CN113234683A - 一种morn4基因敲除细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种MORN4基因敲除细胞系及其构建方法与应用，是运用了CRISPER/Cas9技术对大鼠心肌细胞中的MORN4基因进行敲除，得到了敲除MORN4基因的心肌细胞系。实验证实：与正常的心肌细胞相比，MORN4基因敲除的心肌细胞增殖受到抑制。以此确定本发明可以应用在了解心肌细胞增殖能力的机制以及如何控制心肌细胞增殖过程，也表明心肌细胞增殖可能是修复心脏的有效策略。

Description

一种MORN4基因敲除细胞系及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种MORN4基因敲除细胞系及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

心脏病的危害极大，威胁人类的生命。有数据显示，心脏病已成人类健康的头号杀手，全世界每年有1700万人死于心脏病，每3例因病死亡者中，就有1例是心脏病患者。因此，寻求预防和治疗心脏病的方法非常迫切。

MORN4是包含4个MORN motif的蛋白，MORN motif广泛存在于动物、植物、原生生物的蛋白中，数量从2-17不等。研究发现，干扰MORN4在心脏病治疗中具有重要作用，比如能够抑制H9c2细胞和原代心肌细胞的自噬流来促进H9c2细胞和原代心肌细胞的凋亡，能够抑制心肌细胞增殖，为通过心肌细胞增殖方式修复心脏损伤提供可能。

心肌细胞增殖对于心脏损伤修复具有重要作用，但目前心肌细胞增殖的机制研究还不完善，研制一种有效的调控研究工具成为亟需解决的问题。经检索，有关MORN4基因敲除细胞系及其构建方法与应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种MORN4基因敲除细胞系及其构建方法与应用。

本发明所述MORN4基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于：是运用CRISPR/Cas9技术对细胞中的MORN4基因进行敲除；其中敲除MORN4基因的两个SgRNA分别命名为SgRNA1和SgRNA2，SgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SgRNA作用位点位于大鼠MORN4基因第五个外显子上；SgRNA的表达载体为PX459M。

上述MORN4基因敲除细胞系的构建方法，步骤是：

(1)合成SgRNA，在序列5’端及3’端引入BbiI酶切位点得到SgRNA靶点引物；

(2)将步骤(1)所得到的引入BbiI酶切位点的SgRNA靶点引物进行磷酸化及退火处理；

(3)利用BpiI酶将PX459载体进行线性化处理；

(4)连接BpiI酶处理的PX459载体与步骤(1)所得到的SgRNA靶点引物，得到表达载体PX459M；

(5)将步骤(4)得到的表达载体PX459M进行转化和鉴定阳性克隆；

(6)将步骤(5)确定的表达载体PX459M转染细胞，经嘌呤霉素筛选，即获得MORN4基因敲除细胞系。

上述MORN4基因敲除细胞系的构建方法中：所述转染的细胞为大鼠心肌细胞。

上述方法构建得到的MORN4基因敲除细胞系。

MORN4基因敲除细胞系在研究心肌细胞增殖能力的机制以及如何控制心肌细胞增殖过程中的应用。

本发明提供了一种MORN4基因敲除细胞系。实验证实，与正常的心肌细胞相比，本发明所述MORN4基因敲除的心肌细胞增殖受到抑制。

目前的许多研究表明，成年哺乳动物心脏发生损伤后心肌细胞可以增殖，这表明心肌细胞增殖可能是修复心脏的有效策略。因此，MORN4基因敲除的细胞系不仅可以用于研究MORN4基因的功能，而且可用于研究心肌细胞增殖的机制、相关疾病的治疗以及新药研发等方面，因此其应用前景广阔。

附图说明

图1为SgRNA表达载体构建图。

图2为SgRNA表达载体转化效率图。

图3为MORN4基因敲除细胞系细胞使用EDU技术检测增殖的结果。

图4为MORN4基因敲除细胞系使用免疫荧光技术观察中心体数目检测增殖的结果。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细、明确的说明，但下述说明仅仅是仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，不能限制本发明的范围。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。实验方法若未特殊说明，均按照常规实验条件和方法操作。

实施例1：

一、靶点引物的设计：

以大鼠MORN4基因组序列为目标，在(http://asia.ensembl.org/index.html)查询MORN4的基因组序列，MORN4基因组序列如SEQ ID NO.3，利用在线设计网站(http:// chopchop.cbu.uib.no/；http://crispor.tefor.net/crispor.py？batchId＝ pQZSHO2YdxVaq0lEPA0R等)对MORN4基因序列进行靶点设计，除根据网站给出的评分高低外，还根据参考文献以及MORN4的功能结构域特点，在不同的靶点之间进行取舍，最终筛选确定两个靶点，预测靶点序列为SgRNA1：GTGCTCCGCCGTGGTTCAGC(SEQ ID NO.1)和SgRNA2：GTGTCCCTTGTGCGTGCG(SEQ ID NO.2)此外，需要在靶点5’端及3‘端引入BpiI酶切位点才能与后续载体进行连接，添加类型如下：CACC+SgRNA1-F；AAAC+SgRNA1-R；CACC+SgRNA2-F；AAAC+SgRNA2-R，如图1所示。

二、引物磷酸化与退火

将添加了BpiI酶切位点的靶点引物合成后，需要先进行磷酸化及退火处理。

反应体系及条件如下：

反向在PCR仪中进行，37℃,30min；95℃,5min。PCR梯度降温到25℃，速度为每秒降低0.1℃；25℃,5min；4℃,5min。放置在冰上或者保存在负-20℃冰箱备用。注意：退火这一步如果PCR不是梯度PCR仪，37度磷酸化反应后，加热到95度变性后取出到室温，让它慢慢降到室温，以保证退火效果。

三、PX459M载体的BpiI酶消化

利用BpiI酶将PX459M载体进行线性化处理：

1％凝胶电泳分离验证，割胶回收载体片段，回收后的载体浓度应大于50ng/ul。

四、连接反应

将处理完成后的引物与线性化载体进行连接：

16℃连接过夜，或22-25℃连接2h。

五、转化和鉴定阳性克隆

连接反应完成后，同构建真核过表达质粒同等的方法转化到大肠杆菌感受态细胞，涂板隔夜培养后，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，鉴定引物上游为SgRNA1-F，下游选用PX459M上的通用测序引物(CAG-R)，成功连接一般可扩增出长度500bp左右的阳性片段。

六、嘌呤霉素筛选

PX459M具有嘌呤霉素抗性，可用于后期阳性细胞筛选。

需要确定嘌呤霉素对正常细胞的最低致死量，一般来说不同的细胞对于嘌呤霉素的敏感性不同，对哺乳动物细胞嘌呤霉素的致死剂量范围大致为0.5ug/mL-10ug/mL。将细胞铺板后培养至80％覆盖率，添加不同剂量的嘌呤霉素，维持培养24-36h，观察可引起正常细胞死亡的最低剂量。

将构建好的基因编辑质粒转染细胞，转染剂量1-2ug/mL，转染6h后换液并继续过夜培养，按照上一步确定的嘌呤霉素最低致死量添加到转染后的细胞，持续观察细胞状态，一般24-36h可将未转染的细胞全部杀死。此时换用新鲜培养基将剩余的阳性细胞继续培养，待回复状态后可进行传代，必要时可利用嘌呤霉素进行二次筛选。

将筛选后的阳性细胞利用胰酶消化，离心收集后利用计数板确定数量，并稀释浓度转入到96孔板中，可进行多次稀释以保证96孔板的每一个孔只加入一个细胞。随后持续观察一周左右，单个细胞可出现典型的聚集生长，对单个细胞生长的孔进行标记。期间要注意添加培养基。

96孔板中的细胞生长速率不一，需要及时观察将覆盖率达到传代水平的细胞进行转移，扩大培养到48或24孔板并做好标记，持续培养知道单个细胞扩大到一个小皿左右(此使需要准备2-3套培养基及PBS并分次操作，防止一旦污染全部返工)，此时可转移部分细胞出来进行WB及IFA鉴定，将具有敲除及敲低的细胞进行扩大培养，并及时冻存，防止污染。

七、Western Blot鉴定MORN4基因敲除情况

为了确定MORN4基因的敲除情况，比较转染SgRNA1、SgRNA2、空载质粒的细胞中MORN4蛋白的表达水平，其结果如图2所示。

使用蛋白裂解液(PMSF:RIPA＝1:100)裂解细胞，收集细胞后进行离心，离心后使用BCA法测定蛋白浓度；取30μg蛋白样品上样，80V进胶，待Maker跑开后，将电压调至120V跑胶；湿转法进行转膜操作；脱脂奶粉封闭1h；封一抗，4°过夜孵育；回收一抗后用TBST洗膜3次，封二抗，室温下孵育1h；TBST洗膜3次，每次8min；使用ECL显色液A液和B液进行显影操作。

八、免疫荧光鉴定MORN4基因敲除情况

将细胞传代到铺了细胞爬片的24孔板中，把培养板置于培养箱中培养；待细胞密度达到90％以上，处理细胞；弃掉培养液，PBS洗3次，每孔加入多聚甲醛室温固定15min；弃掉多聚甲醛，PBS洗三次，加入5％BSA封闭液，室温封闭1h；吸去封闭液，每孔加一抗200，4°孵育过夜；回收一抗，PBS洗3次，加入荧光标记的二抗，室温避光1h；吸去二抗，PBS洗三次，每次5min，加入200μLDAPI应用液，室温孵育10min；吸去DAPI应用液，PBS洗3次，封片，共聚焦显微镜拍照，其结果如图2所示。

九、EDU鉴定MORN4基因的功能

接种适当数量细胞于96孔板，用完全细胞培养液培养过夜；制备50μM EDU培养基，用细胞培养液以1：1000的比例稀释EDU溶液；待细胞长到合适阶段后，弃培养液，每孔每次加入100μL 50μM EDU培养基孵育2小时；弃培养液，每孔加入100μL细胞固定液室温孵育15-30分钟；2mg/mL甘氨酸孵育10分钟；PBS洗两次；弃上清，每孔加入100μL渗透剂透化细胞，PBS冲洗1次；其结果如图3所示。

十、免疫荧光鉴定MORN4基因的功能

将细胞传代到铺了细胞爬片的24孔板中，把培养板置于培养箱中培养；待细胞密度达到90％以上，处理细胞；弃掉培养液，PBS洗3次，每孔加入多聚甲醛室温固定15min；弃掉多聚甲醛，PBS洗三次，加入5％BSA封闭液，室温封闭1h；吸去封闭液，每孔加一抗200，4°孵育过夜；回收一抗，PBS洗3次，加入荧光标记的二抗，室温避光1h；吸去二抗，PBS洗三次，每次5min，加入200μLDAPI应用液，室温孵育10min；吸去DAPI应用液，PBS洗3次，封片，共聚焦显微镜拍照，其结果如图4所示。

序列表

<110> 山东大学

<120>一种MORN4基因敲除细胞系及其构建方法与应用

<141> 2021-03-15

<160>3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> SgRNA1核苷酸序列

<222>（1）…（20）

<400>1

gtgctccgcc gtggttcagc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> SgRNA2核苷酸序列

<222>（1）…（20）

<400> 2

gtgtcccttg tgtgcgtgcg 20

<210> 3

<211> 12361

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> MORN4基因核苷酸序列

<222>（1）…（12361）

<400> 3

atacacatgt gtcacatatg tgtccatgtg tggagatcag aggacagtaa gcgtttctca 60

ctttctgtta tgtgagttct agggatcaaa ctcaggttgt caggcttagt gacaaacggc 120

caacctggtg acccatctca gcagccccca ataacctatt ttcttgagtc aaattattgt 180

cccaacccaa tagaagtact taatcaaaag agctattgtt tgactgtatt gtgagaatgc 240

cttcaacttc cttttttcca gtgaacccta aaagggctga gaggctatct cagtggtaga 300

atgtttgctt accatacaga agaccccgtg ttcacctcca acacaacaaa aaataaacca 360

tcctggctaa agatctctat agcattccac tggcctttca gtcacaggta aagtagctat 420

gtagggatgt ctatgtaact aatgtagtga tgtctgcttt gtggatcctc agaaccatgg 480

aaatggtatg tgatttcatt cgtctcattt agttaatgga ttttaaaata tgggcaagga 540

aagatccaag attctgagtt ctccctggga ttctgagttt tcccctcaaa ctttatttct 600

gtgtttaccc cttggaacta tatttccccc ttaggtaagc gtgtgtccta atacacatgt 660

gctgggagag cacttaccca gtgctaagtc tgcactgggc attgttttaa gtatcttaca 720

tggattagct ccattaactg ccattaaaac tcctatgatg ttggatgctg tgtcccgacg 780

agacaaggta atttgctctg acctaacaag ccatcttgct gaaactacag tttcaagcca 840

tcaaagaaac tacagtttgc aaactcttgt gctaatttat aagtcttccc ataatttggt 900

cccgcacaat ctgtgattta atctcatttt ttccttatta tttcctagca cgagttctaa 960

gaagatccct ttctttccaa tccatttctc agtgactgca ctttaatcta caatcaattc 1020

cacagtttag cttacattac caagtgagta attagtacca cattgaatgt attgtccgat 1080

ctcattttac aggctagaga gcttactaag ttactcaaaa cacacacaat tcgtaagtag 1140

caaaagatag gatttgagca cagaaatcaa atctttaaaa aacaaagcaa aactaccgtc 1200

cctttggcgt tgtgttctca cacaagtcct gtaaagccct ctatcacttt catcattatt 1260

actttctaac ctgcggctga aggaatccta atccaaaaag caatttgaac cagtttgctt 1320

tgtctttcaa cgcctcactc gtgtcatgag tcccatgaga gacgcatcaa cgaccagggc 1380

ttttccaagc cctgaagaac ttgcttctcc cgcatgcact tcactaaaca aacatatggc 1440

tacacggaca tccgggaaca gtatttggga agatttgctc caatagtggc actaggtttt 1500

aaatacaaaa gatgtggaac acagagagtc cctatgaatg gaaatgtgca gcgcatcatt 1560

aattataaag ctgagcttct aaatctgggt ttaggttttc tcttcatact tagcggtgga 1620

gttgtttatg aatctaaaaa tcacaacctt ttgaaatgta gccactttga acacacgttc 1680

gaccttatct aggattaaag tctctgcctg gaggtgtctg aagacgtgaa acctgagtcc 1740

ttcttttcgg ttggggttaa tgagattgga cagcaggctc agccccaccc ctttttcaga 1800

tctttggccc agactcccaa aacactgggc ccctcacaaa gatggcacga aagagggctg 1860

gaccaatggg gagtggcgtt gctcgcggtt gcctaggtaa cagccaatga acagcgggaa 1920

ttgtgcccag tgcggccgta agggatggcg gcgtccagtg gggctgaggc gggtggcggg 1980

gcagagggga aagtggcagt ggggagcccg gagcagcaaa gatcctagct gctggagccc 2040

cgcgtcaagt cggggcgtaa cagtcgtctt cgagaagccg agctcaggtt ggcctgcggc 2100

gcgggtggga agaggacttg ggagtgcggt ccaccaggta aggactgagg cggcaagcag 2160

gtgactgggc tggggaagga gcctctgtcc tggctgtact gacaagaagg tggctaccag 2220

tgggatccca aaattgggtt tggagtttcg atccagaggt cgtagccctg gagaacacag 2280

gacactggtt atcaagaggg gtgtgccggg ctgtgtctgc agggaatgcc agatctgtgg 2340

gagcttgaag agcctgtgga gtgggagccg accccccccc ccccaaaaaa aaggacagaa 2400

ccgggctgaa atgaaaaatg cagtggaaga ctgggttgcg tgtcgaagtc tggggttttg 2460

tttaatctag ggcgcgtctg tgccacaggt agggagatgt cccacttact gaggcttggg 2520

gaatgggttg tcatttctgt aattcagcat ccacgaacta cttaggaccc aaccagagta 2580

acttcactat attagagccc ggcccagaca ctgtcccttc ccttagcata gatagaatag 2640

tgttgtgaca atattactcc ggagagccta tcactctttt tttttttttt tttttctttt 2700

tttcggagct ggggaccgaa cccagggcct tgcgctcgct aggcaagtgc tctaccgctg 2760

agctaaatcc ccaaccccga gcctatcact cttgtgtcat tgtcttttta aaaaccttct 2820

tcttggtacc agtgttctct tttcatcttc ttcaatctaa ccatcccaca ttctccctaa 2880

aaataaaacc tgcttatcat aacagtgcca atgcttactt tccagatagg aaggagatta 2940

taattttaaa gttaaaaccc taattatttc atattcattt aaaaacacgt tttattaaac 3000

agtatttcca gtttcctaat ctttgctcat cagagctttc attttcccct cttaggactc 3060

taaaaactta tggttgcttc ctttgtaact aaaagaattt tttgttagct tgcctaccca 3120

aggaagtggc tttgggaaca gttcggagat ggtgtggata gttagggtgt ctgcttccaa 3180

acaaaaggtc tctaactggg atatgattat tctcaggttg gggagggaag aattgttgtt 3240

attttgtttt aaaacttctt aatttaagct ggacatacat ggtggagcct caggagacag 3300

aggcaggtgg atcttcttga gttcaaggcc agcctggtct acatagtgag ttccaggaca 3360

accaaggact acataatcct ccttcaaata acaaacaaaa acgtcttgat ttagacaaaa 3420

gttgctgcaa atgcataaat gttctttagt tagcttggtt ttatgagaga gagagagaca 3480

gggagaagga gaaaaggtgg gggaggcatg gcaatagtgt ttactgctcc tgcagagggc 3540

caggattcag ttcttagcac ccacctgtaa ctccagttcc agggaatcta aaggcctctc 3600

aggcctccac aggctcttgt acacacatag catacaaaca ttcatgcaag ttcacacaga 3660

gacacataaa ctcaaagcac ttctaaaaaa tgaaaacaat ttcttatcac tgtcttcgag 3720

ttctgtttgg agccatccac tgaagaaaaa aagtaagaga gcaaaagata tagtctcttt 3780

ccaacagtcc cagaacagtg gattacaggg acaaaaaaaa aatggtaatt ttaggttacg 3840

tttccatctg atcatttgca gcttgtctgt cacaagcaca gaaagggcct ctgtgggaat 3900

gtggatcgtg ttggtttgtg actggattcc aggtatagat ctgaagccta gggcatcaat 3960

tttctccaac aggattattt aagcaagtat tatagacgtc gatctgtgtt ccttattaaa 4020

gtattgggtt tcccatttgc attagtactg gatacacttt attaatctat atttgcctca 4080

gtaactatgg ataatcttgg ttactggtga aattcccagg atgtgacagt atcacctgtt 4140

tggacacatg ttgcagttcc tagacaaatg tattcagcca tagcccgaga cccctgagtt 4200

ctacatatgt tccttttaat tagcacttct gatttgagtc ttgaaactgt tcatggtttt 4260

aagaaaccac tgctgaattt actgtatctt tctagattga aaaggaatgg aaatttgtaa 4320

tatatactct tgaaaaccag cacggaatgg tgtcggggta ggttggcagg tggtactctg 4380

cttattacca ctaaacaatg aattaaccca gcccttagca gcttaaaacc accccacgat 4440

actcccagat cctaagtcag gactctagac ctgacatcat ggagatggct tctgtttatt 4500

ccatagattc tccggtgagt gggtcagtgt ctgactggga actggaacca tttgactgac 4560

agctccttca ctaacgactg ctcctgtcag agctaagatg actgacaagt gaggatgcag 4620

ggcggtggtg gcatacggtg ctagtgcacg cctttgatcc tagcactcgg gaggcagagg 4680

caggcagata tctgtgagtt tgaggccagc ttgatctata gagcgagttc caggacagcc 4740

aagactacac ggagaaaccc tgtctcaaac cttctcccca atgcccccca aaattggaat 4800

atcaactgga gtaacagtac gtcctataac tggctacctc agtacttggg agccttccga 4860

taatatattt tatcttagaa taacattttt atttccatat attttaaaga cttatttatt 4920

tattttataa tacactaagt acactgtcac tcccttcaga cacaccagaa gaacacatca 4980

tatcccatta cagatggtag tgagccacca tgtgattact gggaattgaa ctcaggacct 5040

ctggaagagc agtcagtgct ctaaactgct gaaccatctc tccggcccat atttacttat 5100

ttacctgtgt aaatatatat gtttatatat gttcacatgc tatggtacgc tttgtggaag 5160

tcagagagta acttgctgga attggttctc tcctcccccg tgtgggtccc gggatcctga 5220

gggtaggttc ctttgcctgc tgaaccatct caccggctcc agtcaggtgt tcttaggctg 5280

tgactcaggc ctcaagctat gggtctagta acgagcagaa tgaacgttca tgatgctgta 5340

tttggtgtac ataggtgatt aagcatttct tccatggtgc tgtatttgaa gcagtccaag 5400

tctgatccaa tctagggaga cactgcaaac atctttagaa ataagactaa gcacattaag 5460

caataaaaaa aagaaagaag tttcagtggc tggaaagttg gctcagcggt taagagcact 5520

ggctgctctt ctagaggtcc tgagttcaat tcccatcaac tacatggtgg ctcacaacca 5580

tctgtaatgg gatcctcttc tggactgcag gtaaagcact gatatattaa atagatagac 5640

agacaaacag atagacagat aaatcctttt taaaaattta aataaaattt ctaattttat 5700

caccttcctt aaaatattta agatattagc ccaagaactg acagcataac aatatcaacc 5760

aaaagacagc tttacactta ggagcatagc tagtactttg tccatagaga atcctcaaat 5820

acttccttgt tttctccctg gtccctgtcc accatgtgag atccaattct ggaggttccc 5880

tgtagcttcc gtgaagagta aacagatata aaagcattgt ccccagaagc cctgcgtgcc 5940

cacctctcag tcactgcagt gacccaccaa catttgagga aagagaaatt ggttaacccc 6000

tggcaaacat ttaaagaaag ttcccttatt gtactgtctt ctaagtctcc tgactgactt 6060

cttcatgaca gtacagttat taaatgtagt caaagataaa cagttcttca gccaagaagg 6120

gcagggcttg ccataagccc agtactcagg aagcagaggc tttgtgaatg caagggcagc 6180

ctggtctaca cagcaagctc aaggctagcc aagacttcat agagagaacc tgtctcggaa 6240

cgtcaaatat acctacatac atgctaatac acacacatac acacacacac acacacacac 6300

acacgcatac tcattacata cacacatact aatgcataca cactcacaga catacacact 6360

cagacatata cacaatcata tatacacaca tgctcatata cacaaacata cacacattca 6420

tatataaaca tacacatata agcatactca tttttataca ctcatttata cacatacata 6480

tacactctca tatatacaca cacactcata tatacacact catatacact tatatgcata 6540

cacactcatg tacatacaca cattcatata catacataag ctcacctata cacacactga 6600

tatgcatata cacagttata cccatatgca ttcatattat actcatgcat acacatactg 6660

gtatgcatac acacactcat actcacacat taacatgcat acatactctg atatgcatac 6720

acacacactg atatgcatac atgcacaatc atacacatgc atttatatta cactcatata 6780

catacacatt gatacgcata cacacatagc ctacacatat gtgttcatat tacactcctg 6840

catacacaca ctcatataca tacacacagc tcttcagatt caggtgggca tactttgaag 6900

agttatggag caatttggaa tgttttattt tgttgcttga gataagacct catatgtaac 6960

cctgactgac ctggaactga aaggcatctg ccggcctgca tctccagagt gctgggatga 7020

aagatgtgta acgccatggc cagcgtgttt gcaatttata tcatcatttg actttgaaaa 7080

gctaaagatg gcctgtagct agcagaacac cttaactcca ctgtgaagag ttttctctcg 7140

aaattcttac ggaaaactta tcttcctctc attaatgttg tatttgctgt gaagtctcac 7200

tgacctcagc ccaagcctgc tctgatctgg gctgatgata agagtttcag tttctgtgtg 7260

gcttgaagga aaggaagctg ttgactggca ccaggcccac aagtatttaa agatcctctc 7320

tagtttggtg caccagacag tacagtcctt atactctcaa ggaaagctgc acttgtcctg 7380

ttagcatcag gcaggtgcct gcgagggaga ctttcagtta actattcacc atggcatctt 7440

tagttgtaac tttgtgtctc cctctggttc agtcatagtc cgcaggcttt ccgatgggaa 7500

tctaaagatg tgcttgttca aactataggt tcccaaagct tacacagaat tggacaggtt 7560

tgaggtcaag cctacgaatc tgcattttat catttgagaa aacattgtaa tacttaacta 7620

tagaaaagac aaaggggtga ataaaaagat ctagaaaatg gaaaaatact tctgttgttt 7680

attgattctg tttatacttt atggtgactt aaacgtccat atcccttctt tttttttttt 7740

tttttttttt tggagctggg gaccgaaccc agggccttgc gcttcctagg taagcgctct 7800

accactgagc taaatcccca gcccctccat atcccttctt atgggatatc cttgaacaca 7860

cagttttttt accacccagt agtccgcagt gctattgaga tggtgatgac acctctaaga 7920

cgtagtgtcc tgaaacaact attatttctt tgcccgatga aacagtgagt cattagtgta 7980

ggcccccggc tcagagccag caccttctat gtcttgctga gttcaggtgt ctgtgatcag 8040

ctgggacaat tactccatat gatcgctcct catctagaat attagtctag actcctgcat 8100

ttaaatatct gtatcatcac ctttggtaac actccattaa ctaagtaatg cacacaacca 8160

acccagacca aggcaactct gtcttttggt aggaggatat ctcttcctca ccagcgtctc 8220

tgaagggact cggctgcccc aacccctcct gtcatttttc ttaatcactg ctttcctcct 8280

attccaatcc ttgttcacat gccccacccc cacccccaga caccacagac tctttcccta 8340

gcttagctgt ccaattttca gagagcaccg tgaatgagtc tgacctaagc caaggctcag 8400

cctgaaggaa ggagggccag catagtcagg gagggttgtg tgctcatccc ttgcttaggc 8460

accaacaaaa cctttgttat gagtaatgtt tagggtttgg ctttgttttt tttaacttta 8520

tgtctgtgac gatttgcctg tgggtctatg tgtggactgt gtgcttactt ggtacctgtg 8580

gaagtcagaa ggaggttttt ggatcccctg gaactggaga ttagatggtt gtgagacatg 8640

atgtgaggtt gggaatgaaa cctggatctt ctgcaagagc aacacgtgcg cttaaccact 8700

gagccatctt gtcagcacca ccaaaaaact tcttaaccac tctgagcttg tgtttcttcc 8760

tctgtaacac aaaggagttt gcattacatc tgtgtggttc tttaacagct caagatctct 8820

gtgtatagtc tctatcaccc taaataagcc gtcttatcta agcggaccag ataacttgtg 8880

tttccgttgc tctcttactg tctttgctgc ttgcttttgc atttaatcct ttcccccatt 8940

gatttatgtg gaggcaggtc cgcatagctg aggatgacgt tgaatgcatg gtccgcagcg 9000

tctgctgaga ttacagatgt gcaccacagt tgtgctgagg gctgctcacc cctgtacttg 9060

acacagaatt accttgtccc tggtatagcc tggtgtttca cctgctgagc ctaccgacct 9120

tattataact tccctgaggg gactctgttt atgcatccac agaacacagc acgtgtcaag 9180

taaatatctg tagatttagc ttccatttcc atcacaggaa acaggaactg gctgaaaacg 9240

gaaggggtga gggcgcttta gccgaggtgg aggtgggggg cgaggaggac attttaagtg 9300

acctgaggta ggattgtact tgaggtaaat gtgcacttgc cggagctcag cctctagtcc 9360

tctcgccatc ccatgactct gctttctctg tttatcatag ttggcatcct cttctataag 9420

ctgccgccat gaccctgacg aaaggctcct tcacctactc cagtggagag gaataccgcg 9480

gcgagtggaa agagggtgag aagctgccct ggggcagcca actccagggc gccattcagt 9540

ccccactgcg ggactcagct ccacgtagaa cctttccttt atgtcagggc tcaatgaagg 9600

aactagaaat gaatccagtc ttcccactcc ttcatgtata gtgcttggac acagtctgtt 9660

gtcttaaata tgaggtgccc agaagagcca attaaattct tttgggtgca gtttagagag 9720

ttcaggattc gagaattagt gaaaaccctc aaaaacaagt gacactcctt ccctgactcc 9780

tgtgacagct tttgacagcg gaagtgatcc taaattctta ggaagaacaa aacgctttgg 9840

agccgtgact ttgctgaaac ggcagcacaa gcactttaat ggctcagttt ggaaagaaaa 9900

gctggccacc ttaaggtctc tcagtgttca gtcccagcaa gccacgaaac tgacccaagg 9960

acgaaggcct ttccacacta aagaggggcg aagggcagct tttcgtgggt aaggctgtgg 10020

gaaagtgtgg gctgctaagc cagtgagaac aggacccgga agctccccca ttccaacctg 10080

gtgcctgtcc ttctctttgc tcaggccgga gacatggttt tggtcaactg atgtttgctg 10140

atggtggcac ctacctgggt cactttgaga atgggctttt taatggcttt ggggtactga 10200

ccttctcaga tgggtcaagg taagtattaa gtcactcctc cgtcgttgaa ctagcaagac 10260

tctgatacaa gtatgagccc tggtggttgt ctgtccaacc ctgagcttgc ccaggcacta 10320

aaggaaacag aaaagggatg agcagttctt ttcttgattc cttttctttt gaaactaagc 10380

tttatttatt tctctgtgtt ctttatttgt gaaggatgtg ccacagtgct tgtgaggagt 10440

gagttctccc cttccgccat gagggtcccc aggatttaac tcagtcatca agtgtgggga 10500

caggtttctt ttgtctacta agccatcttg cctgcctttg ttattttaaa ataaatgtca 10560

gagccaggca ctgtggtgaa tgtttgtagt cctagcactg gagaggcaga gtagagagta 10620

tcctgaattt caggtcatgc tggtctaggt ggcactggta gagttatgag atgagctcca 10680

ccacagagct caccttgact gacagacaca cggacgactg ctcgcctcag ttaccccaca 10740

cagccaacgt acccactgaa ggctaactaa cctcttggtc tctctgcagg tatgaggggg 10800

agttttccca gggcaagttc aatggtgtcg gagtcttcat tcgatatgac aacatgacct 10860

ttgaggggga atttaaaaat gggagagtgg atggctttgg taagtttcgg ctcagcagaa 10920

tggaacatag gtggaatgct cctgtgtctt aactctccgg tggctctctc cagcaatctg 10980

cagtgcccat gcctgaaact ctctcctcct ctccagtctc tgcgtgtcag gctgacccgt 11040

cctcccctct gtcctcctca caggcttgct gactttccca gacggttctc atggactacc 11100

ccgcaatgaa ggcctgtttg agaacaacaa acttctgcgc cgtgagaagt gctccgccgt 11160

ggttcagcgg gctcagagcg cctccaagtc agccaggaac ctcactgcct gacggagctc 11220

tgggtgcagt cggaaagtat ctgtaaagca gtggtgtccc ttgtgtgcgt gcgaggtgaa 11280

caaatgaacc ggaagtgaga tgagaatgac cctgatgtca cagcctgaga ggtgctctgt 11340

cccctgccag gcaggagttc agtggcaggc aagagtggag ggttttggcc ccaggaccct 11400

acggcggtta tgtcctccct ggccctgatg cgctcaagca cagggcctgc ccctctgcca 11460

tgtcattccc aggaccttgg gtttcccagt gctgtggcct tctctccatc tgctgtcaag 11520

ccacagggag cctcttcttt ccacccagat aatcccagtc ctgtgtgctg ccattgaaga 11580

agtcagagaa agacaggagt gacataaatc acagcagctc tgtgaagccc aggccagagc 11640

tcttctgggt gttacccact cattcactgc atttggaggc ctggctctgg gctggtctct 11700

gtgtcttctt atccctcctc agtgtaagag tgtggttttc ttctccctcg gctttacctg 11760

actcctcctt acctgagtta cagcagacag cccaatcccc ctctgtgcct ctctcctccc 11820

ttagatgtca gacaggatcc ctttatagaa agccatgtaa gaaactagtg tgaaggaaac 11880

gtatggccca catttgttac tcactccggg gcagagggca accctatccg ggcatctgtg 11940

aaatgatctg gaatcgcact gagagagcat tccttcccag tgtaccatga tcacactcat 12000

tgtcccttgc gtgttcaaag atttggatcc atcctagtgt gagctccatt tgactcatga 12060

ctctagaagc aagagtcttg gctctcaggc ctgggacaga tcttcctgcc aaaatcatca 12120

tgacagggtc tccagttagc ctaggtccta gcccagcctg agccctagcc ccaggcccca 12180

tcctcaaatc tctctcagca gcagactgtg gtggagatta tagctgtgtg cctctattta 12240

tcatctgatc cgtactgtag aaacaagtgt ttataggaat aaaccaatca cagaactgcc 12300

tagaattagt gttatggatt ttctggactt caggcctcat gaatatcgac cgtttgatat 12360

t 12361

Claims (5)

1.一种MORN4基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于：是运用CRISPR/Cas9技术对细胞中的MORN4基因进行敲除；其中敲除MORN4基因的两个SgRNA分别命名为SgRNA1和SgRNA2，SgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SgRNA的表达载体为PX459M。

2.根据权利要求1所述MORN4基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，步骤是：

(1)合成SgRNA，在序列5’端及3’端引入BbiI酶切位点得到SgRNA靶点引物；

(2)将步骤(1)所得到的引入BbiI酶切位点的SgRNA靶点引物进行磷酸化及退火处理；

(3)利用BpiI酶将PX459载体进行线性化处理；

(4)连接BpiI酶处理的PX459载体与步骤(1)所得到的SgRNA靶点引物，得到表达载体PX459M；

(5)将步骤(4)得到的表达载体PX459M进行转化和鉴定阳性克隆；

(6)将步骤(5)确定的表达载体PX459M转染细胞，经嘌呤霉素筛选，即获得MORN4基因敲除细胞系。

3.根据权利要求2所述MORN4基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于：所述转染的细胞为大鼠心肌细胞。

4.权利要求1所述方法构建得到的MORN4基因敲除细胞系。

5.根据权利要求5所述MORN4基因敲除细胞系在研究心肌细胞增殖能力的机制以及如何控制心肌细胞增殖过程中的应用。

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