CN109810875A - 一种扇形核酸多联检装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种扇形核酸多联检装置，包括：圆盘式离心支架、扇形芯片和封闭贴膜，所述圆盘式离心支架与所述扇形芯片连接，所述扇形芯片与所述封闭贴膜连接；该装置各反应孔可以分别预埋不同项目的引物探针，可实现一次性多种项目的检测，消耗低、操作便捷、密封性好、不易产生气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种扇形核酸多联检装置。
背景技术
1985年PCR技术诞生，随着三十多年的发展，PCR技术得到了迅猛的发展及广泛的应用，尤其是在疾病的临床诊断中，PCR技术以其快速、灵敏和特异的优势，日益取代了传统的微生物诊断方法，进入常规检测。PCR技术衍生出较多核酸扩增技术，包括实时荧光定量PCR、环介导核酸等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)及常温核酸扩增技术(Enzymes MediatedAmplification，EMA)等。
其中，实时荧光定量PCR技术是使用最广泛的技术，国内有多家公司针对该技术开展检测产品的研究工作。这些产品主要使用的是200μl的PCR管，单管主要检测单指标，反应体积20-50μl不等，配套的荧光定量仪价格比较昂贵，因此检测多指标时就会引起样本、试剂、耗材、时间、人员成本及仪器维护等浪费，不能达到高通量检测的需求，且不易推广。同时，人们的健康意识及科学素养越来越高，对病原筛查及科学用药更加谨慎，所以单次取样而获得多指标检测结果就更加顺应人们对病原高通量筛查的需求。
本公司自主研发的常温核酸扩增技术(Enzymes Mediated Amplification，EMA)，是多酶介导的核酸扩增技术，可在37-45℃恒温条件下，30分钟内检测出病原核酸。因此，亟待一种扇形核酸多联检装置出现，该装置各反应孔可以分别预埋不同项目的引物探针，可实现样本一次性取样30分钟内得到多指标检测结果。该装置单孔反应体积是10μl，降低了样本、耗材和试剂的消耗，节约检测时间及成本，同时降低样本病原的漏检概率，提高检测通量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种扇形核酸多联检装置，该装置各反应孔可以分别预埋不同项目的引物探针，可实现一次性多种项目的检测，消耗低、操作便捷、密封性好、不易产生气溶胶污染。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种扇形核酸多联检装置，包括：圆盘式离心支架、扇形芯片和封闭贴膜，所述圆盘式离心支架与所述扇形芯片连接，所述扇形芯片与所述封闭贴膜连接。
本发明提供的一种扇形核酸多联检装置，该装置各反应孔可以分别预埋不同项目的引物探针，可实现一次性多种核酸的检测，消耗低、操作便捷、密封性好、不易产生气溶胶污染。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
作为优选的方案，所述圆盘式离心支架上设有中心正圆台，所述中心正圆台与所述圆盘式离心支架连接。
作为优选的方案，所述圆盘式离心支架上设有小型正圆台，所述小型正圆台与所述圆盘式离心支架连接，所述小型正圆台沿着所述中心正圆台圆周均匀设置并与扇形芯片一侧的卡槽卡接。
作为优选的方案，所述圆盘式离心支架上设有弹片，所述扇形芯片另一侧通过所述弹片与所述圆盘式离心支架固定连接。
作为优选的方案，所述扇形芯片包括：加液池、分液槽、气体置换孔、反应孔和废液槽，所述加液池、所述分液槽、所述气体置换孔、所述反应孔和所述废液槽通过流道相互连接。
作为优选的方案，将样品加入加液池中，通过圆盘式离心支架的离心力作用，样品流入分液槽中，分液槽收集样品，经过气体置换孔与反应孔置换气体，使得反应孔充满样品，多余的样品会排出到废液槽中。
作为优选的方案，所述封闭贴膜上设有加样孔，所述加样孔与加液池相对应且相互配合，将样品从加样孔加入流到加液池中。
作为优选的方案，所述加样孔上设有加样孔贴膜，所述加样孔贴膜与所述加样孔相对应且相互配合连接。
作为优选的方案，所述圆盘式离心支架上设有六组中型圆柱体。
作为优选的方案，六组中型圆柱体在圆盘式离心支架表面边缘呈均匀分布，所述扇形芯片按放于两组中型圆柱体之间并与两组中型圆柱体固定连接。
附图说明
图1是一种扇形核酸多联检装置的结构图
图2是一种扇形核酸多联检装置中扇形芯片结构图
图3是一种扇形核酸多联检装置中封闭贴膜的结构图
图4是一种扇形核酸多联检装置中排气孔的结构图
图5是实施例3呼吸道5联检芯片的制作及测试结果
其中：1.圆盘式离心支架；2.扇形芯片；3.中心正圆台；4.小型正圆台；5.中型圆柱体；6.弹片；7.卡槽；8.加液池；9.分液槽；10.气体置换孔；11.反应孔；12.废液槽；13.流道；14.封闭贴膜；15.杯型分液槽；16.加样孔；17.加样孔贴膜；18.排气孔。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
为了达到本发明的目的，如图1至5所示，本实施例中的一种扇形核酸多联检装置，包括：圆盘式离心支架1、扇形芯片2和封闭贴膜14，所述圆盘式离心支架1与所述扇形芯片2连接，所述扇形芯片2与所述封闭贴膜14连接。
本发明提供的一种扇形核酸多联检装置，该装置各反应孔可以分别预埋不同项目的引物探针，可实现一次性多种项目的检测，消耗低、操作便捷、密封性好、不易产生气溶胶污染。
在一些实施例中，所述圆盘式离心支架1上设有中心正圆台3，所述中心正圆台3与所述圆盘式离心支架1连接。
采用上述实施例，其结构简单，操作方便，便于中心正圆台3的离心运动。
在一些实施例中，所述圆盘式离心支架1上设有小型正圆台4，所述小型正圆台4与所述圆盘式离心支架1连接，所述小型正圆台4沿着所述中心正圆台3圆周均匀设置并与扇形芯片2一侧的卡槽7卡接。
采用上述实施例，小型正圆台4紧靠中心正圆台3且均匀分布，锥角大小等于中心正圆台3的锥角，小型正圆台4底面朝上，具有向下的摩擦力，从而具有卡扣作用，扣住扇形芯片2小弧边的卡槽7。
在一些实施例中，所述圆盘式离心支架1上设有弹片6，所述扇形芯片2另一侧通过所述弹片6与所述圆盘式离心支架1固定连接。
采用上述实施例，弹片6均匀分布于圆盘式离心支架1的边缘，突出设置于圆盘式离心支架1外边缘5毫米，每2个弹片6的中间位置对应小型正圆台4的位置，弹片6的a角＜80°，用于固定1个扇形芯片2，同时起到缓冲的作用。
在一些实施例中，所述扇形芯片2包括：加液池8、分液槽9、气体置换孔10、反应孔11和废液槽12，所述加液池8、所述分液槽9、所述气体置换孔10、所述反应孔11和所述废液槽12通过流道13相互连接。
采用上述实施例，其结构简单，操作方便。
在一些实施例中，将样品加入加液池8中，通过圆盘式离心支架1的离心力作用，样品流入分液槽9中，分液槽9收集样品，经过气体置换孔10与反应孔11置换气体，使得反应孔11充满样品，多余的样品会排出到废液槽12中。
采用上述实施例，所述加液池8容积＞60μl，所述加液池8远离圆心端与分液槽9通过流道13连接，大于60μl的样品首先被加到加液池8中，通过圆盘式离心支架1的离心力的作用，样品流入分液槽9的5个杯型分液槽15中，分液槽9收集样品完成后，经过气体置换孔10与反应孔11置换气体，从而使得5个反应孔11充满样品，而多余的样品会排放到废液槽12中，操作方便，达到高通量，提高了工作效率。
在一些实施例中，所述封闭贴膜上设有加样孔，所述加样孔与加液池相对应且相互配合，将样品从加样孔加入流到加液池中。
采用上述实施例，所述封闭贴膜14覆盖贴在扇形芯片2上表面，所述封闭贴膜14上设有加样孔16，加样孔16与加液池8对应，样品从加样孔16加入流到加液池8中，这样操作方便，提高了工作效率。
在一些实施例中，所述加样孔16上设有加样孔贴膜17，所述加样孔贴膜17与所述加样孔16相对应且相互配合连接。
采用上述实施例，所述加样孔贴膜17与所述加样孔16相对应且相互配合连接，提高了密封性、不易产生气溶胶污染。
在一些实施例中，所述圆盘式离心支架1上设有六组中型圆柱体5。
采用上述实施例，中型圆柱体5均匀分布于圆盘式离心支架1的上表面靠近圆盘式离心支架1边缘，每个中型圆柱体5的位置对应每2个小型正圆台4的中间位置，每2个中型圆柱体5固定1个扇形芯片2。
在一些实施例中，六组中型圆柱体5在圆盘式离心支架1表面边缘呈均匀分布，所述扇形芯片2按放于两组中型圆柱体5之间并与两组中型圆柱体5固定连接。
采用上述实施例，中型圆柱体5均匀分布于支架的上表面靠近支架边缘，每个中型圆柱体5的位置对应每2个小型正圆台4的中间位置，每2个中型圆柱体5固定1个扇形芯片2。
所述扇形核酸多联检装置由1个圆盘式离心支架1、6个扇形芯片2和6个封闭贴膜14组成。
所述圆盘式离心支架1上表面具有6个扇区A-F，对应1个中心正圆台3、6个同心小型正圆台4、6个中型圆柱体5和12个弹片6。其中，圆盘式离心支架1与核酸检测仪连接。
所述中心正圆台3位于圆盘式离心支架1的上表面的中心位置，中心正圆台3底面朝下。
所述小型正圆台4紧靠中心正圆台3且均匀分布，锥角大小等于中心正圆台3的锥角，小型正圆台4底面朝上，具有向下的摩擦力，从而具有卡扣作用，扣住扇形芯片2小弧边的卡槽7。
所述中型圆柱体5均匀分布于圆盘式离心支架1的上表面靠近圆盘式离心支架1边缘，每个中型圆柱体5对应每2个小型正圆台4的中间位置，每2个中型圆柱体5固定1个扇形芯片2。
所述弹片6均匀分布于圆盘式离心支架1的边缘，位置设置于突出圆盘式离心支架1约5毫米的距离，每2个弹片6的中间位置对应小型正圆台4，弹片6的a角＜80°，用于固定1个扇形芯片2，同时起缓冲作用。
所述扇形芯片2为透明材料制成，透明材料包括PMMA，每个扇形芯片2顶角为45°，扇形芯片2固定于每2个中型圆柱体5之间，反应孔11暴露于圆盘式离心支架1的底板上。
所述扇形芯片2由卡槽7、加液池8、分液槽9、气体置换孔10、反应孔11及废液槽12组成，这些组成通过流道13连接。
所述卡槽7是半个小正圆台，位于扇形芯片2的小弧边的中心位置，刚好与小型正圆台4相契合，由于小型正圆台4向下的摩擦力，从而被固定住。
所述加液池8容积＞60μl，远离圆心端与分液槽9通过流道13连接，大于60μl的样品首先被加到加液池8中，通过离心力的作用，样品流入分液槽9的5个杯型分液槽15中，分液槽9收集样品完成后，经过气体置换孔10与反应孔11置换气体，从而使得5个反应孔11充满样品，而多余的样品会排放到废液槽12中。
所述封闭贴膜14呈透明状，完全覆盖黏贴于扇形芯片2表面，在对应加样池8远离圆心端的位置含有一个加样孔16，加样孔16直径1mm，样品从加样孔16加到加样池8中。
所述扇形芯片2是通过离心力及反应孔11来实现液体的等量分装。
所述5个反应孔11可以预埋不同试剂、引物或探针，经过加样及离心，同步进行反应检测。
所述封闭贴膜14上含有可揭开加样孔贴膜17，该加样孔贴膜17刚好覆盖加样孔16。
扇形核酸多联检装置由1个圆盘式离心支架1、6个扇形芯片2和6个封闭贴膜14三种部件组成。圆盘式离心支架1可以安装到核酸检测仪中，其上表面具有6个扇区A-F，对应1个中心正圆台3、6个同心小型正圆台4、6个中型圆柱体5和12个弹片6。中心正圆台3位于圆盘式离心支架1的上表面的中心位置，圆台底面朝下。小型正圆台4紧靠中心正圆台3且均匀分布，锥角大小等于正中心正圆台3的锥角，圆台底面朝上，具有向下的摩擦力，从而具有卡扣作用，扣住扇形芯片2小弧边的卡槽7。中型圆柱体5均匀分布于支架的上表面靠近支架边缘，每个中型圆柱体5对应每2个小型正圆台4的中间位置，每2个中型圆柱体5固定1个扇形芯片2。弹片6均匀分布于圆盘式离心支架1的边缘，突出于圆盘式离心支架1大概5毫米，每2个弹片6的中间位置对应小型正圆台4，弹片6的a角＜80°，用于固定1个扇形芯片2，同时起缓冲作用。
扇形芯片2为透明材料制成，透明材料包括PMMA等，每个扇形芯片2顶角为45°，固定于每2个中型圆柱体5、每个小型正圆台4及2个弹片6之间，反应孔11暴露于圆盘式离心支架1的底板。扇形芯片2由卡槽7、加液池8、分液槽9、气体置换孔10、反应孔11及废液槽12组成，卡槽7、加液池8、分液槽9、气体置换孔10、反应孔11及废液槽12通过流道13连接。卡槽7是半个小正圆台，位于扇形芯片2的小弧边的中心位置，刚好与小型正圆台4相契合，由于小型正圆台4向下的摩擦力，从而被固定住。加液池8容积＞60μl，远离圆心端与分液槽9通过流道13连接。大于60μl的样品首先被加到加液池8中，通过离心力的作用，样品流入分液槽9的5个杯型分液槽15中，分液槽9收集样品完成后，经过气体置换孔10与反应孔11置换气体，从而使得5个反应孔11充满样品，而多余的样品会排出到废液槽12中。
封闭贴膜14呈透明状，完全覆盖黏贴于扇形芯片2表面，在对应加样池8远离圆心端的位置含有一个加样孔16及覆盖加样孔的贴膜17，加样孔16直径1mm，样品从加样孔16加到加样池8中。
扇形芯片2经过配平后，通过离心力来实现液体的等量分装。5个反应孔11可以预埋不同试剂、引物或探针，经过加样、配平、离心及加热，同步进行荧光检测。
具体实施时，在反应孔11中预埋试剂、引物或探针，经过冻干后形成干粉状，贴上封闭贴膜14，形成核酸检测用芯片。检测时，用移液枪取60μl处理好的样本，从加样孔16缓慢加入到加样池8中，贴上贴膜覆盖住加样孔，将芯片安装到核酸检测仪中的圆盘式离心支架1上，配平后，经过机器的离心，样本被均匀分装且充满整个反应孔11，机器通过37-45℃加热恒温，各反应孔11完成相应指标的核酸扩增，机器采集各反应孔11荧光信号，进行数据处理和图形绘制，自动判读结果，实现单样本多指标的检测。
本发明设计一种扇形核酸多联检装置，该装置各反应孔11可以分别预埋不同项目的试剂、引物或探针等，结合EMA技术，可实现样本单次取样，37-45℃恒温反应，30分钟内得到多指标检测结果。本发明具有样本试剂低消耗，操作简单，密封性好，污染小，高通量，成本低廉等优点，同时节约患者检测时间及成本，适合应用于临床病原的筛查，协助科学用药。
实施例1芯片的使用模拟实验
如图1和2在反应孔11中预埋水(＜5μl)，贴上封闭贴膜14，形成核酸检测用芯片。检测时，揭开加样孔贴膜17，用移液枪移取60μl模拟样本，从加样孔16缓慢加入到加样池8中，再次贴上加样孔贴膜17覆盖住加样孔16。将扇形芯片2安装到核酸检测仪中的圆盘式离心支架1上，配平，经过机器的离心，样本被均匀分装且充满整个反应孔11，机器通过37-45℃加热恒温，机器采集各孔荧光信号，进行数据处理和图形绘制。
实施例2排气孔的验证
如图4，废液槽12未与加液池8连接，使用的时候在加样孔贴膜17的排气孔18相应位置需要戳一个小孔，用于排气。如实施例1的使用方法，将样本加到加样池8中，封闭加样孔16。由于需要排气，所以排气孔18上的小孔是不能封闭的。将扇形芯片2安装到核酸检测仪中的圆盘式离心支架1上，使用如图2的扇形芯片2做对照，经过机器的离心，运行完成后，取出扇形芯片2，两个扇形芯片2的反应孔11均无气泡，但是考虑到扇形芯片2上排气孔18不封闭，具有产生气溶胶污染的风险，增加了污染检测环境的风险。所以将废液槽12与加液池8连通。
实施例3呼吸道5联检芯片的制作及测试
如图2，在反应孔11中经过微流控预埋试剂，每个反应孔11的试剂含有终浓度为24-27ng/μl的单链DNA结合蛋白、62-125pg/μl的ATP再生蛋白、6-7.5ng/μl的DNA解旋酶、2-3ng/μl的DNA聚合酶、90-120pg/μl的DNA限制性内切酶、300-400pg/μl的辅助蛋白、20-30mM的磷酸肌酸钠、2-3mM的ATP、100-150μM的dNTP、50-60mM的Tris-Ac(pH8.0)、35-50μg/μl的海藻糖、100-120mM的KAc、7.5-10ng/μl的甘露醇、1-5％的PEG20000(W/V)，其中RNA体系另外添加终浓度为0.75-7.5ng/μl M-MLV逆转录酶、0.25-2.5ng/μl RNase抑制剂。
5个反应孔11分别预埋了5个项目的引物和探针，顺时针依次是肺炎支原体、肺炎衣原体、合胞病毒、流感病毒H3亚型、嗜肺军团菌，引物浓度是200-300nM、探针浓度是30-40nM，序列见表1。以上试剂预埋后，经过冻干，贴上封膜，形成一个简单的多联检芯片。
表1呼吸道5联检各反应孔引物、探针序列
注：“i6-FAMdT”指6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”指带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3 Spacer”指3’羟基封闭。
检测时，本实施例使用的模拟样本是含有肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌目的序列质粒的等比混合物。用移液枪取30μl模拟样本加入30μl反应液，吸打混匀，反应液含有终浓度为20-100mM的MgAc2、160-200mM的Tris-Ac、110-140mM的KAc及10-15％的PEG20000，揭开加样孔贴膜17，用移液枪移取样本核酸从加样孔16加入到加样池8中，再次贴上加样孔贴膜17，封闭加样孔16。将加样完成的扇形芯片2安装进圆盘式离心支架1的扇区A内并配平，A区反应孔顺时针标记1-5，即A1-A5，分别检测样本中是否含有肺炎支原体、肺炎衣原体、合胞病毒、流感病毒H3亚型或嗜肺军团菌。
在机器上选择反应程序并运行，5000rpm离心1min，样本被均匀分装且充满整个反应孔11，机器通过37-45℃恒温加热，各反应孔完成相应指标的核酸扩增，机器间隔30s采集各孔荧光信号，进行数据处理和图形绘制，给出报告，结果见图5。出现了3条曲线，分别是A1、A2、A5三个孔，是肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌阳性结果，而A3、A4无扩增曲线，合胞病毒、流感病毒H3亚型为阴性结果，说明样本中含有肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌基因目的序列，与预期结果一致。
本发明公开了一种扇形核酸多联检装置，由圆盘式离心支架、扇形芯片和封闭贴膜组成。该装置能够实现单样本多项目同时扩增检测，比普通核酸检测装置效率更高，且密封性好，能有效避免产物气溶胶污染。同时降低了样本、耗材和试剂的消耗，降低病原漏检概率，提高了检测通量，适合应用于临床病原的筛查，协助科学用药。
一种扇形核酸多联检装置的有益效果，产生如下的有益效果：
(1)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，可实现单次取样而获得多指标检测结果，实现高通量筛查，节约了患者检测成本及时间；
(2)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，简化了检测人员的操作流程，只有加样-贴膜两步，降低了出错率，节约人员成本及时间；
(3)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，试剂等均预先填装，减少了检测人员操作过程试剂的暴露，降低了假阳性的概率；
(4)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，在加样完成后，经贴膜覆盖形成封闭空间，避免了气溶胶蒸发，降低污染；
(5)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，废液槽与加样池联通，保证了离心力作用下液体流动的顺畅；
(6)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，气体置换孔的设置，可保证试剂能充满整个反应孔，提高反应准确度；
(7)本发明提出的一种扇形核酸多联检装置，该装置单孔反应体积是10μl，降低了样本、耗材和试剂的消耗，节约了制造成本。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种扇形核酸多联检装置，其特征在于，包括：圆盘式离心支架、扇形芯片和封闭贴膜，所述圆盘式离心支架与所述扇形芯片连接，所述扇形芯片与所述封闭贴膜连接。
2.根据权利要求1所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述圆盘式离心支架上设有中心正圆台，所述中心正圆台与所述圆盘式离心支架连接。
3.根据权利要求2所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述圆盘式离心支架上设有小型正圆台，所述小型正圆台与所述圆盘式离心支架连接，所述小型正圆台沿着所述中心正圆台圆周均匀设置并与扇形芯片一侧的卡槽卡接。
4.根据权利要求3所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述圆盘式离心支架上设有弹片，所述扇形芯片另一侧通过所述弹片与所述圆盘式离心支架固定连接。
5.根据权利要求4所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述扇形芯片包括：加液池、分液槽、气体置换孔、反应孔和废液槽，所述加液池、所述分液槽、所述气体置换孔、所述反应孔和所述废液槽通过流道相互连接。
6.根据权利要求5所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，将样品加入加液池中，通过圆盘式离心支架的离心力作用，样品流入分液槽中，分液槽收集样品，经过气体置换孔与反应孔置换气体，使得反应孔充满样品，多余的样品会排出到废液槽中。
7.根据权利要求6所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述封闭贴膜上设有加样孔，所述加样孔与加液池相对应且相互配合，将样品从加样孔加入流到加液池中。
8.根据权利要求7所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述加样孔上设有加样孔贴膜，所述加样孔贴膜与所述加样孔相对应且相互配合连接。
9.根据权利要求8所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，所述圆盘式离心支架上设有六组中型圆柱体。
10.根据权利要求9所述的扇形核酸多联检装置，其特征在于，六组中型圆柱体在圆盘式离心支架表面边缘呈均匀分布，所述扇形芯片按放于两组中型圆柱体之间并与两组中型圆柱体固定连接。
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