CN101988132A

CN101988132A - 检测b亚群禽白血病的环介导等温扩增反应引物

Info

Publication number: CN101988132A
Application number: CN 201010528615
Authority: CN
Inventors: 王笑梅; 王永强; 高宏雷; 高玉龙; 秦立廷; 祁小乐
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2010-11-01
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2030-11-01
Also published as: CN101988132B

Abstract

本发明公开了检测B亚群禽白血病的环介导等温扩增反应引物，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，外引物由引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成；内引物由引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成；环引物由引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成。本发明选取禽白血病病毒gp85区段设计B亚群LAMP引物，根据所设计引物，建立了ALV-B分型LAMP检测方法，该检测方法不与禽白血病其它主要亚群发生交叉反应，同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。本发明检测方法方便准确，现地适用性好，准确性高、特异性强、灵敏度高。

Description

检测B亚群禽白血病的环介导等温扩增反应引物

技术领域

本发明涉及环介导等温扩增反应引物，尤其涉及检测B亚群禽白血病的环介导等温扩增反应引物，属于B亚群禽白血病的检测领域。

背景技术

B亚群禽白血病由B亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus-B，ALV-B)引起，主要造成淋巴细胞性白血病和肉瘤。20世纪70年代，Graf等和Kawai等分别报道过B亚群禽白血病。1987年以后，国际大型种鸡公司已基本实现了ALV净化，此后少有B亚群白血病的病例报道。但2000年以后，又出现了B亚群自然感染的报道。Spencer等从商品鸡群中同时检测到ALV-A和ALV-B。Gingerich等在白来航鸡群中发现J和B亚群的重组病毒，该病毒的LTR为J，囊膜基因为B。Mays等也报道了相似类型的B/J亚群重组病毒。Lupiani等在观测到髓细胞增生表现的商品蛋鸡群中分离到一株重组病毒，该病毒具有B亚群的gp85区段，E亚群的gp37区段和J亚群的LTR。B亚群的再次流行以及与其它亚群的共感染或重组现象值得科研人员关注。但目前对B亚群的分型检测方法相对较少，商品化的抗体检测试剂盒不能与A亚群区分。对B亚群病毒抗原的检测主要是利用PCR方法，扩增gp85的特异性区段。因此，建立B亚群的分型检测方法十分必要。

2000年日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增反应(LAMP)，其特点是针对靶基因的6(或8)个区域设计4(或6)种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15-60min扩增10⁹-10¹⁰倍，具有不需要特殊仪器、快速、特异性强的特点，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定。

采用LAMP方法鉴别检测B亚群禽白血病的前提和关键是需要根据禽白血病亚群间序列特征，设计得到B亚群LAMP引物。

发明内容

本发明的目的是根据禽白血病亚群间序列特征，提供一组用于检测B亚群禽白血病的环介导等温扩增反应(LAMP)引物；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一组检测B亚群禽白血病病毒的环介导等温扩增反应(LAMP)引物，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，外引物由引物SEQ ID NO.1(F3)和SEQ ID NO.2(B3)组成；内引物由引物SEQ ID NO.3(FIP)和SEQ IDNO.4(BIP)组成；环引物由引物SEQ ID NO.5(LF)和SEQ ID NO.6(LB)组成。

本发明根据禽白血病亚群间序列特征，选取禽白血病病毒gp85区段设计B亚群LAMP引物。根据所设计的B亚群LAMP引物，本发明建立了ALV-B的分型LAMP检测方法。本发明所建立的分型LAMP检测方法不与禽白血病其它主要亚群发生交叉反应，同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。本发明所建立的ALV-B分型LAMP检测方法，方便准确，现地的适用性好，准确性高、特异性强、灵敏度高。

敏感性试验表明，本发明检测方法在80分钟内能够检测出400个拷贝的病毒核酸，比常规PCR敏感10倍。本发明建立的ALV-B的分型LAMP检测方法可以区分A、J、C、E亚群。其结果可以通过明显的颜色变化进行判断，整个反应过程不需要开盖，极大地减少了污染的可能性，可应用于B亚群禽白血病的分型检测，利用该技术特异、灵敏、快速及可视化的优势，为该病的临床检测提供帮助，具有临床应用的前景。

为了避免与其它亚群发生交叉反应，本发明所建立的分型LAMP检测方法将反应温度提高为67℃，使Bst聚合酶的活性受到一定的影响；本发明方法将反应时间延长到80min，能够检出400个拷贝的病毒核酸，比常规PCR敏感10倍。在本发明中，加入了荧光染料FDR。该染料能够在反应液配制时加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定。这样便极大地降低了污染的可能性，提高了该方法在现地的适用性。

附图说明

图1ALV-B LAMP与其它亚群的区分；1：ALV-J；2：ALV-A；3：ALV-B；4：ALV-C；5：ALV-E。

图2ALV-B LAMP方法的特异性试验；1：ALV-B；2：AIV；3：NDV；4：IBV；5：IBDV；6：MDV；7：CAV；8：REV。

图3ALV-B LAMP方法与常规PCR检测方法的敏感性比较；M：DL2000 1：4*10⁵质粒；2：4*10⁴质粒；3：4*10³质粒；4：4*10²质粒；5：4*10¹质粒；6：H₂O。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1材料与方法

1.1病毒

J亚群禽白血病HPRS-103株、A亚群禽白血病RAV-1株、B亚群禽白血病RAV-2株、C亚群禽白血病RAV-49株、E亚群禽白血病RAV-0株、鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株、鸡传染性贫血病病毒(CAV)M9905株、禽网状内皮组织增生病病毒HLJR0901株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组保存(上述毒株可从中国兽医药品监察所购买得到)。禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相应课题组馈赠(上述毒株也可从中国兽医药品监察所购买得到)。

1.2ALV-B LAMP引物的设计

对GenBank中的B亚群禽白血病病毒序列进行比对，同时比较其它亚群的相应区域，选取gp85区段进行引物设计。利用在线软件Primer Explorer V4software(https://primerexplorer.jp)设计LAMP引物(包括一对外引物F3，B3；一对内引物FIP，BIP；一对环引物LF，LB)见表1。

表1检测B亚群禽白血病病毒的LAMP引物的名称、序列和位置

1.3前病毒DNA的提取

研磨病料，12000rpm离心2min，吸取上清100μL。加入2倍体积(200μL)的盐酸胍裂解液，振荡，室温静止10min。加入等体积(300μL)的苯酚：氯仿：异戊醇混合液，混匀，12000rpm离心5min。取上清移至新的EP管中，重复抽提两次。将上清转移至新的EP管中，加等体积的异丙醇沉淀DNA，13000rpm离心15min，吸去异丙醇后，加入200μL 70％异丙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃液。室温干燥，用30μL无DNase的水重悬沉淀。立即使用或-20℃保存备用。

1.4阳性质粒标准品的制备

同时利用引物H5(5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’，Smith et al.，1998)和B3扩增B亚群前病毒DNA获得726bp的目的片段，TA克隆至pMD18-T载体(TaKaRa公司)，转化感受态细胞DH5α，提取质粒，测序验证后作为ALV-BLAMP的质粒标准品ALV-Bgp85a。用紫外分光光度计测其OD₂₆₀，换算成摩尔浓度后，-20℃保存，用前稀释。

1.5ALV-B LAMP反应温度及反应时间的筛选

用Loopamp DNA amplification kit(Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan)进行LAMP反应。每25μL的反应体系中含有：12.5μL的ReactionMix.，1μL的Bst DNA Polymerase，FIP和BIP各1.6μM，LF和LB各0.8μM，F3和B3各0.2μM，1μL的fluorescent reagent FDR(Eiken ChemicalCo.，Ltd，Tokyo，Japan)，以质粒标准品ALV-Bgp85a为模板，不同温度(61℃、63℃、65℃、67℃)、不同时间(45min、60min、90min、120min)检测引物的反应性能。利用Loopamp Realtime Turbidimeter LA-320C(Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan)检测浊度值，确定反应温度及反应时间。

1.6特异性试验

取等体积的ALV-B、ALV-J、ALV-A、ALV-C、ALV-E、AIV、NDV、IBV、IBDV、MDV、CAV、REV样品提取病毒DNA(或RNA)进行LAMP反应，检测ALV-B LAMP是否与其它亚群及其它禽类常见传染病病原发生交叉反应。并重复一次。

1.7敏感性试验

对阳性质粒标准品ALV-Bgp85a进行10倍稀释，取4*10⁵至4*10¹五个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测的敏感度。同时以等量的ALV-Bgp85a为模板，进行常规的PCR反应，取扩增产物5μL，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，比较二者敏感性的差异。并重复一次。

1.8临床样品的检测

对本发明人实验室近两年搜集自黑龙江、吉林、辽宁、山东、内蒙古、宁夏、湖北的禽白血病疑似病料168份，按1.3方法提取DNA，进行LAMP与PCR的检测。

2实验结果

2.1ALV-B LAMP检测方法与ALV-J、ALV-A、ALV-C、ALV-E亚群的区分

如图1所示，用ALV-B LAMP对J亚群、A亚群、C亚群、E亚群禽白血病的检测均为阴性，而B亚群禽白血病有很好的扩增。说明B亚群禽白血病的LAMP检测方法能够成功地区分J、A、C、E亚群。此外，其结果在自然光下可以简单地通过明显的颜色区别进行判定。

2.2ALV-B LAMP检测方法的特异性

特异性试验结果表明(图2)，ALV-B LAMP检测方法不与禽流感、新城疫、传染性支气管炎病、传染性法氏囊病、鸡传染性贫血病、马立克氏病、网状内皮组织增生病发生非特异性反应。该方法具有良好的特异性。

2.3ALV-B LAMP检测方法的敏感性

以10倍稀释的ALV-B阳性质粒标准品为模板，确定ALV-B LAMP检测方法在80min内的最低检出限为400个拷贝的病毒核酸。其敏感度是常规PCR的10倍。

2.4临床检测

对168份组织病料的检测，ALV-B LAMP的阳性率为0.6％，PCR未检出阳性样品。

Claims

1.一组检测B亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus-B，ALV-B)的环介导等温扩增反应引物，其特征在于：由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，所述外引物由引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成；所述内引物由引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成；所述环引物由引物SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6组成。

2.权利要求1所述的环介导等温扩增反应引物在制备检测B亚群禽白血病的试剂中的用途。