CN118207194A - 人工改造胞嘧啶脱氨酶及dna中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工改造胞嘧啶脱氨酶及DNA中5‑甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法，涉及生物技术领域。本发明利用双加氧酶nTET蛋白，特异性地将5‑甲基胞嘧啶氧化为5moC(包括5hmC、5fC、5caC)，使得在人工改造胞嘧啶脱氨酶A3Am蛋白处理后，不同序列特征的5moC能够拮抗脱氨基，在随后的聚合酶链式反应扩增中扩增为胞嘧啶，而不同序列特征的胞嘧啶能够被A3Am完全脱氨基，在随后的聚合酶链式反应中扩增为胸腺嘧啶。因此，在最终的测序中只有5‑甲基胞嘧啶被读作胞嘧啶。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，不涉及亚硫酸氢盐处理，可直接获得DNA中5‑甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。

Description

人工改造胞嘧啶脱氨酶及DNA中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率 测序方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种人工改造胞嘧啶脱氨酶及DNA中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法。

背景技术

5-甲基胞嘧啶(5mC)是哺乳动物中最普遍且最重要的表观遗传学修饰。5mC在调控基因表达方面发挥着重要的作用。局部或整体水平下DNA甲基化图谱的改变与多种生物进程和病理过程有关，如胚胎发育、X染色体失活及癌症等疾病的发生。在哺乳动物基因组中，DNA甲基转移酶(DNMTs)利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将甲基转移到未修饰胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5mC。其含量约占胞嘧啶的3％且几乎所有的5mC都存在于CpG二核苷酸中。此外，5mC可以被TET蛋白逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。

目前，5mC的检测分为两类，包括5mC的整体含量检测和测序分析，其中，已有的检测DNA中5mC整体含量的方法主要包括液相色谱/质谱法(LC/MS)、薄层色谱法(TLC)和电化学检测法。这些方法一般都需要对DNA进行水解处理，虽然能够检测5mC整体的含量，但是不能提供5mC在DNA序列中的位置信息。在5mC的测序方法中，基于免疫沉淀的测序方法已被用于DNA中5mC的定位分析，如甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)和甲基CpG结合域测序(MBD-seq)等。然而，这些基于免疫亲和富集的方法无法以单碱基分辨率检测5mC，且更偏向于富集高甲基化区域。

亚硫酸氢盐测序方法(BS-seq)是一种广泛使用的DNA中5mC单碱基分辨率测序方法。该方法是通过利用亚硫酸氢盐对未修饰的胞嘧啶(C)进行脱氨基而5mC及5hmC不能脱氨基的原理对DNA进行处理；同样的，在处理过程中，5fC和5caC也会被亚硫酸氢盐脱氨基。在后续的测序过程中C被读作胸腺嘧啶(T)，这种由C到T的转化可以直接获得5mC和5hmC的定位信息。但是，基于亚硫酸氢盐的策略需要苛刻的化学脱氨条件，从而导致高达99.9％的DNA被降解。为了解决该局限性，不断研发出利用生物酶介导的测序方法。例如：1)生物酶结合化学试剂的测序方法(TAPS)，该方法需要β-糖基转移酶将5hmC转化成5gmC，经加哺乳动物TET蛋白处理后，5mC可以转变成5caC，5caC会在化学试剂吡啶硼烷的作用下生成二氢尿嘧啶(DHU)在测序过程中读作T，而C和被保护的5hmC在测序过程中均被读作C。2)酶法测序方法(EM-seq)，首先，采用TET蛋白和β-糖基转移酶将5mC和5hmC转化为脱氨酶APOBEC3A(人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A，A3A)不能脱氨基的产物，然后采用A3A将未修饰的C脱氨转化为尿嘧啶(U)，在后续的测序中，只有C读作T，而5mC和5hmC保持C。3)DNA甲基化直接测序法(DM-seq)，首先，采用甲基化转移酶和β-糖基转移酶将C和5hmC转化为脱氨酶A3A不能脱氨基的产物，然后采用A3A将5mC脱氨转化为胸腺嘧啶(T)，在后续的测序中，只有5mC读作T，而C保持为原始的C。目前测定DNA甲基化的酶学方法基本都需要多种生物酶的共同辅助，使得流程比较复杂，操作比较繁琐。此外，TAPS测序法和EM-seq测序法均涉及TET蛋白氧化5mC为5caC，然而，由于TET蛋白不能完全将5mC氧化为5caC，因此会导致假阴性结果的产生。

有鉴于此，有必要设计一种人工改造胞嘧啶脱氨酶及DNA中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶A3Am，该胞嘧啶脱氨酶对DNA中的C具有高效的脱氨基效率，而对5moC的脱氨基效率很低。本发明的目的还在于提供一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶A3Am辅助的DNA中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法，即一种能应用于DNA修饰测序领域中，具有高灵敏度、高选择性且操作简便的单碱基分辨率的5mC定位测序方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的A3Am蛋白。

所述的胞嘧啶脱氨酶在制备用于对胞嘧啶脱氨基的产品中的应用，所述胞嘧啶为C和/或5mC。

所述的胞嘧啶脱氨酶在制备用于检测5mC的产品中的应用。

一种人工改造胞嘧啶脱氨酶辅助的DNA中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法，包括如下步骤：

S1、获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1的nTET蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的胞嘧啶脱氨酶A3Am；

S2、先用nTET对待检DNA进行氧化处理，获得氧化后的DNA；随后将氧化后的DNA进行变性处理获得单链DNA，再用人工改造的胞嘧啶脱氨酶对单链DNA进行脱氨基处理，得到脱氨基的DNA片段；

S3、对脱氨基的DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；

S4、对扩增产物进行测序，待检DNA中的C位点在测序中被读为T，5mC位点在测序中被读为C。

进一步的，步骤S2中，DNA的氧化反应体系由物质的量浓度比例为(45-55):(70-80):(0.5-1.5):(1-3):(95-105)的pH 6.0-7.0BisTris-HCl、(NH4)2FeSO4、α-酮戊二酸、抗坏血酸、NaCl组成；nTET双加氧酶的用量需要根据实验过程中表达的蛋白的具体活性进行调整，以保证nTET双加氧酶的用量可以使反应体系中DNA上的5-甲基胞嘧啶充分氧化即可；氧化反应温度为35-40℃，反应时间为1.5-2.5h。

进一步的，步骤S2中，变性处理操作为：在90-95℃下孵育10-15min后转入冰浴静置5-10min使双链DNA变性成单链DNA。

进一步的，步骤S2中，单链DNA进行脱氨基处理所使用的脱氨基反应缓冲液为终浓度为20-25mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为6.5-7.0；胞嘧啶脱氨酶A3Am的用量需要根据实验过程中表达的A3Am蛋白的具体活性进行调整，以保证A3Am蛋白的用量可以使反应体系中DNA上的胞嘧啶充分脱氨基即可；脱氨基反应的条件为35-40℃反应3-5h。

进一步的，步骤S2中，脱氨基处理后将反应体系中的胞嘧啶脱氨基酶进行高温灭活处理，冷却后进行下一步操作；高温灭活具体操作为90-95℃条件下孵育10-15min。

进一步的，步骤S4中，若PCR扩增得到的是特定序列的DNA片段，扩增产物直接进行Sanger测序；若PCR扩增形成DNA文库，则将扩增产物进行高通量测序。

本发明的技术原理如图1-图2所示，双加氧酶nTET蛋白特异性地将5mC氧化形成氧化产物5moC(包括5hmC、5fC、5caC)。在人工改造的胞嘧啶脱氨酶A3Am蛋白处理后，不同基序环境下的5moC均能够抵抗脱氨，在随后的聚合酶链式反应扩增中扩增为C，而C能够被A3Am完全脱氨，在随后的聚合酶链式反应中扩增为T。因此，只有5mC才能在最终的测序中被读为C。从而实现对所有位点的DNA甲基化(5mC)进行定位分析的目的。

本发明的有益效果是：

本发明提供的测序方案不依赖于亚硫酸氢盐处理，相对于目前的主流方法而言，操作更简单快捷，更利于推广使用。具体为：

1.本发明中，方法操作简便，无需复杂的样品前处理。

2.本发明无需亚硫酸氢盐处理，反应条件温和，不会造成DNA的降解。

3.本发明DNA用量小，仅需100ng的基因组DNA即可对5mC进行定位分析。

4.本发明涉及的人工改造的胞嘧啶脱氨酶A3Am对C具有高效的脱氨效率，而对5moC的脱氨基效率很低，有利于5mC的定位分析。

5.本发明无需采用昂贵的第三代测序平台，只需采用下一代测序平台技术即可完成5mC的单碱基分辨率定位分析。

6.本发明涉及的方法能够广泛应用于不同生物来源5mC修饰位点的研究，并有助于对5mC的生物学功能进行更加深入的研究。

附图说明

图1为本发明中A3Am对C、5mC和5mC氧化产物(5moC)的脱氨基结构示意图。

图2为本发明定位示意图。本发明中，5mC首先被nTET特异性氧化，生成5moC(5hmC、5fC、5caC)，随后经过A3Am脱氨处理，C被A3Am完全脱氨基，测序中读作T，而5moC拮抗A3Am的脱氨基作用，测序中仍然读作C。因此，只有5mC能够被读成C。

图3为本发明中人工合成的含有5mC的DNA链(ssDNA和dsDNA)经不同物种来源双加氧酶氧化后的LC-MS/MS检测结果。

图4为本发明中人工合成的含有5mC的DNA链(dsDNA)经双加氧酶nTET氧化前后LC-MS/MS检测结果。

图5为本发明中利用Sanger测序检测人工合成的含有C的DNA链(C-dsDNA)，含5mC修饰的DNA链(5mC-dsDNA)，含5hmC修饰的DNA链(5hmC-dsDNA)，含5fC修饰的DNA链(5fC-dsDNA)，含5caC修饰的DNA链(5caC-dsDNA)经过A3Am脱氨基的结果。

图6为本发明中人工合成的同时含C和5mC修饰的DNA链(C/5mC-DNA)经nTET氧化和A3Am蛋白处理后Sanger测序的读出结果，其中5mC位点在nTET氧化与A3Am脱氨基处理后均未突变，仍读作C；而C位点在nTET氧化与A3Am脱氨后突变为T。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

【实施例1】不同物种来源双加氧酶的筛选

本发明使用的不同物种来源的双加氧酶的氨基酸序列参考美国国家生物技术信息中心。

nTET蛋白的构建及表达。为了构建全长nTET(NCBI Gene ID:8864623)蛋白重组质粒，将nTET基因序列分别通过BamHI和XhoI酶切位点插入到pET-28a(+)-sumo质粒(擎科生物科技有限公司，北京，中国)中。在类泛素蛋白修饰分子(SUMO)和nTET蛋白之间人工嵌入重组人鼻病毒蛋白(HRV 3C)进行融合连接，构建了6×His-SUMO-HRV 3C-nTET-HRV 3C-8×His重组质粒。蛋白表达后采用His标签进行纯化，获得全长的nTET蛋白。

nTET蛋白的氨基酸序列如下：

MTTFKQQTIKEKETKRKYCIKGTTANLTQTHPNGPVCVNRGEEVANTTT

LLDSGGGINKKSLLQNLLSKCKTTFQQSFTNANITLKDEKWLKNVRTAYFVC

DHDGSVELAYLPNVLPKELVEEFTEKFESIQTGRKKDTGYSGILDNSMPFNYV

TADLSQELGQYLSEIVNPQINYYISKLLTCVSSRTINYLVSLNDSYYALNNCLYP

STAFNSLKPSNDGHRIRKPHKDNLDITPSSLFYFGNFQNTEGYLELTDKNCKV

FVQPGDVLFFKGNEYKHVVANITSGWRIGLVYFAHKGSKTKPYYEDTQKNSL

KIHKETK(SEQ ID NO.1)。

CcTET蛋白的构建及表达。为了构建全长CcTET(NCBI Gene ID:6014677)蛋白重组质粒，将CcTET基因序列分别通过BamHI和XhoI酶切位点插入到pET-28a(+)-sumo质粒中。在SUMO和CcTET蛋白之间人工嵌入HRV 3C进行融合连接。构建6×His-SUMO-HRV 3C-CcTET-HRV 3C-8×His重组质粒。蛋白表达后采用His标签进行纯化，获得全长的CcTET蛋白。

AlkB蛋白的构建及表达。为了构建全长AlkB(NCBI Gene ID:946708)蛋白重组质粒，将AlkB基因序列分别通过NdeI和XhoI酶切位点插入到pET-28a(+)质粒中。在thrombin位点和6×His之间人工嵌入AlkB进行融合连接。构建6×His-AlkB-6×His重组质粒。蛋白表达后采用His标签进行纯化，获得全长的AlkB蛋白。

【实施例2】不同物种来源的双加氧酶性质分析

具体步骤如下：

(1)配制氧化反应体系溶液：nTET氧化体系50mM BisTris-HCl(pH6.0)，75mM(NH4)2FeSO4，1mMα-酮戊二酸，2mM抗坏血酸及100mM NaCl；CcTET氧化体系50mM HEPES(pH 7.0)，750μM Fe2+，1mMα-酮戊二酸，2mM抗坏血酸，2.5mM的二硫苏糖醇；AlkB氧化体系46.5mMTAPS(pH 7.0)，5μM Fe(NH4)2(SO4)2，0.93mMα-酮戊二酸，1.86mM抗坏血酸。

(2)氧化活性测定。终浓度为10μM的双加氧酶和25μM的ssDNA于20μL氧化体系中37℃孵育2h进行氧化反应；终浓度为20μM的双加氧酶和100ng的dsDNA于20μL氧化体系中37℃孵育2h进行氧化反应。

(3)在上述氧化反应体系中加入1μL 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，2μL20mg/mL蛋白酶K于55℃消化反应30min，95℃灭活10min以消化双加氧酶。

(4)在消化体系中加入DNA核酸酶进行酶解处理。

所使用的DNA链的序列见下表：

结果见图3，LC-MS/MS结果表明，不同物种来源的双加氧酶中，nTET蛋白具有最高的氧化活性。此外，图4表明，经过nTET双加氧酶氧化后，5mC的色谱峰明显的降低，明显生成了5hmC，5fC，5caC的色谱峰。因此，可以认为nTET能够有效的氧化5mC生成氧化产物5moC(5hmC，5fC，5caC)。该数据证明，nTET蛋白可以作为氧化5mC的双氧化酶。

【实施例3】人工改造胞嘧啶脱氨酶的筛选

本发明使用的野生型胞嘧啶脱氨酶wtA3A的氨基酸序列参考美国国家生物技术信息中心(NCBI Gene ID:200315)，对其进行突变使得对C和5mC有良好脱氨基能力但不能对5moC脱氨基的突变蛋白，最后得到A3Am蛋白。A3Am与wtA3A相比，不同之处包括：25-26位氨基酸从甘氨酸-缬氨酸更改为谷氨酸-脯氨酸-色氨酸-缬氨酸-精氨酸，29位氨基酸从组氨酸更改为精氨酸，30位氨基酸从赖氨酸更改为谷氨酰胺，134位氨基酸从脯氨酸更改为苏氨酸，135位氨基酸从亮氨酸更改为天冬氨酸。

A3Am蛋白的编码序列插入pET-41a(+)质粒载体，蛋白N端带有GST标签，C端带有8xHis标签，标签与A3Am蛋白之间含有HRV 3C切割位点，蛋白表达于大肠杆菌BL21(DE3)pLySs细胞。蛋白表达后采用谷胱甘肽琼脂糖珠进行纯化，经HRV 3C酶切后，分别获得全长的A3Am脱氨酶。

A3Am蛋白的氨基酸序列如下：

MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNEPWVRGRRQTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDTDYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN(SEQ ID NO.2)。

A3Am蛋白的编码序列如下：

atggaagccagcccagcatccgggccccgccacttgatggatccacacatcttcacttccaactttaacaatgagccctgggttcgtggacgccgccagacctacctgtgctacgaagtggagcgcctggacaatggcacctcggtcaagatggaccagcaccggggctttcttcacaaccaggctaagaatcttctctgtggcttttacggccgccatgcggagctgcgcttcttggacctggttccttctttgcagttggacccggcccagatctaccgggtcacttggttcatctcctggagcccctgcttctcctggggctgtgccggggaagtgcgtgcgttccttcaggagaacacacacgtgcgtctgcgtatcttcgctgcccgcatctatgattacgacaccgattataaggaggcactgcaaatgctgcgggatgctggggcccaagtctccatcatgacctacgatgaatttaagcactgctgggacacctttgtggaccaccagggatgtcccttccagccctgggatggactggatgagcacagccaagccctgagtgggcgtctgcgggccattctccagaatcagggaaac(SEQ ID NO.3)。

【实施例4】人工改造的胞嘧啶脱氨酶性质分析

具体步骤如下：

(1)首先配制工作溶液：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶解于去离子水中，浓度为200mM，并调节其pH至6.5。

(2)经过DNA聚合酶链式扩增反应合成分别含有C，5mC，5hmC，5fC及5caC的DNA链C-DNA，5mC-DNA，5hmC-DNA，5fC-DNA及5caC-DNA。

(3)取步骤(2)中所得的变性DNA样品60ng，分别加入一定量的A3Am(蛋白的用量需要根据实验过程中表达的脱氨酶蛋白的具体活性进行调整)，2μL步骤(1)配制的4-羟乙基哌嗪乙磺酸反应缓冲液(pH 6.5)，加去离子水至反应体系为20μL。在37℃下反应4个小时；反应结束后，将样品在95℃下孵育10分钟。

(4)随后对步骤(3)脱氨基的DNA链进行DNA聚合酶链式扩增反应，扩增后的产物进行Sanger测序检测。

所使用的DNA链的序列见下表：

结果见图5，Sanger测序结果表明，处理后C和5mC均被读作T，可以认为A3Am能够脱去C和5mC的氨基；而处理后5hmC，5fC和5caC仍读作C，故而可以认为A3Am对5hmC，5fC，5caC没有脱氨基的能力。该数据证明，通过结合nTET蛋白，A3Am可以作为筛选胞嘧啶中5mC的脱氨酶。

【实施例5】标准合成DNA分析

商品化合成的分别含有C及5mC的DNA链。取DNA 100ng，加入一定量的nTET(根据所使用的nTET的实际活性确定最合适的氧化浓度)，50mM BisTris-HCl(pH 6.0)，75mM(NH4)2FeSO4，1mMα-酮戊二酸，2mM抗坏血酸及100mM NaCl，加去离子水至反应体系为20μL，在37℃水浴中温育2个小时。在上述氧化反应体系中加入1μL 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，2μL20mg/mL蛋白酶K于55℃消化反应30min，95℃灭活30min以消化氧化酶。

将氧化后的DNA进行变性解链处理，氧化后的DNA在95℃高温下孵育10分钟后立即转入冰浴中，静置5分钟，使双链DNA变性成单链DNA。随后进行脱氨基处理，所使用的脱氨基反应缓冲液中各成分的终浓度为20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为6.5，A3Am脱氨基蛋白的用量需要根据实验过程中表达的脱氨酶蛋白的具体活性进行调整，以保证脱氨基蛋白的用量可以使反应体系中DNA上的胞嘧啶充分脱氨基；脱氨基反应温度为37℃，反应时间为4小时。脱氨酶的高温灭活处理是在脱氨基反应结束后对反应体系进行90℃，10分钟的孵育，待反应温度冷却至室温。

取上述反应后的DNA进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10×扩增缓冲液5μL，10μmol/L正反向引物各2μL，模板DNA5ng，Hot Start Taq DNA聚合酶用量10U，补加去离子水至体系为50μL。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-72℃退火30sec；(4)72℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；72℃延伸10min，放置4℃进行贮存。样品进行Sanger测序。

结果见图6，经nTET氧化和A3Am蛋白处理后Sanger测序的读出结果，其中5mC位点在nTET氧化与A3Am脱氨基处理后均未突变，仍读作C；而C位点在nTET氧化与A3Am脱氨后突变为T。该结果表明nTET结合A3Am可以实现单碱基分辨率下无需亚硫酸氢盐的5mC定位分析。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶在制备用于对胞嘧啶脱氨基的产品中的应用，其特征在于：所述胞嘧啶为C和/或5mC。

3.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶在制备用于检测5mC的产品中的应用。

4.一种人工改造胞嘧啶脱氨酶辅助的DNA中5-甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的nTET蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的人工改造的胞嘧啶脱氨酶；

S2、用所述nTET对待检DNA进行氧化处理，获得氧化后的DNA；后将所示氧化后的DNA进行变性处理获得单链DNA，再用所述人工改造的胞嘧啶脱氨酶对所述单链DNA进行脱氨基处理，得到脱氨基的DNA片段；

S3、对所述脱氨基的DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；

S4、对所述扩增产物进行测序，待检DNA中的C位点在测序中被读为T，5mC位点在测序中被读为C。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤S2中，DNA的氧化反应体系由物质的量浓度比例为(45-55):(70-80):(0.5-1.5):(1-3):(95-105)的pH 6.0-7.0BisTris-HCl、(NH4)2FeSO4、α-酮戊二酸、抗坏血酸、NaCl组成；氧化反应温度为35-40℃，反应时间为1.5-2.5h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤S2中，变性处理操作为：在90-95℃下孵育10-15min后转入冰浴静置5-10min使双链DNA变性成单链DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤S2中，单链DNA进行脱氨基处理所使用的脱氨基反应缓冲液为终浓度为20-25mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为6.5-7.0。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤S2中，脱氨基反应的条件为35-40℃反应3-5h。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤S2中，脱氨基处理后将反应体系中的胞嘧啶脱氨基酶进行高温灭活处理，冷却后进行下一步操作；高温灭活具体操作为90-95℃条件下孵育10-15min。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤S4中，若PCR扩增得到的是特定序列的DNA片段，扩增产物直接进行Sanger测序；若PCR扩增形成DNA文库，则将扩增产物进行高通量测序。