CN116732140A

CN116732140A - 一种核酸检测系统及其在检测dna突变中的应用

Info

Publication number: CN116732140A
Application number: CN202210201735.5A
Authority: CN
Inventors: 史硕博; 苏昕; 付金玉
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2023-09-12

Abstract

本发明公开了一种核酸检测系统及其在检测DNA突变中的应用。本发明公开的核酸检测系统由Cas12a、crRNA与A、B、C、E、F和G六条单链DNA组成；A由A1、A2、A3、A4连接得到，A3与待测DNA在所述crRNA的引导下被所述Cas12a切割得到的粘性末端反向互补；B与A4反向互补；C由C1、C2连接得到，C1与A2反向互补；E由E1、E2连接，E1与A3的5′端的4个核苷酸反向互补，E2与C1序列完全相同或部分相同；F的序列与C2反向互补、3′末端标记荧光淬灭基团；G的序列与A1反向互补、5′末端标记荧光基团。本发明的系统可以达到检测单个拷贝的灵敏度和1％的区分度(突变型/野生型)。

Description

一种核酸检测系统及其在检测DNA突变中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种核酸检测系统及其在检测DNA突变中的应用。

背景技术

基因检测在医疗与健康、疾病预防以及病原微生物检测存在重要作用。现有的基因检测手段主要包括测序，PCR等相关检测方法，这些方法均存在操作复杂、耗时长等缺点。近年来，以CRISPR技术为代表的基因编辑技术在基因定点突变、目标基因敲除、目标基因沉默和激活、基因定点整合以及单碱基替换等方面的研究中发挥了巨大的推进作用。在常用的CRISPR type II技术中，crRNA(CRISRP RNA)引导Cas蛋白识别和编辑特定的DNA序列。经过不断总结经验,研究人员发现在设计crRNA时遵循一定规律(crRNA的特异性主要与临近PAM的8-12个序列有关)或改造Cas蛋白可以有效降低脱靶率，从而有效识别单碱基突变，精确识别出特定DNA。近些年CRISPR技术已经被初步开发应用于基因体外检测领域，基于基因编辑技术CRISPR开发的体外诊断技术入选2018年世界十大科技进展。美国麻省理工学院张锋教授基于CRISPR技术开发出新型基因诊断技术，可用于检测患寨卡病毒或登革热病毒的存在并同时进行分型，还实现了识别特定的细菌类型以及检测抗生素耐药性基因(Science.2017；356(6336):438-442)。与此同时，基于Cas12a(又名Cpf1)美国加州大学伯克利分校Jennifer A.Doudna教授开发了一个名为DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统，用来快速、准确地检测各种亚型的人乳头瘤病毒(Science.2018；360(6387):436-439)。类似的，中科院上海植物生理生态研究所王金博士等也基于Cas12a建立了一个核酸体外探测技术，并成功用来检测狂犬病毒及日本脑炎病毒(Cell Discovery 2018,4(1):20)。

上述检测方法均是基于Cas12a/Cas13a蛋白的共有附属活性(可切割ssDNA或ssRNA)进行开发，在识别目标突变标记后，可以非特异性切割其它ssRNA或ssDNA，使荧光素摆脱了淬灭剂的淬灭，释放出荧光从而指示基因突变，但仍存在以下几个技术难点：(1)需要在系统中提供连接荧光分子及其淬灭剂的单链核酸分子，单链核酸存在结构不稳定带来的假阳性、储存期短等不足；(2)整个体系的单碱基区分能力全部依赖于CRISPR系统的识别能力，存在一定的脱靶风险，在具有相似序列的位置也可能会发生切割，因此对待识别的单核苷酸突变会带来假阳性等不足；(3)每个待测突变靶点对应一个Cas蛋白，增加了系统复杂性和成本，难以实现多靶点同时检测，正交性差。这在一定程度上限制了该方法的发展。

发明内容

基于现有技术中存在的问题，本发明选用Cas12a蛋白进行研究，以检测EGFR基因多位点突变以及新型冠状病毒多位点突变为例，使Cas12a蛋白在识别切割完靶标后产生8bp的粘性末端，并结合粘性末端介导的链置换反应(Toehold-mediated stranddisplacement reaction,TSDR)对产生的粘性末端进行识别。链置换反应的动力完全来自与toehold(脚趾)结合的碱基互补配对，无需酶的参与，不需要考虑酶存在时相对苛刻的反应条件且可在室温下能够完成反应，提升了反应的普遍适用性和通量。也即，本发明开发出一种新的灵敏度高，特异性强以及可同时进行多个靶标检测的新的核酸诊断方法。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测DNA突变或检测DNA序列的系统，所述系统包括：Cas12a、crRNA与TSDR试剂；

所述crRNA的间隔序列能够识别待测DNA中的目的突变(或待测DNA中的待测核苷酸)；

所述TSDR试剂为TSDR试剂1或TSDR试剂2；所述TSDR试剂1由试剂A、试剂B、试剂C、试剂E、试剂F与试剂G组成；

所述试剂A为由A1、A2、A3、A4依次连接得到的单链DNA，结构式为5′-A1-A2-A3-A4-3′，A1的长度为15-30nt，A2的长度为15-30nt，A3与待测DNA在所述crRNA的引导下被所述Cas12a切割得到的粘性末端反向互补，A3的长度为8nt，A4的长度为15-30nt；

所述试剂B为与A4反向互补的单链DNA；

所述试剂C为由C1、C2依次连接得到的单链DNA，结构式为5′-C1-C2-3′，C1与A2反向互补，C2的长度为15-30nt；

所述试剂E为由E1、E2依次连接得到的单链DNA，结构式为5′-E1-E2-3′，E1与A3的5′端的4个核苷酸反向互补，E2与C1序列完全相同或部分相同，E1的长度为4nt，E2的长度为15-30nt；

所述试剂F为序列与C2反向互补、3′末端标记有荧光淬灭基团或荧光基团的单链DNA；

所述试剂G为序列与A1反向互补、5′末端标记有荧光基团或荧光淬灭基团的单链DNA；所述试剂F的3′末端与所述试剂G的5′末端靠近时无荧光信号发出，二者远离时所述试剂F或所述试剂G能够产生荧光信号；

A1、A2、A3、A4、B、C1、C2、E1、E2、F、G除上述描述的互补情况外，彼此间不相同或互补，且均与待测样本DNA不相同或互补；

所述TSDR试剂2由试剂A′、试剂B′、试剂C′、试剂E′、试剂F′与试剂G′组成；

所述试剂A′为由A1′、A2′、A3′、A4′依次连接得到的单链DNA，结构式为3′-A1′-A2′-A3′-A4′-5′，A1′的长度为15-30nt，A2′的长度为15-30nt，A3′与待测DNA在所述crRNA的引导下被所述Cas12a切割得到的粘性末端反向互补，A3′的长度为8nt，A4′的长度为15-30nt；

所述试剂B′为与A4′反向互补的单链DNA；

所述试剂C′为由C1′、C2′依次连接得到的单链DNA，结构式为3′-C1′-C2′-5′，C1′与A2′反向互补，C2′的长度为15-30nt；

所述试剂E′为由E1′、E2′依次连接得到的单链DNA，结构式为3′-E1′-E2′-5′，E1′与A3′的5′端的4个核苷酸反向互补，E2′与C1′序列完全相同或部分相同，E1′的长度为4nt，E2′的长度为15-30nt；

所述试剂F′为序列与C2′反向互补、5′末端标记有荧光淬灭基团或荧光基团的单链DNA；

所述试剂G′为序列与A1′反向互补、3′末端标记有荧光基团或荧光淬灭基团的单链DNA；所述试剂F′的5′末端与所述试剂G′的3′末端靠近时无荧光信号发出，二者远离时所述试剂F′或所述试剂G′能够产生荧光信号；

A1′、A2′、A3′、A4′、B′、C1′、C2′、E1′、E2′、F′、G′除上述描述的互补情况外，彼此间不相同或互补，且均与待测样本DNA不相同或互补。

上述系统中，A3与A3′用于与待测DNA在crRNA的引导下被Cas12a切割得到的粘性末端通过反向互补结合。

在C1与A2结合的情况下，E2能够通过E1与A3的结合而使C1与A2解链进而实现E2与A2的结合。

在C1′与A2′结合的情况下，E2′能够通过E1′与A3′的结合而使C1′与A2′解链进而实现E2′与A2′的结合。

A1、A2、A3、A4连接形成所述A，这四个片段间可通过连接片段连接，也可直接连接。C1、C2连接形成所述C，这两个片段间可通过连接片段连接，也可直接连接。E1、E2连接形成所述E，这两个片段间可通过连接片段连接，也可直接连接。

A1′、A2′、A3′、A4′连接形成所述A′，这四个片段间可通过连接片段连接，也可直接连接。C1′、C2′连接形成所述C′，这两个片段间可通过连接片段连接，也可直接连接。E1′、E2′连接形成所述E′，这两个片段间可通过连接片段连接，也可直接连接。

A1、A2、A3、A4、所述试剂B、C1、C2、E1、E2、所述试剂F、所述试剂G均可含有一个或多个核苷酸突变、插入或缺失。

A1′、A2′、A3′、A4′、所述试剂B′、C1′、C2′、E1′、E2′、所述试剂F′、所述试剂G′均可含有一个或多个核苷酸突变、插入或缺失。

所述试剂A、所述试剂B、所述试剂C、所述试剂E、所述试剂F、所述试剂G能够满足这六种试剂在同一体系中可形成如图1所示的结构，即所述试剂G可与A1形成双链DNA，所述试剂F可与C2形成双链DNA，所述试剂G与A1结合、所述试剂F与C2结合后无荧光信号发出，C1可与A2形成双链DNA，E2也可与A2形成双链DNA，E1可与A3结合，所述试剂B可与A4形成双链DNA。

所述试剂A′、所述试剂B′、所述试剂C′、所述试剂E′、所述试剂F′、所述试剂G′能够满足这六种试剂在同一体系中可形成如图1所示的结构，即所述试剂G′可与A1′形成双链DNA，所述试剂F′可与C2′形成双链DNA，所述试剂G′与A1′结合、所述试剂F′与C2′结合后无荧光信号发出，C1′可与A2′形成双链DNA，E2′也可与A2′形成双链DNA，E1′可与A3′结合，所述试剂B′可与A4′形成双链DNA。

所述荧光淬灭基团能淬灭所述荧光基团发出的荧光信号。

上述系统中，A3与A3′均可含有锁核酸修饰。

A3的5′端的第一个核苷酸可为目的突变核苷酸(或待测DNA中的待测核苷酸)。A3含有6个锁核酸修饰。A3的锁核酸修饰位于5′端起的第1、3、5、6、7、8个核苷酸处。

A3′的3′端的第一个核苷酸可为目的突变核苷酸(或待测DNA中的待测核苷酸)。A3′可含有6个锁核酸修饰。A3′的锁核酸修饰位于3′端起的第1、3、5、6、7、8个核苷酸处。

上述系统中，A1与A1′的长度均可为15-25nt，或15-20nt，如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30nt。

A2与A2′的长度均可为20-25nt，如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30nt。

A4与A4′的长度均可为20-25nt，如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30nt。

C2与C2′的长度均可为15-25nt，或15-20nt，如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30nt。

E2与E2′的长度均可为20-25nt，如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30nt。

上述系统中，A1与A1′的序列均可为序列3的第1-16位。

A2与A2′的序列均可为序列3的第17-38位。

A3与A3′的序列均可为序列3的第39-46位。

A4与A4′的序列均可为序列3的第47-68位。

所述试剂B与所述试剂B′的序列均可为序列4。

C1与C1′的序列均可为序列5的第1-22位。

C2与C2′的序列均可为序列3的第23-38位。

E2与E2′的序列均可为序列6的第5-26位。

所述试剂F与所述试剂F′的序列均可为序列7。

所述试剂G与所述试剂G′的序列均可为序列8。

上述系统中，所述crRNA的间隔序列的长度可为17nt。

所述crRNA的非间隔序列的序列可为GAAUUUCUACUGUUGUAGAU。

所述crRNA的间隔序列在与待测DNA结合时，能够覆盖所述目的突变(如所述目的突变为单核苷酸的突变、插入或缺失或为大于等于两个核苷酸的插入或缺失)或能够覆盖所述目的突变的一部分(如所述目的突变为大于等于两个核苷酸的插入或缺失)或待测DNA中的待测核苷酸。待测DNA中目的突变为SNP突变时，所述crRNA中目的突变可位于间隔序列5′末端起的第15个核苷酸处。

上述系统中，所述Cas12a的序列可为如下Z1)、Z2)或Z3)：

Z1)氨基酸序列是序列2的第1-1300位的蛋白质；

Z2)将序列表中序列2的第1-1300位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

Z3)在Z1)或Z2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使Z1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2的第1-1300位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述Z2)中的蛋白质，为与序列2的第1-1300位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述Z2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述Z2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第1-3900位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1的第1-3900位所示的DNA分子编码序列序列1的第1-3900位所示的蛋白质。

上述系统还可含有所述Cas12a在所述crRNA的引导下切割DNA所需的其他切割试剂(如缓冲液等)。

上述系统还可含有TSDR反应所需的其他TSDR试剂(如缓冲液、Mg²⁺、Na⁺等)。

上述系统还可含有RPA(Recombinase Polymerase Amplification)扩增引物，所述RPA扩增引物能扩增含有所述目的突变(或待测DNA中的待测核苷酸)在内的DNA片段。

所述RPA扩增引物的扩增产物含有Cas12a识别所需的PAM序列，该PAM序列的位置能够满足所述crRNA对待测DNA中的目的突变(或待测DNA中的待测核苷酸)。所述RPA扩增产物中，PAM序列可位于所述间隔序列的第1个核苷酸上游。

所述系统还可含有进行RPA扩增所需的其他RPA试剂(如酶、缓冲液等)。所述系统还可含有进行RNA转录所需的其他转录试剂(如引物、酶、缓冲液等)。

具体的，所述系统可由所述Cas12a、所述crRNA与所述TSDR试剂组成，还可由所述Cas12a、所述crRNA、所述TSDR试剂与所述其他切割试剂组成，还可由所述Cas12a、所述crRNA、所述TSDR试剂与所述其他TSDR试剂组成，还可由所述Cas12a、所述crRNA、所述TSDR试剂、所述其他TSDR试剂与所述其他TSDR试剂组成。

所述系统还可由所述Cas12a、所述crRNA、所述TSDR试剂、所述RPA扩增引物组成，还可由所述Cas12a、所述crRNA、所述TSDR试剂、所述RPA扩增引物与如下至少一种组成：所述其他TSDR试剂、所述其他TSDR试剂、所述其他RPA试剂、所述其他转录试剂。

所述系统可为产品。

所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种检测DNA突变的方法，所述方法包括：

1)将待酶切DNA利用所述Cas12a、所述crRNA进行切割，得到切割产物；所述待酶切DNA为待测DNA或利用所述RPA扩增引物对所述待测DNA进行RPA扩增得到的含有Cas12a识别所需的PAM序列的RPA扩增产物；

2)向所述切割产物中加入所述试剂A、所述试剂B、所述试剂C、所述试剂E、所述试剂F、所述试剂G进行TSDR反应，或加入所述试剂A′、所述试剂B′、所述试剂C′、所述试剂E′、所述试剂F′、所述试剂G′进行TSDR反应，得到反应产物；

3)按照如下31)或32)确定待测DNA是否含有目的突变：

31)检测所述反应产物中的荧光信号，如所述反应产物中无荧光信号，所述待测DNA含有或候选含有目的突变；如所述反应产物中有荧光信号，所述待测DNA不含有或候选不含有目的突变；

32)比较所述反应产物与对照反应产物中的荧光信号，如所述反应产物中的荧光信号低于所述对照反应产物中的荧光信号，所述待测DNA含有或候选含有目的突变；如所述反应产物中的荧光信号高于所述对照反应产物中的荧光信号，所述待测DNA不含有或候选不含有目的突变；所述对照反应产物为将步骤1)中待测DNA替换为不含有目的突变的DNA并按照步骤1)和2)得到的反应产物。

上述方法步骤2)中，可将所述试剂A、所述试剂B、所述试剂C、所述试剂F、所述试剂G先添加至反应体系中孵育(如95℃孵育2min)后冷却(如至室温)；而后向体系中添加所述切割产物孵育(如室温孵育1h)；然后向体系中添加所述试剂E，完成TSDR反应；

或，将所述试剂A′、所述试剂B′、所述试剂C′、所述试剂F′、所述试剂G′先添加至反应体系中孵育(如95℃孵育2min)后冷却(如至室温)；而后向体系中添加所述切割产物孵育(如室温(25-27℃)孵育1h)；然后向体系中添加所述试剂E′，完成TSDR反应。

上述检测DNA突变的方法可为非诊断目的的检测DNA突变的方法。

本发明还提供了下述任一应用：

X1)所述系统在制备检测DNA突变产品中的应用；

X2)所述系统在制备检测DNA序列产品中的应用；

X3)所述系统在检测DNA突变中的应用；

X4)所述系统在检测DNA序列中的应用。

所述系统应用于检测DNA序列时，上文中的目的突变处的核苷酸即为待检测的核苷酸。

本发明还提供了下述任一应用：

X1)所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在制备检测DNA突变产品中的应用；

X2)所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在制备检测DNA序列产品中的应用；

X3)所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在检测DNA突变中的应用；

X4)所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在检测DNA序列中的应用。

所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2应用于检测DNA序列时，上文中的目的突变处的核苷酸即为待检测的核苷酸。

本发明中，所述目的突变可为缺失/插入突变或SNV突变(如SNP)。

本发明具有如下特点：(1)相较于其他利用CRISPR-Cas蛋白的附属活性的检测方法，本发明利用Cas蛋白的主活性，而非附属活性；(2)本发明可以达到检测单个拷贝的灵敏度和1％的区分度(突变型/野生型)；(3)本发明可以达到检测8bp的粘性末端(overhang)，这在别的检测方法中是没有检测过的；(4)与Cas12a-based附属活性检测方法相比，本发明更易进行多重检测；(5)本发明是基于对粘性末端的识别而实现的核酸突变检测。

附图说明

图1RPA-Cas12a-TSD检测突变方法示意图。注：虚线框内表示PAM序列，实现框内表示SNP位点，三角符号表示LNA修饰。

图2TSDR系统检测示意图。a,TSDR系统示意图。b,存在8bp-overhang TSDR反应示意图。c，无8bp-overhang TSDR反应示意图。注：F表示荧光基团，Q表示荧光淬灭基团；原点表示核苷酸。

图3靶标核酸的扩增及切割。a,RPA扩增结果。b,Cas12a识别切割EGFR基因突变体L858R示意图。注：红色标注为SNP位点；WT表示野生型；MT表示突变型。

图4RPA-Cas12a-TSDR系统可有效区分SNVs。a-c,突变体L858R,delE746-A750和T790M荧光信号检测结果，各曲线从上至下依次为NO-D、Wild type、Mutant type、NO-E。d-f,ΔFU计算结果，d为突变体L858R，f为delE746-A750，g为T790M。

注：Wild Type表示野生型，Mutant Type表示突变型；EW均为突变型结果，EM均为野生型结果。n＝3个重复，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图5TSDR检测系统优化。a-c，不同数量LNA修饰荧光检测结果。d，不同数量LNA修饰的ΔFU结果。e-g，进攻链E不同脚趾E1长度荧光检测结果。h，进攻链E不同脚趾长度其ΔFU结果。i-k，不同孵育温度荧光检测结果。l，不同孵育温度下ΔFU结果计算结果。

注：a-c、e-g、i-k中，各曲线从上至下依次为NO-D、Wild type、Mutant type、NO-E，Wild Type表示野生型，Mutant Type表示突变型；d、h、l中，EW均为突变型结果，EM均为野生型结果。突变型与野生型存在单核苷酸差异；SNP位点位于8bp-overhang第1个核苷酸处，3LNA修饰分别位于第2、4、6位核苷酸处，6LNA分别修饰位于第1、3、5、6、7、8位核苷酸处。n＝3个重复，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图6RPA-Cas12a-TSDR系统检测灵敏度。a-c,TSDR系统可以检测10nM靶标overhang，各曲线从上至下依次为NO-D、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、NO-E。a为TSDR检测突变体L858R荧光显示结果；b为突变体delE746-A750；c为突变体T90M。d-f,不同浓度靶标对应ΔFU线性化分析。d，突变体L858R；e为突变体delE746-A750；f为突变体T90M。

图7RPA-Cas12a-TSDR系统可以检测单个拷贝核酸分子。a，RPA可对单个拷贝核酸分子进行扩增，M为DNA分子量标准，用到1-9分别表示待测样本DNA的稀释液，浓度依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝/μL。b-d,突变体L858R,delE746A750和T790M荧光信号检测结果；检测靶标为单个拷贝核酸分子RPA扩增产物经Cas12a切割所得；Notarget表示将检测靶标(即TSDR体系中的D)替换为等体积的去离子水；各曲线从上至下依次为No target、Wild Type、Mutant Type。e,ΔFU计算结果。

注：M表示Marker，n＝3个重复，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。Wild Type表示野生型，Mutant Type表示突变型；EW均为突变型结果，EM均为野生型结果。

图8RPA-Cas12a-TSDR系统检测低丰度突变体。a-c,突变体L858R,delE746-A750和T790M荧光信号检测结果，各曲线从上至下依次为No target、100:0、99:1、95:5、90:10。d-f,ΔFU计算结果。

注：n＝3个重复，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。WT表示野生型，MT表示突变型。

图9RPA-Cas12a-TSDR系统多重检测结果。从左至右依次为检测靶标1-8。

图10RPA-Cas12a-TSDR系统细胞样品检测。a-c,突变体L858R,delE746-A750和T790M荧光信号检测结果，各曲线从上至下依次为NO-D、Wild type、Mutant type、NO-E。d,ΔFU计算结果。

注：n＝3个重复，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。Wild Type表示野生型，MutantType表示突变型；EW均为野生型型结果，EM均为突变型结果。

图11SARS-CoV-2S基因及其突变体检测。a,SARS-CoV-2S基因荧光信号检测结果，各曲线从上至下依次为NO-D、S基因、NO-E；b,突变体N501Y荧光信号检测结果，各曲线从上至下依次为NO-D、Wild type、Mutant type、NO-E；c,D614G荧光信号检测结果，各曲线从上至下依次为NO-D、Wild type、Mutant type、NO-E。d,ΔFU计算结果。

注：n＝3个重复，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。Wild Type表示野生型(即S基因)，Mutant Type表示突变型；EW均为野生型结果，EM均为突变型结果。

图12SARS-CoV-2S基因及其突变体3个靶标同时检测结果。从左至右依次为检测靶标1-5。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的细胞系H1975(张萌.miRNA-149-3p和miRNA-149-5p在肺癌中的作用机制研究[D].北京化工大学,2019.DOI:10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.001469.)，经北京化工大学王艳东老师课题组同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的细胞系H1650：合肥源恩生物技术有限公司。

实施例1、Cas12a融合蛋白的制备

1、Pet28a-FnCpf1质粒的制备

将pET-28a(+)的XbaI和NotI的识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的Cas12a基因，得到重组载体，将得到的重组载体记为Pet28a-FnCpf1。Pet28a-FnCpf1含有序列表中序列1所示的DNA片段，该重组载体能够表达序列2所示的Cas12a与His标签的融合蛋白(记为Cas12a融合蛋白)。

序列1中，第1-3900位为Cas12a基因的序列，第3901-3936位为pET-28a(+)载体上的序列。序列1所述的DNA片段(记为Cas12a融合基因)编码序列2所示的Cas12a融合蛋白，序列2的第1-1300位为Cas12a的氨基酸序列。

Cas12a融合基因序列(序列1)：

ATGAGTATCTACCAGGAATTTGTCAATAAATACAGCCTGTCTAAAACGCTCCGCTTTGAACTGATTCCACAGGGCAAAACACTGGAGAACATCAAAGCCCGCGGCCTGATTCTGGACGATGAAAAACGTGCAAAGGATTATAAAAAAGCCAAACAGATCATTGACAAGTATCATCAATTCTTTATTGAGGAAATTCTCTCTAGTGTATGCATTTCAGAGGATCTGCTGCAAAACTATTCGGATGTGTACTTTAAACTGAAGAAATCTGATGATGACAACTTGCAGAAGGACTTTAAGTCGGCTAAGGACACCATCAAGAAACAGATTAGTGAATATATTAAAGACTCCGAAAAATTCAAAAATCTGTTTAATCAGAATCTGATTGACGCCAAGAAAGGCCAGGAATCAGACCTGATCCTGTGGTTGAAACAGAGTAAGGATAACGGTATTGAACTTTTTAAAGCGAATTCGGATATTACCGACATCGACGAAGCATTGGAAATTATTAAGAGCTTTAAAGGTTGGACTACTTATTTCAAAGGATTTCATGAGAACCGCAAAAATGTGTATTCAAGTAACGATATTCCGACAAGCATCATTTACCGTATTGTAGACGATAACCTGCCGAAATTTCTGGAAAATAAAGCGAAGTACGAAAGCCTTAAAGATAAAGCGCCCGAAGCCATTAACTACGAGCAGATTAAAAAAGATTTGGCCGAGGAACTTACCTTCGATATTGATTACAAGACCTCTGAAGTCAATCAGCGTGTGTTTTCACTGGACGAAGTCTTTGAGATCGCCAACTTCAACAACTATCTGAACCAGTCCGGCATTACGAAATTTAACACCATTATTGGCGGGAAATTCGTTAATGGTGAAAACACTAAGCGGAAAGGCATTAACGAATATATCAATCTGTACTCACAGCAAATCAATGACAAAACTTTGAAAAAATACAAGATGTCTGTCCTCTTCAAACAGATTCTCTCAGATACCGAAAGCAAATCTTTCGTCATCGACAAATTAGAGGATGACAGCGATGTCGTCACTACTATGCAGAGCTTTTATGAACAAATTGCCGCGTTTAAAACGGTAGAAGAGAAATCAATCAAAGAAACCCTGTCGCTCCTGTTCGATGATCTGAAAGCGCAGAAACTCGACCTGTCTAAGATTTACTTCAAAAATGATAAAAGTCTGACGGATCTGAGCCAGCAGGTCTTTGACGACTATTCAGTAATTGGCACGGCTGTATTGGAATATATCACTCAACAGATTGCCCCGAAAAACTTAGATAACCCGTCTAAAAAAGAACAGGAACTGATCGCTAAAAAAACAGAGAAAGCAAAATATCTGAGCTTGGAAACTATCAAATTAGCGCTGGAGGAGTTCAATAAACACCGTGACATTGATAAACAGTGCCGCTTTGAGGAGATTCTGGCGAACTTCGCGGCGATTCCCATGATCTTCGATGAAATTGCGCAGAATAAAGATAACTTGGCACAGATCAGCATCAAATATCAAAACCAAGGTAAGAAAGATTTGCTTCAAGCTTCCGCGGAGGATGATGTGAAGGCCATCAAGGATCTGCTGGATCAGACCAATAACCTCCTGCATAAACTTAAAATTTTCCATATTAGTCAGTCTGAAGATAAAGCGAATATTCTGGACAAAGATGAACACTTTTATTTAGTGTTCGAAGAGTGCTATTTTGAACTGGCTAACATTGTCCCGCTGTACAACAAGATTCGTAACTATATCACTCAGAAACCGTATTCCGACGAAAAATTCAAGCTCAATTTCGAAAATTCCACGCTGGCAAACGGTTGGGACAAAAACAAAGAACCGGATAATACAGCGATCTTATTTATCAAAGATGATAAGTACTATCTCGGCGTGATGAACAAAAAGAACAATAAGATTTTCGATGACAAGGCAATTAAAGAGAACAAAGGCGAAGGCTACAAAAAAATCGTATATAAACTGCTGCCGGGTGCGAACAAAATGTTACCAAAAGTGTTTTTCTCGGCGAAAAGTATCAAATTTTACAACCCTAGCGAGGACATCTTACGCATTCGTAATCATAGCACGCACACTAAAAATGGATCTCCGCAAAAAGGATATGAAAAGTTTGAATTCAACATTGAAGATTGCCGTAAATTCATTGATTTCTACAAACAGAGTATTTCCAAACATCCGGAATGGAAAGACTTTGGTTTTCGTTTCAGCGATACTCAGCGCTATAACTCGATCGACGAATTCTACCGTGAGGTAGAAAATCAGGGCTATAAACTCACGTTTGAGAATATTAGTGAGAGCTACATTGATTCCGTGGTCAACCAGGGGAAATTGTACCTGTTTCAGATTTATAATAAAGATTTCTCGGCCTATAGTAAAGGTCGGCCAAACCTGCATACCCTGTACTGGAAAGCCCTGTTTGATGAACGCAACCTGCAGGACGTCGTTTACAAATTAAACGGCGAAGCGGAACTGTTTTATCGTAAACAGTCTATTCCTAAAAAAATCACGCATCCTGCCAAGGAAGCTATTGCAAACAAGAATAAAGATAACCCAAAGAAAGAATCTGTCTTCGAATATGATCTTATTAAAGATAAACGGTTCACGGAGGACAAGTTTTTCTTTCACTGCCCAATTACCATTAATTTCAAATCTTCAGGTGCTAATAAATTCAACGATGAAATTAATTTGTTGCTGAAAGAAAAAGCTAACGATGTGCATATCCTGTCGATCGATCGTGGCGAACGCCATCTTGCGTACTACACCCTCGTCGACGGCAAGGGAAATATCATCAAACAGGACACTTTTAATATCATTGGGAATGATCGTATGAAAACGAATTACCATGATAAACTTGCAGCCATTGAGAAGGACCGGGATAGCGCGCGGAAAGACTGGAAGAAGATTAACAATATCAAAGAGATGAAAGAAGGTTACCTGAGTCAAGTGGTCCATGAGATTGCTAAGCTTGTTATCGAGTATAACGCAATTGTGGTCTTCGAAGATCTTAATTTTGGTTTTAAGCGGGGTCGTTTTAAAGTCGAAAAACAGGTCTATCAGAAACTGGAGAAAATGCTGATTGAAAAACTGAACTATCTTGTGTTTAAAGATAACGAATTCGATAAAACCGGCGGCGTTCTTCGTGCCTATCAACTGACAGCACCGTTCGAAACATTTAAAAAAATGGGCAAACAGACCGGAATCATTTACTATGTGCCCGCCGGGTTCACCTCAAAGATTTGTCCTGTGACGGGCTTCGTCAATCAACTCTACCCAAAATACGAATCGGTTAGTAAAAGTCAGGAATTCTTCTCCAAGTTTGATAAGATCTGTTACAACCTGGACAAAGGGTACTTTGAGTTTAGCTTTGATTACAAAAACTTTGGAGACAAGGCGGCCAAAGGAAAGTGGACTATCGCTTCCTTTGGCAGTCGGCTGATTAACTTCCGTAACTCGGATAAGAACCACAACTGGGACACACGTGAAGTTTATCCGACTAAGGAGCTGGAAAAACTGTTGAAAGATTACTCGATTGAATACGGCCATGGTGAATGCATTAAAGCAGCGATTTGTGGTGAAAGTGATAAGAAATTTTTCGCAAAACTGACGTCAGTACTTAACACGATTCTGCAGATGCGTAATTCGAAAACCGGCACGGAGCTGGATTACTTAATCTCTCCTGTGGCAGATGTGAACGGCAATTTTTTCGACTCGCGTCAGGCGCCGAAAAATATGCCGCAGGATGCCGATGCGAACGGCGCGTATCACATTGGCTTGAAGGGGCTGATGTTGCTCGGGCGCATTAAAAACAATCAAGAAGGCAAAAAGTTAAACCTGGTCATTAAAAACGAAGAGTACTTCGAATTTGTTCAAAATCGCAATAACGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。

Cas12a融合蛋白序列(序列2)：

MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNNAAALEHHHHHH。

2、Cas12a的表达纯化

将步骤1所得Pet28a-FnCpf1导入E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆接种到5mL含卡那霉素的LB液态培养基中，37℃、180rpm/min条件下过夜培养，第二日取菌液50μL接种到5mL含卡那霉素的液态LB培养基中，在37℃、180rpm/min条件下培养至菌液OD600＝0.4～0.6。加入IPTG至终浓度为0.4mM，16℃，180r/min培养16h。离心收集菌体，并复溶于15mL的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0),1M NaCl,1mM DTT,5％(体积百分比)甘油)中。利用低温超高压细胞破碎仪破碎细胞。4℃、12000rpm/min离心1h，取上清过滤膜，收集滤液。用5个柱体积的A液(30mM咪唑，50mM Tris-HCl(pH8.0),1M NaCl,1mM DTT,5％(体积百分比)甘油)平衡镍柱后利用蠕动泵以4mL/min中的流速上样。利用AKTA纯化蛋白，分别用含有3％、5％、10％、20％、100％不同体积百分比B液(1M咪唑，50mM Tris-HCl(pH 8.0),1M NaCl,1mMDTT,5％(体积百分比)甘油)的洗脱液(洗脱液由A液与B液或由B液组成)依次洗脱10个柱体积，收集纯化样品跑胶。随后将含目的蛋白的纯化样品收集至透析袋中，置于含500mL的Storage buffer(50mM Tris-HCl(pH 8.0),500mM NaCl,1mM DTT,10％(体积百分比)甘油)大烧杯中，于磁力搅拌器上过夜透析换液。将透析换液后产物置于超滤管中，在4000rpm/min的条件下离心1h浓缩蛋白，即得到Cas12a融合蛋白溶液，分装储存于-80度，保存备用。

实施例2、RPA-Cas12a-TSD检测EGFR基因突变位点

本实施例的RPA-Cas12a-TSD检测突变方法步骤如图1所示，共分为3步。第一步利用RPA(Recombinase Polymerase Amplification)对目的核酸分子进行等温扩增，所用引物为RPA扩增引物。接下来第二步，利用CRISPR/Cas12a对扩增产物进行识别和切割。该步骤中，Cas12a对底物的特异性较高，突变型扩增产物完全被切割并产生带有SNP位点的8bp-overhang(Nucleic Acids Research,2017,Vol.45,No.9e74 doi:10.1093/nar/gkx018)，野生型扩增产物不被切割因而不产生8bp-overhang，可有效区分野生型和突变型。最后一步，利用TSDR(Toehold-mediated strand displacement report)系统对Cas12a切割产生的8bp-overhang进行检测。

一、RPA-Cas12a-TSDR检测方法的建立

1、RPA扩增

利用Twist-Amp basic kit(TwistDX,Britsh)RPA反应试剂盒进行扩增反应。每个RPA扩增反应包括29.5μL buffer，RPA扩增引物上、下游引物各2.4μL(引物浓度均为10μM)，2μL模板DNA(即待测样本DNA)，2.5μL醋酸镁和11.2μL水。将上述混合物放置39℃反应15分钟后，利用乙醇沉淀法纯化扩增产物。

2、crRNA转录

转录crRNA所需要的模板由表3中上下游引物扩增所得(标“F”的为上游引物，标“R”的为下游引物)，随后利用T7 High Yield Transcription Kit(Thermo FisherScientific,America)试剂盒进行crRNA转录，37℃过夜反应。最后，利用RNA Clean&ConcentratorTM-5(Zymo Research,America)纯化试剂盒对转录产物进行纯化。

3、Cas12a切割反应

对步骤1所得纯化扩增产物利用Cas12a进行识别切割，Cas12a切割反应体系包括500nM实施例1得到的Cas12a融合蛋白，500nM步骤2所得纯化后的转录产物，2μL步骤1所得纯化扩增产物，0.5μL RNase inhibitor(TaKaRa,Japan)，NEB buffer 3.1和水补齐20μL。37℃，反应15分钟，得到切割产物。

4、TSDR反应

按照下表1制备TSDR反应体系：将所得体系添加10X TAE buffer、Mg²⁺、Na⁺、A、B、C、F、G于95℃孵育2min后冷却至室温；而后向体系中添加D(8bp-Overhang)室温孵育1h；然后向体系中添加E，并迅速进行荧光信号检测，完成TSDR反应；整个过程中用荧光定量仪(ABIQuantStudio 3)，每10s/cycle进行荧光信号检测。表1中，10X TAE buffer(400mM Tris-醋酸，20mM EDTA，冰醋酸调PH至8)；

A：由A1、A2、A3、A4依次连接得到的单链DNA，结构式为5′-A1-A2-A3-A4-3′，当待测样本DNA含有目的突变时，A3与待测样本DNA(或待测样本的RPA扩增产物)被Cas12a切割所产生的两个8bp-overhang中的一个反向互补，A的序列为 (序列3)，加粗部分为A1，单下划线部分为A2，双下划线部分为A3，N为A、T、C、G，虚下划线部分为A4；

B：与A4反向互补的单链DNA，序列为(序列4)；

C：由C1、C2依次连接得到的单链DNA，结构式为5′-C1-C2-3′，C1与A2反向互补，C的序列为(序列5)，单下划线部分为C1，斜体部分为C2；/>

D：步骤3所得切割产物；

E：由E1、E2依次连接得到的单链DNA，结构式为5′-E1-E2-3′，E1与A3的5′端的4个核苷酸反向互补，E2与C1序列相同，E的序列为(序列6)，N为A、T、C、G，双下划线部分为E1，无下划线部分为E2；

F：序列与C2反向互补、3′末端标记有荧光淬灭基团Q的单链DNA，序列为 (序列7)；

G：序列与A1反向互补、5′末端标记有荧光基团F的单链DNA，序列为 (序列8)；荧光基团F所发荧光能被F中的荧光淬灭基团Q淬灭。

A1、A2、A3、A4、B、C1、C2、E1、E2、F、G除上述描述的互补情况外，彼此间不相同或互补，且均与待测样本DNA不相同或互补。

各序列间的关系如图2中a所示。

表1、TSDR反应体系

注：“/”表示不添加该试剂。

当待测样本DNA的RPA扩增产物被Cas12a切割产生8bp-overhang(即待测样本DNA含有目的突变)时，该8bp-overhang可与A3相结合，阻止进攻链E链与A链结合，导致E链很难将C链进行置换，从而荧光基团F被荧光淬灭基团Q继续猝灭(图3中b)，即TSDR反应结束后体系无荧光信号发出或仅含有本底荧光信号。而当待测样本DNA的RPA扩增产物不被Cas12a切割(即待测样本DNA不含有目的突变)时，体系中不存在8bp-overhang，进攻链E链很容易与A链结合，并将C链置换掉，荧光淬灭基团Q无法继续对荧光基团F进行猝灭，从而荧光基团F显示荧光(图3中c)，即TSDR反应结束后体系有较高的荧光信号发出。

二、RPA-Cas12a-TSDR可有效检测突变

选取EGFR基因常见的三个突变位点(L858R，T790M，delE746-A750)为靶标进行检测。合成序列9所示的EGFR野生型基因与序列10所示的含有三个突变位点的EGFR突变型基因。L858R突变位点为序列9的第2573位核苷酸，野生型为T，突变型为G；T790M突变位点为序列9的第2369位核苷酸，野生型为C，突变型为T；delE746-A750突变位点为序列9的第2236-2250位核苷酸，野生型为序列9的第2236-2250位，突变型为缺失序列9的第2236-2250位。

1、RPA扩增

按照步骤一中1的RPA扩增方法，分别利用表2中的L858R-RPA-F与L858R-RPA-R、T790M-RPA-F与T790M-RPA-R、del-RPA-F与del-RPA-R组成的三对引物，以合成的EGFR野生型基因为模板进行RPA扩增，得到L858R位点野生型扩增产物(图3中a，EGFR-WT)、T790M位点野生型扩增产物、delE746-A750位点野生型扩增产物；分别利用表2中的L858R-RPA-F与L858R-RPA-R、T790M-RPA-F与T790M-RPA-R、del-RPA-F与del-RPA-R组成的三对引物，以合成的EGFR突变型基因为模板进行RPA扩增，得到L858R位点突变型扩增产物(图3中a，EGFR-MT)、T790M位点突变型扩增产物、delE746-A750位点突变型扩增产物。然后按照步骤一中1的方法对所得各扩增产物分别进行纯化。

表2、RPA扩增引物

注：大写字母为人为引入错配核苷酸，以获得Cas12a识别所需的PAM序列，L858R等SNP突变位点位于PAM序列下游第15个核苷酸处。

2、crRNA转录

按照步骤一中2的crRNA转录方法，对表3中的crRNA-F与L858R-R互相扩增所得到的双链DNA分子进行转录，得到L858R转录产物。然后按照步骤一中2的方法进行纯化。L858R转录产物的序列为GAAUUUCUACUGUUGUAGAUCACAGAUUUUGGGCGGG。

按照步骤一中2的crRNA转录方法，对表3中的crRNA-F与T790M-R互相扩增所得到的双链DNA分子进行转录，得到T790M转录产物。然后按照步骤一中2的方法进行纯化。T790M转录产物的序列为GAAUUUCUACUGUUGUAGAUCGUGCAGCUCAUCAUGC。

按照步骤一中2的crRNA转录方法，对表3中的crRNA-F与del-R互相扩增所得到的双链DNA分子进行转录，得到delE746-A750转录产物。然后按照步骤一中2的方法进行纯化。delE746-A750转录产物的序列为GAAUUUCUACUGUUGUAGAUGGAGAUGUCUUGAUAGC。

表3、crRNA转录模板所需引物

注：crRNA-F与L858R-R、T790M-R、del-R、SARS-R、N501Y-R、D614G-R的加粗部分反向互补；下划线部分特异识别RPA产物。

3、Cas12a切割反应

按照步骤一中3的方法，以步骤1得到的L858R位点突变型扩增产物作为待测DNA，利用步骤2得到的纯化后的L858R转录产物以及实施例1得到的Cas12a融合蛋白进行Cas12a切割反应，得到L858R突变型切割产物(图3中b)。利用步骤1得到的L858R位点野生型扩增产物作为对照，得到L858R野生型对照切割产物。

按照步骤一中3的方法，以步骤1得到的T790M位点突变型扩增产物作为待测DNA，利用步骤2得到的纯化后的T790M转录产物以及实施例1得到的Cas12a融合蛋白进行Cas12a切割反应，得到T790M突变型切割产物。利用步骤1得到的T790M位点野生型扩增产物作为对照，得到T790M野生型对照切割产物。

按照步骤一中3的方法，以步骤1得到的delE746-A750位点突变型扩增产物作为待测DNA，利用步骤2得到的纯化后的delE746-A750转录产物以及实施例1得到的Cas12a融合蛋白进行Cas12a切割反应，得到delE746-A750突变型切割产物。利用步骤1得到的delE746-A750位点野生型扩增产物作为对照，得到delE746-A750野生型对照切割产物。

4、TSDR反应

按照步骤一中4的方法，检测步骤3中所得各切割产物的TSDR反应荧光信号。L858R突变型切割产物、L858R野生型对照切割产物检测所用A为表4中A-L858R(6LNA)，E为表4中E-L858R-4nt，F中的荧光淬灭基团Q为BHQ1，G中的荧光基团F为FAM；T790M突变型切割产物、T790M野生型对照切割产物检测所用A为表4中A-T790M，E为表4中E-T790M，F中的荧光淬灭基团Q为BHQ1，G中的荧光基团F为FAM；delE746-A750突变型切割产物、delE746-A750野生型对照切割产物检测所用A为表4中A-delE746-A750，E为表4中E-delE746-A750，F中的荧光淬灭基团Q为BHQ1，G中的荧光基团F为FAM。

选取每个样品终点荧光值进行计算ΔFU＝【F(t)-F(NO-E)】，F(t)为突变型检测体系的荧光信号，F(NO-E)为NO-E对照体系的荧光信号。

表4、TSDR系统核苷酸序列

注：加粗部分为8bp-overhang互补区域；下划线标注为LNA修饰。

RPA-Cas12a-TSDR系统对EGFR基因三个突变位点(L858R，T790M，delE746-A750)的检测结果如图4中a-c所示，三个突变位点的野生型与突变型的ΔFU均存在显著差异(图4中d-f)，说明，RPA-Cas12a-TSDR系统可有效对del缺失突变及SNP突变进行检测。

三、RPA-Cas12a-TSDR检测方法的优化

1、8bp-overhang锁核苷酸的优化

通过两条引物退火形成8bp-overhang，利用TSDR系统进行检测，并对该检测系统进行优化。因为8bp碱基互补配对不稳定，因此发明人在其互补区域引入锁核酸修饰，并对引入不同数量的锁核酸修饰进行优化。

通过检测EGFR基因的突变位点(L858R)确定8bp-overhang中不同数量的锁核酸修饰对实验结果的影响，具体按照步骤二中1-4的方法，将A-L858R(6LNA)替换为A-L858R(0LNA)、A-L858R(3LNA)或A-L858R(6LNA)，其他步骤均不变，计算ΔFU。

8bp-overhang中引入不同数量的锁核酸，发现TSDR系统检测结果存在差异。如图5中a-d所示，当引入6个锁核酸修饰且修饰位于SNP位点时，其荧光差异显著。说明，随着锁核酸引入数量的增加，其荧光信号越低，且当SNP位点处带有LNA修饰，TSDR系统对野生型和突变型区分最明显。

2、E中E1长度的优化

接下来对进攻链E不同脚趾长度(即E1的长度)进行优化。分别选取3、4、5nt，3种长度的脚趾进行检测。具体按照步骤二中1-4的方法，将E-L858R-4nt替换为E-L858R-3nt、E-L858R-4nt或E-L858R-5nt，其他步骤均不变，计算ΔFU。

结果如图5中e-h所示，随着脚趾长度的增加，其荧光信号增强。当脚趾为5nt时，发现野生型和突变型均存在较高的荧光信号，无法有效区分。脚趾长度为3nt时，发现野生型和突变型可有效区分，但其荧光信号均低，达不到预期的效果。而当选取脚趾长度为4nt时发现，野生型和对照均有较强的荧光信号，突变型荧光信号较低，野生型与突变型差异明显。此外，对其ΔFU进行计算发现当脚趾长度为3nt和4nt时野生型和突变型差异显著。因此，脚趾长度为4nt进行为最佳长度。

3、温度的优化

最后探讨添加D(8bp-overhang)后的不同孵育温度对TSDR检测系统的影响。具体按照步骤二中1-4的方法，将步骤4中的孵育温度由25℃分别替换为15℃、20℃、30℃或35℃，其他步骤均不变，计算ΔFU。

结果如图5中i-l所示，不同的温度下荧光信号检测结果存在差异。当温度过低时，野生型和突变型差异不明显，温度过高时，野生型和突变型差异降低。对其ΔFU计算发现，在25℃时，野生型和突变型差异最显著。当温度升高至30-35℃时，其差异显著性降低。因此，最佳孵育温度为室温(25-27℃)。

实施例3、RPA-Cas12a-TSDR系统检测基因突变位点的灵敏度

首先验证TSDR系统检测Cas12a切割产物的最低浓度为多少。接下来，按照实施例2中步骤2的1-4的方法，利用TSDR系统对EGFR基因的三个突变靶标在不同浓度下进行了检测，将L858R突变型切割产物、T790M突变型切割产物、delE746-A750突变型切割产物在TSDR反应体系中的浓度均设置为10nM(≈6×10⁹拷贝/μL)、20nM(1.2×10¹⁰拷贝/μL)、40nM(1.8×10¹⁰拷贝/μL)、60nM(3.6×10¹⁰拷贝/μL)、80nM(4.8×10¹⁰拷贝/μL)、100nM(6×10¹⁰拷贝/μL)，其他步骤均不变。检测结果如图6中a-c所示，TSDR系统最低均可以检测到10nM(≈6×10⁹拷贝/μL)的切割产物。

此外，还对不同浓度的检测底物的ΔFU值进行了线性化分析，其R²均达到0.9以上，证明其存在很好的线性关系(图6中d-f)。

接下来，发明人又检测了RPA-Cas12a-TSDR系统最低可以检测到多少拷贝的核酸分子。按照实施例2中步骤二的1-4的方法，将底物(即待测样本DNA)核酸浓度稀释成不同的梯度浓度(即10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝/μL)，然后进行RPA扩增反应。RPA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证结果如图7中a所示，RPA扩增可有效对单个拷贝的核酸分子进行扩增。最后，利用TSDR系统对单个拷贝的扩增产物的Cas12a切割产物进行检测发现，该系统可有效对其荧光信号进行检测，且野生型和突变型区分明显(图7中b-d)。此外，对其ΔFU计算发现，野生型和突变型均存在显著差异(图7中e)。

RPA-Cas12a-TSDR系统检测低丰度突变体：按照实施例2中步骤2的1-4的方法，按照不同的比例进将三种突变的野生型和突变型切割产物混合作为D加至TSDR反应体系中，其他步骤均不变，然后利用该系统进行检测。野生型和突变型切割产物的摩尔比设置为90:10、95:5、99:1、100:0。

检测结果如图8中a-c所示，RPA-Cas12a-TSDR系统可以检测到1％的突变型靶标(野生型和突变型切割产物的摩尔比为99:1)。另外，对其ΔFU计算发现，1％的突变型靶标与野生型存在显著性差异(图8中d-f)。

实施例4、RPA-Cas12a-TSDR多重检测EGFR基因的三个突变位点

按照实施例2步骤二中1-4的方法，将A-L858R(6LNA)、A-T790M、A-delE746-A750等量混合，将得到的混合物(A-L858R(6LNA)、A-T790M、A-delE746-A750的浓度均为100nM)替换表1中的A添加至TSDR反应体系中；将L858R突变检测所用G记为G-L858R(荧光基团为FAM，序列同上文G的序列)，将T790M突变检测所用G记为G-T790M(荧光基团为ROX，序列同上文G的序列)，将delE746-A750突变检测所用G记为G-delE746-A750(荧光基团为HEX，序列同上文G的序列)，将G-L858R、G-T790M、G-delE746-A750等量混合，将得到的混合物(G-L858R、G-T790M、G-delE746-A750的浓度均为100nM)替换表1中的G添加至TSDR反应体系中；将检测靶标作为D添加至TSDR反应体系中；将E-L858R-4nt、E-T790M与E-delE746-A750等量混合，将得到的混合物(E-L858R-4nt、E-T790M与E-delE746-A750的浓度均为100nM)替换表1中的E添加至TSDR反应体系中，其他步骤均不变，进行L858RT790M与delE746-A750三种突变的同时检测。

检测靶标为：L858R突变型切割产物、T790M突变型切割产物与delE746-A750突变型切割产物的等体积混合物(记为检测靶标1)，以去离子水为检测靶标2，L858R突变型切割产物与delE746-A750突变型切割产物的等体积混合物(记为检测靶标3)，L858R突变型切割产物(记为检测靶标4)，L858R突变型切割产物与T790M突变型切割产物的等体积混合物(记为检测靶标5)，T790M突变型切割产物与delE746-A750突变型切割产物的等体积混合物(记为检测靶标6)，T790M突变型切割产物(记为检测靶标7)，delE746-A750突变型切割产物(记为检测靶标8)。

结果如图9所示，RPA-Cas12a-TSD系统可以达到同时检测3个靶标，且对其荧光值进行计算，三个突变靶标均与野生型存在差异，且正交性较好。另外，RPA-Cas12a-TSD系统可以检测不同的靶标组合。

实施例5、RPA-Cas12a-TSDR系统检测细胞样品

细胞系H1975为EGFR基因T790M和L858R双突变株，细胞系H1650为delE746-A750缺失突变株。接下来，对这两株细胞系进行培养并进行核酸提取，将提取的核酸作为待测样本DNA按照实施例2步骤二中1-4的方法进行检测，利用实施例2步骤二中三种野生型扩增产物作为野生型对照。

检测结果如图中10中a-c所示，该系统可成功对这两株突变细胞系进行检测。对其荧光值计算发现，三个突变型均与野生型存在差异显著性(图10中d)。

实施例6、RPA-Cas12a-TSDR系统检测SARS-CoV-2S基因及其突变位点

按照实施例2中步骤二的1-4的方法，分别将SARS-CoV-2S基因(南京金斯瑞生物科技有限公司，其序列为序列表中序列11)、SARS-CoV-2S基因的N501Y突变体(南京金斯瑞生物科技有限公司，其序列为序列表中序列12)、SARS-CoV-2S基因的D614G突变体(南京金斯瑞生物科技有限公司，其序列为序列表中序列12)作为待测样本DNA，进行检测。SARS-CoV-2S基因所用RPA扩增引物为表2中SARS-RPA-F与SARS-RPA-R，所用crRNA转录引物为表3中crRNA-F与SARS-R，所用A为表4中A-SARS，E为表4中E-SARS，荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；N501Y突变体所用RPA扩增引物为N501Y-RPA-F和N501Y-RPA-R，所用crRNA转录引物为表3中crRNA-F与N501Y-R，所用A为表4中A-N501Y，E为表4中E-N501Y，荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；D614G突变体所用RPA扩增引物为D614G-RPA-F和D614G-RPA-R，所用crRNA转录引物为表3中crRNA-F与D614G-R，所用A为表4中A-D614G，E为表4中E-D614G，荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

检测结果如图11中a-c所示，该系统可有效对SARS-CoV-2S基因及其突变体进行检测，其ΔFU显示突变型和野生型也存在显著性差异(图11中d)。

此外，发明人还按照实施例4的方法利用不同的荧光基团对SARS-CoV-2S基因及其突变体进行同时多重检测，具体如下：

按照实施例2步骤二中1-4的方法，将表4中A-SARS、A-N501Y、A-D614G等量混合，将得到的混合物(A-SARS、A-N501Y、A-D614G的浓度均为100nM)替换表1中的A添加至TSDR反应体系中；将SARS-CoV-2S基因突变检测所用G记为G-SARS(荧光基团为FAM，序列同上文G的序列)，将N501Y突变检测所用G记为G-N501Y(荧光基团为HEX，序列同上文G的序列)，将D614G突变检测所用G记为G-D614G(荧光基团为ROX，序列同上文G的序列)，将G-SARS、G-N501Y、G-D614G等量混合，将得到的混合物(G-SARS、G-N501Y、G-D614G的浓度均为100nM)替换表1中的G添加至TSDR反应体系中；将检测靶标作为D添加至TSDR反应体系中；将表4中E-SARS、E-N501Y与E-D614G等量混合，将得到的混合物(E-SARS、E-N501Y与E-D614G的浓度均为100nM)替换表1中的E添加至TSDR反应体系中，其他步骤均不变，进行SARS-CoV-2S基因及其两种突变的同时检测。

检测靶标如下：

检测靶标1：SARS-RPA-F与SARS-RPA-R对SARS-CoV-2S基因的RPA扩增产物的Cas12a切割产物、N501Y-RPA-F和N501Y-RPA-R对SARS-CoV-2S基因N501Y突变体的RPA扩增产物的Cas12a切割产物、D614G-RPA-F和D614G-RPA-R对SARS-CoV-2S基因D614G突变体的RPA扩增产物的Cas12a切割产物的等体积混合物；

检测靶标2：去离子水；

检测靶标3：SARS-RPA-F与SARS-RPA-R对SARS-CoV-2S基因的RPA扩增产物的Cas12a切割产物、N501Y-RPA-F和N501Y-RPA-R对SARS-CoV-2S基因N501Y突变体的RPA扩增产物的Cas12a切割产物的等体积混合物；

检测靶标4：SARS-RPA-F与SARS-RPA-R对SARS-CoV-2S基因的RPA扩增产物的Cas12a切割产物；

检测靶标5：SARS-RPA-F与SARS-RPA-R对SARS-CoV-2S基因的RPA扩增产物的Cas12a切割产物D614G-RPA-F和D614G-RPA-R对SARS-CoV-2S基因D614G突变体的RPA扩增产物的Cas12a切割产物的等体积混合物。

检测结果如图中12所示，该系统可成功对SARS-CoV-2S基因及其突变体进行多重检测，且ΔFU结果也显示其突变型与野生型存在显著性,且正交性较好)。另外，RPA-Cas12a-TSD系统可以检测不同的靶标组合。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>北京化工大学

<120>一种核酸检测系统及其在检测DNA突变中的应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3936

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgagtatct accaggaatt tgtcaataaa tacagcctgt ctaaaacgct ccgctttgaa 60

ctgattccac agggcaaaac actggagaac atcaaagccc gcggcctgat tctggacgat 120

gaaaaacgtg caaaggatta taaaaaagcc aaacagatca ttgacaagta tcatcaattc 180

tttattgagg aaattctctc tagtgtatgc atttcagagg atctgctgca aaactattcg 240

gatgtgtact ttaaactgaa gaaatctgat gatgacaact tgcagaagga ctttaagtcg 300

gctaaggaca ccatcaagaa acagattagt gaatatatta aagactccga aaaattcaaa 360

aatctgttta atcagaatct gattgacgcc aagaaaggcc aggaatcaga cctgatcctg 420

tggttgaaac agagtaagga taacggtatt gaacttttta aagcgaattc ggatattacc 480

gacatcgacg aagcattgga aattattaag agctttaaag gttggactac ttatttcaaa 540

ggatttcatg agaaccgcaa aaatgtgtat tcaagtaacg atattccgac aagcatcatt 600

taccgtattg tagacgataa cctgccgaaa tttctggaaa ataaagcgaa gtacgaaagc 660

cttaaagata aagcgcccga agccattaac tacgagcaga ttaaaaaaga tttggccgag 720

gaacttacct tcgatattga ttacaagacc tctgaagtca atcagcgtgt gttttcactg 780

gacgaagtct ttgagatcgc caacttcaac aactatctga accagtccgg cattacgaaa 840

tttaacacca ttattggcgg gaaattcgtt aatggtgaaa acactaagcg gaaaggcatt 900

aacgaatata tcaatctgta ctcacagcaa atcaatgaca aaactttgaa aaaatacaag 960

atgtctgtcc tcttcaaaca gattctctca gataccgaaa gcaaatcttt cgtcatcgac 1020

aaattagagg atgacagcga tgtcgtcact actatgcaga gcttttatga acaaattgcc 1080

gcgtttaaaa cggtagaaga gaaatcaatc aaagaaaccc tgtcgctcct gttcgatgat 1140

ctgaaagcgc agaaactcga cctgtctaag atttacttca aaaatgataa aagtctgacg 1200

gatctgagcc agcaggtctt tgacgactat tcagtaattg gcacggctgt attggaatat 1260

atcactcaac agattgcccc gaaaaactta gataacccgt ctaaaaaaga acaggaactg 1320

atcgctaaaa aaacagagaa agcaaaatat ctgagcttgg aaactatcaa attagcgctg 1380

gaggagttca ataaacaccg tgacattgat aaacagtgcc gctttgagga gattctggcg 1440

aacttcgcgg cgattcccat gatcttcgat gaaattgcgc agaataaaga taacttggca 1500

cagatcagca tcaaatatca aaaccaaggt aagaaagatt tgcttcaagc ttccgcggag 1560

gatgatgtga aggccatcaa ggatctgctg gatcagacca ataacctcct gcataaactt 1620

aaaattttcc atattagtca gtctgaagat aaagcgaata ttctggacaa agatgaacac 1680

ttttatttag tgttcgaaga gtgctatttt gaactggcta acattgtccc gctgtacaac 1740

aagattcgta actatatcac tcagaaaccg tattccgacg aaaaattcaa gctcaatttc 1800

gaaaattcca cgctggcaaa cggttgggac aaaaacaaag aaccggataa tacagcgatc 1860

ttatttatca aagatgataa gtactatctc ggcgtgatga acaaaaagaa caataagatt 1920

ttcgatgaca aggcaattaa agagaacaaa ggcgaaggct acaaaaaaat cgtatataaa 1980

ctgctgccgg gtgcgaacaa aatgttacca aaagtgtttt tctcggcgaa aagtatcaaa 2040

ttttacaacc ctagcgagga catcttacgc attcgtaatc atagcacgca cactaaaaat 2100

ggatctccgc aaaaaggata tgaaaagttt gaattcaaca ttgaagattg ccgtaaattc 2160

attgatttct acaaacagag tatttccaaa catccggaat ggaaagactt tggttttcgt 2220

ttcagcgata ctcagcgcta taactcgatc gacgaattct accgtgaggt agaaaatcag 2280

ggctataaac tcacgtttga gaatattagt gagagctaca ttgattccgt ggtcaaccag 2340

gggaaattgt acctgtttca gatttataat aaagatttct cggcctatag taaaggtcgg 2400

ccaaacctgc ataccctgta ctggaaagcc ctgtttgatg aacgcaacct gcaggacgtc 2460

gtttacaaat taaacggcga agcggaactg ttttatcgta aacagtctat tcctaaaaaa 2520

atcacgcatc ctgccaagga agctattgca aacaagaata aagataaccc aaagaaagaa 2580

tctgtcttcg aatatgatct tattaaagat aaacggttca cggaggacaa gtttttcttt 2640

cactgcccaa ttaccattaa tttcaaatct tcaggtgcta ataaattcaa cgatgaaatt 2700

aatttgttgc tgaaagaaaa agctaacgat gtgcatatcc tgtcgatcga tcgtggcgaa 2760

cgccatcttg cgtactacac cctcgtcgac ggcaagggaa atatcatcaa acaggacact 2820

tttaatatca ttgggaatga tcgtatgaaa acgaattacc atgataaact tgcagccatt 2880

gagaaggacc gggatagcgc gcggaaagac tggaagaaga ttaacaatat caaagagatg 2940

aaagaaggtt acctgagtca agtggtccat gagattgcta agcttgttat cgagtataac 3000

gcaattgtgg tcttcgaaga tcttaatttt ggttttaagc ggggtcgttt taaagtcgaa 3060

aaacaggtct atcagaaact ggagaaaatg ctgattgaaa aactgaacta tcttgtgttt 3120

aaagataacg aattcgataa aaccggcggc gttcttcgtg cctatcaact gacagcaccg 3180

ttcgaaacat ttaaaaaaat gggcaaacag accggaatca tttactatgt gcccgccggg 3240

ttcacctcaa agatttgtcc tgtgacgggc ttcgtcaatc aactctaccc aaaatacgaa 3300

tcggttagta aaagtcagga attcttctcc aagtttgata agatctgtta caacctggac 3360

aaagggtact ttgagtttag ctttgattac aaaaactttg gagacaaggc ggccaaagga 3420

aagtggacta tcgcttcctt tggcagtcgg ctgattaact tccgtaactc ggataagaac 3480

cacaactggg acacacgtga agtttatccg actaaggagc tggaaaaact gttgaaagat 3540

tactcgattg aatacggcca tggtgaatgc attaaagcag cgatttgtgg tgaaagtgat 3600

aagaaatttt tcgcaaaact gacgtcagta cttaacacga ttctgcagat gcgtaattcg 3660

aaaaccggca cggagctgga ttacttaatc tctcctgtgg cagatgtgaa cggcaatttt 3720

ttcgactcgc gtcaggcgcc gaaaaatatg ccgcaggatg ccgatgcgaa cggcgcgtat 3780

cacattggct tgaaggggct gatgttgctc gggcgcatta aaaacaatca agaaggcaaa 3840

aagttaaacc tggtcattaa aaacgaagag tacttcgaat ttgttcaaaa tcgcaataac 3900

gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactga 3936

<210> 2

<211> 1311

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val

1010 1015 1020

Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu

1025 1030 1035

Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg

1040 1045 1050

Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly

1055 1060 1065

Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser

1070 1075 1080

Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys

1085 1090 1095

Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp

1100 1105 1110

Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe

1115 1120 1125

Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr

1130 1135 1140

Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu

1160 1165 1170

Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly

1175 1180 1185

Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe

1190 1195 1200

Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg

1205 1210 1215

Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu

1265 1270 1275

Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu

1280 1285 1290

Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn Ala Ala Ala Leu Glu His His His

1295 1300 1305

His His His

1310

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(46)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

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tccgatcg 68

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cgatcggaca tgagcacggg tt 22

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

gttgagggct gaagacatga attattcaag tgacgact 38

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

nnnngttgag ggctgaagac atgaat 26

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

agtcgtcact tgaata 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ggccgcggac tcagca 16

<210> 9

<211> 3633

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360

gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420

caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480

agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540

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gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320

gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380

gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440

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gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740

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catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920

cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980

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caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160

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ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060

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accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180

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agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300

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<210> 10

<211> 3618

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360

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agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540

cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600

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gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720

acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780

aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840

cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900

gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960

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ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080

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ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200

atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260

gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320

gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380

gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440

tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500

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agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620

cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680

gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740

cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800

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catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920

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caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160

ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220

cccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc aacaaggaaa tcctcgatga agcctacgtg 2280

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gtgcagctca tcatgcagct catgcccttc ggctgcctcc tggactatgt ccgggaacac 2400

aaagacaata ttggctccca gtacctgctc aactggtgtg tgcagatcgc aaagggcatg 2460

aactacttgg aggaccgtcg cttggtgcac cgcgacctgg cagccaggaa cgtactggtg 2520

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gagaaagaat accatgcaga aggaggcaaa gtgcctatca agtggatggc attggaatca 2640

attttacaca gaatctatac ccaccagagt gatgtctgga gctacggggt gaccgtttgg 2700

gagttgatga cctttggatc caagccatat gacggaatcc ctgccagcga gatctcctcc 2760

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atcatggtca agtgctggat gatagacgca gatagtcgcc caaagttccg tgagttgatc 2880

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gacatggacg acgtggtgga tgccgacgag tacctcatcc cacagcaggg cttcttcagc 3060

agcccctcca cgtcacggac tcccctcctg agctctctga gtgcaaccag caacaattcc 3120

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tgtgtcaaca gcacattcga cagccctgcc cactgggccc agaaaggcag ccaccaaatt 3480

agcctggaca accctgacta ccagcaggac ttctttccca aggaagccaa gccaaatggc 3540

atctttaagg gctccacagc tgaaaatgca gaatacctaa gggtcgcgcc acaaagcagt 3600

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<210> 11

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

atgttcgttt tcctggttct gctgccgctg gttagcagcc aatgcgtgaa tctgaccacc 60

cgcacccaac tgccgccggc gtacaccaac agcttcaccc gtggtgttta ctatccggac 120

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attcgtggtt ggatttttgg caccaccctg gacagcaaaa cccagagcct gctgatcgtt 360

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ctgggcgttt actatcacaa gaacaacaaa agctggatgg agagcgaatt tcgtgtttat 480

agcagcgcga acaactgcac ctttgagtac gtgagccagc cgttcctgat ggacctggaa 540

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agcgcgctgg agccgctggt tgacctgccg atcggtatta acatcacccg ttttcaaacc 720

ctgctggcgc tgcaccgtag ctacctgacg ccgggtgaca gcagcagcgg ttggaccgct 780

ggtgctgcgg cgtactatgt tggttacctg caaccgcgta ccttcctgct gaaatacaac 840

gaaaacggca ccatcaccga tgcggttgat tgcgcgctgg acccgctgag cgaaaccaag 900

tgcaccctga agagcttcac cgtggagaag ggtatttatc agaccagcaa cttccgtgtg 960

caaccgaccg aaagcattgt tcgttttccg aacatcacca acctgtgccc gtttggcgag 1020

gttttcaacg cgacccgttt cgcgagcgtg tatgcgtgga accgtaaacg tatcagcaac 1080

tgcgttgcgg actatagcgt gctgtacaac agcgcgagct tcagcacctt taagtgctat 1140

ggtgtgagcc cgaccaaact gaacgatctg tgctttacca acgtttacgc ggatagcttc 1200

gtgattcgtg gcgacgaggt tcgtcagatc gcgccgggtc aaaccggcaa gattgcggac 1260

tacaactata aactgccgga cgatttcacc ggctgcgtta tcgcgtggaa cagcaacaac 1320

ctggatagca aagtgggtgg caactacaac tatctgtacc gtctgtttcg taagagcaac 1380

ctgaaaccgt tcgagcgtga cattagcacc gaaatctacc aggcgggtag caccccgtgc 1440

aacggtgttg agggctttaa ctgctatttc ccgctgcaaa gctacggttt ccaaccgacc 1500

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ccggcgaccg tgtgcggccc gaagaagagc accaacctgg tgaagaacaa atgcgtgaac 1620

ttcaacttta acggcctgac cggcaccggc gtgctgaccg agagcaacaa gaaattcctg 1680

ccgtttcagc aattcggtcg tgacatcgcg gataccaccg atgcggtgcg tgacccgcag 1740

accctggaga tcctggacat caccccgtgc agcttcggtg gcgttagcgt gatcacgccg 1800

ggcaccaaca ccagcaacca ggttgcggtg ctgtatcaag acgttaactg caccgaagtt 1860

ccggtggcga ttcacgcgga tcagctgacc ccgacctggc gtgtgtacag caccggcagc 1920

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gaatgcgaca ttccgatcgg tgcgggcatt tgcgcgagct accagaccca aaccaacagc 2040

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agcgtgacca ccgagatcct gccggttagc atgaccaaaa ccagcgtgga ctgcaccatg 2220

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ctgctgttca acaaggttac cctggcggat gcgggtttca tcaaacagta tggtgattgc 2520

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accattacca gcggttggac ctttggtgcg ggtgcggcgc tgcaaatccc gtttgcgatg 2700

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ctgagccgtc tggacaaagt tgaggcggaa gtgcaaattg accgtctgat caccggccgt 3000

ctgcaaagcc tgcaaaccta tgtgacccag caactgattc gtgcggcgga aattcgtgcg 3060

agcgcgaacc tggcggcgac caagatgagc gagtgcgttc tgggtcagag caagcgtgtg 3120

gacttttgcg gtaaaggcta tcacctgatg agcttcccgc agagcgcgcc gcacggcgtt 3180

gtgtttctgc acgttaccta cgtgccggcg caagaaaaga actttaccac cgcgccggcg 3240

atctgccatg atggtaaagc gcactttccg cgtgaaggtg ttttcgtgag caacggcacc 3300

cactggtttg ttacccagcg taacttctac gagccgcaaa tcattaccac cgacaacacc 3360

ttcgtgagcg gtaactgcga tgttgtgatt ggcatcgtta acaacaccgt gtatgacccg 3420

ctgcaaccgg agctggacag cttcaaagag gaactggata aatacttcaa gaaccacacc 3480

agcccggacg ttgatctggg tgacattagc ggcatcaacg cgagcgttgt gaacattcaa 3540

aaggagatcg accgtctgaa cgaagtggcg aaaaacctga acgaaagcct gatcgacctg 3600

caagagctgg gcaagtatga acaatacatt aaatggccgt ggtacatttg gctgggtttc 3660

atcgcgggcc tgattgcgat cgttatggtg accatcatgc tgtgctgcat gaccagctgt 3720

tgcagctgcc tgaagggttg ttgcagctgc ggcagctgct gcaagtttga tgaggacgat 3780

agcgagccgg ttctgaaagg cgtgaagctg cattacacct aa 3822

<210> 12

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

atgttcgttt tcctggttct gctgccgctg gttagcagcc aatgcgtgaa tctgaccacc 60

cgcacccaac tgccgccggc gtacaccaac agcttcaccc gtggtgttta ctatccggac 120

aaagtttttc gtagcagcgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc gttctttagc 180

aacgttacct ggttccacgc gatccacgtg agcggcacca acggcaccaa gcgtttcgac 240

aacccggtgc tgccgtttaa cgatggtgtt tacttcgcga gcaccgagaa gagcaacatc 300

attcgtggtt ggatttttgg caccaccctg gacagcaaaa cccagagcct gctgatcgtt 360

aacaacgcga ccaacgtggt tattaaggtg tgcgagttcc aattttgcaa cgatccgttc 420

ctgggcgttt actatcacaa gaacaacaaa agctggatgg agagcgaatt tcgtgtttat 480

agcagcgcga acaactgcac ctttgagtac gtgagccagc cgttcctgat ggacctggaa 540

ggcaagcaag gcaacttcaa aaacctgcgt gagttcgtgt tcaagaacat tgatggttac 600

ttcaaaatct acagcaagca caccccgatc aacctggttc gtgacctgcc gcagggtttt 660

agcgcgctgg agccgctggt tgacctgccg atcggtatta acatcacccg ttttcaaacc 720

ctgctggcgc tgcaccgtag ctacctgacg ccgggtgaca gcagcagcgg ttggaccgct 780

ggtgctgcgg cgtactatgt tggttacctg caaccgcgta ccttcctgct gaaatacaac 840

gaaaacggca ccatcaccga tgcggttgat tgcgcgctgg acccgctgag cgaaaccaag 900

tgcaccctga agagcttcac cgtggagaag ggtatttatc agaccagcaa cttccgtgtg 960

caaccgaccg aaagcattgt tcgttttccg aacatcacca acctgtgccc gtttggcgag 1020

gttttcaacg cgacccgttt cgcgagcgtg tatgcgtgga accgtaaacg tatcagcaac 1080

tgcgttgcgg actatagcgt gctgtacaac agcgcgagct tcagcacctt taagtgctat 1140

ggtgtgagcc cgaccaaact gaacgatctg tgctttacca acgtttacgc ggatagcttc 1200

gtgattcgtg gcgacgaggt tcgtcagatc gcgccgggtc aaaccggcaa gattgcggac 1260

tacaactata aactgccgga cgatttcacc ggctgcgtta tcgcgtggaa cagcaacaac 1320

ctggatagca aagtgggtgg caactacaac tatctgtacc gtctgtttcg taagagcaac 1380

ctgaaaccgt tcgagcgtga cattagcacc gaaatctacc aggcgggtag caccccgtgc 1440

aacggtgttg agggctttaa ctgctatttc ccgctgcaaa gctacggttt ccaaccgacc 1500

tacggtgttg gttaccagcc gtaccgtgtg gttgtgctga gctttgaact gctgcacgcg 1560

ccggcgaccg tgtgcggccc gaagaagagc accaacctgg tgaagaacaa atgcgtgaac 1620

ttcaacttta acggcctgac cggcaccggc gtgctgaccg agagcaacaa gaaattcctg 1680

ccgtttcagc aattcggtcg tgacatcgcg gataccaccg atgcggtgcg tgacccgcag 1740

accctggaga tcctggacat caccccgtgc agcttcggtg gcgttagcgt gatcacgccg 1800

ggcaccaaca ccagcaacca ggttgcggtg ctgtatcaag gcgttaactg caccgaagtt 1860

ccggtggcga ttcacgcgga tcagctgacc ccgacctggc gtgtgtacag caccggcagc 1920

aacgttttcc aaacccgtgc gggttgcctg attggtgcgg agcacgtgaa caacagctat 1980

gaatgcgaca ttccgatcgg tgcgggcatt tgcgcgagct accagaccca aaccaacagc 2040

ccgcgtcgtg cgcgtagcgt tgcgagccag agcatcattg cgtatacgat gagcctgggt 2100

gcggaaaaca gcgtggcgta cagcaacaac agcattgcga tcccgaccaa cttcaccatt 2160

agcgtgacca ccgagatcct gccggttagc atgaccaaaa ccagcgtgga ctgcaccatg 2220

tatatctgcg gcgatagcac cgaatgcagc aacctgctgc tgcaatacgg tagcttttgc 2280

acccaactga accgtgcgct gaccggcatt gcggttgagc aggataaaaa cacccaagaa 2340

gttttcgcgc aggtgaagca aatttacaaa accccgccga tcaaggactt tggtggcttc 2400

aactttagcc agatcctgcc ggacccgagc aagccgagca aacgtagctt tattgaggac 2460

ctgctgttca acaaggttac cctggcggat gcgggtttca tcaaacagta tggtgattgc 2520

ctgggcgaca ttgcggcgcg tgacctgatc tgcgcgcaaa agtttaacgg cctgaccgtg 2580

ctgccgccgc tgctgaccga tgaaatgatt gcgcagtaca ccagcgcgct gctggcgggc 2640

accattacca gcggttggac ctttggtgcg ggtgcggcgc tgcaaatccc gtttgcgatg 2700

caaatggcgt atcgtttcaa cggtattggc gttacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg cgaaccaatt taacagcgcg attggtaaaa tccaggatag cctgagcagc 2820

accgcgagcg cgctgggcaa actgcaagat gttgtgaacc agaacgcgca agcgctgaac 2880

accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggtgcgatta gcagcgtgct gaacgacatc 2940

ctgagccgtc tggacaaagt tgaggcggaa gtgcaaattg accgtctgat caccggccgt 3000

ctgcaaagcc tgcaaaccta tgtgacccag caactgattc gtgcggcgga aattcgtgcg 3060

agcgcgaacc tggcggcgac caagatgagc gagtgcgttc tgggtcagag caagcgtgtg 3120

gacttttgcg gtaaaggcta tcacctgatg agcttcccgc agagcgcgcc gcacggcgtt 3180

gtgtttctgc acgttaccta cgtgccggcg caagaaaaga actttaccac cgcgccggcg 3240

atctgccatg atggtaaagc gcactttccg cgtgaaggtg ttttcgtgag caacggcacc 3300

cactggtttg ttacccagcg taacttctac gagccgcaaa tcattaccac cgacaacacc 3360

ttcgtgagcg gtaactgcga tgttgtgatt ggcatcgtta acaacaccgt gtatgacccg 3420

ctgcaaccgg agctggacag cttcaaagag gaactggata aatacttcaa gaaccacacc 3480

agcccggacg ttgatctggg tgacattagc ggcatcaacg cgagcgttgt gaacattcaa 3540

aaggagatcg accgtctgaa cgaagtggcg aaaaacctga acgaaagcct gatcgacctg 3600

caagagctgg gcaagtatga acaatacatt aaatggccgt ggtacatttg gctgggtttc 3660

atcgcgggcc tgattgcgat cgttatggtg accatcatgc tgtgctgcat gaccagctgt 3720

tgcagctgcc tgaagggttg ttgcagctgc ggcagctgct gcaagtttga tgaggacgat 3780

agcgagccgg ttctgaaagg cgtgaagctg cattacacct aa 3822

Claims

1.一种系统，包括：Cas12a、crRNA与TSDR试剂；

所述crRNA的间隔序列能够识别待测DNA中的目的突变或待测核苷酸；

所述试剂B为与A4反向互补的单链DNA；

所述试剂B′为与A4′反向互补的单链DNA；

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：A3与A3′含有锁核酸修饰；

和/或，A1与A1′的长度均为15-25nt，或15-20nt，或16nt；

和/或，A2与A2′的长度均为20-25nt，或22nt；

和/或，A4与A4′的长度均为20-25nt，或22nt；

和/或，C2与C2′的长度均为15-25nt，或15-20nt，或16nt；

和/或，E2与E2′的长度均为20-25nt，或22nt。

3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：A1与A1′的序列均为序列3的第1-16位；

和/或，A2与A2′的序列均为序列3的第17-38位；

和/或，A3与A3′的序列均为序列3的第39-46位；

和/或，A4与A4′的序列均为序列3的第47-68位；

和/或，所述试剂B与所述试剂B′的序列均为序列4；

和/或，C1与C1′的序列均为序列5的第1-22位；

和/或，C2与C2′的序列均为序列3的第23-38位；

和/或，E2与E2′的序列均为序列6的第5-26位；

和/或，所述试剂F与所述试剂F′的序列均为序列7；

和/或，所述试剂G与所述试剂G′的序列均为序列8。

4.根据权利要求1-3中任一所述的系统，其特征在于：所述crRNA的间隔序列的长度为17nt。

5.根据权利要求1-4中任一所述的系统，其特征在于：所述系统还含有RPA扩增引物，所述RPA扩增引物能扩增含有所述目的突变或待测核苷酸在内的DNA片段。

6.权利要求1-3中任一所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2。

7.一种检测DNA突变的方法，包括：

1)将待酶切DNA利用权利要求1-4中任一所述Cas12a、所述crRNA进行切割，得到切割产物；所述待酶切DNA为待测DNA或利用权利要求5中所述RPA扩增引物对所述待测DNA进行RPA扩增得到的含有Cas12a识别所需的PAM序列的RPA扩增产物；

2)向所述切割产物中加入权利要求1-3中任一所述试剂A、所述试剂B、所述试剂C、所述试剂E、所述试剂F、所述试剂G进行TSDR反应，或加入权利要求1-3中任一所述试剂A′、所述试剂B′、所述试剂C′、所述试剂E′、所述试剂F′、所述试剂G′进行TSDR反应，得到反应产物；

3)按照如下31)或32)确定待测DNA是否含有目的突变：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述TSDR反应在25-27℃下进行。

9.下述任一应用：

X1)权利要求1-5中任一所述的系统在制备检测DNA突变产品中的应用；

X2)权利要求1-5中任一所述的系统在制备检测DNA序列产品中的应用；

X3)权利要求1-5中任一所述的系统在检测DNA突变中的应用；

X4)权利要求1-5中任一所述的系统在检测DNA序列中的应用。

10.下述任一应用：

X1)权利要求1-3中任一所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在制备检测DNA突变产品中的应用；

X2)权利要求1-3中任一所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在制备检测DNA序列产品中的应用；

X3)权利要求1-3中任一所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在检测DNA突变中的应用；

X4)权利要求1-3中任一所述TSDR试剂1或所述TSDR试剂2在检测DNA序列中的应用。