CN1775796A - 核酸制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过将样品进行热循环来从模板核酸制备核酸的方法、装置和计算机程序。在第一种数目的热循环之后，将部分量的第一反应混合物进行第二种数目的热循环。这种两步扩增法使得整个反应时间加速而不影响检测的限度。

Description

核酸制备
发明领域
本发明涉及从模板核酸制备核酸的方法，用于从模板制备核酸的诊断装置，对使用热循环(thermocycle)从模板核酸制备核酸的方法进行控制的计算机程序，包含所述程序的计算机程序产品，制备核酸的设备和测定样品中模板核酸的存在或不存在或量的方法。
发明背景
从包含核酸的样品中扩增这些核酸的方法是公知的。在体内方法中，使用带有被遗传工程改造的含有待扩增核酸的基因组的微生物来生产大量该核酸的拷贝。这些方法慢而且在成功实施之前需要大量实验。最近，用来制备大量核酸的且无需微生物参与的体外方法已被建立。第一个体外扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其在EP 201 184中被描述。在一个非常优选的PCR实施方案中，含有待扩增核酸的样品重复经历反映如下步骤的温度变化型(temperatureprofile)：引物与靶核酸杂交，使用待拷贝核酸为模板延伸所述引物，从而制备延伸产物，以及从模板核酸上分离所述延伸产物。该温度变化型被应用几次，从而使得这些步骤重复进行，其中包括能与第一引物的延伸产物杂交的第二引物的杂交和延伸。每一个重复进行的温度变化型被叫做热循环。
该方法已被应用到基于核酸增加量带来的较高检测灵敏性的测定核酸的方法中。在EP 200 362中公开了一种方法，其使用添加能与形成于反应混合物中的核酸杂交的探针并测定形成的杂交体(hybrid)的存在、不存在或量，以此作为样品中最初核酸的量度。
最近，已发现核酸的扩增方法如此有效以至于有污染环境的危险，如在其中进行扩增反应的实验室。这可在随后的检测中产生假阳性的结果。在EP 543942中公开了一种方法，该方法无需在杂交体扩增和检测之间打开反应室、容器或管来添加探针。那些方法被叫做均质扩增和检测方法。
将扩增反应进行到最大程度所需的时间取决于所使用的反应体积。例如，当在热循环仪器，如PCR系统9700仪器(Applied Biosystems)上的一个50-100μl体积内进行PCR反应时，需要的反应时间为2-4小时。其中的大部分时间需要用来改变反应混合物的温度来进行热循环。这能通过几种方式来加速。第一，改变反应容器的形状来增加表面，从而使得能够实施更快的加热和冷却方案。第二，减小反应体积，从而使较少体积需要被加热和冷却。通过这些方式，诸如LightCycler(Roche Diagnostics)的热循环仪使得反应时间能够降到直到几分钟而不是几小时。然而，使用小反应体积的缺点是也只有小体积的样品能被加入到反应中，这将成比例地降低检测的限度(LOD)。可选择地，维持反应体积并通过大的非常平的扩增室将热扩散距离降到最小。然而，这将导致扩增面积和检测面积极大增加并通过这些方式造成使用昂贵的热循环仪和大量一次性物品。此外这些反应室的表面积的增加能抑制反应。
在WO2004/51218中公开了一种检测不同的分析物的方法，其中在反应混合物的所有成分进行多重扩增后，反应混合物被分成等分试样，并用试剂处理该等分试样以用来使特定分析物在单独的反应中特异扩增。该方法的缺点是第二次扩增时需要额外的试剂。
在WO02/20845中公开了一种避免引物二聚体形成的方法，这通过使用低引物浓度进行第一扩增反应，然后添加更多引物并进行更多扩增步骤来实现。同样，该方法的缺点是在扩增的某一阶段，反应管必须被打开以添加更多试剂。这既对实验室中的工作流程是不方便的而且又是污染原因的问题所在。此外标准热循环仪的使用不允许非常快的循环速度。
先前提及的这两个现有技术文件都没有旨在以任何方式缩短扩增时间，因此，本分明的目的是提高扩增速度。
发明概述
第一方面，本发明涉及一种通过将样品进行热循环来从模板核酸制备核酸的方法，其包括：
a)将第一扩增室内的第一种量的所述样品进行第一种数目的热循环来制备第一种量的第一反应混合物，和
b)将第二扩增室内的部分量的所述第一反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物
其中所述第二扩增室的体积优选小于所述第一扩增室的体积。
在步骤a)中，整体加热和冷却速度优选至少为2开/秒(K/s)，且在步骤b)中更高，优选至少为5K/s。
第二方面，本发明涉及用于从模板制备核酸的诊断装置，其包括：
-第一扩增室，和
-第二扩增室，
其中所述第二扩增室的体积优选小于所述第一扩增室的体积。在步骤a)中，整体加热和冷却速度优选至少为2开/秒(K/s)，且在步骤b)中更高，优选至少为5K/s。
第三方面，本发明涉及对使用热循环从模板核酸制备核酸的方法进行控制的计算机程序，其特征在于该计算机程序被设置成将第一种数目的热循环应用于样品，并随后将具有较短循环时间的第二种数目的热循环应用到来源于相同样品的不同体积的反应混合物上。
第四方面，本发明涉及包含物理储存设备上的所述程序的计算机程序产品。
第五方面，本发明涉及制备核酸的仪器，其包括：
-热循环仪和
-控制该热循环仪的单元，
其中用于控制该热循环仪的单元加载了所述的计算机程序。
第六方面，本发明涉及测定样品中模板核酸的存在或不存在或量的方法，其包括上述的核酸制备方法和检测核酸的形成，以此作为待测核酸存在或不存在或量的量度。
附图简述
图1阐明了本发明的原理。通过降低第二个步骤中的反应体积，能降低所需的反应时间而没有改变检测的限度(LOD)。
图2显示了最优化的等分试样扩增方法的计算。
图3显示了用于进行所述的核酸制备方法的包含两个扩增室的热循环装置。
图4显示了用于进行本发明方法的毛细管一次性物品(还可见实施例3)。
图5显示了以多重模式进行所述核酸制备方法的可能装置(还可见实施例4)。
发明详述
本发明一方面涉及从模板核酸制备核酸的方法。在该方法中，将第一种量的样品进行第一种数目的热循环从而制备第一种量的第一反应混合物。然后将所述第一反应混合物的等分试样/部分量进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物。通过只将第一反应混合物的等分试样进行第二种数目的热循环，与热循环第一反应混合物所需的时间相比，由于减小了热扩散的距离，所以每个热循环的时间可被降低。前几个热循环对扩增的特异性来说是至关重要的，并因此需要非常精确的温度水平，而没有主要的高于额定值(overshooting)和低于额定值(undershooting)。同样，第一反应步骤内大约5-200μl的反应体积为添加足够的来自待分析样品材料的核酸制剂提供了充足的体积，从而使得也可能实现非常灵敏的扩增方法。额外40-50个循环的第二部分主要需要来产生可检测的信号水平。根据这些需要，可调节循环仪、扩增室和反馈控制到非常精确的水平或速度。此外，良好封闭的、紧密的第二扩增体积导致高灵敏度的光学结构。其原理阐释于图1。
该方法优选基于PCR方法，但还能使用其他方法，如线性的或指数的核酸扩增方法。指数扩增方法是本领域公知的。特别合适的方法如PCR(US4,683,202)和LCR(US5,185,243，US5,679,524和US5,573,907)，其中反应混合物反复经历不同的温度(热循环)。
样品量、热循环的第一和第二种数目和时间长短取决于具体目的和所用的扩增方法。第一种量的样品一般具有5μl-200μl的体积，优选5μl-50μl。进行扩增反应进一步所需的试剂能以干燥形式被加入，例如作为第一扩增室的沉淀物，所述沉淀物通过加入样品溶解。这些试剂也能以溶液被加入，一般以2.5-100μl的体积而被加入，更优选以2.5-25μl的体积被加入。然后将该样品在第一扩增室进行第一种数目的热循环，其一般为3-15个热循环，更优选5-8个。热循环的时间长短在不同扩增方法之间有很大变化。对于PCR来说，它一般在20秒到5分钟之间变化，更优选在20-120秒之间。在这一步骤中，优选使用具有整体加热和冷却速度至少为2开/秒，更优选在4-7K/s之间的扩增室。
整体加热和冷却速度能被描述为温度步骤除以从一个温度水平转换到另一个温度水平所需的时间。这是在热循环装置中能产生更快速PCR方案的相关参数。一般地，这些步骤为从95℃到60℃，60℃到72℃和72℃到95℃。因此，在本发明的内容中，整体加热和冷却速度被理解为在大约60℃和95℃的温度范围内指定的扩增室和指定的反应体积的速度。
整体加热和冷却速度受热循环仪中所使用的加热和冷却装置以及决定待扩增反应混合物体积的扩增室的大小的影响。使用带有小体积扩增室的快速热循环仪能缩短循环时间。
常规的热循环仪基于带有安装好的铝块的Peltier技术(Applied Biosystem9700)，其一般具有小于2-3K/s的整体斜坡速度(integral ramping speed)，并因此不能单独获得本发明所建议概念的全部益处。用诸如LightCycler的产生5-6K/s加热和冷却速度的热循环仪或者安装了高效Peltier部件的仪器，就能看见第一点好处。使用允许斜坡速度(特别是冷却速度)大于10K/s的热循环仪甚至能获得更多的益处。
在第二扩增室内，将部分量的所述第一种量的反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物。一般地，所述部分量的所述第一种量的反应混合物的体积为0.05到5μL，更优选0.1-2μL。一般地，将该部分量的所述反应混合物进行不到50个热循环，更优选20-40个热循环。所述部分量的所述第一反应混合物的较小体积，使得所述第二扩增室的整体加热和冷却速度较高(至少5K/s，优选8到12K/s)，并且热循环的时间长短比第一轮扩增时的热循环的时间长短要短，通常在5-30秒之间变化。
样品可来源于人、动物和自然界中其他来源。优选地，样品(尤其是诊断方法中的样品)是血液、血清、血浆、骨髓、组织、痰、胸膜和腹膜的渗出液和悬浮液、尿、精液和粪便。
优选核酸在扩增前从样品中纯化出来，从而使或多或少纯的核酸样品被加到扩增反应中。纯化核酸的方法是本领域公知的。除了描述于Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Coldspring Harbour Laboratory Press(1989))的实验室方法外，还可获得用于此目的商业试剂盒(例如，MagNAPure，Roche Diagnostics)。
因此，尤其对于那些无需将存在于样品中的核酸进一步纯化以及纯化的样品包含来自供体样品的核酸制剂的情况，根据本发明的样品可以是直接来自供体的样品。
本分明的另一方面涉及从上述样品中制备和/或检测核酸的方法，其中存在于样品中的核酸的纯化优选被整合在该装置的第一扩增室内。装置和方法是现有技术中公知的，在所述装置和方法中，在与用于进行核酸扩增反应相同的反应室内纯化存在于样品中的核酸。例如在WO 03/106031中描述了集成装置，其中使用了象玻璃棉网(fleece)的结合基质来捕获存在于样品中的核酸。在样品制备之后，在用于核酸样品制备的相同反应室内进行扩增反应。这一方法能与本发明的方法和装置相结合。可纯化样品中的核酸并在装置的第一反应室内将其进行第一种数目的热循环从而制备第一种量的第一反应混合物。所述第一反应混合物的等分试样随后被转移至第二扩增室以进行第二种数目的热循环，从而制备第二种量的第二反应混合物。该方法和装置具有几个意想不到的优点。
第一，如已描述的那样，由于较小的反应体积，第二扩增步骤使得热循环更快。
第二，同样，如果样品的核酸仍部分结合到用于样品制备的结合基质上并且未被完全从所述的基质上洗脱，那么这些核酸仍能被扩增，因为结合基质在第一种数目的热循环期间存在。第三，如果所述的结合基质在某种程度上抑制了扩增反应，那么当将该反应进行第二种数目的热循环时，该抑制效应不再存在，因为用于进行第二种数目的热循环的第一反应混合物的等分试样不再与所述的结合基质接触。
热循环被定义为将反应混合物进行了规定时间段的至少两个温度处理的顺序。这种热循环能被重复。在PCR方法中通常使用三个不同的温度。在大约45-70℃引物被退火到靶核酸。在大约72℃的温度结合到靶上的引物被热稳定的聚合酶延长并随后在大约90-100℃分开双链核酸。在PCR方法中，所述循环通常重复30到50次。改变反应混合物内的温度所需的时间主要取决于反应管的体积和形状，并且通常从几分钟到若干分之几秒不等。
在将部分量的第一反应混合物进行第二种数目的热循环之前，优选将该部分量的反应混合物转移至第二扩增室。这可通过使用移液管手工进行。然而，考虑到污染风险，优选在装置内自动进行，例如通过泵和阀进行。第一和第二扩增室能被槽、阀、疏水屏障和其他装置彼此分隔。用于这种集成装置的技术方法对专家来说是公知的。(见例如Lee等，J.Micromech.Microeng.13(2003)89-97；Handique等.， Anal.Chem.72 4100-9；Hosokawa等Anal.Chem.71 4781-5，Puntambekar等., Proc.Transducers’01(Berlin：Springer) pp1240-3，Zhao等.，Science 291 1023-6；Andersson等.，Sensors Actuators B 75 136-41)。
任选地，第一和第二扩增反应室是没有物理隔离两种反应混合物的一个未分隔的反应室中的两个区。然而，在这种情况下，尤其是关于在第一和第二反应区内制备的扩增的核酸，当进行第二种数目的热循环时，需要避免反应产物扩散/使反应产物扩散最小化。这能通过几种方式获得，例如通过固相结合的引物。
如果在第一和第二扩增室之间放置一个槽，那么如果两室之间的扩散被最小化，则也能避免通过阀、出口、疏水屏障的物理分隔。
反应混合物包含进行选择的扩增方法所需的所有成分。通常这些是允许特异结合到待扩增的靶核酸上的引物，诸如聚合酶、反转录酶等等的酶，核苷三磷酸，缓冲液，如镁的单价和二价阳离子。这些成分取决于扩增方法并对本领域专家是公知的。
在第一和第二反应混合物内制备的核酸产物能通过本领域公知的方法检测，例如通过在琼脂糖凝胶上检测产物的长度。通过使用序列特异性的寡核苷酸探针，能获得进一步的特异性水平，例如通过实施DNA印迹或斑点印迹技术。在均质扩增和检测方法中，检测探针或其他检测装置在被扩增的核酸产生期间已存在于反应混合物中。在EP 0 543 942描述的方法中，当延伸引物时，探针被加工聚合酶降解。众所周知，标记通常能被用于检测。例子有荧光标记如荧光素、若丹明等。
因此，本发明一方面涉及测定样品中模板核酸的存在或不存在或量的方法，其包括：
a)将第一扩增室内的第一种量的所述样品进行第一种数目的热循环来制备第一种量的反应混合物，
b)将第二扩增室内部分量的所述第一反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物，和
c)测定核酸的形成作为待测定核酸的存在或不存在或量的量度
其中所述第二扩增室的体积优选小于所述第一扩增室的体积。在步骤a)中，整体加热和冷却速度优选至少为2开/秒(K/s)，且在步骤b)中更高，优选至少为5K/s。
核酸的形成能在完成步骤a)和b)之后，或在步骤a)和/或b)的扩增期间被测定。
当将部分量的第一反应混合物转移至第二扩增室时，通常无需添加额外的反应成分。这避免了反应室的任何开启，至少当自动进行时，并避免了任何污染风险。然而，对于特定应用而言，添加额外的试剂可能是有用的。例如，当进行嵌套式PCR方案时添加额外的引物可能是有用的，或添加允许检测某种扩增产物的额外的探针可能是有用的。这些试剂可以手工添加，但也可以在反应前以液体或固体形式储存于反应装置内并在将部分量的第一反应混合物向第二扩增室内转移后被混合。在本发明的一个特定的实施方案中，这些试剂，特别是引物和探针，被结合到固相上。
由于只有部分量的第一反应混合物被用于制备第二反应混合物，所以原则上多数第二反应混合物能来自于第一反应混合物。这允许对大于一部分量的第一反应混合物进行第二种数目的热循环并因此允许进行多重反应方案。在最简单的情况中，这可以是相同混合物的平行反应，从而符合在该方法中获得的结果。如果不同的引物和/或探针被添加到部分量的第一反应混合物中，那么一个真实的多重检测方法是可能的，例如用于检测一个靶的不同的等位基因的方法。
用于本发明方法的可能的装置在实施例3中被描述。如上文已论述的那样，本发明的方法未被限制到某种装置上。它能使用商业上可获得的热循环仪手工进行，如Applied Biosystems 9700’er系统和LightCycler(RocheDiagnostics)。然而，这种方法特别适合基于以下技术的功能集成的装置，例如描述于Micro Total Analysis Systems，Proceedings uTAS’94，A van den Berg，PBerveld，1994；Integrated Microfabricated Biodevices，M J Heller，A Guttman，2002；microsystem Engineering of Lab-on-a-Chip devices，O Geschke，H Klandk，PTellemann，2004；US 2003/0152492和US 5,639,423中的装置。这些装置通常具有自动的液体输送，其允许在反应室、热循环装置、事先加载在装置内的或能被自动添加的试剂、以及检测反应产物的装置之间传输样品。反应由计算机工具和用于进行控制的计算机程序来控制。
因此，本发明的另一方面是用于从模板制备核酸的诊断装置，其包括：
-第一扩增室，和
-第二扩增室，
其中所述第二扩增室的体积优选小于所述第一扩增室的体积。在步骤a)中，整体加热和冷却速度优选至少为2开/秒(K/s)，且在步骤b)中更高，优选至少为5K/s。
第二扩增室体积的较小尺寸使得能够降低每个热循环所需的时间。在标准热循环仪中，如PCR系统9700(Applied Biosystems)，扩增室体积的尺寸没有改变，此外更常使用金属块用于热循环，这不能使热循环所需的时间降低到小于几分钟。因此，取扩增反应物的等分试样并使用诸如LightCycler的更快的热循环仪进行第二扩增反应使得能降低整个反应时间而不会降低测定的灵敏性。
适合于本发明诊断装置的扩增室基本在现有技术中是公知的。这些扩增室确实为包含的反应混合物提供了空间。例如所述室可以是适合于诸如PerkinElmer 9700er仪器的热循环仪金属块上的钻孔的薄壁塑料管，或是能被放置于LightCycler仪器中的玻璃毛细管的内体积。扩增室的体积受能用于反应的反应混合物的最大体积所限制。
例如反应混合物能通过使用如Peltier或电阻加热元件的加热元件来加热。对于冷却，可使用主动冷却元件或被动冷却元件，像散热片。对于将包含于反应室内的反应混合物进行加热和冷却，有几种方法是公知的。在很多传统的热循环仪中使用包含扩增室的金属块为反应混合物提供加热和冷却。在LightCycler形式中，环绕玻璃毛细管浮动的热气流提供了这种功能。
本发明的诊断装置具有至少两个上述扩增室。这些室位于一个装置内或被分隔在两个不同的装置内，在那里，第一反应混合物的等分试样向第二扩增室的转移能通过手动移液进行，或，优选地，自动进行。根据本发明的设备具有一个包含该装置的容器。它也包含加热和冷却这些室的，且优选还用于在热循环期间控制扩增循环温度的装置，优选加载了下述计算机程序的用于进行控制的单元。
因此，本发明的另一方面是对使用热循环从模板核酸制备核酸的方法进行控制的计算机程序，其特征在于该计算机程序被设置成将样品进行第一种数目的热循环，随后将来源于相同样品的不同体积反应混合物进行具有更短循环时间的第二种数目的热循环。本发明更优选的方面涉及上述的用于控制核酸制备方法的计算机程序。
这些计算机程序能被储存于物理储存装置中，如磁盘或CD。
本发明的另一方面是制备核酸的装置，其包括：
-热循环仪，和
-控制热循环仪的单元，
其中所述控制热循环仪的单元加载了上述的计算机程序。该热循环仪优选是上述的诊断装置。
本发明被进一步描述于下面的实施例中：
实施例
实施例1
最优化的PCR方案
为在一个立方体反应室内进行100μl PCR反应，提出了这样的问题：在最优化的Aliquot PCR方法中100μl体积中应进行多少个循环，及在多少数目的循环之后，多少大小的等分试样应被加到第二反应室，从而在最短时间内进行所述方法而不改变检测限度并不失去灵敏性。100μl体积的一般的PCR循环需要大约130秒。在最优化的PCR反应中被扩增核酸的量在每个循环中将被加倍。因此，n个循环之后，第一反应体积的1/2n能被用作进行第二种数目的热循环的部分量，其由于较小体积而能被更快地循环。缩短的热循环的确切时间一方面由温度曲线来限定，另一方面由热扩散的距离来限定。对于实际计算，假定被加热的体积具有立方体形状并且通过单个壁与热源/散热片接触。在PCR期间，大多数时间被消耗在从所述单个壁通过水达到均匀温度分布的热扩散上。热扩散时间由立方体体积边长的2次方按比例决定，因此将体积减少到原来的二分之一就将扩散时间减少到原来的2-2/3分之一。此外，采用了50个热循环的一般操作。
所述计算的结果显示于图2。如果进行50个长的热循环，那么反应时间将是110分钟。通过应用本发明的方法，能将其缩短至直到20分钟而不失去灵敏性。如所示那样，在5到8个热循环之后，取第一反应混合物的等分试样，并将这个部分量进行剩余的热循环，该热循环由于较小体积而能被进行得更快，这是最理想的。根据第一热循环的数目，3.2到4.0μl将被用于进行第二热循环。还应进一步提及的是，那个大小的反应体积正好适合用标准的检测方法，例如荧光检测，来检测扩增的核酸。
尽管这个计算是基于一些假定，例如每个循环靶核酸的加倍(其在现实实验中是很难获得的)，但它很好地阐释了本发明的优点。
实施例2
图3显示了具有适合于进行本发明方法的两个扩增室和热循环元件的设备的示意图。这两个室通过能作为疏水阀发挥作用的狭窄部分来进行物理接触。通过这种方式，当第一扩增室被填充时，第二扩增室未被自动填充。几个热循环后，第一反应混合物的等分试样被转移至第二扩增室，例如通过旋转该装置或通过应用流体静压。
实施例3
图4描述了Light-Cycler管的修改，其特征是将窄管的管顶部加宽。宽的部分和窄的部分被疏水部分(阀)彼此分开。在管的上半部运行几个第一循环之后，等分试样被旋至该管的较低部分从而使得现在能够进行更快的循环变化型。这当然需要仪器的一些改变以允许在循环程序内进行离心步骤。然而，该离心步骤也能使用可获得的离心机进行，而无需改变现存的Light-Cycler装置。
实施例4
图5显示了盘状的装置的示意图，其具有一个进行第一种数目的较高反应体积热循环的反应室，并能将超过一个部分量的第一反应混合物进行第二种数目的热循环，并因此允许多重反应方法。在这个例子中，反应液体能通过旋转盘装置和应用离心力而被转移，但也能使用其他方法如气动力、真空等。通常可逆地阻断第一和第二反应室之间的液体连接是可取的，例如通过阀、疏水出口等等。然而，如上面已概括的，如果扩散被最小化，那么使用一个具有两个反应区的反应室也是可能的，在那里第二区能被用于进行更快的热循环。例如通过结合到固相上的引物和/或探针来获得扩增核酸的扩散的最小化。

Claims (36)

1.一种通过将样品进行热循环而从模板核酸制备核酸的方法，其包括：
a)将第一扩增室内的第一种量的所述样品进行第一种数目的热循环来制备第一种量的第一反应混合物，和
b)将第二扩增室内的部分量的所述第一反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物
其中所述第二扩增室的体积小于所述第一扩增室的体积。
2.一种通过将样品进行热循环而从模板核酸制备核酸的方法，其包括：
a)将第一扩增室内的第一种量的所述样品进行第一种数目的热循环来制备第一种量的第一反应混合物，其整体加热和冷却速度至少为2开/秒(K/s)，和
b)将第二扩增室内的部分量的所述第一反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物，其整体加热和冷却速度高于所述第一扩增室的整体加热和冷却速度，并至少为5K/s。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二扩增室的体积小于所述第一扩增室的体积。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其中在步骤a)中的整体加热和冷却速度是4到7K/s和在步骤b)中是8-12K/s。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其中所述第一扩增室内的所述第一种量的所述样品的体积是5-200μl，优选5到50μl。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其中所述部分量的所述第一反应混合物的体积是0.05到5μl，优选0.1到2μl。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其中所述第一种数目的热循环少于所述第二种数目的热循环。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其中所述部分量的第一反应混合物被从所述第一反应混合物的剩余物中以物理方式移出。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述部分量的第一反应混合物被设备从所述第一反应混合物的剩余物中自动移出。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其中步骤b)中的热循环所用的时间短于步骤a)中的热循环所用的时间。
11.根据权利要求1-10任一所述的方法，其中将一个或多个额外的部分量的所述第一反应混合物进行步骤b)中的热循环。
12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其中将部分量的所述第二反应混合物进行第三部分数目的热循环。
13.根据权利要求1-12任一所述的方法，其中在进行所述第一种数目的热循环之前，使用所述第一扩增室来纯化存在于未被纯化的样品中的核酸。
14.一种测定模板核酸存在或不存在或量的方法，其包括：
a)将第一扩增室内的第一种量的所述样品进行第一种数目的热循环来制备第一种量的第一反应混合物，和
b)将第二扩增室内的部分量所述第一反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物，和
c)测定核酸的形成作为待测定核酸的存在或不存在或量的量度
其中所述第二扩增室的体积小于所述第一扩增室的体积。
15.一种通过将样品进行热循环而从模板核酸制备核酸的方法，其包括：
a)将第一扩增室内的第一种量的所述样品进行第一种数目的热循环来制备第一种量的第一反应混合物，其整体加热和冷却速度至少为2开/秒(K/s)，和
b)将第二扩增室内的部分量的所述第一反应混合物进行第二种数目的热循环来制备第二种量的第二反应混合物，其整体加热和冷却速度高于所述第一扩增室的整体加热和冷却速度，并至少为5K/s，
c)测定核酸的形成作为待测定核酸的存在或不存在或量的量度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二扩增室的体积小于所述第一扩增室的体积。
17.根据权利要求14-16任一所述的方法，其中所述核酸的形成在步骤a)和b)完成之后测定(步骤c)。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸的形成在步骤a)和/或b)期间测定(步骤c)。
19.根据权利要求14-18任一所述的方法，其中在步骤a)中的整体加热和冷却速度为4-7K/s，且在步骤b)中为8-12K/s。
20.根据权利要求14-19任一所述的方法，其中所述第一扩增室内的所述第一种量的所述样品的体积为5-200μl，优选5-50μl。
21.根据权利要求14-20任一所述的方法，其中所述部分量的所述第一反应混合物的体积为0.05-5μl，优选0.1-2μl。
22.根据权利要求14-21任一所述的方法，其中所述第一种数目的热循环小于第二种数目的热循环。
23.根据权利要求14-22任一所述的方法，其中所述部分量的第一反应混合物被从所述第一反应混合物的剩余物以物理方式移出。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述部分量的第一反应混合物被装置从所述第一反应混合物的剩余物自动移出。
25.一种用于从模板制备核酸的诊断装置，其包括：
a.第一扩增室，和
b.第二扩增室，
其中所述第二扩增室的体积小于所述第一扩增室的体积。
26.一种用于从模板制备核酸的诊断装置，其包括：
a.具有整体加热和冷却速度至少为2K/s的第一扩增室，和
b.具有整体加热和冷却速度高于所述第一扩增室的第二扩增室，并且其至少为5K/s。
27.根据权利要求26所述的装置，其中所述第二扩增室的体积小于所述第一扩增室的体积。
28.根据权利要求25-27任一所述的装置，其中所述第一扩增室的整体加热和冷却速度为4-7K/s，且所述第二扩增室的整体加热和冷却速度为8-12K/s。
29.根据权利要求25-28任一所述的装置，其中所述第一扩增室内的所述第一种量的体积为5-200μl，优选5-50μl。
30.根据权利要求25-29任一所述的装置，其中所述第二扩增室的体积为0.05-5μl，优选0.1-2μl。
31.根据权利要求25-30任一所述的装置，其中第一扩增室还允许在扩增之前纯化存在于样品中的核酸。
32.根据权利要求25-31任一所述的装置，其具有从所述第一扩增室向所述第二扩增室转移液体的装置。
33.一种使用热循环来控制从模板核酸制备核酸的方法的计算机程序，其特征在于，该计算机程序被设置成向所述样品应用第一种数目的热循环和随后向来源于相同样品的不同体积反应混合物应用具有更短循环时间的第二种数目的热循环。
34.一种计算机程序，任选根据权利要求33所述的计算机程序，用于控制权利要求1-24任一所述的方法。
35.一种计算机程序产品，其包含在物理储存设备上的根据权利要求33或34的程序。
36.一种制备核酸的装置，其包括：
a.根据权利要求25-32任一所述的诊断装置，和
b.控制该诊断装置的单元，
其中控制该诊断装置的单元加载了根据权利要求33-35任一所述的计算机程序。
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