JP2016123338A - マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 - Google Patents
マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016123338A JP2016123338A JP2014266607A JP2014266607A JP2016123338A JP 2016123338 A JP2016123338 A JP 2016123338A JP 2014266607 A JP2014266607 A JP 2014266607A JP 2014266607 A JP2014266607 A JP 2014266607A JP 2016123338 A JP2016123338 A JP 2016123338A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microrna
- methylation
- ribonucleotide
- nucleic acid
- mass
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims description 28
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 14
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 20
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NMPVEAUIHMEAQP-UHFFFAOYSA-N 2-Bromoacetaldehyde Chemical compound BrCC=O NMPVEAUIHMEAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002585 base Substances 0.000 description 10
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-acetaldehyde Chemical compound ClCC=O QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical class NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N diammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical class CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- MXLFEAGTBOBNHM-UHFFFAOYSA-N CCO.COS(=O)(=O)OC Chemical compound CCO.COS(=O)(=O)OC MXLFEAGTBOBNHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000342 Monte Carlo simulation Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 230000006093 RNA methylation Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】
マイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするのに適した計測方法を提供する。
【解決手段】
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られた修飾マイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。
【選択図】なし
マイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするのに適した計測方法を提供する。
【解決手段】
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られた修飾マイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法に関する。
リボ核酸（ＲＮＡ）の生体内におけるメチル化修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるものと比較してもより多彩であり、疾患との深い関連性等が指摘されている。
特に、発生を含む生物学、並びに慢性炎症、生活習慣病及び癌を含む疾患における重要性から、２３塩基対にサイズピークを有するマイクロＲＮＡが注目されている。所望のマイクロＲＮＡの検出には、定量ＲＴ−ＰＣＲ等が用いられる（非特許文献１）。
ＲＮＡのメチル化修飾を計測する方法として、核酸シークエンス法や液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）等を用いることも提案されている。しかし、従来の方法は、生体内におけるマイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするためには適しておらず、このため、マイクロＲＮＡのメチル化に関する生物医学的な意義の解明がほとんど進んでいない。
Ｙｏｓｈｉｏｋａ Ｙ．ら他１７名、「Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ」、Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１４年、７；５：３５９１
本発明者らは、マイクロＲＮＡのメチル化修飾を網羅的にかつ高精度にプロファイリングするのに適した計測方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＲＮＡのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤を利用し、かつ質量分析により断片化測定を行うことにより、上記課題を解決できることを見出し、さらに試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。
項２．
前記工程（２）における断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行う、項１に記載の方法。
項３．
リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したプレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記スポットを、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得る、項３に記載の方法。
項５．
１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを有する前記プレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項３又は４に記載の方法。
項６．
前記工程（２）における質量分析により、リボヌクレオチドの量及び核酸配列情報も同時に計測する、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．
項５に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップ。
項１．
マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。
項２．
前記工程（２）における断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行う、項１に記載の方法。
項３．
リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したプレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記スポットを、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得る、項３に記載の方法。
項５．
１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを有する前記プレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、項３又は４に記載の方法。
項６．
前記工程（２）における質量分析により、リボヌクレオチドの量及び核酸配列情報も同時に計測する、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．
項５に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップ。
本発明によれば、マイクロＲＮＡのメチル化修飾を簡便にかつ高精度に計測できる。
１． メチル化修飾部位を計測する方法
本発明の、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法は、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む。
本発明の、マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法は、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む。
１．１ 工程（１）
計測対象とするマイクロＲＮＡは特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。マイクロＲＮＡは、特に限定されないが、典型的には、塩基数２０〜２５である。
計測対象とするマイクロＲＮＡは特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。マイクロＲＮＡは、特に限定されないが、典型的には、塩基数２０〜２５である。
計測対象とするリボヌクレオチドの例として、ヒトマイクロＲＮＡ等が挙げられる。ヒトマイクロＲＮＡは現在、２５７８種からなるとされている。
一種のリボヌクレオチドのみを計測対象としてもよいし、複数種のリボヌクレオチドを計測対象としてもよい。例えば、ヒトから採取した検体に含まれるヒトマイクロＲＮＡ総体をそのまま計測対象とすることもできる。この場合、必要に応じて、後述する工程（２）における質量分析により、個々のヒトマイクロＲＮＡについて、発現量及び核酸配列に関する情報も同時に取得できる。
また、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を測定対象とすることもできる。本発明によれば、ＲＮＡ及びＤＮＡのそれぞれの鎖の識別が可能となる。
リボヌクレオチドのメチル化候補部位は、既に明らかにされており、具体的には、表１に示す通りである。
それぞれの部位に対して使用できる修飾剤の例も表１に示す。ハロゲン化アセトアルデヒドは、好ましくは、ブロモアセトアルデヒド又はクロロアセトアルデヒドであり、より好ましくはブロモアセトアルデヒドである。
本発明において、修飾剤は、特に表１に記載のものに限定されず、同様の作用を有するものを適宜使用することができる。後述する工程（３）において、修飾剤の作用による質量数の変化の有無により計測を行うことが重要である。したがって、本発明で用いる修飾剤は、個々のメチル化候補部位に選択的に作用するものであり、かつ後述の工程（２）で検出可能な質量変化を生じうるものであればよい。
修飾剤を作用させる条件は、修飾剤毎により異なり、適宜選択することができる。
必要に応じて、複数種の修飾剤を同時に作用させることもできる。
１．２ 工程（２）
質量分析による核酸の断片化測定の方法は既に知られており、特に限定されないが、例えば、ブルカーダルトニクス社製ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ｔｏｆ／ｔｏｆ等に代表されるような、ＭＡＬＤＩ型質量分析計を利用できる。
質量分析による核酸の断片化測定の方法は既に知られており、特に限定されないが、例えば、ブルカーダルトニクス社製ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ｔｏｆ／ｔｏｆ等に代表されるような、ＭＡＬＤＩ型質量分析計を利用できる。
この場合、特に限定されないが、断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行うとＤＮＡは分解を受けずＲＮＡのみが断片化を受ける上に、塩の除去が不要なために、ターゲットプレート上での操作が可能となり有利である。この場合、加水分解は主として５’末端側から進行する。アンモニアによる加水分解の条件としては、特に限定されないが、例えば、０．１ Ｎ アンモニア水６０℃、３０分間等が挙げられる。
ターゲットプレート上の断片化処理を行った検体、又は未処理の検体について、ＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）を塗布した後に、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行う。この場合、特に限定されないが、例えば、３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）、ＣＨＣＡ（α-シアノ-4-ヒドロキシけい皮酸）等が利用出来る。
特に限定されないが、リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したターゲットプレート上において、工程（１）及び（２）を行うと、一度に複数種のリボヌクレオチドに対する計測結果を得ることができ、有利である。
特に限定されないが、そのようなスポットとしては、例えば、直径１０μｍ〜１００μｍのもの等が挙げられる。そのスポット内に、特に限定されないが、例えば、１０７以上の同一種のリボヌクレオチドを配置してもよい。
そのようなスポットは、特に限定されないが、例えば、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得ることができる。
特に限定されないが、アビジンからなる基盤をスポット内に配置し、捕捉用核酸をビオチン化したものをかかる基盤に固定化することにより、上記スポットを作成することができる。
特に限定されないが、１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを配置することができる。一例として、２５７８種のヒトマイクロＲＮＡをそれぞれ選択的に捕捉しうる捕捉核酸が種類毎に固定化されている２５７８種のスポットを、１ミリ四方内に配置することができる。
異なるスポット同士が互いに近接している場合には、質量分析による断片化測定の際に近接するスポットにそれぞれ由来するシグナル同士が干渉し合い、スポット毎の計測値に影響が生じ得る。したがって、必要に応じて、所定領域内における各スポットの配置に際しては、シグナル間の干渉が生じても影響が最小限で済むように配置順に配慮することが重要となる。配置順の決定においては、必要に応じて数理的統計的手法を利用することができる。
特に限定されないが、各スポットの配置順の決定は、例えば以下のようにして行うことができる。
（１）全マイクロＲＮＡの分類
この段階においては、全マイクロＲＮＡを、それぞれ特定の部分配列を共有するもの同士からなる集団に分類する。この際、同じ集団に属するマイクロＲＮＡ同士の間に、観測機器により判別可能な質量差があることが必要となる。この条件を満たす部分配列が、捕捉核酸の候補となる。
この段階においては、全マイクロＲＮＡを、それぞれ特定の部分配列を共有するもの同士からなる集団に分類する。この際、同じ集団に属するマイクロＲＮＡ同士の間に、観測機器により判別可能な質量差があることが必要となる。この条件を満たす部分配列が、捕捉核酸の候補となる。
（２）捕捉核酸の最適化
上記（１）により得られた捕捉核酸の候補の中には、捕捉しようとするマイクロＲＮＡが互いに重複しているものがある場合がある。この場合、全マイクロＲＮＡを漏れなく捕捉しつつ、捕捉核酸の総数が最小となるように捕捉核酸の集約を行う。
上記（１）により得られた捕捉核酸の候補の中には、捕捉しようとするマイクロＲＮＡが互いに重複しているものがある場合がある。この場合、全マイクロＲＮＡを漏れなく捕捉しつつ、捕捉核酸の総数が最小となるように捕捉核酸の集約を行う。
（３）捕捉核酸の配置最適化
上記（２）により集約された捕捉核酸を、隣接する捕捉核酸により捕捉されるマイクロＲＮＡ同士の質量差が最大となるように、配置順を最適化する。この際に、必要に応じてモンテカルロ法等の数理的統計的手法を利用することができる。
上記（２）により集約された捕捉核酸を、隣接する捕捉核酸により捕捉されるマイクロＲＮＡ同士の質量差が最大となるように、配置順を最適化する。この際に、必要に応じてモンテカルロ法等の数理的統計的手法を利用することができる。
１．３ 工程（３）
工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する。このとき、修飾剤がその標的箇所を修飾できなかったことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されているといえる。
工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する。このとき、修飾剤がその標的箇所を修飾できなかったことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されているといえる。
反対に、上記において差があるときは、修飾剤がその標的箇所を修飾したことを意味している。すなわち、その標的箇所は、メチル化されていないといえる。
２． 計測用チップ
本発明の計測用チップは、上記に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップである。
本発明の計測用チップは、上記に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップである。
特に限定されないが、そのようなスポットとしては、例えば、直径１０μｍ〜１００μｍのもの等が挙げられる。そのスポット内に、特に限定されないが、例えば、１０７以上の同一種のリボヌクレオチドが配置されていてもよい。
そのようなスポットは、特に限定されないが、例えば、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得ることができる。
特に限定されないが、アビジンからなる基盤をスポット内に配置し、捕捉用核酸をビオチン化したものをかかる基盤に固定化することにより、上記スポットを作成することができる。
特に限定されないが、１ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを配置することができる。一例として、２５７８種のヒトマイクロＲＮＡをそれぞれ選択的に捕捉しうる捕捉核酸が種類毎に固定化されている２５７８種のスポットを、１ミリ四方内に配置することができる。
スポットの配置順については、既に説明した通りである。
チップの基材としては、特に限定されないが、例えば、導電性を付与したガラス及びプラスチック（ポリエチレン）等が挙げられる。
特に限定されないが、高速解析を行うため、上記のスポットを有する多数のウェルを備える計測用チップとすることができる。特に限定されないが、３８４ウェルプレート等が例示できる。
この計測用チップは、既に説明した、メチル化修飾部位を計測する方法のために使用できる。また、メチル化修飾の有無とは無関係に、質量分析により、リボヌクレオチドの量及び／又は核酸配列情報を計測するために使用することもできる。
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
以下の手順においては、質量分析用試薬（マトリクスなど）、化学合成用試薬（クロロアセトアルデヒドなど）、分子生物学用（塩基や合成核酸など）、特級試薬（アンモニア水など）を使用した。
測定１
メチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）を分け取り、ＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解し吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。この同じ位置に先のマイクロＲＮＡ水溶液１μＬを重層して乾燥した。完全な乾燥を確認した後、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、該プリカーサーイオンに対して、ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ（インソース分解、ＩＳＤ）を用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認した。図に示さないが濃度を増減させることである程度の定量性が確保されることもあわせて確認した（図１）。
メチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）を分け取り、ＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解し吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。この同じ位置に先のマイクロＲＮＡ水溶液１μＬを重層して乾燥した。完全な乾燥を確認した後、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、該プリカーサーイオンに対して、ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ（インソース分解、ＩＳＤ）を用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認した。図に示さないが濃度を増減させることである程度の定量性が確保されることもあわせて確認した（図１）。
測定２
先述のメチル化塩基を含む合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）水溶液に、０．１ Ｎ アンモニア水を等量加え、６０℃、３０分反応させた後、遠心乾燥によりアンモニアを除去した後、先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、アルカリ加水分解が５’末端側から進行すること、並びにアルカリ加水分解が内部塩基配列の確認にきわめて有効であることを確認した（図２）。
先述のメチル化塩基を含む合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）水溶液に、０．１ Ｎ アンモニア水を等量加え、６０℃、３０分反応させた後、遠心乾燥によりアンモニアを除去した後、先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、アルカリ加水分解が５’末端側から進行すること、並びにアルカリ加水分解が内部塩基配列の確認にきわめて有効であることを確認した（図２）。
測定３
合成したマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト配列／１本鎖）とその相補配列を有する合成ＤＮＡ（ヒト配列の３６９−３ｐの相補鎖／１本鎖）を同じモル数ずつ混合し、いったん加熱させた後に、徐冷することでアニールさせ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を形成し、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。このＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれについてプリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、ＩＳＤによりＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれの鎖の識別および配列決定が可能であることを確認した（図３）。
合成したマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト配列／１本鎖）とその相補配列を有する合成ＤＮＡ（ヒト配列の３６９−３ｐの相補鎖／１本鎖）を同じモル数ずつ混合し、いったん加熱させた後に、徐冷することでアニールさせ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を形成し、濃度を１ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。このＲＮＡ−ＤＮＡキメラ２本鎖を先述のとおりマトリクスとともにターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれについてプリカーサーイオンの観察により全体の質量を確認するとともに、ＩＳＤによりＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれの鎖の識別および配列決定が可能であることを確認した（図３）。
測定４
ヒト培養細胞を開始材料として抽出・精製して得られた小分子ＲＮＡ画分をＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解して、吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１００ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。ターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察によりマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト）に相当する質量数の親イオンを見いだし、該プリカーサーイオンに対してＩＳＤを用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認し、マイクロＲＮＡ３６９−３ｐであることを確認した（図５）。
ヒト培養細胞を開始材料として抽出・精製して得られた小分子ＲＮＡ画分をＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ超純水に溶解して、吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１００ｐｍｏｌｅ／μＬに調整した。あらかじめＭＡＬＤＩ用マトリクス（イオン化助剤）として、１０ｍｇ／ｍＬ ３−ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液１μＬをターゲットプレートに塗布し乾燥させた。ターゲットプレート上に塗布・乾燥させ、ＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、プリカーサーイオンの観察によりマイクロＲＮＡ３６９−３ｐ（ヒト）に相当する質量数の親イオンを見いだし、該プリカーサーイオンに対してＩＳＤを用いた測定を実施することによりメチル化塩基を含めた内部配列を確認し、マイクロＲＮＡ３６９−３ｐであることを確認した（図５）。
硫酸ジメチル処理
図５に模式的に示したとおり、アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニンについて、硫酸ジメチル処理によるメチル化処理においては、アデニン、Ｎ６−メチルアデニンの２種の分子では１位の窒素メチル化を受けることが期待されるが、すでにメチル化を受けている１−メチルアデニンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数は変化しない。
図５に模式的に示したとおり、アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニンについて、硫酸ジメチル処理によるメチル化処理においては、アデニン、Ｎ６−メチルアデニンの２種の分子では１位の窒素メチル化を受けることが期待されるが、すでにメチル化を受けている１−メチルアデニンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数は変化しない。
以下に示す手順に従って反応を行い、ＨＰＬＣによる溶出位置の変化およびＬＣ−ＭＳＭＳによる溶出位置および質量数の変化は期待通りのものであった。アデニン、１−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニンを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、それぞれ個別に溶解し、用時調整した１５％硫酸ジメチルのエタノール溶液を終濃度０．５％添加し、２５℃で１分処理を行った。終濃度２％となるようβメルカプトエタノールを添加し、十分に攪拌することで、反応を停止させた後、ＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳＭＳによる測定に供した。また、上述のメチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）についても同様に硫酸ジメチル処理を行い、先述の手段に従ってＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、誘導体化の有効性を確認した。
クロロアセトアルデヒド処理
図６に模式的に示したとおり、シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンについて、クロロアセトアルデヒド処理によるメチル化処理においては、シトシン、５−メチルシトシンの２種の分子では３位窒素原子とＮ４位窒素原子による環状化が期待されるが、３位窒素原子がメチル化を受けている３−メチルシトシンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数の変化は生じない。
図６に模式的に示したとおり、シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンについて、クロロアセトアルデヒド処理によるメチル化処理においては、シトシン、５−メチルシトシンの２種の分子では３位窒素原子とＮ４位窒素原子による環状化が期待されるが、３位窒素原子がメチル化を受けている３−メチルシトシンについてはさらなるメチル化は生じず、質量数の変化は生じない。
以下に示す手順に従って反応を行い、ＨＰＬＣによる溶出位置の変化およびＬＣ−ＭＳＭＳによる溶出位置および質量数の変化は期待通りのものであった。シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５）に、それぞれ個別に溶解し、終濃度１％となるようにブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行った。過剰のブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドをジエチルエーテル抽出により除去した後、水層を乾燥させて得られた残渣をＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳＭＳによる測定に供した。また、上述のメチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００−ｃ−５ｐ（ヒト配列／１本鎖）についても同様にブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行い、先述の手段に従ってＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行い、誘導体化の有効性を確認した。
Claims (7)
- マイクロＲＮＡにおけるメチル化修飾部位を計測する方法であって、
（１）リボヌクレオチドのメチル化候補部位の一つに選択的に作用しうる修飾剤をマイクロＲＮＡに作用させる工程；
（２）工程（１）で得られたマイクロＲＮＡに対して、質量分析により断片化測定を行う工程；及び
（３）工程（２）で得られた、それぞれのリボヌクレオチドについての質量数の検出値を、未修飾の対応するリボヌクレオチドの質量数と比較し、差がないときに前記メチル化候補部位がメチル化されていると判定する工程
を含む方法。 - 前記工程（２）における断片化を、アンモニアによるアルカリ加水分解により行う、請求項１に記載の方法。
- リボヌクレオチドを種類毎にスポット状に配置したプレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記スポットを、前記プレート上に固定された捕捉用核酸に対して相補的な核酸配列を含むリボヌクレオチドを結合させることにより得る、請求項３に記載の方法。
- １ミリ四方に、１０００〜３０００種の前記スポットを有する前記プレート上において、前記工程（１）及び（２）を行う、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記工程（２）における質量分析により、リボヌクレオチドの量及び核酸配列情報も同時に計測する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項５に記載のスポットを形成するための捕捉用核酸が表面に固定化されたチップ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014266607A JP6694635B2 (ja) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014266607A JP6694635B2 (ja) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020071963A Division JP2020150946A (ja) | 2020-04-13 | 2020-04-13 | マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016123338A true JP2016123338A (ja) | 2016-07-11 |
| JP6694635B2 JP6694635B2 (ja) | 2020-05-20 |
Family
ID=56356606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014266607A Active JP6694635B2 (ja) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6694635B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016197881A (ja) * | 2010-08-17 | 2016-11-24 | エム アンド ケー ホールディングス インコーポレイテッド | 映像符号化装置 |
| WO2019163900A1 (ja) * | 2018-02-22 | 2019-08-29 | 国立大学法人大阪大学 | Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004024203A (ja) * | 2002-06-28 | 2004-01-29 | Canon Inc | 飛行時間型二次イオン質量分析法によるｒｎａの分析方法 |
| JP2005024532A (ja) * | 2003-06-13 | 2005-01-27 | Institute Of Physical & Chemical Research | 生体分子マイクロアレイ用基板、生体分子マイクロアレイ、相互作用促進用装置および方法、ならびに、相互作用の検出方法 |
| JP2006145400A (ja) * | 2004-11-19 | 2006-06-08 | Institute Of Physical & Chemical Research | 生体分子を相互作用させる方法、および、生体分子を移動させる方法 |
| JP2006515987A (ja) * | 2002-11-27 | 2006-06-15 | セクエノム，インコーポレイティド | 配列変化検出及び発見用の断片化をベースとする方法及びシステム |
| JP2006258670A (ja) * | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Nissha Printing Co Ltd | Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法 |
| JP2007521000A (ja) * | 2003-07-02 | 2007-08-02 | コンソルシウム・ナシオナル・ドゥ・ルシェルシュ・アン・ジェノミク（セーエヌエールジェ） | Ｄｎａ中の突然変異検出方法 |
| JP2008512129A (ja) * | 2004-09-10 | 2008-04-24 | セクエノム，インコーポレイティド | 核酸の広範囲配列分析法 |
| WO2008109945A1 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Human Genetic Signatures Pty Ltd | Analysis of ribonucleic acid |
| WO2013153911A1 (ja) * | 2012-04-12 | 2013-10-17 | 国立大学法人東京大学 | 核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法 |
| JP2014128249A (ja) * | 2012-12-28 | 2014-07-10 | Hokkaido Univ | 神経変性疾患の検査と治療に対するｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子の利用 |
-
2014
- 2014-12-26 JP JP2014266607A patent/JP6694635B2/ja active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004024203A (ja) * | 2002-06-28 | 2004-01-29 | Canon Inc | 飛行時間型二次イオン質量分析法によるｒｎａの分析方法 |
| JP2006515987A (ja) * | 2002-11-27 | 2006-06-15 | セクエノム，インコーポレイティド | 配列変化検出及び発見用の断片化をベースとする方法及びシステム |
| JP2005024532A (ja) * | 2003-06-13 | 2005-01-27 | Institute Of Physical & Chemical Research | 生体分子マイクロアレイ用基板、生体分子マイクロアレイ、相互作用促進用装置および方法、ならびに、相互作用の検出方法 |
| JP2007521000A (ja) * | 2003-07-02 | 2007-08-02 | コンソルシウム・ナシオナル・ドゥ・ルシェルシュ・アン・ジェノミク（セーエヌエールジェ） | Ｄｎａ中の突然変異検出方法 |
| JP2008512129A (ja) * | 2004-09-10 | 2008-04-24 | セクエノム，インコーポレイティド | 核酸の広範囲配列分析法 |
| JP2006145400A (ja) * | 2004-11-19 | 2006-06-08 | Institute Of Physical & Chemical Research | 生体分子を相互作用させる方法、および、生体分子を移動させる方法 |
| JP2006258670A (ja) * | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Nissha Printing Co Ltd | Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法 |
| WO2008109945A1 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Human Genetic Signatures Pty Ltd | Analysis of ribonucleic acid |
| WO2013153911A1 (ja) * | 2012-04-12 | 2013-10-17 | 国立大学法人東京大学 | 核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法 |
| JP2014128249A (ja) * | 2012-12-28 | 2014-07-10 | Hokkaido Univ | 神経変性疾患の検査と治療に対するｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子の利用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOCHEMISTRY, 1969, 8(8), PP.3260-3266, JPN6018046655, ISSN: 0004101036 * |
| IARC SCI. PUBL., 1986, 70, PP.57-73, JPN6018046656, ISSN: 0004101035 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016197881A (ja) * | 2010-08-17 | 2016-11-24 | エム アンド ケー ホールディングス インコーポレイテッド | 映像符号化装置 |
| JP2016213854A (ja) * | 2010-08-17 | 2016-12-15 | エム アンド ケー ホールディングス インコーポレイテッド | イントラ予測モード符号化方法 |
| WO2019163900A1 (ja) * | 2018-02-22 | 2019-08-29 | 国立大学法人大阪大学 | Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法 |
| CN112004942A (zh) * | 2018-02-22 | 2020-11-27 | 国立大学法人大阪大学 | 利用了rna修饰的分析、诊断方法 |
| JPWO2019163900A1 (ja) * | 2018-02-22 | 2021-01-07 | 国立大学法人大阪大学 | Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法 |
| EP3763826A4 (en) * | 2018-02-22 | 2021-06-30 | Osaka University | ANALYSIS / DIAGNOSTIC METHODS USING RNA MODIFICATION |
| JP7125782B2 (ja) | 2018-02-22 | 2022-08-25 | 国立大学法人大阪大学 | Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6694635B2 (ja) | 2020-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7125782B2 (ja) | Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法 | |
| Chen et al. | Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq | |
| JP7327826B2 (ja) | 核酸の検知 | |
| Chen et al. | Analytical methods for deciphering RNA modifications | |
| CN116157533A (zh) | 使用杂交方法捕获遗传靶标 | |
| Chen et al. | Single cell omics: from assay design to biomedical application | |
| CN111344409A (zh) | 用于检测癌症的非编码rna | |
| Yap et al. | Molecular diagnostics in oral cancer and oral potentially malignant disorders—A clinician’s guide | |
| Tretyakova et al. | Locating nucleobase lesions within DNA sequences by MALDI-TOF mass spectral analysis of exonuclease ladders | |
| Liu et al. | Analysis of genome-wide in cell free DNA methylation: progress and prospect | |
| Kim et al. | Aptamers generated by Cell SELEX for biomarker discovery | |
| Adams et al. | Global mutational profiling of formalin-fixed human colon cancers from a pathology archive | |
| JP6694635B2 (ja) | マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 | |
| WO2012038831A2 (en) | A method for detecting, quantifying and mapping damage and/or repair of dna strands | |
| US11866779B2 (en) | Jettison-MS for nucleic acid species | |
| JP2020150946A (ja) | マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法 | |
| US11339441B2 (en) | Profiling chemically modified DNA/RNA units for disease and cancer diagnosis | |
| WO2018011166A3 (en) | Methods for quantifying the population of myeloid dendritic cells in a tissue sample | |
| Widłak | High-throughput technologies in molecular biology | |
| Wambua et al. | Creating mass signatures for the detection of microRNA | |
| Roboz et al. | Mass spectrometry in leukemia research and treatment | |
| Gao et al. | Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry | |
| Wu et al. | Deciphering global signal features of high-throughput array data from cancers | |
| Herbert et al. | Analysis of RNA and Its Modifications | |
| WO2020218489A1 (ja) | トンネル電流を使用したマイクロｒｎａ解析 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171226 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180320 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180625 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20181031 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181204 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190131 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20190401 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190402 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20190403 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190401 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190620 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190823 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191001 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200313 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200413 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6694635 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |