CN106520555A - 生物氧化锰生成微藻及微藻—生物氧化锰体系及其在双酚a降解中的应用 - Google Patents

生物氧化锰生成微藻及微藻—生物氧化锰体系及其在双酚a降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物氧化锰生成微藻及微藻—生物氧化锰体系及其在双酚A降解中的应用。本发明生物氧化锰生成微藻Desmodesmus sp.WR1，保藏编号为CCTCC M 2016461。所述微藻可利用环境中低价态的锰离子，生成纳米级无定形锰氧化物颗粒，该类生成的锰氧化物具有较高的氧化活性，可对环境中的有机污染物进行氧化降解，显著提高BPA的去除效率；同时，所述微藻还可利用有机物氧化过程中氧化锰经还原而释放出的锰离子，实现氧化锰再生。该微藻光合自养，生长迅速，易培养，利用该微藻进行生物氧化锰的生产和再生具有操作简单，成本低，环境友好，可再生等特点，为生物氧化锰在环境修复中应用提供新的技术支持。

Description

生物氧化锰生成微藻及微藻—生物氧化锰体系及其在双酚A 降解中的应用
技术领域
本发明涉及应用微生物技术领域以及环境修复领域，更具体地，涉及一株生物氧化锰生产藻株Desmodesmussp.WR1，同时涉及利用该微藻制备生物氧化锰的方法，和利用该微藻和生物氧化锰所形成的体系对内分泌干扰物双酚A的降解应用。
背景技术
环境中的锰氧化物被认为在有机和无机物的生物地球化学循环中起到关键的作用，然而在近中性环境中锰氧化物的生产速度有限，因此众多证据显示环境微生物控制着锰氧化物在环境中生成。
目前利用细菌来生成氧化锰研究报道较多，结果显示细菌产生的生物氧化锰多为非晶体或弱晶型的纳米级颗粒，该类锰氧化物比表面极大，氧化活性高，作为高活性吸附剂和氧化催化剂，被广泛应用到重金属的去除，以及对有机污染物降解中。
但利用细菌生成生物氧化锰需要提供营养物质和不断曝气，生产成本高，且在生物氧化锰的实际应用中很难利用锰氧化细菌实现过程中锰氧化物再生。然而，微藻作为水环境中最重要的生产者，其以光能为源驱动力，不仅环境适应性高培养简单，藻光合作用放出氧气和生长过程中对碳的固定可提高环境pH，这又满足了锰氧化物的生成的热力学条件，在生物氧化锰的生成上具有较大潜力和利用价值。此外，微藻作用一种环境友好、成本低、效益高的可再生资源被广泛用到污染水体的植物修复，生物能源和药用次生代谢产物的生产等方面。
尽管如此，微藻在水环境中对锰氧化物生成的作用并未引起关注，仅有较少的研究对藻细胞表明积累的铁锰沉淀和锰钙颗粒进行了描述。利用微藻生成生物氧化锰，以及对该类锰氧化物的形态特征和氧化性质的系统研究和应用评价尚未见有报道。
双酚A(BPA)作为一种典型的内分泌干扰物，对暴露与其中的生物产生不利影响，如导致精子数目降低、雌性化、影响性腺发育和导致超雌等现象。目前世界各地的污水、垃圾填埋场及自然环境水体和沉积物中均有不同程度检出BPA的报道。将BPA从环境中去除的方法包括物理化学和生物学方法。本发明旨在利用微藻和生物氧化锰形成生物氧化锰再生体系，将生物氧化锰的氧化和吸附作用，以及微藻生长提高氧气和pH水平和直接对锰离子进行氧化等过程相结合，形成物理化学和生物学相结合的方法，建立高效的BPA降解体系。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株具有生物氧化锰生成能力的微藻藻株。该藻株生长快，易培养，可利用二价锰离子生成纳米级锰氧化物颗粒包裹在细胞表面，或形成后积累于培养基底部。
本发明的另一目的是提供所述微藻的应用，应用于制备微藻-生物氧化锰体系。
本发明还一目的是提供所述微藻-生物氧化锰体系的制备方法。
本发明同时提供所述微藻-生物氧化锰体系在降解双酚A方面的应用。
该藻株
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
本发明提供一种生物氧化锰生成微藻(Desmodesmus sp.WR1)，于2016年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址是中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2016461。
所述藻株属于绿藻链带藻属，细胞多形成4或2个群体，也有单细胞，细胞表面有棘状凸起，细胞大小约6～10μm，该藻的18S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。该藻与绿藻Desmodesmus subspicatu，NCBI登录号为KF673378.1，具有99％的同源性。
本发明同时提供所述生物氧化锰生成微藻的应用，所述藻株在二价锰离子存在条件下，可对锰离子进行氧化生成纳米级无定形的锰氧化物颗粒，该锰氧化物颗粒具有较高的氧化活性。微藻在生长过程中通过光合作用产生氧气，又可因利用培养基中的二氧化碳使培养基pH升高，这为锰氧化物生产提供了理化条件；加之微藻本身也具有较高的锰离子氧化能力；此外，微藻还可再次氧化污染物氧化降解过程中作为电子受体的锰氧化物因还原而释放出的锰离子，形成微藻-生物氧化锰再生体系。所述微藻可很好地应用于形成微藻-生物氧化锰体系。利用微藻生产生物氧化锰无需曝气和提供有机营养物质，操作简单成本低，在具有较大的应用潜力。
所述微藻-生物氧化锰体系的制备方法包括以下步骤：
S1.将微藻培养至对数期，经离心收集后用BG-11培养基在680nm下调节其初始的藻细胞光密度到0.02，得到藻液；
S2.在步骤S1所得藻液中加入氯化锰溶液获得含有锰离子终浓度为0.5mM的微藻培养液；
S3.将步骤S2所述微藻培养液置于光照培养箱中培养生成生物氧化锰，形成微藻-生物氧化锰体系。
优选地，步骤S1所述微藻培养的条件为采用光照培养箱中进行培养。温度光暗时间比16L:8D，光强为40～50μmol photon m-2s-1。利用分光光度计在680nm下调节细胞光密度为0.02，约每毫升3.5×106个藻细胞；
优选地，步骤S1所述离心的条件是6000转/分，4℃离心15分钟。
优选地，步骤S2所述氯化锰溶液浓度为0.5M。
优选地，步骤S3所述培养的时间为3天，可观察到大量棕色锰氧化物生成。
在转速6000转/分下对生成的生物氧化锰和藻细胞进行收集，保留沉淀弃掉上清液，沉淀可经冷冻干燥或50℃烘干保存，为保持藻细胞活性，亦可在4℃保存备用。
本发明提供所述的制备方法制得的微藻-生物氧化锰体系。
本发明还提供所述微藻-生物氧化锰体系在在内分泌干扰物的氧化降解中的应用。
优选地，所述内分泌干扰物为双酚A。利用生物氧化锰，或微藻-生物氧化锰再生体系对环境存在的BPA进行降解，该方法效率高成本低，操作简单，且可循环利用，该方法不仅大大提高了BPA的降解效率，藻细胞生长利用环境中的氮磷等无机营养，也可对富营养化进行一定修复。
具体的应用方法是将制备的微藻-生物氧化锰沉淀按照其中氧化锰终浓度为3mg/L～10mg/L投入到被BPA污染的水体中即可。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株新的具有生物氧化锰生成能力的微藻藻株。该藻株生长快，易培养，可利用二价锰离子生成纳米级锰氧化物颗粒包裹在细胞表面，或形成后积累于培养基底部，填补了本领域技术空白。
基于所述微藻，本发明提供了一种利用微藻生成生物氧化锰的方法，微藻为光合自养生物，易培养成本低，操作简单。该微藻能将锰离子氧化成三价或四价的锰氧化物，包裹在藻细胞表面，或积累在培养及底部，经扫描电镜、投射电镜、X粉晶衍射等研究发现，生成的生物氧化锰为纳米级无定型的颗粒，具有较大的比表面积和氧化活性及吸附能力。与利用细菌生成氧化锰相比，该方法无需曝气和提供有机营养，且可将藻细胞和锰离子同时投入应用，建立生物氧化锰再生体系。与人工生成生物氧化锰相比，该方法操作简单，更易获得，成本低，且因生成的氧化锰为纳米级微粒具有更高的活性。
本发明提供一种去除BPA的方法，利用藻类生成的生物氧化锰降解水体中的BPA，该方法效率高，成本低，操作简单，此外利用藻类与生物氧化锰建立再生体系，不仅可有效去除BPA，亦可对水体中的氮磷元素进行去除，在污水处理方面中具有应用潜力。
附图说明
图1为微藻Desmodesmus sp.在扫描电镜观察下的形态图。
图2为该微藻的系统发育树。
图3微藻生成生物氧化锰的浓度
图4为该微藻及所生成的生物氧化锰在扫描电镜观察下的形态图。
图5为能谱仪分析该微藻表面生成的锰氧化物颗粒的元素图谱。
图6为该微藻生成的生物氧化锰在透射电镜下的形态图。
图7为该微藻生成的生物氧化锰经制备后用于X射线衍射分析样品的LBB显示图。
图8为该绿藻生成的生物氧化锰的X射线衍射图。
图9为微藻-生物氧化锰体系对BPA的去除情况。
图10为BPA去除过程中生物氧化锰含量变化图。
具体实施方式
下面结合附图和实施过程对本发明作进一步说明，除非特别说明，本发明采用的试剂及仪器为本技术领域常规的试剂及仪器，来源于商业渠道。
实施例1
本实施例提供一株锰氧化物生成藻株(Desmodesmus sp.WR1)，于2016年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址是中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2016461。
所述藻株属于绿藻链带藻属，细胞多形成4或2个群体，也有单细胞，细胞表面有棘状凸起，细胞大小约6～10μm。
将所得微藻通过形态和分子学方法进行鉴定：
首先形态学上，将藻细胞利用2.5％的戊二醛固定后，多次清洗后利用酒精梯度系列进行脱水，其后对样品进行干燥并镀金后，在扫描电镜下观察其形态，结果如图1所示，并与藻类分类学文献对比，确定该藻所属种类。
分子上，提取藻的DNA，利用真核生物通用引物EUKA-F(5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)/EUKB-R(5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTA C-3′)对该绿藻18S rDNA序列进行扩增，得到基因片段序列(如SEQ ID NO.1所示)；
并与NCBI数据库进行对比和建立系统发育树(图2所示)，该藻与绿藻Desmodesmussubspicatu，NCBI登录号为KF673378.1，具有99％的同源性。证明该藻与链带属微藻具有较高相似性，因此确定该藻株为链带属微藻Desmodesmus sp..对其命名为Desmodesmussp.WR1。
实施例2
微藻Desmodesmus sp.WR1生物氧化锰体系的制备，过程如下：
将本发明实施例1所述微藻藻株培养到对数期，在6000转/分转速下离心后，弃掉上清液，用灭菌后的BG-11培养基和分光光度计在680nm下调节初始藻光密度为0.02，加入初始浓度为0.5M的MnCl2储备液获得锰离子终浓度为0.5mM，在光照培养箱中培养24小时，培养基和细胞表面均可见到棕色沉淀产生。如图3所示，生物氧化锰浓度随实验时间逐渐升高，且初始藻接种密度越高，生物氧化锰浓度升高越快。利用leucoberbelin blue(LBB)法测定生成的生物氧化锰含量。
LBB方法：首先称取一定量的LBB溶解于0.25％的冰乙酸溶液当中配制成0.004％的LBB溶液，然后取上述藻培养液0.1mL，加入0.5mL LBB溶液中，在室温下遮光放置15～20min进行反应，LBB被锰氧化物氧化后呈现蓝色并在620nm下有最大吸收峰，利用分光光度计测定上清液在620nm的吸光度对生成的生物氧化锰进行定量，借此从培养的藻株中，筛选出具有最大生成生物氧化锰潜力的藻株。
培养24h后，取一定量的培养液经固定、洗涤、脱水、临界点干燥及镀金后，进行扫描电镜观察和能谱仪测定细胞表面颗粒物的化学元素组成。如图4所示，加入锰离子后在藻细胞表面生成生物氧化锰及聚集的生物氧化锰颗粒。如图5所示，利用能谱仪测定细胞表面生成的生物氧化锰颗粒的组成元素，发现该颗粒元素组成主要包括Mn、O等元素。
培养24h后，取一定量培养液经离心收集沉淀，有去离子多次洗涤后，加入去离子水重悬后，滴到铜网上待自然风干后进行投射电镜测定生物氧化锰形态。图6显示微藻生成的生物氧化锰形态特征，确定其为无定型纳米大小颗粒。
将培养后的藻液离心收集藻细胞和生成的生物氧化锰，用去离子水多次洗涤后，在50℃下烘干并研磨，先用LBB法测定其中生物氧化锰含量，其后对干粉样品进行X射线衍射分析，如图7所示，样品的X射线衍射图谱说明该微藻产生的生物氧化锰为非晶体锰氧化物。
实施例3微藻-生物氧化锰再生体系对BPA的去除应用试验
过程如下：
将微藻培养至对数期，离心后加入BG-11培养基调节其光密度到0.02，将上述藻液100mL分装至250mL的锥形培养瓶，加入MnCl2溶液获得锰离子终浓度为0.1，0.5和1mM，在上述处理中加入双酚A，双酚A浓度为14.5mg/L，处理时间为一周，利用高效液相色谱测定培养基中残留BPA浓度，通过残留BPA浓度(C)与初始浓度(C0)的比值，即C/C0计算生物氧化锰的生成对BPA的去除效果。此外，利用LBB法测定该过程中生物氧化锰的浓度变化。
表1高效液相色谱参数设置
试验结果如图8所示，与对照相比，生物氧化锰生成显著促进了BPA的去除。如图9所示，在BPA去除的过程中，生物氧化锰的含量都持续升高，说明在微藻存在的情况下，生物氧化锰在促进BPA去除的过程中仍可以通过微藻对锰离子的再氧化进行补充，可作为一个微藻-生物氧化锰系统应用到污水处理工艺中。
实施例4微藻生物氧化锰从城市生活污水中去除双酚A的效率研究
从暨南大学内的污水口取4L城市生活污水，过滤去除较大颗粒物之后，加入BPA至终浓度为2mg/L，此后分装至250mL的锥形瓶，用事先制备好的保存于4℃的微藻和生物氧化锰沉淀按照生物氧化锰浓度2mg/L至8mg/L加入到分装的城市污水中，用液相色谱测定处理一周间污水中残留的BPA浓度，结果发现生物氧化锰对污水中BPA也具有较高的去除效率。

Claims (10)

1.生物氧化锰生成微藻Desmodesmus sp.WR1，保藏编号为：CCTCC M 2016461。
2.根据权利要求1所述生物氧化锰生成微藻，其特征在于，所述微藻的18S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述生物氧化锰生成微藻，其特征在于，所述微藻的细胞多形成4或2个群体或单细胞，细胞表面有棘状凸起，细胞的大小为6～10μm。
4.权利要求1～3任一项所述生物氧化锰生成微藻的应用，其特征在于，应用于形成微藻-生物氧化锰体系。
5.权利要求4所述微藻-生物氧化锰体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将微藻培养至对数期，经离心收集后用BG-11培养基在680nm下调节其初始的藻细胞光密度到0.02，得到藻液；
S2.在步骤S1所得藻液中加入氯化锰溶液获得含有锰离子终浓度为0.5mM的微藻培养液；
S3.将步骤S2所述微藻培养液置于光照培养箱中培养生成生物氧化锰，形成微藻-生物氧化锰体系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述培养的时间为3天。
7.权利要求5或6所述的制备方法制得的微藻-生物氧化锰体系。
8.权利要求7所述微藻-生物氧化锰体系在在内分泌干扰物的氧化降解中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述内分泌干扰物为双酚A。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将制备的微藻-生物氧化锰沉淀按照其中氧化锰终浓度为3mg/L～10mg/L投入到被双酚A污染的水体中。
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