WO2020250923A1 - ペプチド及びその用途 - Google Patents

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WO2020250923A1
WO2020250923A1 PCT/JP2020/022817 JP2020022817W WO2020250923A1 WO 2020250923 A1 WO2020250923 A1 WO 2020250923A1 JP 2020022817 W JP2020022817 W JP 2020022817W WO 2020250923 A1 WO2020250923 A1 WO 2020250923A1
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peptide
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present
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吉朗 北原
順子 岡松
和高 新保
直子 嵐田
絢香 白澤
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味の素株式会社
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    • A23L33/19—Dairy proteins

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides and novel uses of peptides.
  • the present invention also relates to a method for producing the peptide.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 describe that a peptide having the amino acid sequence LIVTTQTMKG (SEQ ID NO: 7) at the N-terminal has a ghrelin secretion inhibitory effect and also has an appetite inhibitory effect based on ghrelin secretion suppression. ..
  • these documents include intestinal barrier function improving action, blood glucose elevation suppressing action, insulin sensitivity improving action, FGF21 (Fibroblast growth factor 21) secretion promoting action, stress suppressing action, and neuroprotective action. , Fatigue reduction effect is not described.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 show that ghrelin improves intestinal barrier function.
  • Non-Patent Document 4 describes that ghrelin improves insulin sensitivity by meta-analysis of past studies. Therefore, from the ghrelin secretion inhibitory action described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, it cannot be inferred that there is an intestinal barrier function improving action, an insulin sensitivity improving action, and a blood glucose level elevation suppressing action. In addition, there is no publicly known document showing the relationship between ghrelin and FGF21.
  • a peptide consisting of a specific amino acid sequence has an effect of improving intestinal barrier function and an effect of suppressing blood glucose elevation. It was found for the first time that it has an insulin sensitivity improving effect and an FGF21 secretion promoting effect. The present inventors have further found for the first time that a peptide consisting of the specific amino acid sequence has a stress-suppressing effect, a neuroprotective effect, and a fatigue-reducing effect. Based on these new findings, the present inventors have further studied and completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] Amino acid sequence of any one of LIVTTQTMKGL (SEQ ID NO: 1), LIVTTQTMKG (SEQ ID NO: 2), LIVTTQTMK (SEQ ID NO: 3), IVTQTMKGL (SEQ ID NO: 4), IVTQTMKG (SEQ ID NO: 5), and VTQTMKGL (SEQ ID NO: 6).
  • An agent for improving intestinal barrier function which contains a peptide consisting of (hereinafter, these may be collectively referred to as "peptide according to the present invention”).
  • LIVTQTMKGL (SEQ ID NO: 1), LIVTQTMKG (SEQ ID NO: 2), LIVTQTMK (SEQ ID NO: 3), IVTQTMKGL (SEQ ID NO: 4), IVTQTMKG (SEQ ID NO: 5), which comprises a step of hydrolyzing whey protein with chymotrypsin.
  • VTQTMKGL (SEQ ID NO: 6), a method for producing a hydrolyzate of a whey protein containing a peptide consisting of any of the amino acid sequences.
  • the peptide according to the present invention has an intestinal barrier function improving action, a blood glucose elevation suppressing action, an insulin sensitivity improving action, a FGF21 secretion promoting action, a stress suppressing action, a neuroprotective action, and a fatigue reducing action, and is used for applications based on these actions. , Medicine, food, etc.
  • the peptides according to the present invention are the following (1) to (6).
  • IVTQTMKGL Peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the peptide according to the present invention is as described above.
  • It has an intestinal barrier function improving action, a blood glucose elevation suppressing action, an insulin sensitivity improving action, a FGF21 secretion promoting action, a stress suppressing action, a neuroprotective action, and a fatigue reducing action.
  • an intestinal barrier function improving action a blood glucose elevation suppressing action, an insulin sensitivity improving action, a FGF21 secretion promoting action, a stress suppressing action, a neuroprotective action, and a fatigue reducing action.
  • only one type of peptide according to the present invention may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the peptide according to the present invention can be used not only in the form of a free form but also in the form of a salt, a hydrate or a solvate.
  • the term "peptide” as used herein is a concept that also includes salts, hydrates, and solvates.
  • Examples of the salt form of the peptide according to the present invention include salts that are acceptable as pharmaceuticals or foods, and examples thereof include acid addition salts (for example, inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, nitrates and phosphates, acetates).
  • organic acid salts such as caprylate
  • metal salts eg, sodium salts, potassium salts
  • alkali metal salts, magnesium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, aluminum salts, zinc salts
  • ammonium salts for example, salts with ammonium, tetramethylammonium, etc.
  • the amino acids constituting the peptide may be either L-form or D-form.
  • the peptide according to the present invention can be produced, for example, by a solid-phase synthesis method or the like as shown below.
  • a carrier used for solid-phase synthesis a carrier capable of binding to a resin (resin) at the C-terminal carboxyl group of the peptide chain via a linker is usually used.
  • Typical examples of such a solid phase carrier include Wang resin, AM resin, TGR resin and the like.
  • the amino acid used for solid-phase synthesis is preferably one in which the amino group of the main chain is protected by a 9-fluorenylmethylcarbonyl (Fmoc) group or a t-butoxycarbonyl (Boc) group, but is limited to these. is not.
  • a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, a carboxyl group or the like is present in the side chain portion of the amino acid, it is preferable that these functional groups are protected by a protecting group other than the Fmoc group and the Boc group.
  • the introduction of the protected amino acid into the carrier can be carried out by a known method. For example, a method using a carbodiimide-based condensing agent as the condensing agent can be mentioned.
  • Examples of the carbodiimide-based condensing agent include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSCI) and the like.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPC diisopropylcarbodiimide
  • WSCI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DCM dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPC diisopropylcarbodiimide
  • WSCI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • WSCI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DCM dicyclohex
  • the secondary amine piperidine is usually used, but pyrrolidine, diethylamine, dibutylamine, diisopropylamine and the like can also be used.
  • the above reaction can be carried out at a reaction temperature from 0 ° C. to the boiling point of the solvent, and the reaction is preferably at room temperature.
  • the carrier after the reaction can be taken out from the solvent by filtration or the like.
  • the carrier into which the amino acid from which the Fmoc has been removed obtained above is introduced is swollen again in DMF, and the protected amino acid is reacted.
  • Condensing agents include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSCI), 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H- 1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate (HATU), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), etc. alone Alternatively, they can be mixed and used. The above reaction can be carried out at a reaction temperature from 0 ° C.
  • the reaction is preferably at room temperature.
  • the elongation of the peptide chain can be confirmed by the Kaiser test, and the carrier after the reaction can be taken out from the solvent by filtration or the like.
  • the peptide can be excised from the carrier by known methods. For example, the peptide is cut out using a strong acid such as trifluoroacetic acid. At this time, the protecting group of the side chain of each amino acid in the peptide may be removed at the same time.
  • the peptide according to the present invention can also be produced by allowing a hydrolase to act on whey protein.
  • the protein hydrolase used for hydrolyzing whey protein is not particularly limited, but an enzyme having protease activity or peptidase activity and can be used for food production is preferable. Examples of such enzymes include chymotrypsin.
  • examples of whey protein that is a substrate for an enzyme reaction include, but are not limited to, purified milk ⁇ -lactoglobulin, and milk or whey containing whey protein is used as a substrate as it is. May be good.
  • the amount of the protein hydrolase used is, for example, an amount such that the mass ratio of the protein hydrolase to the substrate (whey protein) (protein hydrolase: substrate) is 1:20 to 1: 1000. Can be mentioned.
  • the enzyme reaction time is, for example, about 30 minutes to 24 hours, preferably about 2 hours to 8 hours.
  • the enzyme reaction temperature is, for example, 25 to 70 ° C, preferably 37 ° C.
  • the enzymatic reaction is carried out, for example, at pH 5-9, preferably pH 6-8. After completion of the enzymatic reaction, the enzyme can be appropriately inactivated to obtain a hydrolyzate of whey protein containing the peptide according to the present invention.
  • the obtained hydrolyzate can be used as it is in the agent of the present invention described later, but the peptide according to the present invention may be obtained by separation and purification by a known method.
  • the present invention relates to an intestinal barrier function improving agent containing a peptide according to the present invention.
  • the "intestinal barrier function" is a function of preventing the invasion of microorganisms into the intestinal tissue by secreting physical walls such as intestinal epithelial cells, mucous layer, and sugar coating, and molecules having antibacterial activity. That is.
  • the intestinal barrier function improving action can be evaluated by, for example, the method of Test Example 1 described later or a method similar thereto.
  • the intestinal barrier function improving agent of the present invention has metabolic diseases, intestinal infections, cognitive decline, depression, stress, inflammatory diseases, age-related symptoms and cardiovascular diseases. It can be expected to be used for prevention or treatment (improvement), life extension, and health maintenance.
  • the present invention relates to an agent for suppressing an increase in blood glucose, which contains a peptide according to the present invention.
  • "elevation of blood glucose” means an increase in blood glucose level due to meal intake, and usually means an increase in blood glucose level that occurs within about 3 to 5 hours after eating.
  • the blood glucose elevation inhibitory effect can be evaluated by, for example, the method of Test Example 2 described later or a method similar thereto.
  • the agent for suppressing an increase in blood glucose of the present invention prevents or treats (improves) metabolic diseases, cognitive decline, depression, stress, inflammatory diseases, age-related symptoms and cardiovascular diseases based on the effect of suppressing an increase in blood glucose. ), It can be expected to be used for life extension and health maintenance.
  • the present invention relates to an insulin sensitivity improving agent containing a peptide according to the present invention.
  • insulin sensitivity refers to the ease with which insulin acts in the body. Insulin can exert a sufficient effect when insulin sensitivity is high, and insulin when insulin sensitivity is low. Does not work well.
  • the action of insulin refers to the action of controlling glucose / lipid / protein metabolism and the action of inducing cell proliferation and differentiation.
  • the insulin sensitivity improving effect can be evaluated by, for example, the method of Test Example 3 described later or a method similar thereto.
  • the insulin sensitivity improving agent of the present invention prevents or treats (improves) metabolic diseases, cognitive decline, depression, stress, inflammatory diseases, age-related symptoms and cardiovascular diseases based on the insulin sensitivity improving action. ), It can be expected to be used for life extension and health maintenance.
  • the present invention relates to an FGF21 secretagogue containing a peptide according to the present invention.
  • FGF21 is an intercellular signaling factor mainly produced in the liver and the like, and is involved in the regulation of proliferation, differentiation and metabolism of various cells.
  • the FGF21 secretagogue action can be evaluated by, for example, the method of Test Example 4 described later or a method similar thereto.
  • the FGF21 secretion-promoting agent of the present invention prevents or treats (improves) metabolic diseases, cognitive decline, depression, stress, inflammatory diseases, age-related symptoms and cardiovascular diseases based on the FGF21 secretion-promoting action. ), It can be expected to be used for life extension and health maintenance.
  • the present invention relates, in one aspect, to a stress-suppressing or neuroprotective agent containing a peptide according to the invention.
  • stress suppression means “physical stressor” (heat or cold, noise or congestion, etc.), “chemical stressor” (polluting substance, drug, oxygen deficiency / excess, carbon monoxide, etc.), “ It refers to suppressing the psychological, physical, and behavioral effects caused by "psychological and social stressors” (human relations, work problems, family problems, etc.).
  • neuroroprotection refers to protection of central and peripheral nerves from loss of function due to physical and chemical factors.
  • the stress-suppressing action and the neuroprotective action can be evaluated by, for example, the method of Test Example 5 described later or a method similar thereto.
  • the stress-suppressing or neuroprotective agent of the present invention prevents or treats cognitive decline, depression, stress, inflammatory diseases, age-related symptoms and cardiovascular diseases based on the stress-suppressing or neuroprotective effects. It can be expected to be used for improvement), life extension, and health maintenance.
  • the present invention relates to a fatigue reducing agent containing a peptide according to the present invention.
  • reducing fatigue refers to reducing fatigue, decreased motivation, decreased concentration, etc. caused by overlapping physical and mental loads.
  • the fatigue reducing effect can be evaluated by, for example, the method of Test Example 6 described later or a method similar thereto.
  • the fatigue-reducing agent of the present invention prevents or treats (improves) cognitive decline, depression, stress, inflammatory diseases, age-related symptoms and cardiovascular diseases, prolongs lifespan, and health based on the fatigue-reducing action. Expected to be used for maintenance.
  • the intestinal barrier function improving agent, the blood glucose elevation suppressing agent, the insulin sensitivity improving agent, the FGF21 secretion promoting agent, the stress suppressing or neuroprotecting agent, and the fatigue reducing agent of the present invention are collectively referred to as "the present invention".
  • the agent of the present invention may be referred to as the peptide itself according to the present invention, and the composition containing the peptide according to the present invention and other components (for example, a carrier acceptable as a medicine or food). It may be a substance (for example, a pharmaceutical composition, a food composition).
  • the "agent” in the present invention is a concept that includes medicines and foods.
  • the agent of the present invention is orally or parenterally administered to subjects such as humans, mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys) and birds (eg, chickens, turkeys). Can be safely administered.
  • mammals eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys
  • birds eg, chickens, turkeys.
  • the agent of the present invention is not particularly limited in form, and examples thereof include powders, granules, tablets, capsules, liquids (for example, solutions, suspensions, emulsions), beverages, jellies, puddings, yogurts, candies, chewing gums and the like. Be done. These can be produced by known methods.
  • the peptide according to the present invention is mixed with a food or pharmaceutically acceptable carrier (eg, excipient, binder, disintegrant, lubricant, solvent) and used in a method known in the field of food preparation or pharmaceutical preparation. It is possible to produce powders, granules, tablets, capsules, liquids and the like.
  • the peptide according to the present invention can also be produced by adding and mixing it with foods (for example, general foods, beverages (for example, water, soft drinks)).
  • foods for example, general foods, beverages (for example, water, soft drinks)
  • food is a concept that broadly includes foods that can be taken orally (excluding pharmaceuticals), and is not only so-called “food” but also beverages, dietary supplements, and foods with health claims (for example, foods for specified health use). , Functional foods, functional foods), supplements, etc.
  • the dose (intake) of the peptide according to the present invention is, for example, 0.05 mg to 500 g, preferably 0.5 mg to 50 g, more preferably, per day for an adult (body weight 60 kg). Is 5 mg to 10 g.
  • the dose (intake) of the peptide according to the present invention is, for example, 0.05 mg to 500 g, preferably 0.5 mg to 50 g, more preferably 0.5 mg to 50 g per day for an adult (body weight 60 kg). It is 5 mg to 10 g.
  • the dose (intake) of the peptide according to the present invention is, for example, 0.05 mg to 500 g, preferably 0.5 mg to 50 g, more preferably 0.5 mg to 50 g per day for an adult (body weight 60 kg). It is 5 mg to 10 g.
  • the dose (intake) of the peptide according to the present invention is, for example, 0.05 mg to 500 g, preferably 0.5 mg to 50 g, more preferably 0.5 mg to 50 g per day for an adult (body weight 60 kg). It is 5 mg to 10 g.
  • the dose (intake) of the peptide according to the present invention is, for example, 0.05 mg to 500 g, preferably 0.5 mg to 50 g, per day for an adult (body weight 60 kg). It is preferably 5 mg to 10 g.
  • the dose (intake) of the peptide according to the present invention is, for example, 0.05 mg to 500 g, preferably 0.5 mg to 50 g, more preferably 5 mg per day for an adult (body weight 60 kg). ⁇ 10g.
  • the content of the peptide according to the present invention can be appropriately selected from the amount in which the dose (intake) is within the above range.
  • the present invention also relates to a novel peptide consisting of any of the amino acid sequences of LIVTTQTMKGL (SEQ ID NO: 1), IVTQTMKGL (SEQ ID NO: 4), IVTQTMKG (SEQ ID NO: 5), and VTQTMKGL (SEQ ID NO: 6).
  • the definition and production method of each peptide are the same as those described above for the agent of the present invention.
  • these peptides have an intestinal barrier function improving action, a blood glucose elevation suppressing action, an insulin sensitivity improving action, a FGF21 secretion promoting action, a stress suppressing action, a neuroprotective action, or a fatigue reducing action, and are based on these actions. It can be used as a medicine, food, etc. for various purposes.
  • FIG. 3 shows the result of calculating the area under the blood glucose level transition curve ( ⁇ AUC) based on the 0-minute value. From FIGS.
  • KK-Ay mice had strong insulin resistance, and no clear decrease in blood glucose level was observed even when insulin was administered in the vehicle group, but in the compound 1 administration group, It showed a significant decrease in blood glucose. Such an effect of improving insulin sensitivity was also observed for compounds 2 to 6.
  • Acetyl-L-carnitine is an endogenous metabolite known to have anti-stress and neuroprotective effects (eg, Nasca C et al., “L-acetylcarnitine causes rapid antidepressant effects through the epigenetic induction of mGlu2). receptors ”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, Mar 19; 110 (12): 4804-4809; and Kazak F et al.,“ Neuroprotective effects of acetyl-l-carnitine on lipopolysaccharide-induced neuroinflammation in mice: Involvement of brain-derived neurotrophic factor ”, Neuroscience Letters, 2017 Sep 29; 658: 32-36).
  • the results are shown in FIG. From FIG. 5, an increase in blood acetyl-L-carnitine concentration was observed 120 minutes after administration in the compound 1 administration group as compared with the vehicle group, and a stress-suppressing or nerve-protecting reaction was confirmed.
  • the peptide according to the present invention is useful as a medicine or food for improving intestinal barrier function, suppressing blood glucose elevation, improving insulin sensitivity, promoting FGF21 secretion, suppressing stress, protecting nerves, and reducing fatigue.

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Abstract

本発明の目的は、新規ペプチド、ペプチドの新規用途及び該ペプチドの製造方法の提供である。　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、腸管バリア機能改善用剤、血糖上昇抑制用剤、インスリン感受性改善用剤、ＦＧＦ２１分泌促進用剤、ストレス抑制または神経保護用剤、又は疲労軽減用剤。配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。ホエイタンパク質を、キモトリプシンにより加水分解する工程を含む、配列番号１～配列番号６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有するホエイタンパク質の加水分解物の製造方法。

Description

ペプチド及びその用途
　本発明は、新規ペプチド及びペプチドの新規用途に関する。また、本発明は、該ペプチドの製造方法に関する。
　特許文献１及び非特許文献１には、Ｎ末端にアミノ酸配列ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号７）を有するペプチドがグレリン分泌抑制作用を有し、グレリン分泌抑制に基づく食欲抑制作用をも有すると記載されている。しかし、これらの文献には、腸管バリア機能改善作用、血糖上昇抑制作用、インスリン感受性改善作用、ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子21（Fibroblast growth factor 21））分泌促進作用、ストレス抑制作用、神経保護作用、疲労軽減作用については記載されていない。
　非特許文献２及び３には、グレリンが腸管バリア機能を改善することが示されている。また、非特許文献４には、過去の研究のメタ解析によりグレリンがインスリン感受性を改善することが記載されている。従って、特許文献１や非特許文献１に記載されたグレリン分泌抑制作用からは、腸管バリア機能改善作用、インスリン感受性改善作用、血糖値上昇抑制作用があることは類推することはできない。
　また、グレリンとＦＧＦ２１との関連を示した公知文献等は見当たらない。
国際公開第２０１７／１５０５３６号
H. Aoki et al., "Lacto-ghrestatin, a novel bovine milk-derived peptide, suppresses ghrelin secretion", FEBS Letters 591 (2017) 2121-2130 R. Wu et al., "Orexigenic Hormone Ghrelin Ameliorates Gut Barrier Dysfunction In Sepsis In Rats", Critical Care Medicine, 2009 August; 37(8): 2421-2426; doi: 10.1097/CCM.0b013e3181a557a2 Y. Cheng et al., "Ghrelin Attenuates Intestinal Barrier Dysfunction Following Intracerebral Hemorrhage in Mice", International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17, 2032; doi: 10.3390/ijms17122032 C. Zhang et al., "The Correlation Between Circulating Ghrelin and Insulin Resistance in Obesity: A Meta-Analysis", Frontiers in Physiology, September 2018, Volume 9, Article 1308; doi: 10.3389/fphys.2018.01308
　本発明の目的は、新規ペプチド及びペプチドの新規用途を提供することである。また、本発明の目的は、該ペプチドの製造方法を提供することである。
　本発明者らは、消化管バイパス手術モデル動物におけるホエイ（乳清タンパク質）投与後の消化管内容物の解析から、特定のアミノ酸配列からなるペプチドが、腸管バリア機能改善作用、血糖上昇抑制作用、インスリン感受性改善作用、ＦＧＦ２１分泌促進作用を有することを初めて見出した。本発明者らは、さらに、該特定のアミノ酸配列からなるペプチドが、ストレス抑制作用、神経保護作用、疲労軽減作用を有することを初めて見出した。本発明者らは、これらの新知見に基づいてさらに鋭意検討して本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド（以下、これらを一括して「本発明に関するペプチド」と言うこともある。）を含有する、腸管バリア機能改善用剤。
［２］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、血糖上昇抑制用剤。
［３］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、インスリン感受性改善用剤。
［４］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、ＦＧＦ２１分泌促進用剤。
［５］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、ストレス抑制または神経保護用剤。
［６］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、疲労軽減用剤。
［７］ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
［８］ホエイタンパク質を、キモトリプシンにより加水分解する工程を含む、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有するホエイタンパク質の加水分解物の製造方法。
　本発明に関するペプチドは、腸管バリア機能改善作用、血糖上昇抑制作用、インスリン感受性改善作用、ＦＧＦ２１分泌促進作用、ストレス抑制作用、神経保護作用、疲労軽減作用を有し、該作用に基づく用途のための、医薬、食品等として利用し得る。
図１は、試験例１における、化合物１（ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチド）経口投与後の血中ＦＤ－４濃度（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝５））を示す。 図２は、試験例２における、経口糖付加試験（ＯＧＴＴ）実施時のΔＡＵＣ（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝６～７））を示す。 図３は、試験例３における、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）実施時の０分時の血糖値からの推移（図３（ａ））及びΔＡＵＣ（図３（ｂ））（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝４～６））を示す。 図４は、試験例４における、血中ＦＧＦ２１濃度（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝５））を示す。 図５は、試験例５における、血中アセチル－Ｌ－カルニチン濃度（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝３））を示す。 図６は、試験例６における、血中オルニチン／シトルリン比（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝５））を示す。 図７は、製造例７における、化合物１の濃度（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（ｎ＝２））を示す。
　本発明に関するペプチドは、下記（１）～（６）である。
（１）ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチド
（２）ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチド
（３）ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチド
（４）ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）のアミノ酸配列からなるペプチド
（５）ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるペプチド
（６）ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるペプチド
　本発明に関するペプチドは、上記した通り、腸管バリア機能改善作用、血糖上昇抑制作用、インスリン感受性改善作用、ＦＧＦ２１分泌促進作用、ストレス抑制作用、神経保護作用、疲労軽減作用を有する。後述の本発明の剤において、本発明に関するペプチドは、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明に関するペプチドは、遊離体のみならず塩、水和物、溶媒和物の形態でも使用することができる。本明細書における「ペプチド」という用語は、塩、水和物、溶媒和物をも包含する概念である。本発明に関するペプチドの塩の形態としては、医薬又は食品として許容される塩が挙げられ、例えば、酸付加塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α－ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩）、金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩）、アンモニウム塩（例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等との塩）等が挙げられる。
　本発明において、ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体のいずれであってもよい。
　本発明に関するペプチドは、例えば以下に示すような固相合成法等により製造することができる。
　固相合成に用いる担体としては、通常は樹脂（レジン）にリンカーを介してペプチド鎖のＣ末端のカルボキシル基と結合することのできる担体を用いる。このような固相担体の代表的な例としてはＷａｎｇレジン、ＡＭレジン、ＴＧＲレジン等が挙げられる。
　固相合成に用いるアミノ酸としては、主鎖のアミノ基が９－フルオレニルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）基又はｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護されているものが好ましいが、これらに限られるものではない。また、アミノ酸の側鎖部位に、水酸基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基等が存在する場合、これらの官能基はＦｍｏｃ基及びＢｏｃ基以外の保護基で保護されることが好ましい。
　担体への保護アミノ酸の導入は公知の方法で行うことができる。例えば、縮合剤としてカルボジイミド系縮合剤を用いる方法が挙げられる。前記カルボジイミド系縮合剤としてはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＩ）等を挙げることができる。反応に用いる溶媒としてはＤＣＭ、テトラヒドロフラン、トルエン等を用いることができる。反応は、室温で反応させることが好ましい。
　上記で得られた保護アミノ酸－担体に２級アミンを添加することによりＦｍｏｃ基を除去することができる。前記反応溶媒としてはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いることが好ましい。また、前記２級アミンとしては、通常ピペリジンが用いられるが、ピロリジン、ジエチルアミン、ジブチルアミン、ジイソプロピルアミン等を用いることもできる。上記反応は、０℃～溶媒の沸点までの反応温度で行うことができ、室温で反応させることが好ましい。反応後の担体は、ろ過等により溶媒中から取り出すことができる。
　上記で得たＦｍｏｃを除去したアミノ酸が導入された担体を再度ＤＭＦに膨潤し、保護アミノ酸を反応させる。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＩ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム　３－オキシド　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）等を単独で又は混合して用いることができる。上記反応は、０℃～溶媒の沸点までの反応温度で行うことができ、室温で反応させることが好ましい。ペプチド鎖の伸長は、Ｋａｉｓｅｒ試験により確認することができ、反応後の担体は、ろ過等により溶媒中から取り出すことができる。
　ペプチドは、公知の方法で担体から切り出すことができる。例えば、ペプチドの切り出しはトリフルオロ酢酸等の強酸を用いて行う。この際、ペプチド中の各アミノ酸の側鎖の保護基の除去が同時に行われても良い。
　また、本発明に関するペプチドは、ホエイタンパク質に、加水分解酵素を作用させて製造することもできる。ホエイタンパク質を加水分解するために用いるタンパク質加水分解酵素は、特に限定されないが、プロテアーゼ活性又はペプチダーゼ活性を有し食品製造に使用可能な酵素が好ましい。そのような酵素としては、例えば、キモトリプシンが挙げられる。
　該製造方法において、酵素反応の基質であるホエイタンパク質としては、例えば、精製した牛乳βラクトグロブリンが挙げられるが、これに限定されず、ホエイタンパク質を含有する牛乳や乳清をそのまま基質として用いてもよい。
　該製造方法において、タンパク質加水分解酵素の使用量は、例えば、タンパク質加水分解酵素と基質（ホエイタンパク質）の質量比（タンパク質加水分解酵素：基質）が、１：２０～１：１０００となる量が挙げられる。
　酵素反応時間は、例えば３０分～２４時間、好ましくは２時間～８時間程度である。酵素反応温度は、例えば２５～７０℃、好ましくは３７℃である。酵素反応は、例えばｐＨ５～９、好ましくはｐＨ６～８で行う。
　酵素反応の終了後、適宜酵素を失活させて、本発明に関するペプチドを含有するホエイタンパク質の加水分解物を得ることができる。得られた加水分解物は、そのまま後述の本発明の剤に用いることもできるが、公知の方法で分離、精製して本発明に関するペプチドを得てもよい。
　本発明は、一態様として、本発明に関するペプチドを含有する、腸管バリア機能改善用剤に関する。
　本発明において、「腸管バリア機能」とは、腸管上皮細胞や粘液層、糖衣などによる物理的な壁や、抗菌活性を有する分子の分泌などにより微生物の腸管組織内部への侵入を防止する機能のことである。
　本発明において、腸管バリア機能改善作用は、例えば後述の試験例１の方法又はこれに準じた方法により評価することができる。
　本発明の腸管バリア機能改善用剤は、腸管バリア機能改善作用に基づき、代謝性疾患、腸管感染症、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、加齢に伴う諸症状及び心血管系疾患の予防又は治療（改善）、寿命延長、健康維持のための利用が期待できる。
　本発明は、一態様として、本発明に関するペプチドを含有する、血糖上昇抑制用剤に関する。
　本発明において、「血糖上昇」とは、食事摂取に起因する血糖値の上昇のことであり、通常は食後３～５時間程度までに起こる血糖値の上昇を意味する。
　本発明において、血糖上昇抑制作用は、例えば後述の試験例２の方法又はこれに準じた方法により評価することができる。
　本発明の血糖上昇抑制用剤は、血糖上昇抑制作用に基づき、代謝性疾患、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、加齢に伴う諸症状及び心血管系疾患の予防又は治療（改善）、寿命延長、健康維持のための利用が期待できる。
　本発明は、一態様として、本発明に関するペプチドを含有する、インスリン感受性改善用剤に関する。
　本発明において、「インスリン感受性」とは、体内でのインスリンの作用のしやすさのことであり、インスリン感受性が高い場合にはインスリンが十分に作用を発揮でき、インスリン感受性が低い場合にはインスリンが十分に作用を発揮できない。インスリンの作用とは糖・脂質・タンパク質代謝を制御する作用や細胞の増殖、分化を誘導する作用などを指す。
　本発明において、インスリン感受性改善作用は、例えば後述の試験例３の方法又はこれに準じた方法により評価することができる。
　本発明のインスリン感受性改善用剤は、インスリン感受性改善作用に基づき、代謝性疾患、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、加齢に伴う諸症状及び心血管系疾患の予防又は治療（改善）、寿命延長、健康維持のための利用が期待できる。
　本発明は、一態様として、本発明に関するペプチドを含有する、ＦＧＦ２１分泌促進用剤に関する。
　ＦＧＦ２１は、主に肝臓などで産生される細胞間シグナル因子で、様々な細胞の増殖、分化、代謝の制御に関わる。
　本発明において、ＦＧＦ２１分泌促進作用は、例えば後述の試験例４の方法又はこれに準じた方法により評価することができる。
　本発明のＦＧＦ２１分泌促進用剤は、ＦＧＦ２１分泌促進作用に基づき、代謝性疾患、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、加齢に伴う諸症状及び心血管系疾患の予防又は治療（改善）、寿命延長、健康維持のための利用が期待できる。
　ＦＧＦ２１と、代謝性疾患、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、心血管系疾患との関係については、多くの報告がされている（例えば、EMBO Molecular Medicine (2018) 10, e8791；Hormones and Behavior 85 (2016) 86-95；Psychiatry Research 252 (2017) 111-113；Molecular Psychiatry (2015) 20, 215-223；Endocrinology, June 2012, 153(6), 2689-2700；Cellular Signalling 40 (2017) 10-21；Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders, https://doi.org/10.1007/s11154-019-09488-x）。
　本発明は、一態様として、本発明に関するペプチドを含有する、ストレス抑制または神経保護用剤に関する。
　本発明において、「ストレス抑制」とは、「物理的ストレッサー」（暑さや寒さ、騒音や混雑など）、「化学的ストレッサー」（公害物質、薬物、酸素欠乏・過剰、一酸化炭素など）、「心理・社会的ストレッサー」（人間関係や仕事上の問題、家庭の問題など）によって引き起こされる心理面、身体面、行動面への影響を抑制することを指す。
　本発明において、「神経保護」とは、中枢神経および末梢神経が物理的、化学的な要因によって機能を失うことから保護することを指す。
　本発明において、ストレス抑制作用、神経保護作用は、例えば後述の試験例５の方法又はこれに準じた方法により評価することができる。
　本発明のストレス抑制または神経保護用剤は、ストレス抑制作用または神経保護作用に基づき、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、加齢に伴う諸症状及び心血管系疾患の予防又は治療（改善）、寿命延長、健康維持のための利用が期待できる。
　本発明は、一態様として、本発明に関するペプチドを含有する、疲労軽減用剤に関する。
　本発明において、「疲労軽減」とは、肉体的、精神的な負荷が重なることによって引き起こされる疲れ、やる気の低下、集中力低下などを軽減することを指す。
　本発明において、疲労軽減作用は、例えば後述の試験例６の方法又はこれに準じた方法により評価することができる。
　本発明の疲労軽減用剤は、疲労軽減作用に基づき、認知機能低下、うつ、ストレス、炎症性疾患、加齢に伴う諸症状及び心血管系疾患の予防又は治療（改善）、寿命延長、健康維持のための利用が期待できる。
　本発明の腸管バリア機能改善用剤、血糖上昇抑制用剤、インスリン感受性改善用剤、ＦＧＦ２１分泌促進用剤、ストレス抑制または神経保護用剤、疲労軽減用剤（以下、これらを一括して「本発明の剤」と言うこともある。）は、本発明に関するペプチドそのものであってもよく、本発明に関するペプチドと、その他の成分（例えば、医薬又は食品として許容される担体）とを含有する組成物（例えば、医薬組成物、食品組成物）であってもよい。
　本発明における「剤」は、医薬、食品を包含する概念である。
　本発明の剤は、ヒト、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥）等の対象に、経口的、非経口的に安全に投与することができる。
　本発明の剤は、形態は特に問わず、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル、液剤（例えば、溶液、懸濁液、乳液）、飲料、ゼリー、プリン、ヨーグルト、キャンディー、チューイングガム等が挙げられる。これらは公知の方法で製造することができる。例えば、本発明に関するペプチドを食品又は医薬として許容される担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤）と混合し、食品製剤又は医薬製剤の分野で公知の方法で散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル、液剤等を製造することができる。また、本発明に関するペプチドを、食品（例えば、一般食品、飲料（例えば、水、ソフトドリンク））に添加、混合して製造することもできる。
　本明細書において、食品とは、経口摂取し得るもの（医薬品を除く）を広く包含する概念であり、いわゆる「食べ物」のみならず飲料、健康補助食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品）、サプリメント等を含む。
　本発明の腸管バリア機能改善用剤において、本発明に関するペプチドの投与量（摂取量）は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、例えば０．０５ｍｇ～５００ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５０ｇ、より好ましくは５ｍｇ～１０ｇである。
　本発明の血糖上昇抑制用剤において、本発明に関するペプチドの投与量（摂取量）は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、例えば０．０５ｍｇ～５００ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５０ｇ、より好ましくは５ｍｇ～１０ｇである。
　本発明のインスリン感受性改善用剤において、本発明に関するペプチドの投与量（摂取量）は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、例えば０．０５ｍｇ～５００ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５０ｇ、より好ましくは５ｍｇ～１０ｇである。
　本発明のＦＧＦ２１分泌促進用剤において、本発明に関するペプチドの投与量（摂取量）は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、例えば０．０５ｍｇ～５００ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５０ｇ、より好ましくは５ｍｇ～１０ｇである。
　本発明のストレス抑制または神経保護用剤において、本発明に関するペプチドの投与量（摂取量）は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、例えば０．０５ｍｇ～５００ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５０ｇ、より好ましくは５ｍｇ～１０ｇである。
　本発明の疲労軽減用剤において、本発明に関するペプチドの投与量（摂取量）は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、例えば０．０５ｍｇ～５００ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～５０ｇ、より好ましくは５ｍｇ～１０ｇである。
　本発明の剤において、本発明に関するペプチドの含有量は、投与量（摂取量）が上記範囲となる量から適宜選択することができる。
　本発明はまた、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなる、新規ペプチドに関する。各ペプチドの定義及び製造方法は、本発明の剤について上述した説明と同じである。これらのペプチドは、上述した通り、腸管バリア機能改善作用、血糖上昇抑制作用、インスリン感受性改善作用、ＦＧＦ２１分泌促進作用、ストレス抑制作用、神経保護作用又は、疲労軽減作用を有し、該作用に基づく用途のための、医薬、食品等として利用し得る。
　以下に、製造例及び試験例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例によって限定されるものではない。
　以下の製造例、試験例において、化合物１～６は下記を示す。
化合物１：ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチド
化合物２：ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチド
化合物３：ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチド
化合物４：ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）のアミノ酸配列からなるペプチド
化合物５：ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるペプチド
化合物６：ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるペプチド
［製造例１］化合物1の製造
　Fmoc-Leu-Wang樹脂を出発原料として、9-fluorenylmethoxycarbonyl法(Fmoc法)によりペプチド鎖を伸長させて、目的の保護ペプチド樹脂を合成した。次いで、トリフルオロ酢酸処理により脱樹脂、脱保護を行って粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、凍結乾燥することにより目的物を白色粉末として得た。
収量3.0ｇ（純度98.3%）
ESI-MS: MW=1103.0 (理論値 1103.4)
アミノ酸分析値；Thr (2) 1.90, Glu (1) 1.01, Gly (1) 0.98, Val (1) 0.80, Met (1) 0.97, Ile (1) 0.79, Leu (2) 2.0, Lys (1) 1.01, NH3 (1) 1.10
［製造例２］化合物２の製造
　Fmoc-Gly-Wang樹脂を出発原料として、9-fluorenylmethoxycarbonyl法(Fmoc法)によりペプチド鎖を伸長させて、目的の保護ペプチド樹脂を合成した。次いで、トリフルオロ酢酸処理により脱樹脂、脱保護を行って粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、凍結乾燥することにより目的物を白色粉末として得た。
収量1.26ｇ（純度99.3%）
ESI-MS: MW=990.2 (理論値 990.2)
アミノ酸分析値；Thr (2) 1.89, Glu (1) 1.00, Gly (1) 0.97, Val (1) 0.81, Met (1) 0.98, Ile (1) 0.80, Leu (1) 0.99, Lys (1) 1.01, NH3 (1) 1.10
［製造例３］化合物３の製造
　Fmoc-Lys(Boc)-Wang樹脂を出発原料として、9-fluorenylmethoxycarbonyl法(Fmoc法)によりペプチド鎖を伸長させて、目的の保護ペプチド樹脂を合成した。次いで、トリフルオロ酢酸処理により脱樹脂、脱保護を行って粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、凍結乾燥することにより目的物を白色粉末として得た。
収量1.26ｇ（純度99.0%）
ESI-MS: MW=933.1 (理論値 933.2)
アミノ酸分析値；Thr (2) 1.89, Glu (1) 1.00, Val (1) 0.81, Met (1) 0.98, Ile (1) 0.80, Leu (1) 0.99, Lys (1) 1.01, NH3 (1) 1.10
［製造例４］化合物４の製造
　Fmoc-Leu-Wang樹脂を出発原料として、9-fluorenylmethoxycarbonyl法(Fmoc法)によりペプチド鎖を伸長させて、目的の保護ペプチド樹脂を合成した。次いで、トリフルオロ酢酸処理により脱樹脂、脱保護を行って粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、凍結乾燥することにより目的物を白色粉末として得た。
収量1.26ｇ（純度99.4%）
ESI-MS: MW=990.0 (理論値 990.2)
アミノ酸分析値；Thr (2) 1.89, Glu (1) 1.00, Gly (1) 0.99, Val (1) 0.68, Met (1) 0.98, Ile (1) 0.67, Leu (1) 1.00, Lys (1) 1.02, NH3 (1) 1.12
［製造例５］化合物５の製造
　Fmoc-Gly-Wang樹脂を出発原料として、9-fluorenylmethoxycarbonyl法(Fmoc法)によりペプチド鎖を伸長させて、目的の保護ペプチド樹脂を合成した。次いで、トリフルオロ酢酸処理により脱樹脂、脱保護を行って粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、凍結乾燥することにより目的物を白色粉末として得た。
収量1.26ｇ（純度99.3%）
ESI-MS: MW=876.9 (理論値 877.1)
アミノ酸分析値；Thr (2) 1.88, Glu (1) 1.00, Gly (1) 0.97, Val (1) 0.66, Met (1) 0.99, Ile (1) 0.65, Leu (1) 1.00, Lys (1) 1.01, NH3 (1) 1.09
［製造例６］化合物６の製造
　Fmoc-Leu-Wang樹脂を出発原料として、9-fluorenylmethoxycarbonyl法(Fmoc法)によりペプチド鎖を伸長させて、目的の保護ペプチド樹脂を合成した。次いで、トリフルオロ酢酸処理により脱樹脂、脱保護を行って粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、凍結乾燥することにより目的物を白色粉末として得た。
収量1.26ｇ（純度99.5%）
ESI-MS: MW=877.0 (理論値 877.1)
アミノ酸分析値；Thr (2) 1.87, Glu (1) 1.00, Gly (1) 0.98, Val (1) 1.00, Met (1) 0.99, Ile (1) 1.00, Leu (1) 1.00, Lys (1) 1.01, NH3 (1) 1.33
［試験例１］腸管透過性
　前日１０時より絶食処置を施した雄性ＫＫ－Ａｙマウス（１１週齢）に、投与媒体（０．５％メチルセルロース；ｖｅｈｉｃｌｅ）又は化合物１　１００ｍｇ／ｋｇを経口投与し、１時間後にＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ（ＦＤ－４）３００ｍｇ／ｋｇを経口投与した。ＦＤ－４投与１時間及び２時間後に尾静脈より採血し、血漿中のＦＤ－４濃度を測定した。結果を図１に示す。
　図１より、ＦＤ－４を経口投与し１時間及び２時間後どちらもｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて化合物１投与群において血中ＦＤ－４濃度の上昇抑制を認めたことから、化合物１は腸管バリア機能を改善することが確認された。
［試験例２］経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）
　前日１７時より絶食処置を施した雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢）に、投与媒体（０．５％メチルセルロース；ｖｅｈｉｃｌｅ）又は化合物１　３０ｍｇ／ｋｇを経口投与し、１時間後に２ｇ／ｋｇのグルコースを強制経口投与した。投与前、投与１５、３０、６０、１２０及び１８０分後に尾静脈から採血して血糖値を測定した。
　グルコース負荷後の血糖値は、負荷後３０分以降で化合物１投与群において低く推移した。０分値を基準とした血糖値推移曲線下面積（ΔＡＵＣ）を計算した結果を図２に示す。
　図２より、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて、化合物１投与群で低値を示したことから、化合物１の血糖上昇抑制作用が確認された。
［試験例３］インスリン負荷試験（ＩＴＴ）
　前日１７時より絶食処置を施した雄性ＫＫ－Ａｙマウス（７～１２週齢）に、投与媒体（０．５％メチルセルロース；ｖｅｈｉｃｌｅ）又は化合物１　３０ｍｇ／ｋｇを経口投与し、１時間後にインスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）を皮下投与した。投与前、投与１５、３０、６０、１２０及び１８０分後に尾静脈から採血して血糖値を測定した。化合物２～６についても同様の方法で血糖値を測定した。０分時の血糖値からの推移を図３（ａ）に示す。０分値を基準とした血糖値推移曲線下面積（ΔＡＵＣ）を計算した結果を図３（ｂ）に示す。
　図３（ａ）及び（ｂ）より、ＫＫ－Ａｙマウスはインスリン抵抗性が強く、ｖｅｈｉｃｌｅ群ではインスリンを投与しても血糖値の明らかな低下は認められなかったが、化合物１投与群においては有意な血糖低下を示した。このようなインスリン感受性改善効果は、化合物２～６についても同様に認められた。
［試験例４］ＦＧＦ２１分泌促進作用
　６時間絶食処置を施した雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）に、投与媒体（０．５％メチルセルロース；ｖｅｈｉｃｌｅ）又は化合物１　３０ｍｇ／ｋｇを強制経口投与し、投与前、投与１２０分後に門脈より採血し、血漿中ＦＧＦ２１濃度を測定した。結果を図４に示す。
　図４より、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて、化合物１投与群では投与１２０分後の血中ＦＧＦ２１の濃度上昇が確認された。
［試験例５］抗ストレス、神経保護作用
　一晩絶食処置を施した雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（９週齢）を、マウス用拘束ストレスケージに収容して３時間静置した後に、投与媒体（０．５％メチルセルロース；ｖｅｈｉｃｌｅ）又は化合物１　３０ｍｇ／ｋｇを経口投与し、投与１２０分後に下大静脈より採血し、血漿中アセチル－Ｌ－カルニチン濃度を測定した。アセチル－Ｌ－カルニチンは抗ストレス、神経保護作用を有することが知られている内因性の代謝物である（例えば、Nasca C et al., “L-acetylcarnitine causes rapid antidepressant effects through the epigenetic induction of mGlu2 receptors”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, Mar 19; 110(12): 4804-4809；および、Kazak F et al., “Neuroprotective effects of acetyl-l-carnitine on lipopolysaccharide-induced neuroinflammation in mice: Involvement of brain-derived neurotrophic factor”, Neuroscience Letters, 2017 Sep 29; 658: 32-36）。
　結果を図５に示す。
　図５より、ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて、化合物１投与群では投与１２０分後の血中アセチル－Ｌ－カルニチン濃度の上昇が観察され、ストレス抑制あるいは神経を保護する反応が確認された。
［試験例６］抗疲労作用
　一晩絶食処置を施した雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢）に、投与媒体（０．５％メチルセルロース；ｖｅｈｉｃｌｅ）又は化合物１　３０ｍｇ／ｋｇを強制経口投与し、投与１２０分後に門脈より採血し、血漿中オルニチン、シトルリン濃度を測定した。血漿中のオルニチン／シトルリン比は慢性疲労症候群などの疲労時に上昇するバイオマーカーとして知られている（例えば、Yamano E et al., “Index markers of chronic fatigue syndrome with dysfunction of TCA and urea cycles”, Scientific Reports, 2016 Oct 11; 6: 34990, doi: 10.1038/srep34990）。
　結果を図６に示す。
　図６より、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて、化合物１投与群では投与１２０分後の血中オルニチン／シトルリン比が低下しており、疲労を軽減する生体反応が観察された。
［製造例７］牛乳タンパク質加水分解物の製造
　精製した牛乳βラクトグロブリン（終濃度２ｍｇ／ｍL）とキモトリプシン（終濃度０．０２ｍｇ／ｍL）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で混合し、３７℃で反応させた。反応開始後に経時的に反応液を採取し、反応液中の化合物１の濃度をＱ-ＴＯＦ/ＭＳにて測定した。結果を図７に示す。
　図７より、反応時間依存的に反応液中に化合物１が生成されることが確認できた。したがって、牛乳タンパク質の酵素加水分解によっても化合物の製造が可能であることが確認された。
　本発明に関するペプチドは、腸管バリア機能改善、血糖上昇抑制、インスリン感受性改善、、ＦＧＦ２１分泌促進、ストレス抑制、神経保護、疲労軽減のための医薬、食品として有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１９－１０９０８９を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、腸管バリア機能改善用剤。
  2. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、血糖上昇抑制用剤。
  3. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、インスリン感受性改善用剤。
  4. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、ＦＧＦ２１分泌促進用剤。
  5. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、ストレス抑制または神経保護用剤。
  6. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、疲労軽減用剤。
  7. 　ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
  8. 　ホエイタンパク質を、キモトリプシンにより加水分解する工程を含む、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号１）、ＬＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号２）、ＬＩＶＴＱＴＭＫ（配列番号３）、ＩＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号４）、ＩＶＴＱＴＭＫＧ（配列番号５）、ＶＴＱＴＭＫＧＬ（配列番号６）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを含有するホエイタンパク質の加水分解物の製造方法。
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