JPH07508398A

JPH07508398A - 改良型分子スイッチを含む核酸プローブ及びそれらを取り入れたアッセイおよびキット

Info

Publication number: JPH07508398A
Application number: JP1510691A
Authority: JP
Inventors: リザルディ，ポール・エム; クラマー，フレッド・ラッセル; トヤギ，サンジェイ; ゲラ，セサル・エドゥアルド; ブヨリ，イルダ・エメ・ロメリ; チュー，バーバラ・シー; ジョイス，ジェラルド・エフ; オージェル，レスリー・イー
Original assignee: ザ・パブリック・ヘルス・リサーチ・インスティチュート・オブ・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク・インコーポレーテッド; ザ・ソーク・インスティチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-29
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2013-09-30
Also published as: EP0436644B1; US5118801A; DE68926302T2; ATE136941T1; DK56091A; ES2023290A6; EP0436644A1; US5312728A; DE68926302D1; FI911536A0; AU647376B2; DK56091D0; AU4346689A; JP2806455B2; WO1990003446A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】改良型分子スイッチを含む核酸プローブ及びそれらを取り入れたアッセイおよびキットこの発明は核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いるバイオアッセイの分野に関するものである。それらのバイオアッセイは特異的な遺伝子、遺伝子切片、あるいはＲＮＡ分子の検出に有効である。アッセイは診断上、例えば組織、血液、尿検体などに有効であり、食品技術、農業、生物学的研究においても同様である。

られている。ＤＮＡアッセイに関する分野での初期の論文の一つに、ギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）＋　Ｄ、とスピージェルマン（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ）、Ｓ、にょる「ＤＮＡの膜上での不動化によるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの定量アッセイ（ＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　ＤＮＡ−ＲＮＡ　Ｈｙｂｒｉｄｓ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡＩｍｍｏｂｉｌｅｚｅｄ　ｏｎ　ａ　ｍｅｍｌｒａｎｅ、　）Ｊ　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１２　：　８２９−８４２（１９６５）がある。一般的に述べるとこのようなアッセイは、サンプル中で核酸ポリマー鎖を溶解などにより分離し、分離したＤＮＡ＠をニトロセルロース膜に固定してから探し℃いる材料、即ち「標的」材料の独特な配列に相補であるようなプローブ配列を導入し、プローブ切片を相補な標的切片に、もしそれが存在すれば、であるが、ハイブリダイズさせるようインキュベートする。ハイブリダイズしなかったプローブは既知の洗浄法によって除かれて、残ったプローブの量は以下に概略が述べられて〜・る様々な技法の１つによって決定され、これがサンプル中の標的量の測定となる。

核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いるもので、より最近に開発されたバイオアッセイ法ではしばしば「捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ　）プローブ」と呼ばれる第２のプローブを用いている。ランキ（Ｒａｎｋｉ　）　ｒ　Ｍ、　、パルバ（Ｐａ１ｖａ　）　＋　Ａ、１バータ坏ン（Ｖｉｒｔａｎｅｎ　）ｒ　Ｍ−ｒラークノネン（Ｌａａｋｓｏｎｅｎ）、Ｍ、ｒノダールンド（５ｏｄｅｒｌｕｎｄ　）　＋　Ｈ，＋　ｒ粗（ｃｒｕｄｅ　）サンプル匹おける核酸検出の簡便な方法としてのサンドイッチハイブリダイゼーション（Ｓａｎｄｗｉｃｈ　Ｈｙｂｒｉ　−ｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｌｅｔｅｅｔｉｏｎ　ｏｆＮｕｃｌｅｉｅＡｃＩｄｓ　ｉｎ　Ｃｒｕｄｅ　５ａｎｐｌｅｓ　）　Ｊジーン（Ｊｅｎｅ　）２１　：　７７−８５（１９８３）；シバネン（５ｙｖａｎｅｎ　）　＋　Ａ、Ｃ，ラークソネン（Ｌａａｋ−ｓｏｎｅｎ　）　＋　Ｍ、　＋ノダールンド（５ｏｄｅｒｌｕｎｄ　）　＋　Ｈ，＋　１親和性に基づいたハイブリッド実収による核酸ハイブリッドの迅速な定量（Ｆａｓｔ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉ−ｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｓ　ｂｙ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ　ＨｙｂｒｉｄＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）Ｊ　ニュクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄにあるのが好ましい。抽獲プローブはそれを固体表面に結合させる方法で供給される。このようにしてハイブリダイゼーションは溶液中で行５ことが可能であり、そこでは反応が迅速に進行し、ハイブリッドはそれから固体表面に結合することができる。このような方法の一例はビオチンである。

ランガー（Ｌａｎｇｅｒ　）　＋Ｐ、Ｒ，，ワルドロップ（Ｗａｌｄｒｏｐ　）　＋　Ａ、Ａ、＋およびワード（Ｗａｒｄ　）　、　Ｄ−Ｃ０゜「ビオチン標識されたポリヌクレオチドの酵素的合成法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎｔ　−ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）　：新しい核酸親和性プローブ（Ｎｏｖｅｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｒｏｂｅｓ　）Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

ンに結合することができる。

当発明は試験骨内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）あるいは試験管外（ｅｘ　ｖｉｔｒｏ　）にお℃・て核酸部分の存在を検出するための方法と手段に関するものであり、アッセイ及び必要な試薬と手段な含有する薬Δリキッドを含む。

生物学的す／プル内の様々な核酸配列を検出することがこの技法における目的であり、サンプル内では上記配列、言わゆる標的配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ある（・は両方を含む、様々な他の核酸部分の中におけるその存在に比較して小量である。このように例えばヒト免疫不全ウィルスのＲＮＡのような、病理学上の疾患あるいは条件に付随するかもしれないポリペプチドをコードする核酸を検出することが望まれることである。このようなウィルス粒子のタンパクをコードする核酸の検出に加えて、例えば血友病の場合のように、欠陥遺伝子のような、病理学上の疾患あるいは条件に特徴的な他の核酸を検出することは望ましい。またサンプル中のその存在が、その生物が薬剤、例えば抗生物質などの作用に耐性であることを示すような他の核酸を検出することも望まれる。

プローブを検出するためにいくつかの方法がとられてきた。その１つは、簡単に検出できろレポーターグループ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ　）をプローブに連結させることである。このようなレポーターグループの例として螢光有機分子および３２ｐ［識されたリン酸グループがある。これらの検出技術にはサンプル当り約百万標的の感度と℃・５実際上の限界がある。

第２の方法はプローブに信号発生システムを連結させることである。例としてベルオキ／ダーゼのような酵素類が挙げられる。プローブはそれから発色基質と共にインキュベートされる。レアリー（Ｌｅａｒｙ）、Ｊ、Ｊ、、プリガテイ（Ｂｒｉ−ｇａｔｉ）、Ｄ、Ｊ−およびワード（Ｗａｒｄ　）、Ｄ、Ｃ，、「ニトロセルロース上に不動化されたＤＮＡあるいはＲＮＡにハイブリダイズしたビオチン標識されたＤＮＡプローブ可視化のための迅速で感度の島い比色定量法（Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　Ｓｅｎ　−５ｉｔｉｖｅ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌａ−ｂｅｌｅｄ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ■　：パイオブロソト（Ｂｉｏ　Ｂｌｏｔｓ）Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、■　Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｏｒ　ＲＮＡ　Ｉｍｒｎｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎ　Ｎ１ｔｒｏｃｅ　−更にもう１つの方法は、イン・ビボ法により標的それ自体のコピーを多数作ることである。ハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）、Ｊ、Ｌ、、バーエンジャー（Ｂｅｒｎｉｎ−ｇｅｒ　）　、　Ｍ、　、ジエン−（Ｊｅｓｓｅｅ　）　、　Ｊ　、Ａ、、プルーム（Ｂｌｏｏｍ　）　、　Ｆ、Ｒ，ｒテンプル（Ｔｅｍｐｌｅ　）　ｒ　Ｇ、Ｓ、＋　ｒ特異的ＤＮＡ配列のための非放射性プローブを用いたバイオアッセイ（Ｂｉｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　ＳｅｑｕｅｎｃｅＵｓｉｎｇ　ａ　Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｐｒｏｂｅ　）Ｊ、ジーン（Ｇａｎｓ）４９　：２９５−３０２　（１９８６）。この方法は「ポリメラーゼチェ〜ン反応（ＰＯｌｙｍｅ−ｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）ｊ　（Ｐ　ＣＲ）と呼ばれる技術を用いてイン・ビトロにおい又も行うことができる。この技術はサイキ（５ａｉｋｉ　）　＋　Ｒ，に、＋シャー７（Ｓｃｈａｒｆ　）、Ｓ−＋ファローナ（Ｆａｌｏｏｎａ）、Ｆ、＋ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ　）　ｒＫ、Ｂ、、ホーン（Ｈｏｒｎ　）　＋　Ｇ、Ｔ、、エーリッヒ（Ｅｒ１ｉｃｈ　）　＋　Ｈ，Ａ、　＋　アーンハイム（Ａｒｎｈｅ　ｉｍ　）　＋　Ｎ　、の「ベータグロビンゲノム配列の酵素的増幅と鎌状赤血球性貧血診断のための制限部位分析（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｒｎｐｌ　ｉｆ　１ｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ　Ｇｅｎｍ１ｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｔｒｊｃｔｊｏｎ　５ｊｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　５ｉｃｋｌｅ　Ｃｅ１ｌ　Ａｎｅｍｉａ）Ｊ　サイエンＳ、、ノヤーフ（Ｓｃｈａｒｆ　）　、　Ｓ、Ｊ、、ヒグテ（Ｈ４ｇｕｃｈｉ　）　、　Ｒ，＋ホーン（Ｈｏｒｎ）＋Ｇ、Ｔ、＋　ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ　）ｒＫ、Ｂ、、エーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）＋Ｈ，Ａ、の［温度安定Ｉ）ＮＡポリメラーゼを用いた、プライマーによる、ＤＮＡの酵素的増１ｍ（Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒａｃｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｔｈｅｒｍｏｇｔａｂｌｅ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ月　サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）２３且：４８７−４９１（１９８８）；エーリソヒ（Ｅｒｌｉｃｈ　）　＋Ｈ，Ａ、、ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ　）　、Ｄ、Ｈ−、サイキ（５ａｉｋｉ　）　ｒ　Ｒ，に、の「特異的ＤＮＡ増＠（５ｐｅｃｉｆ　ｉｃ　ＤＮＡ　Ａｒｎｐｌ　ｉｆ　１ｃａｔｉｏｎ　）　Ｊ　坏−チア−（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　）第２００３６２号および第２０１１８４号（Ｕ、Ｓ、ｔ！！ｆ許４，６８３．１９５と４，６８３，２０２も蚕照のこと）で報告された。ＰＣＨにおいてプローブは標的配列の最初の部分にのみ相補であるが、＃素を用いる過程では標的全体の複↓のだめのプライマーとして働く。この過程の各くり返しによって標的配列の数はその度に倍になり、多数の、例えば自万といったようなコピー改の標的が産生される。この時点で例えば放射活性で標識されたプローブなど、検出可能なプローブを用いて標的の増幅された数を検出することが可能である。一般にこの標的増幅法の感度は産生される［誤正信号（ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｉｇｎａｌｓ）」、即ち産生された切片で、標的の本当のコピーではないものの数によって限定される。にもかかわらずこの方法はがなり感度が良い。

この過程は少な（とも２本の核酸プローブを必要とし、信号サイクルのための３つの段階から成る。この過程は煩雑で常に信頼できるとはかぎらない。

更に増幅のためのもう１つの方法は、ＲＮＡをプローブに連結することで、ＲＮＡｔ４ＲＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼによって指数関数的にコピーされることが知られて（・る。このようなポリメラーゼの一例としてバクテソオファージＱ−ベータ　リフブリカーゼがある。ハルナ（Ｈａｒｕｎａ　）、１．　とスピージエルマン（ｓｐ−ｉｅｇｅｌｍａｎ　）　、　Ｓ、の「イン・ビトロにおけるウィルスＲＮＡの自動触媒的（ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ　）合成（Ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｖｉｒａｌリカーゼである。マーチ（Ｍａｒｃｈ）　ら、［玉鎖ＲＮＡウィルス（ｐｏａｉｔｉｖｅＳｔｒａｎｄ　ＲＮＡ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　）Ｊアラン（Ａｌａｎ　）Ｒ，リス（Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　（１９８７）。この技法においてＲＮＡは、相同的ＲＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡコピーの指数関数的合成の鋳型として働く。

合成されるＲＮＡの量は初めに存在していた量よりはるかに多い。この増幅の技術はチュ（Ｃｈｕ　）　、　Ｂ、Ｃ，Ｆ、　、クレイ？−（Ｋｒａｍｅｒ　）　、　Ｆ、Ｒ，、オーゲル（Ｏｒｇｅｌ　）　、　Ｌ、Ｅ、の「バイオアッセイのための増幅可能レポーターＲＮＡの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａｎ　Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ＲＮＡ　ｆｏｒ　Ｂｉｏａ−ゲラ（Ｇｕｅｒｒａ　）　、　Ｃ，Ｅ、、ロメリ（Ｌｏｍｅｌｉ　）　＋　Ｈｏｌ　）シー−ルナ（Ｔｕｓｓ−ｉｅ−Ｌｕｎａ　）　＋　Ｉ　クレイ７−（Ｋｒａｍｅｒ　）　、　Ｆ、Ｒ，の「組み換えＲＮＡハイブリダイゼーション・プローブの指数関数的増％　（Ｆ：、ｘｐｏｎｅｎｔ　ｉａｌ　Ａｒｎｐｌ　ｉｆ　ｉ　− ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＲＮＡ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅｓ　）Ｊ　バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６：１１９７　１２０３（１９８８１０月）、これは参考としてユこに含まれており、原稿にてここに添付されている〔これ以降”リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）ら”と呼ぶ〕；公告されたヨーロッパ特許出願（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｅａｔｉｏｎ　）　第２６６，３９９号、（ＥＰ出ｉＮｏ、８７９０３１３１．８）　に開示されて〜・る。ハイブリダイズしなかったプローブを洗浄でとり除いたあと、ＲＮＡポリメラーゼを用いて複製可能なＲＮＡのコピーが作られる。公告されたヨーロッパ特許出願第２６６．３９９号の開示に従ってＲＮＡの複雑をＲＮＡがプローブに連結されている間に起こりうる。

また別の方法として複製可能なＲＮＡを複製に先だって残りのプローブと分離してもよい。この適用はまたプローブ配列を複製可能なＲＮＡに結合させるための様りな化学的連結を開示している。更にそれはそのプローブ配列が複雑可能なＲＮＡの一部であってよいということを開示しており、そのことはミエル（Ｍｉａ −１ｅ　）　、　Ｅ、Ａ、、ミルズ（Ｍｉｌｌｓ　）　、　Ｄ、Ｒ，、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ　）　＋　Ｆ　、　Ｒ。

らの「組み換えＲＮＡの自動触媒的複製（ａｕｔｏｃｕｔａｌｙｔｉｃ　Ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅｏｆ　Ｒｅｃｏｒｎｂｉｎａｎｔ　ＲＮＡＪ　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７１　：　２８１　２９５（１９８３）に記述されている。このヨーロッパ出願はまたそのような組み換えＲＮＡが標的配列Ｋｆｇ異的にハイブリダイズすることは、適当なＲＮＡ用ＲＮＡポメラーゼによる指数関数的複製の鋳型として働く能力を維持することと同様可能なはずであり、そのことは前述のりサルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）らによって得られた結果内に示されている。

ＲＮＡの複雑は、ＰＣＲを用いた標的の増幅とは反対に１回の工程で行うことができる。その工程において複製可能なＲＮＡを数十億ものコピー数まで合成でき、それらのＲＮＡはほんの２０分もの間にプローブに結合されて、理論的には１ｍの標的分子？恢出にまで導くことが可能である。しかしながら実際にはこのタイプのプローブ複製の感度は、しつこく非特異的に結合するプローブによつ℃限定されている。非特異的に結合したプローブは標的にハイブリダイズしたプローブとまったく同様に複製を行う。

信号増幅システムと一緒になったハイブリダイゼー７ヨ／技法を用いるバイオアッセイの実行においての主要な問題は、非特異的に結合したプローブ分子によって産生されるバンクグランドの信号である。これらのバックグランドの信号はバイオアッセイの感度に人為的な限界を与えている。従来のバイオアッセイではこの間趙は非特異的に結合したプローブをとり除くためにデザインされた念入りな洗浄法を用いることによって時には緩和されることがある。これらの洗浄法は必然重鎖アッセイを複雑で高価なものにしている。

共有結合している連結部位によって複製可能なＲＮＡに連結されたプローブを用いたアッセイのバンクグランド・ノイズ水準を下げる手段として、ヨーロッパ特許出願第２６６，３９９号は「スマート（Ｓｍａｒｔ）　プローブ」と呼ぶもの、即ちそのプローブが標的配列にハイブリダイズするまでは、そしエハイプリダイズしない限り複製の鋳型としては働かないよう命じられたＲＮＡに連結したプローブを開示している。その適用において２つの態様がスマートプローブのために開示されて℃・る。

その第１の態様ではスマートプローブは、既知の技法においてイン・ビボ又はイン・ビトロの方法によって作られた約７５−１５０のデオキシヌクレオチドから成るプローブ部位から成る。スマートプローブはまた組み換え体、即ち約１０− ３０ヌクレオチドの挿入異種配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｎｓ　ａｅｑｕｎｃｅ　）を含む複製可能なＲＮＡを含んでおり、これは例えばミーン（Ｍｉｅｌｅ　）　、　Ｅ、Ａ１．ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）、Ｄ、Ｒ，、クレイ？　−（Ｋｒａｍｅｒ　）　、　Ｆ、Ｒ，の「組み換えＲＮＡの自動触媒的？ｊ１．羨（Ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＲＮＡ）Ｊ　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１７１　：２８１−２９５　（１９８３）の方法によって作られる。−〇　（Ｐ　Ｏｘ）　ＮＨ（ＣＨ２）　ａ　ＳＳ　（ＣＨ２）　ｂＮＨ（Ｐｏｔ）Ｏ−の式で表わされる連結部位がそれら２つの部分をそれぞれの５′末端で結合しており、ここで言う龜、ｂはそれぞれ２から２０までを表して℃・る。更にまたスマートプローブのＤＮＡ部３′末端の配列はスマートプローブのＲＮＡ部にある異種配列にハイブリダイズすることができる。

（そして非常にしやすい）。リボヌクレアーゼＨｅ素は標的にハイブリダイズしなかったスマートプローブのＲＮＡ部を切断できるが、標的にハイブリダイズしたスマートプローブのＲＮＡ部を切断することはできないと述べられており、なぜならス７トプロープのＤＮＡ部にあるプローブ配列がその標的にハイブリダイズしている時はスマートプローブのＲＮＡ部にある異種配列に同時にノ・イブリダイズすることは不可能で、あるからであり、それ故増幅に先だって非特異的に結合しているプローブを排除する方法を提供するものであるとされている。ＲＮＡ複製による増幅は連結部位のＳ−８結合切断の予備ステップを任意に含んでいると述べられている。

その態様において標的に７・イブリダイズしていないプローブの切断はりボヌクレアーゼＨにとって可能であると述べられているのは、スマートプローブのＤＮＡ部３′末端（プローブ配列を含む部分）が組換え複製可能ＲＮＡ部にノ・イブリダイズしており、おそらくそれ故リボヌクレアーゼＨがそのＲＮＡを切断できて、それをＲＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼによる増幅の鋳型上して作動不能にするような部分を提供しているからである。

公告されたヨーロッパ特許出願第２６６，３９９号で開示されている。スマートプローブの他の態様においては上で述べられているように連結されたプローブ部、連結部、複製可能なＲＮｐ、ｍがある。ここではしかしプローブは５０−１５０ヌクレオチドのプローブ部分のみではなく、史に「クランプ（Ｃｌａｍｐ　）Ｊ部分と呼ばれる追加部分をその両端に、即ち５′−クランプ部位と３′−クランプ部位をそれぞれ約３０−６０ヌクレオチド含んでいる。各クランプ部位は複雑可能なＲＮＡ部位にノ・イブリダイズしてそのプローブが標的に７・イブリダイズしている時以弧または・・イブリダイズするまでそのＲＮＡを複製の鋳型としては不活性であるようにする。そのような、標的に対するノ・イブリダイゼーションは、直接あ６ｚ−はＳ−８結合の任意的切断ののちにクランプを放出させる。

公告されたヨーロッパ特許出願第２６６，３９９号で開示されたスマートプローブは、弱く共有結合して〜・てどちらかと言うと容易に分離できるＳ−Ｓ連結を含むやや複雑な連結部から成る。Ｓ−Ｓ結合は還元宋件下で簡単に分離する。この適用で開示されて〜・るスマートプローブの２つの変形は、プローブを有能にするために離才ｔだ同一分子内の相互作用に依っている。これは、特に距離のある相互作用についてよ（理解されていないのでそのようなプローブをデザイ／することが困難であり、不利な点である。前述で報告されて〜・る第２の変形は更に複雑で、比較的％ｌ、・隣り合った相補同士に置き換わるべき２つの遠くのクランプを使用して℃・る。そしてそのデザインは）・イブリダイズしているかいな℃１かの遠くのクランプ両方に依存しており、そのことがデザインを非常に難しくしている。

本発明の目的は、核酸ノ・イブリダイゼーションのプローブを有能にする、即ち、適当なアッセイにおいてプローブが標的配列にノ・イブリダイズした時のみ信号に生がｂ捕ヒどなるような単純な分子的アロステリックなスイッチにある。

本発明のさらなる目標は信号産生システムの活性をそのようなスイッチの状態に連結させることである。

本発明の更にもう１つの目標は活性がスイッチの状態に依存するような、いくつかの異なる信号産生システムのどれととも連結されているようなアロステリックスイッチを含むプローブを開発することである。

不発明のもう１つの目標は上記構築物を用いた、改良された感度を持つアッセイを開発することおよびアッセイを実行するキットを開発することである。

発明の概略本発明は単純な分子的アロステリックスイッチに基づくものであり、それは比較的短いプローブ配列と標的配列の間で核酸二重らせんが形成される時、二重らせんの末端はその硬直性の故に、必ず互いに離れて位置づけられる、という原則の上で働くものである。この硬直性については／ヨア（５ｈａｒｅ　）　、　Ｄ、　、ランボウスキ（Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ　）　、　Ｊ、、ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ　）　、　Ｒ，Ｌ、の「短い切片の共有結合的閉環によって研究されたＤＮＡの柔軟性（ＤＮＡ　Ｆｌｅｘｉｂｉ　−１ｉｔｙ　５ｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ＣｏｖａＬｅｎｔ　Ｃ１ｏｕａｕｒｅ　ｏｆ　５ｈｏｒｔ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　１−ｎｔｏ　Ｃ４ｒｅｌｅｓ、）Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８　：　４８３３−４８３７（１９８］ン；ウラノブスキ（Ｕｌａｎｏｖｓｋｙ　）、Ｌ、、ボドナー（Ｂｏｄｎｅｒ　）　＋Ｍ１．トリフオノフ（Ｔｒｉｆｏｎｏｖ　）　ｒ　Ｅ　、Ｎ、　ｒテヨダー（Ｃｈｏｄｅｒ　）　、　Ｍ −の［曲がったＤＮＡ　：デザイン、合成、そして環状化（Ｃｕｒｖｅｄ　ＤＮＡ：Ｄｅｓｉｇｎ。

この発明は少なくとも以下の必涜部分を含む核酸〕・イブリダイゼーションプローブの使用に関するものである：長さ約１５−１１５ヌクレオチドのプローブ配列で、両端がプローブ配列よりかなり短い、好ましくはプローブ配列の半分の長さを＆端にはこえないくらいの相補的核酸配列によってかこまれているもの。この３つの配列の組合わせが単純な分子的アロステリンクスイッチを形成する。標的配列にハイブリダイズされていな℃・時、このスイッチ配列は互〜・にハイブリダイズされ、これを我々は閉鎖スイッチと呼ぶ。プローブ配列が、そのためにデザインされた、丁でに決定されている相補的標的配タリにハイブリダイズする時、硬直性の二重らせんを形成するためのプローブと標的配列の間の強い相互作用は必然的にスイッチ配列の分離を生じ、我々はこれを開スイッチと呼んでいる。開いた形状において、スイッチ配列は互いに作用することはできない。

本発明は上記スイッチを持つプローブ分子を含んでおり、スイッチ配列のうちの１つ、または組合わせられたスイッチ配列の両方が生物学的に機能する核酸部を含み、それは既定の標的配列に対するプローブのノ・イブリダイゼーションを指示する検出可能な信号の選択的産生に有効である。

本発明は更にバイオアッセイ法を含み、その方法は上記プローブ分子内のスイッチ分子におけるアロステリックな変化を利用して、プローブが既定の標的配列と・・イブリダイズしたことを指示する、検出可能な信号を産生する、というものである。アッセイは定性的（定性的に示すもの八または定量的（定量的な決定）であってよい。それは増幅を含んでよく、それは直線的又はまさに指数関数的であってよい。

本発明はまた上記バイオアッセイを行うための、試薬と巨大分子（ｍａｃｒｏ− ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のキットを営む。

図面の簡単な説明第１図は本発明による閉鎖スイッチの図式的表示である。

第２図は第１図のスイッチを、開いた状態で図式的に表示したものである。

第３図は実施例１のプローブの図式的表示で、開いた状態にあるスイッチを含んでいる。

第４図は実施例２のプローブの図式的表示で、閉鎖状態にあるスイッチを含んでいる。

第５図は実施例２のプローブの図式的表示で、開いた状態にあるスイッチを含んでいる。

第６図は実施例３のプローブの図式的表示で、閉鎖状態にあるスイッチを含んでいる。

第７図は実施例３のプローブの図式的表示で、開いた状態にあるスイッチを含んでいる。

第８図は実施例４のプローブの図式的表示で、閉鎖状態にあるスイッチを含んで（・る。

第９図は実施例４のプローブの図式的表示で、開−・た状態にあるスイッチを含み、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ　）をつけ加えて示している。

第１０図は、第９図で示されたりボザイムのヌクレオチド配列を示す詳細な図式である。

第１１図は実施例４のプローブの図式的表示で、開いた状態にあるスイッチを含み、追加ストランドをつけ加えて示している。

第１２図は実施例５のプローブの図式的表示で、閉鎖状態にあるスイッチを含んでいる。

第１３図は実施例５のプローグの図式的表示で、開いた状態にあるスイッチを含んでいる。

る３つの必須なプローブ要素、即ちプローブ配列とその両側にある相補的スイッチ配列を含有している。第１図に抽写されているように、スイッチは閉じている。第２図は同じプローブまたはプローブ部位が開℃・た状態にある。

第１図に関して、プローブ配列１は５′側２から３′側３に渡る核酸プローブ配列である。プローブ配列の５′側にすぐ隣合っているのは核酸第１スイツチ配列４である。プローブ配列の３′側にすぐ隣合っているのは核酸第２スイツチ配列５である。スイッチ配列４と５は相補であり、水素結合７を介して互いにノ・イブリダイズし、ステム（Ｓｔｅｍ）６の「ヘアピン」２次構造を形成する。第２図に関して言及すると、プローブ配列１は水素結合９を介して既定の標的配列８にノ・イブリダイズされている。スイッチ配列４と５は互いに離り作用し合っていない。

プローブはＲＮＡでもＤＮＡでもよい。プローブ配列ｌは既定の標的配列８と高度に特異的に作用し合うのを確実にする。光分な長さがなければならない。それは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さでなくてはならないのだが、それが少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであることが好ましい。

プローブ配列１は標的配列８にハイブリダイズした時（第２図）その両側２．３が、２．３側の間にあるハイブリダイズした領域の硬直性によってスイッチ配列４．５が互いに作用することを許容するような距離内に互℃・に近づくのを物理的に防げることを確実にするため光分に短くなければならない。言い変えるなら、プローブ配列がハイブリダイズして（・る時、スイッチ配列は必然的に互（・に〕・イブリダイズしていな℃・。更にもう１つの力が開いた状態への転換をおこすのに働し・ていて、即ちそれは第２図に示されたハイブリダイズされた領域が二重らせんを形成する時、ステム６をまき戻そうとするねじれの力である。実際にはプローブ配列は約１００ヌクレオチドより長くはない。プローブ配列は２０−６０ヌクレオチド長であることが好ましく、最も好ましいものは約３０ヌクレオチド長である。

スイッチ配列はプローブ配列の長さに関係している。最も好ましくは、スイッチ配列の長さはプローブ配列の長さの半分を超えないものがよい。スイッチ配列は安定なステム６の形成のため少なくとも約１０ヌクレオチド長あるべきである０ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ　）＋　Ｄ、Ｈ，＋スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ　）＋Ｎ、＋　ジエーガー（Ｊａｅｇｅｒ　）　、　Ｊ　、Ａ、　、ロングフェロ−（Ｌｏｎｇ−ｆｅｌｌｏｗ）　、　Ｃ，Ｅ−＋　７ライアー（Ｆｒｅｉｅｒ　）　、　Ｓ、Ｍ、　、カーゼツク（Ｋｉｅｒｚｅｋ　）　、　Ｒ，の［ＲＮＡ構造の予ｉｈのための改良されたパラメーターＣ工ｍｐｒｏｖｅｄ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅ　−る態什のためのスイッチ配夕１ｊの長さはまた必要な慨能配列を言むのに光分に長くなげればならない。約１０〜３０ヌクレオチドのスイッチ配列が望まし℃・。

本発明に従ってプローブをデザインするにあたり、使用されるアッセイ条件下での開スイッチハイブリッド（第２図）の閉スイツチハイブリッド（第１図）に比較した相対的強さに注意を払わなくてはならない；前者がより強くなくてはならなし・。しかしながらアッセイ条件にはハイブリッドの強さが単に長さ依存であるものがある。ウッド（Ｗｏｏｄ　）　＋　Ｗ、　Ｉ　、　＋キットシエア（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ　）　、Ｊ、。

ラスキー（Ｌａｓｋｙ）＋　Ｌ、Ａ、、ｏ−ン（Ｌａｗｎ　）、Ｒ，Ｍ、の「テトラメチルアンモニウムクロライドにおける塩基構成非依存性のハイブリダイゼーション（Ｂ＆−ｓｅ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｓｔｒａｍａ　−ｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　）：？１ＩＪｆｔにＯＮな遺伝子ライブラリーのオリゴヌクレオチドスクリーニングの方法（Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅスイッチデザインはプローブまたはプローブ部位（第１．２図）を適当なヌクレアーゼで標的配列を言むモデル核酸にハイブリダイズする前と後で分解し、その後分解産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することで容易に検討することかできる。これは当業者には明らかでありこれ以上の説明は行わな（゛。

閉から開への転換をおこす助けをするためストランドの置き換えの原理を利用して追加の力を供給してもよい。グリー：ｙ（Ｇｒｅｅｎ　）、Ｃ，とテイベツン（Ｔ１−ｂｂｅｔｔｓ　）　、　Ｃ、の「再結合の割合（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　）はブランチ・マイグレーション（Ｂｒａｎｃｈ　Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　）によるＤＮＡストランドの置き換えを制限した（Ｒｅａｓｇｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｒａｔａ　Ｌｊｍｉｔｅｄ　Ｄｉｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆＤＮＡ　５ｔｒａｎｄ　ｂｙ　Ｂｒａｎｃｈ　Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　）Ｊ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　９：１９０５−１９１８（１９８１）。これはスイッチ配列をプローブ配列にオルバーラップさせろことによって速性されてよく、それはスイッチ配列の少なくともｌヌクレオチドは同時にプローブ配列のヌクレオチドでもあることを意味する。

スイッチ配列がプローブ配列に隣接しなければならない一方、それらはただち（ τ隣である必要はない。いくつかのヌクレオチドがスイッチ配列とプローブ配列を離して（・でもよく、しかしスイッチの憬北が物質的に影響を受ける程に多くはない、当業者が４８に認めるであろう数によって、である。

本発明のプローブ分子は上述のスイッチを含み、デザインを派生させてなおかつプローブ配列ハイブリダイゼーション（第２図）をともなうアロステリンク変化を信号発生に利用することが可能である。

例どして、スイッチ配列は、そのコンフォメーションのおかげで開いた状態にあると仮定して、他の巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ　）やまた同一分子内の異なる部分とさえ作用することが可能とされ、これは検出可能な信号産生に要求される。下の実施例１では第２のスイッチ配列は−〜・た状態において相補的核酸ストランドとハイブリダイズすることができる。実施例３では第１スイツチ配列は開いた状態においてヘアピン構造をとってウィルスタンパクに特異的に結合することを可能にして℃・る。実施例４において第２スイツチ配列は開いた状態においてオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドと作用できる。

実施例５において第１スイツチ配列は、開いた状態において同一プローブ分子内の比較的離れた領域と作用することを可能にするような、構造化されたコンフォメーションを仮定して℃・る。

その反対をすることもまた可ｎヒである。実施例２において、スイッチ配列はそれが閉じた状態にある時のみ特異的＃素に結合できる。

この発明のプローブ分子と方法を用いた信号産生には多くの種類がある。単純なアロステリックスイッチの状態は信号産生を支配し、それはプローブ配列がその憚的配夕１］にハイブリダイズしない限り信号は産生されないことを意味する。

信号産生システムには増幅を伴うもの、特に指数関欽的な増幅を行うものが感度を上げるために好ましい。

以下のχ施例は増嘱を伴う無数の笈法のいくつかを示して〜・る。それらはすべてＲＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼによる、複製可能なＲＮＡの指数関数的複製を用いて、容易に検出できる信号を産生する。実施例はＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡを使用しており、これはカンアン（Ｋａｃｉａｎ　）　＋　Ｄ、Ｌ１ミルズ（Ｍｉ目、ｓ　）　、　Ｄ、Ｒ，、フレ＜　マー（Ｋｒａｍｅｒ）＋　Ｆ、Ｒ，＋スピージエルマン（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ　）　ｒ　Ｓ　、の［細胞外進化と複製の詳細な分析に週した、複製を行５ＲＮＡ分子（Ａ　Ｒｅｐｌｉｃａ　−ｔｉｎｇ　ＲＮＡ　ＩＶｌｏｌｅｃｕｌｅ　５ｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ａ　Ｄｅｔａｉｌｅｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９：３０３８　３０４２（１９７２）で述べられている。実施例はまたＱベータ　Ｎプリカーゼ（Ｑ− ｂｅｔａ　ｒｅｐｌｉｃａｓｅ　）を使用しており、これはＭＤＶ−ｌＲＮＡを複製するための特異的ポリメラーゼである。Ｑベータ　リフブリカーゼはハルナ（Ｈａｒｕｎａ　）　＋　Ｉ　、とスピージェルマン（Ｓｐｉ−ｅｇｅ　１ｍ１ｎ　）　ｒ　Ｓ　、の「ＲＮＡＮプリカーゼの特異的鋳型要求性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃちろん任意の複製可能なＲＮＡとその相同的Ｎプリカーゼでも用いることができるであろう。他の有用な信号産生システムは、酵素、酵素の補因子（ｃｏｆａｃｔ−ｏｒ）、リボサイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ　）　、生物学的活性に要求されるＤＮＡとＲＮＡの配列（例えばプロモーター、プライマー、ある℃・は細菌の形質転換に使われるプラスミドの接着に必要なリンカ−など）を使用しつる。

検出可能な信号は様々で、例えは放射、光吸収、螢光、質量増大、生物学的活性のある化合物の存在などが言１れる。

この発明の、ハイブリダイズしたプローブを検出するのに用いることのできるアッセイ技術もまた様々である。以下の実施例において、複製可能なＲＮＡの合成が、プローブ配列のハイブリダイゼーションが８こったことを信号するのに使われている。実施例で示されている信号産生システムは大まかな３つのクラスに分けられる：実施例２−３ではスイッチは複製可能なＲＮＡ０中にとりこまれている；実施例４−５では複製可能なＲＮＡ配夕ｊ」かプローブ部位につながっていて、切断後しか複製され侍ないようになっており、それは島スイッチの存在に依存する；そして実施例１においては、ハイブリダイゼーションの後で加えた鋳型から復製可能なＲＮＡが転写されるのは、開スイッチ配列が転写の機能的プロモーターの一部を形成する時のみおこり得る。

それに伴った実施例において明らかにされたそれぞれの特異的態様は、プローブが標的配列にハイブリダイズしさえすれば信号が産生されるという目的を満足している。示された信号産生７ステムは生物学的活性が散積にスイッチの状態に依存するか、あるいはスイッチの状態が非特異的に結合したプローブを信号産生不能にする手段を供給するか、あるいはスイッチの状態がノ・イブリダイズしたプローブを非特異的に結合したプローブと分離する手段を供給するかの（・ずれかである。かくして各特異的態様は非特異的に結合したプローブによっておこるバックグランドを著しく減少し、それ故増幅を含むアッセイの感度を顕著に増大させる。

実施例１この実施例ではプローブはＤＮＡ一本領で次の３つの配列を営んでデザインされている：約３４ヌクレオチド長のプローブ配列；プローブ配列の５′側にすぐに隣り合った、約１７ヌクレオチドの第１スイツチ配列；そしてプローブ配列の３ ′側に丁ぐに隣り合った約１７ヌクレオチドの第２スイツチ配列。スイッチ配列は互℃・に相補であるようデザインされ℃いる。互いにハイブリダイズする時、ハイブリダイズされたスイッチ配列はＤＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼ、即ちバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを包含する。この適用にお ℃・て第１スイツチ配列を「プロモーター配列」、第２スイツチ配列を「プロモーター相補」配列と呼ぶ。この実施例においてスイッチ配列はプローブ分子の末端を含む。プロモーターとプロモーター相補配列のデザインはオスターマン（０８−ｔｅｒｍａｎ　）＋　Ｈ，Ｌ、とコールマ／（Ｃｏｌｅｍａｎ　）＋　Ｊ、Ｅ、のｌＴ７リボ核散ポリメラーゼ−プロモーター相互作用（Ｔ７　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒａ　−々が選んだ特定のプロモーター相補配列はＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡである。

既定の憚的配列に相補なプローブ配列を含む、プローブ分子は技法においてよく矧らｒている方法を用いてオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学的合成によって作ることができる。例えばゲイト（Ｇａｉｔ　）　、　Ｍ、　Ｊ　、の「オリゴヌクレオチド合Ｆｙ、（ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳＩＳ）Ｊ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オフスフオード（０ｘｆｏｒｄ　）　、　Ｘ国（ＵＫ）（１９８４）。

この尖乃例のプローブは、このプローブ配列に札袖なりＮｈｔたはＲＮＡ標的配列をｅＥＩｌｌｊするのに用いることができる。標的配夕１」は他の、無関係な核歌や他の物質、例えばタンパク質などを含んだサンプル中にあつ℃よい。プローブは例えばヒト血液や尿などの診療サンプル中の感染物質（ウィルス、細菌、ぶ虫など）の遺伝子切片を検出するのに使用されてよ（・。

標的配タリはプローブにさらされなくてはならない。この技法はよく知られている。一般に、しかし必ずしもではないが、核酸はプローブが加えられる前にサンプルから分離される。

プローブと、核＃標的配夕１ｊを含んでいるかもしれないサンプルは次にプローブ配列と標的配列のハイブリダイゼーションをおこすのに適切な、時間と温度を含む条件のものでインキュベートされる。適切な条件は技法においてよく知られている。存在する標的配列の数の定電的決定には予想される標的最高量を超えた、好ましくははるかに過剰であるようなプローブ量が使用されるべきである。もし標的配列の存在の質的六示のみを望むなら、より少量のプローブを用いることができる。

標的にハイブリダイズしたプローブは技法でよく知られている方法、例えば捕獲プローブを使用して結合していないプローブと分離される。

分離の後、処理済サンプルは標的に）・イブリダイズしたプローブ（第２図）と、更に非特異的に貼付したプローブとを含む。この三者はしかしながら同じ形状にはない。ハイブリダイズしたプローブではアロステリックスイッチは開いている；部ちスイッチ配列は互いにノ・イブリダイズレα・な（・。しかし非％異的に結合したプローブにおいては、スイッチ配列は互いに）・イブリダイズしたままである。

これら開スイッチのプローブの検出について述べる。この実施例は検出に先がけた増＠を言む。

第３凶を蚕押、しで述べると、サンプルは復製りｎしなＲＮＡの転写のためのプロモーター０じタリ１１と鋳塑配夕１」１２を官有する一不頚ｏ　Ｎ　Ａ分子ｌＯとインキュベートさｎる。プロモーター配列１１は水素結合１３を介して、仮性に知られている栄件下で、開スイッチを付つプローブの第２スイツチ配列１５のプロモーター州匍にハイブリダイズする。特別にこのＤＮＡ分子はプロモーター配列（上で述べられたプロモーター相補に相補である〕の１７デオキ７リボヌクレオチドから成り、ＭＤＶ−ポリけＪＲＮＡに相補な２４４のデオキシリボヌ νレオチドがつながって（・る。これは前述のリザルデ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）らによつ℃述べられている。このＤＮＡ分子は、技法において知られている方法でその配列を含むプラスミドの適当な制限断片の相補鎖の１つを分離して調製することができる。マニアテス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）　ｒ　’ｒ、ｌフリツツエ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ　）　、　Ｅ、Ｆ、　、サニプルツク（Ｓａｎｂｒｏｏｋ）＋　Ｊ−＋　ｒモレキュラークローニングＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：アラホ゛ラトリーマニュアル：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊコールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド　スプリング　ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　（１９８２）。我々が構築した過当なプラスミドは（１）唯一の制＠部位（即ち、そのプラスミドの他の場所には存在しない制限部位）で、プロモーターの上流にあり、プロモーターに近いもの（２）プロモーターに遠い、ＭＤＶ−ボ１ＪｅＤＮＡ配列末端にある５ｒｎａ　Ｉ制限部位、を含む。

続いてサンプルは市販のクローン化されたバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼとインキュベートされ、技法で知られている条件を用℃・て各開スイッチにつきＦＪ５０−２００の、あるいはそれ以上のＭＤＶ−ポＩＪＲＮＡ転写物を合成する。ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　）　＋　Ｊ、Ｆ、、ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ　）　＋　Ｒ，Ｇ、　、ウイゼレル（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ　）、Ｇ、ｗｚウーレンベソク（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　）　、　Ｏ、Ｃ。

の［Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと合ＱＤＮＡ＃ｆｆｌを用いたオリゴリボヌクレオチド合ｇ（Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｔ７　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙ−ｍｅｒａ’＋ｅ　ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ＤＮＡ　Ｔｅｎｐｌａｔｅ　）Ｊ　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ　− リノラーゼの鋳型であるＭＤＶ−ボＩＪＲＮＡ転写物とインキュベートする。我々は二オヤ／グ（Ｅｏｙａｎｇ　）　、　Ｌ、とオーガスト（Ａｕｇｕｓｔ　）　＋　Ｊ、Ｔ、の［ファージＱ−ベータ感染した大腸菌からのＱ−ベータＲＮＡポリメラーゼ（Ｑ−ｂｅｔａＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐｈａｇｏ　Ｑ−ｂｅｔａ−４ｎｆｅｃｔｅｄ　Ｅ、　Ｃ（已り」アンドロウ（Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ　）　、　ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９７１）の方法によりＱベータリプリカーゼを調製した。インキュベーションは転写物の指数ｒｊＡ数的増幅に適切な条件下で行われた。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ　）　、　Ｆ、Ｒ，＋ミルズ（Ｍｉ　ｌｌｓ　）　、　Ｄ、Ｒ，、コール（Ｃｏｌｅ　）、Ｐ、Ｂ、、ニジ／％う（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ）、Ｔ、、スピージエルマン（Ｓｐｉａｇｅｌｍａｎ　）　＋　Ｓ　、の［イン・ビトロにおける進化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）　：　エチジウム　ブロマイドに耐性な変異ＲＮＡの配列と表現型（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｈｅｎｏｔｙｐａ　ｏｆ　Ｍｕｔａｎｔ　ＲＮＡＲｅ５ｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　Ｅｔｈｉｄｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ　）　Ｊ　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　８９　：　７１９指数関数的に増幅するＲＮＡの検出はこの応用のはじめに述べたように、物理的あるいは化学的手段の様々な方法のいずれによっても行うことができる。定量的決定にはＲＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼとある一定時間インキユペーションしたあと検出されるＲＮＡの量がサンプル内に存在する標的配列の数の測定量となる実施例２第４図に関連して、この実施例ではプローブは複製可能な組換えＲＮＡ１４である。ミーン（Ｍｉｅｌｅ　）　＋　Ｅ−Ａ−＋ミルズ（Ｍｉｌｌｓン、Ｄ、Ｒ，、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ　）　＋　Ｆ、Ｒ，の［組換えＲＮＡの自媒介的Ｄａ（Ａｕｔｏｃａｔａｌｉｔｉｃ　Ｒｅ　−ｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＲＮＡ）Ｊ　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１７１　：　２８１− ２９５（１９８３）。それは前述のりザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）らの方法に従って調製してもよい。この実施例に便ってプローブを調製する目的として、複製ｂＪ舵な組換えＲＮＡ内にｉすれる異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｎｓ　）配列１５が３つの配列を含むようデザインされている：それらは約４６ヌクレオチド長のプローブ配列１６；プローブ配列の５′側にただちに隣合った約２３ヌクレオチドの第１スイツチ配列エフ；そしてプローブ配列の３′側にただちに隣合った約２３ヌクレオチドの第２スイツチ配列１８、である。スイッチ配列は互いにノ・イブリダイズした時、大腸菌リボヌクレアーゼ■の二不鎖餡識部位を形成するようデザインさＣている。このＥＩ＆部位はスイッチ配列が互いにノ・イブリダイズしていない時はオファージＴ７ＲＮＡにおけるリボヌクレアーゼ■のプロセシング部位を囲むヌクレオチド配列（ＮｕｃＪｅｏｔｊｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ　ａ　Ｒｉｂｏｎｕ　−ｃｌｅａｓｅ　Ｉｌｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　５ｉｔｅ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ７　ＲＮＡ）Ｊ術を用−゛てＮｉ換えプラスミドから転与することによって作ることができる。

樟的配タリの露出、その標的配列とプローブのノ・イブリダイゼーション、そして結合して℃・ないプローブからの分離は実施例１で述べられて（・る通りである。第５図に示されているように、ハイブリダイズしたプローブ１４のプローブ配列１６は標的配列８にハイブリダイズされ、それ故スイッチ配列１７．１８を強いてひき離す。

サンプルをそれから技法で知られている適切な条件下で大腸菌リボヌクレアーゼ ■とインキュベートし、すべての非特異的に結合したプローブを（そして残って −・るどの非結合のプローブも）切断して、それらをＱベータリプリカーゼによる指数関数的複製の鋳型として貫ノ＜ことができないようにする。ニシノ・う（Ｎ１−ｓｈｉｈａｒａ　）　＋　Ｔ、＋ミルズ（Ｍｉ目１）、Ｄ、Ｒｏ、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ　）　＋　Ｆ。

ＲｏのｒＭＤｖ−Ｉ　ＲＮＡにおけるＱベータリプリカーゼ認識部位の配ｆＩＬ（ｉ　ｏ　−ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　）（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｑ−ｂｅｔａ　Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ　Ｒｅ　−ｃｏｇｍｉｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ｉｎ　ＭＤＶ−ＩＲＮＡＪ　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９　３　二　６６９− ６７４（１９８３）。リボヌクレアーゼ■１はそれから例えばフェノール抽出などの、技法でよく矧られている方法によってサンプルから除去される。

我々は短時間の加熱ステップ、リザルデイ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）ら、前述、によって標的配列からプローブを敢しているが、予備的実験はこのステップが任意でよいことを示した。

Ｑ−ベーターレプリカーゼによるプローブの指数関数的複製および検出を笑施沙１１１に小したように行なわれる。

実施沙＋１３゜この実流例ではプローブ１９（第６図）は実施例２のように複製可能な組換えＲＮＡであるか異なる点としては、プローブ配列２０は約３８ヌクレオチド長でリダイ゛ズしている時バクテリオファージＲ１７の殻タンパクの結合部位を形成せず、しかしそのようにハイブリダイズして〜・な（・時は第７図に示すように第１スイツチ配列２１はその殻タンパクの％い結合部位である二次構造を含むように形づくる。カレイ（Ｃａｒｅｙ　）　＋　Ｊ、＋カメ０７（ＣＩＬｍｅｒＯｎ）＋ｖ、＋デ＋Ｉ％セス（ｄｅ　Ｂａ５ｅ　ｔｈ　）　＋　Ｐ　−Ｌ、ｒウーレンペツク（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　）　＋　Ｏ，Ｃ，の「Ｒ１７殻タンパクの、リボ核酸結合部位での配列ｌ＃異的相互作用（５ｅｑｕ＠ｎｃｅ−８ｐａ　−ｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒ１７Ｃｏａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗｉｔｈ　Ｉｔｓ　Ｒｉｂｏ−ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　）ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２　：　２６０１−２６１０（１９８３）。

標的配列の括出、その標的配列とプローブのハイブリダイゼーション、そして結合していないプローブからの分離は実施例１で述べられている通りである。

バクテリオファージＲ１７殻タ／バクは固体支持棚に、例えばセファデックスやセファロイックビーズ、マグネティックビーズ、あるいはマイクロタイタープレートなどに技法ではよく知られた方法によって共有結合的に結合されている。

このような結合の方法の一例はアラボン（Ａｌａｇｏｎ　）　＋　Ａ、Ｊ　、とキング（にｌｎｇ）、Ｔ、Ｐ、の「ポリサッカライドの２−イミノチオレン（２ −１ｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａ　−ｎｅ）による活性化とその使用（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏ１）＋＋＋ａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｗ−ｉｔｈ　２−ｌｍ１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ　ａｎｄ　Ｕｓ　Ｕｓｅｓ　）Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９　：４３３１−４３４５（１９８０）で運べられている。標的配列に結合したプローブと非特異的に結合したプローブを言む、洗浄したサンプルが不浴化されたＲ１７殻タンパクに加えられる。非特異的に結合したプローブは洗浄によって除去さｒ、る。

我々は辺い加熱処理によってＲ１７ｆｆタンパクと標的配列の両方からプローブを放し、固体支持棚を除く。

Ｑ−ベータリプリカーゼによる、プローブの指数ｒＪＡ数的複裂と検出か実施例１で述べられたように行われる。

実施例４この実施例にお（・℃プローブ２３（第８図）は４つの愼能的に異なる配列を含むようデザインされた一本鎖ＲＮＡである、それは：約３４ヌクレオチド長のプローブ配列２４；プローブ配列の５′側にただちに隣り合った。約１７ヌクレオチドの第４スイツチ配列２５；プローブ配列の３′側にただちに隣り合って位置し、第１に相補で、同じ長さの第２スイツチ配列２６；そして第２スイツチ配列の３′側からのびた、複製可能なＲＮＡ配列２７から成り、ここで上記複製可能なＲＮＡ配列の少なくとも５ヌクレオチドは第２スイツチ配列の３′側のヌクレオチドでもある；即ち複製可能なＲＮＡ配列は第２スイツチ配列とオーバーラツプしていると見なすことができる。

標的配列の露出、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーション、そして非結合のプローブの分離は実施例１のように周知である適当な条件下で行われる。

第９図に示されているように、プローブ配列２４は標的配列８にハイブリダイズしてスイッチ配列２５．２６は離れさせられ、それ故複製可能なＲＮＡ配列２７を解放する。プローブが結合した複製可能なＲＮＡ配列は、この時点ではたとえスイッチが開いていてもＲＮＡポリメラーゼによる指数関数的複製を受けない。

指数関数的複製を受けさせるためには複製可能なＲＮＡ配列２７はその５′側で切断されなければならないニジハラ（Ｎ１５ｈｉｈａｒａ）、Ｔ、ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）。

Ｄ、Ｒ，、クンイ？　−（Ｋｒａｍｅｒ　）　、　Ｆ、Ｒ，のｒＭＤＶ−ＩＲＮＡ　におげろＱベータリプリカーゼ認識部位の配置（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｑ−ｂｅｔａ　Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ｉｎ　ＭＶＤ−ＩＲＮＡ）ＪＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９３　：６６９−６７４（１９８３）。

複製可能なＲＮＡ配列を切断するのに少なくとも２つの手段がある。１つはりボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）切断である。もう１つはりボヌクＶアーゼＨによる切断である。前者が好ましく、まずそれを最初に説明する。

Ａ、リボザイム切断リボザイムは組みたてられたＲＮＡ分子で、例えば特定してフオスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ　）結合の切断など、化学反応を触媒することができる。技法においてはりボザイムは２つの分離したオリゴリボヌクレオチドの相互作用によって構築することができることがよく仰られており、２つのオリゴリボヌクレオチドの１つは周知である。適切な条件下でインキュベートすると特定のフオスホジエステル結合で切断される。ウーレンベソク（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　）　、　Ｏ，Ｃ。

の「小さな触媒的オリゴリボヌクレオチド（Ｓｍａｌｌ　Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕ　−ｃｌｅｏｔｉｄｅ）ＪＮａｔｕｒｅ３２８：５９０　６００（１９８７）：ヘイゼロ７（Ｈａｓｅｌｏｆｆ　）　、　Ｊ　、とガーラソク（Ｇｅｒｌａｃｈ　）　、　Ｗ、Ｌ、の「新しい、高度に特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を持つ簡単なＲＮＡ１Ｊ１素（Ｓｉｍｐｌｅ　ＲＮＡＥｎｚｙｍｅ　ｗｉｔｈ　Ｎｅｗ　ａｎｄ　Ｈｉｇｈｌｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＥｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡｃｔｊｖｉｔｉｅｓ）ＪＮａｔｕｒｅ３３４：５８５　５９１（１９８８）。

活性のあるリボザイムの２つの部分に対する要求性は上に引用した２つの参考文献内で概略が述べられている。この発明の目的のため、我々のプローブの第２スイツチ配列は切断される配列の条件を満すようデザインされている。前述のりザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）らに従って、我々が行うために選んだ複製可能なＲＮＡ配列はＭＤＶ−ボ！Ｊ（＋）ＲＮＡである。好ましいデザインを第８囚に示す。そこに示すように、第２スイツチ配列は１７ヌクレオチド長で、ＭＤＶ−ポリ（十）ＲＮＡの５′側の１１ヌクレオチドは第２スイツチ配列の３′側のヌクレオチドでもある。第２スイツチ配列は要求されるＧＵＣ配列を含んでおり、これはＧＵＣの３′側にある、部ち複製可能なＲＮＡ配列の５′側にあるフオスホジエステル結合の切断に必要である。第２スイツチ配列をデザインする際、続いておこるリポザイム形成のための・・イブリダイゼーションは、複製可能なＲＮＡ配列の両側間で２こる相互作用より、よりおこりやすくすることを確実にする注意が必要である。

プローグは適当な組換えプラスミドからの転写によって作ることができる。そのようなプラスミドは前述のりサルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ　）らの基準によって周知である方法を用いてデザインされる。それは周知である方法で構築される。マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）　、　Ｔ、＋フリノツ（Ｆｒｉｔｓｃｈ　）　、　Ｅ、Ｆ、、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ、＋　ｒモレキュラークローニング：ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）Ｊ　コールドスプリングか−バーラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスフ０リングハーバ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏ−ｒｋ）（１９８２）。

非切断ストランド２８は要求されているりボザイムを形成することができ、第９図に示されている。それは周知方法によって作られる。ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇ −ａｎ　）　、　Ｊ、Ｆ、、ダンカン（Ｄｕｎｃ、ａｎ　）　、　Ｒ−Ｇ、　、ウイゼレル（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ　）　＋Ｇ、Ｗ、、ウーレ／ペック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　）　、　０　、　Ｃ、の「Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと合成りＮＡ＠３ｇを用いたオリゴリボヌクレオチドの合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ−ｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａａｅ　ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅ　−８３−８７９８（１９８７）。桑１０図は第９図のスイッチ配列２６とストランド２８によって形成されるリボザイムのヌクレオチド配列を示して℃・る。

非結合のプローブの分離は、好ましくはそれに続いて上述の非切断ストランド２８を周知乗汗下でサンプルとインキュベートし、そのストランドと標的配列にハイブリダイズしているプローブ内の第２スイツチとのハイブリダイゼーションをｌｉ進して預むリボザイムを形成させて行う。上ハ己で！及された既知の条件下でのインキュベートヨ／は複製可能なＲＮＡをこれらのプローブから切断して複製ｏＪｉなＲＮＡをＱベータリプリカーゼによる指数関数的複製の鋳型として働かせる。第１０凶で１５と、切断はストランド２６の、図の左から６香目と７１１ｒ目のヌクレオチドの間でおこる。３”百数関叡的複表と検出は実施例１で述べたように行この態株のためのプローブ（工第８図で示された上辺のプローブと同じであってよい。この聾悸にチ℃・ては山数の犬腸珈リボヌクレアーゼＨを使用する。この酵素はＲＮＡ１Ｊ１が辺いＤＮＡ２ｒリゴヌクンオチドにハイブリダイズされた時、その・・イブリダイズさｉｔた領域内でＲＮＡ鎖をνＪ１ｍする。ドニスーケラ−（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ　）　＋　Ｈ、の［ＲＮＡの部位％異的な酵素切ＥＴ（５ｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆ　ｉｃ　Ｅｎ　−こγしを利用するためＶこ、我々に第２スイッチ配列のＧＵＣＡｔ列の両側に〕゛イプリダイズする約１２ヌクレオチドの短いＤ　Ｎ　Ａオリゴヌクレオチド２９（第１に− ）を合成−ＩＩ−る。

好ましくは非結合のプローブの分離に続℃・て短いＤＮＡオリゴヌクレオチド２９を周知条件の下でサンプルとインキュベートし、第２スイツチ配列とのハイブリダイゼーション（第１１図ンを促進させる。それからりボヌクレアーゼＨな加えて、既知の条件下で、インキュベーションの間の切断を触媒する。（ドニスーケラ−Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ＋　前述）。Ｑペータリプリカーゼによる指数関数的複製と検出は実施例１で述べられたように行う。

実施例５この実施例は、リポザイム配列がどちらもプローブの一部であるということ以外は爽雁例４−Ａに似て℃・る。プローブ３０←第１２図〕は一本鎖ＤＮＡで、実施例４で運べられたように調製されるが、次の５つの配列を含むようにデザインされている：約３４ヌクレオチド長のプローブ配列３１；第９図で示された非切断ストランド２８の配列を持つ約１７ヌクレオチドの第１スイッチ３２；実施例１にあるような、第１配列に相補な約１７ヌクレオチドの第２スイツチ配列３３；第２スイッチ配列の３′側からのびている約４５ヌクレオチドの間隔（５ｐａｃｅｒ）配列３４、およびｖ１ａ可能なＲＮＡ部３５゜間隔配列の３′側にある６つのヌクレオチドは第９図で示された第２スイッチ配列の５′側の６ヌクレオチドと園しである。このように１１］隔配列が複製可能なＲＮＡ配列につながる領域はりボザイムの切断可能なストランドを含んでおり、これはちょうど実施例４−Ａの第２スイツチ配列２６がそうであると同じである。非結合のプローブでは第１スイツチ３２は第２スイツチ３３にハイブリダイズして℃゛る。しかし標的配列にハイブリダイズしたプローブではスイッチが開かれ、第１スイツチ配列３２は間隔配列３４０３′側が複製可能なＲＮＡ配列３５の５′側につながっている領域とのハイブリダイズが可能となって、リボザイムが形成される。間隔３４は、そのようなハイブリダイゼーションか行われるように、光分長（デザインされている憚的自己列の露出、プローブの標的配列への）・イブリダイズ、好ましくは、非結合プローブの分路は実施汐り１におし・て述べられている通りである。

プローブの、標的配列への・・イブリタイゼーンヨン（第１３図）の際に、スイッチ配列３２．３３は互（゛にハイブリダイズセず、リボザイム３６が形成される複製可能なＲＮＡの解放、指数ｔＪＡ数的″Ｄ１．製と検出は実施例４−Ａにおけると祠様に行われる。

上記で述べられているように本発明のアッセイは定性的でも定量的でもよい。

当業者ならばただちに認めるように、上で説明されている方法による既定の標的配列の定性的証明には、アッセイで用いられる生物学的そして化学的試薬が筒感度のアッセイにおいて再現性のある、検出可能な信号を産生ずるのに充分な、簡単に決定可能な量で使用されなければならない。

定量同決定には、加えられたプローブの量が、期待される標的配列の最高量をはるかに超えてなくてはならない、そしてインキュベーションは実質的にすべての標的配列がプローブとハイブリダイズするような条件下で行われなければならない。「実質的にすべて」ということはアッセイに再現性を与えるに充分なほど非常に高（・割合、ということを意味する。信号検出までの連続したステップにおいて各ステップは同様に定量的でなければならない。働えば非結合プローブの破壊手段は再現性のためと、更にバンクグランドノイズを消すため、実質的にすべての非結合プローブを壊さなければならない。転写と複製のステップは定量に充分な量の試薬を使わなければならず、再現性のために、設定時間を守って行わなければならない。

しばしば定性的、または定量的アッセイのどちらも少なくとも負の対照、即ち標的配列な言まンへ・もののアッセイを平行して行うことがあり、時には更に例えば等比数タリ的に増加するような既升童の標的配列を含む一連のサンプルを含むことがある。

本発明は、少なくとも１つの特異的な既定の核酸標的配列を、本発明のプローブ分子を用いて定性的に検出するか、筐たは定量的に決定するのに有効なアッセイキットにも関する。アッセイキットは、上述されている少なくとも３つの必須な配列を含む１つまたはそれ以上のプローブと、スイッチが開いていることを表す信号の産主に有効な少なくとも１つの追加的な生物学的に活性のある分子、例えばＤＮＡ９、リボザイム形成物、ＲＮＡ鎖又は酵素などを含む。キットはまた洗浄溶液、不浴化の試薬と材料、増−試薬と検出試薬のような追加的試薬を含んでよい。増幅試薬は酵素とヌクレオチドを含んでよい。検出試薬は標識されたヌクレオチドと発色基質を含んでよい。研究用にデザインされたキットはプラスミドを含んでよく、それによって研究者は本発明に従って、所望のいがなるプローブ配列でも含みうるプローブの調製が可能になる。

ＦｔＧ、ＩＦＩＧ、４ＦＩＧ、１２国際調査報告国際調査報告　ρＣＴ／ＵＳ　８９１０４２７５フロントページの続き（７２）発明者　リザルディ、ポール・エムメキシコ合衆国メキシコ、クエルナバカ。

コロニア・ランチョ・コルテス　セ・ペロ２１２０　、プリヴアダ・セリト　９９（７２）発明者　クラマー、フレッド・ラッセルアメリカ合衆国ニューヨーク州１０４６３．ニューヨーク、ウェスト・トゥーハントレッドサーティファースト・ストリート　５６１（７２）発明者　トヤギ、サンジェイアメリカ合衆国ニューヨーク州１０４６３．ニューヨーク、コーリア・アベニュー　３２４５（７２）発明者　ゲラ、セサル・エドウアルドアメリカ合衆国ニューヨーク州１１２０１．ニューヨーク、ライロー・ストリート　１４９（７２）発明者　ブヨリ、イルダ・エメ・ロメリメキシコ合衆国デ・エフェ、セ・ぺ０８８１０　、コル・マルティ、プラヤ・オラ・ベルブ　２６０（７２）発明者　チュー、バーバラ・シーアメリカ合衆国カリフォルニア用９２０１４゜デル・マー、ルエット・し・バルク　１３１６−ディー（７２）発明者　ジョイス、ジェラルド・エフアメリカ合衆国カリフォルニア用９２０２４゜エンシニタス、フォース・ストリート（７２）発明者　オーシェル、レスリー・イーアメリカ合衆国カリフォルニア用９２０３７゜う・ホーラ、テリー・ヒル・ドライブ

Claims

【特許請求の範囲】

１．既定の核酸標的配列の検出用プローブであつて、ａ．約２０から約６０ヌクレオチドのプローブ配列で、５′側と３′側を持ちこのプローブ配列は上記標的配列に相補であり；ｂ．プローブ配列の５′側にある約１０から約４０ヌクレオチドの第１スイツチ配列；ｃ．プローブ配列の３′側にある約１０から約４０ヌクレオチドの第２スイツチ配列、該第２スイツチ配列は該第１スイツチ配列に相補的であり；ここにおいてプローブ配列が該標的配列にハイブリダイズしない時、第１スイツチ配列は第２スイツチ配列にハイブリダイズするが、プローブ配列が該標的配列とハイブリダイズしている時、それによつて二重らせんを形成して、該二重らせんの硬直性は第１スイツチ配列が第２スイツチ配列にハイブリダイズするのを防げ、さらに、ここにおいて該第１スイツチ配列、上記第２スイツチ配列、あるいは第１と第２スイツチ配列の組み合わせば、プローブ配列が該標的配列とハイブリダイズする時検出可能な信号を選択的に産生するのに有効である、生物学的に機能する核酸部分を含むことから成るプローブ。
２．上記プローブ配列、上記第１スイツチ配列、そして上記第２スイツチ配列が核酸一本鎖の部分である請求項１記載のプローブ。
３．上記第１スイツチ配列と上記第２スイツチ配列が上記プローブ配列にただちに隣接する請求項１記載のプローブ。
４．上記第１スイツチ配列の少なくとも１ヌクレオチドは同時に上記プローブ配列のヌクレオチドでもある請求項１記載のプローブ。
５．上記第２スイツチ配列の少なくとも１ヌクレオチドは同時に上記プローブ配列のヌクレオチドでもある請求項１記載のプローブ。
６．上記第２スイツチ配列がＤＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター相補配列を含む請求項１記載のプローブ。
７．上記第１スイツチ配列と上記第２スイツチ配列が互いにハイブリダイズする時、上記ＲＮＡの複製を妨げるようなアロステリツク配置をもたらす請求項１記載のプローブを含む複製可能な組み換えＲＮＡ。
８．上記第１と第２スイツチ自己列の一方が、互いにハイブリダイズしていない時、信号産生系に要求される要素である生物学的に機能する核酸部分からなる請求項２記載のプローブ。
９．上記核酸一本鎖がＤＮＡ鎖であり、上記第２スイツチ配列かＤＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター相補配列を含んでいる請求項８記載のプローブ。
１０．上記核酸一本鎖がＤＮＡ鎖であり、上記第２スイツチ配列がＤＮＡ用ＤＮＡポリメラーゼのプライマーを含む請求項８記載のプローブ。
１１．上記核酸一本鎖がＤＮＡ鎖であり、上記第２スイツチ配列がＤＮＡ用ＲＮＡポリメラーゼのプライマーを含む請求項８記載のプローブ。
１２．上記第２スイツチ配列からのびた複製可能なＲＮＡ配列をさらに含んでおり、上記複製可能なＲＮＡ配列は、上記プローブから切断された時のみ、ＲＮＡポリメラーゼによる指数関数的複製の鋳型として働くことができる請求項２記載のプローブ。
１３．上記複製可能なＲＮＡ配列の少なくとも１ヌクレオチドは同時に上記第２スイツチ配列のヌクレオチドでもある請求項１２記載のプローブ。
１４．上記第２スイツチ配列と上記複製可能なＲＮＡ配列の間に間隔配列を持ち、上記複製可能なＲＮＡ配列に結合されているもので、そこにおいて上記第１スイツチ配列はリボザイムの一部から成り、さらにそこにおいて間隔配列と複製可能なＲＮＡ配列はそれらが結合している領域に上記リポザイムの残りを含む請求項１２記載のプローブ。
１５．上記第２スイツチ配列が上記第１スイツチ配列とリポザイムを形成できない請求項１４記載のプローブ。
１６．請求項２記載のプローブを含む複製可能な組換えＲＮＡ分子である請求項２記載のプローブ。
１７．上記第１と第２スイツチ配列は、互いにハイブリダイズする時、特異的なタンパク質に対する結合部位を持つ請求項１６記載の複製可能な組換えＲＮＡ分子。
１８．特異的タンパク質がリポヌクレアーゼである請求項１７記載の複製可能な組換えＲＮＡ分子。
１９．上記第１と第２スイツチ配列の１つは、もう一方にハイブリダイズしていない時、特異的なタンパク質に対する結合部位を有する複製可能な組換えＲＮＡ分子。
２０．上記特異的タンパク質がバクテリオフアージタンパク質である請求項１９記載の複製可能な組換えＲＮＡ分子。
２１．上記切断部位が制限酵素による切断のための部位である請求項１９記載の複製可能な組換えＲＮＡ。
２２．上記制限酵素がリポヌクレアーゼＩＩＩである請求項２１記載の複製可能な組換えＲＮＡ。
２３．上記核酸一本鎖がＤＮＡ鎖であるもの請求項２記載のプローブ。
２４．上記第１と第２スイツチ配列が、互いにハイブリダイズする時、特異的タンパク質に対する結合部位を有する請求項２３記載のプローブ。
２５．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、もう一方にハイブリダイズしない時、特異的タンパク質に対する結合部位を有する請求項２３記載のプローブ。
２６．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、もう一方にハイブリダイズしない時、信号産生に必要なＤＮＡ配列に対する結合部位を有する請求項２３記載のプローブ。
２７．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、もう一方にハイブリダイズしない時、信号産生に必要なＲＮＡ配列に対する結合部位を有する請求項２３記載のプローブ。
２８．上記核酸一本鎖がＲＮＡ鎖である請求項２記載のプローブ。
２９．上記第１と第２スイツチ配列が、互いにハイブリダイズした時、特異的タンパク質に対する結合部位を有する請求項２８記載のプローブ。
３０．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、もう一方にハイブリダイズしない時、特異的タンパク質に対する結合部位を有する請求項２８記載のプローブ。
３１．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、互いにハイブリダイズしない時、オリゴデオキシリボヌクレオチドに対する結合部位を有する請求項２８記載のプローブ。
３２．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、もう一方にハイブリダイズしない時、信号産生に要求されるＤＮＡ配列に対する結合部位を有する請求項２８記載のプローブ。
３３．上記第１と第２スイツチ配列の１つが、もう一方にハイブリダイズしない時、信号産生に要求されるＲＮＡ配列に対する結合部位を有する請求項３２記載のプローブ。
３４．上記第１と第２スイツチ配列から選択された１つからのびているＲＮＡ配列であり、かつそこに隣接しており、該ＲＮＡ配列と該選択されたスイツチ配列は共に信号産生に必要な核酸配列に対する結合部位を有する、から成る請求項２８記載のプローブ。
３５．信号産生に必要な上記核酸配列がＲＮＡである請求項３４記載のプローブ
３６．上記結合部位と信号産生に必要な上記核酸配列が、ハイブリダイズする時、共にリポザイムを形成する請求項３５記載のプローブ。
３７．上記結合部位および上記核酸配列が信号産生に必要であり、ハイブリダイズする時、リポザイムを含む請求項３５記載のプローブ。
３８．上記リポザイムがプローブから信号産生に必要なＲＮＡプローブ断片を切断する請求項３７記載のプローブ。
３９．上記ＲＮＡプローブ断片が複製可能なＲＮＡから成る請求項３８記載のプローブ。
４０．上記ＲＮＡプローブ断片がリンカーから成る請求項３８記載のプローブ。
４１．上記ＲＮＡプローブ断片がプライマーから成る請求項３８記載のプローブ
４２．信号産生に必要な上記核酸配列がオリゴデオキシリボヌクレオチドである請求項３４記載のプローブ。
４３．上記結合部位と、信号産生に必要な上記核酸配列が、ハイブリダイズする時、タンパク質結合部位を形成する請求項４２記載のプローブ。
４４．上記タンパク結合部位がリポヌクレアーゼＨ結合部位である請求項４３記載のプローブ。
４５．上記第１と第２スイツチ配列から選択された１つからのびているＲＮＡ配列であり、かつ約３０−７０ヌクレオチドの間隔配列によつてそこから分離されているもので、ハイブリダイズする時、上記結合部位と上記スイツチ配列は共に信号産生に要求されるリポザイムを構成するように、上記ＲＮＡ配列および上記間隔配列は他のスイツチ配列に対する結合部位を形成することから成る請求項２８に記載のプローブ。
４６．上記リポザイムがプローブから信号産生に必要なＲＮＡプローブ断片を切断する請求項４５記載のプローブ。
４７．上記ＲＮＡプローブ断片が複製可能なＲＮＡから成る請求項４６記載のプローブ。
４８．上記ＲＮＡプローブ断片がリンカーから成る請求項４６記載のプローブ。
４９．上記ＲＮＡプローブ断片がプライマーから成る請求項４６記載のプローブ
５０．核酸を含むサンプル中の、少なくとも１つの既に決定している核酸標的配列を検出する方法であつて次の工程、ａ．請求項１記載のプローブをサンプルに加え；ｂ．プローブを上記標的配列に特異的にハイブリダイズさせ；ｃ．信号を産生するために工程ｂで上記標的配列と特異的にハイブリダイズしなかつたプローブの能力を破壊し；ｄ．工程ｂで上記標的配列に特異的にハイブリダイズしたプローブから信号を産生し；ｅ．その信号を検出すること，から成る方法。
５１．上記プローブが複製可能なＲＮＡである請求項５０記載の方法。
５２．上記工程ｃにおいて上記標的配列に特異的にハイブリダイズしなかつたプローブの複製能力をリポヌクレアーゼによつて破壊し、上記工程ｄが上記標的配列と特異的にハイブリダイズしたプローブを、指数関数的に複製することから成る請求項５１記載の方法。
５３．上記工程ｂにおいて上記標的配列と特異的にハイブリダイズしたプローブを、そのように特異的にハイブリダイズしなかつたプローブと工程ｄの前に分離する請求項５１記載の方法。
５４．上記サンプル中の上記標的配列の量を定量的に決定することから成り、工程ａで加えられたプローブの量は上記サンプル中に予想される標的配列の最大予想数を大きく上回るものであり、工程ｂは実質的にすべての標的配列がプローブとハイブリダイズするまで行われ、工程ｃにおいては上記標的配列に特異的にハイブリダイズしなかつた、実質的にすべてのプローブの複製能力が破壊され、工程ｄは予め決定した時間行われ、工程ｅは定量的である請求項５０記載の方法。
５５．上記標的配列を含まないサンプルのアツセイを平行して行うことを追加的に含むことから成る請求項５４記載の方法。
５６．核酸を含むサンプル中の、少なくとも１種類のすでに決定されている核酸標的配列を検出する方法で、以下の工程；ａ．請求項１記載のプローブをサンプルに加え；ｂ．プローブを上記標、的配列に特異的にハイブリダイズさせ；ｃ．工程ｂで上記標的配列と特異的にハイブリダイズしたプローブの存在を指示する複製可能なＲＮＡを指数関数的に複製し；ｄ．複製産物を検出すること；から成る方法。
５７．上記プローブが第１のＤＮＡ鎖であり、工程ｃに先がけた複製可能なＲＮＡの転写のための鋳型である第２のＤＮＡ鎖を上記プローブの第２スイツチ配列にハイブリダイズさせる追加工程から成る請求項５６記載の方法。
５８．上記プローブが複製可能な組換えＲＮＡであり、ステツプｃに先がけて工程ｂで標的配列にハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしなかつたプローブから分離する追加工程を含み、更に工程ｃの複製可能なＲＮＡが上記複製可能な組換えＲＮＡである請求項５６記載の方法。
５９．上記プローブが上記第２スイツチ区分からのびた、複製可能なＲＮＡは配列から成るＲＮＡ鎖であり、工程ｃに先がけて、工程ｂで標的配列にハイブリダイズしたプローブから上記複製可能なＲＮＡ配列を選択的に切断する追加ステツプを含み、更に工程ｃの複製可能なＲＮＡが該複製可能なＲＮＡ配列である請求項５６記載の方法。
６０．切断のステツプがリポザイム切断を含む請求項５９記載の方法。
６１．切断のステツプはリポヌクレアーゼのサノプルヘの添加を含む請求項５９記載の方法。
６２．上記サンプル中の上記標的配列の量の定量的決定から成り、工程ａで加えられたプローブ量は上記サンプル中に予想される標的配列の、最大予想数を大きく上回るものであり、工程ｂは実質的にすべての標的配列がプローブとハイブリダイズする玄で行われ、工程ｃは予め決定した時間行われ、工程ｄは定量的である請求項５６記載の方法。
６３．上記標的配列を含玄ないサンプルのアツセイを平行して行うことを追加的に含む請求項６２記載の方法。
６４．核酸を含むサンプル中の、少なくとも１種類のすでに決定されている核酸標的配列を検出する方法で、次の工程、ａ．請求項１記載のプローブをサンプルに加え；ｂ．プローブを上記標的配列に特異的にハイブリダイズさせ；ｃ．工程ｂで標的配列とハイブリダイズしたプローブから上記ＲＮＡ−信号産生分を切断し；ｄ．上記ＲＮＡ−信号産生物を用いて信号を増幅産生させ；ｅ．上記増幅信号を検出する，から成る方法。
６５．上記ＲＮＡ−信号産生物が発色信号を産生する酵素を含む請求項６４記載の方法。
６６．上記プローブおよび適当なＲＮＡリプリカーゼの適量から成る請求項５０記載のアツセイを行うためのテストキツト。
６７．上記プローブおよび適当なＲＮＡリプリカーゼの適量から成る請求項５６記載のアツセイを行うためのテストキツト。