に影響を及ぼさなかった。１９のクローンには、配列の類似性は見られず、ステムおよびループ領域の長さも同一ではないことから、コール酸との結合部位は、３つのステムのジャンクションであることが示唆された。
（２）ジャンクション上の３つの塩基対の置換が親和性に及ぼす影響
そこで、選択した１９クローンのジャンクション上の３つの塩基対の多様性、および配置に注目した。これらのクローンのジャンクションは、２つのＧ‐Ｃおよび１つのＡ‐Ｔ、または３つのＧ‐Ｃから構成されていた（それぞれ、２Ｇ‐Ｃ、３Ｇ‐Ｃジャンクションと呼ぶ）（図６ａ）。図６ｂに２Ｇ‐Ｃジャンクションの例としてｃｈ９−４８を、３Ｇ‐Ｃジャンクションの例としてｃｈ１６−４０を示す。選択した１９のクローンのうち、９クローンが２Ｇ‐Ｃジャンクションを有しており、他の１０クローンは、３Ｇ‐Ｃジャンクションを有していた。３Ｇ‐Ｃジャンクションの３塩基対の配置を比較すると、１０クローンのうち９クローンは同じ配置だった。２Ｇ‐Ｃジャンクションを有する９クローンのうち、６クローンは、同じ配置をしており、残りの３クローンはそれぞれ異なった配置をしていた。
ジャンクション上の３つの塩基対の、相互作用にとっての構造上の必要性を評価するために、最も低いＫｄ値を示すクローン９、および１６の正常なスリーウエイジャンクション領域を有する欠失体であるｃｈ１６−４０およびｃｈ９−４８について、ジャンクション上の塩基対の置換を行った。１塩基対を置換したｃｈ１６−４０、およびｃｈ９−４８の、コール酸に対する相対結合親和性を表５に示す。表中の数字は、塩基対置換前の結合親和性を１００とした時の相対的な親和性（％）を表す。
興味深いことに、ワトソン‐クリック塩基対を形成する置換では、親和性を失わなかったが、ミスマッチの塩基対となる置換では、完全に親和性を失った。３つのワトソン‐クリック塩基対を形成する６つのヌクレオチドについて、ＣＰＫモデルを構築することにより、内径が１２から１７Åの穴を有するシクロファン（ｃｙｃｌｏｐｈａｎｅ）様の、３つのプリン塩基、および３つのピリミジン塩基からなる環状構造体を形成し得ることが示された。さらに、この穴の形状およびサイズは、およそ１５Åのサイズのコール酸が入り込むのに適している。なおＣＰＫモデル（Ｃｏｒｅｙ−Ｐａｕｌｉｎｇ−ｋｏｌｔｕｎ ｓｐａｃｅ ｆｉｌｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌ）とは、分子模型のうちの空間実体模型の一種である。米国の国立衛生研究所（ＮＩＨ）の原子模型委員会がＣｏｒｅｙ−Ｐａｕｌｉｎｇの分子模型を改良して商品化した。
いくつかの例外は見られるものの、ワトソン‐クリック塩基対への置換は、結合親和性に対し影響を与えない。Ｇ‐ＣからＡ−Ｔへの置換では、結合親和性が減少した（Ｃ５−Ｇ３６からＴ５−Ａ３６；５６．１％，Ｃ６−Ｇ２１からＴ６−Ａ２１；３４．７％）が、Ａ−ＴからＧ−Ｃへの置換では、結合親和性の減少はほとんど見られなかった（Ｔ２２−Ａ３５からＣ２２−Ｇ３５；９５．２％）。これらの結果は、選択した１９のクローンの特徴が、２または３Ｇ‐Ｃであり、１Ｇ‐ＣまたはＧＣ塩基対のないジャンクションが見られなかったことと一致する。
〔実施例４〕２分子で構成した本発明によるＤＮＡアプタマーの親和性
標的塩基配列とプローブの２分子で構成される本発明によるアプタマーにおいて、スリーウエイジャンクションを構成する塩基配列の変異によって生じるリガンドとの親和性の変化を観察した。すなわち次の塩基配列からなる標的塩基配列とプローブをハイブリダイズさせたスリーウエイジャンクション構造の、コール酸に対する親和性をＳＰＲによって測定した。標的塩基配列とプローブを各５μＭ混合し、実施例１−（１）と同じ条件で熱変性させた。コール酸を固定化したＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）のセンサーチップに２０μｌのプローブ−標的塩基配列溶液をロードした場合、６００ＲＵ（ＲＵ＝レゾナンズユニット）のＳＰＲシグナルの変化が得られた。それに対して、標的塩基配列に一塩基変異を導入した場合（標的塩基配列の下線部分の配列がＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ）、ＳＰＲのシグナル変化はまったく得られなかった。この組み合わせに限らず、ジャンクションに隣接する塩基対にミスマッチを導入した場合には、結合親和性が検出されなくなった。標的塩基配列の配列／配列番号：２７（小文字はプローブの相補鎖で、スペースを挟んだ塩基の部分にジャンクションが位置する）
プローブ（ＣＨ３Ｊ−１−１００）の配列／配列番号：２８（小文字が標的塩基配列の相補鎖）
次に、実施例２（１）のＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄにより、コール酸、プローブ、標的塩基配列、各５０μＭの条件で、コール酸のプローブ−標的塩基配列複合体への結合量を測定した。使用した標的塩基配列およびプローブの塩基配列を以下に示す。
標的塩基配列の配列／配列番号：２９
プローブの配列／配列番号：３０（小文字が標的塩基配列の相補鎖）
測定の結果、結合量は３６．６μＭだった（ｃｈ２−４０の場合，同条件で結合量２７．８μＭ）。これに対して、１塩基変異を導入した標的塩基配列（５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣｃＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’；配列番号：３１、小文字が変異）の場合、同条件でコール酸は全く結合しなかった（結合量０μＭ）。
〔実施例５〕化学的修飾によるアプタマーの二次構造の評価
（１）四酸化オスミウムによるチミンの化学的修飾
アプタマーの二次構造および相互作用に関与する塩基を評価するため、酸化剤である四酸化オスミウムを用いて、ｃｈ９−４８の化学修飾の実験を行った。四酸化オスミウムは、ピリジン存在下で１本鎖の状態のチミンと選択的に反応する（Ｆｕｒｌｏｎｇ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，２００９−２０１７，１９８９）。この選択性は、チミンのＣ５，６二重結合を攻撃する四酸化オスミウムの活性によるものと考えられている（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．，３，１−２５，１９９０）。オスミル化部位は、アルカリ処理により切断することができる。
３’−ＦＩＴＣでラベルした５μＭのｃｈ９−４８、またはｃｈ９−４８−Ｃ６を、５ｍＭコール酸を添加した、または添加しない１ｍＭ四酸化オスミウム、３％ピリジンから成る１００μｌの結合バッファーで、２０℃で１５分間インキュベートした。このとき熱変性により１本鎖にするために、コントロールは８０℃でインキュベートした。引き続き２回のエタノール沈殿を行い、反応を停止させた。アプタマーを、１５μＬの１Ｍピペリジンで９０℃、３０分間処理し、オスミニウム酸塩付加化合物のサイト（１本鎖状態にあるＴ）を切断した。１５μｌのホルムアミドローディングバッファーの添加後、切断した産物を、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル（１９％，１量体：２量体の比が１９：１）上で電気泳動した。泳動系は、９０ｍＭトリスホウ酸塩（ｐＨ８．０）および２ｍＭ ＥＤＴＡから構成される。ゲルをスキャンし、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５を使用して解析した。結果を図７に示す。
（２）実験結果
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真を図７に示す。２０℃で結合バッファーを使用した折り畳まれる条件でのｃｈ９−４８の修飾パターンは、推定二次構造（図８）と非常に良く一致した。ジャンクションの近傍のＴ４３で、強い修飾が見られ、ループ状の領域のＴもまた、反応性に富んでいた。ステム領域のＴは、Ｔ２３およびＴ４６を除いて効率的に保護されていた。Ｔ２３は、ステムの末端に位置することから反応性に富み、Ｔ４６は、ループを欠く短いステム構造の不安定性により反応性に富むものと考えられる。ｃｈ９−４８の６番目のＧがＣへの置換によりコール酸と結合しない変異体のｃｈ９−４８−Ｃ６を用意し、ｃｈ９−４８と修飾パターンを比較した。コール酸存在下では、ｃｈ９−４８の分岐点のＴ４３の修飾の度合いは、４０％以下に減少した。対照的にｃｈ９−４８−Ｃ６では、Ｔ４３の反応性は、コール酸により僅かに抑制された。このことから、ｃｈ９−４８上のＴ４３は、直接コール酸との結合に関与しているものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明は、核酸アプタマーの形成を利用した新規な標的塩基配列の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、１塩基のミスマッチに基づいてリガンドとの結合親和性が大きく変化する核酸アプタマーの利用によって、ＳＮＰの特異的な検出を可能とする。１塩基のミスマッチによって、これほど明確な変化をもたらす検出原理はこれまでに知られていない。
一方、本発明は、本発明の標的塩基配列の検出方法に有用な、新規な構造の核酸アプタマーを合わせて提供する。スリーウエイジャンクションにコール酸などのリガンドを捕捉する本発明の核酸アプタマーは、３つのジャンクション部分の３つの塩基対のいずれか一つでもミスマッチとなるとリガンドとの結合親和性を失う。したがって、スリーウエイジャンクションからなる核酸アプタマーは、本発明をＳＮＰの検出に応用するときにきわめて好適な核酸アプタマーと言うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、各選択ラウンドで溶出された１本鎖ＤＮＡのパーセンテージを示すグラフ。縦軸がロードしたＤＮＡに対する溶出ＤＮＡのパーセンテージを、横軸がラウンド数を示す。
図２は、クローン１とクローン２の予測される二次構造を示す図。各クローンのコール酸との結合に必要な最短配列を含む欠失変異体であるｃｈ−１−３９とｃｈ２−３８の塩基配列をイタリックで示した。また、スリーウエイジャンクション領域を完全に保持した欠失変異体であるｃｈ１−４７とｃｈ２−４０を構成する塩基配列は、中抜きの文字で示した。
図３は、ｃｈ１−４７（○）とｃｈ２−４０（□）のコール酸に対する結合曲線を示すグラフ。縦軸は１本鎖ＤＮＡに結合したコール酸の濃度（μＭ）、横軸は１本鎖ＤＮＡ濃度（μＭ）の対数を示す。
図４は、クローン５、７、９、および１１のスリーウエイジャンクション領域を含む欠失変異体に予測される２次構造を示す図。矢印は、クローン５とクローン９がコール酸固定化カラムに結合するために必要な最短の塩基配列を示す。
図５は、ｃｈ２−４０の変異解析結果を示す図。塩基対置換（ａ）、１塩基置換（ｂ）、あるいは欠失と挿入（ａ）を、ｃｈ２−４０に導入した。置換あるいは欠失させる塩基を、太字で示した。矢印は、置換あるいは欠失させる塩基と、変異を伴わない状態のｃｈ２−４０に対する変異体の親和性のパーセンテージを示している。
図６は、２Ｇ−Ｃジャンクションおよび３Ｇ−Ｃジャンクションの構造を示す図。（ａ）は、各ジャンクションの構造の模式図を示す。（ｂ）は、各ジャンクションの一例としてｃｈ９−４８、およびｃｈ１６−４０の場合を示す。
図７は、ｃｈ９−４８およびｃｈ９−４８−Ｃ６の四酸化オスミウムによるチミンの修飾を示す写真。
レーン１：変性させて１本鎖としたコントロール
レーン２：ｃｈ９−４８、コール酸なし
レーン３：ｃｈ９−４８、コール酸添加
レーン４：ｃｈ９−４８−Ｃ６、コール酸なし
レーン５：ｃｈ９−４８−Ｃ６、コール酸添加
レーン６：ｃｈ９−４８のマキサムギルバートＡ＋Ｇラダー
図８は、ｃｈ９−４８の推定二次構造を示す図。チミン（Ｔ）を太字で表す。
図９−図２１は、本発明の核酸アプタマーを形成することができる塩基配列を選択するための、実施例で使用したソフトウエアのソースコードである。
本発明は、試料中に存在する特定の塩基配列（以下、標的塩基配列という）の検出方法に関する。
背景技術
核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。またＰＣＲのような塩基配列を増幅する方法が応用できることから、例えば培養のような時間と手間のかかる操作無しでも高感度な検出が可能となる場合もある。
相補的な塩基配列のハイブリダイゼーションを検出するために、様々な方法が報告されている。もっとも基本的な反応原理は、サザンブロットアッセイとして広く利用されている。この方法は、試料ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに固定し、これを標識プローブと反応させる方法である。試料ＤＮＡ中にプローブと相補的な塩基配列が存在すれば、標識プローブはハイブリダイゼーションによってニトロセルロースフィルターに捕捉される。試料ＤＮＡの固定操作を省くために、捕捉用のプローブを利用することもできる。この場合は、固相側から順に［固相］−［捕捉プローブ］−［試料ＤＮＡ］−［標識プローブ］という構成で、標識プローブが捕捉されることになる。いずれの方法を用いるとしても、これらの方法で問題となるのは、標識プローブの標的塩基配列に依存しない固相への吸着である。標識プローブの非特異的な吸着は、感度の低下の最大の要因である。したがって、一般的には、ハイブリダイゼーション反応は、反応とはまったく無関係な塩基配列を持つキャリアーを多量に加えた中で行われる。また、反応後の洗浄を十分に行うことで、非特異的な吸着の影響を抑制するようにしている。しかし、これらの対策は必ずしも十分なものではない。
ハイブリダイズしなかった標識プローブとの分離を必要としない、核酸の分析方法も公知である。たとえば、１本鎖状態と２本鎖状態とでは蛍光標識によるシグナルに変化を生じることを応用したホモジニアスな検出方法が実用化されている。この方法は、バックグランドシグナルの影響を受けるために、高い感度を達成することが難しいという問題点があった。そのため、ＰＣＲなどによって予め増幅されたＤＮＡを分析対象とするのが一般的な利用方法である。
一方ゲノムプロジェクトの進展にともなって、単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰと省略する）の存在が注目されている。副作用を含む薬剤の治療効果の違いや、いろいろな疾患の素因の有無を、ＳＮＰによって説明できる可能性が推測されたためである。たとえば、薬剤の重篤な副作用がＳＮＰに基づく遺伝的な素因によって左右されていることが明らかになれば、副作用と関連しているＳＮＰを解析することでその薬剤の投与による事故を防ぐことが可能になる。ＳＮＰはゲノムの塩基配列における１塩基の多型である。３０億塩基におよぶヒトゲノムには、およそ１０００塩基ごとにＳＮＰが存在するといわれている。ＳＮＰは文字どおりゲノムにおける１塩基の相違を意味する。１塩基の相違を的確に検知するこには実際には高度な技術が求められる。互いに相補的な塩基配列を持つ核酸は、両者の塩基配列が完全に相補的でなくてもハイブリダイゼーションを起こすため、先に述べたようなハイブリダイゼーションアッセイで、１塩基の相違を直接検出することは困難とされている。
現在行われている既知のＳＮＰを検出する方法としては、たとえばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を挙げることができる。この方法は、電気泳動分離を必要とすることから、大量の検体の処理には不向きである。したがって、このような問題点の無い、新たなＳＮＰの検出方法の提供が待たれている。
ところで、特定の構造を持つ核酸が、相補的な塩基配列の間の水素結合とは異なる原理で、タンパク質などと特異的に結合する現象は既に知られている。この親和性を利用して、より親和性の大きい核酸分子をインビトロで選択するＳＥＬＥＸ法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）も公知である（Ｎａｔｕｒｅ ３５５，５６４−５６６，１９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダムな塩基配列を持つＲＮＡのライブラリーをリガンドに接触させ、リガンドに結合したものを回収してＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅精製物を鋳型とするＲＮＡを転写して再びリガンドに接触させる工程を繰り返すことによって、あるリガンドに結合親和性の高い核酸を得る方法である。しかし、このようにして選択された親和性を持つ核酸分子が、各種のハイブリダイゼーションアッセイに利用できることは知られていない。特に、わずかに１塩基の相違を識別することが求められるＳＮＰの検出への応用を示唆する報告はない。
発明の開示
本発明は、特定の塩基配列を持った標的塩基配列の検出において、新規なアイディアに基づいた原理の提案を課題としている。より具体的には、本発明者らが見出した、相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションとは異なる原理に基づいた核酸の結合親和性を標的塩基配列の検出方法に応用することが本発明の課題である。更に本発明は、この新規な原理に基づいて、ＳＮＰの検出方法の提供をも課題とする。加えて本発明は、このような核酸の検出方法に有用な、リガンドとの結合活性をもたらす新規な構造を持つ核酸の提供を課題とする。
本発明者らは、ＤＮＡに代表される核酸の構造とその核酸によってもたらされる種々の生化学的な活性を塩基配列特異的な新たな核酸の検出方法の原理として採用することができるのではないかと考えた。そして、核酸の低分子化合物に対する結合親和性が、特定の構造を構成する核酸の塩基配列に大きく依存し、たとえばわずかに１塩基の置換によって結合親和性が大きく変動することを確認した。本発明者らは、この知見に基づいて、核酸のリガンドに対する結合親和性をハイブリダイゼーションアッセイに応用することにより、より特異的な塩基配列の検出方法が実現できることを見出した。更に本発明者らは、リガンドとの結合活性に基づく核酸の検出方法によって、ＳＮＰの検出が可能となることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の核酸の検出方法、この検出方法のＳＮＰの検出への応用、そしてこれらの検出方法を可能とする新規な構造を持った核酸に関する。
〔１〕次の工程を含む標的塩基配列の存在を検出する方法。
ａ）標的塩基配列とプローブをハイブリダイゼーションさせ、リガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを生成する工程
ｂ）アプタマーの親和性を指標として標的塩基配列の存在を検出する工程
〔２〕標的塩基配列が単塩基多型を含み、プローブが標的塩基配列における単塩基の置換にともなってリガンドとの親和性が変動するものである〔１〕に記載の方法。
〔３〕標的塩基配列とのハイブリダイゼーションによって、リガンドとの結合親和性を獲得するプローブ。
〔４〕標的塩基配列とのハイブリダイズによって３本以上のステムが交差する構造を構成し、このステムが交差する位置でリガンドと結合する〔３〕に記載のプローブ。
〔５〕ステムの数が３本であり、ジャンクションを構成する３組の塩基対のうち少なくとも２組がＧ−Ｃ塩基対である〔４〕に記載のプローブ。
〔６〕各ステムが３塩基対以上の長さを持つ〔４〕に記載のプローブ。
〔７〕３本以上のステムを持ち、このステムが交差する位置でリガンドと結合する核酸アプタマー。
〔８〕〔４〕に記載のプローブからなる、標的塩基配列の検出用試薬。
あるいは本発明は、標的塩基配列とのハイブリダイズによってリガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを構成することができるオリゴヌクレオチドの、標的塩基配列の検出における使用に関する。
更に本発明は、標的塩基配列とのハイブリダイズによってリガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを構成することができるオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の選択方法、およびこの方法を実施するためのプログラムに関する。本発明の塩基配列の選択方法は、まず、標的塩基配列、およびオリゴヌクレオチドの塩基配列に含まれる相補的な塩基配列を探索し、１つめのステムが構成できるかどうかを確認する。１つ目のステムが構成できると判断された場合には、１つ目のステムの構成に必要な塩基配列を除く領域の塩基配列によって、更に２つ目、そして３つ目のステムが構成できるかどうかを評価する工程を含む。一方、本発明のプログラムは、これらのステップを実施するためのアルゴリズムで構成される。
本発明において、リガンドとの結合活性を持つ核酸を核酸アプタマーと記載する。核酸アプタマーとは、分子内、あるいは分子間に少なくとも１組の相補的な塩基配列を備え、この相補的な塩基配列のハイブリダイズによって構成された、リガンドとの親和性を有する核酸分子を言う。本発明における代表的な核酸アプタマーは、前記相補的な塩基配列のハイブリダイズによる２本鎖部分（ハイブリッド）と、ハイブリッドを形成しない１本鎖部分とで構成される。本発明における核酸アプタマーは、通常、前記１本鎖部分が水素結合、スタッキング、あるいは疎水性相互作用により、各アプタマーに固有の高次構造を形成する。高次構造の形成に特に重要な結合様式は、水素結合とスタッキングである。また前記水素結合の中で特に重要なのが、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型、Ｇ−カルテットなどの塩基対形成である。
核酸アプタマーのリガンドに対する結合親和性は、高次構造に依存している。したがって、たとえば核酸ハイブリッドを維持できない条件では、高次構造とならないため、結合親和性を失う。核酸アプタマーの高次構造は、一般に、ステム−ループ、ステム−バルジ、およびシュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）の３つのグループのいずれかに分類される。本発明における核酸アプタマーは、望ましくは相補的な塩基配列の近傍にループ、バルジ、あるいは非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対などの非ステム構造を形成する塩基配列を備え、この非ステム構造がリガンドとの結合部位、またはその一部を構成する。ここで非ステム構造とはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対からなるステム（Ｂ型ＤＮＡ）以外のすべての高次構造を指す。より具体的には、本発明における核酸アプタマーは、望ましくはステム−ジャンクション構造を有し、ジャンクション部分においてリガンドと結合する。ステム−ジャンクション構造は、ステムループとステムバルジの特徴を併せ持つ構造と言うことができる。
一方、本発明におけるリガンドとは、核酸アプタマーが有する立体構造によって結合される、核酸以外のあらゆる成分であることができる。具体的には、タンパク質のほか、様々な低分子化合物に対して結合親和性を有する核酸アプタマーが報告されている。以下にこれまでに報告された核酸アプタマーのリガンドをまとめた。
アミノ酸（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３６８０−３６８４，１９９３）
ヌクレオチド（Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５０−５５３，１９９３；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，６５６−６６５，１９９５）
コエンザイムＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，４６５３−４６６３，１９９８）
テオフィリン（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３，１４２５−１４２９，１９９４）
アミノグリコシド系抗生物質（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１２３３８−１２３４６，１９９６）
有機染料（Ｎａｔｕｒｅ ３５５，８５０−８５２，１９９２）
ポルフィリン誘導体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，６９５１−６９２２，１９９６）
なお２本鎖の核酸に結合する蛋白質や色素が公知である。また２本鎖核酸に含まれるミスマッチを認識して結合するＭｕｔＳ等の蛋白質も知られている。本発明のリガンドは、１組の相補的な塩基配列のみによって構成される構造を認識するリガンドを含まない。これらのリガンドを結合する公知の核酸アプタマーは、本発明の核酸の検出方法に利用することができる。この他、後に述べるように本発明者らは核酸で構成されたスリーウエイジャンクションによって、コール酸がリガンドとして捕捉されることを確認した。図２に太字で示した塩基で構成される構造がスリーウエイジャンクション（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ、あるいはｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｍ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）である。「スリーウエイジャンクション」とは、３本の核酸鎖が相互に２本鎖を形成することによって、結果的に３つの２本鎖核酸が１ヶ所で交錯した構造を言う。すなわち、３本のステム（２本鎖）が１ヶ所で交差しており、６つの塩基による３組の相補塩基対がスリーウエイジャンクションを構成する。３本の核酸鎖は、ステムループ構造を伴った１本鎖核酸（図６ｂ）であっても良いし、あるいは３本の独立した核酸鎖によってスリーウエイジャンクションを構成することができる（図６ａ）。
更に１つのステムループを伴った１本鎖と、この鎖とは別の１本鎖とがハイブリダイズすることによって２つのステムを構成する構造（図６ａにおける３本鎖のうちの任意の２本がループを形成している状態）を想定することもできる。ｔＲＮＡなどでも類似の構造を取ることは公知であるが、ジャンクション部分にリガンドを捕捉することは、本発明者によって初めて見出された知見である。この新規な構造を持つ核酸アプタマーは、本発明による核酸の検出方法に利用することができる望ましい核酸アプタマーの一つである。
核酸アプタマーを標的塩基配列の検出に利用するには、標的塩基配列の有無によって核酸アプタマーの構造が変わり、リガンドとの結合親和性が変動するように設計する。たとえば先に述べた本発明者らが新たに見出したスリーウエイジャンクション構造によって構成される核酸アプタマーの場合は、リガンドの結合のためにはジャンクション部分の塩基対結合が３つとも完全に相補的でなければならない。更に、より高度な親和性を得るためには、ジャンクションを構成する３組の塩基対のうち、２組がＧ−Ｃ塩基対であることが望ましい。２組のうちの１組はプローブとして用意することができるので、残る１組を標的塩基配列中のＧ、またはＣに求めることになる。言いかえれば、本発明に基づいて標的塩基配列の検出を行う場合には、標的塩基配列中のＧまたはＣにおいてジャンクションが構成されるようにプローブを設計し、しかもプローブ側のジャンクションに相当する部分がＧ−Ｃ塩基対とするのが望ましいということができる。
あるいは標的塩基配列中のＧとＣが連続した部分、すなわちＧＧ、ＧＣ、ＣＧ、あるいはＣＣをジャンクション構成塩基とすることができる場合には、プローブ側のジャンクション構成塩基は、任意のワトソン−クリック塩基対とすることもできる。もちろん、可能であれば、ジャンクションを構成する３組の塩基対を全てＧ−Ｃ塩基対とすることによって、高度な親和性を確実に達成できることは言うまでも無い。
更に、ステム部分を構成する２本鎖も完全に相補的な方が、より高度な親和性をもたらすことがわかっている。一方、ループ部分の構成塩基は親和性にほとんど影響を与えない。したがって、標的塩基配列の存在によって、親和性の維持に必要な条件が満たされる（または満たされない）ときに、リガンドとの結合活性が標的塩基配列の指標となる。
具体的には、スリーウエイジャンクションを構成する３つのＤＮＡ鎖のいずれか１つを標的塩基配列とし、残る２本をプローブとして提供することにより、両者がハイブリダイズしたときにのみステムジャンクションが構成されるようにすることができる。たとえば１つのステムループと、その両端を構成する１本鎖部分に標的塩基配列とのハイブリダイズに必要な相補的な塩基配列を含むようなプローブは、標的塩基配列とのハイブリダイズによりスリーウエイジャンクションを与える。言いかえれば、１本鎖ＤＮＡの中心部分を構成する相補的な塩基配列が分子内で２本鎖を構成し、その両側に標的塩基配列に対する相補的塩基配列からなる１本鎖部分を持つＴ字型のプローブである。このような構成では、３本ステムループのループはプローブ側の１ヶ所にしか構成されない。しかしながら、実施例で確認しているように、３本ステムループ構造におけるループ部分の塩基はリガンドとの結合親和性に影響を与えない。したがって、リガンドとの結合親和性の獲得にはループは必ずしも必要ではない。
本発明において、標的塩基配列とのハイブリダイズによって核酸アプタマーを構成することができるプローブの望ましい構造を以下に示す。
プローブＡ：−［Ｔ１］＋［Ｃ］−［ｃ］＋［Ｔ２］−
プローブＢ：−［Ｔ１］＋［Ｃ］−、および−［ｃ］＋［Ｔ２］−
［Ｔ１］および［Ｔ２］は、標的塩基配列における隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である。［Ｃ］と［ｃ］とは相補的な塩基配列で構成される。なお＋は、＋の左右に示した領域の間に塩基の介在が許されないことを意味する。他方−で示した部分には任意の塩基配列の介在が許される。プローブＡに対して、プローブＢは、プローブＡにおける［Ｃ］−［ｃ］間の結合が無く、２つの異なるオリゴヌクレオチド分子でプローブを構成している。このような構造を有するプローブは、標的塩基配列の存在下で相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによって３つのステムが交差するジャンクションを構成する。
本発明においては、以下の構造を有するプローブを核酸アプタマーを構成するプローブとして用いることもできる。
−［Ｔ１］＋［Ｔ２］−
［Ｔ１］および［Ｔ２］は、標的塩基配列に含まれる、ステム構造を形成することができる相補的な塩基配列に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列である。すなわち、標的塩基配列自身が１組の相補的な塩基配列を含んでおり、分子内でハイブリダイズすることができる構造を有する場合には、この相補的な塩基配列の３’側および５’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を、それぞれ［Ｔ１］および［Ｔ２］がハイブリダイズするための領域として選択することができる。
スリーウエイジャンクション構造の核酸アプタマーを利用して、標的塩基配列におけるＳＮＰの検出を行うには、検出すべきＳＮＰがちょうどスリーウエイジャンクションに相当するように、プローブを設計する。このような構成とすることによって、ＳＮＰの有無によってリガンドとの結合親和性がきわめて明瞭に変化するような反応系を構成することができる。本発明のスリーウエイジャンクション構造の核酸アプタマーの利用により、ジャンクション部分を構成する塩基対が完全に相補的である場合に比べて、ＳＮＰに伴って１組の塩基対にミスマッチが生じた場合のリガンドとの結合親和性が実質的に失われるような特徴的な構造を利用することができる。１塩基の相違によって、大きな結合親和性の違いをもたらす核酸アプタマーによって、高い正確性と感度が期待できる。
本発明においては、標的塩基配列とプローブとのハイブリダイゼーションは、リガンドとの結合親和性を指標として検出される。核酸アプタマーとリガンドとの結合には、公知のあらゆる結合分析の原理を応用することができる。以下に、いくつかの検出原理を具体的に説明する。
不均一系：
標識プローブと標的塩基配列とのハイブリダイズの結果として生じる核酸アプタマーを固相上のリガンドに捕捉することができる。固相に捕捉された（または液相に残った）標識プローブを検出することによって、標的塩基配列の検出が達成される。固相に標識プローブを捕捉する点で公知の核酸ハイブリダイゼーションアッセイと共通するが、固相との結合が相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションとは異なる原理に基づいていることから、より確実な洗浄条件を利用することができる。つまり、相補的塩基対結合には影響を与えない低いストリンジェンシーで洗浄しても、固相やリガンドと非特異的に吸着した標識プローブを十分に除去することができる条件を容易に設定することができる。その結果、バックグランドシグナルの低い特異的な検出が可能となる。
均一系：
蛍光物質と他の分子との結合によって、蛍光偏光が生じる現象が知られている。この現象を利用して、本発明による標的塩基配列の検出方法を均一系で実施することができる。すなわち、プローブまたはリガンドを蛍光標識しておき、核酸アプタマーとリガンドとの結合の結果生じる蛍光偏光を測定することによって、標的塩基配列の検出を行うことができる。蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネートなどが公知である。リガンドとして自身が蛍光を発する化合物を利用することもできる。たとえば核酸アプタマーによって結合される公知のリガンドの一つであるポルフィリン誘導体には、蛍光を発するものが多い。
表面プラズモン共鳴：
物質の結合を光学的に直接検出することができる表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）が公知である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーは金属薄膜近傍の媒質の屈折率の変化を測定することにより、生体分子の相互作用を測定する技術として知られている。ＳＰＲは、表面プラズモンが金属／液体界面（センサー表面）で励起した場合に起こり、試料と接触していない表面の側に光を当てて、そこから光を反射させると、ＳＰＲによって特定の組み合わせの角度および波長で反射光強度が低下する（ＳＰＲシグナル発生）。センサー表面に結合した分子により、表面層近くでの屈折率に変化が生じ、それがＳＰＲシグナルの変化として検出される。生体分子の相互作用により、屈折率とＳＰＲシグナルにさらなる変化が生じ、このシグナルの変化を検出することにより、生体分子の相互作用を測定することができる。本発明における核酸の検出方法では、核酸アプタマーによって捕捉されるリガンドを、チップ上に固定化することにより、標的塩基配列とプローブのハイブリダイゼーションによって生成する核酸アプタマーの量を、ＳＰＲシグナルの変化から測定することができる。標的塩基配列は、ＰＣＲのような増幅法によって得られた増幅生成物であっても良い。チップ上にリガンドを固定化する方法としては、アビジン‐ビオチン反応を利用することができるが、これに限定されない。ＳＰＲによれば、標識物質を用いることなくきわめて高感度な検出が可能となる。
本発明において標的塩基配列となる核酸分子とプローブは、両者のハイブリダイゼーションによって核酸アプタマーを生成することができるものであれば、どのような核酸分子、あるいはその誘導体であることもできる。具体的には、ＲＮＡやＤＮＡのような天然の、あるいは化学的に合成された核酸分子、合成ヌクレオチド誘導体で構成されたＡＡやＤＮＡの誘導体、あるいはバックボーンをペプチド結合やアルキル鎖で構成した誘導体等を示すことができる。これらの核酸分子、あるいはその誘導体は、生物試料に由来するもののほか、試料に由来する核酸分子を鋳型としてＰＣＲやＮＡＳＢＡ法のような核酸の酵素的な増幅反応によって得られた生成物であることもできる。
本発明の標的塩基配列の検出方法に必要なプローブやリガンドは、予め組み合わせてキットとして供給することができる。本発明に基づく標的塩基配列の検出方法には、標識を検出すために必要な試薬や、対照試料などを添えることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。
〔実施例１〕ＳＥＬＥＸ法によるコール酸に結合するＤＮＡアプタマーの選択
（１）コール酸と結合するＤＮＡアプタマーの選択の手順
コール酸と特異的に結合するＤＮＡアプタマーは、６４ヌクレオチドのランダムインサートを持つ１００ｍｅｒの１本鎖オリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−Ｎ６４−ＡＧＡＴＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＧ−３’；配列番号：１）（Ｎ６４は６４ヌクレオチドのランダム配列を示す）から成る１本鎖ＤＮＡプールから、ＳＥＬＥＸ法（Ｎａｔｕｒｅ ３５５，５６４−５６６，１９９０）により選択した。１本鎖ＤＮＡライブラリーには、約９ｘ１０１４の独立した配列が含まれる。１本鎖ＤＮＡはホスホアミデート法により合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製した。１００ｍｅｒのＤＮＡについては、逆相レジンを使用した固層抽出によって精製した。
各ラウンドでの選択は、以下のように行った。まず、６４ヌクレオチドのランダムインサートを持つ１００ｍｅｒの１本鎖オリゴヌクレオチドを、選択バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．６）中で、９５℃５分間により変性させ、徐々に室温まで冷やした。選択バッファー中の折りたたまれた１本鎖ＤＮＡ（最初のサイクルでは４５μｇ、その後のサイクルでは２−３μｇ）を、１０ｍｌ以上の選択バッファーで平衡化した５００μｌのコール酸アガロースカラム（ＳＩＧＭＡ製、２μｍｏｌコール酸／ｇ ｇｅｌ、以下選択カラムと記載する）へロードした。３０分間平衡化した後、カラムを、カラム容量の５から１０倍の選択バッファーで洗浄した。カラムに残った１本鎖ＤＮＡを、５ｍＭコール酸を含む選択バッファー１．５ｍｌで溶出して回収し、２０μｇ／ｍｌのグリコーゲンを含むエタノールで沈殿させた。５ｍＭコール酸で特異的に溶出させた１本鎖ＤＮＡの量は、収集フラクションの２６０ｎｍの波長の吸光度から算出した。この１本鎖ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
１０および１２ラウンドの選択においては、コール酸アガロースに代えてコール酸を結合したＡｆｆｉｇｅｌ １０２を用いた。異なる担体を利用することにより、コール酸アガロースのアミノヘキシルリンカーと結合する１本鎖ＤＮＡを除去することができる。Ａｆｆｉｇｅｌ １０２（ＢｉｏＲａｄ）上にはアミノエチルリンカーを介してコール酸を結合させた。Ａｆｆｉｇｅｌ １０２上にアミノエチルリンカーをコール酸を介して固定化する手順は以下の通りである。
３ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ １０２に対し、２０ｍｇのコール酸を、１０ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で１００ｍｇのＥＤＣを縮合剤として用いて結合させた。混合液を室温で１０時間、ときおり攪拌しながらインキュベーションした。Ａｆｆｉｇｅｌ １０２上のコール酸の濃度（８μｍｏｌ／ｍｌ ｇｅｌ）は、２，４，６−トリニトロベンゼン硫酸との反応によって決定した。コール酸で固定化したＡｆｆｉｇｅｌ １０２は３倍量Ａｆｆｉｇｅｌ １０２と混合し、おおよそ２μｍｏｌ／ｍｌのゲルになるように、カラム中のコール酸の濃度を調整した。
更に、アガロースそのものに結合する１本鎖ＤＮＡの混入を防ぐために、選択ラウンド５、６、７、および１３の後にカウンターセレクションを行った。すなわち、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＳＩＧＭＡ）対照カラムに１本鎖ＤＮＡをロードすることによって、アガロースマトリックスと結合した１本鎖ＤＮＡを除去した。
（２）ＰＣＲによる増幅
ＰＣＲプライマーは、５’−ｂｉｏｔｉｎ−ＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＴ−３’（配列番号：２）、および５’−ＧＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−３’（配列番号：３）を用いた。１００μｌのＰＣＲ混合液には、１ｕｎｉｔのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）、各々６０ｐｍｏｌのプライマー、各々２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、およびポリメラーゼ反応の精度を増すために０．４−０．８μｇのＰｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（大腸菌１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。ＰＣＲの反応サイクルは、９４℃３０秒、４６℃３０秒、７２℃３０秒で行った。増幅したビオチン化した２本鎖ＤＮＡを、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、１本鎖ＤＮＡを得るために、カラムに固定化したアビジンと結合させた。このようにして得た１本鎖ＤＮＡを、次のラウンドのインプットとして使用した。以上の操作を繰り返して、コール酸との結合親和性を有する１本鎖ＤＮＡを濃縮した。
（３）クローニングおよび塩基配列解析
選択ラウンド１３のライブラリーから増幅した２本鎖ＤＮＡのＰＣＲ産物を、ジデオキシ法によるシーケンシングのために、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製）へクローニングした。配列の相同性解析、および自由エネルギー最小化による１本鎖ＤＮＡの二次構造の推測をＭａｃＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ ｖ１．０プログラム（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）で行った。各配列クローン上で３つのステムを形成することができる相補配列の検索は、Ｃ言語で書いた独自のコンピュータープログラムによって行った。図９−図２１にこのコンピュータープログラムのソースコードを示した。更に、このコンピュータープログラムのアルゴリズムを以下にまとめる。
このアルゴリズムは、与えられた塩基配列が取りうる、全てのスリーウエイジャンクション構造を求めるものである。なおスリーウエイジャンクション構造とは、ステム１、ステム２、およびステム３が１箇所で交差した構造（たとえば図８）であることは先に述べたとおりである。このアルゴリズムは、相補的な塩基配列の検索を繰り返すことによって、まずステム１を構成する塩基配列の存在を明らかにする。次いでもしもステム１を構成できる場合には、残る領域によってステム２を構成しうる塩基配列の存在を探索する。ステム２も構成できた場合には、更に残された領域によってステム３を構成しうる塩基配列の探索を行う。各探索ステップは、以下の工程１）−３）によって行われる。
１）取り得るステム１を求める。
与えられた塩基配列の５’末端側から１塩基ずつ３’末端方向へ選んでいき、その塩基をステム１の開始位置ステム１ｂとみなして、ステム１が形成されうるかどうかを以下によって判断する。すなわち、ステム１ｂと相補的な塩基を、３’末端側から順次検索し、ステム１の終了位置ステム１ｅとする。ステム１ｂから３’末端方向へ「最低ステム長」の長さの塩基配列が、ステム１ｅから５’末端方向へ同じ長さの塩基配列と相補的になっていれば、ステム１は形成されたとみなす。「最低ステム長」は任意の数値であることができる。
２）取り得るステム２を以下のように求める。
ステム１を構成する領域を除く範囲の配列において、ステム２が形成されるかどうかを上記１）と同様に求める。ただし、ステム２のループ部分の長さは「最低ループ長」以上になっていることが条件である。さらに、ステム２の開始位置ステム２ｂとステム１の距離は「ギャップサイズ」以下であるようにステム２ｂを選ぶ。「最低ループ長」と「ギャップサイズ」は任意の数値であることができる。
３）最後に取り得るステム３を以下のように求める。
ステム１とステム２を構成する領域を除く範囲の配列において、ステム３が形成されるかどうかを上記２）と同様に求める。ただし、ステム３の開始位置ステム３ｂとステム２の距離およびステム３の終了位置ステム３ｅとステム１の距離が、前記「ギャップサイズ」以下であるようにステム３ｂおよびステム３ｅを選ぶ。
（４）実験結果
上記のようにして選択した最初のラウンドでは、ロードした１本鎖ＤＮＡの１％以下が、選択カラムに保持された。その後のラウンドでは、コール酸に結合した１本鎖ＤＮＡの量が顕著に増大し、選択の１３ラウンド以後は、ロードした１本鎖ＤＮＡの約７０％がカラムに保持され溶出した（図１）。
１３ラウンドの後、コール酸の結合に関与する共通モチーフ配列を決めるため１９クローンの塩基配列を決定した。１９クローンの配列は全て異なっており、ＭａｃＤＮＡＳＩＳプログラムを利用した一次配列相同性解析からは、はっきりした相同性は見られなかった。しかし、表１で示すように、二次構造であるスリーウエイジャンクションを形成すると推測される配列が見られた。表１中の塩基配列において、３組のスリーウエイ領域（２本鎖を構成する領域）を、それぞれ、アンダーライン、太字、そして中抜きの文字で示した。イタリックで示したのは、ステム領域におけるミスマッチ、あるいはｗｏｂｂｌｅ（Ｔ−Ｇ）を示している。
ａ）Ｃｌｏｎｅ−１： 配列番号：８
Ｃｌｏｎｅ−２： 配列番号：９
Ｃｌｏｎｅ−５： 配列番号：１０
Ｃｌｏｎｅ−７： 配列番号：１１
Ｃｌｏｎｅ−９： 配列番号：１２
Ｃｌｏｎｅ−１１： 配列番号：１３
ｂ）Ｃｌｏｎｅ−３： 配列番号：１４
Ｃｌｏｎｅ−４： 配列番号：１５
Ｃｌｏｎｅ−６： 配列番号：１６
Ｃｌｏｎｅ−８： 配列番号：１７
Ｃｌｏｎｅ−１０： 配列番号：１８
Ｃｌｏｎｅ−１２： 配列番号：１９
Ｃｌｏｎｅ−１３： 配列番号：２０
Ｃｌｏｎｅ−１４： 配列番号：２１
Ｃｌｏｎｅ−１５： 配列番号：２２
Ｃｌｏｎｅ−１６： 配列番号：２３
Ｃｌｏｎｅ−１７： 配列番号：２４
Ｃｌｏｎｅ−１８： 配列番号：２５
Ｃｌｏｎｅ−１９： 配列番号：２６
〔実施例２〕各種ＤＮＡアプタマーの欠失変異体を用いた、コール酸との結合モチーフ配列の探索
（１）解離定数の決定法
コール酸の１本鎖ＤＮＡとの親和性を、イクイブリウム フィルトレーション法（ｔｈｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１４２５−１４２９，１９９４）によって解析した。コール酸を、選択バッファー（２００μｌ）中のＤＮＡサンプルへ、終濃度が５０μＭとなるように加えた。各結合混合液を２５℃で５分間インキュベーションした。次に混合液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍｉｃｏｎ）へ移し、８５０ｘｇで１５分間遠心した。この操作によって１本鎖ＤＮＡと結合していないコール酸が濾液として回収される。濾液２０μｌから３０μｌ中のコール酸の濃度を、ｐ−ニトロテトラゾリウム青色色素、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む３αヒドロキシステロイド、ジアホラーゼを利用した診断キット（ＷＡＫＯ ｃｈｅｍｉｃａｌ）で定量的に測定した。各１本鎖ＤＮＡサンプルでは、結合したコール酸の濃度（Ｃｂ）を、濾液および保持液中のコール酸の濃度の違いに基づいて以下の式（式１）により決定した。
Ｃｂ（μＭ）＝Ｃｒ−Ｃｆ＝（１００００−Ｖｆ×Ｃｆ）／（２００−Ｖｆ）−Ｃｆ
Ｖｆ（μｌ）は濾液の容量、ＣｒおよびＣｆ（μＭ）は、濾液および保持液中のコール酸の濃度を表す。更に平衡解離定数（Ｋｄ）を、以下の標準二次結合式（式２）により計算した。
Ｃｂ＝（１／２）｛Ｄｔ＋５０＋Ｋｄ−［（Ｄｔ＋５０＋Ｋｄ）２−２００Ｄｔ］１／２｝
Ｄｔは１本鎖ＤＮＡの全濃度を表す。
（２）各種ＤＮＡアプタマー欠失体の、コール酸との親和性（結合定数）の測定
コール酸との結合に必要な最短配列を決定するために、クローン１、および２について、全長アプタマーの５’末端および３’末端から１以上のヌクレオチドが欠失した、欠失体シリーズを作製した。選択カラムへ、０．５ｎｍｏｌのクローン１、クローン２、およびそれらの各欠失体シリーズを加え、５ｍＭコール酸により選択カラムから特異的に溶出した１本鎖ＤＮＡの量を測定した（クローン１の７５％、クローン２の７７％が特異的に溶出した）。次に、３９ｍｅｒのクローン１の欠失体ｃｈ１−３９（５’−ＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣ−３’；配列番号：４）、および３８ｍｅｒのクローン２の欠失体ｃｈ２−３８（５’−ＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＣ−３’；配列番号：５）を用いた実験から、これらの欠失体が、コール酸との結合に必要な最短配列であることが分かった。ｃｈ１−３９の２２％、ｃｈ２−３８の４０％が選択カラムから溶出したのに対し、さらに配列の短い欠失体では、溶出が見られなかった。興味深いことに、ＭａｃＤＮＡＳＩＳプログラムによって推測したクローン１および２の二次構造は、４ｂｐ以上の３つのステムが結合した構造をしており、ｃｈ１−３９およびｃｈ２−３８は、このスリーウエイジャンクション（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）領域を含んでいた（図２）。
次に、この領域の正常な配列を有するクローン１および２の欠失体を用意し、それぞれｃｈ１−４７（５’−ＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ−３’；配列番号：６）、ｃｈ２−４０（５’−ＡＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＣＴ−３’；配列番号：７）と名付けた。これらの欠失体を用いて、コール酸との親和性を調べた（図３）。その結果、これらの欠失体は、完全長クローンの選択カラムに対する親和性と、ほぼ同じ親和性を示した（それぞれ、７０％および７３％）。式１、２および図３の結果から、コール酸に対する解離定数は、ｃｈ１−４７が３１．０μＭ、ｃｈ２−４０が１９．６μＭと決定した。さらに、完全長の配列を持つ他の１７個のクローンの推定二次配列では、４つのクローン（クローン５、７、９、および１１）についてｃｈ２−４０と類似したスリーウエイジャンクションを含んでいた（図４）。これらの４クローンの正常なスリーウエイジャンクション領域を含む欠失体ｃｈ５−６３、ｃｈ７−６９、ｃｈ９−４８、ｃｈ１１−７６を用意し、コール酸に対する解離定数を測定した（表２）。
クローン１１の推定二次構造は、他の５つのクローンよりも複雑であった。スリーウエイジャンクション領域以外の領域を欠失したクローン１１の３５ｍｅｒの欠失体を用意し、コール酸に対する解離定数を決定した。その結果、解離定数は７６．８μＭであり、７６ｍｅｒの欠失体の解離定数（５２．１μＭ）に匹敵するものであった。
上記の６つのクローンの推定スリーウエイジャンクション構造を比較することによって、２つの共通点が明らかとなった。すなわち、第一に３つのステムおよび、２つのループはそれぞれ４塩基対および４塩基以上から構成されていることが高い親和性をもたらす。第２に、ジャンクション近傍の３塩基対を、２または３対のＧＣ塩基対で構成することが親和性を高める。
さらに、他の１３のクローンの配列を、前記アルゴリズムに基づくコンピュータープログラムによって解析した。プログラムによる解析条件は次のとおりである。まず最低ステム長２、最低ループ長４、ギャップサイズ０、の条件で各配列を検索した。条件を満たす塩基配列のうち、ジャンクションの部分に２つ以上のＧＣ塩基対を含み、なおかつ各ステム長が３塩基対以上になるスリーウエイジャンクションを目で見て（つまりプログラムを使わずに）選択した。このとき、ステムにはミスマッチが含まれていてもよいものとする。つまり、ｃｈ１−４７の様に、ステム中のジャンクションから３番目以降の塩基対にミスマッチが含まれてもよいものとした。この場合、ミスマッチはステム長としてカウントしない。すなわち、ミスマッチを除いて、各ステム長が３塩基対以上になるものを選び出した。その結果、１２のクローンがスリーウエイジャンクション構造を有する配列を含んでおり、それぞれ３塩基対以上のステムが見られ、さらに２または３対のＧＣ塩基対が、ジャンクションの近傍に存在していた。残りの１クローンも３つのステムのうち１つのステムが、２塩基対ではあるものの、スリーウエイジャンクション構造を有する配列を含んでいた。正常なスリーウエイジャンクション領域を含むこれらの１３クローンの欠失体を作製し、コール酸に対する親和性を調べた。これらの１３クローンの欠失体の塩基配列および前記６クローンの欠失体の塩基配列を、表３に示す。これらの塩基配列は、表１の塩基配列においてアンダーラインではさんだ部分に相当する。
〔実施例３〕１塩基および１塩基対変異による、コール酸との結合親和性に及ぼす影響
（１）ステムまたはループ上の置換が親和性に及ぼす影響
選択したクローンの推定スリーウエイジャンクション構造の形成、およびコール酸との結合に必要な、重要な構成要素を決定するために、クローン２のスリーウエイジャンクション領域を有する欠失体ｃｈ２−４０について、変異体解析を行った。１塩基および１塩基対置換、もしくは１塩基欠失または挿入のあるｃｈ２−４０変異体のシリーズを合成し、これらの変異体の、コール酸に対する相対結合親和性を、「ｔｈｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ」によって評価した。図５ａは、欠失体ｃｈ２−４０上の１塩基を、図の矢印で示す塩基に置換した場合の結合親和性を示す。図５ｂは、ｃｈ２−４０上のスリーウエイジャンクションのステム部分を形成する１組の塩基対を、図の矢印で示す塩基対に置換した場合の結合親和性を示す。
図５ａで示すように、３つのステム上の塩基対置換では、Ｇ‐ＣからＡ‐Ｔ塩基対への置換により、相対結合親和性が６５．３％（Ｃ６−Ｇ２１からＴ６−Ａ２１）減少したが、それでも親和性は見られた。対照的に、ジャンクションの周囲のいくつかの１塩基置換では、結合親和性を完全に失った（図５ｂ；Ｇ４からＣ４、Ｃ６からＧ６、Ａ２２からＴ２２、Ｇ３６からＣ３６への置換）。１塩基置換と１塩基対置換との結合親和性への影響を比較すると、推定される二次構造中のワトソン‐クリック塩基対を構成できない１塩基置換では、塩基対置換よりも結合親和性が顕著に減少した。
これらの結果から、推定される二次構造の形成が裏付けられ、スリーウエイジャンクションの形成が、親和性の維持にとって非常に重要であることが示唆された。ｃｈ２−４０欠失体のジャンクションの周囲の１塩基置換および１塩基対置換では、結合親和性が顕著に減少したが、ｃｈ２−４０の５’末端および３’末端、もしくは２つのループ上の１塩基置換および１塩基対置換では、結合親和性の減少は見られなかった。さらに、２つのループ上の１塩基置換、Ａ１２およびＡ２８の欠失、Ａ１２とＣ１３との間、またはＡ２８とＴ２９との間へのアデノシンの挿入では、ほとんど結合親和性に影響を及ぼさなかった。１９のクローンには、配列の類似性は見られず、ステムおよびループ領域の長さも同一ではないことから、コール酸との結合部位は、３つのステムのジャンクションであることが示唆された。
（２）ジャンクション上の３つの塩基対の置換が親和性に及ぼす影響
そこで、選択した１９クローンのジャンクション上の３つの塩基対の多様性、および配置に注目した。これらのクローンのジャンクションは、２つのＧ‐Ｃおよび１つのＡ‐Ｔ、または３つのＧ‐Ｃから構成されていた（それぞれ、２Ｇ‐Ｃ、３Ｇ‐Ｃジャンクションと呼ぶ）（図６ａ）。図６ｂに２Ｇ‐Ｃジャンクションの例としてｃｈ９−４８を、３Ｇ‐Ｃジャンクションの例としてｃｈ１６−４０を示す。選択した１９のクローンのうち、９クローンが２Ｇ‐Ｃジャンクションを有しており、他の１０クローンは、３Ｇ‐Ｃジャンクションを有していた。３Ｇ‐Ｃジャンクションの３塩基対の配置を比較すると、１０クローンのうち９クローンは同じ配置だった。２Ｇ‐Ｃジャンクションを有する９クローンのうち、６クローンは、同じ配置をしており、残りの３クローンはそれぞれ異なった配置をしていた。
ジャンクション上の３つの塩基対の、相互作用にとっての構造上の必要性を評価するために、最も低いＫｄ値を示すクローン９、および１６の正常なスリーウエイジャンクション領域を有する欠失体であるｃｈ１６−４０およびｃｈ９−４８について、ジャンクション上の塩基対の置換を行った。１塩基対を置換したｃｈ１６−４０、およびｃｈ９−４８の、コール酸に対する相対結合親和性を表５に示す。表中の数字は、塩基対置換前の結合親和性を１００とした時の相対的な親和性（％）を表す。
いくつかの例外は見られるものの、ワトソン‐クリック塩基対への置換は、結合親和性に対し影響を与えない。Ｇ‐ＣからＡ−Ｔへの置換では、結合親和性が減少した（Ｃ５−Ｇ３６からＴ５−Ａ３６；５６．１％，Ｃ６−Ｇ２１からＴ６−Ａ２１；３４．７％）が、Ａ−ＴからＧ−Ｃへの置換では、結合親和性の減少はほとんど見られなかった（Ｔ２２−Ａ３５からＣ２２−Ｇ３５；９５．２％）。これらの結果は、選択した１９のクローンの特徴が、２または３Ｇ‐Ｃであり、１Ｇ‐ＣまたはＧＣ塩基対のないジャンクションが見られなかったことと一致する。
〔実施例４〕２分子で構成した本発明によるＤＮＡアプタマーの親和性
標的塩基配列とプローブの２分子で構成される本発明によるアプタマーにおいて、スリーウエイジャンクションを構成する塩基配列の変異によって生じるリガンドとの親和性の変化を観察した。すなわち次の塩基配列からなる標的塩基配列とプローブをハイブリダイズさせたスリーウエイジャンクション構造の、コール酸に対する親和性をＳＰＲによって測定した。標的塩基配列とプローブを各５μＭ混合し、実施例１−（１）と同じ条件で熱変性させた。コール酸を固定化したＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）のセンサーチップに２０μｌのプローブ−標的塩基配列溶液をロードした場合、６００ＲＵ（ＲＵ＝レゾナンズユニット）のＳＰＲシグナルの変化が得られた。それに対して、標的塩基配列に一塩基変異を導入した場合（標的塩基配列の下線部分の配列がＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ）、ＳＰＲのシグナル変化はまったく得られなかった。この組み合わせに限らず、ジャンクションに隣接する塩基対にミスマッチを導入した場合には、結合親和性が検出されなくなった。標的塩基配列の配列／配列番号：２７（小文字はプローブの相補鎖で、スペースを挟んだ塩基の部分にジャンクションが位置する）
標的塩基配列の配列／配列番号：２９
〔実施例５〕化学的修飾によるアプタマーの二次構造の評価
（１）四酸化オスミウムによるチミンの化学的修飾
アプタマーの二次構造および相互作用に関与する塩基を評価するため、酸化剤である四酸化オスミウムを用いて、ｃｈ９−４８の化学修飾の実験を行った。四酸化オスミウムは、ピリジン存在下で１本鎖の状態のチミンと選択的に反応する（Ｆｕｒｌｏｎｇ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，２００９−２０１７，１９８９）。この選択性は、チミンのＣ５，６二重結合を攻撃する四酸化オスミウムの活性によるものと考えられている（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．，３，１−２５，１９９０）。オスミル化部位は、アルカリ処理により切断することができる。
３’−ＦＩＴＣでラベルした５μＭのｃｈ９−４８、またはｃｈ９−４８−Ｃ６を、５ｍＭコール酸を添加した、または添加しない１ｍＭ四酸化オスミウム、３％ピリジンから成る１００μｌの結合バッファーで、２０℃で１５分間インキュベートした。このとき熱変性により１本鎖にするために、コントロールは８０℃でインキュベートした。引き続き２回のエタノール沈殿を行い、反応を停止させた。アプタマーを、１５μＬの１Ｍピペリジンで９０℃、３０分間処理し、オスミニウム酸塩付加化合物のサイト（１本鎖状態にあるＴ）を切断した。１５μｌのホルムアミドローディングバッファーの添加後、切断した産物を、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル（１９％，１量体：２量体の比が１９：１）上で電気泳動した。泳動系は、９０ｍＭトリスホウ酸塩（ｐＨ８．０）および２ｍＭ ＥＤＴＡから構成される。ゲルをスキャンし、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５を使用して解析した。結果を図７に示す。
（２）実験結果
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真を図７に示す。２０℃で結合バッファーを使用した折り畳まれる条件でのｃｈ９−４８の修飾パターンは、推定二次構造（図８）と非常に良く一致した。ジャンクションの近傍のＴ４３で、強い修飾が見られ、ループ状の領域のＴもまた、反応性に富んでいた。ステム領域のＴは、Ｔ２３およびＴ４６を除いて効率的に保護されていた。Ｔ２３は、ステムの末端に位置することから反応性に富み、Ｔ４６は、ループを欠く短いステム構造の不安定性により反応性に富むものと考えられる。ｃｈ９−４８の６番目のＧがＣへの置換によりコール酸と結合しない変異体のｃｈ９−４８−Ｃ６を用意し、ｃｈ９−４８と修飾パターンを比較した。コール酸存在下では、ｃｈ９−４８の分岐点のＴ４３の修飾の度合いは、４０％以下に減少した。対照的にｃｈ９−４８−Ｃ６では、Ｔ４３の反応性は、コール酸により僅かに抑制された。このことから、ｃｈ９−４８上のＴ４３は、直接コール酸との結合に関与しているものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明は、核酸アプタマーの形成を利用した新規な標的塩基配列の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、１塩基のミスマッチに基づいてリガンドとの結合親和性が大きく変化する核酸アプタマーの利用によって、ＳＮＰの特異的な検出を可能とする。１塩基のミスマッチによって、これほど明確な変化をもたらす検出原理はこれまでに知られていない。
一方、本発明は、本発明の標的塩基配列の検出方法に有用な、新規な構造の核酸アプタマーを合わせて提供する。スリーウエイジャンクションにコール酸などのリガンドを捕捉する本発明の核酸アプタマーは、３つのジャンクション部分の３つの塩基対のいずれか一つでもミスマッチとなるとリガンドとの結合親和性を失う。したがって、スリーウエイジャンクションからなる核酸アプタマーは、本発明をＳＮＰの検出に応用するときにきわめて好適な核酸アプタマーと言うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、各選択ラウンドで溶出された１本鎖ＤＮＡのパーセンテージを示すグラフ。縦軸がロードしたＤＮＡに対する溶出ＤＮＡのパーセンテージを、横軸がラウンド数を示す。
図２は、クローン１とクローン２の予測される二次構造を示す図。各クローンのコール酸との結合に必要な最短配列を含む欠失変異体であるｃｈ−１−３９とｃｈ２−３８の塩基配列をイタリックで示した。また、スリーウエイジャンクション領域を完全に保持した欠失変異体であるｃｈ１−４７とｃｈ２−４０を構成する塩基配列は、中抜きの文字で示した。
図３は、ｃｈ１−４７（○）とｃｈ２−４０（□）のコール酸に対する結合曲線を示すグラフ。縦軸は１本鎖ＤＮＡに結合したコール酸の濃度（μＭ）、横軸は１本鎖ＤＮＡ濃度（μＭ）の対数を示す。
図４は、クローン５、７、９、および１１のスリーウエイジャンクション領域を含む欠失変異体に予測される２次構造を示す図。矢印は、クローン５とクローン９がコール酸固定化カラムに結合するために必要な最短の塩基配列を示す。
図５は、ｃｈ２−４０の変異解析結果を示す図。塩基対置換（ａ）、１塩基置換（ｂ）、あるいは欠失と挿入（ａ）を、ｃｈ２−４０に導入した。置換あるいは欠失させる塩基を、太字で示した。矢印は、置換あるいは欠失させる塩基と、変異を伴わない状態のｃｈ２−４０に対する変異体の親和性のパーセンテージを示している。
図６は、２Ｇ−Ｃジャンクションおよび３Ｇ−Ｃジャンクションの構造を示す図。（ａ）は、各ジャンクションの構造の模式図を示す。（ｂ）は、各ジャンクションの一例としてｃｈ９−４８、およびｃｈ１６−４０の場合を示す。
図７は、ｃｈ９−４８およびｃｈ９−４８−Ｃ６の四酸化オスミウムによるチミンの修飾を示す写真。
レーン１：変性させて１本鎖としたコントロール
レーン２：ｃｈ９−４８、コール酸なし
レーン３：ｃｈ９−４８、コール酸添加
レーン４：ｃｈ９−４８−Ｃ６、コール酸なし
レーン５：ｃｈ９−４８−Ｃ６、コール酸添加
レーン６：ｃｈ９−４８のマキサムギルバートＡ＋Ｇラダー
図８は、ｃｈ９−４８の推定二次構造を示す図。チミン（Ｔ）を太字で表す。
図９−図２１は、本発明の核酸アプタマーを形成することができる塩基配列を選択するための、実施例で使用したソフトウエアのソースコードである。
Claims (5)
- 標的塩基配列とのハイブリダイゼーションによって、リガンドとの結合親和性を獲得するプローブであって、該ハイブリダイゼーションによって、それぞれ４塩基対以上の長さを持つ３本のステムが交差するスリーウェイジャンクション構造（ここで、該スリーウェイジャンクションを構成する３組の塩基対のうち少なくとも２組がＧ−Ｃ塩基対である）を有する核酸アプタマーを構成し、該核酸アプタマーがこのステムが交差するスリーウェイジャンクションの位置でコール酸であるリガンドと結合する、プローブ。
- 請求項１に記載のプローブおよび標的塩基配列を含む核酸アプタマーであって、該プローブと該標的塩基配列とのハイブリダイゼーションによって、それぞれ４塩基対以上の長さを持つ３本のステムが交差するスリーウェイジャンクション構造が構成され、このステムが交差するスリーウェイジャンクションの位置でコール酸であるリガンドと結合する核酸アプタマー。
- 次の工程を含む標的塩基配列の存在を検出する方法：
ａ）標的塩基配列と請求項１に記載のプローブをハイブリダイゼーションさせ、それにより、それぞれ４塩基対以上の長さを持つ３本のステムが交差するスリーウェイジャンクション構造を有し、このステムが交差するスリーウェイジャンクションの位置でコール酸であるリガンドとの結合親和性を有する核酸アプタマーを生成する工程、及び
ｂ）核酸アプタマーのリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列の存在を検出する工程。 - 標的塩基配列が単塩基多型を含み、プローブが標的塩基配列における単塩基の置換にともなってリガンドとの結合親和性が変動するものである請求項３に記載の方法。
- 請求項１に記載のプローブからなる、標的塩基配列の検出用試薬。
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