CN114129704B - 一种乳源性寡肽在制备防治糖尿病及糖尿病并发症药物中的应用 - Google Patents
一种乳源性寡肽在制备防治糖尿病及糖尿病并发症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有如SEQID NO.1所述氨基酸序列的乳源性寡肽在制备防治糖尿病及其并发症药物中的应用。本发明所述寡肽能显著降低1型和2型糖尿病小鼠的血糖，促进胰岛β细胞去分化和增殖，改善胰岛形态，促进胰岛素分泌，并能有效减少胰岛的氧化应激损伤；能显著改善胰岛素抵抗，对糖脂代谢有积极的调节作用，促进胰岛素抵抗肝细胞葡萄糖吸收和糖原合成；能显著降低糖尿病小鼠的肝重指数和体重，且能优化血液中的各项指标，尤其显著降低血清谷丙转氨酶和甘油三酯水平，从而控制肥胖和降低肝损伤。可用于制备防治糖尿病及其并发症的药物，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及肽的用途，具体涉及一种乳源性寡肽在制备防治糖尿病及糖尿病并发症药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一类在世界范围内广泛存在的代谢性疾病。2019年，国际糖尿病联盟(IDF)公布了第九版的全球糖尿病地图。结果显示，全球约4.25亿人患有糖尿病。我国成年糖尿病(20-79岁)患病人数达到1.14亿，是全球糖尿病患病人数最多的国家。另外，中国也是老年糖尿病人数最多的国家，目前中国65岁以上的糖尿病患者已经达到3550万。糖尿病人中1型糖尿病(T1D)与2型糖尿病(T2D)占据大多数。1型糖尿病与与β细胞的自身免疫性破坏有关，胰岛β细胞受损，胰岛素分泌减少有关，表现为胰岛素的绝对缺乏；2型糖尿病则则与肥胖和胰岛素抵抗引起的胰岛β细胞功能和存活的逐渐恶化有关，早期表现为胰岛素的相对缺乏，即外周组织对胰岛素作用不敏感，并产生糖、脂、蛋白质代谢紊乱，其具体发病机制仍未有定论。血糖高还会引发严重的糖尿病并发症，如肥胖；高血脂；视神经萎缩导致视力下降，严重时可致失明；肾病，严重时肾功能衰竭；心肌梗死、脑梗、脑溢血、下肢坏死等。
糖尿病是一种糖代谢障碍合并蛋白质和脂肪代谢障碍为特征的内分泌紊乱疾病，和生活习惯、饮食结构、活动方式有关。1型糖尿病与胰岛β细胞退行性改变有关，β细胞不能分泌足够的胰岛素。氧化应激可通过损伤胰岛β细胞导致1型糖尿病的发生发展。氧化应激的标志物主要为自由基，其中关系密切的反应性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)又称活性氧族。ROS可直接损伤胰岛β细胞，还可通过影响胰岛素合成和分泌的信号转导通路间接损伤胰岛β细胞。2型糖尿病发病的主要环节包括β细胞功能缺陷导致不同程度的胰岛素缺乏和组织对胰岛素抵抗。于是，胰岛素增敏剂和促进胰岛素分泌类药物被开发出来，用于解决这两大类问题。2型糖尿病早期，胰岛素对其受体的亲和力降低导致高胰岛素血症，引发胰岛素抵抗。随着糖尿病的发展，引起β细胞功能缺陷。而研究表明，β细胞去分化是2型糖尿病中β细胞功能异常的主要原因。临床用药上，1型糖尿病需要长期应用胰岛素维持生命，2型糖尿病患者用药首选二甲双胍，其他还有胰岛素增敏剂、GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂等。但注射胰岛素对糖尿病患者依从性差，使用带来痛苦；二甲双胍有诸多副作用如胃肠道紊乱、乳酸性酸中毒和B12缺乏症等；GLP-1受体激动剂代表药物艾塞那肽、利拉鲁肽等价格昂贵。因此，研究开发一种制备方法简单、价格低且安全无毒副作用的糖尿病药物具有非常大的前景。
肽类药物是生物药物中的一大类别，具有明显优点。肽类均直接或间接来自天然产物；肽类的特异性远强于小分子，抗原性远低于蛋白质，摒弃了小分子和蛋白质药物的缺点；代谢产物氨基酸基本不具备毒性，所以安全性高，是极具发展前景的功能因子。寡肽往往能开避胃肠道消化，克服蛋白质分子被消化酶破坏从而不能口服的弊端。因此开发具有降糖作用的肽类药物成为各国医药研发人员的研究热点。
β-乳球蛋白是牛乳的主要蛋白质，寡肽LIVTQTMKG是β-乳球蛋白经过嗜热菌蛋白酶分解产生的一种小肽。尚未见其用于防治糖尿病及糖尿病并发症的报道。
发明内容
发明目的：
本发明的目的在于公开一种寡肽在防治糖尿病及糖尿病并发症的药物中的应用。
技术方案：
具有LIVTQTMKG氨基酸序列的寡肽在制备防治糖尿病药物中的应用。本发明将具有LIVTQTMKG氨基酸序列的寡肽缩写为LGP9。
所述寡肽添加一种或多种药学上可接受的辅料制成制剂。
所述寡肽通过合成或由牛乳蛋白水解产物分离得到。
所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂等。
所述制剂为注射剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂等。
所述制剂的给药方式包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、口服给药。
本发明所述寡肽作为一种结构明确的寡肽药物，其氨基酸序列决定了它不仅可以规避胃肠道消化，而且易于穿过生物膜，从而有助于胃肠道吸收，有助于开展较为充分的药效学研究，有利于开发成口服药物。
本发明通过体内实验证明，LGP9可显著降低糖尿病小鼠的高血糖、高血脂和肥胖，可用于制备防治糖尿病及其并发症的药物。具体来说，本发明通过建立四氧嘧啶(ALX)诱导的1型糖尿病小鼠模型证明，LGP9能明显降低小鼠血糖，减轻“三多一少”症状，减轻胰岛的氧化应激损伤，促进胰岛细胞增殖，修复损伤的胰岛，增加胰岛素的合成和分泌。本发明通过自发性2型糖尿病KKay模型小鼠及建立高脂饮食(HFD)加链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病小鼠模型证明，LGP9能显著降低各种2型糖尿病模型小鼠高血糖，减轻胰岛素抵抗，并显著逆转糖尿病小鼠β细胞去分化，从而增加胰岛素的合成和分泌。此外，LGP9显著降低糖尿病小鼠的肝重指数和体重，且能优化血液中的各项指标，尤其显著降低血清谷丙转氨酶和甘油三酯水平。
有益效果
本发明发现了寡肽的新用途，具体而言：该寡肽能显著降低1型和2型糖尿病小鼠的血糖，促进胰岛β细胞去分化和增殖，改善胰岛形态，促进胰岛素分泌，并能有效减少胰岛的氧化应激损伤；能显著改善胰岛素抵抗，对糖脂代谢有积极的调节作用，促进胰岛素抵抗肝细胞葡萄糖吸收和糖原合成；能显著降低糖尿病小鼠的肝重指数和体重，且能优化血液中的各项指标，尤其显著降低血清谷丙转氨酶和甘油三酯水平，从而控制肥胖和降低肝损伤。可用于制备防治糖尿病及其并发症的药物，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为LGP9纯度及分子量鉴定，其中A为HPLC图谱，B为质谱图；
图2为LGP9对四氧嘧啶诱导的1型糖尿病小鼠的治疗作用。A为各组小鼠体重变化；B为各组小鼠饮水量变化；C为各组小鼠的空腹血糖值；D为各组小鼠的糖化血清蛋白水平；E为各组小鼠胰岛MDA水平；F为各组小鼠胰岛SOD水平；G为各组小鼠胰岛组织HE染色结果(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)；
图3为LGP9对四氧嘧啶损伤的胰岛β细胞的保护作用。A为细胞存活率；B为细胞MDA含量(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)；
图4为LGP9对高脂饲料加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病ICR小鼠的治疗作用。A为各组小鼠体重变化；B为各组小鼠饮水量变化；C为各组小鼠的空腹血糖值；D为各组小鼠的糖化血清蛋白水平；E-F为各组小鼠胰岛素耐量的实验结果；G为各组小鼠胰岛组织HE染色结果(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)；
图5为LGP9对高脂饮食加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病C57BL/6J小鼠的治疗作用。A为各组小鼠体重变化；B为各组小鼠进食量变化；C为各组小鼠饮水量变化；D为各组小鼠的空腹血糖值；E-F为各组小鼠口服糖耐量的实验结果；G-H为各组小鼠腹腔注射胰岛素耐量的实验结果；I为各组小鼠的谷丙转氨酶水平；J为各组小鼠的糖化血红蛋白水平；K-L为各组小鼠血清胰岛素和血清胰高血糖素水平；M为各组小鼠胰岛组织HE染色结果(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)；
图6为LGP9对自发性糖尿病小鼠KK-Ay小鼠的治疗作用。A为各组小鼠体重变化；B为各组小鼠饮水量变化；C为各组小鼠的空腹血糖值；D-E为各组小鼠口服糖耐量的实验结果；F为各组小鼠胰岛组织HE染色结果(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝3)；
图7为LGP9对胰岛素抵抗肝细胞的改善作用。A为细胞糖吸收；B为细胞糖原含量；C为胰岛素作用后细胞糖吸收变化(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)。
图8为LGP9对高糖诱导胰岛细胞Rin-m5f去分化相关标志物表达的影响。A为INS的mRNA水平；B为Pdx1的mRNA水平；C为Nkx6.1的mRNA水平；D为Mafa的mRNA水平；E为Glut2的mRNA水平；F为ALDH1A3的mRNA水平；G为Ngn3的mRNA水平；H为Oct4的mRNA水平；I为WB结果；J-K为GLUT2、PDX1和INS的蛋白表达水平。
图9为LGP9对高脂饲料加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病C57BL/6J小鼠胰腺β细胞去分化标志物表达的影响。A为PDX1的WB图谱；B为PDX1表达的定量分析；C为ChgA、ALDH1A3和OCT4的WB图谱；D为OCT4表达的定量分析；E为ChgA表达的定量分析；F为ALDH1A3表达的定量分析。
具体实施方式
实施例1：LGP9的合成及纯度
所述LGP9由上海生物工程有限公司合成，纯度为95％，质谱鉴定分子量为990.3Da(图1)。
实施例2：LGP9对四氧嘧啶诱导的1型糖尿病小鼠的治疗作用
使用四氧嘧啶诱导建立1型糖尿病小鼠模型，实验选用清洁级ICR小鼠(由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号:SCXK(苏)2017-0007)，雄性，体重22-24g，饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22±2℃，湿度为50％-60％。适应性饲养3天后，饥饿8小时，眼眶取血测定空腹血糖，以剔除血糖异常小鼠。继续禁食不禁水至24小时，尾静脉注射50mg/Kg四氧嘧啶。注射72小时后，测定空腹血糖，将空腹血糖值大于11.1mmol/L且出现多饮多食多尿症状的小鼠，作为模型成功的模型鼠。根据血糖值随机分成三组，分别为模型组，LGP9低剂量组(0.3mg/Kg)，LGP9高剂量组(1mg/Kg)。实验给药周期为4周，实验中小鼠自由饮食和饮水，每天一次进行LGP9灌胃操作，每周测定一次空腹血糖。实验开始四周后处死小鼠，处死前禁食不禁水12小时。处死时摘取眼球取血，处死后开腹，分离胰腺组织，取部分胰腺放入组织固定液中；收集血清，测定小鼠血清中糖化血清蛋白的含量；称取胰腺组织，用PBS提取胰腺组织中的MDA和SOD并进行测定；取组织固定液中的胰岛组织进行HE染色。
结果：根据体重结果(图2A)，模型组小鼠体重相比于对照组持续下降且下降明显。根据饮水量结果(图2B)，模型组小鼠饮水量显著高于对照组。并且在实验过程中，观察到模型组小鼠活力下降，反应迟钝，进食量多但瘦弱，尿量增多的现象。以上结果均反映出四氧嘧啶诱导的1型糖尿病模型小鼠具有明显的“三多一少”症状。在给予LGP9之后，低剂量组与高剂量组均对糖尿病小鼠有恢复部分体重与降低饮水量的改善作用(图2A和2B)，改善作用随给药天数增加而更加显著。
根据每周测定小鼠空腹血糖的结果(图2C)，第0周，模型组、LGP9低剂量组(0.3mg/Kg)和LGP9高剂量组(1mg/Kg)的空腹血糖值显著高于正常对照组，且彼此间无差异。开始给药后，LGP9低剂量组与LGP9高剂量组的血糖开始下降，低剂量组在给药第2周和第3周相比于模型组显示出显著性差异，高剂量组则在第2周、第3周和第4周持续显示出显著性的降血糖效果。糖化血清蛋白可以反映过去1-3周的平均血糖浓度，是糖尿病诊断及用药监测的重要指标。根据图2D，模型组的糖化血清蛋白水平显著高于正常对照组。在给予LGP9之后，LGP9低剂量组相比于模型组糖化血清蛋白水平有轻微下降，而LGP9高剂量组则相比于模型组显著降低。以上结果说明LGP9对糖尿病小鼠具有显著的降糖效果。
丙二醛(MDA)作为体内脂质过氧化的终产物，常常用来衡量动物体受到氧自由基损伤的程度。根据图2E，在模型组小鼠胰腺中，MDA相比于对照组显著增多。当给予LGP9进行治疗后，相比于模型组，LGP9低高剂量均表现了对MDA产生的显著降低作用。超氧化物歧化酶(SOD)可以消除体内的超氧自由基，使之转化为过氧化氢，在体内过氧化氢酶的作用下，分解成为无毒无害的水。因此，SOD的含量反映着体内清除自由基的能力。根据图2F，模型组小鼠相比于对照组小鼠，四氧嘧啶导致的胰岛损伤使得SOD的含量显著降低，当给予LGP9以后，低剂量组高剂量组相比于模型组都有了显著的升高。以上结果说明LGP9对于胰岛的氧化应激损伤有显著的修复作用。
根据胰岛HE染色结果(图2G)，正常对照组的胰岛胰岛结构呈圆形，边缘清晰且面积较大。而模型组胰岛面积显著缩小，且结构遭到破坏不够清晰。在给予LGP9之后，相比于模型组胰岛，低剂量组与高剂量组的胰岛形态、大小均呈现不同程度的好转。这表明LGP9对损伤的胰岛有显著修复和促进增殖的作用。
实施例3：LGP9对四氧嘧啶损伤的胰岛β细胞的保护作用
培养胰岛β细胞株Rin-m5f细胞，接种于96孔板，在含有10％新生牛血清的1640培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时。加入含15mM四氧嘧啶的培养基作用1小时建立β细胞损伤模型，然后吸弃培养液，换成含有不同浓度LGP9(10μM、30μM、90μM、150μM)的培养基孵育24小时。孵育完成后，每孔加10μL MTT溶液，在37℃、5％CO2条件下继续培养4小时，小心弃去孔内培养基，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)震荡摇匀10分钟，在波长490nm测各孔吸光度并计算细胞存活率。
结果：根据图3A，15mM的四氧嘧啶作用1小时后，胰岛β细胞的存活率显著下降约50％，说明四氧嘧啶对胰岛β细胞造成了显著损伤。在给予不同浓度的LGP9作用24小时后，细胞存活率有不同程度的上升，从30μM起相比于模型组有显著差异。这说明LGP9可以显著降低四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤。
培养胰岛β细胞株Rin-m5f细胞，接种于6孔板，在含有10％新生牛血清的1640培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时，然后分组(正常组、模型组、LGP9 30μM组、LGP990μM组)再孵育24小时。收集细胞裂解，取细胞裂解液上清测定MDA和SOD的含量。
结果：MDA含量代表胰岛β细胞受氧自由基损伤的程度。根据图3B，模型组中，胰岛β细胞MDA含量相比于正常组显著增加，低、高剂量的LGP9作用后，均显著降低了损伤β细胞中的MDA含量。SOD的含量反映着胰岛β细胞清除自由基的能力。根据图3C，模型组β细胞的SOD含量则相比正常组显著减少，在90μM的LGP9作用下，β细胞中的SOD含量相比模型组有显著上升。这说明，LGP9可以显著减轻四氧嘧啶损伤的β细胞中的氧化损伤。
实施例4：LGP9对高脂饲料加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病ICR小鼠的降糖作用
实验选用清洁级雄性ICR小鼠(由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2017-0007)，4周龄，体重18-22g，实验动物饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22±2℃，湿度为50％-60％。适应性饲养3天后，随机挑选6只作为正常对照组，始终喂养普通饲料。其余小鼠喂高脂饲料(20％猪油，2％麻油，22％糖，1％胆固醇，0.2％胆盐加高蛋白基础配料)，高脂饲料喂养6周后，进行STZ腹腔注射，注射剂量为30mg/Kg，连续4天，正常对照组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。完成注射3周后，眼眶取血测定小鼠空腹血糖值，将空腹血糖值大于11.1mmol/L的认定为造模成功。随机将小鼠分为模型组,LGP9组(3mg/Kg)和阳性组(200mg/Kg二甲双胍，即MET组)。糖尿病小鼠按分组连续5周每天灌胃3mg/Kg LGP9和200mg/Kg MET溶液，正常对照组和模型组灌胃等剂量的蒸馏水。实验给药周期为35天，实验中小鼠自由进食和饮水，每周测定一次空腹血糖。实验末期，进行胰岛素耐量测定。实验开始5周后断颈处死小鼠，处死前禁食不禁水12小时。收集血液，分离血清，测定小鼠血清中糖化血清蛋白(GSP)和甘油三酯(TG)的含量。分离胰腺组织，同时取胰腺尾部放入组织固定液中，用于后续HE染色。分离肝脏组织称重并计算肝重指数。
结果：2型糖尿病小鼠表现为肥胖、多饮、多食、多尿的特征。模型组小鼠体重(图4A)虽未相对正常对照组拉开差距，但饮水量(图4B)大幅上升，结合造模后小鼠空腹血糖值远远高于正常对照组(图4C)，可以确定该2型糖尿病小鼠造模成功。在LGP9作用后，糖尿病小鼠体重(图4A)呈现下降的趋势，但相对模型组无统计学差异。饮水量(图4B)在LGP9作用1周后即出现下降，2周后下降至正常对照组小鼠饮水量水平，并维持至实验结束。二甲双胍作为2型糖尿病的临床一线用药，对糖尿病小鼠的体重和饮水量均起到了显著的降低作用(图4A和4B)。以上结果说明LGP9与阳性药二甲双胍对糖尿病小鼠的体重和饮水量均有显著的降低作用。
根据小鼠空腹血糖周变化的结果(图4C)，造模后，模型组、LGP9组与MET组的空腹血糖值均远远高于正常对照组，集中在35mmol/L的高血糖水平。LGP9作用后，糖尿病小鼠血糖上升的趋势得到抑制，相比于模型组血糖有所降低，在第4、5周与模型组血糖拉开差距，显著降低。LGP9发挥了降血糖作用，且与二甲双胍作用相似，说明LGP9对2型糖尿病小鼠具有显著降糖效果。
糖化血清蛋白(GSP)半衰期20天，代表1到3周内的平均血糖水平。根据结果(图4D)，模型组相比正常组小鼠的糖化血清蛋白水平要显著增高，LGP9作用后，糖尿病小鼠糖化血清蛋白相比于模型组显著下降。
胰岛素耐量实验(ITT)可以直接地反映机体对胰岛素的敏感性。根据图4E，在注射胰岛素后，模型组小鼠血糖下降缓慢，2小时后未能降至正常水平，且曲线下面积(图4F)显著高于正常组小鼠，这符合2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的特征。LGP9在改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗的方面显示出了良好的效果，在注射胰岛素后，LGP9组小鼠的血糖值连续下降，在2小时后基本降至正常组水平，血糖曲线下面积对比模型组小鼠有显著下降，这说明LGP9治疗改善了糖尿病小鼠外周组织的胰岛素抵抗，使胰岛素发挥了降血糖的作用，也提示LGP9或有胰岛素增敏的作用。
根据小鼠胰岛HE染色结果(图4G)，正常组小鼠的胰岛染色较浅，结构呈圆形，轮廓清晰且面积较大。而模型组小鼠的胰岛面积大小不一，边界模糊，说明受到了损伤。LGP9组与MET组小鼠的胰岛相比于模型组胰岛，在形态、大小上均呈现好转，边界更清晰，形态更规整。这提示LGP9和二甲双胍对损伤的胰岛有显著的修复和保护的作用。
2型糖尿病中脂代谢紊乱、胰岛素相对缺乏等会引起脂质堆积在肝脏中，损害肝脏功能，影响肝脏糖代谢，从而加剧糖尿病。脂质堆积将增加肝脏的大小和重量，因而导致肝重指数(肝重指数＝肝重/体重)的上升。根据表1，模型组小鼠的肝脏占全身重量的比例要显著高于正常组小鼠，而LGP9组及MET组都显著地降低了糖尿病小鼠的肝重指数。
血清甘油三酯(TG)是临床上一项重要的血脂指标，过高的甘油三酯水平会影响脂肪细胞功能，导致血液黏稠度增加，增加心血管疾病风险。高脂饮食、肥胖、糖尿病等都容易引发甘油三酯升高。根据表1，模型组小鼠的血清甘油三酯水平较正常组显著升高。而LGP9组与MET组的小鼠血清甘油三酯水平都相比于模型组显著下降，绝大部分在1.76mmol/L的正常界限以下，这说明LGP9与阳性药二甲双胍均能有效降低肥胖糖尿病小鼠的血清甘油三酯水平。
表1 2型糖尿病ICR小鼠中各组小鼠的肝重指数及血清甘油三酯水平
(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)
实施例5：LGP9对高脂饲料加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病C57BL/6J小鼠的治疗作用
实验选用清洁级雄性C57BL/6J小鼠(由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号:SYXK(苏)2021-0011)，6周龄，体重18-22g，实验动物饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22±2℃，湿度为50％-60％。适应性饲养3天后，随机挑选6只作为正常对照组，始终喂养普通饲料。其余小鼠喂高脂饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司专利配方饲料：ZL201110127312.5)，高脂饲料喂养6周后，进行链脲佐菌素腹腔注射，注射剂量为20mg/Kg，连续4天，正常对照组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。完成注射1周后，再次进行链脲佐菌素腹腔注射，注射剂量为10mg/Kg，连续3天，正常对照组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。完成注射两周后，禁食小鼠8小时，进行尾尖采血，用血糖试纸条测定小鼠空腹血糖值，将空腹血糖值大于11.1mmol/L的认定为造模成功。随机将小鼠分为模型组，LGP9低剂量组(1mg/Kg)，LGP9中剂量组(3mg/Kg)，LGP9高剂量组(9mg/Kg)和阳性组(150mg/Kg二甲双胍，0.2mg/Kg利拉鲁肽)。糖尿病小鼠按分组连续4周每天灌胃LGP9和二甲双胍，腹腔注射利拉鲁肽，正常对照组和模型组灌胃等剂量的蒸馏水。实验给药周期为28天，实验中小鼠自由进食和饮水，从给药的第二周开始每周测定一次空腹血糖。实验末期，进行口服糖耐量和胰岛素耐量测定。实验结束后断颈处死小鼠，收集血液，分离血清，测定小鼠血清中胰岛素和糖化血红蛋白的含量；分离胰腺组织，同时取胰岛含量丰富的胰腺尾部放入组织固定液中，进行HE染色。
结果显示：根据体重、进食量和饮水量结果(图5A-C)，模型组小鼠体重、进食量和饮水量均有上升，与正常组小鼠拉开差距，结合造模后小鼠空腹血糖值远远高于正常对照组(图5D)，可以确定该2型糖尿病小鼠造模成功。在生物活性肽LGP9作用后，糖尿病小鼠体重降低较为明显，进食量和饮水量在给药1周后即出现下降，2周后下降至正常对照组小鼠饮水量水平，并维持至实验结束。二甲双胍和利拉鲁肽均是2型糖尿病的临床一线用药，二甲双胍是小分子药物，通过口服给药，而利拉鲁肽是大分子肽类药物，通过腹腔注射给药。两种阳性药均对糖尿病小鼠的体重、进食量和饮水量起到了降低作用(图5A-C)。以上结果说明LGP9对糖尿病小鼠的体重、进食量和饮水量有显著的降低作用。
根据小鼠空腹血糖周变化的结果(图5D)，造模后，未给药前，模型组、LGP9组与二甲双胍组的空腹血糖值均远远高于正常对照组，属于高血糖水平。LGP9作用后，在第3、4周与模型组血糖拉开差距，显著下降。二甲双胍组和利拉鲁肽组在给药第3周和第4周相比于模型组血糖显著下降。以上结果说明LGP9可以显著降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，且低、中、高剂量组间存在剂量依赖性作用。
根据小鼠口服糖耐量结果(图5E-F)和小鼠腹腔注射胰岛素耐量结果(图4G-H)，禁食16小时后对小鼠灌胃2g/Kg的葡萄糖(0.4g/mL)，对照组小鼠血糖波动幅度小，在2小时内恢复至初始水平，而模型组糖尿病小鼠有着明显的糖耐量受损的情况，其血糖急剧上升，在2小时内不能恢复到初始水平。LGP9低、中、高剂量组和阳性药组小鼠的糖耐量受损情况均得到了较好的改善，曲线下面积相比于模型组有显著下降。小鼠口服糖耐量实验结束三天后，禁食4小时，检测小鼠腹腔注射胰岛素耐量的情况。结果显示在注射胰岛素30分钟后对照组小鼠血糖降低幅度小，并且在两小时内恢复至初始水平；模型组小鼠的血糖波动幅度大，说明其体内胰岛素调控紊乱，不能很好地控制血糖稳态；而LGP9低剂量组小鼠相对于模型组小鼠情况有所改善，但并没有统计学差异，LGP9中、高剂量组和阳性药组小鼠情况改善良好，均有显著性差异。以上结果说明糖尿病小鼠有着严重的糖耐量受损，对胰岛素的调控出现紊乱，对血糖的调节能力较差，无法调控体内的血糖稳态，LGP9则对小鼠糖耐量受损和血糖稳态的调控有良好的改善作用。
谷丙转氨酶(ALT)在肝脏中含量很高，当肝脏受损或者在病毒性肝炎的急性阶段，肝细胞受损后，该酶逸入血液，可使血清中ALT含量明显升高。根据小鼠血清中ALT结果(图5I)，模型组小鼠血清中ALT含量比对照组小鼠血清ALT含量明显升高，肝损伤明显。LGP9低、中、高剂量组小鼠ALT下降呈剂量依赖性，中、高剂量组与模型组相比有显著差异。阳性药二甲双胍组和利拉鲁肽组小鼠ALT均有明显的下降。以上结果说明LGP9与二甲双胍和利拉鲁肽效果相似，能有效的减少肝细胞损伤。
糖化血红蛋白浓度(GHb)可有效地反映过去8～12周平均血糖水平。根据小鼠糖化血红蛋白结果(图5J)，在4周内模型组小鼠糖化血红蛋白含量显著增高，这说明模型组小鼠的血糖显著升高。LGP9低、中、高剂量与阳性药二甲双胍、利拉鲁肽对于糖尿病小鼠糖化血红蛋白有不同程度的降低作用。以上结果说明，LGP9能有效的降低糖化血红蛋白的含量。
根据血清胰岛素结果(图5K)和胰高血糖素结果(图5L)，模型组小鼠的血清胰岛素含量明显降低，同时胰高血糖素含量显著升高。LGP9作用后，低、中剂量组小鼠血清胰岛素升高，血清胰高血糖素降低明显；LGP9高剂量组小鼠血清胰岛素增加显著，同时血清胰高血糖素降低显著。阳性药二甲双胍组小鼠血清胰岛素增高明显，血清胰高血糖素减少也较为显著；利拉鲁肽组小鼠血清胰岛素升高明显，但血清胰高血糖素减少不显著。通过小鼠血糖水平和胰岛素水平计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR，HOMA-IR＝空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(μU/mL)/22.5)，结果(表2)显示模型组小鼠HOMA-IR指数升高显著且＞1.66，说明模型组小鼠已经发生了严重的胰岛素抵抗；LGP9处理后的小鼠HOMA-IR指数降低显著。以上结果说明LGP9和阳性药均对胰岛素抵抗有较好的改善。
表2 2型糖尿病C57BL/6J小鼠中各组小鼠的胰岛素抵抗指数
(与正常组相比*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001与模型组相比#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；n＝6)；
根据小鼠胰岛HE染色结果(图5M)，对照组小鼠的胰岛染色较浅，结构近似圆形，轮廓清晰且面积较大。模型组小鼠胰岛明显减小，形态不规则且边界模糊，说明胰岛受到了损伤。LGP9低剂量组小鼠胰岛依旧较小，边界较为清晰，在形态上有所好转，LGP9中、高剂量组和阳性药二甲双胍、利拉鲁肽组小鼠胰岛在大小、形态方便均有较好的改善，胰岛面积恢复正常水平，边界清晰，近似圆形。以上说明LGP9中、高剂量和阳性药二甲双胍、利拉鲁肽对损伤的胰岛有修复和保护的作用。
实施例6：LGP9对自发性糖尿病KK-Ay小鼠的治疗作用
KK-Ay小鼠是C57BL/6J小鼠与KK小鼠杂交繁殖后，转入黄色肥胖糖尿病突变基因(Ay)而形成的转基因小鼠。KKAy小鼠具有多食、高血糖、高度胰岛素抵抗等表现，可自发形成2型糖尿病。实验选用的C57BL/6J小鼠和KK-Ay小鼠，雄性，8周龄，体重28-32g(北京华阜康生物科技股份有限公司)，实验动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0008。实验动物饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22±2℃，湿度为50％-60％。C57BL/6J小鼠作为正常对照组始终喂以普通饲料，KK-Ay小鼠始终喂以高脂饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司专利配方饲料：ZL201110127312.5)。经过4周喂养，小鼠达到12周龄。禁食不禁水4小时，尾尖取血，测定所有小鼠的空腹血糖，正常组小鼠的血糖浓度应处于3.9～6.1mmol/L，KK-Ay小鼠血糖浓度应高于11.1mmol/L。自发形成2型糖尿病的KKAy小鼠随机分成2组，分别为模型组与LGP9作用组，每组3只。LGP9给药组按照5mg/Kg的剂量连续灌胃4周。与此同时，模型组和正常组给予等容量蒸馏水灌胃处理。每周测定小鼠体重、饮水量和空腹血糖，实验末期进行口服糖耐量实验。
根据体重和饮水量结果(图6A和6B)，糖尿病小鼠的体重和饮水量显著高于正常组小鼠，LGP9作用后，KK-Ay小鼠体重和饮水量持续下降，并相比于模型组有显著性差异。
根据血糖结果(图6C)，正常组小鼠的空腹血糖稳定处于5mmol/L的水平，模型组小鼠的空腹血糖在第1、2两周有所下降，在第3周上升，在第4周回复到成模后的高血糖水平。这可能是因为前2周KK-Ay小鼠的糖尿病模型还不太稳定。LGP9组小鼠的空腹血糖则持续下降，在第4周时已接近正常组小鼠血糖水平。
根据口服糖耐量结果(图6D-E)，模型组小鼠2小时内始终维持高血糖水平，曲线下面积显著高于正常组小鼠，LGP9组小鼠的各时间点血糖值均显著低于模型组，曲线下面积也显著低于模型组。以上结果说明LGP9对于自发性糖尿病KK-Ay小鼠有显著的降血糖作用。
根据小鼠胰岛HE染色结果(图6F)，模型组胰岛细胞轻度变性,胰岛代偿性增大，LGP9组胰岛体积明显减小,说明LGP9对KK-Ay 2型糖尿病模型小鼠具有提高胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗作用。
实施例7：LGP9对胰岛素抵抗肝细胞的改善作用
使用炎症因子TNF-α作用于肝细胞HepG2细胞，诱导建立胰岛素抵抗肝细胞模型。TNF-α是第一个被发现与2型糖尿病中胰岛素抵抗、糖代谢紊乱有关的炎症因子。将HepG2细胞接种于96孔板中，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时。吸出培养液，更换为含有10ng/mL TNF-α和不同浓度的LGP9(30μM、60μM、90μM、150μM)的无血清培养基培养基作用48小时，吸出培养液，更换为无血清DMEM培养基培养6小时。用葡萄糖氧化酶试剂盒检测培养液中葡萄糖含量，计算细胞葡萄糖吸收。
结果：根据图7A，TNF-α造模后，HepG2细胞糖吸收相比于正常组显著下降，而LGP9各剂量给药组则改善了胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖吸收，相比于模型组有显著上升，上升程度随LGP9浓度升高而加大。
将HepG2细胞接种于12孔板中，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时。吸出培养液，更换为含有10ng/mL TNF-α和低、高浓度的LGP9(30μM、90μM)作用48小时，收集细胞，利用硫酸-蒽酮法检测细胞内糖原含量。
结果：糖原是肝细胞吸收葡萄糖后储存葡萄糖的重要形式，胰岛素抵抗后，肝细胞的糖原合成降低。根据图7B，TNF-α造模的胰岛素抵抗HepG2细胞的糖原合成量相比于正常组显著降低。LGP9低剂量组相比于模型组在糖原含量上无显著差异，而LGP9高剂量组的糖原合成则相比于模型组有显著上升。
将HepG2细胞接种于96孔板中，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时。吸出培养液，更换为含有10ng/mL TNF-α和低、高浓度的LGP9(30μM、90μM)作用48小时。吸出培养液，更换为无血清DMEM培养基培养6小时。结束前加入100nM的胰岛素作用30分钟。
结果：根据图7C，对于正常组的HepG2细胞，100nM胰岛素并未改变糖吸收水平。对于模型组的胰岛素抵抗HepG2细胞，100nM胰岛素作用后的糖吸收水平有上升趋势，但不显著。在LGP9低剂量组和高剂量组，使用胰岛素后，均能显著提升胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖吸收水平，且提升程度随LGP9作用剂量增加而上升。所以，LGP9可以改善胰岛素抵抗HepG2细胞的胰岛素敏感性，帮助胰岛素发挥作用，促进肝细胞的葡萄糖吸收。
实施例8LGP9对高糖诱导胰岛细胞Rin-m5f去分化的抑制作用
培养胰岛β细胞Rin-m5f细胞接种于12孔板，在含有10％新生牛血清的1640培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时。吸出培养液，更换为含10mg/mL的葡萄糖的3％血清的1640培养基作用24h，再用不同浓度的LGP9(10μM，30μM)的1640培养基(含10mg/mL的葡萄糖，3％血清)作用24小时。提取细胞RNA，检测去分化Rin-m5f细胞的β细胞相关基因Ins、Aldh1a3、Pdx1、Nkx6.1、Mafa、Glut2的mRNA水平。
结果：Ins作为胰岛β细胞的标志性激素，是胰岛β细胞功能完好的检测指标。根据图8A，模型组Rin-m5f细胞中的胰岛素的基因表达水平下降，LGP9各组作用后，Ins含量相比模型组升高。β细胞与其他内分泌细胞的区别不仅仅在于胰岛素的表达，还包括其他重要基因，如胰岛素信号通路中的关键分子基因Pdx1，β细胞中含量丰富的转录因子基因Nkx6.1、Mafa，葡萄糖转运蛋白基因Glut2等。根据图8B，模型组Pdx1的mRNA水平显著下降，LGP9组则相比于模型组上调了PDX1的基因转录水平。根据图8C，模型组的Nkx6.1的mRNA水平相比于正常组显著下降，LGP9可以改善Nkx6.1恢复至正常组水平。根据图8D高糖显著降低了Mafa的基因转录水平，LGP9则相比于模型组有所上升。根据图8E，模型组Glut2的mRNA水平相比于正常组下调，LGP9组则相比于模型组上调。ALDH1A3是前体细胞标志物，成熟的胰岛β细胞中该蛋白基因表达受抑制，而去分化的胰岛β细胞中则检测到ALDH1A3的大量表达。根据图8F，模型组Aldh1a3的mRNA水平相比于正常组有所上升，在LGP9各组作用下，均将上升的Aldh1a3下降至正常组水平。除Aldh1a3表达上升指示β细胞是否有发生去分化，还可以根据Ngn3这一内分泌祖细胞标志物基因来检测β细胞去分化的水平。当β细胞发生去分化后，成为祖细胞样细胞，并拥有全能性，Oct4的表达水平则可用于检测其全能性的水平。根据图8G，高糖组Ngn3的mRNA水平相比正常组显著增加，而LGP9作用后降低了Ngn3的转录水平。根据图8H，模型组Oct4的mRNA含量比正常组显著增加，意味着模型组细胞的去分化水平较高，而LGP9作用则能显著地降低Oct4的mRNA水平。以上结果说明，LGP9能够在转录水平有效防止β细胞去分化，维持β细胞的身份。
培养胰岛β细胞Rin-m5f细胞接种于6孔板，在含有10％新生牛血清的1640培养基中37℃、5％CO2继续培养24小时。吸出培养液，更换为含10mg/mL的葡萄糖的3％血清的1640培养基作用24小时，再用不同浓度的LGP9(10μM，30μM)的1640培养基(含10mg/mL的葡萄糖，3％血清)作用24小时。提取细胞进行胰岛素、GLUT2和PDX1蛋白含量检测。
结果：根据图8I-L，高糖使Rin-m5f细胞的胰岛素、GLUT2和PDX1蛋白含量大幅下降，说明其β细胞功能受到了损伤。而LGP9作用后，其低、高剂量不同程度地提高胰岛素、GLUT2和PDX1蛋白含量。这说明LGP9对发生去分化表达降低的β细胞功能蛋白有恢复作用，能够逆转β细胞去分化。
实施例9LGP9对高脂饲料加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病C57BL/6J小鼠胰腺β细胞去分化的抑制作用
实验选用清洁级雄性C57BL/6J小鼠(由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号:SYXK(苏)2021-0011)，6周龄，体重18-22g，饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22±2℃，湿度为50％-60％。适应性饲养3天后，随机挑选6只作为正常对照组，始终喂养普通饲料。其余小鼠喂高脂饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司专利配方饲料：ZL201110127312.5)，高脂饲料喂养6周后，进行链脲佐菌素腹腔注射，注射剂量为20mg/Kg，连续4天，正常对照组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。完成注射1周后，再次进行链脲佐菌素腹腔注射，注射剂量为10mg/Kg，连续3天，正常对照组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。完成注射两周后，禁食小鼠8小时，进行尾尖采血，用血糖试纸条测定小鼠空腹血糖值，将空腹血糖值大于11.1mmol/L的认定为造模成功。随机将小鼠分为模型组，LGP9低剂量组(1mg/Kg)，LGP9中剂量组(3mg/Kg)和LGP9高剂量组(9mg/Kg)。糖尿病小鼠按分组连续4周每天灌胃LGP9，正常对照组和模型组灌胃等剂量的蒸馏水。实验给药周期为28天，实验中小鼠自由进食和饮水。实验结束后断颈处死小鼠，分离胰腺组织，液氮冻存。取保存在液氮中的胰腺组织，按比例加入提前加好蛋白酶抑制剂的动物组织裂解液，使用匀浆器充分裂解细胞，静置后离心取上清，使用BCA蛋白试剂盒检测总蛋白浓度，分装后-80℃保存，通过Western Blot测定蛋白表达量。
结果：β细胞去分化早期表现在胰岛素基因表达的下调，进一步表现在β细胞基因表达的缺失，包括PDX1等的下调，和成熟β细胞中不表达基因的上调，主要包括OCT4、ChgA和Aldh1a3等的表达增加。根据Western Blot结果显示，在模型组中，成熟β细胞PDX1(图9A和图9B)的表达缺失，并且在LGP9处理后有较好的恢复效果，表达增加；同时成熟β细胞不表达的基因OCT4、ChgA和Aldh1a3(图9C-F)在模型组中表达上升，经过LGP9干预后，低剂量组表达略有下降，而中、高剂量组表达显著降低。因此LGP9能够有效防止β细胞发生去分化。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种乳源性寡肽在制备防治糖尿病及糖尿病并发症药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly
1 5
Claims (4)
1.一种寡肽在制备预防与治疗胰岛损失的糖尿病并发症药物中的应用，其特征在于所述的寡肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；所述的糖尿病并发症为高血脂、肥胖、肝损伤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述寡肽和药学上可接受的辅料制成制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、润滑剂或稳定剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述制剂为注射剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。
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