WO2014030745A1 - バイオマスからのエタノールの生産方法 - Google Patents

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WO2014030745A1
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yeast
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haa1
acetic acid
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近藤　昭彦
誠久 蓮沼
由梨 崎濱
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国立大学法人神戸大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol from biomass.
  • biomass is a renewable resource, exists in large quantities on the earth, and does not increase carbon dioxide in the atmosphere even if it is used (carbon neutral), thereby contributing to the prevention of global warming.
  • bioethanol is mainly made from corn and sugarcane, and competition with food is a problem. Therefore, in the future, production of bioethanol using lignocellulosic biomass such as rice straw, wheat straw and waste wood that does not compete with food will be required.
  • Lignocellulosic biomass is mainly composed of three types of components: cellulose, hemicellulose, and lignin.
  • cellulose when saccharified to glucose, cellulose can be used for ethanol fermentation by yeast Saccharomyces cerevisiae that can assimilate glucose.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae that can assimilate glucose.
  • natural yeast even if hemicellulose is saccharified to pentoses such as xylose and arabinose, natural yeast has a very low ability to assimilate such as xylose and arabinose, so that it is difficult to utilize for ethanol production by fermentation.
  • xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) derived from the yeast Pichia stipitis and xylulokinase derived from the yeast Saccharomyces cerevisiae were used using genetic recombination techniques.
  • Yeast that overexpresses these enzymes by introducing the gene (XK) into yeast has been produced (Non-patent Documents 1 and 2).
  • xylose isomerase (XI) from the genus Anaerobic Piromyces or Orpinomyces (XI) and XK gene derived from yeast Saccharomyces cerevisiae are introduced into yeast and expressed, whereby ethanol fermentation from xylose (Non-Patent Document 3).
  • xylose-assimilating yeast has enabled ethanol fermentation from xylose
  • problems in industrializing this For example, xylose has problems such as a slow rate of assimilation (consumption) compared to glucose, a slow ethanol production rate, and a low ethanol yield.
  • the biggest problem in the practical application of ethanol production from cellulosic biomass is the presence of fermentation inhibitors in saccharified biomass.
  • an enzymatic method, a dilute sulfuric acid method, a hydrothermal decomposition method, or the like is used.
  • Enzymatic methods require many kinds and a large amount of enzymes, and there is a problem in cost for industrialization.
  • dilute sulfuric acid method and hydrothermal decomposition method produce various overdecomposition products (by-products) such as weak acids such as acetic acid and formic acid, aldehydes such as furfural and hydroxymethylfurfural (HMF), and phenols such as vanillin.
  • Non-Patent Documents 4 to 6 are fermentation inhibitors that greatly inhibit ethanol fermentation from xylose. Therefore, in order to put ethanol fermentation from biomass into practical use using the sulfuric acid method and hydrothermal decomposition method, which are advantageous in terms of cost, even in the presence of yeast that is resistant to biomass over-decomposition, or these fermentation inhibitors A yeast capable of efficient ethanol fermentation is required.
  • Non-Patent Documents 4 to 6 It has been found that furfural has a great influence on yeast survival, growth rate, budding, ethanol yield, biomass yield, enzyme activity and the like. HMF was found to cause lipid accumulation, reduce protein content, and inhibit alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase in yeast cells. In order to search for resistance genes against furfural and HMF, research has been carried out using methods such as screening for disrupted strains and transcription analysis (Non-patent Documents 7 and 8).
  • weak acids such as acetic acid and formic acid are considered to affect the pH in yeast cells. That is, the weak acid in the medium is present in an undissociated state, and when this non-dissociated weak acid permeates the yeast cell membrane and enters the yeast cytosol near pH neutral, anion, proton and It is considered that the pH in the yeast cell is decreased by dissociating into (Non-patent Document 4).
  • ATPase works to maintain homeostasis and consequently requires ATP.
  • ATP is regenerated by ethanol fermentation.
  • ethanol fermentation from xylose is considered to have low ATP regeneration efficiency because fermentability decreases in the presence of acetic acid.
  • the present inventors examined the relationship between acetic acid and pH in the fermentation medium in a strain obtained by introducing XR, XDH and XK genes into the MN8140X strain of yeast Saccharomyces cerevisiae. It was found that yeast fermentation inhibition does not occur when the pH is adjusted from the acidic side to the neutral side. It has been reported that similar results were obtained even in yeast introduced with XI and XK genes (Non-patent Document 9).
  • the present inventors have used xylose-assimilating yeast transformed to overexpress at least one gene of a pentose phosphate pathway metabolic enzyme such as transaldolase (TAL) or transketolase (TKL). Efficient ethanol fermentation from xylose has been studied even in the presence of acetic acid (Patent Document 1).
  • TAL transaldolase
  • TKL transketolase
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing ethanol by ethanol fermentation from xylose using saccharified biomass containing various fermentation inhibitors.
  • the present inventors have introduced various yeasts in saccharified biomass, which are obtained by introducing an acetic acid-responsive transcription factor gene into xylose-assimilating yeast and overexpressing the gene.
  • the present invention was completed by finding that it has resistance to the fermentation inhibitory substance.
  • the present invention provides a method for producing ethanol from biomass, which comprises mixing and cultivating xylose-assimilating yeast transformed with saccharified biomass so as to overexpress the gene for an acetic acid-responsive transcription factor. including.
  • the acetic acid responsive transcription factor is Haa1.
  • the transformed xylose-assimilating yeast is a yeast deficient in the PHO13 gene.
  • the saccharified biomass includes a fermentation inhibitor.
  • the fermentation inhibitor is at least one selected from the group consisting of acetic acid, formic acid, furfural, hydroxymethylfurfural and vanillin.
  • the present invention also provides a xylose-assimilating yeast transformed so as to overexpress the gene for an acetic acid responsive transcription factor.
  • the acetic acid responsive transcription factor is Haa1.
  • the transformed xylose-assimilating yeast is a yeast deficient in the PHO13 gene.
  • the present invention also provides a method for producing a xylose-assimilating yeast that exhibits resistance to a fermentation inhibitor when mixed with saccharified biomass, cultured and fermented, and the method provides an acetic acid-responsive transcription factor to the xylose-assimilating yeast. A step of transforming so that the above gene is overexpressed.
  • the present invention also provides a method for producing a xylose-assimilating yeast that exhibits resistance to acetic acid when mixed with saccharified biomass, cultured and fermented, and the method comprises the gene for an acetic acid-responsive transcription factor in a xylose-assimilating yeast. Transforming to overexpress.
  • the acetic acid responsive transcription factor is Haa1.
  • the method further includes the step of deleting the PHO13 gene from the xylose-assimilating yeast.
  • ethanol can be efficiently produced by ethanol fermentation from xylose using saccharified biomass containing various fermentation inhibitors. This makes it possible to produce bioethanol using lignocellulosic biomass such as rice straw, wheat straw, and waste wood that does not compete with food.
  • the yeast of the present invention is a transformed xylose-assimilating yeast into which an acetic acid-responsive transcription factor gene has been introduced.
  • the xylose-assimilating yeast used for transformation is not particularly limited as long as it is a yeast that can produce ethanol from xylose by ethanol fermentation. Examples thereof include xylose-assimilating yeast obtained by introducing a plasmid that imparts xylose-assimilating ability to yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the plasmid imparting xylose utilization ability can be prepared according to, for example, the description of S. Katahira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, Vol. 72, p. 1136-1143.
  • the method for introducing a gene into yeast is not particularly limited.
  • a lithium acetate method, an electroporation method, and a protoplast method can be mentioned.
  • the introduced gene may exist in the form of a plasmid, or may exist in a form inserted into a yeast chromosome or in a form integrated into a yeast chromosome by homologous recombination.
  • the acetic acid-responsive transcription factor is not particularly limited, and examples thereof include Haa1. Preferably, it is Haa1.
  • Haa1 E. Bellissimi et al., “Identification of a DNA-binding site for the transcription factor Haa 1, required for Saccharomyces cerevisiae response to acetic acid stress, 2011, Vol.
  • TPO2 gene In response to acetic acid, TPO2 gene, YLR297w gene, STP3 gene, YRO2 gene, YAR029w gene, TOS3 gene, YIR035c gene, YGP1 gene, PCL10 gene, YPR127w gene, DSD1 gene, MSN4 gene, YJR096w gene, SPI1 gene , HOR2 gene, YKR075c gene, SUR2 gene, ICY1 gene, INM1 gene, SAP30 gene, YNL200c gene, STF2 gene, SYC1 gene, YLR326w gene, YAR028w gene, YNL024 Gene, YNR034w-a gene, GPG1 gene, PDE1 gene, ADI1 gene, YNL217w gene, NRG1 gene, YPL071c gene, TMA10 gene, GRX8 gene, PFK27 gene, FKH2 gene, EEB1 gene
  • the gene for an acetic acid responsive transcription factor may be endogenous or exogenous in the host microorganism.
  • a gene derived from Saccharomyces cerevisiae can be used, and the base sequence of this gene is as shown in SEQ ID NO: 1 (its encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2).
  • the gene of a well-known acetic acid response transcription factor can be utilized suitably, It is not limited to the gene illustrated above.
  • the gene can be used regardless of origin. That is, the gene may be derived from organisms such as animals, plants, fungi (such as molds), and bacteria other than those described above. Those skilled in the art can appropriately obtain information on such genes by accessing various gene database (for example, NCBI) websites (for example, for Haa1, the NCBI gene registration number is Gene ⁇ ID: 856117). is there).
  • the gene of the acetate-responsive transcription factor used in the present invention has an acetate-responsive transcription activity, it has a certain relationship with the sequence information disclosed in the database or the like or the sequences of various genes specifically described in the present specification. It may be a gene encoding a protein having As such an embodiment, a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the disclosed amino acid sequence, and having an enzymatic activity to be expressed or enhanced in the present invention is provided. Examples include the gene to be encoded. Any one type of amino acid mutation relative to the disclosed amino acid sequence, that is, deletion, substitution or addition may be used, or two or more types may be combined.
  • the total number of these mutations is not particularly limited, but is, for example, about 1 or more and 10 or less, or 1 or more and 5 or less.
  • amino acid substitutions may be any substitution as long as each enzyme activity is present, and examples include conservative substitutions. Specifically, within the following groups (that is, between amino acids shown in parentheses): ) (Glycine, alanine) (valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).
  • the gene used in the present invention has an amino acid sequence having, for example, 70% or more sequence identity with respect to the disclosed amino acid sequence, and is intended to be expressed or enhanced in the present invention. And a gene encoding a protein having the enzyme activity. Sequence identity can also be 74% or more, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more.
  • sequence identity or similarity is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing sequences, as is known in the art. .
  • Sequence “identity” means between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. Means the degree of sequence invariance.
  • similarity refers to a protein or polynucleotide sequence as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. It means the degree of correlation.
  • the method for determining identity and similarity is preferably a method designed to align the longest between the sequences to be compared. Methods for determining identity and similarity are provided as programs available to the public. For example, the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (Eg Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410; Altschyl et al, Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3389-3402 ) Can be determined.
  • the conditions for using software such as BLAST are not particularly limited, but it is preferable to use default values.
  • a gene that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to a DNA consisting of the disclosed base sequence can be mentioned.
  • the stringent condition refers to, for example, a condition where a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • nucleic acid having high nucleotide sequence identity that is, a disclosed nucleotide sequence, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95%
  • examples include a condition in which a complementary strand of DNA consisting of a base sequence having the above or 98% identity is hybridized and a complementary strand of a nucleic acid having a lower homology is not hybridized.
  • the sodium salt concentration is, for example, 15 to 750 mM, 50 to 750 mM, or 300 to 750 mM
  • the temperature is, for example, 25 to 70 ° C., 50 to 70 ° C., or 55 to 65 ° C.
  • the formamide concentration is, for example, The conditions are 0 to 50%, 20 to 50%, or 35 to 45%.
  • the filter washing conditions after hybridization are such that the sodium salt concentration is, for example, 15 to 600 mM, 50 to 600 mM, or 300 to 600 mM, and the temperature is, for example, 50 to 70 ° C., 55 to 70 ° C. Or 60 to 65 ° C.
  • the disclosed base sequence and, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98%
  • examples thereof include a gene comprising a DNA having a base sequence having the above identity and encoding a protein having an enzyme activity to be expressed or enhanced in the present invention.
  • Such a gene is, for example, using DNA extracted from various organisms, various cDNA libraries, genomic DNA libraries, etc. as a template using primers designed based on the disclosed or known base sequences. By performing PCR amplification, it can be obtained as a nucleic acid fragment.
  • a nucleic acid fragment can be obtained by performing hybridization using a nucleic acid derived from the above library as a template and a DNA fragment that is a part of a gene encoding an enzyme to be expressed or expressed in the present invention as a probe. Can do.
  • the gene may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods.
  • the gene may be modified by, for example, a DNA encoding a disclosed or known amino acid sequence by a conventional mutagenesis method, site-directed mutagenesis method, molecular evolution method using error-prone PCR, or the like.
  • a known technique such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto can be mentioned.
  • a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis for example, Mutant-K (Takara Bio Inc.)) Mutant-G (manufactured by company) or Mutant-G (manufactured by Takara Bio Inc.)
  • the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit of Takara Bio Inc. is introduced.
  • the gene may be codon optimized to optimize expression in the host microorganism. Codon optimization can be performed using any means and apparatus commonly used by those skilled in the art.
  • the form in which the expression of the gene encoding the acetate responsive transcription factor is enhanced is not particularly limited. It is only necessary to confirm an increase in the production amount or activity of these proteins compared to before the modification that enhances the expression of these genes.
  • gene expression for example, any endogenous gene is linked under the control of a stronger promoter (which can be either a constitutive promoter or an inducible promoter). Embodiments are mentioned.
  • a stronger promoter which can be either a constitutive promoter or an inducible promoter.
  • an embodiment in which either an endogenous gene and / or an exogenous gene is additionally introduced can be mentioned. Any additionally introduced gene is preferably operably retained by a strong promoter, such as a constitutive promoter.
  • the enhancement of expression is also referred to as “overexpression” in the present specification.
  • the acetate-responsive transcription factor gene is preferably inserted into a plasmid.
  • the plasmid preferably has a selection marker and a replication gene for Escherichia coli in terms of facilitating preparation of the plasmid and detection of the transformant.
  • the selection marker is not particularly limited, and examples thereof include drug resistance genes and auxotrophic genes.
  • the drug resistance gene is not particularly limited, and examples thereof include an ampicillin resistance gene (Amp r ) and a kanamycin resistance gene (Kan r ).
  • the auxotrophic gene is not particularly limited, and examples thereof include N- (5′-phosphoribosyl) anthranilate isomerase (TRP1) gene, tryptophan synthase (TRP5) gene, malate ⁇ -isopropyl dehydrogenase (LEU2) gene, imidazoleglycerol Examples thereof include a phosphate dehydrogenase (HIS3) gene, a histidinol dehydrogenase (HIS4) gene, a dihydroorotate dehydrogenase (URA1) gene, and an orotidine-5-phosphate decarboxylase (URA3) gene.
  • a replication gene for yeast is not always necessary.
  • the plasmid preferably has an appropriate promoter and terminator for expressing the acetate-responsive transcription factor gene in yeast.
  • the promoter and terminator are not particularly limited.
  • triose phosphate dehydrogenase (TDH3) gene phosphoglycerate kinase (PGK) gene, glyceraldehyde 3′-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene, glyceraldehyde 3′- Examples include the promoter and terminator of the phosphate dehydrogenase (GAP) gene.
  • TDH3 triose phosphate dehydrogenase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • GAP glyceraldehyde 3′- Examples
  • the plasmid has a gene necessary for homologous recombination, if necessary.
  • the gene required for homologous recombination is not particularly limited, and examples thereof include Trp1, LEU2, HIS3, and URA3.
  • the plasmid optionally has a secretory signal sequence.
  • the plasmid as described above can be prepared according to the description in Example 1 below, but is not particularly limited.
  • pIU-GluRAG-SBA and pIH-GluRAG-SBA described in R. Yamada et al., Enzyme Microb. Technol., 2009, Vol. 44, p. 344-349 can also be used.
  • An acetate-responsive transcription factor gene is inserted between the promoter and terminator of these plasmids.
  • plasmids having an acetic acid-responsive transcription factor gene When introducing plasmids having an acetic acid-responsive transcription factor gene into xylose-assimilating yeast, it is preferable to cut the plasmid into a linear shape at one site in order to incorporate these genes into the chromosome by homologous recombination. .
  • a transformed yeast overexpressing the acetate-responsive transcription factor gene can be produced.
  • the overexpression of the acetate-responsive transcription factor gene can be confirmed by methods well known to those skilled in the art, such as RT-PCR.
  • the xylose-assimilating yeast overexpressing the acetate responsive transcription factor gene is deficient in the PHO13 gene. That is, it can be a xylose-assimilating yeast that overexpresses the acetate-responsive transcription factor gene and lacks the PHO13 gene. In one embodiment, it may be a xylose-assimilating yeast that overexpresses Haa1 and lacks the PHO13 gene.
  • the PHO13 gene is presumed to be alkaline phosphatase, but its intracellular function and specific substrate have not been clarified.
  • Yeast introduced with the genes for xylose-utilizing enzymes xylose reductase, xylitol dehydrogenase, and xylulokinase and lacking the PHO13 gene can improve xylose-utilizing ability, and the presence of acetic acid, formic acid, or furfural Fermentability can be maintained under (K. Fujitomi et al., Bioresour. Technol., 2012, 111, p. 161-166).
  • the NCBI gene registration number is GeneGe ID: 851362.
  • the base sequence of the PHO13 gene derived from Saccharomyces cerevisiae and its encoded amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • Preparation of yeast lacking the PHO13 gene can be made by suppressing the expression of the gene in yeast.
  • Embodiments of gene expression suppression include suppression of normal protein production and production or promotion of non-functional mutant proteins.
  • Examples of the genetic manipulation for that purpose include transgenic, gene knockout, knock-in and the like.
  • production of a xylose-assimilating yeast deficient in the PHO13 gene can be carried out according to the procedure described in the above-mentioned K. Fujitomi et al.
  • Method for producing ethanol from biomass of the present invention saccharified biomass and transformed yeast overexpressing an acetic acid responsive transcription factor gene are mixed and cultured.
  • saccharified biomass there may be a fermentation inhibitor such as acetic acid produced by biomass overdegradation.
  • a fermentation inhibitor such as acetic acid produced by biomass overdegradation.
  • the transformed yeast of the present invention is resistant to such a fermentation inhibitor, ethanol fermentation is inhibited. Without any further progress, ethanol is produced in the culture.
  • the method for producing ethanol from biomass of the present invention includes a step of mixing and cultivating xylose-utilizing yeast transformed with saccharified biomass so as to overexpress the gene of an acetic acid responsive transcription factor (in the present specification, In this case, this culture step is also referred to as a fermentation step).
  • Biomass is not an exhaustible resource, but an industrial resource originating from a living organism constituent material. In other words, it refers to a renewable, organic resource excluding fossil resources.
  • the biomass is not particularly limited, and examples thereof include resource crops or wastes thereof.
  • the resource crop is not particularly limited, and examples thereof include corn and sugarcane, and examples of the resource crop waste include waste generated in these treatment steps.
  • Lignocellulosic biomass is preferred because it does not compete with food.
  • the lignocellulosic biomass is not particularly limited, for example, parts excluding parts that are foods of gramineous plants such as rice, wheat, Japanese pampas grass, reeds (for example, rice husks, roots, stems, leaves), and these parts Waste generated from products consisting of
  • Biomass saccharification refers to the degradation of polysaccharides in biomass into oligosaccharides or monosaccharides, and includes the further excessive decomposition of monosaccharides.
  • the saccharification method used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme method, a dilute sulfuric acid method, and a hydrothermal decomposition method.
  • the dilute sulfuric acid method and hydrothermal decomposition method are preferable in terms of cost.
  • biomass is treated with 1 to 5% dilute sulfuric acid at 180 to 200 ° C. for about 5 minutes to 1 hour.
  • the hydrothermal decomposition method for example, the biomass is treated with water at about 130 to 300 ° C. and about 10 MPa.
  • Saccharified biomass refers to a composition obtained by saccharifying biomass, and saccharified biomass is mainly composed of monosaccharides produced by degradation of polysaccharides, and other oligosaccharides remaining undegraded or Contains polysaccharides and by-products produced by hyperlysis.
  • the by-product generated by overdegradation is not particularly limited, and examples thereof include weak acids such as acetic acid and formic acid, aldehydes such as furfural and hydroxymethylfurfural (HMF), and phenols such as vanillin.
  • the transformed yeast can be increased in the amount of cells by culturing under aerobic conditions before being subjected to fermentation. Culture of the transformed yeast can be appropriately performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the pH of the medium is, for example, 4 to 6, preferably 5.
  • the dissolved oxygen concentration in the medium during aerobic culture is, for example, 0.5 to 6 ppm, preferably 1 to 4 ppm, more preferably 2 ppm.
  • the culture temperature is, for example, 20 to 45 ° C, preferably 25 to 35 ° C, more preferably 30 ° C.
  • Culturing is preferably carried out until the amount of yeast cells is, for example, 10 g (wet amount) / L or more, preferably 25 g (wet amount) / L, more preferably 37.5 g (wet amount) / L or more. For example, it is about 20 to 50 hours.
  • culture conditions generally applied to yeast can be appropriately selected and used.
  • stationary culture, shaking culture, aeration-agitation culture, or the like can be used for culture for fermentation.
  • the aeration conditions can be appropriately selected from anaerobic conditions, microaerobic conditions, aerobic conditions, and the like.
  • the culture temperature is, for example, 25 ° C. to 40 ° C., preferably 28 ° C. to 35 ° C., more preferably 30 ° C.
  • the culture time can be set to any time as necessary, and can be set to a culture time within a range of, for example, 6 hours to 24 hours, or 12 hours to 36 hours, or 24 hours to 50 hours. .
  • the pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • the fermentation medium can further contain a medium component that can be added for culturing the yeast, if necessary.
  • a step of recovering an ethanol-containing fraction from the culture solution (fermentation solution), and a step of purifying or concentrating it can also be performed. These steps and the means required for them are appropriately selected by those skilled in the art.
  • the yeast of the present invention has resistance to various fermentation inhibitors such as aldehydes such as acetic acid, formic acid and furfural contained in saccharified biomass subjected to pretreatment such as hydrothermal decomposition.
  • Ethanol can be efficiently produced by ethanol fermentation from xylose using the yeast of the present invention and saccharified biomass containing various fermentation inhibitors.
  • Example 1 Test of ethanol fermentation from xylose in the presence of acetic acid using Haa1 overexpressing xylose-assimilating yeast
  • Example 2 Test of ethanol fermentation from xylose in the presence of acetic acid using Haa1 overexpressing xylose-assimilating yeast
  • Preparation of Haa1 overexpression plasmid A plasmid for overexpressing the Haa1 gene in yeast was constructed.
  • pRS405 + 2 ⁇ m prepared as described in J. ⁇ Ishii et al., J. Biochem., 2009, Vol. 145, p. 701-708, was cleaved with restriction enzymes SacI and SacII, and triose phosphate dehydrogenase from yeast Saccharomyces cerevisiae Similarly, the TDH3 promoter and TDH terminator fragment obtained by excising the (TDH3) gene with restriction enzymes SacI and SacII were ligated, and the TDH3 promoter and TDH3 terminator were inserted into the multicloning site of pRS405 + 2 ⁇ m to obtain pRS405pTDH3.
  • the yeast Saccharomyces cerevisiae-derived Haa1 gene (SEQ ID NO: 1 shows the deduced amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) was inserted between the TDH3 promoter and TDH3 terminator of pRS405pTDH3 to prepare plasmid pRS425pTDH3-Haa1.
  • the Haa1 gene used for insertion was prepared by using, as a template, genomic DNA extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae MT8-1 strain (MATa) by a conventional method, using primers Haa1-F (SEQ ID NO: 5) and Haa1-R (SEQ ID NO: 6).
  • a DNA fragment was obtained by a conventional PCR method using, and this fragment was prepared by treating with restriction enzymes NotI and SalI.
  • the resulting plasmid pRS425pTDH3-Haa1 has Amp r gene which confers ampicillin resistance to the transformants.
  • Plasmid pRS425pTDH3-Haa1 or dopRS425pTDH3 (used as a control) was introduced into the xylose-assimilating transformed yeast BY4741XU strain by the lithium acetate method, and BY4741XU / pIUX1X2XK / pRS425pTDH3-Haa1 strains (pRS425pTDH3 / pRS425HTD1).
  • the pIUX1X2XK / pRS425pTDH3 strain (pRS425pTDH3 (control) strain) was prepared.
  • strains are SD-HM solid medium (amino acid-free yeast nitrogen base (Yeast Nitrogen withoutidAmino [Acids) [Difco) 6.7 g / L, glucose 20 g / L, histidine 0.02 g / L, methionine 0 (.02 g / L).
  • amino acid-free yeast nitrogen base Yeast Nitrogen withoutidAmino [Acids) [Difco) 6.7 g / L, glucose 20 g / L, histidine 0.02 g / L, methionine 0 (.02 g / L).
  • Haa1 overexpression strain The expression of the Haa1 gene in the pRS425pTDH3 / Haa1 strain (Haa1 overexpression strain) was examined as follows. Prepare a fermented liquor (xylose 50 g / L, yeast extract 10 g / L, bactopeptone 20 g / L, calcium casaminoate 1.0 g / L, yeast 40 g / L: total amount 50 mL), and culture at 30 ° C. for 1 hour. The yeast cells were sampled. The pRS425pTDH3 (control) strain was used as a control strain.
  • the actin gene was used as a control gene, and calculation was performed by the comparative Ct method. The results are shown in Table 1 below.
  • the xylose and ethanol produced in the medium were quantified over time by HPLC (High performance liquid chromatography system; manufactured by Shimadzu Corporation).
  • HPLC High performance liquid chromatography system
  • Shim-pack SPR-Pb manufactured by Shimadzu Corporation
  • ultrapure water purified water using Milli-Q made by Millipore Japan
  • the detector Used a refractive index detector.
  • the HPLC conditions were a flow rate of 0.6 mL / min and a temperature of 80 ° C.
  • FIG. 1A to 1C show the results of 0 mM, 30 mM, and 60 mM of acetic acid in the case of the control strain, respectively
  • FIGS. 1D to 1F show the results of 0 mM of acetic acid in the case of the Haa1 overexpressing strain, respectively.
  • 30 mM, 60 mM results are shown.
  • the white rhombus is the xylose concentration
  • the white square is the ethanol concentration.
  • the Haa1 overexpressing strain compared to the control strain in both the final xylose consumption and the final ethanol production in the absence of acetic acid or in the presence of 30 mM or 60 mM acetic acid. Increased significantly. In the case of 30 mM acetic acid, the ethanol yield exceeded 80% of the theoretical yield, and in the case of 60 mM acetic acid, it exceeded 50%. In the case of 60 mM acetic acid, it was 33% in the control strain.
  • Example 2 Ethanol fermentation test from xylose in the presence of formic acid using Haa1 overexpressing xylose-assimilating yeast
  • Ethanol fermentation from xylose in the presence of formic acid was performed using Haa1 overexpressing strain or control strain.
  • ethanol fermentation was carried out so that formic acid was not added (0 mM) and the formic acid concentration was 20 mM in a YP medium containing an initial xylose concentration of 50 g / L and a yeast cell amount of 40 g / L (wet weight). This was carried out in the same manner as in Example 1 except that formic acid added was used for fermentation culture.
  • a summary of the fermentation test is shown in Table 3.
  • the Haa1 overexpressing strain increased both xylose consumption and ethanol production rate in the presence of 20 mM formic acid as compared to the control strain (in FIG. 2, the amount of xylose is indicated by white triangles and the amount of ethanol is indicated by black triangles). ).
  • the ethanol yield also exceeded 80% of the theoretical yield.
  • Example 3 Growth test in the presence of furfural using Haa1 overexpressing xylose-assimilating yeast
  • a growth culture test in the presence of furfural was performed using the Haa1 overexpressing strain and the control strain.
  • a culture solution having the composition shown in Table 4 below was prepared, and yeast culture was started. The culture was performed at 30 ° C. with shaking at 70 rpm. The amount of growing cells was measured over time by measuring the absorbance at a wavelength of 600 nm (OD 600 ).
  • Haa1 overexpression, PHO13 deficiency, growth test in the presence of acetic acid using xylose-assimilating yeast Haa1 overexpression, PHO13 deficiency, xylose-assimilating yeast
  • Haaa1 overexpression PHO13 deficiency strain Haa1 overexpression PHO13 deficiency strain
  • Ha. ., 2012, Vol. 111, p. 161-166 Ha. ., 2012.
  • the PHO13-deficient xylose-assimilating yeast hereinafter referred to as “PHO13-deficient control strain” was also obtained by performing PHO13 deficiency similarly for the control strain described in Example 1 (pRS425pTDH3 strain).
  • a growth culture test in the presence of acetic acid was performed using Haa1 overexpressing strain and control strain, and Haa1 overexpressing PHO13 deficient strain and PHO13 deficient control strain.
  • FIG. 4 (A) Haa1 overexpressing strain and control strain; and (B) Haa1 overexpressing PHO13 deficient strain and PHO13 deficient control strain).
  • the Haa1 overexpressing strain shown by a black bar
  • the control strain shown by a white bar
  • the Haa1 overexpressing PHO13-deficient strain is a PHO13-deficient control strain (shown by a white bar) regardless of the concentration of acetic acid. Growth was improved compared to. It was observed that PHO13 deficiency in addition to Haa1 overexpression grew even in the presence of acetic acid at higher concentrations (eg, 60 mM and 80 mM).
  • Example 5 Haa1 overexpression, PHO13 deficiency, ethanol fermentation test from xylose in the presence of acetic acid using xylose-utilizing yeast
  • a Haa1 overexpressing PHO13-deficient strain and a PHO13-deficient control strain an ethanol fermentation test from xylose in the presence of acetic acid was performed in the same manner as in Example 1.
  • the concentration of acetic acid to be added was 0 mM, 50 mM and 100 mM, and calcium pantothenate was changed to 1.0 g / L instead of calcium pantothenate 1.6 g / L.
  • FIG. 5 (A) Haa1 overexpressing PHO13-deficient strain and (B) PHO13-deficient control strain).
  • the Haa1-overexpressing PHO13-deficient strain has xylose utilization and ethanol production in both acetic acid concentrations of 50 mM and 100 mM compared to the PHO13-deficient control strain. Exceeded.
  • yeast deficient in PHO13 in addition to Haa1 overexpression can tolerate even in the presence of higher concentrations of acetic acid (eg, 100 mM) and can produce ethanol.
  • Example 6 Haa1 overexpression, PHO13 deficiency, ethanol fermentation test with real biomass using xylose-assimilating yeast
  • an ethanol fermentation test from xylose with real biomass was performed.
  • a culture solution having the composition shown in Table 7 below was prepared, and yeast culture was started. The culture was performed at 30 ° C. with shaking at 120 rpm.
  • the actual biomass (C5 saccharified solution) is added to the hydrolyzed pretreated rice straw decomposition solution so that the saccharifying enzyme (Pectinase G Amano: Amano Enzyme Co., Ltd.) becomes 1 (w / w)%, and is 50 ° C. And saccharification was performed for 2 days under the condition of 150 rpm. The ethanol produced was quantified over time in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 6 shows the results 2 hours, 4 hours, 6 hours and 24 hours after the start of fermentation.
  • the production amount of ethanol increased rapidly after 6 hours had elapsed from the start of fermentation.
  • the PHO13-deficient control strain ethanol production was not observed at the same time. It was observed that yeast deficient in PHO13 in addition to Haa1 overexpression showed an increase in the rate of ethanol production using real biomass.
  • ethanol can be efficiently produced by ethanol fermentation from xylose using saccharified biomass containing various fermentation inhibitors.

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Abstract

　種々の発酵阻害物質を含む糖化バイオマスを用いたキシロースからのエタノール発酵により、効率的にエタノールを生産する方法を提供すること。本発明のバイオマスからのエタノールの生産方法は、酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。

Description

バイオマスからのエタノールの生産方法
　本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。
　近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与できるからである。
　しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。
　リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成される。このうちセルロースは、グルコースまで糖化されると、グルコースを資化できる酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などによるエタノール発酵に利用できる。これに対して、ヘミセルロースは、キシロース、アラビノースなどのペントースまで糖化されても、天然の酵母はキシロース、アラビノースなどの資化能力が極めて低いため、発酵によるエタノール生産への利用が困難である。
　そこで、キシロースを資化するために、遺伝子組換え技術を用いて、酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のキシルロキナーゼ（ＸＫ）の遺伝子を酵母に導入し、これらの酵素を過剰発現する酵母が作製されている（非特許文献１および２）。他にも、嫌気性真菌ピロミセス（Piromyces）属またはオルピノマイセス（Orpinomyces）属由来のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）および酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＸＫ遺伝子を酵母に導入して発現させることで、キシロースからのエタノール発酵が可能になった（非特許文献３）。
　このようなキシロース資化性酵母の創製により、キシロースからのエタノール発酵が可能になったとはいえ、これを工業化するには種々の問題がある。例えば、キシロースはグルコースと比較して資化（消費）される速度が遅くエタノール生産速度が遅いこと、エタノール収率が低いことなどの問題がある。さらに、セルロース系バイオマスからのエタノール生産の実用化における最大の問題は、糖化バイオマス中の発酵阻害物質の存在である。
　セルロース系バイオマスをＣ６糖のグルコースまたはＣ５糖のキシロースやアラビノースなどへと分解（糖化）するには、酵素法、希硫酸法、水熱分解法などが用いられる。酵素法は、多種類、多量の酵素が必要であり、工業化にはコスト的に問題がある。一方、希硫酸法や水熱分解法は、酢酸、ギ酸などの弱酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのアルデヒド、バニリンなどのフェノール類など、種々の過分解物（副生成物）を生じ、これらの副生成物がキシロースからのエタノール発酵を大きく阻害する発酵阻害物質であることが知られている（非特許文献４～６）。したがって、コスト的に有利な硫酸法や水熱分解法を用いてバイオマスからのエタノール発酵を実用化するには、バイオマスの過分解物に耐性を有する酵母、またはこれらの発酵阻害物質の存在下でも効率的なエタノール発酵が可能な酵母が求められる。
　これまでに発酵阻害物質が酵母に及ぼす影響が調べられてきた（非特許文献４～６）。フルフラールは、酵母の生存、成長速度、出芽、エタノール収率、バイオマス収率、酵素活性などに大きな影響を及ぼすことがわかった。ＨＭＦは、酵母の細胞内で、脂質の蓄積を引き起こし、タンパク質含有量を減少させ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼを阻害することがわかった。フルフラールやＨＭＦに対する耐性遺伝子を探索するため、破壊株のスクリーニング、転写分析などの方法を用いて研究が行われている（非特許文献７および８）。
　一方、酢酸やギ酸などの弱酸は、酵母の細胞内のｐＨに影響を及ぼすと考えられている。すなわち、培地中の弱酸は解離してない状態で存在しており、この非解離状態の弱酸が酵母の細胞膜を透過し、ｐＨが中性付近の酵母の細胞質ゾルに侵入すると、アニオンとプロトンとに解離して酵母の細胞内のｐＨを減少させると考えられている（非特許文献４）。細胞内のｐＨが減少すると、ホメオスタシスを維持するためにＡＴＰａｓｅが働き、この結果ＡＴＰが必要になる。嫌気条件下ではエタノール発酵によりＡＴＰが再生される。一般に、グルコースからのエタノール発酵では、酢酸存在下でもあまり発酵能が影響を受けることなくＡＴＰが再生されると考えられる。しかし、キシロースからのエタノール発酵では酢酸存在下では発酵能が低下するため、ＡＴＰの再生効率が低いと考えられる。
　本発明者らは、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＮ８１４０Ｘ株にＸＲ、ＸＤＨおよびＸＫの遺伝子を導入して得られた株にて発酵培地中の酢酸とｐＨとの関係を調べたところ、酢酸存在下でもｐＨを酸性側から中性側へ調節すると酵母の発酵阻害が起こらないことがわかった。ＸＩおよびＸＫの遺伝子を導入した酵母でも同様の結果が得られたことが報告されている（非特許文献９）。
　しかし、セルロース系バイオマスからのエタノール生産の工業化において、ｐＨの調節は、コストを要し、かつ中性付近のｐＨでは他の微生物が混入しやすくなるため、現実的ではない。このため、酢酸存在下（ｐＨが酸性側）でのキシロースからの効率的なエタノール発酵が求められる。
　本発明者らは、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）やトランスケトラーゼ（ＴＫＬ）などのペントースリン酸経路の代謝酵素の少なくとも１種の遺伝子を過剰発現するように形質転換したキシロース資化性酵母を用いることによって、酢酸の存在下でもキシロースからの効率的なエタノール発酵を検討している（特許文献１）。
　また、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を過剰発現するように形質転換したキシロース資化性酵母を用いることによって、ギ酸の存在下でもキシロースからの効率的なエタノール発酵を検討している（特許文献２）。
　一方で、種々の発酵阻害物質を含む実際の糖化バイオマスを用いたキシロースからのエタノール発酵に適したさらなる技術の改良が所望されている。
国際公開第２０１１／０６５５３９号 特開２０１１－１６７０９６号公報
B. C. H. ChuおよびH. Lee、「Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fermentation」、Biotechnology Advances、2007年、第25巻、p. 425-441 C. LuおよびT. Jeffries、「Shuffling of promoters for multiple genes to optimize xylose fermentation in an engineered Saccharomyces cerevisiae strain」、Appl. Environ. Microbiol.、2007年、第73巻、p. 6072-6077 M. Kuyperら、「Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation」、FEMS Yeast Res.、2005年、第5巻、p. 399-409 J. R. M. Almeidaら、「Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae」、J. Chem. Technol. Biotechnol.、2007年、第82巻、p. 340-349 A. J. A. van Marisら、「Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status」、Antonie van Leeusenhoek、2006年、第90巻、p. 391-418 E. PalmqvistおよびB. Hahn-Hagerdal、「Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition」、Bioresource Technology、2000年、第74巻、p. 25-33 S. W. Gorsichら、「Tolerance to furfural-induced stress is associated with pentose phosphate pathway genes ZWF1, GND1, RPE1, and TKL1 in Saccharomyces cerevisiae」、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第71巻、p. 339-349 A. Peterssonら、「A 5-hydroxymethyl furfural reducing enzyme encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 gene conveys HMF tolerance」、Yeast、2006年、第23巻、p. 455-464 E. Bellissimiら、「Effects of acetic acid on the kinetics of xylose fermentation by an engineered, xylose-isomerase-based Saccharomyces cerevisiae strain」、FEMS Yeast Res.、2009年、第9巻、p. 358-364
　本発明は、種々の発酵阻害物質を含む糖化バイオマスを用いたキシロースからのエタノール発酵により、効率的にエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、酢酸応答転写因子の遺伝子をキシロース資化性酵母に導入して得られた、該遺伝子を過剰発現する形質転換酵母が、糖化バイオマス中の種々の発酵阻害物質に耐性を有することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。
　１つの実施態様では、上記酢酸応答転写因子はＨａａ１である。
　１つの実施態様では、上記形質転換キシロース資化性酵母は、ＰＨＯ１３遺伝子を欠損した酵母である。
　１つの実施態様では、上記糖化バイオマスは、発酵阻害物質を含む。
　１つの実施態様では、上記発酵阻害物質は、酢酸、ギ酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールおよびバニリンからなる群より選択される少なくとも１種である。
　本発明はまた、酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を提供する。
　１つの実施態様では、上記酢酸応答転写因子はＨａａ１である。
　１つの実施態様では、上記形質転換キシロース資化性酵母は、ＰＨＯ１３遺伝子を欠損した酵母である。
　本発明はまた、糖化バイオマスと混合し、培養および発酵したときに発酵阻害物質に対する耐性を示すキシロース資化性酵母の作製方法を提供し、該方法は、キシロース資化性酵母に酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現させるように形質転換する工程を含む。本発明はまた、糖化バイオマスと混合し、培養および発酵したときに酢酸に対する耐性を示すキシロース資化性酵母の作製方法を提供し、該方法は、キシロース資化性酵母に酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現させるように形質転換する工程を含む。
　１つの実施態様では、上記酢酸応答転写因子はＨａａ１である。
　１つの実施態様では、上記キシロース資化性酵母からＰＨＯ１３遺伝子を欠損させる工程をさらに含む。
　本発明の方法によれば、種々の発酵阻害物質を含む糖化バイオマスを用いたキシロースからのエタノール発酵により、効率的にエタノールを生産することができる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が可能となる。
ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３／Ｈａａ１株（Ｈａａ１過剰発現株、Ｄ～Ｆ）およびｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３株（コントロール株、Ａ～Ｃ）について、酢酸非存在下（０ｍＭ：ＡおよびＤ）ならびに酢酸存在下（３０ｍＭ、ＢおよびＥ、および６０ｍＭ、ＣおよびＦ）のキシロースからエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノール）濃度の経時変化を示すグラフである。 ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３／Ｈａａ１株（Ｈａａ１過剰発現株）およびｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３株（コントロール株）について、ギ酸非存在下（０ｍＭ、Ａ）および２０ｍＭのギ酸存在下（Ｂ）のキシロースからエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノール）濃度の経時変化を示すグラフである。 ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３／Ｈａａ１株（Ｈａａ１過剰発現株）およびｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３株（コントロール株）について、フルフラール非存在下（０ｍＭ）および５ｍＭのフルフラール存在下の培養の生育菌体量の経時変化を示すグラフである。 Ｈａａ１過剰発現株およびコントロール株（Ａ）；ならびにＨａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株およびＰＨＯ１３欠損コントロール株（Ｂ）を酢酸非存在下（０ｍＭ）および種々の濃度の酢酸存在下の７２時間培養後の生育菌体量を示すグラフである。 Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株（Ａ）およびＰＨＯ１３欠損コントロール株（Ｂ）について、酢酸非存在下（０ｍＭ）ならびに酢酸存在下（５０ｍＭおよび１００ｍＭ）のキシロースからエタノール発酵させた場合の、発酵液中の基質（キシロース）濃度および生産物（エタノール）濃度の経時変化を示すグラフである。 Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株（Ａ）およびＰＨＯ１３欠損コントロール株（Ｂ）について、実バイオマスからエタノール発酵させた場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
　（本発明の酵母）
　本発明の酵母は、酢酸応答転写因子の遺伝子を導入した形質転換キシロース資化性酵母である。形質転換に用いるキシロース資化性酵母としては、キシロースからエタノール発酵によりエタノールを生産できる酵母である限り、特に限定されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）にキシロース資化能を付与するプラスミドを導入して得られるキシロース資化性酵母が挙げられる。キシロース資化能を付与するプラスミドとしては、例えば、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製することができる。
　酵母に遺伝子を導入する方法は特に制限されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法が挙げられる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
　酢酸応答転写因子としては、特に限定されず、例えば、Ｈａａ１が挙げられる。好ましくは、Ｈａａ１である。Ｈａａ１（E. Bellissimiら、「Identification of a DNA-binding site for the transcription factor Haa 1, required for Saccharomyces cerevisiae response to acetic acid stress」、Nucleic Acids Res.、2011年、第39巻、p. 6896-6907）は、酢酸に応答して、ＴＰＯ２遺伝子、ＹＬＲ２９７ｗ遺伝子、ＳＴＰ３遺伝子、ＹＲＯ２遺伝子、ＹＡＲ０２９ｗ遺伝子、ＴＯＳ３遺伝子、ＹＩＲ０３５ｃ遺伝子、ＹＧＰ１遺伝子、ＰＣＬ１０遺伝子、ＹＰＲ１２７ｗ遺伝子、ＤＳＤ１遺伝子、ＭＳＮ４遺伝子、ＹＪＲ０９６ｗ遺伝子、ＳＰＩ１遺伝子、ＨＯＲ２遺伝子、ＹＫＲ０７５ｃ遺伝子、ＳＵＲ２遺伝子、ＩＣＹ１遺伝子、ＩＮＭ１遺伝子、ＳＡＰ３０遺伝子、ＹＮＬ２００ｃ遺伝子、ＳＴＦ２遺伝子、ＳＹＣ１遺伝子、ＹＬＲ３２６ｗ遺伝子、ＹＡＲ０２８ｗ遺伝子、ＹＮＬ０２４ｃ遺伝子、ＹＮＲ０３４ｗ－ａ遺伝子、ＧＰＧ１遺伝子、ＰＤＥ１遺伝子，ＡＤＩ１遺伝子、ＹＮＬ２１７ｗ遺伝子、ＮＲＧ１遺伝子、ＹＰＬ０７１ｃ遺伝子、ＴＭＡ１０遺伝子、ＧＲＸ８遺伝子、ＰＦＫ２７遺伝子、ＦＫＨ２遺伝子、ＥＥＢ１遺伝子、ＹＬＲ３４６ｃ遺伝子、ＱＣＲ１０遺伝子、ＡＴＧ８遺伝子、ＹＥＲ１８８ｗ遺伝子の発現を活性化することが知られている。
　酢酸応答転写因子の遺伝子は、宿主微生物において内因性であってもよいし、外因性であってもよい。例えば、Ｈａａ１は、サッカロマイセス・セレビシエに由来する遺伝子が用いられ得、この遺伝子の塩基配列は配列番号１に示されるとおりである（そのコードアミノ酸配列を配列番号２に示す）。また、公知の酢酸応答転写因子の遺伝子を適宜利用することができ、上述に例示した遺伝子に限定されない。遺伝子としては、由来を問わないで利用することができる。すなわち、遺伝子は、上記以外に、動物、植物、真菌（カビなど）、細菌などの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、当業者であれば、各種遺伝子データベース（例えば、ＮＣＢＩなど）のホームページにアクセスすることにより適宜入手することができる（例えば、Ｈａａ１について、ＮＣＢＩ遺伝子登録番号はＧｅｎｅ ＩＤ：８５６１１７である）。
　本発明で用いられる酢酸応答転写因子の遺伝子は、酢酸応答転写活性を有する限りにおいて、データベースなどにおいて開示される配列情報または本願明細書中に具体的に記載された各種遺伝子の配列と一定の関係を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このような実施態様としては、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換もしくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、例えば、１個以上１０個以下程度、または１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、各酵素活性を有する限りにおいていずれの置換であってもよいが、例えば、保存的置換が挙げられ、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
　他の実施態様としては、本発明で用いられる遺伝子は、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。配列同一性はまた、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上であり得る。
　本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
　さらに他の実施態様として、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が例えば、１５～７５０ｍＭ、５０～７５０ｍＭ、または３００～７５０ｍＭ、温度が例えば、２５～７０℃、５０～７０℃、または５５～６５℃、ホルムアミド濃度が例えば、０～５０％、２０～５０％、または３５～４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が例えば、１５～６００ｍＭ、５０～６００ｍＭ、または３００～６００ｍＭ、温度が例えば５０～７０℃、５５～７０℃、または６０～６５℃である。さらなる他の実施態様として、開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有する塩基配列を有し、本発明で発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
　このような遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、各種生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリーなどに由来する核酸を鋳型とし、本発明で発現または発現しようとする酵素をコードする遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
　また、遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法または Gapped duplex法等の公知手法またはこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（タカラバイオ株式会社製）やMutant-G（タカラバイオ株式会社製）)などを用いて、あるいは、タカラバイオ株式会社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異が導入される。
　遺伝子は、宿主微生物での発現を最適にするように、コドンが最適化されてもよい。コドンの最適化は、当業者が通常用いる任意の手段、装置を用いて実施され得る。
　宿主微生物において、酢酸応答転写因子をコードする遺伝子の発現が増強されている形態は特に限定されない。これら遺伝子の発現を増強する改変が行われる前に比べて、これらのタンパク質の生産量または活性の増大が確認されればよい。遺伝子の発現が増強されている実施態様としては、例えば、内因性のいずれかの遺伝子がより強力なプロモーター（構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれであってもよい）の制御下に連結された実施態様が挙げられる。また、追加的に内因性および／または外因性のいずれかの遺伝子が導入されている実施態様が挙げられる。追加的に導入されたいずれかの遺伝子は好ましくは構成的プロモーターなど強力なプロモーターで作動可能に保持されている。発現の増強について、本明細書中においては「過剰発現」ともいう。
　酢酸応答転写因子遺伝子をキシロース資化性酵母に導入するために、好ましくは酢酸応答転写因子遺伝子をプラスミドに挿入する。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、特に限定されず、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられる。栄養要求性遺伝子としては、特に限定されず、例えば、Ｎ－（５'－ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β－イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）遺伝子、オロチジン－５－リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられる。酵母用の複製遺伝子は必ずしも必要ない。プラスミドは、酢酸応答転写因子遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、特に限定されず、例えば、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）遺伝子、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、グリセルアルデヒド３’－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子、グリセルアルデヒド３’－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが挙げられる。プラスミドは、必要に応じて、相同組換えに必要な遺伝子を有する。相同組換えに必要な遺伝子としては、特に限定されず、Ｔｒｐ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３が挙げられる。プラスミドは、必要に応じて、分泌シグナル配列を有する。以上のようなプラスミドは、以下の実施例１の記載に準じて作製され得るが、特に限定されない。例えば、R. Yamadaら、Enzyme Microb. Technol.、2009年、第44巻、p. 344-349に記載のｐＩＵ－ＧｌｕＲＡＧ－ＳＢＡ、ｐＩＨ－ＧｌｕＲＡＧ－ＳＢＡもまた用いられ得る。これらのプラスミドのプロモーターとターミネーターとの間に酢酸応答転写因子遺伝子を挿入する。
　キシロース資化性酵母に、酢酸応答転写因子遺伝子を有するプラスミドを導入する際は、これらの遺伝子を相同組換えにより染色体に組み込むために、プラスミドを１ヶ所で切断して線状にすることが好ましい。
　このようにして、酢酸応答転写因子遺伝子を過剰発現する形質転換酵母を作製することができる。酢酸応答転写因子遺伝子が過剰発現していることは、ＲＴ－ＰＣＲ法など、当業者に周知の方法により確認できる。
　１つの実施態様では、上記酢酸応答転写因子遺伝子を過剰発現するキシロース資化性酵母（酢酸応答転写因子遺伝子を過剰発現する形質転換酵母）は、ＰＨＯ１３遺伝子を欠損している。すなわち、酢酸応答転写因子遺伝子を過剰発現しかつＰＨＯ１３遺伝子を欠損した、キシロース資化性の酵母であり得る。１つの実施態様では、Ｈａａ１を過剰発現しかつＰＨＯ１３遺伝子を欠損した、キシロース資化性の酵母であり得る。
　ＰＨＯ１３遺伝子は、アルカリフォスファターゼであることが推定されているが、その細胞内における機能および具体的な基質は明らかになっていない。キシロース資化性酵素であるキシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼの遺伝子を導入し、かつＰＨＯ１３遺伝子を欠損させた酵母は、キシロース資化能が向上し得、そして酢酸、ギ酸、またはフルフラールの存在下で発酵能を維持し得る（K. Fujitomiら、Bioresour. Technol.、2012年、第111巻、p. 161-166）。ＰＨＯ１３遺伝子について、ＮＣＢＩ遺伝子登録番号はＧｅｎｅ ＩＤ：８５１３６２である。サッカロマイセス・セレビシエに由来するＰＨＯ１３遺伝子の塩基配列およびそのコードアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。
　ＰＨＯ１３遺伝子を欠損した酵母の作製は、酵母における該遺伝子の発現を抑制することによってなされ得る。遺伝子の発現の抑制の実施態様としては、正常タンパク質の生産量の抑制、および機能しない変異体タンパク質の生産もしくは促進などが挙げられる。そのための遺伝子操作としては、トランスジェニック、遺伝子ノックアウト、ノックインなどが挙げられる。例えば、ＰＨＯ１３遺伝子を欠損したキシロース資化性酵母の作製は、上記K. Fujitomiらの文献に記載の手順に準じて行い得る。
　（バイオマスからのエタノールの生産方法）
　本発明のバイオマスからのエタノールの生産方法では、糖化バイオマスと酢酸応答転写因子遺伝子を過剰発現する形質転換酵母とを混合し、該形質転換酵母を培養する。糖化バイオマス中には、バイオマスの過分解により生じる酢酸などの発酵阻害物質が存在し得るが、本発明の形質転換酵母は、このような発酵阻害物質に耐性を有するため、エタノール発酵が阻害されることなく進行し、エタノールが培養液中に生産される。
　本発明のバイオマスからのエタノールの生産方法は、酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む（本明細書中においては、この培養工程を、発酵工程ともいう）。
　バイオマスとは、枯渇性資源ではない、現生生物体構成物質起源の産業資源をいう。すなわち、再生可能な、生物由来の有機性資源から化石資源を除いたものをいう。バイオマスとしては、特に限定されず、例えば、資源作物またはその廃棄物が挙げられる。資源作物としては、特に限定されず、例えば、トウモロコシ、サトウキビが挙げられ、さらに資源作物の廃棄物としては、これらの処理工程で発生する廃棄物が挙げられる。食糧と競合しない点で、好ましくはリグノセルロース系バイオマスである。リグノセルロース系バイオマスとしては、特に限定されず、例えば、イネ、ムギ、ススキ、ヨシなどのイネ科植物の食糧となる部位を除く部位（例えば、籾殻、根、茎、葉）、およびこれらの部位でなる製品から生じた廃棄物が挙げられる。
　バイオマスの糖化とは、バイオマス中の多糖類をオリゴ糖または単糖に分解することをいい、単糖がさらに過分解することも含む。本発明で用いる糖化方法としては、特に限定されず、例えば、酵素法、希硫酸法、水熱分解法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。希硫酸法では、例えば、１～５％の希硫酸でバイオマスを１８０～２００℃にて５分～１時間程度処理する。水熱分解法では、例えば、１３０～３００℃、１０ＭＰａ程度の水にてバイオマスを処理する。
　糖化バイオマスとは、バイオマスを糖化処理して得られた組成物をいい、糖化バイオマスは、多糖類が分解して生成した単糖を主成分とし、ほかに、分解されずに残ったオリゴ糖や多糖、および過分解して生成した副生物を含有する。過分解して生成した副生物としては、特に限定されず、例えば、酢酸、ギ酸などの弱酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのアルデヒド、バニリンなどのフェノール類が挙げられる。
　上記形質転換酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その菌体量を増加させ得る。形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地のｐＨは、例えば４～６、好ましくは５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、例えば０．５～６ｐｐｍ、好ましくは１～４ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍである。培養温度は、例えば２０～４５℃、好ましくは２５～３５℃、より好ましくは３０℃である。酵母菌体量が例えば１０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは２５ｇ（湿潤量）／Ｌ、より好ましくは３７．５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上になるまで培養することが好ましく、培養時間は例えば２０～５０時間程度である。
　発酵工程では、酵母に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養のために、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下、および好気条件などから適宜選択することができる。培養温度は、例えば２５℃～４０℃、好ましくは２８℃～３５℃、より好ましくは３０℃である。培養時間は、必要に応じて任意の時間が設定され得、例えば、６時間～２４時間、または１２時間～３６時間、または２４時間～５０時間などの範囲内の培養時間に設定することができる。ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。発酵培地には、糖化バイオマスに加えて、酵母の培養のために添加され得る培地成分を必要に応じてさらに含めることもできる。
　エタノール発酵終了後、培養液（発酵液）からエタノール含有画分を回収する工程、さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもできる。これらの工程およびそれらに要する手段は、当業者によって適宜選択される。
　本発明の酵母は、水熱分解などの前処理に供した糖化バイオマスが含有する酢酸、ギ酸、フルフラールなどのアルデヒドなどの種々の発酵阻害物質に対して耐性を有する。本発明の酵母と種々の発酵阻害物質を含む糖化バイオマスとを用いたキシロースからのエタノール発酵により、効率的にエタノールを生産することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　（実施例１：Ｈａａ１過剰発現キシロース資化性酵母を用いた酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵試験）
　（Ｈａａ１過剰発現用プラスミドの作製）
　Ｈａａ１遺伝子を酵母で過剰に発現させるためのプラスミドを構築した。
　ｐＲＳ４０５＋２μｍ（J. Ishiiら、J. Biochem.、2009年、第145巻、p. 701-708の記載と同様に調製）を制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩで切断し、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のトリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）遺伝子を同様に制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩで切り出したＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨターミネーターの断片を連結し、ｐＲＳ４０５＋２μｍのマルチクローニングサイトにＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターを挿入し、ｐＲＳ４０５ｐＴＤＨ３を得た。ｐＲＳ４０５ｐＴＤＨ３のＴＤＨ３プロモーターとＴＤＨ３ターミネーターとの間に、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来Ｈａａ１遺伝子（配列番号１：推定アミノ酸配列を配列番号２に示す）を挿入して、プラスミドｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３－Ｈａａ１を作製した。
　挿入に用いたＨａａ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８－１株（ＭＡＴａ）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーHaa1-F（配列番号５）およびHaa1-R（配列番号６）を用いた常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得、この断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３－Ｈａａ１は、形質転換体にアンピシリン耐性を付与するＡｍｐｒ遺伝子を有する。
　（Ｈａａ１過剰発現キシロース資化性酵母の作製）
　酵母サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株（インビトロジェン）に、キシロース資化能力を付与するプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ（酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクダーゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ（ＸＫ）を共発現するプラスミドとして、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製）をそれぞれ酢酸リチウム法により導入し、キシロース資化性形質転換酵母ＢＹ４７４１ＸＵ株を作製した。
　上記キシロース資化性形質転換酵母ＢＹ４７４１ＸＵ株に、プラスミドｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３－Ｈａａ１またはドｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３（コントロールとして使用）を酢酸リチウム法により導入し、ＢＹ４７４１ＸＵ／ｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ／ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３－Ｈａａ１株（ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３／Ｈａａ１株）、およびＢＹ４７４１ＸＵ／ｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ／ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３株（ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３（コントロール）株）を作製した。これらの株はＳＤ－ＨＭ固体培地（アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）［Difco社製］６．７ｇ/Ｌ，グルコース２０ｇ/Ｌ，ヒスチジン０．０２ｇ/Ｌ，メチオニン０．０２ｇ/Ｌ）で培養した。
　（Ｈａａ１過剰発現株のＨａａ１遺伝子の発現試験）
　ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３／Ｈａａ１株（Ｈａａ１過剰発現株）におけるＨａａ１遺伝子の発現を以下のようにして調べた。発酵液（キシロース５０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、カザミノ酸カルシウム１．０ｇ／Ｌ、酵母４０ｇ／Ｌ：合計量５０ｍＬ）を調製し、３０℃にて１時間培養し、酵母菌体をサンプリングした。コントロール株としてｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３（コントロール）株を用いた。得られたサンプルからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後に定量ＰＣＲにより、Ｈａａ１過剰発現株とコントロール株とにおいてＨａａ１発現の相対値を算出した。コントロール遺伝子としてアクチン遺伝子を用い、比較Ｃｔ法にて算出した。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなように、Ｈａａ１過剰発現株は、コントロール株と比較してＨａａ１遺伝子の発現が増大していることが確認できた。
　（Ｈａａ１過剰発現株の酢酸存在下での発酵試験）
　Ｈａａ１過剰発現株またはコントロール株を用いて酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵を行った。Ｈａａ１過剰発現株またはコントロール株をＳＤ培地にて１日間前培養し、次いでＳＤ培地にて２日間本培養した後、発酵に供した。キシロース初期濃度５０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量４０ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地に、酢酸を添加しないもの（０ｍＭ）、および酢酸濃度が３０ｍＭまたは６０ｍＭとなるように酢酸を添加したものを調製し、酵母の発酵培養を開始した。発酵試験の概要を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　培地中のキシロースおよび生産されたエタノールを、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所製）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはShim-pack SPR-Pb（株式会社島津製作所製）を用い、移動層には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ－Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、流速０．６ｍＬ／分および温度８０℃とした。
　結果を図１に示す。図１の（Ａ）～（Ｃ）はそれぞれ、コントロール株の場合の酢酸０ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭの結果を示し、図１（Ｄ）～（Ｆ）はそれぞれ、Ｈａａ１過剰発現株の場合の酢酸０ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭの結果を示す。図１中、白菱形はキシロース濃度であり、白四角はエタノール濃度である。
　図１から明らかなように、コントロール株では、酢酸濃度の増加とともに、キシロース消費速度が減少し、それに伴ってエタノール生産速度および生産量ともに減少した。このことから、酢酸の存在によってキシロースからのエタノール発酵が大きく阻害されることがわかる。
　これに対し、Ｈａａ１過剰発現株はコントロール株と比較して、酢酸非存在下、あるいは３０ｍＭまたは６０ｍＭの酢酸存在下のいずれの条件においても、最終的なキシロース消費量および最終的なエタノール生産量ともに大幅に増加した。３０ｍＭ酢酸の場合エタノール収率も理論収率の８０％を上回り、６０ｍＭ酢酸の場合でも５０％を上回った。なお、６０ｍＭ酢酸の場合、コントロール株では３３％であった。
　（実施例２：Ｈａａ１過剰発現キシロース資化性酵母を用いたギ酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵試験）
　Ｈａａ１過剰発現株またはコントロール株を用いてギ酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵を行った。本実施例におけるエタノール発酵は、キシロース初期濃度５０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量４０ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地に、ギ酸を添加しないもの（０ｍＭ）、およびギ酸濃度が２０ｍＭとなるようにギ酸を添加したものを発酵培養に用いた以外は、実施例１と同様にして行った。発酵試験の概要を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１と同様にして、培地中のキシロースおよび生産されたエタノールを経時的に定量した。結果を図２に示す（図２（Ａ）：ギ酸０ｍＭ、（Ｂ）：ギ酸２０ｍＭ）。
　図２から明らかなように、コントロール株では、ギ酸の添加により、キシロース（図２中、白丸で示す）の消費速度が減少し、それに伴ってエタノール（図２中、黒丸で示す）の生産速度および生産量ともに減少した。このことから、ギ酸の存在によってキシロースからのエタノール発酵が大きく阻害されることがわかる。
　これに対し、Ｈａａ１過剰発現株はコントロール株と比較して、２０ｍＭのギ酸存在下、キシロース消費量およびエタノール生産速度ともに増加した（図２中、キシロース量を白三角で示し、エタノール量を黒三角で示す）。エタノール収率も理論収率の８０％を上回った。
　（実施例３：Ｈａａ１過剰発現キシロース資化性酵母を用いたフルフラール存在下での生育試験）
　Ｈａａ１過剰発現株およびコントロール株を用いて、フルフラール存在下での生育培養試験を行った。以下の表４に示す組成の培養液を調製し、酵母の培養を開始した。培養は、３０℃にて、７０ｒｐｍの振盪下にて行った。生育菌体量は、波長６００ｎｍでの吸光度測定（ＯＤ６００）により経時的に測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　結果を図３に示す。図３から明らかなように、コントロール株は、フルフラールの存在下（図３中、黒丸で示す）では、フルフラールの非存在下（図３中、白丸で示す）に比べて生育が遅延した。Ｈａａ１過剰発現株は、フルフラールの存在下（図３中、黒三角で示す）では、フルフラールの非存在下（図３中、白三角で示す）に比べて生育が遅延したが、コントロール株よりも生育遅延が抑制された。
　Ｈａａ１過剰発現株およびコントロール株について、生育菌体量（ＯＤ６００）がＯＤ６００＝０．５に至るまでの時間もまた調べた。この結果を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５からも明らかなように、Ｈａａ１過剰発現株では、コントロール株よりもフルフラールの存在下での生育遅延が抑制された。
　（実施例４：Ｈａａ１過剰発現、ＰＨＯ１３欠損、キシロース資化性酵母を用いた酢酸存在下での生育試験）
　Ｈａａ１過剰発現、ＰＨＯ１３欠損、キシロース資化性酵母（以下、「Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株」という）を、実施例１に記載のＨａａ１過剰発現株についてＰＨＯ１３欠損を、K. Fujitomiら、Bioresour. Technol.、2012年、第111巻、p. 161-166に記載の手順に準じて行うことにより得た。他方、実施例１に記載のコントロール株（ｐＲＳ４２５ｐＴＤＨ３株）についても同様にＰＨＯ１３欠損を行うことにより、ＰＨＯ１３欠損キシロース資化性酵母（以下、「ＰＨＯ１３欠損コントロール株」という）を得た。
　Ｈａａ１過剰発現株およびコントロール株、ならびにＨａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株およびＰＨＯ１３欠損コントロール株を用いて、酢酸存在下での生育培養試験を行った。以下の表６に示す組成の培養液を調製し、酵母の培養を開始した。培養は、３０℃にて、１２０ｒｐｍの振盪下にて行った。７２時間後に、生育菌体量を、波長６００ｎｍでの吸光度測定（ＯＤ６００）により測定した（菌体の初発濃度はＯＤ６００＝０．１とした）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　結果を図４に示す（（Ａ）Ｈａａ１過剰発現株およびコントロール株；ならびに（Ｂ）Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株およびＰＨＯ１３欠損コントロール株）。図４（Ａ）から明らかなように、Ｈａａ１過剰発現株（黒棒で示す）は、５ｍＭ、１０ｍＭおよび４０ｍＭの酢酸を添加した場合、コントロール株（白棒で示す）に比べて生育が改善された。また、図４（Ｂ）から明らかなように、Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株（黒棒で示す）は、どの濃度の酢酸を添加した場合であっても、ＰＨＯ１３欠損コントロール株（白棒で示す）に比べて生育が改善された。Ｈａａ１過剰発現に加えてＰＨＯ１３欠損させることで、より高濃度（例えば、６０ｍＭおよび８０ｍＭ）の酢酸の存在下でも生育したことが観察された。
　（実施例５：Ｈａａ１過剰発現、ＰＨＯ１３欠損、キシロース資化性酵母を用いた酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵試験）
　Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株およびＰＨＯ１３欠損コントロール株を用いて、実施例１と同様にして、酢酸存在下でのキシロースからのエタノール発酵試験を行った。但し、添加する酢酸の濃度を０ｍＭ、５０ｍＭおよび１００ｍＭとし、パントテン酸カルシウム1.6g/Lに代えてパントテン酸カルシウム1.0g/Lとした。
　結果を図５に示す（（Ａ）Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株および（Ｂ）ＰＨＯ１３欠損コントロール株）。図５（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株は、５０ｍＭおよび１００ｍＭのいずれの酢酸濃度においても、ＰＨＯ１３欠損コントロール株に比べて、キシロース資化量およびエタノール生産量が上回った。このように、Ｈａａ１過剰発現に加えてＰＨＯ１３欠損させた酵母は、より高濃度の酢酸（例えば、１００ｍＭ）の酢酸の存在下でも耐えられ、エタノールを生産することができることが観察された。
　（実施例６：Ｈａａ１過剰発現、ＰＨＯ１３欠損、キシロース資化性酵母を用いた実バイオマスでのエタノール発酵試験）
　Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株およびＰＨＯ１３欠損コントロール株を用いて、実バイオマスでのキシロースからのエタノール発酵試験を行った。以下の表７に示す組成の培養液を調製し、酵母の培養を開始した。培養は、３０℃にて、１２０ｒｐｍの振盪下にて行った。実バイオマス（Ｃ５糖化液）は、水熱前処理した稲わら分解液に、糖化酵素（ペクチナーゼＧアマノ：天野エンザイム株式会社製）を１（ｗ／ｗ）％になるように添加し、５０℃にて１５０ｒｐｍの条件で２日間、糖化処理することにより作製した。生産されたエタノールを、実施例１と同様にして経時的に定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　結果を図６に示す。図６には、発酵開始から２時間、４時間、６時間および２４時間後の結果を示す。図６から明らかなように、Ｈａａ１過剰発現ＰＨＯ１３欠損株（黒丸）では、発酵開始から６時間を経過した後にエタノールの生産量が急増した。ＰＨＯ１３欠損コントロール株では、同時間ではエタノールの生産は観察されなかった。Ｈａａ１過剰発現に加えてＰＨＯ１３欠損させた酵母は、実バイオマスを用いたエタノール生産の速度の上昇を示すことが観察された。
　本発明の方法によれば、種々の発酵阻害物質を含む糖化バイオマスを用いたキシロースからのエタノール発酵により、効率的にエタノールを生産することができる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が可能となり、化石燃料の代替燃料を提供するとともに地球温暖化防止や食糧問題の解決に寄与することができる。

Claims (8)

  1. 　バイオマスからのエタノールの生産方法であって、
    　酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程
    を含む、方法。
  2. 　前記酢酸応答転写因子がＨａａ１である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記形質転換キシロース資化性酵母が、ＰＨＯ１３遺伝子を欠損した酵母である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記糖化バイオマスが、発酵阻害物質を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記発酵阻害物質が、酢酸、ギ酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールおよびバニリンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の方法。
  6. 　酢酸応答転写因子の遺伝子を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母。
  7. 　前記酢酸応答転写因子がＨａａ１である、請求項６に記載の酵母。
  8. 　ＰＨＯ１３遺伝子を欠損した、請求項６または７に記載の酵母。
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