CN117106020B - 具有消化酶抑制活性的红小豆来源的寡肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了来自具有消化酶抑制活性的红小豆来源的寡肽FYPTDW及其应用及其在控制肥胖和糖尿病中的应用。本申请的寡肽具有较强的胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α‑葡萄糖苷酶抑制活性，无毒，分子量小，易于修饰和改造，不被胃肠道消化；并且其作用靶点明确、抑制作用机理清楚，有望作为功能成分广泛应用于和肥胖和糖尿病有关的药品中。

Description

具有消化酶抑制活性的红小豆来源的寡肽及其应用
技术领域
本申请属于生物活性肽领域和肥胖/糖尿病治疗领域。具体地，本申请提供了来自具有消化酶抑制活性的红小豆来源的寡肽及其应用。
背景技术
肥胖是热量摄入过多或体力活动不足导致能量不平衡的结果，并受遗传、环境和行为等因素影响。根据世界卫生组织公布的数据，2016年全球成年男性肥胖人数为2.81亿，成年女性肥胖人数为3.9亿。《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》表明中国居民超重和肥胖率不断增加，至少有一半的成年居民超重或肥胖。目前的抗肥胖策略主要包括改变生活方式、减肥手术和药物治疗。然而节食和加强运动存在难以长期坚持的缺点。减肥手术易导致并发症如血栓形成、肺栓塞、消化道梗阻、消化道溃疡、胆石症等的出现。脂类过量摄入将导致肥胖，故抑制膳食脂肪吸收是减肥的重要途径之一。在脂肪消化吸收过程中胰脂肪酶和胆固醇酯酶发挥了关键作用，胰脂肪酶是消化膳食脂肪的关键酶，可水解肠腔中50％～70％的脂肪，抑制胰脂肪酶活性能减少膳食甘油三酯的消化和吸收。胆固醇酯酶可以水解胆固醇酯类物质，从而产生胆固醇和游离脂肪酸，对胆固醇酯酶的抑制被认为是限制和延迟膳食胆固醇吸收的关键。常见的膳食脂质消化酶抑制剂奥利司他被广泛应用于临床治疗肥胖，然而该成分存在一定的不良反应，如肝肾损害、营养不良、腹部痉挛、脂肪性大便、胀气等。因此，尽管用于肥胖控制的治疗选项越来越多，但对用于治疗肥胖的可选且改进的药物仍存在较大需求。
糖尿病是一类以高血糖为特征，在世界范围内广泛存在的代谢性疾病。2019年全球约4.25亿人患有糖尿病，而我国成年糖尿病患病人数达到1.14亿，是全球糖尿病患病人数最多的国家，所以发展改善血糖水平的相关预防措施的应用刻不容缓。α-葡萄糖苷酶是一种在碳水化合物消化过程中的关键酶，对其有抑制活性的物质可阻碍碳水化合物吸收、抑制餐后血糖水平的快速升高，故α-葡萄糖苷酶抑制剂常被糖尿病患者使用。阿卡波糖是目前临床上常用的降糖药，它能与α-葡萄糖苷酶发生竞争性抑制作用，从而延缓葡萄糖吸收，达到降低餐后血糖的目的。但长期服用阿卡波糖会产生胃肠道痉挛、胀气等副作用，并且不可避免地产生耐药性，因此有必要开发出一种比现有药物更安全、副作用更小的降糖药。
生物活性肽是对机体的功能或状态具有积极作用并最终影响机体健康的特殊蛋白质片段，其中的寡肽是一类氨基酸残基数目在2～10个的小肽。肽类的抗原性低于蛋白质，代谢产物氨基酸基本不具备毒性，所以安全性高；另外相较于蛋白质，肽类在较低浓度下就能表现出显著的生理健康益处，并且其分子量小，易于修饰和改造，方便人工合成，这些都表明肽类物质是未来极具发展前景的功能因子。研究表明肽类中的寡肽能避开胃肠道消化，克服蛋白质被消化酶破坏从而不能口服的弊端。因此开发具有控制肥胖或糖尿病作用的寡肽成为各国生物医药领域的研究热点。
消化酶抑制剂可以通过抑制小肠内消化酶(胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶)活性来延缓脂肪和碳水化合物的消化，减少脂肪和碳水化合物的吸收，从而有效抑制肥胖和糖尿病。先前的研究表明红小豆蛋白水解物可以显著抑制脂代谢紊乱、调节葡萄糖稳态，并且其中的＜3kDa级分在体外表现出最佳的消化酶抑制活性，因此我们进一步通过超滤、质谱测序、生物信息学等技术筛选出红小豆蛋白水解物中具有较强胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽并进行功能验证，为开发和肥胖或糖尿病有关的药品提供技术支持。
发明内容
本申请的目的在于解决现有肥胖和糖尿病治疗药物毒副作用明显，和以蛋白质为基料的肥胖和糖尿病功能性产品有效利用率低的问题。本申请提供三种红小豆蛋白来源的可以控制肥胖和糖尿病的寡肽。本发明首先经双酶水解法得到红小豆蛋白水解物，然后通过超滤、质谱测序、生物信息学等技术筛选出生物活性肽，最后利用Fmoc固相合成方法制备的寡肽验证胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并基于分子对接技术阐明抑制机理。本发明所述红小豆蛋白来源的三种寡肽，色氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-组氨酸-丙氨酸(Trp-Glu-Met-His-Ala，WEMHA)、苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸(Phe-Tyr-Pro-Trp，FYPW)和苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-色氨酸(Phe-Tyr-Pro-Thr-Asp-Trp，FYPTDW)，具有较强的胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，无毒，天然来源也可人工合成、分子量小、易于修饰和改造、不被胃肠道消化，并且其作用靶点明确、抑制作用机理清楚，有望作为功能成分广泛应用于和肥胖和糖尿病有关的药品中，具有广阔的市场发展前景。
本申请提供了红小豆来源的寡肽，所述寡肽来源于红小豆，并具有胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。
所述寡肽用于控制肥胖和糖尿病。
所述寡肽的氨基酸序列为WEMHA、FYPW或者FYPTDW。
使用本领域已知的算法，例如BLAST、GenPAST等计算与上述寡肽具备80％以上序列同一性的寡肽也考虑具有类似的功能和用途。
本申请还提供了用于控制肥胖和糖尿病的药物组合物，其包含上述寡肽。
本申请还提供了上述寡肽在制备控制肥胖和糖尿病的药物组合物中的应用。
本申请还提供了上述寡肽在制备胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
所述“控制”是指消除、减轻症状或者抑制症状的发展速度，所述症状包括但不限于体重、体脂、血糖、尿糖、糖尿病和肥胖的并发症如心血管疾病、肾脏疾病、消化系统疾病等。
所述药物组合物或中还包括选自填充剂、包衣剂、pH调节剂、抗氧化剂、溶剂、助溶剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种的辅料。
所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、粉末剂、口服液、水针剂、粉针剂。
上述药物组合物的剂型和赋形剂本领域技术人员可以根据寡肽的稳定性、溶解性等特性，结合药剂学一般认识和工具书进行设计和选择。
本申请还提供了上述寡肽的Fmoc固相合成制备方法，包括：
(1)使用分子筛浸泡N,N-二甲基甲酰胺，甲醇除杂；
(2)N,N-二甲基甲酰胺溶胀活化Wang树脂；
(3)接第一个氨基酸；
(4)Fmoc保护基脱除；
(5)接第二个氨基酸并脱除Fmoc保护基；
(6)重复步骤(5)多次，直到合成到最后一个氨基酸并脱除Fmoc保护基；
(7)树脂的脱落及纯品分离检测；所述检测通过质谱和/或液相方法进行。
进一步地，所述步骤(3)为：室温下，通过抽滤去掉N,N-二甲基甲酰胺，加入1mmol5倍摩尔过量的C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的N,N-二异丙基碳二亚胺，N,N-二甲基甲酰胺做溶剂室温反应3h；反应完毕用N,N-二甲基甲酰胺洗4～6次，每次5-6mL。再加入体积比为1:1的吡啶和乙酸酐，反应30min。反应完毕用N,N-二甲基甲酰胺洗4～6次，每次5-6mL；
进一步地，所述步骤(4)为：抽滤去掉N,N-二甲基甲酰胺，将10mL 20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液加入到树脂中，N2搅拌10min后滤出溶液，再加入10mL 20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液，N2吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用N,N-二甲基甲酰胺洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL；
进一步地，所述步骤(5)为：称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的1-羟基苯并三氮唑于反应管中，加入适量N,N-二甲基甲酰溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，室温反应40min，用N,N-二甲基甲酰洗4～6次，每次5-6mL；取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10mL 20％的哌啶N,N-二甲基甲酰溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用N,N-二甲基甲酰洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。
进一步地，所述步骤(7)包括：以含95％三氟乙酸、2％三异丙基硅烷、2％乙二硫醇、1％H2O的三氟乙酸切割液切割2h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气吹干，再用乙醚沉淀、离心，然后用乙醚洗3～5次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体；
取样品在超声溶解后，置于分析型高效液相色谱仪中检测；HPLC分析参数为：流动相A：100％乙腈加0.1％三氟乙酸；流动相B：100％水加0.1％三氟乙酸；流速：1mL/min，检测波长：220nm；和/或使用质谱检测，质谱参数为离子源为电喷雾离子化源，雾化气流速：1.5L/min，CDL：-20.0V，CDL温度：250℃，加热块温度：200℃，离子源电压：+4.5kV，检测器电压：1.5kV，流动相流速：0.2mL/min，流动相比例：50％H2O/50％ACN。
所述方法中使用茚三酮检测Fmoc保护基脱除效果。
本申请中的质谱和液相检测方法可以使用本领域市售的仪器和耗材，适合的参数和试剂本领域技术人员可以根据该领域的一般认识和适当的初步实验确定。
附图说明
图1为WEMHA(A)、FYPW(B)和FYPTDW(C)的高效液相色谱结果图；
图2为WEMHA(A)、FYPW(B)和FYPTDW(C)的质谱分析结果图；
图3为三种寡肽的消化酶活性抑制率；
图4为WEMHA(A)、FYPW(B)和FYPTDW(C)与胰脂肪酶的分子对接结果图；
图5为WEMHA(A)、FYPW(B)和FYPTDW(C)与胆固醇酯酶的分子对接结果图；
图6为WEMHA(A)、FYPW(B)和FYPTDW(C)与α-葡萄糖苷酶的分子对接结果图。
具体实施方式
实施例1红小豆蛋白的提取
红小豆脱脂：
红小豆粉过80目筛后，按照红小豆与正己烷1:3的质量体积比混合，室温下用水浴恒温振荡器连续搅拌4h，静置1h使红小豆粉沉降，倾出上层正己烷进行回收。最后将脱脂红小豆粉置通风橱中风干12h备用。
碱溶酸沉法分离红小豆蛋白：
将脱脂红小豆粉与蒸馏水以1:10的质量体积比混合，并使用1mol/L NaOH调节溶液pH值至8.5。在40℃的水浴恒温振荡器中连续搅拌1h后，4℃，7000×g离心30min，弃沉淀。用1mol/L HCl将上清液pH值调至4.5，室温下静置1h后，在4℃，7000×g下离心10min以利于蛋白质沉淀。收集蛋白质沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀3次后复溶于5倍的蒸馏水中，使用1mol/LNaOH将pH值调节至7.0。红小豆蛋白溶液装入透析袋，并置于蒸馏水中低温透析24h。透析过程中需要换4～5次蒸馏水，最后冷冻干燥并保存在-20℃。采取凯氏定氮法测定提取的红小豆蛋白的蛋白质含量(88.7％)。
实施例2双酶水解法制备粗肽
将红小豆蛋白与蒸馏水以1:20的质量体积比混合均匀，使用1mol/L HCl调节溶液pH值到2.0。然后加入4％胃蛋白酶(w/w，250U/mg，Sigma)，混匀后置于水浴摇床中振荡酶解，摇床转速为300rpm，酶解时间2h，酶解温度37℃。
胃蛋白酶酶解结束后，先使用0.9mol/L NaHCO3将溶液pH值调节到5.3，再用1mol/L NaOH将pH值维持在7.5，最后加入4％胰酶(w/w，8×USP，Sigma)，并在37℃下酶解2h。
胰酶酶解结束后，酶解液沸水浴10min，灭活残留的酶。酶解液经室温冷却后，4℃，7000×g离心20min，收集上清液(红小豆粗肽)。
实施例3粗肽<3kDa级分的制备及鉴定
超滤制备<3kDa级分
12mL红小豆粗肽溶液转移至3kDa离心超滤管，4℃，5000×g离心30min后即得分子量＜3kDa的红小豆粗肽溶液，冷冻干燥并在-20℃保存。
肽测序
取100mg的<3kDa级分冻干粉样品并用C18除盐柱进行除盐。将样品经由配备分析柱Acclaim PepMap C18,75μm×25cm和在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。3μL样品以60min的梯度分离样品，柱流量为300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV。流动相A相：0.1％甲酸水溶液，B相：含0.1％甲酸的80％的ACN溶液。梯度从2％的B相起始，平衡3min，在47min以非线性梯度升高到35％，1min内升高到100％，维持12min。
质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数如下：(1)MS：扫描范围(m/z)：200-1800，AGC target：3e6，分辨率：70000，最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率：17500，AGC target：1e5，动态排除时间：30s，最大注入时间：45ms。
串联质谱图经过PEAKS Studio version 10.6分析。PEAKSDB对uniprot-Vigna(version202111,140881entries)数据库搜库，肽段卡值为：-10lgP≥20；在数据库中未检索到的肽段，通过设置ALC(％)≥80得出，部分典型结果见表1。
实施例4基于生物信息学技术的活性肽筛选
作为功能成分应用于和肥胖和糖尿病有关的药品的生物活性肽，其无毒和高生物活性是筛选的基本前提。胃肠道的代谢活动是限制肽类物质吸收的主要障碍，而由2-6个氨基酸组成，分子量集中在1000Da以下的寡肽可以不被胃肠道消化。故基于生物信息学技术对<3kDa级分中的肽，依据分子量小(<1000Da)、无毒、高生物活性和胃肠道不消化为标准，筛选出符合开发要求的寡肽。采用ToxinPrep(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html)平台，基于SVM(Swiss-Port)算法，对肽进行毒性预测。通过PeptideRanker在线平台(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)分析肽的潜在生物活性，其中阈值大于0.5则被认为具有生物活性。采用PeptideCutter(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)基于胃蛋白酶和胰蛋白酶对肽进行胃肠道消化性预测。最终依据分子量小(<1000Da)、无毒、高生物活性(>0.5)和胃肠道不消化为标准，首次从红小豆蛋白中筛选得到未经报道的寡肽WEMHA、FYPW和FYPTDW(见表1)。
表1基于生物信息学的红小豆肽性质预测
实施例5寡肽的人工合成
采用Fmoc固相合成法制备寡肽WEMHA、FYPW和FYPTDW，具体如下：
溶剂处理：
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇在使用前用G3孔的分子筛浸泡过夜除杂质和水。
树脂充分溶胀：
称取2.0g空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15mL DMF，室温活化30min。接第一个氨基酸：
室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入1mmol 5倍摩尔过量的C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的N,N-二异丙基碳二亚胺，DMF做溶剂室温反应3h。反应完毕用DMF洗4～6次，每次5-6mL。再加入体积比为1:1的吡啶和乙酸酐，反应30min。反应完毕用DMF洗4～6次，每次5-6mL。
Fmoc保护基的离去：
抽滤去掉的溶剂，将10mL 20％的哌啶DMF溶液加入到树脂中，N2搅拌10min后滤出溶液，再加入10mL 20％的哌啶DMF溶液，N2吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。
茚三酮检测脱除效果：
取出少量树脂，用甲醇洗三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全，即可进行下步反应；若呈无色，说明保护基没有脱除完全，则需要重复以上脱保护操作。
接第二个氨基酸及Fmoc保护基脱除：
称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的1-羟基苯并三氮唑于反应管中，加入适量DMF溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，室温反应40min，用DMF洗4～6次，每次5-6mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10mL 20％的哌啶DMF溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
以此类推，重复上面步骤，直到合成到N端最后一个氨基酸，去掉Fmoc保护基，然后抽干。
树脂的脱落及纯品分离检测：
最后用三氟乙酸切割液(95％三氟乙酸：2％三异丙基硅烷：2％乙二硫醇：1％H2O)切割2h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气吹干，再用乙醚沉淀、离心，然后用乙醚洗3～5次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体。
人工合成寡肽的质量检测：
取少量样品在超声溶解后，置于分析型高效液相色谱仪中检测。HPLC分析参数为：流动相A：100％乙腈加0.1％三氟乙酸；流动相B：100％水加0.1％三氟乙酸；流速：1mL/min，检测波长：220nm。
对于WEMHA而言，色谱柱：Gemini-NX 5μC18 110A,4.6*250mm，进样量：20μL，梯度程序如下表：
对于FYPW而言，色谱柱：4.6×250mm,Sinochrom ODS-BP 5μm，进样量：5μL，梯度程序如下表：
对于FYPTDW而言，色谱柱：4.6×250mm,Sinochrom ODS-BP 5μm，进样量：5μL，梯度程序如下表：
Agilent-6125B质谱参数如下：离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，雾化气流速：1.5L/min，CDL：-20.0V，CDL温度：250℃，加热块温度：200℃，离子源电压：+4.5kV，检测器电压：1.5kV，流动相流速：0.2mL/min，流动相比例：50％H2O/50％ACN。
最后通过高效液相色谱和质谱分析，确定三种寡肽的纯度均大于95％，具体的色谱和质谱结果分别见图1和图2。
实施例6作用靶点抑制效果的验证
胰脂肪酶活性抑制实验：
使用pH 7.3的磷酸缓冲液配制2.5mg/mL胰脂肪酶溶液，然后以5500rpm离心5min取上清液。使用pH 7.3的磷酸缓冲液稀释对硝基苯基丁酸酯至10mM。
将50μL的5mg/mL寡肽溶液(对照实验使用蒸馏水)、40μL的2.5mg/mL胰脂肪酶溶液和20μL的10mM对硝基苯丁酸酯在37℃孵育30min后，酶标仪在405nm处记录吸光度。胰脂肪酶活性的抑制率根据公式(1)进行计算。
式(1)中：A：对照的吸光度；B：对照空白的吸光度；C：样品的吸光度；D：样品空白的吸光度。
胆固醇酯酶活性抑制实验：
使用pH 7.0的磷酸缓冲液(含100mM NaCl，5.16mM牛磺胆酸钠)分别配制25μg/mL胆固醇酯酶溶液和10mM对硝基苯基丁酸酯溶液。
将50μL的8mg/mL寡肽溶液(对照实验使用蒸馏水)、50μL的25μg/mL胆固醇酯酶溶液和50μL的10mM对硝基苯丁酸酯在25℃孵育5min后，酶标仪在405nm处记录吸光度。胆固醇酯酶活性的抑制率根据公式(2)进行计算。
式(2)中：A：对照的吸光度；B：对照空白的吸光度；C：样品的吸光度；D：样品空白的吸光度。
α-葡萄糖苷酶活性抑制实验：
使用磷酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH 6.9)分别配制1U/mLα-葡萄糖苷酶溶液和5mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液。
25μL的10mg/mL寡肽溶液(对照实验使用蒸馏水)和50μL 1U/mLα-葡萄糖苷酶溶液在37℃孵育10min后，添加25μL 5mM PNPG溶液，并在37℃孵育5min，最后酶标仪在405nm处读取吸光度。α-葡萄糖苷酶活性抑制率根据公式(3)进行计算。
式(3)中：A：对照的吸光度；B：对照空白的吸光度；C：样品的吸光度；D：样品空白的吸光度。
体外试验结果发现(见图3)，寡肽WEMHA、FYPW和FYPTDW的胰脂肪酶活性抑制率分别是76.04％、57.81％和56.37％，胆固醇酯酶活性抑制率分别是63.08％、55.26％和53.34％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率分别是37.07％、45.11％和33.99％，这表明这三个寡肽对消化酶(胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶)有较好的抑制活性，尤其是WEMHA对胰脂肪酶和胆固醇酯酶有更好的抑制活性，FYPW对α-葡萄糖苷酶有更好的抑制活性，总之这三个寡肽望作为功能性成分广泛应用于和肥胖和糖尿病有关的药品中。
实施例7寡肽抑制机理的分析
将上述寡肽WEMHA、FYPW和FYPTDW进行胰脂肪酶分子对接试验，以明确抑制机理。从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)获取胰脂肪酶(PDB编号：1ETH)的晶体结构，采用Dock 6.9将三条寡肽与胰脂肪酶进行半柔性对接，基于Grid打分函数进行能量评价。在分子对接前保留胰脂肪酶分子的链A(包含448个氨基酸残基)用于对接分析，同时去除共结晶分子和其他多肽链。分子对接以胰脂肪酶活性位点(Ser153、Asp177和His264)为中心，即坐标为X：64.153，Y：39.278，Z：127.241。对接打分是配体与大分子结合的近似势能，较低的得分值表明目的大分子与配体之间具有强亲和力。范德华力贡献指的是π-π堆积、疏水作用等非极性作用。静电力贡献则表现为盐桥、氢键等极性作用。对接打分是范德华力贡献和静电力贡献的总和，通常小于-50kcal/mol的对接打分值表示较好的结合力。根据对接打分，选择与胰脂肪酶的最佳结合方式，确定寡肽与胰脂肪酶之间的相互作用方式。图4显示了寡肽与胰脂肪酶的最佳对接姿势，其中在该情况下WEMHA的对接打分是-85.155739kcal/mol，范德华力贡献是-86.007996kcal/mol，静电力贡献是0.852255kcal/mol(见表2)。对接模拟图4A也展示了肽WEMHA与胰脂肪酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用、π-π堆积和氢键。具体地说，肽WEMHA与氨基酸残基(His264)形成盐桥，与氨基酸残基(Val260、Leu214)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(His152)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Phe259、Ser153、Phe78、Tyr115)形成氢键(见图4A)。FYPW的对接打分是-88.913910kcal/mol，范德华力贡献是-89.265671kcal/mol，静电力贡献是0.351757kcal/mol(见表2)。对接模拟图4B也展示了肽FYPW与胰脂肪酶氨基酸残基的结合主要依赖于疏水相互作用、π-π堆积和氢键。具体地说，肽FYPW与氨基酸残基(Pro181、Tyr115、Phe78、Leu265、Val260、Ala261、Trp253)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(His152)形成π-π堆积，与氨基酸残基(His152、Asp80、Arg257)形成氢键(见图4B)。FYPTDW的对接打分是-104.993675kcal/mol，范德华力贡献是-105.254501kcal/mol，静电力贡献是0.260825kcal/mol(见表2)。对接模拟图4C也展示了肽FYPTDW与胰脂肪酶氨基酸残基的结合主要依赖于疏水相互作用、π-π堆积和氢键。具体地说，肽FYPTDW与氨基酸残基(Trp253、Ile79、Tyr115、Pro181、Val260、Ala261、Leu265)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(His152)形成π-π堆积，与氨基酸残基(His152、Asp80)形成氢键(见图4C)。
将上述寡肽WEMHA、FYPW和FYPTDW进行胆固醇酯酶分子对接试验，以明确抑制机理。从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)获取胆固醇酯酶(PDB编号：1F6W)的晶体结构，采用Dock 6.9将三条寡肽与胆固醇酯酶进行半柔性对接，基于Grid打分函数进行能量评价。在分子对接前去除多余的水分子，同时分子对接以胆固醇酯酶活性位点(Ser194、His435和Asp320)为中心，即坐标为X：8.039，Y：-1.404，Z：21.544。根据对接打分，选择与胆固醇酯酶的最佳结合方式，确定寡肽与胆固醇酯酶之间的相互作用方式。图5显示了寡肽与胆固醇酯酶的最佳对接姿势，其中在该情况下WEMHA的对接打分是-90.673828kcal/mol，范德华力贡献是-87.311569kcal/mol，静电力贡献是-3.362263kcal/mol(见表2)。对接模拟图5A也展示了肽WEMHA与胆固醇酯酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用和氢键。具体地说，肽WEMHA与氨基酸残基(Lys445)形成盐桥，与氨基酸残基(Ile439、Phe324、Trp227、Val285、Ala108)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Asp437、His435、Tyr125)形成氢键(见图5A)。FYPW的对接打分是-83.269859kcal/mol，范德华力贡献是-80.324417kcal/mol，静电力贡献是-2.945439kcal/mol(见表2)。对接模拟图5B也展示了肽FYPW与胆固醇酯酶氨基酸残基的结合主要依赖于疏水相互作用、π-阳离子相互作用和氢键。具体地说，肽FYPW与氨基酸残基(Leu124、Ala436、Phe324、Met281、Leu392、Val285、Trp227、Ala108)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Trp227)形成π-阳离子相互作用，与氨基酸残基(Ser194、His435、Asp437)形成氢键(见图5B)。FYPTDW的对接打分是-104.004013kcal/mol，范德华力贡献是-101.542305kcal/mol，静电力贡献是-2.461708kcal/mol(见表2)。对接模拟图5C也展示了肽FYPTDW与胆固醇酯酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用和氢键。具体地说，肽FYPTDW与氨基酸残基(Lys445)形成盐桥，与氨基酸残基(Phe119、Phe393、Phe324、Trp227、Ala108)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Gly107、Ser194、His435、Asp437、Gln440)形成氢键(见图5C)。
将上述寡肽WEMHA、FYPW和FYPTDW进行α-葡萄糖苷酶分子对接试验，以明确抑制机理。从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)获取α-葡萄糖苷酶(PDB编号：3A4A)的晶体结构，采用Dock 6.9将三条寡肽与α-葡萄糖苷酶进行半柔性对接，基于Grid打分函数进行能量评价。在分子对接前去除多余的水分子，同时分子对接以α-葡萄糖苷酶活性位点(Asp215、Glu277和Asp352)为中心，即坐标为X：21.016，Y：-5.15，Z：21.61。根据对接打分，选择与α-葡萄糖苷酶的最佳结合方式，确定寡肽与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用方式。图6显示了寡肽与α-葡萄糖苷酶的最佳对接姿势，其中在该情况下WEMHA的对接打分是-108.6011kcal/mol，范德华力贡献是-105.3338kcal/mol，静电力贡献是-3.2672kcal/mol(见表2)。对接模拟图6A也展示了肽WEMHA与α-葡萄糖苷酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用和氢键。具体地说，肽WEMHA与氨基酸残基(Lys156、Asp307)形成盐桥，与氨基酸残基(Phe303、Asp307、Arg315)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Glu277、Arg442、Thr306、Thr310)形成氢键(见图6A)。FYPW的对接打分是-87.6918kcal/mol，范德华力贡献是-84.9916kcal/mol，静电力贡献是-2.7002kcal/mol(见表2)。对接模拟图6B也展示了肽FYPW与α-葡萄糖苷酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用、π-π堆积和氢键。具体地说，肽FYPW与氨基酸残基(Glu411)形成盐桥，与氨基酸残基(Asp352、Tyr72、Val216、Phe178)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Phe303)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Tyr347、Asn350)形成氢键(见图6B)。FYPTDW的对接打分是-98.5592kcal/mol，范德华力贡献是-97.1765kcal/mol，静电力贡献是-1.3827kcal/mol(见表2)。对接模拟图6C也展示了肽FYPTDW与α-葡萄糖苷酶氨基酸残基的结合主要依赖于盐桥、疏水相互作用、π-π堆积和氢键。具体地说，肽FYPTDW与氨基酸残基(Asp352、Glu411)形成盐桥，与氨基酸残基(Asp352、Val216、Phe178、Phe159、Tyr158、Lys156、Pro312、Asp307、Phe303、Arg315)形成疏水相互作用，与氨基酸残基(Tyr72、Phe303)形成π-π堆积，与氨基酸残基(Asn350、Tyr158、Ser240、Gln279)形成氢键(见图6C)。
表2寡肽的分子对接结果

Claims (7)

1.红小豆来源的寡肽，其特征在于，所述寡肽来源于红小豆，并具有胰脂肪酶、胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性；所述寡肽的氨基酸序列为FYPTDW。
2.根据权利要求1所述的寡肽在制备控制肥胖和糖尿病的药物组合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述药物组合物还包括选自填充剂、包衣剂、pH调节剂、抗氧化剂、溶剂、助溶剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种的辅料。
4.根据权利要求2所述的应用，其中所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、水针剂、粉针剂。
5.用于控制肥胖和糖尿病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的寡肽。
6.根据权利要求1所述的寡肽的Fmoc固相合成制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)使用分子筛浸泡N,N-二甲基甲酰胺，甲醇除杂；
(2)N,N-二甲基甲酰胺溶胀活化Wang树脂；
(3)接第一个氨基酸；
(4)Fmoc保护基脱除；
(5)接第二个氨基酸并脱除Fmoc保护基；
(6)重复步骤(5)多次，直到合成到最后一个氨基酸并脱除Fmoc保护基；
(7)树脂的脱落及纯品分离检测；所述检测通过质谱和/或液相方法进行。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中：
所述步骤(3)为：室温下，通过抽滤去掉N,N-二甲基甲酰胺，加入1mmol 5倍摩尔过量的C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的N,N-二异丙基碳二亚胺，N,N-二甲基甲酰胺做溶剂室温反应3h；反应完毕用N,N-二甲基甲酰胺洗4～6次，每次5-6mL；再加入体积比为1:1的吡啶和乙酸酐，反应30min；反应完毕用N,N-二甲基甲酰胺洗4～6次，每次5-6mL；
所述步骤(4)为：抽滤去掉N,N-二甲基甲酰胺，将10mL 20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液加入到树脂中，N2搅拌10min后滤出溶液，再加入10mL 20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液，N2吹动搅拌5min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用N,N-二甲基甲酰胺洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL；
所述步骤(5)为：称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的1-羟基苯并三氮唑于反应管中，加入适量N,N-二甲基甲酰溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，室温反应40min，用N,N-二甲基甲酰洗4～6次，每次5-6mL；取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10mL 20％的哌啶N,N-二甲基甲酰溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用N,N-二甲基甲酰洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL；
所述步骤(7)包括：以含95％三氟乙酸、2％三异丙基硅烷、2％乙二硫醇、1％H2O的三氟乙酸切割液切割2h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气吹干，再用乙醚沉淀、离心，然后用乙醚洗3～5次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体；以及
取样品在超声溶解后，置于分析型高效液相色谱仪中检测；HPLC分析参数为：流动相A：100％乙腈加0.1％三氟乙酸；流动相B：100％水加0.1％三氟乙酸；流速：1mL/min，检测波长：220nm；和/或使用质谱检测，质谱参数为离子源为电喷雾离子化源，雾化气流速：1.5L/min，CDL：-20.0V，CDL温度：250℃，加热块温度：200℃，离子源电压：+4.5kV，检测器电压：1.5kV，流动相流速：0.2mL/min，流动相比例：50％H2O/50％ACN。
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