CN115838400B - 两种靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽 - Google Patents

Abstract

本申请提供了两种靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽，其氨基酸序列分别为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2，其具备显著的血管紧张素转化酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶抑制活性。本申请还提供了这两种肽在制备治疗代谢综合征以及相关疾病的药物中的用途。本申请的两种肽制备方法简单、易于修饰和改造、适用于食品、保健品以及药品的工业化生产。

Description

两种靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽

技术领域

本申请属于生物活性肽领域和代谢类疾病治疗领域，具体地，本申请提供了两种靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽及其相应用途。

背景技术

代谢综合征是指机体的脂肪、蛋白质、碳水化合物等发生代谢紊乱的病理状态，是一组以肥胖、血脂异常、高血压等症状，严重影响人体健康的临床征候群。近年来，随着人们生活水平和生活方式的改变，比如过量摄入高脂、高糖、高盐食品等，导致代谢综合征在全球范围内高发。据统计，全球约25％的成人患有代谢综合征。预计2040年全球代谢综合征患者将达到25.68亿左右。代谢综合征可使2型糖尿病的发病危险性增加5倍以上，心血管疾病的死亡率增加2倍以上，其已成为危害大众健康的世界性公共卫生问题。

目前，治疗代谢综合征的药物大都围绕肥胖、高血压、高血脂等相关指标，通过控制其相关危险因素来改善代谢综合征。化学药物针对代谢综合征发病机制进行治疗，具有显著的治疗效果，但长期药物治疗易产生副作用和耐药性，造成患者依从性差。在减肥药物中，奥利司他是目前市场上常见的胰脂肪酶抑制剂，但该药物的使用存在腹泻腹胀、油性斑点、大便失禁、脂肪泻等副作用，且副作用发生率高达91％。卡托普利是一种可以用于高血压治疗的血管紧张素转化酶抑制剂，但会产生头痛、失眠、恶心呕吐、腹泻、便秘等副作用。因此，亟需研发更安全有效的药物用于代谢综合征的治疗。

多肽是氨基酸以肽链链接在一起而形成的化合物，也是水解的中间产物。多肽药物具有分子量低、安全性高、靶向性强、易于修饰和改造、药用剂量小等诸多优点，目前已广泛应用于多种代谢性疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的研发前景。红小豆的蛋白质含量丰富，之前的研究发现红小豆蛋白水解物<3kDa级分具有较强的胰脂肪酶和胆固醇酯酶抑制活性，因此从其中寻找可治疗代谢综合征的天然多肽成为了药物和功能食品的研发热点。

发明内容

本发明的目的在于解决现有代谢综合征治疗药物毒副作用明显，以及无法同时预防和治疗代谢综合征中多个相关危险因素的问题，提供两种红小豆源可预防和治疗代谢综合征的生物活性肽。本发明首先使用胃蛋白酶和胰酶水解得到红小豆蛋白水解物，再通过分离纯化、成分鉴定、生物信息学等技术筛选出生物活性肽，然后基于分子对接技术实现生物活性肽的代谢综合征作用靶点(血管紧张素转化酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶)筛选，最后利用Fmoc固相合成方法制备的生物活性肽验证其对血管紧张素转化酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶的抑制活性，并阐明抑制机理。

一方面，本申请提供了两种靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

另一方面，本申请提供了上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备血管紧张素转化酶和/或胰脂肪酶和/或胆固醇酯酶抑制剂中的应用。

另一方面，本申请提供了上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备治疗代谢综合征的药物或保健品中的应用。

另一方面，本申请提供了上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备治疗肥胖，高血脂，高血压或糖尿病的药物或保健品中的应用。

另一方面，本申请提供了上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备食品中的应用，所述食品适用于代谢综合征人群，肥胖人群，高血脂人群，高血压人群，糖尿病人群。

一种药物、保健品或食品，其包含上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽。

进一步地，上述药物、保健品或食品中还包含辅料、食品原料。

另一方面，本申请提供了制备上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽的方法，所述方法为酶解方法或者Fmoc固相合成方法。

进一步地，所述酶解方法包括使用胃蛋白酶和胰酶酶解红小豆蛋白的步骤和分离上述靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽的步骤。

进一步地，所述Fmoc固相合成方法包括(1)使用分子筛浸泡N,N-二甲基甲酰胺和甲醇以除杂；(2)N,N-二甲基甲酰胺溶胀活化Wang树脂；(3)接第一个氨基酸；(4)Fmoc保护基脱除；(5)接第二个氨基酸并脱除Fmoc保护基；(6)重复步骤(5)多次，直到合成到最后一个氨基酸并脱除Fmoc保护基；(7)树脂的脱落，通过液相和/或质谱方法进行质量检测。

本申请中所述的代谢综合征是指依照各国家、学会或教科书的各种诊断标准判定的代谢综合征，其临床表现包括但不限于肥胖或者超重、脂代谢和糖代谢异常、高血压等，诊断中所用的指标包括但不限于体重、血脂、血压、血糖等。

本领域技术人员可以根据纯度等要求选择适合的方法从酶解物中分离所需肽，这些方法包括但不限于层析、沉淀等。

Fmoc固相合成的方法本领域公知，本领域技术人员可以根据仪器、树脂、安全性等要求选择不同的试剂和参数。

本申请所述的食品可以为本领域中已知的食品种类，包括但不限于点心、主食、膨化食品、液体或者冲饮形式的粥、糖、糊、饮料等。

上述辅料本领域技术人员可以根据寡肽的稳定性、溶解性等特性，结合药剂学、食品学中一般认识和工具书进行设计和选择。

本申请中的液相和质谱检测方法可以使用本领域市售的仪器和耗材，适合的参数和试剂本领域技术人员可以根据该领域的一般认识和适当的初步实验确定。

本发明的两种红小豆源亲水性肽，色氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asn-Pro-Trp-Asp，WNPWD)，酪氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-色氨酸-脯氨酸-苏氨酸(Tyr-Ser-Asn-Trp-Pro-Thr，YSNWPT)，具有天然、无毒、无致癌性、无过敏性、分子量小、不被胃肠道消化，体外稳定性好的特点，血管紧张素转化酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶抑制活性高，并且进一步发现它们通过盐桥、疏水相互作用、π-π堆积、π-阳离子相互作用、氢键与作用靶点酶的氨基酸残基结合实现抑制活性的发挥。同时本发明提供的两种红小豆肽的制备方法简单、易于修饰和改造、适合工业化生产、可大规模制备。总之，两种红小豆肽的发现为开发和代谢综合征有关的食品、保健品以及药品提供了新的资源，对于预防和治疗代谢综合征具有重要的应用意义。

附图说明

图1为肽WNPWD(A)和YSNWPT(B)的质谱结果图；

图2为两种红小豆肽的酶活性抑制率；

图3为肽WNPWD(A)和YSNWPT(B)的血管紧张素转化酶活性抑制机理；

图4为肽WNPWD(A)和YSNWPT(B)的胰脂肪酶活性抑制机理；

图5为肽WNPWD(A)和YSNWPT(B)的胆固醇酯酶活性抑制机理。

具体实施方式

实施例1红小豆蛋白的提取及其水解物的制备

红小豆粉过80目筛后，按照红小豆与正己烷1:3的质量体积比混合，室温下用水浴恒温振荡器连续搅拌4h，静置1h使红小豆粉沉降。在倾出上层正己烷后，将脱脂红小豆粉置通风橱中风干12h备用。

将脱脂红小豆粉与蒸馏水以1:10的质量体积比混合，并使用1mol/L NaOH调节溶液pH值至8.5。在40℃的水浴恒温振荡器中连续搅拌1h后，4℃，7000×g离心30min，弃沉淀。用1mol/L HCl将上清液pH值调至4.5，室温下静置1h后，在4℃，7000×g下离心10min以利于蛋白质沉淀。收集蛋白质沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀3次后复溶于5倍的蒸馏水中，使用1mol/LNaOH将pH值调节至7.0。红小豆蛋白溶液装入透析袋，并置于蒸馏水中低温透析24h。透析过程中需要换4～5次蒸馏水，最后冷冻干燥并保存在-20℃。

将红小豆蛋白与蒸馏水以1:20的质量体积比混合均匀，使用1mol/L HCl调节溶液pH值到2.0。然后加入4％胃蛋白酶(w/w，250U/mg)，混匀后置于水浴摇床中振荡酶解，摇床转速为300rpm，酶解时间2h，酶解温度37℃。

胃蛋白酶酶解结束后，先使用0.9mol/L NaHCO₃将溶液pH值调节到5.3，再用1mol/L NaOH将pH值维持在7.5，最后加入4％胰酶(w/w，8×USP)，并在37℃下酶解2h。

胰酶酶解结束后，酶解液沸水浴10min，灭活残留的酶。酶解液经室温冷却后，4℃，7000×g离心20min，收集红小豆蛋白水解物上清液。

实施例2蛋白水解物的分离纯化、成分鉴定以及活性肽筛选

分离纯化

12mL红小豆蛋白水解物上清液转移至3kDa离心超滤管，4℃，5000×g离心30min后即得分子量＜3kDa级分，冷冻干燥并在-20℃保存。

成分鉴定

取100mg的<3kDa级分冻干粉样品并用C18除盐柱进行除盐。将样品经由配备分析柱Acclaim PepMap C18,75μm×25cm和在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。3μL样品以60min的梯度分离样品，柱流量为300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV。流动相A相：0.1％甲酸水溶液，B相：含0.1％甲酸的80％的ACN溶液。梯度从2％的B相起始，平衡3min，在47min以非线性梯度升高到35％，1min内升高到100％，维持12min。

质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数如下：(1)MS：扫描范围(m/z)：200-1800，AGC target：3e⁶，分辨率：70000，最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率：17500，AGC target：le⁵，动态排除时间：30s，最大注入时间：45ms。

串联质谱图经过PEAKS Studio version 10.6分析。PEAKS DB对uniprot-Vigna(version202111,140881entries)数据库搜库，肽段卡值为：-10lgP≥20；在数据库中未检索到的肽段，通过设置ALC(％)≥80得出，部分典型结果见表1。

基于生物信息学的活性肽筛选

作为功能成分用于和代谢综合征有关的食品、保健品以及药品的生物活性肽，其安全性和高生物活性是筛选的基本前提。胃肠道的代谢活动是限制肽类物质吸收的主要障碍，而由2-6个氨基酸组成，分子量集中在1000Da以下的活性肽可以不被胃肠道消化。故基于生物信息学技术对<3kDa级分中的肽段，依据分子量小(<1000Da)、无毒、无致癌性、无过敏性、高潜在生物活性和抗高血压活性、胃肠道不消化和体外保持稳定为标准，筛选出符合开发要求的生物活性肽。

采用ToxinPrep(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html)平台，基于SVM(Swiss-Port)算法，对肽进行毒性预测。利用admetSAR(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/home/)对肽进行致癌性预测。利用AllerTOP v.2.0(http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/)对肽进行过敏性预测。通过PeptideRanker在线平台(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)分析肽的潜在生物学活性，其中阈值大于0.5则被认为具有生物活性；进一步利用AHTpin(http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpin/index.php)平台对肽进行抗高血压活性预测。采用PeptideCutter(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)对肽基于胃蛋白酶和胰蛋白酶进行胃肠道消化性预测；体外稳定性通过ExPasy(https://web.expasy.org/protparam/)预测，其中不稳定系数小于40则判定为能够稳定存在。依据分子量小(<1000Da)、无毒、无致癌性、无过敏性、高生物活性(>0.5)和抗高血压活性、胃肠道不消化和体外稳定(<40)为标准，首次从红小豆蛋白中筛选得到未经报道的生物活性肽WNPWD和YSNWPT(见表1)。

进一步运用计算机软件对WNPWD和YSNWPT的物理特性进行预测，其中总平均亲水性通过ExPasy(https://web.expasy.org/protparam/)，等电点通过Pepdraw(http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw/)评估。如表1所示，总平均亲水性可以用来表征蛋白质的亲疏水性，其中负值越大表明亲水性越强，结果表明WNPWD和YSNWPT具有较好的亲水性。WNPWD和YSNWPT的等电点小于7，表明它们均呈酸性。

表1基于生物信息学的红小豆肽性质预测

实施例3代谢综合征作用靶点的筛选

以筛选出的WNPWD和YSNWPT为配体，常见的代谢综合征作用靶点(血管紧张素转化酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶)为受体，通过分子对接实现生物活性肽的代谢综合征作用靶点筛选。

将肽WNPWD和YSNWPT进行血管紧张素转化酶分子对接试验，以明确作用靶点。从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)获取血管紧张素转化酶(PDB编号：108A)的晶体结构，采用Dock 6.9将肽WNPWD和YSNWPT与血管紧张素转化酶进行半柔性对接，基于Grid打分函数进行能量评价。在分子对接前保留Zn²⁺和Cl^-，去除水分子和其他配体。分子对接以血管紧张素转化酶的S1活性口袋(Ala354、Glu384和Tyr523)为中心，即坐标为X：44.831，Y：34.109，Z：46.363。对接打分是配体与大分子结合的近似势能，较低的得分值表明目的大分子与配体之间具有强亲和力。范德华力贡献指的是π-π堆积、疏水相互作用等非极性作用。静电力贡献则表现为盐桥、氢键等极性作用。对接打分是范德华力贡献和静电力贡献的总和。内部排斥能数值越大，排斥力较大，表明该构象越不稳定，而内部排斥能小于30kcal/mol则表明构象较为稳定。表2显示了肽WNPWD与血管紧张素转化酶的对接打分是-111.6701kcal/mol，范德华力贡献是-109.9446kcal/mol，静电力贡献是-1.7255kcal/mol，内部排斥能是30.2964kcal/mol；YSNWPT与血管紧张素转化酶的对接打分是-116.817kcal/mol，范德华力贡献是-112.1678kcal/mol，静电力贡献是-4.6492kcal/mol，内部排斥能是19.9632kcal/mol。通常小于-50kcal/mol的对接打分值表示较好的结合力。两个肽与血管紧张素转化酶的对接打分均低于-50kcal/mol，故血管紧张素转化酶是其潜在的代谢综合征作用靶点。

将肽WNPWD和YSNWPT进行胰脂肪酶分子对接试验，以明确作用靶点。从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)获取胰脂肪酶(PDB编号：1ETH)的晶体结构，采用Dock 6.9将肽WNPWD和YSNWPT与胰脂肪酶进行半柔性对接，基于Grid打分函数进行能量评价。在分子对接前保留胰脂肪酶分子的链A(包含448个氨基酸残基)用于对接分析，同时去除共结晶分子和其他多肽链。分子对接以胰脂肪酶活性位点(Ser153、Asp177和His264)为中心，即坐标为X：64.153，Y：39.278，Z：l27.241。表2显示了肽WNPWD与胰脂肪酶的对接打分是-94.304695kcal/mol，范德华力贡献是-92.594940kcal/mol，静电力贡献是-1.709757kcal/mol，内部排斥能是26.672638kcal/mol；YSNWPT与胰脂肪酶的对接打分是-83.211685kcal/mol，范德华力贡献是-81.022415kcal/mol，静电力贡献是-2.189272kcal/mol，内部排斥能是28.050215kcal/mol。两个肽与胰脂肪酶的对接打分均低于-50kcal/mol，故胰脂肪酶是其潜在的代谢综合征作用靶点。

将肽WNPWD和YSNWPT进行胆固醇酯酶分子对接试验，以明确作用靶点。从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)获取胆固醇酯酶(PDB编号：1F6W)的晶体结构，采用Dock6.9将肽WNPWD和YSNWPT与胆固醇酯酶进行半柔性对接，基于Grid打分函数进行能量评价。在分子对接前去除多余的水分子，同时分子对接以胆固醇酯酶活性位点(Ser194、Asp320和His435)为中心，即坐标为X：8.039，Y：-1.404，Z：21.544。表2显示了肽WNPWD与胆固醇酯酶的对接打分是-95.577209kcal/mol，范德华力贡献是-92.263840kcal/mol，静电力贡献是-3.313366kcal/mol，内部排斥能是19.405476kcal/mol；YSNWPT与胆固醇酯酶的对接打分是-98.347321kcal/mol，范德华力贡献是-98.489227kcal/mol，静电力贡献是0.141908kcal/mol，内部排斥能是23.565737kcal/mol。两个肽与胆固醇酯酶的对接打分均低于-50kcal/mol，故胆固醇酯酶是其潜在的代谢综合征作用靶点。

表2两种肽的分子对接结果

实施例4生物活性肽的人工合成

采用Fmoc固相合成法制备肽WNPWD和YSNWPT，具体如下：

溶剂处理

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇在使用前用G3孔的分子筛浸泡过夜除杂质和水。

树脂充分溶胀

称取2.0g空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15mL DMF，室温活化30min。

接第一个氨基酸

室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入1mmol 5倍摩尔过量的C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的N,N-二异丙基碳二亚胺，DMF做溶剂室温反应3h。反应完毕用DMF洗4～6次，每次5-6mL。再加入体积比为1:1的吡啶和乙酸酐，反应30min。反应完毕用DMF洗4～6次，每次5-6mL。

Fmoc保护基的离去

抽滤去掉上一步的溶剂，将10mL 20％的哌啶DMF溶液加入到树脂中，N₂搅拌10min后滤出溶液，再加入10mL 20％的哌啶DMF溶液，N₂吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。

茚三酮检测脱除效果

取出少量树脂，用甲醇洗三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全，即可进行下步反应；若呈无色，说明保护基没有脱除完全，则需要重复以上脱保护操作。

接第二个氨基酸及Fmoc保护基脱除

称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的1-羟基苯并三氮唑于反应管中，加入适量DMF溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，室温反应40min，用DMF洗4～6次，每次5-6mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10mL 20％的哌啶DMF溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。

以此类推，重复上述步骤，直到合成到N端最后一个氨基酸，去掉Fmoc保护基，然后抽干。

树脂的脱落及纯品分离检测

最后用三氟乙酸切割液(95％三氟乙酸：2％三异丙基硅烷：2％乙二硫醇：1％H₂O)切割2h，抽滤反应液，得肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气吹干，再用乙醚沉淀、离心，然后用乙醚洗3～5次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体。

肽的质量检测

取少量样品在超声溶解后，置于分析型高效液相色谱仪中检测。HPLC参数为：色谱柱：Gemini-NX 5μC18 110A,4.6*250mm；流动相A：100％乙腈加0.1％三氟乙酸；流动相B：100％水加0.1％三氟乙酸；流速：1mL/min；进样量：20μL，检测波长：220nm。

对于WNPWD而言，梯度程序如下表：

对于YSNWPT而言，梯度程序如下表：

Agilent-6125B质谱参数：离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，雾化气流速：1.5L/min，CDL：-20.0V，CDL温度：250℃，加热块温度：200℃，离子源电压：+4.5kV，检测器电压：1.5kV，流动相流速：0.2mL/min，流动相比例：50％H₂O/50％ACN。

最后通过高效液相色谱和质谱分析，确定肽WNPWD和YSNWPT的纯度均大于95％，具体的质谱结果见图1。

实施例5作用靶点的抑制效果评价和抑制机理分析

血管紧张素转化酶活性抑制实验

使用100mM硼酸钠缓冲液(pH 8.3，300mM氯化钠)配制5mM马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)溶液和0.1U/mL血管紧张素转化酶溶液。

将200μL 1mg/L WNPWD/YSNWPT溶液(等量蒸馏水作为对照组)与500μL HHL溶液在37℃下孵育5min。然后加入200μL血管紧张素转化酶溶液涡旋混匀，37℃下孵育60min。反应结束后，加入100μL 0.2mM HCl溶液终止反应。反应液经孔径为0.22μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后，使用HPLC测定产物马尿酸的峰面积。每个样品做3个平行。

HPLC参数：色谱柱：InertSil ODS-SP 5um 4.6×150mm，柱温：30℃，进样量：10μL。流动相A：100％水；流动相B：75％水/25％乙腈，流速：1mL/min，检测波长：228nm。血管紧张素转化酶活性抑制率的计算公式如下：

式(1)中A_Blank为不添加肽产生的马尿酸的峰面积，A_Sample为添加肽产生的马尿酸的峰面积。

胰脂肪酶活性抑制实验

使用pH 7.3的磷酸缓冲液配制2.5mg/mL胰脂肪酶溶液，然后以5500rpm离心5min取上清液。使用pH 7.3的磷酸缓冲液稀释对硝基苯基丁酸酯至10mM。

将50μL 5mg/mL WNPWD/YSNWPT溶液(等量蒸馏水作为对照组)、40μL胰脂肪酶溶液和20μL对硝基苯丁酸酯溶液在37℃孵育30min后，酶标仪在405nm处记录吸光度。胰脂肪酶活性抑制率的计算公式如下：

式(2)中：A：对照吸光度；B：对照空白吸光度；C：样品吸光度；D：样品空白吸光度。

胆固醇酯酶活性抑制实验

使用pH 7.0的磷酸缓冲液(含100mM NaCl，5.16mM牛磺胆酸钠)分别配制25μg/mL胆固醇酯酶溶液和10mM对硝基苯基丁酸酯溶液。

将50μL 8mg/mL WNPWD/YSNWPT溶液(等量蒸馏水作为对照组)、50μL胆固醇酯酶溶液和50μL对硝基苯丁酸酯溶液在25℃孵育5min后，酶标仪在405nm处记录吸光度。胆固醇酯酶活性抑制率的计算公式如下：

式(3)中：A：对照吸光度；B：对照空白吸光度；C：样品吸光度；D：样品空白吸光度。

体外试验结果显示，肽WNPWD和YSNWPT的血管紧张素转化酶活性抑制率分别是80.80％和79.43％，胰脂肪酶活性抑制率分别是48.42％和47.84％，胆固醇酯酶活性抑制率分别是45.18％和56.36％(图2)。这表明两个肽对血管紧张素转化酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶有较好的抑制活性，可有效预防和治疗代谢综合征，并有望作为功能成分广泛应用于和代谢综合征有关的食品、保健品以及药品中，具有良好的市场前景。

通过分子对接技术明确肽WNPWD和YSNWPT与靶点酶之间的作用位点和相互作用力，进一步阐明抑制作用机理。具体实验参数设置参照实施例3。

分子对接模拟图3A展示了肽WNPWD与血管紧张素转化酶氨基酸残基的结合主要依赖于π-π堆积、疏水相互作用和氢键。具体地说，肽WNPWD与氨基酸残基(Phe570)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Glu143、Pro407、Glu403)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Asn66、Arg522、His410)形成氢键。分子对接模拟图3B展示了肽YSNWPT与血管紧张素转化酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、π-π堆积和氢键。具体地说，肽YSNWPT与氨基酸残基(Glu123、Lys368)形成盐桥，与氨基酸残基(Phe391)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Tyr135、Ser517、Ser355、Arg522、Gly404、Met223)形成氢键。

分子对接模拟图4A展示了肽WNPWD与胰脂肪酶氨基酸残基的结合主要依赖于π-π堆积、疏水相互作用、π-阳离子相互作用和氢键。具体地说，肽WNPWD与氨基酸残基(Phe78)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Leu214、Phe216、Phe78)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(His264)形成π-阳离子相互作用，与氨基酸残基(Asn263、Val260)形成氢键。分子对接模拟图4B展示了肽YSNWPT与胰脂肪酶氨基酸残基的结合主要依赖于疏水相互作用、盐桥、π-π堆积和氢键。具体地说，肽YSNWPT与氨基酸残基(Val260、Tyr115、Ile79)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Arg257、His152、His76)形成盐桥，与氨基酸残基(Phe78、His264、Phe216)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Gly77、Phe78)形成氢键。

分子对接模拟图5A展示了肽WNPWD与胆固醇酯酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用和氢键。具体地说，肽WNPWD与氨基酸残基(Arg423)形成盐桥，与氨基酸残基(Ala436、Asp434、Ile323、Phe324、Ala108、Trp227、Val285)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Gln440、Ser194)形成氢键。分子对接模拟图5B展示了肽YSNWPT与胆固醇酯酶氨基酸残基的结合主要依赖于疏水相互作用和氢键。具体地说，肽YSNWPT与氨基酸残基(Ala117、Ile323、Tyr453)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Tyr453、Gln440、His435、Ser194、Gly106)形成氢键。

Claims (8)

1.靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽，其特征在于，其氨基酸序列为WNPWD

或YSNWPT。

2.根据权利要求1所述的靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备血管紧张素转化酶和/或胰脂肪酶和/或胆固醇酯酶抑制剂中的应用。

3.根据权利要求1所述的靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备治疗代谢综合征的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽在制备治疗肥胖，高血脂，高血压或糖尿病的药物中的应用。

5.一种药物，其特征在于，其包含根据权利要求1所述的靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽。

6.根据权利要求5所述药物，所述药物中还包含辅料。

7.制备根据权利要求1所述的靶向预防或治疗代谢综合征的红小豆肽的方法，其特征在于，所述方法为Fmoc固相合成方法。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述Fmoc固相合成方法包括(1)使用分子筛浸泡N,N-二甲基甲酰胺和甲醇以除杂；(2)N,N-二甲基甲酰胺溶胀活化Wang树脂；(3)接第一个氨基酸；(4)Fmoc保护基脱除；(5)接第二个氨基酸并脱除Fmoc保护基；(6)重复步骤(5)多次，直到合成到最后一个氨基酸并脱除Fmoc保护基；(7)树脂的脱落，通过液相和/或质谱方法进行质量检测。

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