CN114478729A - 一种糖尿病抑制肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种糖尿病抑制肽，属于多肽制备技术领域。本发明公开一种糖尿病抑制肽，所述糖尿病抑制肽包括氨基酸序列为LPFYPQ、GPVTPPILG和/或LPFYPQGV的多肽。上述三种抑制肽是从高粱醇溶蛋白酶解物中筛选得出，其能够对DPP‑IV产生竞争性抑制作用，进而缓解DPP‑IV对胰高血糖素样肽‑1的降解作用，实现降血糖的效果，并且其对糖尿病患者而言降低血糖安全可靠，且安全无副作用，易于人体吸收，因此该糖尿病抑制肽对高粱醇溶蛋白降血糖产品的开发具有实际意义。

Description

一种糖尿病抑制肽
技术领域
本发明涉及多肽制备技术领域，特别是涉及一种糖尿病抑制肽。
背景技术
由于不规律的饮食习惯和生活方式的变化，糖尿病患者人数激增的现象逐年严峻。目前为止，糖尿病是仅次于直接影响人类健康和生活的肿瘤、心血管疾病之后的第三大类世界性疾病。糖尿病引起的血糖升高会对人体脏器造成长期损害，导致血管、心脏和肾脏等器官的功能出现障碍，严重甚至会导致器官衰竭。
二肽基肽酶IV(DPP-IV)作为新目标被应用在糖尿病靶点研究中，通过对此靶点的活性进行调节，可以达到控制餐后血糖水平的目的，最终实现对糖尿病的预防和治疗。在饮食和运动的双重控制下仍无法达到控制血糖的情况下，采用DPP-IV抑制剂的干预治疗方法，完全能达到对糖化血红蛋白削减的目的，最终实现对空腹和餐后血糖的有效调控，同时在短期内药效好，安全性高。
人工合成的DPP-IV抑制剂如西格列汀，沙格列汀等，虽引发不良反应的概率较低，但也存在一定的问题，如轻度头痛，呼吸道感染和腹泻等问题。对于一些如肾功能不全的患者，会在用药时调节所需剂量，以防止不良反应的发生。与人工合成的DPP-IV抑制剂相比，食源性DPP-IV抑制肽的毒性和副作用都较小。食源性DPP-IV抑制肽通常是食物通过胃肠道消化，外源酶水解或特定加工方式释放出具有DPP-IV抑制活性的肽序列，作用条件温和，并且释放出的肽序列多为短肽，在机体内的消化吸收更加容易。由于其制备来源广泛，使得膳食中蛋白成分可以作为功能食品来辅助治疗高血糖等问题。因此，具有DPP-IV抑制活性的动植物多肽被开发出来并得以应用，凭借比化学合成类药物更便宜的成本和无副作用的优势成为大家的关注热点。
然而，现有技术中开发的食源性DPP-IV抑制肽大多来源于动物蛋白，以海洋动物为主，反而从植物蛋白获得DPP-IV抑制肽的相关报道较少，而如何从高粱蛋白中开发制备DPP-IV抑制肽，更是没有任何公开记载，因此，本发明提供一种来源于高粱醇溶蛋白的DPP-IV抑制肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种糖尿病抑制肽，以解决上述现有技术存在的问题，该糖尿病抑制肽能够对DPP-IV产生竞争性抑制作用，实现降血糖的效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种糖尿病抑制肽，包括氨基酸序列为LPFYPQ、GPVTPPILG和/或LPFYPQGV的多肽。
本发明还提供一种上述糖尿病抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备高粱醇溶蛋白酶解物：向高粱醇溶蛋白质悬浮液中添加木瓜蛋白酶进行酶解，酶解结束后离心收集上清液，即得高粱醇溶蛋白酶解物；
(2)酶解物的分离纯化：高粱醇溶蛋白酶解物进行超滤分离，取DPP-IV抑制活性最强的超滤组分经葡聚糖凝胶柱分离纯化，再次收集DPP-IV抑制活性最强的组分，即得多肽混合物；
(3)抑制肽的鉴定、筛选及合成：采用nano-LC-ESI-MS/MS液质联用鉴定分析多肽混合物，之后筛选具备生物活性的多肽，再将其与DPP-IV酶进行分子对接，选出结合键能最低的多肽，将选出的多肽经固相化学合成法进行合成，即得糖尿病抑制肽。
进一步地，步骤(1)所述高粱醇溶蛋白质悬浮液质量浓度为4％。
进一步地，步骤(1)所述木瓜蛋白酶添加量为8000U/g，所述酶解条件为酶解时间3.6h、酶解温度51℃和pH＝5.5。
进一步地，步骤(2)所述超滤分离分子截留量分别为10kDa、5kDa和3kDa。
进一步地，步骤(2)所述葡聚糖凝胶柱包括Sephadex G-25凝胶柱，所述分离纯化条件是上样量2mL，上样浓度4mg/mL，流速1.2mL/min，在280nm处进行分离纯化。
进一步地，步骤(3)所述筛选具备生物活性的多肽为通过服务器筛选，所述服务器为Peptide Ranker服务器，通过该服务器预测评分超过0.5的多肽具备生物活性。
进一步地，步骤(3)所述DPP-IV酶是通过去除水分子和氨基酸链、添加极性氢原子和原子电荷后得到的，所述分子对接是利用Vina1.1.2软件包进行对接。
本发明还提供一种上述糖尿病抑制肽在制备抑制DPP-IV产品中的应用。
本发明还提供一种上述糖尿病抑制肽在制备降血糖产品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从高粱醇溶蛋白酶解物中筛选出三种新型糖尿病抑制肽，其氨基酸序列分别为LPFYPQ(LP6)、GPVTPPILG(GP9)、LPFYPQGV(LP8)，体外抑制活性IC50值分别为69.87μM、95.07μM、167.66μM，并且明确了上述三种抑制肽分别与DPP-IV结合的关键氨基酸残基及结合位点：抑制肽LPFYPQ与DPP-IV核心位点Arg125、Glu205、Glu206等6个氨基酸残基以氢键结合，与Arg125、Glu205、Glu206等8个氨基酸残基形成疏水相互作用；抑制肽GPVTPPILG与DPP-IV核心位点Tyr662、Arg125、Glu205等6个氨基酸残基以氢键结合，与Ser630、His740、Ser209等8个氨基酸残基形成疏水相互作用；抑制肽LPFYPQGV与DPP-IV核心位点Ser630、Tyr662、Tyr666等10个氨基酸残基以氢键结合，且与Ser630、Tyr631、Tyr662等14个氨基酸残基形成疏水相互作用，由此制备获得的抑制肽能够对DPP-IV产生竞争性抑制作用，进而缓解DPP-IV对胰高血糖素样肽-1的降解作用，实现降血糖的效果。
本发明筛选制备的三种多肽对糖尿病具有持续稳定的抑制作用，对糖尿病患者而言降低血糖安全可靠，且安全无副作用，易于人体吸收，因此该糖尿病抑制肽对高粱醇溶蛋白降血糖产品的开发具有实际意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为超滤组分凝胶过滤色谱图；
图2为LP6与DPP-IV蛋白的结合模式图，其中(a)为LP6与DPP-IV蛋白分子对接结果三维局部图，(b)为LP6与DPP-IV蛋白结合氢键模式图，(c)为LP6与DPP-IV蛋白分子对接结果三维整体图，(d)为LP6与DPP-IV蛋白的疏水相互作用模式图；
图3为GP9与DPP-IV蛋白的结合模式图，其中(a)为GP9与DPP-IV蛋白分子对接结果三维局部图，(b)为GP9与DPP-IV蛋白结合氢键模式图，(c)为GP9与DPP-IV蛋白分子对接结果三维整体图，(d)为GP9与DPP-IV蛋白的疏水相互作用模式图；
图4为LP8与DPP-IV蛋白的结合模式图，其中(a)为LP8与DPP-IV蛋白分子对接结果三维局部图，(b)为LP8与DPP-IV蛋白结合氢键模式图，(c)为LP8与DPP-IV蛋白分子对接结果三维整体图，(d)为LP8与DPP-IV蛋白的疏水相互作用模式图；
图5为三种多肽经模拟胃肠消化DPP-IV抑制率的变化图，其中A为多肽经过模拟胃部消化DPP-IV抑制率的变化图，B为多肽经过模拟胃肠道连续消化DPP-IV抑制率的变化图，C为多肽经过模拟肠道消化DPP-IV抑制率的变化图；
图6为合成肽LP6、LP8、GP9对Caco-2细胞DPP-IV相对活性的影响，其中A为LP6对Caco-2细胞DPP-IV相对活性的影响图，B为LP8对Caco-2细胞DPP-IV相对活性的影响图，C为GP9对Caco-2细胞DPP-IV相对活性的影响图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
一种糖尿病抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
1.制备高粱醇溶蛋白酶解物
将1g高粱醇溶蛋白溶解于装有25mL去离子水的锥形瓶中，制备出蛋白质悬浮液(4％，w/w)。向悬浮液中添加木瓜蛋白酶，用橡胶塞密封烧瓶。预热至酶解温度后，转移到水浴摇床中。反应结束后，95℃水浴15min灭酶，冷却至室温。离心机3500g离心25min，收集上清液并将其进行冷冻干燥处理。
其中，木瓜蛋白酶酶解条件为：酶解时间3.6h、酶解温度51℃、pH＝5.5、酶活8000U/g。
2.酶解物的分离纯化
2.1超滤分离：将高粱醇溶蛋白酶解物分别通过10kDa、5kDa和3kDa规格的超滤管进行逐步超滤分离，按照不同的分子量范围对超滤组分进行收集，测定各个组分的DPP-IV抑制活性。筛选出活性强的一组进行接下来的分离纯化。
2.1.1DPP-IV抑制率的测定
通过底物发色法对DPP-IV抑制率进行测定。将试验分为4组，分别为阴性实验对照组(DPP-IV酶10μL+Tris-buffer缓冲液40μL+发光底物50μL)，空白实验对照组(发光底物50μL+Tris-buffer缓冲液50μL)，试验实验组(高粱蛋白酶解液40μL+DPP-IV酶10μL+发光底物50μL)，试验空白实验对照组(高粱蛋白酶解液40μL+Tris-buffer缓冲液10μL+发光底物50μL)。反应在96孔板内进行，样品(酶解液或多肽)浓度为5mg/mL，DPP-IV浓度为100ng/mL，发光底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐浓度为100μM，所用溶解液为100mM Tris-buffer缓冲液(pH 8.0)按照酶解液、蛋白酶、缓冲液、底物的顺序依次加入后，在37℃下预热1h，在405nm处测量混合物OD值，计算公式：
Figure BDA0003521281710000081
式中：ΔA0：阴性实验对照组OD-空白实验对照组OD；ΔAx：试验实验组OD-试验空白实验对照组OD。
2.2 Sephadex G-25凝胶柱的分离纯化：将DPP-IV抑制活性高的组分通过AKTA蛋白分离纯化系统处理达到分离收集目的，分子筛过滤条件为上样量2mL，上样浓度4mg/mL，流速1.2mL/min，在检测器的紫外光波长调整为280nm条件下收集各组分，测定各个分离峰组分的DPP-IV抑制活性，筛选出活性强的分离峰进行冷冻干燥。
3.nano-LC-ESI-MS/MS液质联用鉴定分析
将高活性组分冻干粉复溶后进入Thermo Finnigan LTQ Linera Ion trap配套色谱柱(柱长10cm，柱内径75μm，3μm树脂填充)。流动相选择(高效液相设备)：流动相A(90％(V/V)乙腈水溶液(含0.5％甲酸))，流动相B(2％(V/V)乙腈水溶液(含0.5％甲酸))。开始检测时，流动相A在1h内从2％上调为90％，并持续40min。最后通过串联质谱鉴定高粱醇溶蛋白肽序列，串联质谱试验调试条件：喷雾电压稳定保持2.2kV；离子传输管保持温度在250℃；串联质谱的试验调试标准碰撞能量值设置成35％；质谱离子阈值设置为1000。激活时间设置为30ms，在正离子模式下进行操作，采用q＝0.25，对串联质谱测定结束的显示数据进行收集。进行质谱扫描，保持每周期一次完整轨道阱扫描。通过软件ProtTech’s ProtQuest(Norristown，PA，USA)对质谱数据进行在线检测分析。
4.抑制肽的筛选
4.1本发明借助ToxinPred(http://crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/)工具进行预测肽的毒性，通过Peptide Ranker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)服务器对多肽具备生物活性功能的概率进行预测，其预期值超过0.5，就可认为该肽具有活性。
4.1.1受体结构准备
DPP-IV酶的结构需要在蛋白质数据库(Protein data bank,PDB)中检索并获取，PDB代码为1X70。删除结构中的水分子和其他氨基酸链作为初始结构。对1X70结构进行分子力学优化处理，添加极性氢原子，并添加原子电荷，用Autodock Tools打开，并保存为pdbqt格式文件，作为分子对接的受体。
4.1.2配体结构准备
通过Discovery Studio 2019中的Macromolecules模块构建DPP-IV抑制肽分子的三维结构，利用Simulation模块中的Minimize插件对多肽进行结构优化，优化采用MMFF力场。最后，采用AutoDock Tools 1.5.6对得到的配体结构进行相应处理，程序生成的pdbqt文件可实现模拟实验的对接使用。
4.1.3分子对接方法
分子对接采用Vina1.1.2软件包实现，设定1X70晶体结构中的配体所在的位置为活性位点，分别将28个肽类配体对接到活性位点，对接盒子的中心坐标设为(45.83，66.70，49.07)，XYZ各方向的格点数设为40×40×40，格点间距为
Figure BDA0003521281710000091
对接次数设为100，其余参数采用默认值。
4.1.4对接结果优化
分子对接的结果在空间结构上可能有不合理的原子接触，可以采用能量优化的方法对这些作用力进行释放，使其更趋于稳定结构。能量优化采用Amber14力场，优化过程分两步进行：先进行5000步的最陡下降法(Steepest descent method)优化，再用2000步的共轭梯度法(Conjugate gradient method)对结构进行进一步优化，将最终的结果作为后续分析的模型。
5.抑制肽的合成
采用固相化学合成法对所得抑制肽进行合成。
6.结果
6.1酶解物的分离纯化
木瓜蛋白酶水解高粱醇溶蛋白，对分子量范围为>10kDa、5-10kDa、3-5kDa、<3kDa的四组组分的DPP-IV抑制活性进行检测，分子量<3kDa的多肽组分有很好的DPP-IV抑制活性，其IC50值为0.82mg/mL，因此通过凝胶过滤色谱对<3kDa的组分进行进一步纯化。分子量<3kDa组分经过分离纯化后出现三个吸收峰，得到三个组分(P1，P2和P3)，通过DPP-IV抑制活性测定，得到这三个组分的DPP-IV抑制肽IC50值，其中P1组分对DPP-IV的抑制效果最好，将P1进行收集后冻干备用。超滤组分凝胶过滤色谱图见图1。
6.2 nano-LC-ESI-MS/MS液质联用鉴定分析
通过对串联质谱的数据进行匹配对比，在P1组分中共分析得出28种多肽。这些多肽的分子量大多在1000Da以下，并且都是氨基酸残基为5-10的寡肽。
6.3抑制肽的筛选
由预测结果可知，从高粱醇溶蛋白酶解物中获得的28种多肽均属于无毒性的多肽。在鉴定出的28种多肽中，有16种多肽的Peptide Ranker评分超过0.5分(见表1)，可以认为这些多肽具有生物活性。在NCBI数据库中，使用Blast分析工具对P1组分中鉴定出的28种多肽进行相似性比对分析，获得他们所属蛋白来源。得到鉴定出的多肽主要蛋白来源为α-醇溶蛋白，其次是β-、γ-两种类型的醇溶蛋白。
6.3.1分子对接筛选结果及分析
目前研究发现具有Xaa-Pro-、Xaa-Ala-及Trp-Xaa-等典型结构特征的抑制肽一般有控制糖尿病的活性。
对结合键能进行排序，发现与DPP-IV结合所需键能最低的为来源于α-醇溶蛋白的六肽LPFYPQ(LP6)、八肽LPFYPQGV(LP8)和来源于γ-醇溶蛋白的九肽GPVTPPILG(GP9)，这意味着这三种多肽对DPP-IV的抑制效果可能最好。同时这三种多肽都符合Xaa-Pro-结构特征，这也与Xaa-Pro-典型结构特征的多肽一般具有较好抑制DPP-IV活性能力的结论相符(参见表1)。
表1 P1组分混合物中鉴定出的具备DPP-IV抑制活性的16种多肽
Figure BDA0003521281710000111
Figure BDA0003521281710000121
6.3.2抑制肽与DPP-IV的结合模式分析
研究对已上市的DPP-IV抑制剂的结合方式进行总结，发现DPP-IV酶的结合位点以S1和S2的双口袋组合为主。S1单口袋主要由Tyr666、Ser630、Trp659、Tyr631、Val656、Tyr662、Asn710、Val711以及His740组成；S2单口袋主要由Phe357、Ser209、Glu205、Arg358、Glu206以及Arg125组成。
LP6与DPP-IV的结合模式如图2所示，其中(a)为LP6与DPP-IV蛋白分子对接结果三维局部图，(b)为LP6与DPP-IV蛋白结合氢键模式图，(c)为LP6与DPP-IV蛋白分子对接结果三维整体图，(d)为LP6与DPP-IV蛋白的疏水相互作用模式图。图2中(b)和(d)给出了LP6与DPP-IV蛋白的氢键与疏水相互作用，其中疏水相互作用是结合的关键相互作用。在LP6-DPP-IV复合物体系中，参与二者疏水相互作用的关键氨基酸残基包括S2口袋(Arg125、Glu205、Glu206、Ser209、Phe357)的5个氨基酸残基和S1口袋(Tyr666)的1个氨基酸残基。参与氢键的氨基酸残基包括S2口袋(Arg125、Glu205、Glu206、Ser209)和S1口袋(Tyr662)的1个氨基酸残基。
在GP9-DPP-IV复合物体系中，发生疏水相互作用的关键氨基酸残基主要包括S1口袋(Ser630、His740)和S2口袋(Ser209、Phe357、Arg358)，GP9主要通过与S1口袋(Tyr662)和S2口袋(Arg125、Glu205、Glu206)与DPP-IV蛋白之间形成氢键。结合模式如图3所示，其中(a)为GP9与DPP-IV蛋白分子对接结果三维局部图，(b)为GP9与DPP-IV蛋白结合氢键模式图，(c)为GP9与DPP-IV蛋白分子对接结果三维整体图，(d)为GP9与DPP-IV蛋白的疏水相互作用模式图。
从LP8与DPP-IV结合模式图可以观察到，LP8通过疏水相互作用和氢键与DPP-IV结合的氨基酸残基比LP6更多。其中与疏水相互作用的相关氨基酸残基包括S1口袋(Ser630、Tyr631、Tyr662、Tyr666、His740)和S2口袋(Arg125、Glu205、Phe357)，其中与氢键形成的相关氨基酸残基包括S1口袋(Ser630、Tyr662、Tyr666)和S2口袋(Arg125、Glu205)。结合模式如图4所示，其中(a)为LP8与DPP-IV蛋白分子对接结果三维局部图，(b)为LP8与DPP-IV蛋白结合氢键模式图，(c)为LP8与DPP-IV蛋白分子对接结果三维整体图，(d)为LP8与DPP-IV蛋白的疏水相互作用模式图。三种多肽与DPP-IV酶结合的关键残基如表2所示：
表2三种多肽与DPP-IV酶结合的关键残基
Figure BDA0003521281710000131
Figure BDA0003521281710000141
6.4抑制肽合成
通过固相合成法对LP6、GP9、LP8这三种DPP-IV抑制肽进行合成，并将合成的多肽进行纯化处理，多肽纯度越高，活性验证越准确。具体纯化条件见表3-表5。
表3纯化LPFYPQ(LP6)的流动相条件
Figure BDA0003521281710000142
表4纯化GPVTPPILG(GP9)的流动相条件
Figure BDA0003521281710000143
表5纯化LPFYPQGV(LP8)的流动相条件
Figure BDA0003521281710000144
6.5抑制肽的体外抑制活性验证
LP6、GP9、LP8三种多肽的结合能最低，代表它们对DPP-IV的抑制活性可能最强，活性测定发现三种多肽的抑制活性与分子对接的结果相符，LP6、GP9和LP8的IC50值分别为53.34μg/mL(69.87μM)、80.75μg/mL(95.07μM)和154.11μg/mL(167.66μM)。三种多肽的体外抑制活性强弱与其分子对接所需的结合能存在关联性，抑制活性强的多肽对应所需结合能也较低，说明通过计算机模拟分子对接可以作为筛选DPP-IV抑制肽的可靠方法。
效果例1三种多肽的体外模拟消化稳定性分析
本研究通过模拟体外胃肠道消化，对三种多肽进行胃肠道消化稳定性的测试，检测方法如下：将三种DPP-IV抑制肽配制成500μg/mL的溶液，调节溶液pH至2.0(以6mol/L的HCl进行调节)，在37℃水温下的水浴振荡器中保持10min。加入胃蛋白酶，使其浓度达到2000U/mL，混合反应120min，每隔20min取样。将酶灭活后，调整pH至中性，测定活性。加入胰蛋白酶(2000U/mL)，混合反应3h，每隔0.5h取样一次，收集消化液后将酶灭活，在这两个步骤中测定DPP-IV的抑制活性。
其检测结果如图5所示，发现LP6和LP8经过胃消化阶段后，DPP-IV抑制率均下降了10％左右(见图5A)，但继续进行肠道消化阶段，DPP-IV抑制率未发生明显变化(见图5C)。GP9在胃肠道连续消化过程中，DPP-IV抑制率则一直保持稳定(见图5B)。与LP6和LP8相比，GP9在胃肠道消化实验中，表现出了更好的活性稳定性。直接对三种多肽进行肠道消化处理，发现三种多肽的DPP-IV抑制率均未发生明显变化，结合胃消化结果分析，可以发现，如果能降低或避免胃部消化对多肽产生的影响，三种多肽均能保持较高的DPP-IV抑制活性进入小肠吸收阶段。结果表明GP9相比于LP6和LP8，更容易在胃肠道消化后被完整的消化吸收，发挥较为稳定的抑制活性。
效果例2LP6、GP9、LP8三种多肽的效果验证
本研究将合成的LP6、GP9和LP8多肽添加到Caco-2细胞中，验证其对内源性DPP-IV活性的影响。检测三种多肽在12、24和48h时对DPP-IV的抑制活性，检测方法：首先将Caco-2细胞添加到含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中按照常规方法培养。分别用不同浓度三种合成多肽的完全培养基来处理Caco2细胞(LP6、LP8的处理浓度为5，25，50，100mg/mL，GP9的处理浓度为25，50，100，200mg/mL)，对照组只加完全培养基，将其分别培养12h、24h和48h后对细胞内DPP-IV进行提取并进行活性检测。活性检测方法为：在96孔板中加入20μL DPP-IV细胞提取液，50μL Gly Pro-pNA底物(终浓度为500μM)，30μL Tris-HCl的缓冲溶液，37℃培养1h，在405nm处测OD值，计算公式如下：
Figure BDA0003521281710000161
如图6A所示，LP6在24h表现出浓度依赖性DPP-IV抑制；随着LP6浓度的升高，抑制率逐渐升高。随着浓度的增加，LP8和GP9对DPP-IV的抑制作用没有显著变化(图6B和6C)。因此三种多肽可以潜在的治疗Ⅱ型糖尿病。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种糖尿病抑制肽
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Pro Phe Tyr Pro Gln
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Pro Val Thr Pro Pro Ile Leu Gly
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Pro Phe Tyr Pro Gln Gly Val
1 5

Claims (10)

1.一种糖尿病抑制肽，其特征在于，包括氨基酸序列为LPFYPQ、GPVTPPILG和/或LPFYPQGV的多肽。
2.一种根据权利要求1所述糖尿病抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备高粱醇溶蛋白酶解物：向高粱醇溶蛋白质悬浮液中添加木瓜蛋白酶进行酶解，酶解结束后离心收集上清液，即得高粱醇溶蛋白酶解物；
(2)酶解物的分离纯化：高粱醇溶蛋白酶解物进行超滤分离，取DPP-IV抑制活性最强的超滤组分经葡聚糖凝胶柱分离纯化，再次收集DPP-IV抑制活性最强的组分，即得多肽混合物；
(3)抑制肽的鉴定、筛选及合成：采用nano-LC-ESI-MS/MS液质联用鉴定分析多肽混合物，之后筛选具备生物活性的多肽，再将其与DPP-IV酶进行分子对接，选出结合键能最低的多肽，将选出的多肽经固相化学合成法进行合成，即得糖尿病抑制肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述高粱醇溶蛋白质悬浮液质量浓度为4％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述木瓜蛋白酶添加量为8000U/g，所述酶解条件为酶解时间3.6h、酶解温度51℃和pH＝5.5。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述超滤分离分子截留量分别为10kDa、5kDa和3kDa。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述葡聚糖凝胶柱包括Sephadex G-25凝胶柱，所述分离纯化条件是上样量2mL，上样浓度4mg/mL，流速1.2mL/min，在280nm处进行分离纯化。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选具备生物活性的多肽为通过服务器筛选，所述服务器为Peptide Ranker服务器，通过该服务器预测评分超过0.5的多肽具备生物活性。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述DPP-IV酶是通过去除水分子和氨基酸链、添加极性氢原子和原子电荷后得到的，所述分子对接是利用Vina1.1.2软件包进行对接。
9.一种根据权利要求1所述糖尿病抑制肽在制备抑制DPP-IV产品中的应用。
10.一种根据权利要求1所述糖尿病抑制肽在制备降血糖产品中的应用。
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Title
LINGYAN DAI等: "Analysis of the Structure and Activity of Dipeptidyl Peptidase IV(DPP-IV) Inhibitory Oligopeptides from Sorghum Kafirin", 《J. AGRIC. FOOD CHEM.》 *

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