CN113029994B - 基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于胞外有机物多源特征光谱的水体微囊藻毒素浓度反演方法。该方法以叶绿素a浓度表示产毒藻浓度，先建立基于胞外有机物多源特征光谱的叶绿素a归一化反演模型，再计算得到水体微囊藻毒素浓度。测量铜绿微囊藻胞外有机物的三维荧光光谱和紫外‑可见吸收光谱，对特征波长进行提取，融合二者得到多源融合特征光谱信息。利用支持向量机算法，基于胞外有机物多源融合特征光谱构建叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度反演模型，再根据叶绿素a浓度计算水体微囊藻毒素浓度。结合现有的环境光学在线测量技术，该方法可以实现水体微囊藻毒素浓度的实时在线监测，预防突发性的饮用水安全事故，保障饮用水安全。
Description
技术领域
本发明属于水体环境污染物监测领域，尤其涉及一种基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystins，MCs)具有肝和神经毒性，严重威胁饮用水安全。环境中MCs具有多种同分异构体，较为常见的有MC-LR、MC-RR和MC-YR三种，其中MC-LR最受关注。我国颁布的《生活饮用水水质卫生规范》中将MC-LR的上限规定为1μg·L-1。常规的水处理方法对MCs的去除能力十分有限。因此，为及时预警可能的饮用水污染事故、保障饮用水安全，开展水体中MCs浓度的实时快速在线监测十分必要。当前MCs的检测主要依赖物理化学或生物免疫方法，例如高效液相液相法(HPLC)、液相色谱质谱联用法(LC-MS)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。HPLC和LC-MS法虽然灵敏度高、特异性好，但仪器复杂、操作繁琐、成本昂贵，需要专业人员在实验室完成；ELISA法利用抗原抗体间的免疫反应进行检测，无法准确定量，容易产生假阳性。上述方法都不能实现实时、在线的高频次监测，无法满足饮用水安全预警的技术需求。
通过相关的其他水质参数反演MCs浓度是一种替代的MCs浓度间接监测方法。然而，常规的水质参数，如水温、pH、电导率、溶解氧、浊度等，通常与MCs浓度相关性较差。因此，单纯依靠常规的水质参数无法构建有效的MCs浓度反演模型。铜绿微囊藻生长代谢过程中，释放大量的胞外有机物(EOM)进入水体，其与MCs同属一个动态释放过程，都受到藻细胞生理状态、环境条件等因素的影响。
三维荧光光谱技术是一种新兴发展起来的环境光学监测手段，由于包含的光谱信息丰富，检测无需样品前处理、测量快速、成本低廉等诸多优点，已经被广泛应用于环境水体中有机污染物的定性定量分析。尽管如此，三维荧光光谱仅能反映EOM中具有荧光特性的组分，忽视了大量非荧光性的EOM组分，因此获得的EOM组分信息是严重缺失的。同时，由于三维荧光光谱包含了许多不相关的冗余特征信息，在样本有限的情况下，用大量特征来构建反演模型，不仅模型计算成本高，当特征数量超过一定限度时，模型的反演准确度会急剧下降。此外，普通的线性拟合模型不能反应EOM组分与MC-LR浓度间可能存在的非线性关系，导致模型适用性差，反演准确度低，无法获得推广应用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种准确高、适用性好的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法。
技术方案：本发明的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，包括以下步骤：
(1)取铜绿微囊藻不同培养阶段的水样，利用三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱解析铜绿微囊藻胞外有机物EOM的组分；同时测量水样中微囊藻毒素MC-LR的浓度和水体叶绿素a浓度；
(2)将步骤(1)中解析后的三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱分别采用弹性网络正则化算法和连续投影算法进行特征波长提取，融合两种特征波长后得到与MC-LR浓度相关的多源特征光谱；
(3)将步骤(2)获得的多源融合特征光谱数据和步骤(1)测得的MC-LR浓度均以步骤(1)测得叶绿素a浓度进行归一化处理，以归一化的特征光谱数据作为输入参量，归一化的MC-LR浓度作为输出参量，利用支持向量机SVM算法进行模型训练，构建叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度反演模型；
(4)取铜绿微囊藻待测水样，根据步骤(1)测量其释放的EOM三维荧光光谱、紫外-可见吸收光谱以及水体叶绿素a浓度，根据步骤(2)确定的特征波长，提取得到多源特征光谱数据，将特征光谱数据以叶绿素a浓度进行归一化，代入步骤(3)的反演模型计算叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度，以叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度乘以叶绿素a浓度计算得到预测的水体微囊藻毒素浓度。
进一步地，步骤(1)中，所述解析铜绿微囊藻胞外有机物EOM的组分包括以下步骤：
(a)根据与藻细胞结合程度的紧密，将铜绿微囊藻释放的EOM分为溶解态和结合态两部分，分别记为dEOM和bEOM；
(b)通过滤膜直接过滤水样去除藻细胞得到dEOM，用水清洗滤膜上的藻细胞，再将含有藻细胞的水放入70-75℃水浴中加热20-25min，9000个G下离心10-15min，上清液经滤膜过滤得到bEOM；
(c)测量铜绿微囊藻EOM的三维荧光光谱。
进一步地，步骤(b)中，所述滤膜为醋酸纤维滤膜，所述醋酸纤维滤膜的孔径为0.45-0.5μm。
进一步地，步骤(c)中，所述测量的具体参数包括：激发波长扫描范围220～660nm，发射波长扫描范围240～700nm，激发和发射步长分别为10nm和2nm，激发和发射狭缝均为5nm，扫描速度为12000nm/min，光电倍增管电压700V，光谱不校正，光谱数据以超纯水激发350nm/发射397nm处的拉曼峰强度归一化，以消除仪器系统造成的偏差；测量水样的紫外-可见吸收光谱，波长范围为240～700nm，间隔1nm。
进一步地，步骤(1)中，所述测量水样中微囊藻毒素MC-LR浓度的方法包括高效液相色谱法和液相质谱法。
进一步地，步骤(1)中，所述水体叶绿素a浓度的测量方法包括分光光度法。
进一步地，步骤(2)中，所述弹性网络正则化算法包括以下步骤：
(a)将三维荧光光谱数据去除瑞利和拉曼散射，按行展开后作为弹性网络正则化算法的输入，MC-LR浓度测量值作为输出；
(b)对于该模型选择M个惩罚项系数λ，对于每一个λ，将X和Y带入模型中进行3折交叉运算，得到3组均方根误差MSE值；所述X为叶绿素a浓度归一化的胞外有机物多源特征光谱数值，Y为实测得到叶绿素a浓度归一化的MC-LR浓度；
(c)选定MSE最小值的一个标准偏差范围内的最大λ值，代入λ值选出所有回归系数不为0的项，即为选取的特征波长。
进一步地，步骤(2)中，所述连续投影算法包括以下步骤：
(a)对紫外-可见吸收光谱，在N维空间中选择起始向量之前，设置要选择的变量的最大个数N和第一个波长k(0)；
(b)在第1次迭代前，让xj＝X的第j列数据，计算xj在所选变量xk(n-1)正交子空间上的投影，提取投影最大值的波长变量序号，循环运算，由此提取的特征波长变量为k(n)；
(c)对提取的特征波长处的光谱数据执行多元线性回归分析，计算验证集的预测标准偏差RMSEP，最小的RMSEP对应的k(0)和N就是最优的特征波长组合。
进一步地，所述步骤(3)具体包括：将三维荧光特征波长和紫外-可见吸收特征波长进行融合，将融合的特征光谱数据和MC-LR浓度以叶绿素a浓度进行归一化处理，归一化的特征光谱数据作为输入参量，归一化的MC-LR浓度作为输出参量，利用遗传算法优化的支持向量机模型建立叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度反演模型。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明的模型反演结果具有较高的准确度，适用性强，可以广泛应用于水体藻类分泌毒素的监测。
(2)通过胞外有机物的三维荧光光谱和吸收-可见光谱可以利用环境光学监测技术与装备在线获取，操作简单便捷、成本低，不产生二次污染，结合本发明可以实现水体微囊藻毒素浓度的实时在线监测。
附图说明
图1为本发明基于多源特征光谱的水体微囊藻毒素浓度反演方法的流程图；
图2为本发明MC-LR浓度的预测值与实测值的对比图；
图3为本发明基于三维荧光特征光谱的MC-LR浓度预测值与实测值对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
如图1所示，本发明基于多源特征光谱的水体微囊藻毒素浓度反演方法，包括以下步骤：
(1)取样：选取铜绿微囊藻(FACHB-905，购自中国科学院淡水藻种库)在实验室光照培养箱中进行培养，同步培养3组藻样作为平行样品，采用隔天取样的方式连续采集26次共78个样本。随机抽取14个样本作为验证集，其他样本用于训练构建反演模型。
(2)MC-LR的提取：摇匀水样，取50mL水样用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤，往固相萃取小柱中依次加10mL甲醇，10mL水，小柱活化之后连接固相萃取装置，接入收集滤液，进行固相萃取，流速控制在9mL/min，用10mL淋洗液(5％甲醇)通过小柱，再用10mL洗脱液(0.1％三氟乙酸的甲醇溶液)洗脱，收集洗脱后的液体，倒入25mL KD浓缩瓶内，在40℃下旋转蒸发，最后用50％的甲醇定容至0.5mL，在旋涡混合器上振动混合均匀，用一次性针筒戴上0.22μm滤头过滤去除杂质，用棕色色谱分析瓶保存。
(3)采用高效液相色谱仪(L-2000，日立)测定MC-LR的浓度，色谱柱为150mm×4.6mm×5μm C18反相柱(Waters公司)。色谱分析条件：选用甲醇和0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液作为流动相，进行55/45(甲醇/0.1％TFA水)-65/35(甲醇/0.1％TFA水)梯度洗脱，流速0.8mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，单个测定时间30min，检测波长238nm。
(4)取5mL培养的藻液，通过0.45μm孔径的醋酸纤维滤膜直接过滤水样，滤液用于测量dEOM；用10mL蒸馏水清洗滤膜上的藻细胞，再将含有藻细胞的水放入70℃水浴中加热20min，9000g下离心10min，上清液经0.45μm孔径的醋酸纤维滤膜过滤，滤液用于测量bEOM。
(5)测量铜绿微囊藻胞外有机物的三维荧光光谱：利用荧光分光光度计(F-7000，日立)测量bEOM和dEOM的三维荧光光谱，参数设定如下：激发波长扫描范围：220～660nm，发射波长扫描范围：240～700nm，激发和发射步长分别为10nm和2nm，激发和发射狭缝均为5nm，扫描速度为12000nm/min，光电倍增管电压700V，光谱不校正。三维荧光光谱数据以超纯水激发350nm/发射397nm处的拉曼峰强度归一化，以消除仪器系统造成的偏差；通过数值置零消除瑞利散射的影响，以超纯水光谱数据扣除空白消除拉曼散射的影响。
(6)测量水样的紫外-可见吸收光谱，波长范围为240～700nm，间隔1nm。
(7)利用弹性网络正则化算法和连续投影算法分别对三维荧光光谱、紫外-可见吸收光谱中与MC-LR浓度相关的特征波长进行提取，并融合得到特征光谱。
(8)对每个水样的藻类叶绿素a浓度进行测定。
(9)对融合的特征光谱和MC-LR浓度以叶绿素a浓度进行归一化处理。
(10)利用Matlab软件，以归一化的融合光谱作为自变量，归一化的MC-LR浓度为因变量，建立支持向量机回归模型，MC-LR反演值与实测值的变化如图2所示。
随机抽取第1、2、12、26、27、34、38、43、45、48、60、61、65、78共14个样本作为验证集，图2中反演的MC-LR浓度与实测浓度变化趋势高度一致，实测值与预测值对比如表1所示：
表1基于多源特征光谱的MC-LR浓度预测值与实测值
由表1可知，本模型的决定系数和均方误差分别为0.9837和17.4。
图3为基于三维荧光特征光谱的验证集样品MC-LR反演浓度与实测浓度的对比，实测值与预测值如表2所示。
表2基于三维荧光特征光谱的MC-LR浓度预测值与实测值
由表2可知，反演结果的决定系数和均方误差分别为0.7525和264。可以看出，基于多源特征光谱的MC-LR浓度预测值的准确度显著优于基于三维荧光特征光谱的预测结果。
Claims (8)
1.一种基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取铜绿微囊藻不同培养阶段的水样，利用三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱解析铜绿微囊藻胞外有机物EOM的组分；同时测量水样中微囊藻毒素MC-LR的浓度和水体叶绿素a浓度；
(2)将步骤(1)中解析后的三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱分别采用弹性网络正则化算法和连续投影算法进行特征波长提取，融合两种特征波长后得到与MC-LR浓度相关的多源特征光谱；
(3)将步骤(2)获得的多源特征光谱数据和步骤(1)测得的MC-LR浓度均以步骤(1)测得叶绿素a浓度进行归一化处理，以归一化的特征光谱数据作为输入参量，归一化的MC-LR浓度作为输出参量，利用支持向量机SVM算法进行模型训练，构建叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度反演模型；
(4)取铜绿微囊藻待测水样，根据步骤(1)测量其释放的EOM三维荧光光谱、紫外-可见吸收光谱以及水体叶绿素a浓度，根据步骤(2)确定的特征波长，提取得到多源特征光谱数据，将多源特征光谱数据以叶绿素a浓度进行归一化，代入步骤(3)的反演模型计算叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度，以叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度乘以叶绿素a浓度计算得到预测的水体微囊藻毒素浓度；
步骤(1)中，所述解析铜绿微囊藻胞外有机物EOM的组分包括以下步骤：
(a)根据与藻细胞结合程度的紧密，将铜绿微囊藻释放的EOM分为溶解态和结合态两部分，分别记为dEOM和bEOM；
(b)通过滤膜直接过滤水样去除藻细胞得到dEOM，用水清洗滤膜上的藻细胞，再将含有藻细胞的水放入70-75℃水浴中加热20-25min，9000个G下离心10-15min，上清液经滤膜过滤得到bEOM；
(c)测量铜绿微囊藻EOM的三维荧光光谱。
2.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，步骤(b)中，所述滤膜为醋酸纤维滤膜，所述醋酸纤维滤膜的孔径为0.45-0.5μm。
3.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，步骤(c)中，所述测量的具体参数包括：激发波长扫描范围220～660nm，发射波长扫描范围240～700nm，激发和发射步长分别为10nm和2nm，激发和发射狭缝均为5nm，扫描速度为12000nm/min，光电倍增管电压700V，光谱不校正，光谱数据以超纯水激发350nm/发射397nm处的拉曼峰强度归一化，以消除仪器系统造成的偏差；测量水样的紫外-可见吸收光谱，波长范围为240～700nm，间隔1nm。
4.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，步骤(1)中，所述测量水样中微囊藻毒素MC-LR浓度的方法包括高效液相色谱法和液相质谱法。
5.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水体叶绿素a浓度的测量方法包括分光光度法。
6.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，步骤(2)中，所述弹性网络正则化算法包括以下步骤：
(a)将三维荧光光谱数据去除瑞利和拉曼散射，按行展开后作为弹性网络正则化算法的输入，MC-LR浓度测量值作为输出；
(b)对于该模型选择M个惩罚项系数λ，对于每一个λ，将X和Y带入模型中进行3折交叉运算，得到3组均方根误差MSE值；所述X为叶绿素a浓度归一化的胞外有机物多源特征光谱数值，Y为实测得到叶绿素a浓度归一化的MC-LR浓度；
(c)选定MSE最小值的一个标准偏差范围内的最大λ值，代入λ值选出所有回归系数不为0的项，即为选取的特征波长。
7.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，步骤(2)中，所述连续投影算法包括以下步骤：
(a)对于紫外-可见吸收光谱，在N维空间中选择起始向量之前，设置要选择的变量的最大个数N和第一个波长k(0)；
(b)在第1次迭代前，让xj＝X的第j列数据，计算xj在所选变量xk(n-1)正交子空间上的投影，提取投影最大值的波长变量序号，循环运算，由此提取的特征波长变量为k(n)；
(c)对提取的特征波长处的光谱数据执行多元线性回归分析，计算验证集的预测标准偏差RMSEP，最小的RMSEP对应的k(0)和N就是最优的特征波长组合。
8.根据权利要求1所述的基于胞外有机物多源特征光谱的微囊藻毒素浓度反演方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：将三维荧光特征波长和紫外-可见吸收特征波长进行融合，将融合的特征光谱数据和MC-LR浓度以叶绿素a浓度进行归一化处理，归一化的特征光谱数据作为输入参量，归一化的MC-LR浓度作为输出参量，利用遗传算法优化的支持向量机模型建立叶绿素a归一化的微囊藻毒素浓度反演模型。
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