CN103571755A

CN103571755A - 一种链带藻nmx451的获得和遗传转化的方法

Info

Publication number: CN103571755A
Application number: CN201310407874.4A
Authority: CN
Inventors: 孔任秋; 徐旭东; 余桂兰; 高宏; 方仙桃
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN103571755B

Abstract

本发明公开了一种链带藻NMX451的获得和遗传转化的方法，涉及产油微藻的筛选及其遗传转化技术。自野外环境分离获得的一种绿藻经18SrDNA序列分析和形态鉴定，确定该藻为链带藻属成员，其序列为SEQNO.1；其遗传转化的方法是：①构建带有抗性基因的核基因转化质粒；②通过电转移的方法转化链带藻NMX451；③PCR检测转化子是否为阳性转化子；④DNA印迹杂交证明外源基因整合进入宿主DNA。该藻株能够耐受高浓度碳酸氢钠，含油脂量达到细胞干重的27.63%；其藻细胞中也含有较高比例的亚麻酸；利用本发明可以将外源基因导入链带藻NMX451，使其获得对于zeocin的抗性，也可以同时表达有经济价值的蛋白。

Description

一种链带藻NMX451的获得和遗传转化的方法

技术领域

本发明涉及产油微藻的筛选及其遗传转化技术，尤其涉及一种链带藻NMX451的获得和遗传转化的方法。

具体地说，本发明是从野外采集水样，通过分离纯化得到一种能进行开放式养殖的产油藻株——链带藻NMX451，并利用基因重组的手段，构建一个带有表达外源抗性基因的质粒，运用电脉冲的方法将DNA转移进链带藻细胞中，经过zeocin抗性筛选获得转化子，其中带有抗性片段或外源基因的质粒整合进入到了宿主基因组中。

背景技术

微藻是一大类低等植物，其中许多种是单细胞的，可进行光合作用，固定二氧化碳，释放氧气，合成油脂或多糖作为贮藏物。相对于高等植物，微藻具有繁殖快和单位面积产出高的特点。从油藻提取的油脂可以经过与甲醇反应转化为生物柴油，被认为最有可能替代日渐枯竭的石油来源的柴油，其含有的16碳和18碳的脂肪酸对于生物柴油的生产最为有利。藻类的油脂也含有不饱和脂肪酸，可以添加到动物饲料中促进生长，其中α-亚麻酸也是促进大脑发育、预防人类心脑血管病、抗衰老等非常好的保健品。筛选获得一种培养容易、生长快和产油高的藻种是生产出具有市场竞争力的油藻生物质的关键。有一些微藻，譬如盐藻、螺旋藻，已经能够进行工厂化养殖和生产，而多数产油微藻难以适应开放式养殖，有些产油微藻可以适应开放式培养，生物量和产油量却难以达到工业化生产的需要，还需要进一步优化培养条件，或适当进行遗传改造提高产量，以降低成本。盐藻、螺旋藻都还没有稳定的基因转化系统，难以进行基因改造，其他具有稳定遗传转化系统的真核微藻种类也很有限，只有三角褐指藻等个别种既能进行基因转化又能进行开放式养殖。因此，建立微藻基因转化方法，将为提高产油微藻的产量而对其进行的遗传改造和为利用微藻表达和生产有经济价值的蛋白提供关键的工具。

本发明就是基于以上背景从内蒙野外水域采集、分离和纯化能进行开放式养殖的产油藻株，并利用该藻株进行遗传转化方法的探索，形成本项发明的技术方案。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术中缺乏能适应进行开放式养殖的微藻和稳定的遗传转化系统，提供一种链带藻NMX451的获得和遗传转化的方法，即在内蒙古野外水域采集水样，分离纯化获得的了一种具有抗逆性、易开放培养的产油微藻-链带藻NMX451，并建立了链带藻NMX451的遗传转化方法，以用于遗传改造表达有经济价值的蛋白，或对产油和吸收二氧化碳等生理特征进行改良等。

本发明的目的是这样实现的：

一、链带藻NMX451

①样品采集

水样采自中国内蒙古鄂尔多斯市东胜区一水塘，精确位置为北纬39°48’53’’，东经109°57’33”；采样时间是2010年9月，采样时水温为27.4℃，水样的电导率为1.05ms/cm，pH值为8.02；

②藻种的分离、18S rDNA序列分析和形态鉴定

水样通过稀释涂平板法在含有8.4g/L碳酸氢钠的BG11中培养、分离出单藻落，各藻落经液体培养提取总脂在薄层层析板上比较，选含油量较高的藻株，提取总DNA，以通用引物扩增18S rDNA，经克隆后送测序，其序列为SEQ NO.1(见序列表)；通过与网上GenBank里的序列比对，该藻为链带藻属（Desmodesmus）成员，在显微镜下观察其形态符合链带藻属特征，细胞有刺并由4个或8个细胞排列在一个平面上呈栅状（图1），命名为链带藻NMX451（Desmodesmus sp.NMX451），2013年7月17日将该藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M2013350；

③链带藻NMX451培养方法、总脂含量和脂肪酸组成

通过试验比较，建立了链带藻NMX451培养条件：

该藻株对NaHCO₃的耐受性比较高，在BG11培养基加浓度为12.6g/L NaHCO₃时，生长最快，最适生长温度在25～30℃之间，能耐受很高光强，光合放氧速率在2300μE/m²·s时达到最大，NaNO₃含量为1.5g/L，能获得1.6g/L的干藻粉，将干藻以1：1的氯仿/甲醇提取总脂，称重法测得总脂含量可以达到27.63%，NaNO₃含量降到0.3g/L时，总脂含量可达到32.20%，但此时生物量较低。通过气相色谱法检测细胞中的脂肪酸组成发现，脂肪酸组成以C16和C18为主，占总脂肪酸含量的97.96%，其中亚麻酸（γ-C18:3，α-C18:3）含量较高，达到24.82%，（表1）。

表1链带藻NMX451总脂中的脂肪酸组成（摩尔百分比)

二、链带藻NMX451的遗传转化的方法

①构建带有抗性基因的核基因转化质粒

用HindⅢ酶切质粒p105b124【王潮岗胡章立等，phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测科学通报2004，49（15）：1519-1522】得到PrbcS2-sh ble-Trbcs2片段（1.2kb），以T4DNA聚合酶补平，将该片段连到用HindⅢ酶切并以T4DNA聚合酶补平的pUC19载上；得到转化链带藻的质粒pHB4785（图2），该质粒以衣藻1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)小亚基的基因rbcS2启动子和终止子来驱动和终止外源基因sh ble在链带藻中的表达。

②通过电转移的方法转化链带藻NMX451

电转化的宿主藻细胞选用对数生长期细胞，浓度为5×10⁹cells/mL；转化用质粒DNA经碱裂解法提取，13%的PEG8000纯化，以PstI切成线形；每100μL细胞悬液加5μg DNA；以Bio-rad公司的电脉冲仪进行电转移，电击杯杯径为1mm，电转移条件为：电压1.2KV，电阻500Ω，电容50μF；经过电脉冲的细胞每100μL转移到预先加入10ml新鲜培养基的灭菌管中，摇床上慢速，弱光过夜恢复，之后涂布在含有40μg/mL zeocin的固体培养基平板上，每个平板的细胞数大致为1×10⁷，置于25℃，光照强度为50μE/m²·s条件培养，2-3星期后获得转化子；链带藻NMX451培养基为BG11补加12.6g/L的碳酸氢钠，其成分见表1，用于转化的固体培养基另外加1.5%的琼脂和40μg·mL^-1zeocin。

表2链带藻NMX451的培养基成分

化学成分	用量（mg/L)
		K₂HPO₄·3H₂O	40
MgSO₄·7H₂O	75
		CaCl₂·2H₂O	36
C₆H₈O₇（柠檬酸）	6
		FeC₆H₅O₇·NH₄OH（柠檬酸铁铵）	6
EDTANa₂	1
		Na₂CO₃	20
NaNO₃	1500
		NaHCO₃	12600
H₃BO₃	2.8
		MnCl₂·4H₂O	1.86
ZnSO₄·7H₂O	0.22
		Na₂MoO₄·2H₂O	0.39
CuSO₄·5H₂O	0.08
		CoCl₂·6H₂O	0.01

③PCR检测转化子

将转化子转接在含有40μg/mL zeocin的液体培养基中培养，提取总DNA作为模板，根据sh ble基因序列设计一对引物：

引物1：5’-TGGTCCGGGACGACGTGACCC-3’和

引物2：5’-CCGGGTCGCGCAGGGCGAA-3’，

通过PCR检测确认转化子为阳性。

④DNA印迹杂交(Southern blot)

任意挑取转化子，提取藻细胞总基因组DNA，取10μg用限制性内切酶Stu I完全酶切，在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳后转移至尼龙膜上，以sh ble基因做探针进行DNA印迹杂交(Southern blot)，证明外源基因整合进入链带藻基因组DNA。

三、应用

1、该藻株含油较高，大量培养获得的含油藻细胞可用于油脂提取；其藻细胞中也含有较高比例的亚麻酸，也可以用于提取亚麻酸，或直接添加到动物饲料中增加不饱和脂肪酸营养。

2、利用本发明描述的遗传转化方法可以将外源基因导入链带藻NMX451，使其获得对于zeocin（抗菌素）的抗性，同时表达有经济价值的蛋白，或者对产油和吸收二氧化碳等生理特征进行改良。

本发明具有下列优点和积极效果：

①链带藻NMX451细胞中含有较高的油质和不饱和脂肪酸——亚麻酸，并且其生长不需要有机质营养，因此可以在廉价的无机营养中通过开放式培养源源不断地获得含油脂和亚麻酸的生物质；其培养基中含有较高浓度碳酸氢钠，可以防止原生动物和致病菌的侵害以及其他杂藻的污染，适应开放式培养，在商业化生产过程中可以降低成本；

②本发明构建了转化链带藻的转化质粒，成功地利用转化质粒对链带藻NMX451进行了遗传转化，经PCR和DNA印迹杂交(Southern blot)检测验证外源基因成功的转入链带藻中。

③可以利用该转化质粒构建链带藻NMX451抗性基因插入突变体库，以筛选优良突变株，比如产油量提高的突变株和不饱和脂肪酸含量提高的突变株，也可以利用该转化质粒上的位点克隆其他外源基因，转入链带藻NMX451表达有经济价值的蛋白比如人血清白蛋白等。

附图说明

图1是链带藻NMX451的显微照片。

图2是转化链带藻NMX451的质粒，

Amp^r是氨苄抗性基因；

P_rbcS2和T_rbcS2分别是启动子和终止子；

Sh ble是zeocin抗性基因。

图3是PCR检测转化子的琼脂糖电泳结果，

1是未转基因的链带藻的检测结果；

2～41是随机挑取的zeocin抗性转化子，显示95%以上为阳性转化子；

“质”代表直接以质粒为模板进行PCR的阳性对照；

M是200bp DNA marker。

图4是Southern blot检测证明sh ble基因已整合入转化子的基因组，用StuI酶切基因组DNA，用sh ble基因片段作探针。1-4是转化子DNA，WT是未转化的野生型DNA对照。

图5是小型跑道池半连续培养链带藻NMX451。

2013年7月17将链带藻NMX451（Desmodesmus sp.NMX451）的藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M2013350。

具体实施方式

下面结合附图和实例详细说明：

实例一、链带藻NMX451小型跑道池半连续培养和总脂的提取

在水面积1m²的跑道池，注入含高浓度碳酸氢钠（12.6g/L）的BG11培养基100L，接种藻株NMX451（图5），水面光强为80μE/m²·s，培养期间，温度维持在25～27℃之间。培养到光密度值（OD₇₅₀）为1.8时开始利用絮凝和离心的方法对藻液进行采收；絮凝体系为：pH为7，CuSO₄浓度18.75μM，壳聚糖浓度7.5μg/L；隔天采收20L的藻液，并向其中加入20L高碱BG11培养基，同时，由于蒸发量很大，要定期补水，使跑道池内培养基体积保持在100L左右；采收持续了一个月，总共收集了16批藻液；收集的诸批次中，藻细胞湿重和干重没有明显变化（表3）。按每100g干藻粉加入4L氯仿/甲醇（1：1）的比例提取总脂，再按1L的比例加入H₂O，振荡混匀后，3000rpm离心5～10min使溶液分层，将下层氯仿相转移到另一容器中通氮气挥发氯仿，得到总油脂，称重计算得到总脂占细胞干重的百分比；结果显示：总脂含量在开头几个批次中随培养时间的延长而增大，从第六批开始，藻细胞中总脂含量接近稳定，最高可以达到27.63%（表3）；总脂经甲酯化反应得到脂肪酸，气相色谱测定总脂的脂肪酸组成（表1），链带藻NMX451中18碳脂肪酸和16碳脂肪酸占97.96%，并含有24.82%的多不饱和脂肪酸亚麻酸（γ-C18:3，α-C18:3），其中α-亚麻酸的含量占21.98%。

表3小型跑道池开放式培养的收获情况

实施例二、用带有该发明中描述的sh ble基因的质粒pHB4785转化链带藻 NMX451

①将藻细胞接种至250ml的三角瓶中通气培养至对数期（生长6天左右），培养条件为：25℃，24小时持续光照培养（光照强度为50μE/m²·s）于显微镜下数细胞计数，6000rpm离心收集藻细胞，用灭菌的375mM山梨醇洗涤2次后重悬，将细胞浓缩至5×10⁹个/ml，分装至灭菌的1.5ml的微量离心管中，每管100μl，放冰上待用；用碱裂解法提取质粒pHB4785，13%的PEG8000纯化后，溶于灭菌的ddH₂O，以PstI切成线形，Biophotometer分光光度计上检测浓度后，以每管5μg与藻细胞混合备用。

②以Bio-Rad公司的电脉冲仪进行电转移，电击杯杯径为1mm，电转移条件为：电压1.2KV，电阻500Ω，电容50μF，经过电脉冲的细胞每100μL转移到预先加入10ml新鲜培养基的灭菌管中，摇床上慢速，弱光过夜恢复，之后涂布在含有40μg/mL zeocin的固体培养基平板上，每个平板的细胞数大致为1×10⁷，置于25℃，光照强度为50μE/m²·s条件培养，2～3星期后获得转化子；将转化子先在新的固体抗性培养基上传代培养，再接入含有40～80μg/mL zeocin液体培养基中传代培养。

③为了鉴定外源DNA是否已整合进入链带藻基因组中，随机挑取40个转化子，液体培养条件下培养至指数生长期，提取基因组DNA做为模板，以引物1和引物2为引物进行PCR扩增抗性基因sh ble，同时PCR扩增质粒pHB4785和野生型基因组DNA作为阳性和阴性对照。PCR反应过程为：94℃预变性6min，之后按94℃30s，58℃30s，72℃30s反应30个循环，最后是72℃延伸10min；结果扩增的抗性基因片段的大小约为375bp，野生型没有扩出条带，随机所选的40株藻，发现38个有sh ble基因（图3）只有2株没扩增出目的片段。

④为了鉴定突变体库中外源DNA的整合方式是否插入宿主基因组中，任意挑取4个转化子，提取藻细胞总基因组DNA，每个取10μg用限制性内切酶StuI完全酶切，以sh ble基因做探针进行DNA印迹杂交(Southern blot)，杂交过程为：酶切样品先在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳（80V，2～3hr）然后经过变性转移至尼龙膜上，将膜浸入含杂交液的杂交袋中，于42℃水浴中预杂交30min，倒出预杂交液，加入混好探针的杂交液，42℃杂交过夜；从杂交袋中取去杂交膜，用大量含2×SSC和0.1%SDS的低严谨性溶液于室温洗两次，每次5min，再用含0.5×SSC和0.1%SDS的高严谨性溶液于65℃洗两次，每次15min；用洗涤液（washing buffer：0.1M马来酸，0.15M NaCl，0.3%Tween20，pH 7.5）漂洗膜1～5min，用100mL封闭液（blocking solution）于室温温育30min，之后用酶联抗体溶液（anti-DIG-AP solution）室温温浴30min；再用洗涤液洗两次，然后在检测液（detection buffer：0.1M Tris-Cl，0.1 NaCl，pH 9.5）中平衡2～5min；在膜的正面加入NBT/BCIP显色液，暗处显色。结果如图4所示，4株突变藻株中都含有sh ble基因。

序列表

<110>中国科学院水生生物研究所；中国石油化工股份有限公司

<120>一种链带藻NMX451的获得和遗传转化的方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>3173bp（两头下划线部分是通用引物）

<212>DNA

<400>

GTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACTGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGGTGGTACCTTCTTACTCGGAATAACCGTAAGAAAATTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATATATTAGATAAAAGGCCGACCGGGCTCTGCCCGACCCGCGGTGAATCATGATATCTTCACGAAGCGCATGGCCTTGTGCCGGCGCTGTTCCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCATTTCATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGAACAAAACAACGCAATGCTGTTGACGCCAGAGATAGTAGGGCAGTTTCACGACTGTTATGCCTGCTAGTCGAGCAGCCATTGACACGGAATGGGTTGGCTGCCGGCAAGACGACCTGGTACGGGGAAGGCTAA GTTGCTGCAAGGCAATATGCTAATCCCGTGGCGAGCTGGCAAAGGGTGACTTTTGCACAGCCGTCGTAACGCACGGTAAGGCGTCGGCTGACTCTTGTGAGTTGGCTTAAGGGACGTGCTAACCCCATCCGAAAGGATGCCTGGTGGAAGAGTACCCATTCTACAAAGCCATCAGGAAGCGATAGTGTGCTGAGGAAATGCTGCACACTGCTTGGTAGTAATGCATTGGATTCTTCAATCTGTCTCCAAATCAACTTGTTACAGAACCCATCGCTTCAGCCTGCCTGGTGCAAAGGCCAACAAGGCCTACGCATATCACATCATGGCATTTGGCTCTGCTTACATCAGAATGTGAAATGGGTACCACAGCCTGAATGACATCGTGCTGGCTCATGCACAGGTCAGTTTGCAGTGAAGGTGGTCTTGGAACAAGTTGAAAATAAGATGGAGGAACGTACGACGCCAATAAAGATTGCTTGTCGCGAGTCCTAGAATTGACGTCGACGCTACCCCGGACAGATCGAATCCATCGCGAAGTGGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTTCAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCTATCTTACTGTCGGGGACCTGCTTCTGGGCTTCATTGTCCGGGACAGGGATTCGGCATGGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGCTTACGCCGTGAATACTTTAGCATGGAAATAACATGATAGGACTCTGCCCTATTCTGTTGGCCTGTAGGAGTGGAGTAATGATTAAGAGGAACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGCGGACGTTTTTGCATGACTCCGTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGAACAAGTGTTTGAAGTATGCACTAACTGCCCATGAAAGCAACCCGTCCGAGTTAATCGCCGGGCAAAGCGGGTTGCTAGTCGCACTGGATCCGCTATACAGCTGCTAGGGTTCAGTGCTGGCGAGACCGTCGAATTGCGGGGACATCCTTAGAGCTCAAGCTACCAAGCTGGGGTGGAAACACACTCAGTGGCCGGGGTAATGACCTAGGGTATGGTAAAAACGCTTGAGATTGGACAATCCGCAGCCAAGCTCCTAAGTGCTGCCTGTCAGCATATGGAGAAGGTTCAGA GACTAGGTGGCGGTCGGTTACAATTGTTTCCAAACCCACACTCACATACTGGCCAACTCAACCCCCTCGGACCACAATGGACTGCACACCGGGCATGTTCACCCGGATGCAAAGGTGGGTGGTGCTTGAACACATCACTGCACACATGCCCACCAGGGCACTTGATGCGGGAGCGGTTGACCATACTGGGCTTGGAACAAGAGTGGCTTAAGATAGAGTCCGCCCTCACTGAAAAGTGACCCCAAGATGAACGTCTTTAGCAGGGACTGGAGCTTGGGGAGGGGCTATATGCACAAAAACTGCAGAATGAAACCCTAAACCCTAAACACGTTATCAGTGATTATGTATGGGTTTGGATGTAGCTTCTCTGCAGCTGCAATGAAGGTGCGCGTCACCAGCATGATGAGTCACTGCTGCTGTGCAGTGTCGAGTCAGTACTGCCGCGCCCTTCTGCTGATGTGTACATGCCCTGGGAGTTTTCGGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGTCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTTTAAATAGTCACGGTCGCTTTTTGCGGCTGGCTTTGACTTCTTAGAGGGACAGTTGGCGTTTAGTCAACGGAAGTATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACAAGCCTATCCCTAGCCGAAAGGCTCGGGTAATCTTTGAAACTGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAGTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCAATTCATCAGATTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCAATTGAAGGTGGCAACACCGTCGATTGCCGAGAAGTTCATTAAACCCTCCCACCTAGAGGAAGGTGAAGTCGTAACA；

<210>2

<211>21

<212>引物1-DNA

<400>

5’-TGGTCCGGGACGACGTGACCC-3’

<210>3

<211>19

<212>引物2-DNA

<400>

5’-CCGGGTCGCGCAGGGCGAA-3’。

Claims

1.一种链带藻NMX451，其特征在于：

用含有碳酸氢钠的BG11中培养、分离获得的一种绿藻，在显微镜下观察其形态符合链带藻Desmodesmus属特征，其18S rDNA序列SEQ NO.1通过系统关系分析证明属于一种链带藻，命名为链带藻NMX451，即Desmodesmus sp.NMX451；该藻株能够耐受高浓度碳酸氢钠，含油脂量达到细胞干重的27.63%；其藻细胞中也含有较高比例的亚麻酸；2013年7月17日将该藻株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013350。

2.按权利要求1所述的链带藻NMX451的遗传转化方法，其特征在于：

①采用带有zeocin抗性基因的质粒；

②通过电转移的方法进行转化获得转化子；

③通过PCR和Southern blot检测验证转化子。

3.按权利要求2所述的遗传转化方法的应用，其特征在于：

①将外源基因导入链带藻NMX451以表达有经济价值的蛋白；

②对链带藻NMX451产油和吸收二氧化碳等生理特征进行改良。