PT1171633E - Métodos para marcar materiais - Google Patents

Description

1 DISCRIÇÃO "MÉTODOS PARA MARCAR MATERIAIS"

Esta invenção refere-se a métodos para marcar materiais, e ã detecção de tal marcação. Há uma exigência comum de se ser capaz de traçar o caminho tomado por um dado material como ele se move de uma posição para outra. 0 movimento pode ser de materiais naturais (por exemplo, o fluxo de água em aquíferos sub-superficiais) ou de materiais que foram processados ou fabricados pelo homem (por exemplo, qualquer artigo construído pelo homem em um processo de fabricação ou de recursos naturais como tais resíduos e minerais). Nestas situações podem haver razões pelas quais é necessário desenvolver procedimentos específicos para traçar estes movimentos. Pode ser que a observação directa não seja possível, como quando se segue o caminho de uma corrente subterrânea. Pode ser que seja necessário controlar o movimento de mercadorias sem o conhecimento directo dos transportadores ou, por razões legais, comprovar que a aparência de um material em um determinado ponto na biosfera foi devida ao mesmo material originário de um ponto de partida conhecido.

Por exemplo, os artigos da fabricação podem ser roubados em trânsito ou revendidos a um preço muito mais baixo do que aquele estipulado pelo fornecedor por um distribuidor não escrupuloso, por exemplo em vendas ambulantes de carro. Um problema chave no fornecimento de uma condenação é a identificação dos artigos particulares vendidos, para estabelecer que as mercadorias foram roubadas ou revendidas de um determinado distribuidor. Os problemas 2 também ocorrem com líquidos tais como o petróleo que são usualmente despejados de transportadoras no mar. É quase impossível identificar qual a transportadora que descarregou o óleo e como tal, os prosseguimentos e condenações por poluir os mares são raramente efectuadas. Os problemas adicionais estão associados com o movimento de materiais naturais, por exemplo o movimento de resíduos É especialmente difícil distinguir um lote de tais materiais naturais do outro. Em caso dos resíduos, os problemas ocorrem na Comunidade Europeia com os resíduos que são movidos através de várias fronteiras diferentes para reunir um número de subsídios da UE para o mesmo lote de resíduos. Um método de marcar os resíduos que pode ser rapidamente detectado é necessário para prevenir tal fraude. Vários métodos são conhecidos na técnica para marcar e detectar materiais, muitos dos quais fazem uso de marcadores de ácido nucleico de micro traço, em particular marcadores feitos de ADN. Os ácidos nucleicos podem fornecer uma quantidade ilimitada de informação, por causa da sequência de bases variável (adenina, citosina, guanina e timina [uracilo no caso de ARN que substitui a timina]) contida dentro da molécula. Os termos de probabilidade podem ser calculados para a frequência de uma dada sequência de bases e, contanto que as bases suficientes sejam usadas, isto é, uma molécula de ADN suficientemente grande é empregue como o marcador, depois para todos os objectivos práticos um micro traço único pode ser definido. Por se utilizarem as combinações das sequências universais (aceites como padrões industriais) e por níveis de variação de sequências específicas, é possível identificar o tipo de produto genérico, a origem do produto (sequências específicas da companhia), o lote ou conjunto, e até fornecer um identificador para uma unidade de comércio. 3 0 Pedido de Patente Internacional anterior No. PCT/GB91/0Q719 (publicado como W091/17 265) divulgou um método para controlar o movimento de um hidrocarboneto pela adição do ADN compatível do hidrocarboneto como um aditivo de micro traço. 0 Pedido Internacional No. PCT/GB93/01822 (publicado como W094/04918) divulga um método para marcar um líquido e posteriormente detectar que o líquido foi marcado o qual compreende adicionar um aditivo ao líquido. 0 aditivo compreende dois ou mais tipos de partículas não visíveis a olho nu, tendo cada um meios de sinal diferentes ou partículas que têm dois ou mais meios de sinal diferentes. 0 meio de sinal ajuda na detecção dos micro grânulos. Um dos meios de sinal compreende o ácido nucleico, enquanto o outro sinal não é um marcador de ácido nucleico. Em cada um dos métodos acima mencionados, o micro traço único que compreende as moléculas de ADN é adicionado ao material, o material resultante é experimentado depois do seu movimento, e a presença do aditivo de micro traço na amostra é detectada, analisada e descodificada. 0 Pedido Internacional No. PCT/GB94/01506 (publicado como W095/02702) descreve um método para marcar um artigo ou elemento sólido por se adicionar a um líquido um aditivo que compreende micro grânulos não visíveis a olho nu que compreende dois ou mais meios de sinal para ajudar à sua detecção e meios de codificação para ajudar à identificação. 0 aditivo pode compreender quer dois ou mais micro grânulos tendo cada um meios de sinal diferentes, pelo menos um micro grânulo que tem um meio de codificação, ou pode compreender um micro grânulo que tem dois ou mais meios de sinal diferentes e pelo menos um meio de codificação. 0 meio de codificação e um dos meios de sinal compreendem um ácido nucleico e um outro meio de sinal referido que compreende um meio de sinal de ácido não nucleico. 0 líquido que contém o aditivo é adicionado ao sólido e deixado a secar com a finalidade de marcar o sólido. 4

Posteriormente, os micro grânulos que têm meio de sinal são detectados no sólido, o sólido é experimentado e o meio de codificação descodificado. 0 método pode ser adaptado para o uso na monitorização de uma interacção entre qualquer material, artigo ou elemento e uma pessoa ou animal, por se fazer uso de um dispositivo adaptado para produzir um aerossol que contém um líquido que compreende um aditivo que contém uma pluralidade de micro grânulos. 0 Pedido Internacional No. PCT/GB93/01822 (publicado como WO94/04918) descreve um método para marcar um líquido e posteriormente detectar que o líquido foi marcado. O método compreende: adicionar ao líquido um aditivo que compreende uma pluralidade de partículas numa quantidade não maior do que 1 parte em peso de partículas por 106 partes em peso líquido, compreendendo as partículas meio de sinal para ajudar a sua detecção e para não ser visível no líquido a olho nu; exemplificar uma posição do líquido que contém o aditivo, e detectar a presença de partículas no líquido, com a condição de que o meio de sinal não consiste somente de um marcador de ácido nucleico.

Em cada um dos métodos da técnica anterior acima mencionados, o ácido nucleico ou o ADN de micro traço divulgado é um ácido nucleico ou ADN sintético que têm uma região variável flanqueada por regiões que tem sequências pré-determinadas. A sequência da região variável dá a cada ácido nucleico ou molécula de ADN de micro traço uma identidade única, característica, enquanto que as sequências pré-determinadas são comuns a todos os marcadores. As sequências pré-determinadas são reconhecidas por iniciadores para a amplificação através da reacção de cadeia de polimerase (PCR) e são usadas para sequenciação subsequente. Assim, com a finalidade de determinar a identidade da região variável no ácido nucleico ou ADN de micro traço, a região variável é amplificada por se utilizarem 5 iniciadores complementares às regiões de flanqueamento que têm sequências pré-determinadas, A região variável é depois sequenciada por se utilizarem os mesmos iniciadores, para determinar a sequência da região variável e a partir daqui a identidade do marcador. Alternativamente, a sequenciação pode ser iniciada a partir de uma região de iniciador de sequenciação incorporada no marcador entre uma região de flanqueamento e a região variável. Como cada região de iniciador de sequenciação pode ter uma sequência única para um marcador particular, isto permite a utilização de dois ou mais ácidos nucleicos diferentes ou marcadores de ADN para marcar o material.

Embora os procedimentos descritos em cima sejam eficazes, os métodos da técnica anterior fornecem essencialmente só uma resposta "SIM/NÃO". Por outras palavras, eles são capazes de determinar se uma amostra particular contém um marcador de ácido nucleico, e qual é a identidade do marcador. Até ao ponto em que estamos cientes, no entanto, ninguém apreciou anteriormente que pode ser desejável determinar a quantidade do marcador presente num material marcado. Os métodos descritos na técnica anterior têm sido relacionados somente com a marcação, detecção e identificação de marcadores, sem fornecerem qualquer indicação quanto de um marcador de ácido nucleico está presente na amostra.

Verificámos agora que pode ser vantajoso determinar quanto de um marcador ou identificador está presente em um material marcado. Reconhecemos que a quantidade de um marcador num material pode dar pistas valiosas quanto à história passada e aos movimentos do material.

Por exemplo, por se medir a quantidade real de um marcador num material e por se comparar esta à quantidade inicialmente usada 6 para marcar o material, ê possível contar se um cliente (se de forma deliberada ou inadvertidamente) diluiu o material. A quantidade de marcador no material também pode indicar se a contaminação se realizou, e a acção apropriada pode depois ser empreendida. Ά determinação da quantidade de um determinado marcador é também útil quando há múltiplas fontes de uma contaminação ambiental. Aqui, as diferentes fontes de contaminação suspeitas, por exemplo, o material em diferentes fábricas ou empresas, pode ser marcado por diferentes marcadores. Uma amostra é tomada da corrente de efluente poluída, e a presença de cada um dos diferentes marcadores pode ser detectada para determinar se a poluição é causada por uma determinada fábrica. De forma importante, por se medirem as concentrações relativas de cada marcador na corrente de efluente, a informação é fornecida na contribuição relativa de cada fonte para a poluição ambiental. As multas apropriadas podem depois ser impostas pelas autoridades nas fábricas ou empresas de poluição com o conhecimento da contribuição de cada fábrica ou empresa para a poluição. Há, por isso, valor num método para a marcação de um material e subsequente detecção que fornece uma indicação da quantidade de marcador presente no material, e isto não foi anteriormente apreciado no campo.

Também será apreciado que há problemas inerentes com as técnicas da arte anterior. Em particular, vários passos estão envolvidos na detecção do marcador na amostra. Em primeiro lugar, as reacções de PCR têm de ser executadas para amplificar o marcador de ADN de micro traço. Com a finalidade de determinar se as reacções são prósperas, e para resolver os produtos de reacção de iníciador-dímeros, iniciadores não incorporados e nucleótidos, os produtos de reacção podem depois ser submetidos a electroforese de gel de 7 poliacrilamida, por exemplo. Os produtos de reacção são depois excisados do gel e o ADN amplificado purificado dos fragmentos de gel. 0 ADN purificado é depois submetido ao ciclo de sequenciação para se determinar a sequência das regiões variáveis. Finalmente, a sequência tem de ser interpretada e comparada com um banco de dados conhecido para determinar a identidade do marcador usado. Os muitos passos envolvidos na fase de detecção dos métodos da técnica anterior tornam o procedimento longo, que exige muito tempo e é laborioso e por isso caro de empreender. Além disso, para a separação adequada dos produtos de reacção de PCR do iniciador-dímeros, os iniciadores não incorporados e os desoxinucleótidos, o comprimento do ADN amplificado deve ser relativamente longo. Em geral, a experiência mostra que o ADN amplificado deve ser maior do que 200 pares de bases em comprimento pata a boa separação a ser realizada usando um gel de resolução normal. A necessidade para um produto de amplificação relativamente longo para a boa separação tem de ser equilibrada pelo custo e dificuldade implicada em designar e sintetizar os oligonucleótidos longos (> 100 nucleótidos longos) para utilização como o marcador. Por isso, embora seja mais eficiente e menos caro sintetizar marcadores mais pequenos, é correspondentemente mais difícil distinguir estes pequenos marcadores de artefactos de amplificação depois de PCR. Há, por isso, também, uma necessidade não cumprida de um método para a marcação de um material e subsequente detecção que envolve menos passos e que pode fazer uso de oligonucleótidos relativamente curtos como marcadores.

Fornecemos, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, um método para detectar se um material foi marcado por um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico, compreendendo o método «os passos de: (a) amostragem de uma porção do material; e (b) 8 detectar a presença do marcador de ácido nucleico na amostra, sendo o referido método caracterizado pelo facto da quantidade do marcador de ácido nucleico presente na amostra é determinada para fornecer uma indicação da quantidade de marcador presente no material.

Numa forme de realização preferida, o método também compreende o passo anterior de: adicionar ou aplicar um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico ao material. 0 marcador de ácido nucleico é de um modo preferido amplificado por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico. A quantidade de marcador de ácido nucleico presente numa amostra é de um modo preferido determinada por se medir a quantidade de amplificação necessária para a quantidade de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado. A quantidade de ácido nucleico amplificado numa reacção de amplificação de ácido nucleico pode ser determinada numa variedade de formas. Os meios reais pelos quais a quantidade de ácido nucleico amplificado é determinada não são importantes, embora descrevamos aqui um número de formas preferidas pelas quais a quantidade pode ser medida. Será apreciado que quanto mais marcador de ácido nucleico estiver inicialmente presente numa amostra, menos amplificação é necessária para alcançar um nível pré-determinado particular de ácido nucleico amplificado. É, por isso, possível calibrar o sistema de detecção utilizando quantidades iniciais conhecidas de marcadores de ácido nucleico numa série de reacções de teste. A cinética da acumulação de ácido nucleico amplificado numa reacção pode depois ser medida, e comparada com aquela das reacções de teste. Isto permite que se determine quanto marcador de ácido nucleico está presente numa amostra de teste, e a partir daqui quanto ácido nucleico está presente no material marcado, vários métodos de amplificação de 9 ácido nucleico são conhecidos, por exemplo, a reacção de cadeia de polimerase, a reacção de cadeia de ligase, TMÂ, e NASBA, etc., e estes métodos podem ser empregues para a amplificação de marcadores de ácido nucleico nos métodos de acordo com vários aspectos da invenção. No entanto, a reacção de amplificação de ácido nucleico de um modo preferido usada é a reacção de cadeia de polimerase (PCR). Nós encaramos que os métodos aqui descritos são apropriadamente usados com formas de realização diferentes do marcador de ácido nucleico, cada um dos quais contém pelo menos uma sequência de identificação para o marcador. Quando nos referimos nesta aplicação a uma "sequência de identificação", referimo-nos a uma disposição de nucleótidos que têm uma sequência particular, cuja sequência permite a identidade do marcador de ácido nucleico no qual está presente para ser determinado. Um conjunto de marcadores de ácido nucleico pode ser assim gerado, cada um dos quais tem uma ou várias sequência(s) de identificação diferentes. 0 remanescente de cada marcador no conjunto (por outras palavras, as regiões que não incluem a sequência ou sequências de identificação) pode ter sequências comuns a todos os marcadores de ácido nucleico no conjunto. Depois de um material ser marcado por um marcador do conjunto, uma amostra de material pode ser tomada. A detecção da presença de uma região de identificação particular na amostra, por isso, fornece uma indicação directa da identidade do marcador de ácido nucleico usado para marcar o material.

Nos métodos de detecção, o marcador de ácido nucleico é contactado com dois iniciadores de oligonucleótido numa reacção de amplificação de ácido nucleico. Uma primeira forma de realização do marcador de ácido nucleico (aqui mencionada como um marcador de Tipo I) contém só uma sequência de identificação, e só um dos 10 iniciadores de oligonueleótido tem uma sequência que corresponde a esta sequência de identificação. Numa outra forma de realização do marcador de ácido nucleico (aqui referido como um marcador de Tipo II) , duas sequências de identificação estão presentes, e ambos os iniciadores de oligonueleótido têm sequências que correspondem às respectivas sequências de identificação. Por outras palavras, pode ser dito que um marcador de Tipo II é amplificado usando iniciadores para as suas sequências de identificação. Numa outra forma de realização alternativa do marcador, ao qual nos referiremos como um marcador de Tipo III, só uma sequência de identificação está presente a qual é flanqueada por regiões de iniciador, e nenhum dos iniciadores de oligonueleótido tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação.

Por isso, pode dizer-se que o marcador de ácido nucleico seja contactado com um primeiro iniciador de oligonueleótido capaz de iniciar a amplificação do marcador de ácido nucleico e ter uma sequência que corresponde a uma primeira sequência contida no marcador de ácido nucleico. Numa primeira forma de realização de um marcador de ácido nucleico (Tipo I), a primeira sequência é a mesma sequência que a sequência de identificação, e o primeiro iniciador de oligonueleótido, por isso, tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação. 0 outro iniciador de oligonueleótido na reacção de amplificação pode corresponder a qualquer outra sequência no marcador de ácido nucleico. De tudo isso o que é essencial é que um dos iniciadores de oligonueleótido é capaz de se iniciar a partir da sequência de identificação, para que a presença da amplificação de ácido nucleico indique que a sequência de identificação está presente, e a partir daqui fornece uma indicação da identidade do marcador de ácido nucleico.

Num marcador de Tipo II, o marcador de ácido nucleico também 11 compreende uma segunda sequência de identificação, em cujo caso o marcador de ácido nucleico é além disso contactado na reacção de amplificação com um segundo iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à segunda sequência de identificação. 0 primeiro oligonucleótido pode ter uma sequência que consiste da primeira sequência de identificação e o segundo oligonucleótido uma sequência complementar à segunda sequência de identificação. Alternativamente, o primeiro oligonucleótido tem uma sequência complementar à primeira sequência de identificação e o segundo oligonucleótido uma sequência que consiste da segunda sequência de identificação. As duas sequências de identificação podem ser adjacentes uma à outra, ou elas podem flanquear sequências intervenientes. Nesta forma de realização, a amplificação realiza-se na presença de dois iniciadores de oligonucleótido, e ambos os iniciadores devem ser capazes de se ligarem durante a reacção de amplificação com a finalidade de que uma amplificação com sucesso se realize. As duas sequências de identificação num marcador de Tipo II podem ter sequências idênticas, ou elas podem ter sequências diferentes. A última disposição leva em conta um número maior de permutações de marcadores de ácido nucleico individualmente distintos a serem produzidos.

Será evidente que, onde uma reacção de amplificação é estabelecida pelo menos com um iniciador de oligonucleótido que corresponde a uma sequência ou sequências de identificação de um marcador de ácido nucleico de Tipo I ou de Tipo II, a especificidade da reacção de amplificação reside essencialmente no iniciador ou iniciadores de oligonucleótido particulares usados. Se a amplificação se realizar, isto significa que o iniciador ou os iniciadores de oligonucleótido reconheceram uma sequência de identificação complementar no marcador de ácido nucleico. De modo inverso, a ausência de amplificação indica que a sequência de identificação 12 particular não está presente no marcador presente na amostra. Isto permite que a identidade de um marcador de ácido nucleico desconhecido seja facilmente determinada por se colocar uma série de meios de amplificação de ácido nucleico com iniciadores diferentes, e detectar qual dos meios de amplificação resulta na amplificação com sucesso. Será apreciado que os métodos que usam as formas de realização acima mencionadas de marcadores de ácido nucleico levem em conta um procedimento de "um passo" a ser executado, naquela detecção, identificação e quantificação do marcador de ácido nucleico que se realiza numa reacção. A presença da amplificação indica que o marcador de ácido nucleico está presente na amostra, e dá uma indicação da identidade do marcador de ácido nucleico usado para marcar o material. Ao mesmo tempo, a quantidade de ácido nucleico amplificado pode ser medida para dar uma indicação da quantidade de marcador de ácido nucleico na amostra e por conseguinte no material. Não há, por isso, nenhuma necessidade de purificação adicional do marcador amplificado e subsequente sequenciação para determinar a identidade. Os marcadores de ácido nucleico usados na invenção podem ser assim muito mais curtos do que os anteriormente usados. É também aqui divulgado um método para marcar um material e posteriormente detectar que ele foi marcado, compreendendo o método os passos de: (a) adicionar ou aplicar um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico ao material, compreendendo o marcador de ácido nucleico pelo menos uma sequência de identificação para o marcador; (b) amostragem de uma porção do material que contêm tal marcador e opcionalmente a separação do marcador de ácido nucleico da amostra; (c) a amplificação de pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico que incluí fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro olígonucleótido que tem uma sequência que 13 corresponde à sequência de identificação do marcador de ácido nucleíco; e (d) a amplificação da detecção de ácido nucleico como uma indicação da presença do marcador na amostra e por conseguinte que o material foi marcado. É também aqui revelado um método para detectar se um material foi marcado por um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico particular, compreendendo o marcador de ácido nucleico pelo menos uma sequência de identificação para o marcador, compreendendo o método os passos de: (a) a amostragem de uma porção do material e opcionalmente a separação de qualquer marcador de ácido nucleico presente da amostra; b) a amplificação de qualquer marcador de ácido nucleico presente na amostra por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico que inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação do marcador de ácido nucleico; e (c) a amplificação de detecção de ácido nucleico como uma indicação da presença do marcador de ácido nucleico particular na amostra e por conseguinte que o material foi marcado por um marcador que compreende aquele marcador.

Em formas de realização preferidas, o marcador de ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência de identificação para o marcador, e o método compreende adicionalmente os passos de: (c) a amplificação pelo menos de uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico a qual inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação do marcador de ácido nucleico; e (d) a determinação da quantidade de amplificação necessária para o ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como 14 uma indicação da quantidade do marcador presente na amostra.

Convenientemente, o método compreende adicionalmente os passos de: (c) a amplificação pelo menos de uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico a qual inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação do marcador de ácido nucleico; e (d) a determinação da quantidade da amplificação necessária para o ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma indicação da quantidade do marcador presente na amostra e por conseguinte da quantidade de marcador no material.

Uma terceira forma de realização do marcador de ácido nucleico (Tipo III) tem uma sequência de identificação a qual é flanqueada pelas primeira e segunda regiões do marcador de ácido nucleico que contém locais de iniciação para a amplificação de ácido nucleico. O marcador de Tipo III, por isso, é amplificado numa reacção de amplificação de ácido nucleico por se fazer contactá-lo com um primeiro iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência a qual não corresponde à sequência de identificação do marcador. 0 outro iniciador de oligonucleótido na reacção de amplificação tem uma sequência a qual também não corresponde à sequência de identificação. Assim, o primeiro oligonucleótido tem uma sequência a qual corresponde a uma sequência contida quer na primeira ou na segunda região e o segundo oligonucleótido contém uma sequência que corresponde a uma sequência nas outras da primeira e da segunda regiões do marcador.

Nesta forma de realização, um conjunto de ácidos nucleicos pode ser gerado com a primeira e a segunda regiões que são comuns a todos os marcadores no conjunto, mas com a sequência de identificação 15 distinta para cada membro do conjunto. A amplificação do ácido nucleico pode ser conduzida usando iniciadores de oligonucleótido que têm sequências "genéricas", as quais se ligam a sequências na primeira e na segunda regiões do marcador. A detecção da sequência de identificação e a quantificação de ácido nucleico amplificado pode realizar-se contemporaneamente com a amplificação, ou posteriormente.

Numa forma de realização preferida, é fornecido um método para marcar um material e posteriormente detectar que ele foi marcado, sendo o referido método caracterizado pelo facto de fornecer uma indicação da quantidade de marcador presente no material, compreendendo o método os passos de: (a) a adição ou a aplicação de um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico para o material, compreendendo o marcador de ácido nucleico uma primeira e uma segunda regiões que flanqueiam uma sequência de identificação par o marcador; (b) amostragem de uma porção do material que contém o tal marcador e opcionalmente a separação do marcador de ácido nucleico da amostra; (c) a amplificação pelo menos de uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico a qual inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à referida primeira região do marcador de ácido nucleico; e (d) a determinação da quantidade da amplificação necessária para o ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma indicação da quantidade do marcador presente na amostra. De um modo preferido, a reacção de amplificação de ácido nucleico é uma reacção de cadeia de polimerase.

Numa forma de realização preferida, é fornecido um método para marcar um material e posteriormente detectar que ele foi marcado, 16 compreendendo o método os passos de: (a) a adição ou a aplicação de um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico ao material, compreendendo o marcador de ácido nucleico uma primeira e uma segunda regiões que flanqueiam uma sequência de identificação para o marcador; (b) a amostragem de uma porção do material que contém o tal marcador e opcionalmente a separação do marcador de ácido nucleico da amostra; (c) contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde a uma sequência contida na referida primeira região do marcador de ácido nucleico e uma sonda de oligonucleótido que carrega um meio de sinal e que tem uma sequência que corresponde à referida sequência de identificação; (d) a amplificação pelo menos de uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de cadeia de polimerase a qual inclui uma polimerase de ácido nucleico que tem actividade de exonuclease de 51 a 3' na qual os fragmentos que carregam meios de sinal são libertados da sonda de oligonucleótido durante a amplificação de ácido nucleico; e (e) a detecção dos fragmentos libertados como uma indicação que a amplificação se realizou e por conseguinte que o material foi marcado. De um modo preferido, o marcador de ácido nucleico é contactado com um segundo iniciador de oligonucleótido capaz de iniciar a amplificação do marcador e que tem uma sequência que corresponde a uma sequência contida na segunda região. Além de ter o meio de sinal, o qual é de um modo preferido uma etiqueta fluorescente, a sonda de oligonucleótido também carrega de um modo preferido meios de extinção para atenuar um sinal dos meios de sinal. Tal atenuação ê de um modo preferido um resultado da transferência de energia de ressonância de Fõrster através do espaço. Um sinal detectável de um fragmento libertado está de um modo preferido a um nivel substancialmente mais alto do que um sinal detectável da sonda de oligonucleótido. 17

De acordo com um segundo aspecto da invenção, fornecemos um método para marcar um material com um marcador de acido nucleico, compreendendo o método os passos de: (a) fornecer um conjunto de marcadores de ácido nucleico, cada marcador de ácido nucleico compreendendo uma região genérica que tem uma sequência presente em todos os marcadores de ácido nucleico dentro do conjunto, sendo a região genérica flanqueada por regiões de codificação que têm sequências de identificação para o marcador; (b) a selecção de um marcador de ácido nucleico particular de dentro do conjunto; e (c) a adição ou a aplicação de um marcador que compreende o marcador de ácido nucleico seleccionado para o material.

Numa forma de realização preferida, ê fornecido um método para a determinação de qual o marcador de ácido nucleico particular de um conjunto conhecido de marcadores de ácido nucleico diferentes foi usado para marcar um material, compreendendo cada marcador de ácido nucleico no conjunto pelo menos uma sequência de identificação para o marcador, compreendendo o método os passos de: (a) a amostragem de uma porção do material marcado e opcionalmente a separação do marcador de ácido nucleico da amostra; b) determinar uma pluralidade de meios de reacção de amplificação de ácido nucleico, contendo cada meio um oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação de um marcador de ácido nucleico conhecido diferente no conjunto e sendo capaz de amplificar um marcador de ácido nucleico diferente do conjunto; (c) contactar o marcador de ácido nucleico da amostra com cada um dos referidos meios de reacção; e (d) a detecção de qual dos meios de reacção resulta na amplificação do marcador de ácido nucleico como uma indicação da identidade do marcador de ácido nucleico particular usado para marcar o material em que a quantidade do marcador de ácido nucleico presente na amostra é determinada para fornecer uma indicação da quantidade do marcador presente na 18 amostra. É também aqui divulgado um conjunto para determinar cujo marcador de ácido nucleico particular de um conjunto conhecido de marcadores de ácido nucleico diferentes foi usado para marcar um material, cada marcador de ácido nucleico no conjunto compreendendo pelo menos uma sequência de identificação para o marcador, compreendendo o conjunto meios para estabelecer uma pluralidade de meios de reacção de amplificação de ácido nucleico, contendo cada meio um oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação de um marcador de ácido nucleico conhecido diferente no conjunto e sendo capaz de amplificar um marcador de ácido nucleico diferente do conjunto. 0 marcador de ácido nucleico compreende de um modo preferido uma região genérica que tem uma sequência presente em todos os marcadores de ácido nucleico no conjunto, e cada meio de amplificação de ácido nucleico também compreende de um modo preferido um oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde a uma sequência contida na região genérica.

Em formas de realização preferidas da invenção, o marcador além disso compreende um meio indicador em adição ao marcador de ácido nucleico, a presença do qual é rapidamente detectável em qualquer porção experimentada do material. A presença do meio indicador numa amostra indica que o marcador de ácido nucleico está também presente na amostra. Assim, um teste simples para a presença de meio indicador e por conseguinte de ácido nucleico numa amostra pode ser feito antes de análise detalhada da identidade ou da quantidade do marcador ser empreendida. 0 meio indicador pode compreender uma pluralidade de partículas. As partículas podem ser formadas a partir de qualquer material de matéria outrora viva não viva ou não viável conveniente, e as partículas podem ter qualquer 19 tamanho ou forma apropriados para o objectívo desejado. Geralmente, as partículas que têm um tamanho médio não maior do que cerca de 5 micrómetros são convenientes para a maior parte dos objectivos. As partículas de um modo preferido têm um tamanho médio de 0,01 a 5 micrómetros, de um modo mais preferido de 0,05 a 1 micrómetro, com um tamanho típico de cerca de 0,25 ou de 0,5 micrómetros. O que é importante é que elas não são visíveis a olho nu, mas podem ser detectadas facilmente. Para esta finalidade, as partículas podem ser marcadas, por exemplo, com tinta fluorescente.

De um modo preferido, o meio indicador compreende micro grânulos ou micro esferas, opcionalmente que carregam um marcador rapidamente detectável. Os micro grânulos/esferas exemplares são comercialmente disponíveis da firma Dynal (Reino Unido) de Wirral, Merseyside, Reino Unido, sob as marcas registadas genéricas DYNABEADS e DYNASHPERES. A preparação destes grânulos é divulgada, por exemplo, nos Pedidos de Patentes Europeias Nos. 91953,10986 e 106873 e nas Patentes norte americanas Nos. 4186120, 4563510 e 4654267.

Os métodos de acordo com a invenção nos seus vários aspectos como descrito aqui provêem a determinação quantitativa da quantidade de marcador de ácido nucleico num material marcado. Descrevemos três métodos preferidos de quantificação da quantidade de ácido nucleico amplificado numa reacção. Como mencionado anteriormente, o método actual de detecção não é relevante, embora haja vantagens na utilização dos métodos aqui descritos.

Uma forma de realização preferida da invenção utiliza um ensaio de nuclease de 5' para a detecção e quantificação, o qual é uma modificação da reacção de cadeia de polimerase (PCR). 0 ensaio de nuclease de 5' foi inicialmente descrito em Holland et ai., 1991 (Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R. e Gelfand, D. H, Proc. 20

Natl. Acad. Soi USA 88, 7276-7280) e Holland et al., 1992 (Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Will, S., Saiki, R. K. e Gelfand, D. H, Clinicai Chemistry, 38, 462-463). Este ensaio é também o sujeito das Patentes norte americanas Nos. 5 210 015 e 5 487 972, e de modificações subsequentes. Um conjunto comercial para conduzir o ensaio de nuclease de 5', conhecido como TAQ MAN, é disponível da firma PE Biosystems.).

Num ensaio de nuclease de 5' como aqui aplicado, o marcador de ácido nucleico é contactado com uma sonda de oligonucleótido marcada, em adição ao primeiro iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde a uma primeira sequência no marcador, na presença de uma polimerase de ADN que tem actividade de exonuclease de 5' a 3' . A sonda de oligonucleótido marcada é capaz de se ligar a uma sequência no marcador de ácido nucleico durante a amplificação. Na primeira forma de realização do marcador de ácido nucleico que tem uma sequência de identificação (marcador de Tipo I) , a sonda marcada liga-se a uma sequência de 5' a 3' a jusante do primeiro iniciador de oligonucleótido. Na segunda forma de realização do marcador de ácido nucleico (marcador de Tipo II), isto é, onde o marcador de ácido nucleico tem duas sequências de identificação e é além disso contactado com um segundo iniciador de oligonucleótido que corresponde à segunda região de identificação, a sequência a qual é ligada pela sonda é flanqueada pelas primeira e segunda sequências de identificação. Assim, a sonda marcada quando ligada ao marcador de ácido nucleico durante a amplificação liga 5' a 3' a jusante de um dos iniciadores de oligonucleótido.

Na terceira forma de realização do marcador (marcador de Tipo III) , a sequência ligada pela sonda consiste da sequência de identificação para o marcador de ácido nucleico. Assim, nesta forma de realização, as localizações da primeira e da segunda regiões 21 (que contêm os locais de iniciação) são tais que o primeiro iniciador de oligonucleótido ligado ao marcador de acido nucleico liga 5' a 3' a jusante da sonda marcada ligada à sua sequência de identificação correspondente. Em todas as formas de realização, o primeiro iniciador de oligonucleótido e a sonda podem ligar-se adjacentes um ao outro. Alternativamente, eles podem ser separados pela presença da sequência de intervenção no marcador de ácido nucleico. A sonda é marcada com um meio de sinal, de um modo preferido um marcador fluorescente.

Durante a fase de síntese do PCR, o primeiro iniciador de oligonucleótido é estendido pela actividade de polimerase da polimerase de ADN. A sonda de oligonucleótido marcada que se liga a jusante será no entanto degradada pela actividade de exonuclease de 5' a 3' da polimerase, e os fragmentos que carregam o meio de sinal serão libertados. 0 meio de sinal nos fragmentos libertados, por isso, pode ser detectado como uma indicação do progresso da reacção de amplificação. Em particular, a presença de tal sinal indica que o ácido nucleico amplificado está presente. Assim, se um sinal é detectado isto indica que o ácido nucleico está presente na amostra e por conseguinte que o material foi marcado. Além disso, a quantidade de sinal será proporcional à quantidade de ácido nucleico amplificado produzido durante o curso da reacção, para que a medição do nível do sinal dê uma indicação da quantidade de ácido nucleico amplificado.

Qualquer polimerase que tem actividade de nuclease de 5' a 3' pode ser usada no ensaio de nuclease de 5' . As polimerases de ADN mamífero ou bacteriano, por exemplo, a polimerase I de ADN de E. coli, é, por isso, conveniente para utilização no método. Para a reacção de cadeia de polimerase, a polimerase deve ser estável ao calor. As polimerases termostáveis são bem conhecidas na técnica, por exemplo, as polimerises de ADN de Thermus aquaticus, Pyrococcusfuriosis, Thermococcus litoralis, Thermusflavus, Thermus thermophilus, etc.

Além de ser marcada por um meio de sinal, a sonda de oligonucleótido também pode ser opcionalmente marcada com um meio de extinção, o qual opera para atenuar um sinal detectável do marcador fluorescente numa sonda intacta. Foi verificado que a atenuação adequada ocorre quando o meio de sinal está na extremidade de 5' do oligonucleótido e o meio de extinção está na extremidade de 3'. Pensa-se que a atenuação ocorre por meio da transferência de energia de ressonância de Fõrster através do espaço (FRET, descrita por Fõrster, V. Th., (1948), Armais Physics (Leipzig), 255-75). Assim, a proximidade do meio de extinção ao meio de sinal na sonda de oligonucleótido causa que um sinal detectável do meio de sinal seja atenuado, quando o segundo oligonucleótido é intacto. Tal atenuação não ocorre quando os fragmentos marcados são libertados pela actividade de exonuclease da polimerase, quando o meio de extinção é separado do meio de sinal. Neste caso, o sinal detectável da sonda de oligonucleótido intacto é substancialmente mais baixo do que o sinal detectável dos fragmentos libertados, e o sinal dos fragmentos libertados pode ser mais rapidamente detectado.

Um método alternativo de medir a presença ou a quantidade de ácido nucleico é medindo a incorporação de iniciadores de oligonucleótido em produtos de amplificação. Para esta finalidade, o primeiro iniciador de oligonucleótido, e/ou o segundo iniciador de oligonucleótido (se presente), é convenientemente marcado por um meio de sinal. Â medida que a amplificação progride, o(s) iniciador(es) é (são) incorporado(s) nos produtos de amplificação do acido nucleico amplificado. Um sinal de um iniciador o qual foi 23 assim incorporado é detectado como uma medida da presença de ácido nucleico amplificado na reacção. Além disso, um tal sinal pode ser medido para fornecer uma indicação da quantidade de ácido nucleico amplificado na reacção. 0(s) iniciador(es) pode(m) ser opcionalmente marcado (s) também com um meio de extinção o qual se presente atenua um sinal detectável do meio de sinal num iniciador de oligonucleótido livre. Quando o oligonucleótido é incorporado num produto de amplificação, no entanto, o meio de extinção não é capaz de atenuar o sinal do meio de sinal. Assim, o sinal detectável de um oligonucleótido livre (em solução) está a um nível substancialmente mais baixo do que o sinal detectável de um iniciador incorporado. De um modo preferido, o meio de sinal é um marcador fluorescente e a atenuação tem lugar por meio de transferência de energia de ressonância de Fõrster através do espaço.

Outras formas de detectar e determinar a quantidade de ácido nucleico amplificado são também possíveis. Assim, por exemplo, a quantidade de ácido nucleico amplificado durante a reacção de PCR pode ser quantificada periodicamente por amostragem da reacção. A quantidade de material de ácido nucleico nas amostras que é hibridisável para uma sonda de ácido nucleico é depois medida. A sonda é um oligonucleótido que tem uma sequência complementar a uma sequência contida no marcador de ácido nucleico, sendo esta sequência flanqueada pelas sequências ligadas pelos iniciadores usados na amplificação. Será apreciado que este método funcione porque só o ácido nucleico amplificado é capaz de hibridisar a tal sonda. A sonda é de um modo preferido marcada para permiti-lhe ser detectada mais rapidamente. Tal principio de detecção é usado no Sistema de PCR Quantitativo de PCR DE LUZ fabricado pela firma Tropix/PE Applied Biosystems. Neste sistema, um iniciador de oligonucleótido é marcado com biotina, e a reacção de PCR é 24 interrompida durante a fase exponencial da amplificação. Uma amostra é tomada do tubo de reacção, e é ligada a uma superfície revestida com estreptavidina. 0 produto ligado ê depois desnaturado, e o cordão não ligado removido. Uma sonda "interna" marcada com fluoresceina é depois contactada com o produto de PCR desnaturado, e um anticorpo anti-fluoresceina conjugado com fosfatase alcalina é adicionado em conjunto com um substrato quimioluminescente. A emissão de luz medida num luminómetro indica a presença e a quantidade do produto de amplificação. 0 ácido nucleico que forma o marcador pode ser o ácido desoxirribonucleico (ADN) ou o ácido ribonucleico (ARN). 0 marcador pode ser feito de proteína conjugada ao ácido nucleico (ácido nucleico de proteína, PNA) . 0 ADN é preferido por causa da sua maior estabilidade e resistência a nucleases. Embora o marcador de ácido nucleico possa ser de cordão duplo, ele de um modo preferido consiste de uma molécula de ADN de cordão singular, de um modo mais preferido, um oligonucleótido. Ambos ocorrem naturalmente e os ácidos nucleicos sintéticos são convenientes para utilização como o marcador. 0 termo "que ocorre naturalmente" refere-se a moléculas de ADN ou de ARN que ocorrem na natureza. 0 termo "sintético" é aplicado ao ADN ou ao ARN sintetizado no laboratório utilizando procedimentos de síntese de rotina bem conhecidos na técnica relevante.

De um modo preferido, o marcador é um oligonucleótido de ADN sintético. 0 ADN sintético pode ser formado das cinco bases que ocorrem naturalmente: adenina, timina, guanina, citosina e uracilo, e bases que não ocorrem naturalmente, por exemplo, bases de inosina, e nucleótidos derivados, tais como 7-deazo-2' desoxiguanosina, oligodesoxinucleótidos de alquifonato, oligo-desoxinucleótidos de fosforotioato e oligodesoxinucleótidos a- 25 anoméricos. Em certas circunstâncias, os marcadores que incorporam bases que não ocorrem naturalmente podem ter vantagens sobre os que contêm bases que só ocorrem naturalmente, por exemplo, em estabilidade, porque eles parecem ser menos degradados pela actividade de nuclease, ou por substâncias quimicamente activas ou por condições ambientais, tal como o calor ou a radiação ultravioleta. A utilização de marcadores que incorporam bases que não ocorrem naturalmente é limitada só pela sua capacidade a ser efectivamente detectada pelos meios de detecção. Para os métodos de marcação que usam a tecnologia de PCR preferida, o marcador deve ser capaz de formar duplexes com iniciadores de PCR e funcionarem como um padrão para as polimerases usadas no procedimento de PCR.

De um modo preferido, o ácido nucleico é detectado e quantificado ao mesmo tempo que é amplificado. Várias tecnologias de amplificação de ácido nucleico podem ser usadas no método aqui descrito, por exemplo, Reacção de Cadeia de Polimerase (PCR), Reacção de Cadeia de Ligase (LCR), NASBA e ΤΜΆ. Numa forma de realização preferida, o método utiliza o PCR, divulgado nas Patentes norte americanas Nos. 4683202 e 4683195 e nos Pedidos de Patentes Europeias Nos. 258017 e 237362.

Tipicamente, a sequência de identificação compreende pelo menos 20 bases de nucleótido para assegurar a especificidade adequada para qualquer marcador para que a contaminação acidental não leve a resultados falsos. Quanto maior a sequência, mais elevado o conteúdo potencial de informação do marcador, mas quanto mais essa degradação se tornará um problema. Além disso, a síntese de marcadores mais longos é mais cara e menos eficiente, como discutido em cima. De um modo preferido, o marcador de ácido nucleico está entre 60 a 125 pares de bases ou nucleótidos em comprimento. De um modo mais preferido, o marcador de ácido 26 nucleico é menor do que 90 nucleótidos ou pares de bases em comprimento e de um modo mais preferido o marcador de ácido nucleico é de cerca de 63 nucleótidos ou pares de bases em comprimento. Isto permite a hibridisação de dois iniciadores os quais são tipicamente de cerca de 20 bases ou nucleótidos cada um em comprimento, e os quais, quando hibridisados para o marcador, são separados por uma região no marcador entre cerca de 20 a até 85 bases/nucleótidos em comprimento. Esta região pode conter uma região de ligação para uma sonda de nuclease de 51 , como descrito em mais detalhe a seguir. O tamanho actual do marcador não é importante, desde que o marcador seja de tamanho adequado para os iniciadores de tamanho conveniente para reconhecer as sequências correspondentes dentro do marcador. Por razões de economia, os marcadores podem ser escolhidos para serem tão curtos quanto possível. O marcador ou o meio de sinal podem ser uma substância fluorescente, especialmente uma tinta fluorescente. As tintas fluorescentes convenientes incluem (mas não são limitadas a) : derivados de aloficocianina, ficocianina, ficoeritrina, rodamina, oxazina, coumarina, fluorosceina, por exemplo, diacetato de fluoresceinisotiocianato e de carboxifluorosceina, bem como vermelho Texas, acridina amarela/cor de laranja, brometo de etídio, iodeto de propídio, bis-benzamida (comercialmente disponível da firma Hoechst sob a marca registada H33258) etc. De um modo preferido, o marcador fluorescente é FAM (6-carboxi-fluoresceina) ou TET (6-carboxi-4,7,2'7'-tetracloro-fluoresceina).

Um marcador de ácido nucleico escolhido do conjunto de marcadores é usado para marcar um material por se aplicar um marcador que compreende o marcador escolhido para o material. Se o material a ser marcado for um líquido, então é simplesmente necessário 27 adicionar o marcador de oligonucleótido directamente ao líquido. Se o material a ser marcado for um líquido à base de água, então o marcador pode ser adicionado directamente ao líquido. Se o material for o hidrocarboneto ou baseado em óleo, o marcador pode ser apropriadamente modificado (por exemplo, por metílação) antes de se adicionar ao material. No caso de um material sólido a ser marcado, o marcador de oligonucleótido pode ser primeiro dissolvido num líquido conveniente, o qual é depois aplicado ao sólido e deixado a secar. 0 marcador de oligonucleótido também pode ser aplicado na forma de um aerossol, o qual é pulverizado para o sólido. Em adição ao marcador de oligonucleótido, o marcador também pode compreender adicionalmente um ligante ou um meio de detecção como descrito anteriormente.

Posteriormente, uma amostra pode ser tomada do material marcado e directamente submetida a análise, com um pré-processamento opcional se necessário. Por exemplo, se o material ê um líquido, um pequeno volume do líquido pode ser tomado e adicionado directamente às reacçóes de amplificação. Semelhantemente pequenas partículas sólidas (por exemplo, hastes) também podem ser adicionadas directamente às reacçóes de amplificação. No entanto, é normalmente preferido no caso de um material sólido que o marcador de ácido nucleico seja extraído do sólido antecipadamente. Isto pode ser convenientemente feito por se lavar o material sólido ao qual o marcador foi aplicado com um tampão â base de água conveniente.

As formas de realização da invenção serão agora descritas só por meio de exemplo e com referência aos desenhos que as acompanham, em que: A FIGURA 1 é um plano do sinal fluorescente detectado sobre o fundo em cada ciclo de PCR de uma série de concentrações de partida(por mL) do marcador de ácido nucleico; e 28 A FIGURA 2 é um plano logarítmico derivado dos dados na Figura 1, que mostra o ciclo de limiar (isto é, o ciclo no qual o sinal detectado está acima do nível de fundo) para uma série de concentrações de partida do marcador de ácido nucleico.

Exemplo I: estrutura de Tipo I detectada e quantificada com o ensaio de nuclease de 5'

Um marcador de Tipo I pode ser usado para marcar um material, e identificado e quantificado por meio do ensaio de nuclease de 51.

Um conjunto de marcadores de oligonucleótido de ADN de cordão singular é sintetizado de acordo com os métodos de síntese de oligonucleótido convencionais como conhecidos na técnica. Os marcadores são de um modo preferido de cerca de 70 nucleótidos (nt) em comprimento, e contêm só uma sequência de identificação dentro de cada marcador. Por exemplo, o conjunto pode conter os marcadores seguintes: SEQ ID: NO 1

Região A Região B Região C

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCCCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAAC SEQ ID: NO 2

Região A Região B Região C

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGAACTGATCGGGCTCAACTGGA

Como pode ser visto em cima, a sequência de identificação (Região C) é uma região variável que tem uma determinada sequência a qual é diferente de marcador para marcador. A sequência desta região, por isso, será única para o marcador particular no qual a determinada sequência é disposta. As Regiões A e B, por outro lado, têm as 29 mesmas sequências para todos os marcadores no conjunto, e podem ser referidas como sequências "genéricas". Neste caso, se a sequência de identificação num marcador tiver 20 nucleótidos de comprimento, então com 4 bases disponíveis, aproximadamente 1,1 x 1012 marcadores únicos podem ser sintetizados.

Um marcador de oligonucleótido único é depois escolhido a partir do conjunto e usado para marcar um material por se aplicar um marcador que compreende o marcador escolhido, como descrito em cima. Posteriormente, uma porção do material marcado é experimentada, e a amostra submetida a análise para determinar a identidade e/ou a quantidade do marcador na amostra. Se necessário, o marcador de oligonucleótido pode ser opcionalmente extraído da amostra e submetido a análise.

Para os objectivos de detecção e quantificação, um conjunto de pares de iniciadores de oligonucleótido correspondentes é sintetizado para utilização numa reacção de cadeia de polimerase (PCR) utilizando e métodos de síntese de ADN convencionais bem conhecidos na técnica. Um iniciador de oligonucleótido em cada par do conjunto tem uma sequência que consiste de uma sequência na Região A do conjunto de marcadores. O outro iniciador de oligonucleótido no par tem uma sequência complementar a uma sequência na região de identificação variável (Região C) de um marcador de oligonucleótido diferente no conjunto. Assim, o número de pares de iniciadores corresponde ao número de marcadores de oligonucleótido no conjunto, e cada par de iniciador no conjunto ê capaz de amplificar um (e só um) dos marcadores de oligonucleótido no conjunto. Será apreciado que o desenho dos pares de iniciadores e a sonda de oligonucleótido possa ser variado. Assim, um iniciador de oligonucleótido num par pode ter uma sequência complementar a uma sequência na Região A, em cujo caso o outro iniciador terá uma 30 sequência que consiste de uma sequência na Região C.

Em adição aos pares de iniciadores, um terceiro oligonucleótido é construído para utilização como uma sonda no ensaio de nuclease de 5', mais uma vez usando os métodos de síntese de ADN convencionais. A sonda de oligonucleótido tem uma sequência que consiste de ou complementar a uma sequência na Região B dos marcadores no conjunto. Como com a escolha de iniciadores de PCR, terá que ser dada a consideração devida à sequência da sonda marcada. Em particular, a sequência de sonda é escolhida para que o seu ponto de fusão esteja de um modo preferido acima daquele de ambos os iniciadores de PCR, para que durante a reacção de amplificação, a sonda seja ligada ao seu alvo antes de qualquer extensão de iniciador significativa tenha lugar. A sonda de oligonucleótido é marcada com um marcador fluorescente tal como o FAM (6-carboxi-fluoresceina) ou TET (6-carboxi-4,7,2'7'-tetracloro-fluoresceina). O marcador fluorescente é ligado à sonda por meios convencionais conhecidos na técnica. Além do mais, é possível actualmente encomendar a partir de fontes comerciais usuais sondas feitas com marcadores fluorescentes ou outros ligados. Bem como o marcador fluorescente, o meio de extinção também é ligado à sonda, por exemplo, por meio de qualquer processo de união convencional como conhecido na técnica. O meio de extinção é de um modo preferido uma tinta de extinção que, quando presente na mesma sonda de oligonucleótido como o marcador fluorescente, atenua ou reduz o sinal de fluorescência observado do marcador fluorescente de um modo preferido através de transferência de energia de ressonância de Fõrster (FRET). Assim, numa sonda de oligonucleótido intacta, o sinal do marcador fluorescente é reduzido.

Uma série de reacções de ensaio de nuclease de 5' é depois 31 colocada. Cada tubo de reacção contém uma porção de aliquota da amostra que contém o marcador de oligonucleótido desconhecido, a polimerase de ADN de Taq, dNTPs, cloreto de magnésio, e tampão. Além do mais, como iniciadores de PCR, cada tubo de reacção contém um par de iniciadores diferente escolhido do conjunto de iniciadores de oligonucleótido descritos em cima, bem como uma quantidade de sonda de oligonucleótido marcada. 0 número de tubos de reacção corresponde ao número de marcadores de oligonucleótido diferentes no conjunto. Uma vez que cada par de iniciador do conjunto só é capaz de amplificar um e só um dos marcadores de oligonucleótido no conjunto de marcadores, o facto que uma reacção de PCR bem sucedida tenha ocorrido num tubo de reacção particular indica que o par de iniciador naquele tubo reconheceu as sequências correspondentes no marcador de oligonucleótido e permitiu a amplificação daquele marcador. A identidade do marcador de oligonucleótido usado para marcar o material, por isso, pode ser facilmente determinada por se executarem as reacções de PCR e determinar qual das reacções é bem sucedida. Naturalmente, se se suspeita que uma amostra contém um determinado marcador, então é necessário só executar uma reacção de PCR com o par de iniciador apropriado para ver se a amplificação se realiza. Semelhantemente se se acredita que o marcador pertence a um pequeno número de marcadores candidatos, um número reduzido de reacções pode ser executada com os pares de iniciadores apropriados. A vantagem do ensaio de nuclease de 5' é que a quantificação de marcador pode realizar-se ao mesmo tempo que a detecção da amplificação. Um sinal de fluorescência único é produzido, a presença do qual indica que a amplificação se realizou (e por conseguinte fornece a identidade do marcador) , enquanto a força do sinal é determinada para fornecer uma indicação da quantidade de marcador na amostra (como descrito em mais detalhe a seguir). 32

Quando a sonda marcada e os iniciadores são hibridisados às suas respectivas sequências complementares, a estrutura do marcador é tal que sonda marcada liga-se de 5' a 3' a jusante de um dos iniciadores. Ã medida que a polimerase de ADN estende o iniciador ligado ao marcador, ela encontra a sonda marcada ligada ao marcador. A actividade da nuclease de 51 a 3' da polimerase degrada a sonda marcada, e liberta fragmentos marcados no meio de reacção. Dependendo da estrutura do marcador, no entanto, os iniciadores e a sonda, a sonda marcada quando hibridisada ao marcador pode até ligar-se imediatamente a jusante (isto é, adjacente) do iniciador. Neste caso, a actividade de exonuclease passa a degradar a sonda marcada sem que qualquer extensão de iniciador se realize. Como acima mencionado, numa sonda de oligonucleótido intacta, o sinal do marcador fluorescente é reduzido, mas quando os fragmentos marcados são libertados, o sinal não é mais atenuado e pode ser detectado por meios apropriados, por exemplo, por um detector de fluorescência. À medida que a amplificação progride, a força do sinal deve aumentar exponencialmente, uma vez que um número crescente de fragmentos marcados é libertado no meio. A força do sinal pode ser determinada e usada para determinar a concentração inicial do marcador na amostra como descrito a seguir. Os vasos de reacção usados no ensaio têm paredes que são transparentes ao sinal fluorescente, e o sinal, por isso, pode ser detectado durante o curso da reacção de PCR sem que a reacção necessite de ser interrompida.

Antes das reacções de amplificação serem executadas, o sistema de detecção é calibrado usando as quantidades iniciais conhecidas dos marcadores de oligonucleótido numa série de reacções de teste. A FIGURA I é um gráfico que mostra o nível do sinal fluorescente detectado sobre o nível de fundo (eixo Y) em cada ciclo da reacção 33 de PCR (eixo X), para uma série de concentrações iniciais (104,106, 108, IO10 por mL) de marcador de ácido nucleico. Os oligonucleótidos de A2, B2 e C2 têm concentrações de 104/mL, A3, B3 e C3 têm concentrações de 106/mL, A4, B4 e C4 têm concentrações de 108/mL enquanto A5, B5 e C5 têm concentrações de 1010/mL. A barra horizontal mostra o nível de fundo do sinal fluorescente, que é estabelecido para ser igual a zero. Como pode ser visto, o ciclo limiar, em outras palavras o ciclo no qual o sinal se torna detectável sobre o nível de fundo (isto é, o ponto em que a curva começa a aumentar), é diferente para concentrações iniciais diferentes do marcador. Quanto mais marcador estiver inicialmente presente na amostra, mais cedo o sinal na reacção se torna significativo. Os dados usados para a Figura 1 são tabulados na Tabela 1 a seguir.

Concentração inicial de 104/mL Concentração inicial de 106/mL

Oligonucleótido A2 B2 C2 Ciclo Limiar 32,3 32,4 33,4

Oligonucleótido A3 B3 C3 Ciclo Limiar 25,3 25,3 26,2

Concentração inicial de 108/mL Concentração inicial de 1010/mL

Oligonucleótido A4 B4 C4 Ciclo Limiar 18,1 18,9 18,1

Oligonucleótido A5 B5 C5 Ciclo Limiar 12,0 12,0 12,2 TABELA 1: Ciclos limiares para concentrações de partida diferentes de oligonucleótido. Três oligonucleótidos foram usados para cada concentração e são mostrados como por exemplo, A2, B2 e C2.

Os dados reunidos durante a calibração podem ser traçados para 34 gerar uma curva padrão. A FIGURA 2 é um gráfico que mostra o ciclo limiar (em outras palavras, o ciclo no qual o sinal é detectãvel sobre o fundo) como o eixo Y, traçado contra o logaritmo da concentração de partida inicial. Será visto que o ciclo limiar é directamente proporcional ao logaritmo da concentração de partida inicial. Num caso ideal, a inclinação da linha deve ser de -3.3.

Com a finalidade de se determinar a concentração inicial do marcador na reacção de teste, o nível ao qual o sinal é detectável sobre o fundo é determinado. Este ciclo limiar é depois comparado com a curva padrão para fornecer a concentração inicial do marcador na amostra. A concentração do marcador na amostra pode ser naturalmente usada para determinar a concentração do marcador no material marcado.

Exemplo II: estrutura de Tipo II detectada e quantificada com o ensaio de nuclease de 5'

Um marcador de Tipo II pode ser usado para marcar um material, e identificado e quantificado por meio do ensaio de nuclease de 5'.

Um conjunto de marcadores de oligonucleótido de ADN de cordão singular é sintetizado de acordo com os métodos de síntese de oligonucleótido convencionais como conhecido na técnica. Os marcadores são de um modo preferido de cerca de 70 nucleótidos (nt) em comprimento, e contêm duas sequências de identificação dentro de cada marcador. Por exemplo, o conjunto pode conter os marcadores seguintes: SEQ ID: NO 3

Região A Região B Região C

CATGACGATGTCGGAATGATCCGACCCGCTTTCGCAGAACACCGAATACCAACTGCGACCAAGGCGT 35 SEQ ID: NO 4

Região A Região B Região C

CATTGGAGACAGACCCGAAGCGACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAACGGTGGGAAATACCAACTGCGA

Como mostrado em cima, num marcador de Tipo II as Regiões A e C são regiões variáveis que têm sequências de identificação as quais são diferentes de marcador para marcador. A Região B, por outro lado, é uma sequência "genérica" que tem a mesma sequência para todos os marcadores no conjunto. No conjunto acima mencionado, uma vez que as sequências de identificação são agora 40 (2 x 20) nucleótidos de comprimento, aproximadamente 2.2 x 1012 marcadores diferentes são disponíveis. Assim, usando um marcador de Tipo II em vez de um marcador de Tipo I aumenta o número de marcadores disponíveis para a marcação. 0 material é marcado e experimentado do mesmo modo que o descrito em cima no Exemplo I. A identificação e a quantificação subsequentes do marcador também são assim descritas como no Exemplo 1 em cima, excepto que uma vez que hã agora duas regiões de identificação, ambos de cada par de iniciadores no conjunto de iniciador são designados para iniciar a amplificação de um marcador singular no conjunto. Em outras palavras, um iniciador de oligonucleótido num par do conjunto tem uma sequência que consiste de uma sequência na Região A de um marcador de oligonucleótido do conjunto, enquanto que o outro iniciador no par tem uma sequência complementar a uma sequência na Região C do mesmo marcador de oligonucleótido. Alternativamente, um iniciador tem uma sequência complementar a uma sequência na Região A e o outro uma sequência que consiste de uma sequência na Região C. Assim, cada par de iniciadores é capaz de amplificar um e só um dos marcadores no conjunto. Em adição aos pares de iniciadores, uma terceira sonda de oligonucleótido marcada é sintetizada como descrito no Exemplo I em 36 cima. 0 ensaio de nuclease de 5' é conduzido do mesmo modo que o descrito no Exemplo I.

Como com um marcador de Tipo I, a presença de uma amplificação bem sucedida fornece a identidade do marcador, e o nível ao qual o sinal é detectável sobre o fundo é determinado e comparado com uma curva padrão para fornecer a concentração inicial do marcador na amostra. Obviamente, a concentração do marcador no material marcado pode ser calculada facilmente a partir da concentração do marcador na amostra.

Exemplo III: marcador de Tipo I ou de Tipo II detectado e quantificado por se medir a incorporação de iniciadores marcados nos produtos de amplificação

Um marcador de Tipo I ou um marcador de Tipo II pode ser usado para marcar um material, e identificado e quantificado por se detectar e determinar a quantidade da incorporação de iniciador de oligonucleótido marcado em amplicons (produtos de amplificação).

Um conjunto de marcadores de oligonucleótido de ADN de cordão singular é sintetizado de acordo com os métodos de síntese de oligonucleótido convencionais como conhecido na técnica. Os marcadores são de um modo preferido de cerca de 70 nucleótidos (nt) em comprimento, e contêm uma (Tipo I) ou duas (Tipo II) sequências de identificação dentro de cada marcador. Por exemplo, o conjunto pode conter os marcadores de Tipo I seguintes:

Região B

SEQ ID: NO 5 Região A 37

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAAC SEQ ID: NO 6

Região A Região B

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCCCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGAACTGATCGGGCTCAACTGGA

Em alternativa o conjunto pode conter os seguintes marcadores de Tipo II: SEQ ID: NO 7

Região A Região B

ATGACGATGTCGGAATGATCCGACCCGCTTTCGCAGAACACCGAATACCAACTGCGACCAAGGCGT SEQ ID: NO 8

Região A Região B

ATTGGAGACAGACCCGAAGCGACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAACGGTGGGAAATACCAACTGCGA 0 desenho e a síntese dos marcadores, e a marcação e a amostragem do material, são como descritos no Exemplo I em cima. Num marcador de Tipo I (SEQ IDs 5 e 6) , a Região A é o mesma para todos os marcadores no conjunto, enquanto que a Região B é a sequência de identificação a qual é diferente em cada marcador no conjunto. No marcador de Tipo II, ambas as Regiões A e B (SEQ IDs 7 e 8) são sequências de identificação. Um conjunto de pares de iniciadores é sintetizado como descrito em cima no Exemplo I (no caso de um marcador de Tipo I) e no Exemplo II (no caso de um marcador de Tipo II). Como antes, cada par de iniciadores é capaz de amplificar um e sõ um marcador dentro do conjunto. Pelo menos um dos iniciadores em cada par deve ser marcado com um meio de sinal (por exemplo, um marcador fluorescente) e um meio de extinção, como descrito em cima em relação à sonda de oligonucleótido marcada no Exemplo I. 38

Uma série de reacções de amplificação de PCR é estabelecida como descrito no Exemplo I em cima, excepto o facto de que a sonda de oligonucleõtido marcada do ensaio de nuclease de 5' não está presente na mistura de reacção. 0 marcador fluorescente e o meio de extinção são escolhidos tal que numa solução livre de iniciador, o meio de extinção atenue o sinal do marcador fluorescente. Esta atenuação realiza-se por meio da transferência de energia de ressonância de Fõrster através do espaço. Quando o iniciador de oligonucleõtido marcado é estendido pela polimerase de ADN e incorporado num produto de amplificação (amplicon) no entanto, o meio de extinção não atenua o sinal do marcador fluorescente, e um sinal do marcador fluorescente pode ser detectado. À medida que a amplificação prossegue, o nível do sinal detectável deve aumentar exponencialmente. Quanto mais elevada for a concentração do marcador inicialmente presente na amostra, mais baixo será o número de ciclo no qual o sinal é detectável sobre o fundo. Por se calibrar o aparelho de detecção na mesma maneira que a descrita no Exemplo I, uma curva padrão pode ser produzida, a qual permitirá que a quantidade do marcador seja determinada. Mais uma vez, a presença do sinal pode ser determinada ao mesmo tempo como o nível do sinal, para fornecer a identidade do marcador bem como a sua quantidade na amostra.

Exemplo IV: marcador de Tipo I ou de Tipo II detectado e quantificado por se medir directamente o produto de amplificação

Um marcador de Tipo I ou um marcador de Tipo II pode ser usado para marcar um material, e identificado e quantificado por directamente se detectar e determinar a quantidade de produtos de amplificação produzidos durante a reacção de PCR. Os produtos de amplificação são detectados e quantificados utilizando do Sistema de PCR 39

Quantitativo de PCR DE LUZ fabricado pela firma Tropix/PE Applied

Biosystems.

Um conjunto de marcadores de oligonucleótido de cordão singular é sintetizado de acordo com os métodos de síntese de oligonucleótido convencionais como conhecidos na técnica. Os marcadores são de um modo preferido de cerca de 70 nucleótidos (nt) em comprimento, e contêm uma (Tipo I) ou duas (Tipo II) sequências de identificação dentro de cada marcador. Por exemplo, o conjunto pode conter os seguintes marcadores de Tipo I: SEQ ID: NO 9

Região A Região B Região C

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAAC SEQ ID: NO 10

Região A Região B Região C

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCCCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGAACTGATCGGGCTCAACTGGA

Em alternativa, o conjunto pode conter os seguintes marcadores de Tipo II: SEQ ID: NO 11

Região A Região B Região C

ATGACGATGTCGGAATGATCCGACCCGCTTTCGCAGAACACCGAATACCAACTGCGACCAAGGCGT SEQ ID: NO 12

Região A Região B Região C

ATTGGAGACAGACCCGAAGCGACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAACGGTGGGAAATACCAACTGCGA

0 desenho e a síntese dos marcadores é como descrito no Exemplo I 40 em cima. Num marcador de Tipo I (SEQ IDs 9 e 10), as Regiões "genéricas" A e B são iguais para todos os marcadores no conjunto, enquanto a Região C é a sequência de identificação a qual é diferente em cada marcador no conjunto. No marcador de Tipo II, ambas as Regiões A e C (SEQ IDs 7 e 8) são sequências de identificação, enquanto que a Região B é comum entre todos marcadores no conjunto. Para a amplificação de PCR, um conjunto de pares de iniciador é sintetizado como descrito em cima no Exemplo I (no caso de um marcador de Tipo I) e no Exemplo II (no caso de um marcador de Tipo II) . Como antes, cada par de iniciadores é capaz de amplificar um e só um marcador dentro do conjunto.

Para permitir que os produtos de amplificação sejam capturados, um dos iniciadores em cada par é marcado com biotina. A marcação e a amostragem do material é como descrito no Exemplo I em cima. Uma série de reacções de PCR é estabelecida, contendo cada tubo de reacção um par de iniciador diferente escolhido a partir do conjunto de iniciadores de oligonucleótido, como descrito no Exemplo I. A detecção e a quantificação do produto de amplificação é efectuada por se tomar periodicamente uma amostra de cada tubo de reacção durante a fase exponencial da amplificação. A amostra é aplicada a um micro prato cujas cavidades são revestidas com estreptavidina. Um iniciador marcado com biotina não incorporada bem como quaisquer produtos de amplificação são capturados na cavidade. As cavidades são depois lavadas várias vezes com o tampão. Os produtos de amplificação são depois desnaturados para expor o ADN de cordão singular ligado ao micro prato, e os cordões complementares são tirados ao lavar. Uma sonda marcada por fluoresceina que tem uma sequência complementar à sequência genérica da Região B é adicionada ao micro prato e deixada a hibridisar para o ADN de cordão singular. Um anticorpo de anti- 41 fluoresceina conjugado com fosfatase alcalina é depois adicionado em conjunto com um substrato quimioluminescente, e a emissão de luz detectada e medida num luminómetro. A presença da emissão de luz indica uma amplificação bem sucedida e por conseguinte a identidade do marcador de ácido nucleico, enquanto a quantidade de luz emitida indica a quantidade do produto de amplificação. Como descrito em cima em relação ao Exemplo I, isto pode ser comparado contra uma curva padrão para dar a concentração inicial do marcador na amostra e por conseguinte no material marcado.

Exemplo V: marcador de Tipo III detectado e quantificado através de ensaio de nuclease de 5'

Um Tipo III pode ser usado para marcar um material, e identificado e quantificado por meio do ensaio de nuclease de 51.

Um conjunto de marcadores de oligonucleótido de ADN de cordão singular é sintetizado de acordo com os métodos de síntese de oligonucleótido convencionais como conhecido na técnica. Os marcadores são de um modo preferido de cerca de 70 nucleótidos (nt) em comprimento, e contêm uma sequência de identificação. Por exemplo, o conjunto pode conter os marcadores seguintes; SEQ ID: NO 13

Região A Região B Região C

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAAC SEQ ID: NO 14

Região A Região B Região C

ACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCATGGCATCGTCGGAGTTGGAGCTGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAAC

Num marcador de Tipo III, só uma sequência de identificação a qual 42 é diferente de marcador para marcador está presente (Região B). As Regiões A e C têm sequências as quais são comuns a todos os marcadores no conjunto. Um marcador de oligonucleótido singular é escolhido a partir do conjunto e usado para marcar um material como descrito em cima no Exemplo I. Posteriormente, uma porção do material marcado é experimentada e submetida a análise para se determinar a sua identidade e/ou a quantidade do marcador na amostra. Para isto, um par de iniciadores de oligonucleotido ê sintetizado um dos quais tem uma sequência que consiste de uma sequência na Região A e o outro uma sequência complementar a uma sequência na Região C. Alternativamente, um iniciador pode ter uma sequência complementar a uma sequência na Região A e o outro uma sequência que consiste de uma sequência na Região C. Além do mais, um conjunto de sondas de oligonucleótido marcadas também é sintetizado, tendo cada sonda no conjunto uma sequência complementar ou correspondente a uma sequência na Região B de um marcador singular no conjunto. As sondas são marcadas por se usarem marcadores fluorescentes que têm máximos de emissão diferentes. Assim por exemplo, uma sonda no conjunto pode ser marcada com rodamina, e uma outra com isotiocianato de fluoresceina (FITC). Cada sonda também é ligada a um meio de extinção, o qual atenua o sinal do marcador fluorescente numa sonda de oligonucleótido intacta.

Para identificar e quantificar o marcador usado para marcar o material, uma reacção de nuclease de 51 é estabelecida que contém o par de iniciadores de oligonucleótido em adição a de um número de sondas diferentemente marcadas do conjunto. Como o par de iniciador é complementar a sequências nas regiões "genéricas" do conjunto, qualquer marcador presente na amostra será amplificado qualquer que seja a sua identidade. No entanto, só uma das sondas marcadas se vai ligar ao marcador de oligonucleótido durante a reacção. Como 43 descrito em cima no Exemplo I, uma sonda hibridisada marcada para a sua sequência complementar n marcador vai ligar-se de 51 a 3' a jusante de um iniciador de amplificação hibridisado ao marcador, e a actividade de exonuclease de 51 a 3' da polimerase do ADN de Taq vai degradar a sonda marcada durante a síntese de ADN para libertar os fragmentos marcados. Como em cima, o meio de extinção não é capaz de atenuar o sinal de um marcador fluorescente num fragmento libertado. Uma vez que vários marcadores fluorescentes são usados para marcar as sondas diferentes presentes na reacção de nuclease de 5', o sinal fluorescente emitido a partir da reacção de nuclease de 5' vai ter um de vários comprimentos de onda dependendo de cuja sonda particular é degradada. Com a finalidade de se detectar o sinal emitido, por conseguinte, um detector multicanal capaz de detectar a radiação emitida num número de comprimentos de onda diferentes é usado. Logo que se conhece qual o fluoroforo que foi usado para marcar qual sonda, a detecção do comprimento de onda (ou cor) da luz emitida vai indicar qual a sonda marcada que foi ligada ao marcador e degradada durante a reacção, e por conseguinte fornecer a identidade do marcador de oligonucleótido dentro do conjunto que foi usado para marcar o material. A força do sinal aumenta exponencialmente durante uma reacção bem sucedida, e a calibração apropriada do sistema de detecção vai permitir que a concentração inicial do marcador de oligonucleótido seja determinada, como explicado em cima no Exemplo I.

Será apreciado que a vantagem de se usar um ensaio de nuclease de 5' com os marcadores de Tipo III seja a de que é possível teoricamente identificar e quantificar o marcador usando uma reacção de amplificação singular. Esta técnica é limitada só pelo número de marcadores fluorescentes distintas disponíveis para marcar as sondas de oligonucleótido diferentes, e pela capacidade dos detectores multicanais de discriminar entre os comprimentos de 44 onda do sinal emitido. Os detectores multicanais correntes são capazes de detectar até oito comprimentos de onda distintos, significando que no momento é possível ter oito sondas de oligonucleótido diferentemente marcadas na reacção de nuclease de 5'. Várias de tais reacções, por isso, têm de ser executadas dependendo do tamanho do conjunto de marcadores. No entanto, à medida que a tecnologia progride, esperamos que será possível no futuro ter um processo de detecção e de quantificação de "um tubo".

Exemplo VI: Exemplo Detalhado que Ilustra o marcador de Tipo II no Ensaio de Nuclease de 5'

Duas etapas estão envolvidas no desenho de marcadores de oligonucleótido, na geração de sequência casual e no desenho de iniciador/conda. Na primeira etapa, um grande número de sequências de ADN casuais de 100 bases de comprimento é primeiro gerada usando o programa de computador de PC/Gene adquirido da firma Oxford Molecular Limited, Reino Unido. Qualquer programa de computador capaz de gerar sequências de ADN casuais pode ser usado. As sequências são escolhidas para ter uma composição igual nominal para todas as quatro bases, e as sequências geradas exportadas no programa de computador de desenho de iniciador/conda apropriado para a segunda etapa do desenho de iniciador/conda. 0 programa de computador usado para desenhar os iniciadores e sonda é o "Primer Express" da firma PE Applied Biosystems. O "Primer Express" é disponível como a parte do programa de computador para fazer funcionar o hardware analítico PE-ABI 7700 usado para empreender os ensaios de nuclease de 5', cujo hardware também é produzido e comercializado pela firma PE Applied Biosystems. A operação detalhada do programa de computador é descrita nos manuais empacotado que acompanham o programa de computador. O programa de computador "Primer Express" aplica as regras normais para o desenho 45 do iniciador de PCR (por exemplo, a necessidade de evitar grampos, a necessidade que os iniciadores tenham correspondência com Tm/ etc.) para desenho dos iniciadores. Além do mais, o programa de computador evita a complementaridade significativa entre a sonda e qualquer dos iniciadores de PCR e assegura que a sonda é complementar à sequência de interesse e se liga a uma região entre os dois iniciadores. 0 programa de computador também assegura que a sonda tem em pelo menos 10 graus Celsius mais elevados do que qualquer iniciador de amplificação, e não tem um G na extremidade de 5' da sonda. Logo que uma sequência de oligonucleótido casual tenha sido importada para o programa de computador de "Primer Express", o programa de computador é instruído para criar um novo desenho de sonda e de iniciador. O programa de computador é depois instruído usando a função "Encontrar Iniciadores/Sonda Agora" para determinar as primeiras 200 combinações de iniciadores e sondas que são adequadas para o conjunto por definição dos parâmetros fornecidos com o programa de computador. As designações por definição são como se segue: o mínimo de Tra de ambos os iniciadores é estabelecido a 50 graus C, o máximo de Tm ê estabelecido a 60 graus C, e o óptimo Tra é estabelecido a 58 graus C. A diferença de Tm máxima entre os iniciadores é de 2 graus. O conteúdo de GC dos iniciadores é estabelecido para ter um mínimo de 20 %, um máximo de 80 %, sem nenhum grampo de 3' de GC para qualquer iniciador. O comprimento mínimo do iniciador é estabelecido para ser de 9, o máximo de 40 e o comprimento óptimo é de 20. O Tm mínimo do produto de amplificação é estabelecido para ser de 0 graus, o Tra máximo é de 85 graus, enquanto os comprimentos mínimos e máximos do produto de amplificação são de 50 e de 150 respectivamente. 0 Tm da sonda é estabelecido para ser pelo menos de 10 graus mais elevado do que o Tm dos iniciadores, e a sequência da sonda é estabelecida para não começar com um G. A repetição de base máxima dos iniciadores é estabelecida em 3 resíduos, enquanto que as exigências de estrutura 46 secundárias do iniciador são estabelecidas para serem: par de base consecutivo máximo de 3, par de base total máximo de 8. A combinação de iniciadores e de sonda com o resultado de penalização mais baixo no que se refere ao oligonucleótido é depois identificada, e a sequência de sonda é depois usada como uma base para desenhar iniciadores de outras sequências de oligonucleótido casuais como descrito a seguir. A "sequência de sonda comum" identificada em cima é introduzida no seguinte oligonucleótido casual importado par o programa de computador "Primer Express". Para esta finalidade, as funções de edição do programa de computador "Primer Express" são utilizadas, como descrito em mais detalhe no manual operacional do programa de computador. A experiência mostrou que o melhor lugar para inserir a sequência de sonda está em volta da posição de base 35. A sequência de sonda inserida pode depois ser fixada usando o programa de computador, e a rotina "Encontrar Iniciadores/Sonda Agora" empreendida mais uma vez para localizar os pares de iniciadores óptimos na sequência resultante (isto é, a sequência casual com a sonda inserida) . Será apreciado que uma vez que o programa de computador é instruído para fixar a sequência de sonda, esta sequência seja a mesma em cada caso. No entanto, os pares de iniciadores determinados para os oligonucleótidos casuais diferentes vão variar porque as regiões que flanqueiam a região de sonda comum são diferentes, sendo criadas ao acaso. 0 melhor par de iniciador óptimo é escolhido para utilização, mesmo se este par tiver um resultado de penalização mais alto do que o melhor par não óptimo.

Será evidente que a inserção da sequência de sonda num oligonucleótido casual cria uma sequência maior do que 100 bases. Isto pode ser remediado de duas maneiras. Primeiro, os 47 oligonucleótidos casuais gerados na primeira etapa podem ser escolhidos para serem de cerca de 70 bases em comprimento, em vez de 100 bases. Assim, a inserção da sequência de sonda vai permitir que o comprimento total da sequência seja menor do que cerca de 100 bases em comprimento, e a rotina "Encontrar Iniciadores/Sonda Agora" pode ser aplicada a esta sequência. Isto no entanto nem sempre dá resultados satisfatórios uma vez que a posição na qual a sonda é inserida vai afectar o resultado da rotina de encontrar o iniciador. Em alguns casos, nenhuns pares de iniciadores satisfatórios podem ser gerados, e o oligonucleótido particular casual terá de ser descartado e o procedimento acima mencionado tentado no oligonucleótido casual seguinte.

Alternativamente, os oligonucleótidos casuais gerados na primeira etapa podem ser mantidos em 100 bases em comprimento. A sequência de sonda é inserida nas sequências de oligonucleótido casuais, e logo que os pares de iniciadores satisfatórios tiverem sido estabelecidos, o oligonucleótido resultante pode ser editado no programa de computador "Primer Express" para remover quaisquer sequências redundantes. Por exemplo, pode ser verificado que há sequências estranhas presentes no oligonucleótido que está fora das sequências de iniciador. Por outras palavras, as sequências de iniciador podem não estar nas extremidades extremas da sequência de oligonucleótido. Neste caso, o oligonucleótido pode ser editado para remover estas sequências para reduzir o comprimento do oligonucleótido, e a rotina "Encontrar Iniciadores/Sonda Agora" pode ser empreendida mais uma vez na sequência editada.

Deve ser observado que a utilização do programa de computador "Primer Express" no desenho dos iniciadores e das sondas de oligonucleótido só deve ser visto como uma ajuda para maximizar as possibilidades do ensaio de nuclease de 5' funcionar bem. 0 único 48 critério absoluto a ser aplicado é se o ensaio de facto funciona na verdade. Assim, só uma sequência de sonda que executou bem num ensaio deve ser seleccionada como a sequência de sonda comum, e uma sequência de sonda não tentada nunca deve ser usada como a base para o desenho de marcador. Mesmo se a sonda funcionar bem com um determinado conjunto de iniciadores contra um alvo específico, ela nem sempre pode funcionar bem. Todos os desenhos de ADN devem ser tentados antes que o marcador seja libertado para objectivos comerciais.

Os marcadores de oligonucleótido, as sequências de iniciadores e de sondas são depois encomendados comercialmente a partir de aparelhos de síntese usuais. Com a finalidade de se minimizar o risco de contaminação, as diferentes casas de síntese devem ser usadas para a síntese dos marcadores e iniciadores de oligonucleótido. De outra maneira os iniciadores podem ser contaminados com vários marcadores, levando a controlos "negativos" que dão um sinal positivo e uma redução consequente na sensibilidade da detecção. De maneira ideal, uma terceira casa de síntese deve ser usada para a produção da sonda. As sondas marcadas devem ser fornecidas em tampão e devem ser protegidas da luz.

As condições de ensaio devem ser padronizadas por se utilizar uma única mistura de tampão misturado, com as únicas variantes a serem os iniciadores usados e a amostra do material a ser analisado. Uma vez que o ensaio de nuclease de 5' é baseado na reacção de cadeia de polimerase, as exigências para se estabelecerem ensaios de PCR bem sucedidos devem ser aderidas. Estas exigências foram estabelecidas em detalhe em várias publicações, e é considerado isto o especialista na técnica será consciente destas exigências. 0 ensaio de nuclease de 5' é conduzido usando os mesmos componentes 49 que o PCR normal excepto para a adição da sonda marcada. Os componentes de PCR são adquiridos da firma PE-Applied Biosystems como o "Conjunto de Reagente de Núcleo de PCR Taqman" o qual tem um número de registo N8080288. Os componentes do conjunto são como se segue: Tampão A 10X a uma concentração de armazenamento para tamponar o pH e fornecer a tinta fluorescente de referência, cloreto de magnésio a uma concentração de armazenamento de 25 mM para fornecer iões de Mg2 necessários para a actividade da polimerase do ADN, dATP a uma concentração de armazenamento de 10 mM (nucleótido de adenina necessário para a extensão do ADN), dUTP a uma concentração de armazenamento de 10 mM (nucleótido de uracilo necessário para a extensão do ADN) , dGTP a uma concentração de armazenamento de 10 mM (nucleótido de guanina necessário para a extensão do ADN), dCTP a uma concentração de armazenamento de 10 mM (nucleótido de citosina necessário para a extensão do ADN), e N glicosidase de uracilo (UNG) a 1 Unidade/microlitro para prevenir o transporte de ADN de um ensaio para o seguinte. A enzima de UNG é inactivada durante a reacção PCR mas vai hidrolisar qualquer ADN que contém o uracilo no começo do processo de PCR. Assim, a enzima previne qualquer ADN de ser transferido de uma reacção PCR para a seguinte. Os frascos de PCR não devem ser abertos para prevenir o transporte de ADN.

Os iniciadores de oligonucleótido e as sondas marcadas devem ser formulados como 5 micromolares de soluções de armazenamento num tampão conveniente o qual tem a composição seguinte: 1 mM de Tris-HC1 a pH 8,3, 5 mM de KC1 e 0,2 mM de cloreto de magnésio. As soluções de iniciadores e de sonda e são aliquotadas num número de frascos e armazenadas congeladas até serem necessárias. Nenhum frasco deve ser deixado a prosseguir por mais de 5 ciclos de gelo/degelo. 50 O "Conjunto de Reagente de Núcleo de PCR Taqman" e os 5 micromolares das soluções de armazenamento de sonda são depois misturadas em conjunto como se segue: 100 microlitros de Tampão A., 220 microlitros de cloreto de magnésio, 20 microlitros de dATP, 20 microlitros de dUTP, 20 microlitros de dGTP, 20 microlitros de dCTP, 5 microlitros de AmpliTaq Gold (polimerase de ADN de Taq ) , 10 microlitros de UNG, 25 microlitros de sonda marcada e 120 microlitros de água. Os 560 microlitros resultantes são suficientes para 40 ensaios se 14 microlitros forem usados por frasco de ensaio. A cada um dos frascos de ensaio é depois adicionado 4,5 microlitros de cada um dos iniciadores avançados e inversos, 5 microlitros de 5 micromolares das soluções de armazenamento descritas em cima e 2 microlitros da amostra que contém o marcador a ser analisado. A solução resultante tem as concentrações finais seguintes de cada componente: IX Tampão A, 5 mM de cloreto de magnésio, 0,2 mM de dATP, 0,2 mM de dUTP, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dCTP, 0,025 Unidades/microlitro de AmpliTaq Gold, 0,05 Unidades/microlitro de UNG, 0,125 micromolares de sonda marcada, 0,9 micromolares de iniciador avançado e 0,9 micromolares de iniciador reverso. A concentração final do marcado alvo é desconhecida.

Quer os pratos de 96 cavidades ópticas ou os tubos ópticos podem ser usados como recipientes de reacção. O primeiro tem o número de catálogo N8010560 e o último o número de catálogo N801Q933 disponível da firma PE Applied Biosystems. Ambos destes necessitam de coberturas ópticas (número de catálogo N8010935 da firma PE Applied Biosystems). O Detector de Sequência ABI Prism 7700, feito pela firma PE-Applied Biosystems, é usado para conduzir o PCR e detectar o sinal fluorescente e deve ser feito funcionar de acordo com as instruções do fabricante.

Lisboa, 11 de Abril de 2007

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES Método par detectar se um de uma pluralidade de materiais foi marcado por um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico em que a sequência do marcador de ácido nucleico é específica para esse material, compreendendo o método os passos de: (a) tomar de amostra uma porção de um material; e (b) detectar a presença do marcador de ácido nucleico na amostra, sendo o referido método caracterizado pelo facto da quantidade de marcador de ácido nucleico presente na amostra ser determinada para fornecer uma indicação da quantidade de marcador presente no material. Método de acordo com a reivindicação 1 que compreende adicionalmente antes do passo (a) o passo de: (i) Adicionar ou aplicar um marcador que compreende um marcador de ácido nucleico ao material. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, o qual compreende adicionalmente o passo de amplificar pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico, a quantidade de amplificação necessária para a quantidade de marcador de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado a ser determinado como uma indicação da quantidade de marcador de ácido nucleico presente na amostra. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o marcador de ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência de 2 identificação para o marcador, compreendendo o método adicionalmente os passos de: (c) amplificar pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico que inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação do marcador de ácido nucleico; e (d) determinar a quantidade de amplificação necessária para o marcador de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma indicação da quantidade de marcador presente na amostra.
2. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o marcador de ácido nucleico compreende a primeira e a segunda regiões da sequência de identificação e de flanquemento para o marcador; o passo (b) compreende adicionalmente a separação do marcador de ácido nucleico da amostra; o método compreende adicionalmente os passos de: (c) amplificar pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico a qual inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à referida primeira região do marcador de ácido nucleico, e (d) determinar a quantidade de amplificação necessária para o marcador de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma indicação de quantidade de marcador presente na amostra.
3. 6. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o marcador de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma primeira e uma segunda regiões da 3 sequência de identificação e de flanquearaento para o marcador, e em que o passo (b) compreende adicionalmente o passo de; (c) contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro iniciador de oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde a uma sequência contida na referida primeira região do marcador de ácido nucleico e um meio de sinal que produz uma sonda de oligonucleótido e que tem uma sequência que corresponde à referida sequência de identificação; (d) amplificar pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de cadeia de polimerase a qual inclui uma polimerase de ácido nucleico que tem actividade de exonuclease 5' a 3' na qual os fragmentos que carregam o meio de sinal são libertados a partir da sonda de oligonucleótido durante a amplificação de ácido nucleico; e (e) detectar os fragmentos libertados como uma indicação que a amplificação se realizou e por conseguinte que o material foi marcado.
4. 7. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o marcador de ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência de identificação para o marcador, compreendendo o método adicionalmente os passos de: (c) amplificar pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de amplificação de ácido nucleico a qual inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação do marcador de ácido nucleico; e (d) determinar a quantidade de amplificação necessária para o marcador de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma indicação de quantidade de marcador 4 presente na amostra e por conseguinte a quantidade de marcador no material.
5. 8. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o passo (i) compreende os passos de: (ii) fornecer um conjunto de marcadores de ácido nucleico, compreendendo cada marcador de ácido nucleico uma região genérica que tem uma sequência presente em todos os marcadores de ácido nucleico dentro do conjunto, sendo a região genérica flanqueada por regiões de codificação que têm sequências de identificação para o marcador; (iii) seleccionar um marcador de ácido nucleico particular a partir de dentro do conjunto; e (iv) adicionar ou aplicar um marcador que compreende o marcador de ácido nucleico seleccionado para o material.
6. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o marcador de ácido nucleico é de um conjunto conhecido de marcadores de ácido nucleico diferentes, compreendendo cada marcador de ácido nucleico no conjunto pelo menos uma sequência de identificação para o marcador, em cujo passo (b) compreende os passos de: (c) colocar uma pluralidade de meios de reacção de amplificação de ácido nucleico, contendo cada meio um oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à sequência de identificação de um marcador de ácido nucleico conhecido diferente no conjunto e sendo capaz de amplificar um marcador de ácido nucleico diferente do conjunto. (d) contactar o marcador de ácido nucleico da amostra com cada um do referido meio de reacção; e (e) detectar qual dos meios de reacção resulta na amplificação de marcador de ácido nucleico como uma indicação da identidade 5 do marcador de ácido nucleico particular usado para marcar o material.
7. 10. Método de acordo com uma das reivindicações 3, 4 ou 7, em que a reacção de amplificação de ácido nucleico é uma reacção de cadeia de polimerase (PCR).
8. 11. Método de acordo com a reivindicação 10 como dependente da reivindicação 3, no qual o marcador de ácido nucleico é contactado com um primeiro iniciador oligonucleótido que tem uma sequência que corresponde à primeira sequência contida no marcador de ácido nucleico e capaz de iniciar a amplificação do marcador de ácido nucleico.
9. 12. Método de acordo com a reivindicação, no qual a primeira sequência é uma sequência de identificação para o marcador de ácido nucleico.
10. 13. Método de acordo com a reivindicação 10 como dependente das reivindicações 4 ou 7 ou de acordo com a reivindicação 11 ou 12, no qual o marcador de ácido nucleico ê contactado com uma sonda de oligonucleótido que carrega um meio de sinal e que tem uma sequência que corresponde a uma segunda sequência contida no marcador de ácido nucleico, incluindo a reacção de PCR uma polimerase de ácido nucleico que tem actividade de exonuclease de 5' a 3' para causar a libertação de fragmentos que carregam o meio de sinal da sonda de oligonucleótido durante a amplificação de ácido nucleico.
11. 14. Método de acordo com a reivindicação 12, no qual o marcador de ácido nucleico compreende adicionalmente uma segunda sequência de identificação, sendo o marcador de ácido nucleico 6 contactado com um segundo iniciador de oligonucleótido capaz de iniciar a amplificação do marcador que tem uma sequência que corresponde à segunda sequência de identificação.
12. 15. Método de acordo com a reivindicação 13 como dependente da reivindicação 11, no qual a segunda sequência é uma sequência de identificação para o marcador de ácido nucleico.
13. 16. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual o marcador de ácido nucleico compreende adicionalmente uma segunda sequência de identificação para o marcador de ácido nucleico, flanqueando a primeira e a segunda sequências de identificação a referida segunda sequência.
14. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, no qual o marcador de ácido nucleico é contactado com um segundo iniciador de oligonucleótido capaz de iniciar a amplificação do marcador e que tem uma sequência que corresponde à referida segunda sequência de identificação.
15. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 7 ou 10 a 15 no qual a quantidade de ácido nucleico amplificado na reacção de amplificação é determinada por se medir o material de ácido nucleico hidrolisável a uma sonda de ácido nucleico, tendo a sonda de ácido nucleico uma sequência que corresponde a uma sequência contida no marcador de ácido nucleico, não sendo a referida sequência sequer sobreposta com uma sequência utilizada para iniciar a amplificação de ácido nucleico.
16. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5, 7, 13, 16 ou 17, no qual a reacção de amplificação de ácido nucleico é uma reacção de cadeia de polimerase, sendo o 7 primeiro oligonucleõtido capaz de iniciar a amplificaçao do marcador de ácido nucleico.
17. 20. Método de acordo com a reivindicação 2 em que o marcador de ácido nucleico compreende uma primeira e uma segunda regiões que flanqueiam uma sequência de identificação para o marcador; o passo (b) compreende adicionalmente a separação do marcador de ácido nucleico da amostra; o método compreende adicionalmente os passos de: (c) amplificar pelo menos uma porção do marcador de ácido nucleico por meio de uma reacção de cadeia de polimerase a qual inclui fazer contactar o marcador de ácido nucleico com um primeiro iniciador de nucleótido que tem uma sequência que corresponde à referida primeira região do marcador de ácido nucleico, sendo o primeiro iniciador de oligonucleótido capaz de iniciar a amplificação do marcador de ácido nucleico, e (d) determinar a quantidade de amplificação necessária para o marcador de ácido nucleico amplificado para alcançar um nível pré-determinado como uma indicação de quantidade de marcador presente na amostra, e em que o marcador de ácido nucleico é contactado com uma sonda de oligonucleótido que carrega um meio de sinal e que tem uma sequência que corresponde à referida sequência de identificação, incluindo a reacção de PCR uma polimerase de ácido nucleico que tem actividade de exonuclease de 5' para 3' para causar a libertação de fragmentos que carregam o meio de sinal da sonda de oligonucleótido durante a amplificação de ácido nucleico.
18. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 11, 12, 14 ou 19, no qual o primeiro iniciador de oligonucleótido carrega um meio de sinal, um sinal de um primeiro iniciador de 8 oligonucleótido incorporado num ácido nucleico amplificado sendo medido para fornecer uma indicação da quantidade de ácido nucleico amplificado na reacção.
19. 22. Método de acordo com a reivindicação 19 como dependente da reivindicação 4, no qual o primeiro iniciador de oligonucleótido carrega um meio de sinal, um sinal de um primeiro iniciador de oligonucleótido incorporado num ácido nucleico amplificado a ser detectado para fornecer uma indicação que a amplificação ocorreu.
20. 23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, no qual um sinal detectável de um primeiro iniciador de oligonucleótido incorporado num ácido nucleico amplificado está a um nível mais elevado do que um sinal detectável do primeiro iniciador de oligonucleótido quando não é assim incorporado.
21. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, no qual o primeiro iniciador de oligonucleótido carrega um meio de extinção para atenuar um sinal do meio de sinal quando o primeiro iniciador de oligonucleótido não está incorporado.
22. 25. Método de acordo com a reivindicação 23, no qual o primeiro iniciador de oligonucleótido carrega um meio de extinção para atenuar um sinal do meio de sinal que começa no primeiro iniciador de oligonucleótido.
23. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 19 ou 20, no qual o marcador de ácido nucleico é contactado com um segundo iniciador de oligonucleótido capaz de iniciar a amplificação do marcador e que tem uma sequência que corresponde a uma sequência contida na segunda região. 9
24. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 15 a 17 ou 20 ou com a reivindicação 26 como dependente da reivindicação 20, no qual o sinal do meio de sinal que começa em fragmentos libertados é medido para fornecer uma indicação da quantidade de ácido nucleico amplificado na reacção.
25. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 15 a 17, 26 ou 27, no qual um sinal detectãvel de um fragmento libertado está a um nível mais elevado do que um sinal detectável de uma sonda de oligonucleótido.
26. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, no qual a sonda de oligonucleótido carrega meios de extinção para atenuar um sinal de um meio de sinal que começa na sonda de oligonucleótido.
27. 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 13, 15 a 17, 20 a 25 ou 26 a 29, no qual o meio de sinal é um marcador fluorescente.
28. 31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 28 ou com a reivindicação 30 como dependente da reivindicação 29, no qual o meio de extinção atenua o sinal do meio de sinal através de transferência de energia de ressonância de Fõrster através do espaço.
29. 32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o marcador compreende adicionalmente um meio indicador, sendo a presença do referido meio indicador detectãvel numa porção de amostra do material como uma indicação de que o marcador de ácido nucleico está presente na 10 referida porção de amostra.
30. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o passo de amostragem de uma porção do material marcado compreende adicionalmente o passo de separação do marcador de ácido nucleico da amostra.
31. 34. Método para marcação de um material com um marcador de ácido nucleico, compreendendo o método os passos de: (a) fornecer um conjunto de marcadores de ácido nucleico, compreendendo cada marcador de ácido nucleico uma região genérica que tem uma sequência presente em todos os marcadores de ácido nucleico dentro do conjunto, sendo a região genérica flanqueada por regiões de codificação que têm sequências de identificação para o marcador; (b) seleccionar um marcador de ácido nucleico particular de dentro do conjunto; e (c) adicionar ou aplicar um marcador que compreende o marcador de ácido nucleico seleccionado ao material.
32. 35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o marcador de ácido nucleico consiste de ADN.
33. 36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o marcador de ácido nucleico é um oligonucleótido de ADN de cordão singular. Lisboa, 11 de Abril de 2007