CN103232946A - 一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用 - Google Patents

一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用,属于生物化工领域。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,分类命名为产酯酵母BTL-Y01 Hansenula anomala BTL-Y01,保藏编号为CCTCC NO:M2013115。BTL-Y01最高耐受温度为38℃,最适生长温度在32℃;耐酸性能好,在pH为1的环境中生长良好,最适生长pH为4;最高耐受酒精浓度为12%。其静置培养发酵产乙酸乙酯高于摇床振荡培养,以小麦糖化液作为产酯培养基其产乙酸乙酯量可达到3.903g/L。该菌株适用于酿酒中,能够提高白酒中乙酸乙酯及总酯含量,提升清香型白酒的典型风味,改善酒质,提高经济效益。

Description

一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用
 
技术领域
    本发明属于生物化工领域,具体涉及一种高耐受性产酯酵母菌株及其应用。
背景技术
产酯酵母,亦称生香酵母,大多属于异型汉逊氏酵母,具有较强的氧化特性和产酯能力,是白酒产香的主要菌种之一。白酒是一种含有丰富香味物质的蒸馏酒,酯类在白酒的香味形成中有特别重要的作用。如何提高白酒中酯类的含量,是白酒生产者普遍关注的问题。
白洒中的酯类,根据其香型的不同,其主要酯的种类和含量都不相同。一般在清香型大曲和川法小曲酒中是乙酸乙酯的含量最多。它是在发酵过程中由酵母菌所产生,其代谢产生途径是在酵母菌细胞内产生。
目前大多数小曲白酒酿造企业普遍出现白酒中乙酸乙酯含量较低,分析其原因有:入池后高发酵力菌株的生长,导致基质中乙醇含量过高,影响乙酸乙酯的生成。因为当基质中乙醇含量超过4%,酯化作用受到抑制;其次可能由于多菌株的生长,导致基质的温度、pH发生变化,影响乙酸乙酯的生成。因此,选育适应性好、高耐受性、高产乙酸乙酯酵母成为解决这一问题的关键点。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种高耐受性产酯酵母菌株。
本发明的另一目的在于提供上述高耐受性产酯酵母菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种高耐受性产酯酵母菌株异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏日期:2013年4月1日,保藏地址:中国.武汉.武汉大学),其分类命名为产酯酵母BTL-Y01 Hansenula anomala BTL-Y01,保藏编号为CCTCC NO:M2013115。
所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01来源于一株分离于小曲酒生产用曲的异常汉逊氏酵母菌株(保藏编号为CCTCC NO:M2013115,可以从中国典型培养物保藏中心或湖北工业大学轻工学部酿酒实验室购买),通过耐性(温度、pH和乙醇浓度耐性)驯化后得到。
所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的培养特征为:YEPD固体培养基(酵母膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,琼脂20g,加水至1000mL,pH6.0-6.5)32℃培养24h,菌落呈圆形,白色,凸起,边缘光滑,表面干燥有脂质感,菌落易挑取,菌落大小为0.05-0.10cm。
所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01于400倍显微镜观察的菌体形态特征为:菌体有圆形或椭圆形,大小为3.66×5.48μm(平均);美兰染色,大部分(80-90%)细胞不着色,为无色,少部分呈蓝色,可以见着液泡;繁殖方式为一端出芽繁殖。
所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的生物学特征为:其最高耐受温度为38℃,最适生长温度在32℃;耐酸性能好,在pH为1的环境中仍然生长良好,最适生长pH为4;最高耐受酒精浓度为12%(体积浓度)。
所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的稳定性特征为:在YEPD固体培养基32℃培养24h,连续传代10代培养,其培养特征及形态特征均无变化,该菌株的生物学性状稳定。
所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01能够以含葡萄糖的培养基作为发酵基质静置培养,可获得酯香味突出,乙酸乙酯含量较高的发酵液;其最佳产酯培养方式为静止培养;产酯最佳培养基为小麦糖化液,小麦糖化液的制备如下:以小麦为原料,将其粉碎后,称取200g,加一定量的水煮沸,糊化10min;待冷却至50-60℃后,加入糖化酶保温糖化1-2小时,然后过滤,补水至1000mL,加葡萄糖将其糖度调节至8度。
上述异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01在酿酒中的应用。将所述的高耐受性产酯酵母菌株制成液体种子液或强化曲投入清香型大曲及川法小曲白酒酿造生产;或者单独发酵,将发酵液加入糟醅中一起蒸酒,可提高酒体中乙酸乙酯含量,改善酒质,提高经济效益。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明高耐受性异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01对温度、pH和酒精浓度的耐受性高,乙酸乙酯产量高;以小麦糖化液作为产酯培养基其产乙酸乙酯量可达到3.903g/L;将其用于酿酒可以提高白酒总酯含量,改善酒质。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1  高耐受性产酯酵母菌株异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的获得
从小曲酒厂生产用曲中分离到产乙酸乙酯酵母菌异常汉逊氏酵母菌株(可以从中国典型培养物保藏中心或湖北工业大学轻工学部酿酒实验室购买),菌株的保藏采用YEPD固体斜面培养基,其配方为:酵母膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,琼脂20g,加水至1000mL,pH6.0-6.5,115℃灭菌30min。菌株的培养也采用YEPD培养基。菌株的培养方式可选用两种:(1)液体培养制种子液:把菌株接种于YEPD液体培养基(酵母膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加水至1000mL,pH6.0-6.5,)中,在30℃温度下,120rpm摇瓶培养20h;(2)固体培养活化菌株:接种于YEPD固体琼脂培养基中,于30℃培养箱培养20h。
将异常汉逊氏酵母菌株分别进行温度梯度,pH梯度及乙醇浓度梯度的逐级驯化,最终得到异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01(该菌株于2013年4月1日交于中国典型培养物保藏中心保藏,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,其分类命名为产酯酵母BTL-Y01 Hansenula anomala BTL-Y01,保藏编号为CCTCC NO:M2013115。)。
实施例2  高耐受性产酯酵母菌株异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的耐受性测试
温度耐受性实验:将活化后的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01培养液按无菌操作法分别接种到装有50mL YEPD液体培养基的三角瓶中,将接种后的培养管置于摇床上,分别放置在30℃、32℃、35℃、38℃、40℃下,120rpm振荡培养24h后,测定600nm波长下的OD值,浓度大的菌液可以作适当稀释,经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数,即为培养液实际的OD值。从表1中可以看出,异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01在38℃下仍能有一定的生长量,在40℃菌株几乎没有生长。因此该菌株的最高耐受温度为38℃,最适生长温度32℃。
表1  不同温度下异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的生长情况
温度 30℃ 32℃ 35℃ 38℃ 40℃
OD值 13.010 14.430 4.682 1.319 0.025
酸度耐受性实验:将活化后的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01培养液按无菌操作法分别接种到装有50mL YEPD液体培养基的三角瓶中,分别调节培养基pH为1、2、3、4、5。放置在32℃下,120rpm振荡培养24h后,测定600nm波长下的OD值。由表2 可知,该菌株在pH为2的情况下生长依然旺盛,可见该菌株耐酸性能很好。其最高耐受pH为1,生长的最适pH为4。
表2 不同pH条件下异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的生长情况
pH 1 2 3 4 5
OD值 10.023 12.476 13.957 16.804 14.372
酒精度耐受性实验:将YEPD液体培养基灭菌后,用无水乙醇调节其酒精含量(体积浓度)分别为0%、3%、6%、9%、12%、14%。将活化后的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01培养液按无菌操作法分别接种于其中,放置在32℃下,120rpm振荡培养24h后,测定600nm波长下的OD值。由表3可知,随着培养基中酒精含量的提高,菌株的生长受抑制越大。在12%的酒精浓度下菌株有一定生长量,在14%的酒精浓度下菌株几乎没有生长,因此该菌的最高耐酒精度为12%。
表3 不同乙醇浓度条件下异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的生长情况
酒精含量 0% 3% 6% 9% 12% 14%
OD值 17.295 15.416 11.857 4.289 2.632 0.016
实施例3  不同培养方式对异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01产酯的影响
将活化后的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01制成种子液,以1%(体积百分比)的接种量接种于产酯发酵培养基中,其配方为:葡萄糖8g,酵母膏1g,蛋白胨2g,水100mL。250mL三角瓶装产酯发酵培养基100mL,于32℃培养4天,分别采用静置、50rpm、100rpm、150rpm四种培养方式。待发酵结束,向发酵液中加入80mL无酯乙醇,并蒸馏接取溜液100mL。用气相色谱法测乙酸乙酯含量。由表4可知,静置培养产酯能力明显高于摇床培养,产乙酸乙酯量达到3.046g/L,高于摇床培养约40%。在摇床发酵时,随着转速的增加,产酯明显呈下降趋势,原因可能是由于通气量过大会使酵母呼吸旺盛,加速了酯的分解。因此,异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01在静置培养方式下产酯量最好。
表4 不同培养方式下异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的产酯量
培养方式 乙酸乙酯(g/L)
静置 3.046
50r/min 2.651
100r/min 2.438
150r/min 2.072
实施例4  不同培养基对异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01产酯的影响
分别以大麦、小麦、玉米、高粱、稻谷为原料,将其粉碎后,称取200g,加一定量的水煮沸,糊化10min;待冷却至50-60℃后,加入糖化酶保温糖化1-2小时,然后过滤,补水至1000mL,加葡萄糖将其糖度调节至8度。灭菌后,接种BTL-Y01,250mL三角瓶装产酯发酵培养基100mL,于32℃静置培养4天。各种原料培养基的产酯结果见表4,由表4可知,小麦糖化液作为产酯培养基产酯量最高,乙酸乙酯产量平均达到3.903g/L,明显高于其他原料作为培养基产酯的含量。所以异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01最适宜的产酯培养基为小麦糖化液。
表5 不同培养基中异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的产酯量
原料 乙酸乙酯(g/L)
大麦 3.132
小麦 3.903
玉米 2.403
高粱 2.334
稻谷 2.391
实施例5  异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01在酿酒中的应用
(1)酵母种子液的制备
首先,将异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01的试管斜面菌株,接种2-3环于200mL YEPD液体培养基中,在200rpm,32℃条件下培养16-20h。
(2)产酯培养基的制备
称200kg小麦,粉碎,加入适量水,于蒸锅中煮沸,糊化10min。待其冷却至60℃左右,加入糖化酶,搅匀,保温2h。然后过滤,将滤液补水至1000升,添加适量葡萄糖,调节其糖度为8度。
(3)高含酯量发酵液的生产
将制备好的产酯培养基分装于浅盘,灭菌。然后将制备好的酵母种子按1%的接种量接种至灭菌后的产酯培养基中,32℃静止培养4天。发酵结束后,测定其总酸、总酯及乙酸乙酯的含量。其总酯为3.63g/L,乙酸乙酯为3.18g/L。
(4)清香型白酒酒醅的生产
按照清香型白酒的生产工艺生产。酒醅发酵结束后,取一定量酒醅蒸馏,测定其乙酸乙酯及乳酸乙酯含量。乙酸乙酯为0. 69g/L,乳酸乙酯为0.84g/L。
(5)窜蒸
蒸酒时,先将酒醅均匀上甑,每甑酒的投粮量为200kg。接着将14L高含酯量的发酵液与两倍质量的清蒸后的谷壳混匀,即发酵液与谷壳的质量比例为1:2。然后均匀的铺洒在上甑后的酒醅上进行蒸酒。蒸馏得到的白酒总酯含量为2.07g/L,乙酸乙酯含量为1.05g/L,乳酸乙酯含量为0.85g/L。采用此种方法生产的清香型白酒风格典型,清香纯正,醇甜爽净,回味悠长。
本发明中所描述的具体实施例仅仅对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采取类似的方式替代,但是并不会偏离本发明的精神或者超越本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种高耐受性产酯酵母菌株异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于:该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,其分类命名为产酯酵母BTL-Y01 Hansenula anomala BTL-Y01,保藏编号为CCTCC NO:M2013115。
2.根据权利要求1所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于该菌株培养特征为:YEPD固体培养基32℃培养24h,菌落呈圆形,白色,凸起,边缘光滑,表面干燥有脂质感,菌落易挑取,菌落大小为0.05-0.10cm。
3.根据权利要求1所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于该菌株于400倍显微镜观察的菌体形态特征为:菌体有圆形或椭圆形,大小为3.66×5.48μm;美兰染色,大部分细胞不着色,为无色,少部分呈蓝色,可以见着液泡;繁殖方式为一端出芽繁殖。
4.根据权利要求1所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于该菌株的生物学特征为:最高耐受温度为38℃,最适生长温度在32℃;耐酸性能好,在pH为1的环境中生长良好,最适生长pH为4;最高耐受酒精浓度为12%。
5.根据权利要求1所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于该菌株的稳定性特征为:在YEPD固体培养基32℃培养24h,连续传代10代培养,其培养特征及形态特征均无变化,该菌株的生物学性状稳定。
6.根据权利要求1所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于该菌株产酯的培养方式为静置培养。
7.根据权利要求1所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01,其特征在于该菌株产酯的培养基为小麦糖化液;小麦糖化液的制备为:以小麦为原料,将其粉碎后,称取200g,加一定量的水煮沸,糊化10min;待冷却至50-60℃后,加入糖化酶保温糖化1-2小时,然后过滤,补水至1000mL,加葡萄糖将其糖度调节至8度。
8.权利要求1-7任一项所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01在酿酒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:将权利要求1-7任一项所述的异常汉逊氏酵母菌BTL-Y01制成液体种子液或强化曲投入清香型大曲及川法小曲白酒酿造生产;或将权利要求1-7任一项所述的异常汉逊氏酵母菌单独发酵,将发酵液加入糟醅中一起蒸酒。
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