KR100879496B1 - 핵산 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플을 열순환시켜, 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법, 장치 및 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다. 수 회의 1차 열순환 후, 반응 혼합물의 일부량을 수 회 2차 열순환시킨다. 이러한 두 단계 증폭 방법에 의해서, 검출 한계에 영향을 미치지 않으면서, 전체 반응 시간이 단축된다.
열순환

Description

핵산 제조{NUCLEIC ACID PREPARATION}
본 발명은 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법, 주형으로부터 핵산을 제조하기 위한 진단 장치, 열순환을 이용하여 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법을 제어하기 위한 컴퓨터 프로그램, 상기 프로그램을 포함하는 컴퓨터 프로그램 상품, 핵산을 제조하기 위한 기구 및 샘플 내의 주형 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
핵산을 포함하는 샘플로부터 핵산을 증폭시키는 방법은 공지되어 있다. 생체 내 방법에서는, 대량의 핵산 복제물을 제조하기 위하여, 증폭시킬 핵산을 포함하도록 유전자 조작시킨 게놈을 가지는 미생물을 사용한다. 그러한 방법은 느리며, 성공적으로 이행하기 전에 많은 실험이 필요하다. 더욱 최근에는, 미생물과 연관되지 않으면서 대량의 핵산을 제조하는 시험관 내 방법이 확립되었다. 최초의 시험관 내 증폭 방법은 EP 201 184 에 기재되어 있는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 이었다. PCR 의 매우 바람직한 구현예에서는, 표적 핵산에 프라이머 혼성화시키는 단계, 복제할 핵산을 주형으로서 사용하여 상기 프라이머를 신장시켜 신장 생성물을 제조하는 단계 및 주형 핵산으로부터 신장 생성물을 분리시키는 단 계를 반영하는 온도 프로파일을, 증폭시킬 핵산을 포함하는 샘플에 반복적으로 행한다. 상기 온도 프로파일을 수 회 적용하여, 1차 프라이머의 신장 생성물에 혼성화가능한 2차 프라이머의 혼성화 및 신장을 포함하는 단계를 반복시킨다. 각각의 반복적으로 수행되는 온도 프로파일을 열순환이라 칭한다.
핵산의 양이 증가함으로써 제공되는 월등한 검출 민감도에 기반하여 핵산을 측정하는 방법에 상기 방법을 적용해 왔다. EP 200 362 에는, 반응 혼합물 내에 형성된 핵산에 혼성화가능한 탐침을 첨가하고, 샘플 내의 본래의 핵산의 척도로서 형성된 혼성물의 존재, 부재 또는 그 양을 검출하는 것을 이용하는 방법이 개시되어 있다.
더욱 최근에는, 핵산의 증폭 방법이 너무나 효과적이라서 환경, 예를 들어, 증폭 반응이 수행되는 실험실을 오염시킬 위험이 있다는 것을 알게 되었다. 이는 연이은 검출의 그릇된 양성 결과를 초래할 수 있다. EP 543 942 에는 증폭과 혼성물의 검출 사이에, 탐침을 첨가하기 위해서 반응 챔버, 용기 또는 튜브를 개방할 필요가 없는 방법이 개시되어 있다. 그러한 방법들을 동차 (homogeneous) 증폭 및 검출 방법이라 칭한다.
현저한 정도로 증폭 반응을 수행하는데 필요한 시간은 사용하는 반응 부피에 따른다. 예를 들어, PCR System 9700 기구 (Applied Biosystems) 와 같은 열순환기 기구에서 50 - 100 ㎕ 부피로 PCR 반응을 수행하는 경우, 2 내지 4 시간의 반응 시간이 필요하다. 이런 시간의 대부분은 열순환을 수행하기 위해서 반응 혼합물의 온도를 변화시키는데 필요하다. 이는 몇몇 수단에 의해 단축될 수 있 다. 첫 번째로, 반응 용기의 모양을 바꿔서 표면을 증가시켜 가열 및 냉각 기간을 더 빠르게 할 수 있다. 두 번째로, 가열 및 냉각시켜야 하는 부피를 더 작게하기 위해 반응 부피를 감소시킬 수 있다. 이러한 수단에 의해, LightCycler® (Roche Diagnostics) 와 같은 열순환기는 반응 시간을 수 시간 대신에 수 분 이하로 감소시킨다. 그러나, 작은 반응 부피를 이용하면 또한 작은 부피의 샘플만을 반응에 첨가할 수 있고, 이는 비례하여 검출 한계 (LOD) 를 감소시킨다는 단점이 있다. 대안적으로는 크고 매우 평평한 증폭 셀에 의해 반응 부피를 유지하고 열 확산 거리를 최소화시킬 수 있다. 그러나, 이는 증폭 면적 및 검출 면적의 과도한 증가를 유도할 것이며, 이러한 수단에 의해 열순환기는 매우 비싸지고 폐기물이 많아질 것이다. 또한 그러한 반응 챔버의 증가된 표면은 반응을 저해할 수 있다.
WO2004/51218 에는 상이한 분석물의 검출 방법이 개시되어 있고, 여기서 반응 혼합물의 모든 성분을 다중 증폭시킨 후, 반응 혼합물을 분취량으로 나누고, 그 분취량을 별도의 반응에서 특이적 분석물의 특이적 증폭용 시약으로 처리한다. 이 방법은 2차 증폭을 위해 추가의 시약이 필요하다는 단점이 있다.
WO 02/20845 에는 프라이머 농도가 낮은 1차 증폭 반응을 이용하여, 프라이머-이량체 형성을 방지한 후, 더 많은 프라이머를 첨가하고 증폭 단계를 더 수행하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 이 방법은 증폭 도중의 어떤 단계에서, 시약을 더 첨가하기 위해 반응 튜브를 개방시켜야 하는 단점이 있다. 이는 실험실에서의 작업의 흐름에 있어서도 불편하고, 오염의 원인이라는 문제도 있다. 또 한, 표준 열순환기를 사용해도 순환운동 속도가 매우 빠르지는 않다.
앞서 언급한 종래 기술 문헌 둘 다 임의의 수단에 의해 증폭 시간을 짧게하는 것을 목적으로 하지 않으며, 따라서, 증폭 속도를 개선시키는 것이 본 발명의 목적이다.
발명의 개요
제 1 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 샘플을 열순환시켜서 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법에 관한 것이다:
a) 1차 증폭 챔버 내에서, 상기 샘플의 1차량을 수 회 1차 열순환시켜 1차 반응 혼합물의 1차량을 제조하는 단계, 및
b) 2차 증폭 챔버 내에서, 상기 1차 반응 혼합물의 일부량을 수 회 2차 열순환시켜 2차 반응 혼합물의 2차량을 제조하는 단계,
여기서, 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 바람직하게는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작다.
통합 가열 및 냉각 속도는, 바람직하게는 단계 a) 에서는 2 켈빈/초 (K/s) 이상이고 단계 b) 에서는 그것을 초과하며, 바람직하게는 5 K/s 이상이다.
제 2 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 주형으로부터 핵산을 제조하기 위한 진단 장치에 관한 것이다:
- 1차 증폭 챔버, 및
- 2차 증폭 챔버,
여기서, 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 바람직하게는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작다. 통합 가열 및 냉각 속도는, 바람직하게는 단계 a) 에서는 2 켈빈/초 (K/s) 이상이고 단계 b) 에서는 그것을 초과하며, 바람직하게는 5 K/s 이상이다.
제 3 측면에서, 본 발명은 열순환을 이용하여 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법을 제어하는 컴퓨터 프로그램에 있어서, 샘플에 수 회의 1차 열순환을 적용하고, 이어서 동일한 샘플로부터 유래한 상이한 부피의 반응 혼합물에 순환운동 시간이 더 짧은 수 회의 2차 열순환을 적용하도록 설정되어 있는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다.
제 4 측면에서, 본 발명은 물리적 저장 수단에 상기 프로그램을 포함하고 있는 컴퓨터 프로그램 상품에 관한 것이다.
제 5 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 핵산 제조용 기구에 관한 것이다:
- 열순환기 및
- 열순환기 제어용 도구,
여기서 열순환기 제어용 도구에는 상기 컴퓨터 프로그램이 탑재되어 있다.
제 6 측면에서, 본 발명은 상기 기재한 핵산 제조 방법을 포함하는, 샘플 내의 주형 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양을 측정하고, 측정할 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양의 척도로서 핵산의 형성을 검출하는 방법에 관한 것이다.
발명의 구성
본 발명의 한 측면은 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 샘플의 1차량을 수 회 1차 열순환시켜 1차 반응 혼합물의 1차량을 제조한다. 이어서, 상기 1차 반응 혼합물의 분취량/일부량을 수 회 2차 열순환시켜 2차 반응 혼합물의 2차량을 제조한다. 1차 반응 혼합물의 분취량만을 수 회 2차 열순환시킴으로써, 1차 반응 혼합물을 열순환운동시키는데 필요한 시간에 비하여, 열순환 당 시간을 감소시킬 수 있고, 이는 열 확산 거리가 감소하기 때문이다. 몇 회의 1차 열적 순환은 증폭의 특이성에 있어서 가장 중요하며, 따라서, 각각 큰 초과/미만 없이 매우 정확한 온도 수준을 요한다. 또한, 1차 반응 단계에서 대략 5 내지 200 ㎕ 의 반응 부피는 분석할 샘플 물질로부터 유래한 충분한 핵산 제제를 첨가하기에 충분한 부피를 제공하여서, 또한 매우 민감한 증폭 방법이 가능하다. 추가적인 40-50 회의 2차 순환 부분은 주로 검출가능한 신호 수준을 만드는데 필요하다. 이러한 필요에 따라서, 순환기, 증폭 챔버 및 피드백 제어를 매우 정확한 온도 수준 또는 속도로 조절할 수 있다. 또한, 적절하게 한정된 콤팩트형 2차 증폭 부피에 의해 고도로 민감한 광학적 설정에 이르게 된다. 이 원리를 도 1 에서 설명한다.
이 방법은 바람직하게는 PCR-법을 기반으로 하지만, 또한 선형 또는 지수함수적 핵산 증폭 방법과 같은 기타 방법을 사용할 수 있다. 지수함수적 증폭 방법이 업계에 주지되어 있다. PCR (US 4,683,202) 및 LCR (US 5,185,243, US 5,679,524 및 US 5,573,907) 같은 방법이 특히 적합하고, 여기서 반응 혼합물은 반 복적으로 상이한 온도를 겪게 된다 (열순환).
샘플의 양, 1차 및 2차 열순환의 횟수 및 길이는 구체적인 목적 및 사용하는 증폭 방법에 따른다. 샘플의 1차량은 전형적으로는 그 부피가 5 ㎕ 내지 200 ㎕, 바람직하게는 5 ㎕ 내지 50 ㎕ 이다. 증폭 반응을 수행하는데 필요한 추가의 시약은 1차 증폭 챔버에서 건조 형태로, 예를 들어, 침전물로서 샘플에 첨가될 수 있고, 이 침전물은 샘플의 첨가에 의해 가용화된다. 이러한 시약은 또한 용액으로, 전형적으로는 2.5 내지 100 ㎕ 의 부피, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 25 ㎕ 의 부피로 첨가될 수 있다. 이어서, 1차 증폭 챔버에서 샘플을 수 회 1차 열순환시키며, 이는 전형적으로는 3 내지 15 회의 열순환, 더욱 바람직하게는 5 내지 8 회이다. 열순환의 길이는 상이한 증폭 방법 간에 매우 다양하다. PCR 에 있어서는, 전형적으로는 20 초 내지 5 분, 더욱 바람직하게는 20 내지 120 초로 다양하다. 이 단계에서 바람직하게는 통합 가열 및 냉각 속도가 2 켈빈/초 이상, 더욱 바람직하게는 4 내지 7 K/s 인 증폭 챔버를 사용한다.
각각의 통합 가열/냉각 속도는 하나의 온도 수준에서 다음 온도 수준으로 바뀌는데 필요한 시간으로 나눈 온도 단계로서 기재될 수 있다. 이것은 더 빠른 PCR 프로토콜을 유도할 수 있는, 열순환기 기계 내의 관련 변수이다. 전형적으로는 이러한 단계는 95 ℃ 에서 60 ℃, 60 ℃ 에서 72 ℃ 및 72 ℃ 에서 95 ℃ 이다. 따라서, 본 발명의 내용 중 통합 가열 및 냉각 속도는 대략 60 ℃ 내지 95 ℃ 의 온도 범위 내의, 주어진 증폭 챔버 및 주어진 반응 부피의 속도로서 이해된다. 상기 통합 가열 및 냉각 속도는 가열 및 냉각을 위해 열순환기에 사용되는 수단 뿐만 아니라 증폭시킬 반응 혼합물의 부피를 결정하는 증폭 챔버의 크기에 의해 영향을 받는다. 증폭 챔버의 부피가 작은 신속한 열순환기를 이용하면 순환운동 시간이 짧다. 알루미늄 블록이 적재된 펠티어 (Peltier) 기술 기반의 통상적인 열순환기 (Applied Biosystem 9700) 는 전형적으로는 통합 증가 속도가 2-3 K/s 미만이고, 따라서, 단독으로는 본원에서 목적하는 발상의 완전한 이득을 주지 않는다. LightCycler 또는 고성능 펠티어 소자가 장착된 기계처럼 5-6 K/s 의 가열 및 냉각 속도를 내는 열순환기로는, 기본적인 이득을 볼 수 있다. 특히 냉각율에 있어서 증가 속도가 10 K/s 를 초과하는 열순환기를 사용하면 더 많은 이득이 달성가능하다.
이어서, 2차 증폭 챔버에서 상기 1차량의 반응 혼합물의 일부량을 수 회 2차 열순환시켜 2차 반응 혼합물의 2차량을 제조한다. 상기 1차량의 반응 혼합물의 상기 일부량의 부피는 전형적으로는 그 부피가 0.05 내지 5 ㎕, 더욱 바람직하게는 0.1-2 ㎕ 이다. 전형적으로는 상기 반응 혼합물의 일부량을 50 회 미만 열순환, 더욱 바람직하게는 20-40 회 열순환시킨다. 상기 1차량의 반응 혼합물의 상기 일부량의 부피가 작을수록 상기 2차 증폭 챔버의 통합 가열 및 냉각 속도는 더 커지고 (5 K/s 이상, 바람직하게는 8 내지 12 K/s) 열순환의 길이는 1차 라운드 증폭에서의 열순환의 길이 미만일 수 있고, 보통 5 - 30 초로 다양하다.
샘플은 인간, 동물 및 그외의 자연으로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 특히 진단적 접근법에서의 샘플로는 혈액, 혈청, 혈장, 골수, 조직, 타액, 늑막 및 복막 일출 및 부유, 소변, 정액 및 대변이 있다.
바람직하게는, 증폭시키기 전에 샘플로부터 핵산을 정제하여 다소 순수한 핵산 샘플을 증폭 반응에 첨가할 수 있다. 핵산 정제 방법은 업계에 주지되어 있다. [Sambrook et al (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Coldspring Harbour Laboratory Press (1989))] 에 기재되어 있는 바와 같은 힘든 방법 이외에, 또한 시판 키트를 상기 목적에 이용할 수 있다 (예를 들어, MagNAPure® Roche Diagnostics).
따라서 본 발명에 따른 샘플은, 특히 샘플에 존재하는 핵산의 추가의 정제가 필요하지 않은 경우, 공여체로부터 직접 유래된 샘플 뿐만 아니라 공여체 샘플로부터의 핵산 제제를 포함하는 정제 샘플일 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 샘플에 존재하는 핵산의 정제가 바람직하게는 상기 장치의 1차 증폭 챔버에 통합되어 있는, 상기 기재한 바와 같은, 샘플로부터 핵산을의 제조하고/하거나 검출하는 방법에 관한 것이다. 핵산 증폭 반응을 수행하는데 사용한 것과 동일한 반응 챔버에서 샘플에 존재하는 핵산을 정제시키는 장치 및 방법은 업계에 공지되어 있다. 예를 들어 WO 03/106031 에는 샘플에 존재하는 핵산을 포착하는데 유리 솜과 같은 결합 매트릭스를 사용하는 통합 장치가 기재되어 있다. 샘플 제조 후, 핵산 샘플 제조에 사용한 동일한 반응 챔버에서 증폭 반응을 수행할 수 있다. 이같은 접근법은 본 발명의 방법 및 장치와 병합될 수 있다. 샘플의 핵산을 정제시킬 수 있고, 이것을 수 회 1차 열순환시켜 장치의 1차 증폭 챔버 내에 1차 반응 혼합물의 1차량을 제조할 수 있다. 이어서, 상기 1차 반응 혼합물의 분취량을 수 회 2차 열순환을 위해 2차 증폭 챔버로 옮겨 2차 반응 혼합물의 2차량을 제조할 수 있다. 이같은 방법 및 장치에는 수 가지의 예기치 않은 장점이 있다. 우선, 이미 기재한 바와 같이, 2차 증폭 단계는 더 작은 반응 부피에 기인하여 열순환운동이 훨씬 더 빨라진다. 두 번째로, 샘플의 핵산이 여전히 부분적으로는 샘플 제조에 사용한 결합 매트릭스에 결합되어 있고, 상기 매트릭스로부터 완전히 용리되지 않은 경우에도, 수 회의 1차 열순환 도중에 상기 결합 매트릭스가 존재하기 때문에 이러한 핵산을 여전히 증폭시킬 수 있다. 그리고 세 번째로, 상기 결합 매트릭스가 증폭 반응을 어느 정도로 저해하는 경우, 반응을 수 회 2차 열순환시킬 때는, 수 회의 2차 열순환을 수행하는데사용하는 1차 반응 혼합물의 분취량이 상기 결합 매트릭스와 더 이상 접촉하지 않기 때문에, 이런 저해 효과는 더 이상 존재하지 않는다.
열순환은 한정된 시간 주기 동안 반응 혼합물에 행하는, 두 개 이상의 일련의 온도로서 정의된다. 이런 열순환은 반복될 수 있다. PCR 법에서는 보통 3 개의 상이한 온도를 사용한다. 대략 45 - 70 ℃ 에서, 프라이머를 표적 핵산에 어닐링시킨다. 대략 72 ℃ 의 온도에서, 표적에 결합된 프라이머를 열안정성 중합효소에 의해 신장시키고, 이어서, 대략 90 - 100 ℃ 에서, 이중-가닥 핵산이 분리된다. PCR 법에서는, 이런 열순환을 보통 대략 30 내지 50 회 반복한다. 반응 혼합물 내의 온도를 바꾸는데 필요한 시간은 주로 반응 용기의 부피 및 모양에 따르고, 보통 수 분에서 1 초의 몇 분의 1 까지 다양하다.
1차 반응 혼합물의 일부량을 수 회 2차 열순환시키기 전에, 이런 반응 혼합물의 일부량을 2차 증폭 챔버로 옮기는 것이 바람직하다. 이는 피펫을 이용함 으로써 수동으로 행해질 수 있다. 그러나, 오염 위험성의 관점에서, 이것이 예를 들어 펌프 및 밸브에 의해 장치 내에서 자동화되는 경우가 바람직하다. 1차 및 2차 증폭 챔버는 도관, 밸브, 소수성 장벽 및 기타 수단에 의해 서로 분리될 수 있다. 이같은 통합 장치에 있어서의 기술적인 수단은 전문가에게 공지되어 있다 (예를 들어 Lee et al., J. Micromech. Microeng. 13 (2003) 89-97; Handique et al., Anal. Chem. 72 4100-9; Hosokawa et al., Anal. Chem. 71 4781-5, Puntambekar et al., Proc. Transducers'01 (Berlin: Springer) pp 1240-3, Zhao et al., Science 291 1023-6; Andersson et al., Sensors Actuators B 75 136-41 참고).
1차 및 2차 증폭 반응 챔버가 두 반응 혼합물이 물리적으로 분리되지 않는, 하나의 비분리 반응 챔버 내의 두 구획인 것도 한 가지 옵션이다. 그러나, 이런 경우 특히 1차 및 2차 반응 구획 내에서 제조된 증폭 핵산에 대하여, 수 회의 2차 열순환을 수행하는 경우, 반응 생성물의 확산을 방지하고/최소화시키는 것이 필요하다. 이는 예를 들어 고체상 결합 프라이머에 의한 수 가지의 수단에 의해 달성될 수 있다.
1차 및 2차 증폭 챔버 사이에 도관이 놓인 경우, 두 챔버 사이의 확산이 최소화되는 경우에는 밸브, 벤트 (vent), 소수성 장벽에 의한 물리적 분리를 피할 수 있다.
반응 혼합물은 정선한 증폭 방법을 수행하는데 필요한 모든 성분을 포함한다. 보통, 이들은 증폭시킬 표적 핵산의 특이적 결합을 허용하는 프라이머, 중 합효소, 역전사효소 등과 같은 효소, 삼인산 뉴클레오티드, 완충액, 마그네슘과 같은 1 및 2가 양이온이다. 상기 성분들은 증폭 방법에 따르고, 전문가에게 주지되어 있다.
1차 및 2차 반응 혼합물에서 제조된 핵산 생성물은 업계에 공지되어 있는 절차에 의해, 예를 들어, 아가로스 겔에서 생성물의 길이를 검출함으로써 검출될 수 있다. 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용함으로써, 예를 들어 서던 (Southern) 또는 닷 (dot) 블랏 (blot) 기술을 수행함으로써, 더 나은 수준의 특이성을 달성할 수 있다. 동차 증폭 및 검출 방법에서는, 검출 탐침 또는 기타 검출 수단이 증폭 핵산의 생성 도중에 반응 혼합물에 이미 존재한다. EP 0 543 942 에 기재된 방법에서는, 프라이머를 신장시킬 때의 가공 중합효소에 의해 탐침이 분해된다. 보통 주지된 표식을 검출에 사용할 수 있다. 예로는 플루오레세인, 로다민 등과 같은 형광 표식이 있다.
따라서, 본 발명의 한 가지 측면은 하기 단계를 포함하는, 샘플 내의 주형 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양을 검출하는 방법에 관한 것이다:
a) 1차 증폭 챔버 내에서, 상기 샘플의 1차량을 수 회 1차 열순환시켜 반응 혼합물의 1차량을 제조하는 단계,
b) 2차 증폭 챔버 내에서, 상기 1차 반응 혼합물의 일부량을 수 회 2차 열순환시켜 2차 반응 혼합물의 2차량을 제조하는 단계, 및
c) 측정할 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양의 척도로서 핵산의 형성을 측정하는 단계,
여기서 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 바람직하게는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작다. 통합 가열 및 냉각 속도는 바람직하게는 단계 a) 에서는 2 켈빈/초 (K/s) 이상이고 단계 b) 에서는 그것을 초과하며, 바람직하게는 5 K/s 이상이다.
핵산의 형성은 단계 a) 및 b) 의 완료 후, 또는 상기 증폭 단계 a) 및/또는 b) 도중에 측정될 수 있다.
1차 반응 혼합물의 일부량을 2차 증폭 챔버로 옮길 때, 보통 추가의 반응 성분을 첨가하지는 않는다. 이는 적어도 자동적으로 행해질 때, 반응 챔버를 어떤식으로는 개방시킬 필요가 없고, 오염 위험성도 피하게 된다. 그러나, 특이적 용도를 위해서는, 추가의 시약을 첨가하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 중복 (nested) PCR 프로토콜을 수행할 때의 추가의 프라이머, 또는 특정 증폭 생성물을 검출하는 추가의 탐침을 첨가하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 시약은 수동으로 첨가할 수 있지만, 또한 반응 이전에 액체 또는 고체 형태로 반응 장치 내에 저장되어 있고, 1차 반응 혼합물의 일부량을 2차 증폭 챔버로 옮길 때 혼합될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 이러한 시약, 특히 프라이머 및 탐침은 고체상에 결합되어 있다.
1차 반응 혼합물의 단지 일부량만을 2차 반응 혼합물을 제조하는데 사용하기 때문에, 원칙적으로는 1차 반응 혼합물로부터 복수의 2차 반응 혼합물이 유도될 수 있다. 이로써 1차 반응 혼합물의 하나를 초과하는 일부량을 수 회 2차 열순환시키는 것, 및 이에 의해 다중 반응 프로토콜이 허용된다. 이는 가장 간단한 경우로는 본 방법에서 수득되는 결과를 만족시키는 동일한 혼합물의 병행 반응일 수 있다. 상이한 프라이머 및/또는 탐침을 1차 반응 혼합물의 일부량에 첨가하는 경우, 예를 들어 표적의 상이한 대립유전자를 검출하기 위한 실제 다중 검출법이 가능하다.
본 발명의 방법에 적절한 장치를 실시예 3 에 기재한다. 상기 이미 논의한 바와 같이, 본 발명의 방법은 특정 장치에 제한되지는 않는다. Applied Biosystems 9700'er 시스템 및 LightCycler (Roche Diagnostics) 와 같은 시판되는 열순환기를 이용하여 수동으로 수행할 수 있다. 그러나, 이런 방법은 예를 들어, Micro Total Analysis Systems, Proceedings uTAS'94, A van den Berg, P Berveld, 1994; Integrated Microfabricated Biodevices, M J Heller, A Guttman, 2002; microsystem Engineering of Lab-on-a-Chip devices, O Geschke, H Klank, P Tellemann, 2004; US 2003/0152492 및 US 5,639,423 에 기재되어 있는 바와 같은 기술을 기반으로 한 기능적으로 통합된 장치에 특히 적합하다. 이같은 장치에는 보통 반응 챔버 사이에 샘플을 수송하는 자동화 액체 수송기, 열순환운동용 수단, 장치에 미리 적재되어 있거나 자동적으로 첨가될 수 있는 시약, 및 반응 생성물 검출용 수단이 있다. 반응은 컴퓨터 매체들 및 제어용 컴퓨터 프로그램에 의해 제어된다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 하기를 포함하는, 주형으로부터 핵산을 제조하기 위한 진단 장치이다:
- 1차 증폭 챔버, 및
- 2차 증폭 챔버,
여기서 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 바람직하게는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작다. 통합 가열 및 냉각 속도는 바람직하게는 단계 a) 에서 2 켈빈/초 (K/s) 이상이고, 단계 b) 에서는 그것을 초과하며, 바람직하게는 5 K/s 이상이다.
2차 증폭 챔버의 부피의 크기가 작을수록 각각의 열순환에 필요한 시간이 감소된다. PCR System 9700 (Applied Biosystems) 과 같은 표준 열순환기에서, 증폭 챔버의 부피의 크기는 바뀌지 않고, 또한 가장 흔하게는 열순환운동에 금속 블록을 사용하는데 이는 열순환에 필요한 시간을 수 분 미만으로 감소시키지 않는다. 따라서, 증폭 반응의 분취량을 취하고, 2차 증폭 반응에 LightCycler 와 같은 더 빠른 열순환기를 이용하면 분석의 민감도를 감소시키지 않으면서 전체 반응 시간이 감소된다.
본 발명의 진단 장치에 적합한 증폭 챔버는 근본적으로 종래 기술에 공지되어 있다. 이러한 챔버는 반응 혼합물을 포함하기 위한 공간을 제공한다. 이런 챔버는 예를 들어 Perkin Elmer 9700er 기계와 같은 열순환기의 금속 블록 내의 뚫린 구멍 또는 LightCycler 기계 속에 놓일 수 있는 유리 모세관의 내용적에 맞는 벽이 얇은 플라스틱 튜브일 수 있다. 증폭 챔버의 부피는 반응에 사용할 수 있는 반응 혼합물의 최대 부피에 의해 한정된다.
반응 혼합물은 예를 들어 펠티어- 또는 저항-가열 요소와 같은 가열 요소를 사용함으로써 가열할 수 있다. 냉각에 있어서는 능동 냉각 요소 또는 수동 냉각 요소, 예컨대 가열 싱크를 사용할 수 있다. 증폭 챔버 내에 포함되어 있는 반응 혼합물에 가열 및 냉각을 수행하는데 있어서 수 개의 수단이 공지되어 있다. 다수의 통상의 열순환기에 있어서, 증폭 챔버를 포함하는 금속 블록을 반응 혼합물에 가열 및 냉각을 제공하는데 사용한다. LightCycler 형식에서는, 유리 모세관 주위를 흐르는 고온의 공기 흐름이 이런 기능을 제공한다.
본 발명의 진단 장치는 상기 기재한 바와 같은 두 개 이상의 증폭 챔버를 가진다. 이러한 챔버는 하나의 기계 내에 위치할 수 있거나 두 개의 상이한 기계에 분리될 수 있고, 이에 의해 1차 반응 혼합물의 분취량을 2차 증폭 챔버로 옮기는 것은 수동으로 피펫에 의해서 행해질 수 있거나, 바람직하게는 자동화될 수 있다. 본 발명에 따른 기구에는 상기 장치가 포함될 곳이 있다. 이것은 또한 챔버를 가열 및 냉각시키고, 바람직하게는 또한 열순환 도중 증폭 순환의 온도를 제어하는 수단, 바람직하게는 하기 기재하는 바와 같은 컴퓨터 프로그램이 탑재된 제어용 도구를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 열순환을 이용하여 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 방법을 제어하는 컴퓨터 프로그램에 있어서, 샘플에 수 회의 1차 열순환을 적용하고, 이어서 동일한 샘플로부터 유래한 상이한 부피의 반응 혼합물에 순환운동 시간이 더 짧은 수 회의 2차 열순환을 적용하도록 설정되어 있는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 프로그램이다. 본 발명의 더욱 바람직한 측면은 상기 기재한 바와 같은 핵산 제조 방법 제어용 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다.
이같은 컴퓨터 프로그램은 물리적 저장 수단, 예컨대 디스켓 또는 CD 에 저장될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 하기를 포함하는, 핵산 제조용 기구이다:
- 열순환기, 및
- 열순환기 제어용 도구,
여기서 열순환기 제어용 도구는 상기 기재한 바와 같은 컴퓨터 프로그램이 탑재되어 있다. 이런 열순환기는 바람직하게는 상기 기재한 바와 같은 진단 장치이다.
샘플을 수 회의 1차 열순환 후, 반응 혼합물의 일부량을 수 회 2차 열순환시키는 본 발명의 방법, 장치 및 컴퓨터 프로그램에 따르면, 이러한 두 단계 증폭 방법에 의해서, 검출 한계에 영향을 미치지 않으면서, 주형 핵산으로부터 핵산을 제조하는 전체 반응 시간이 단축된다.
본 발명을 하기 실시예에 추가로 기재한다:
실시예
실시예 1
최적화 PCR 프로토콜
입방형 반응 챔버에서 100 ㎕ PCR 반응을 수행하는데 있어서, 다음과 같은 의문이 생겼다: 최적화 분취량 PCR 법에서 100 ㎕ 부피에서는 얼마나 많은 순환을 수행해야 하며, 몇 회의 순환 후에 어떤 크기의 분취량을 2차 반응 챔버에 첨가하여야 검출 한계를 바꾸지 않고 민감도를 잃지 않으면서 최소 시간으로 반응이 수행 되는가. 100 ㎕ 부피에서 전형적인 PCR 순환은 약 130 초가 필요하다. 최적의 PCR 반응에서, 증폭되는 핵산의 양은 순환 당 약 두 배가 된다. 따라서, n 회 순환 후에 1차 반응 부피의 1/2n 을, 수 회 2차 열순환시킬 일부량으로서 사용할 수 있고, 이는 더 작은 부피에 기인하여 훨씬 더 빨리 순환될 수 있다. 짧아진 열순환에 필요한 정확한 시간은 한편으로는 온도 프로파일에 의해 및 다른 한편으로는 열 확산 거리에 의해 한정된다. 실제상의 계산에 있어서, 가열되는 부피는 모양이 입방형이며, 단일 벽을 통해 열 원/싱크와 접촉되어 있다고 가정한다. 열 확산에 기인하여 이런 단일 벽으로부터 물을 통해 균질 온도 분포에 도달하는데 PCR 도중의 대부분의 시간이 소비된다. 열 확산 시간은 입방형 부피의 면 길이의 제곱에 비례하고, 따라서 부피가 인수 2 만큼 감소하면 확산 시간은 인수 22/3 만큼 감소한다. 게다가, 열순환은 전형적으로 50 회 실행한다고 가정한다.
이런 계산의 결과를 도 2 에 나타낸다. 50 회 길이의 열순환을 수행하는 경우, 반응 시간은 110 분이 된다. 본 발명의 방법을 적용함으로써, 이는 민감도를 잃지 않으면서 20 분 이하로 짧아질 수 있다. 나타낸 바와 같이, 5 내지 8 회의 열순환 후에 1차 반응 혼합물의 분취량을 취하고, 이 일부량에 남은 열순환을 행하는 것이 최적일 것이고, 이는 더 작은 부피에 기인하여 더 빨리 수행될 수 있다. 1차 열순환의 횟수에 따라, 2차 반응에는 3.2 내지 0.4 ㎕ 를 사용한다. 상기 크기의 반응 부피가 증폭된 핵산을 형광 검출과 같은 표준 검출법으로 검 출하는데 꽤 적합하다는 것을 추가로 언급해야 한다.
이 계산은 어떤 추정, 예컨대 순환 당 표적 핵산의 배증 (실제 실험에서 달성하기는 어려움) 에 기초하지만, 이는 본 발명의 장점을 잘 예증해준다.
실시예 2
도 3 은 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 두 개의 증폭 챔버 및 열순환기 요소가 있는 장치의 도식을 나타낸다. 두 개의 챔버는 소수성 밸브로서 이행될 수 있는 좁다란 부분을 통해 물리적으로 접촉되어 있다. 이런 수단에 의해 2차 증폭 챔버는 1차 증폭 챔버가 채워질 때 동시에 채워지지는 않는다. 수 회의 열순환 후, 1차 반응 혼합물의 분취량을 예를 들어 상기 장치를 회전시키거나 정수압을 적용하여 2차 증폭 챔버로 옮긴다.
실시예 3
도 4 는 튜브의 상부가 넓어지는 좁다란 튜브를 특징으로 하는, Light-Cycler® 튜브의 변형을 묘사한다. 넓은 부분 및 좁다란 부분은 소수성 부분 (밸브) 에 의해 서로 분리되어 있다. 튜브의 상부 반쪽에서의 몇 회의 1차 순환을 실행시킨 후, 분취량이 튜브의 하부 부분으로 회전하면서 내려가고 이제 순환운동 프로파일이 훨씬 더 빨라진다. 이는 물론 순환운동 프로그램에서 원심력 단계를 허용하기 위해서 기계의 어떤 개조를 필요로 한다. 그러나 이런 원심력 단계는 또한 본 Light-Cycler® 장치의 개조를 요하지 않으면서 시판되는 원심기를 사용하여 수행할 수 있다.
실시예 4
도 5 는 더 큰 반응 부피로 수 회의 1차 열순환을 수행하고 상기 1차 반응 혼합물의 하나를 초과하는 일부량을 수 회 2차 열순환시키고, 그리하여 다중 반응법이 허용되는 하나의 반응 챔버를 가지는 디스크-모양의 장치의 도식을 나타낸다. 이런 경우, 디스크 장치를 회전시키고 원심력을 적용하여 반응액을 이동시킬 수 있지만, 또한 공기압력, 진공 등과 같은 다른 방법을 사용할 수 있다. 보통 예를 들어 밸브, 소수성 벤트 등에 의해 1차 및 2차 반응 챔버 사이의 액체 접속을 가역적으로 방지하는 것이 타당하다. 그러나, 상기에 이미 약술한 바와 같이, 확산이 최소화된 경우, 반응 구획이 두 개이고, 그리하여 2차 구획을 더 빠른 순환운동에 사용할 수 있는 하나의 반응 챔버를 사용하는 것이 또한 가능하다. 증폭된 핵산의 확산을 최소화시키는 것은 예를 들어 프라이머 및/또는 탐침을 고체상에 결합시킴으로써 달성할 수 있다.
도 1 은 본 발명의 숨겨진 원리를 설명한다. 2차 단계에서 반응 부피를 감소시킴으로써, 검출 한계 (LOD) 를 바꾸지 않으면서, 필요한 반응 시간을 감소시킬 수 있다.
도 2 는 최적화된 분취량-증폭법의 계산결과를 나타낸다.
도 3 은 기재하는 핵산 제조 방법을 수행하는데 유용한, 두 개의 증폭 챔버를 포함하는 열순환 장치를 나타낸다.
도 4 는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 일회용 모세관을 나타낸다 (또한, 실시예 3 참고)
도 5 는 기재하는 핵산 제조 방법을 다중 형식으로 수행하는데 적절한 장치를 나타낸다 (또한, 실시예 4 참고).

Claims (16)

  1. 하기를 포함하는, 주형으로부터 핵산을 제조하기 위한 장치:
    a. 1차 증폭 챔버, 및
    b. 2차 증폭 챔버,
    여기서 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작음.
  2. 하기를 포함하는, 주형으로부터 핵산을 제조하기 위한 장치:
    a. 통합 가열 및 냉각 속도가 2 K/s 이상인 1차 증폭 챔버, 및
    b. 통합 가열 및 냉각 속도가 상기 1차 증폭 챔버의 것을 초과하며 5 K/s 이상인 2차 증폭 챔버,
    여기서 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작음.
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 통합 가열 및 냉각 속도가 상기 1차 증폭 챔버에서는 4 내지 7 K/s 이고, 상기 2차 증폭 챔버에서는 8 내지 12 K/s 인 장치.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 1차 증폭 챔버의 상기 1차량의 부피가 5 내지 200 ㎕ 의 부피인 장치.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 2차 증폭 챔버의 부피가 0.05 내지 5 ㎕ 의 부피인 장치.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 1차 증폭 챔버가 또한 증폭 전에 샘플에 존재하는 핵산의 정제를 허용하는 것인 장치.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 1차 증폭 챔버로부터 상기 2차 증폭 챔버로 액체를 수송하는 수단이 있는 장치.
  9. 하기를 포함하는, 핵산의 형성을 검출하여 주형 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양을 측정하기 위한 장치:
    a. 1차 증폭 챔버, 및
    b. 2차 증폭 챔버,
    여기서 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작음.
  10. 하기를 포함하는, 핵산의 형성을 검출하여 주형 핵산의 존재 또는 부재 또는 그 양을 측정하기 위한 장치:
    a. 통합 가열 및 냉각 속도가 2 K/s 이상인 1차 증폭 챔버, 및
    b. 통합 가열 및 냉각 속도가 상기 1차 증폭 챔버의 것을 초과하며 5 K/s 이상인 2차 증폭 챔버,
    여기서 상기 2차 증폭 챔버의 부피는 상기 1차 증폭 챔버의 부피보다 작음.
  11. 삭제
  12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 통합 가열 및 냉각 속도가 상기 1차 증폭 챔버에서는 4 내지 7 K/s 이고, 상기 2차 증폭 챔버에서는 8 내지 12 K/s 인 장치.
  13. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 1차 증폭 챔버의 상기 1차량의 부피가 5 내지 200 ㎕ 의 부피인 장치.
  14. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 2차 증폭 챔버의 부피가 0.05 내지 5 ㎕ 의 부피인 장치.
  15. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 1차 증폭 챔버가 또한 증폭 전에 샘플에 존재하는 핵산의 정제를 허용하는 것인 장치.
  16. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 1차 증폭 챔버로부터 상기 2차 증폭 챔버로 액체를 수송하는 수단이 있는 장치.
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