CN115753714B - 一种生物传感器、核酸分子、表达载体及应用 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种生物传感器、核酸分子、表达载体及应用。本发明第一方面提供一种实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平的生物传感器,当亚细胞区室为细胞质时,生物传感器包括至少一种第一元件,当亚细胞区室为细胞器时,生物传感器包括至少一种第一元件和至少一种第二元件,第一元件为能够监测氧化还原物质并且能够将监测到的生物信号转换为电信号的生物传感元件,第二元件为能够在亚细胞区室内定位表达的定位蛋白元件。本发明提供的生物传感器能够实现酵母亚细胞区室内氧化还原物质的实时动态监测,有利于分析酵母亚细胞区室的氧化还原水平,为改善酵母胁迫抗逆性、提高生产性能提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器、核酸分子、表达载体及应用,涉及生物工程技术领域。
背景技术
酵母作为模式微生物,已被广泛用于生产各种大宗化学品、药品、材料和生物燃料。在工业发酵过程中,酵母经常受到环境因素或细胞代谢引起的各种胁迫,如活性氧(ROS)的累积和烟酰胺辅因子NAD(P)H供应不足,这些氧化还原状态的不平衡会导致细胞代谢水平的降低,抑制细胞的生长或生产。因此,细胞内氧化还原的稳态不仅是细胞鲁棒性的重要评价标准,还有助于找出关键因素并改造酵母细胞工厂以提高工业发酵性能。要实现酵母氧化还原状态平衡的调控,首先需要对细胞的氧化还原水平进行监测,但细胞内的氧化还原反应十分复杂,代谢物种类多,反应速度快,这些因素都对氧化还原水平的监测方法提出了更高的要求,既要能够实时快速的反映细胞内的氧化还原水平的变化,又不能影响细胞自身的生长和代谢。
申请号为202210272230.8的中国发明专利公开了一种感测谷胱甘肽GSH荧光探针,该荧光探针对含有巯基的氨基酸,尤其是GSH有专一的选择性,与其他常见氨基酸荧光信号基本没有变化,灵敏度高,监测限低,主要应用于GSH的体外监测。申请号为202010330739.4的中国发明专利公开了一种内质网靶向氧化还原可逆荧光探针,可实现对内质网中内源性和外源性次氯酸的荧光成像。相比上述化学探针,基因编码的生物传感器的监测效率更有优势,可进行实时体内原位监测。申请号为201910141231.7的中国发明专利公开了一种特异性监测多硫化合物的蛋白荧光探针,可实现活细胞和亚细胞器水平上的多硫化物的监测。
酵母作为普遍使用的真核细胞工厂,由于其良好的内源代谢网络以及细胞区室化,更适合许多异源产物的合成,细胞器通过提供合适的反应场所,可以促进某些特定产物的合成和储存,如番茄红素和甘草次酸,因此,实时对酵母亚细胞区室内的氧化还原水平进行实时监测,能够为改善酵母胁迫抗逆性,提高生产性能提供基础。
发明内容
本发明提供一种实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平的生物传感器,能够对酵母亚细胞区室内的氧化还原物质,尤其是对H2O2、GSSG、NADH和NADPH进行实时监测,为改善酵母胁迫抗逆性、提高生产性能提供基础。
本发明还提供编码上述生物传感器的核酸分子和包括该核酸分子的表达载体。
本发明还提供上述生物传感器在实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平方面的应用以及一种实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平的方法。
本发明第一方面提供一种实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平的生物传感器,所述生物传感器用于监测亚细胞区室内的氧化还原物质,所述氧化还原物质包括H2O2、GSSG、NADH和NADPH中的至少一种,所述亚细胞区室包括细胞器和/或细胞质,所述细胞器包括线粒体、内质网、细胞核中的至少一种;
当所述亚细胞区室为细胞质时,所述生物传感器包括至少一种第一元件,当所述亚细胞区室为细胞器时,所述生物传感器包括至少一种第一元件和至少一种第二元件;
所述第一元件为能够监测所述氧化还原物质并且能够将监测到的生物信号转换为电信号的生物传感元件,编码所述第一元件的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-4中的一种;
所述第二元件为能够在亚细胞区室内定位表达的定位蛋白元件,编码所述第二元件的核苷酸序列选自SEQ ID NO.5-7中的一种。
本发明中“细胞氧化还原水平”主要是指酵母细胞的活性氧(ROS)水平,H2O2是活性氧(ROS)的重要组成之一,GSSG、NADH和NADPH是酵母细胞内参与氧化还原反应的物质,因此,本发明选择H2O2、GSSG、NADH和NADPH四种氧化还原物质来反映酵母细胞内的氧化还原水平。
本发明中“亚细胞区室”是对细胞结构的进一步划分,具体包括细胞质和细胞器,细胞器包括线粒体、内质网、细胞核中的至少一种。
本发明中“生物传感器”是指基于基因编码的生物传感器,至少包括一种第一元件,第一元件为能够监测所述氧化还原物质并且能够将监测到的生物信号转换为电信号的生物传感元件,在一种具体实施方式中,图1为本发明提供的第一元件的工作原理示意图,其中,A为用于监测H2O2的第一元件roGFP-Tsa2ΔCR的工作原理示意图,编码roGFP-Tsa2ΔCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,roGFP-Tsa2ΔCR是一种新型荧光蛋白传感器,Tsa2ΔCR上包括巯基,能够与细胞内的H2O2反应,介导roGFP自身的两个半胱氨酸间形成二硫键并激发荧光激发光谱的比率变化,从而监测H2O2水平,具有较高的敏感性;B为用于监测GSSG的第一元件Grx1-rocherry的工作原理示意图,编码Grx1-rocherry的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示,Grx1能够与细胞内的GSSG反应,介导rocherry自身的两个半胱氨酸间形成二硫键,并激发荧光激光光谱的比率变化,从而监测酵母细胞内谷胱甘肽氧化型(GSSG)水平;C为用于监测NADPH的第一元件mBFP的工作原理示意图,编码mBFP的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示,mBFP能够与细胞内的NADPH结合并激发荧光光谱的比例变化,从而监测酵母细胞内NADPH;D为用于监测NADH的第一元件SoNar的工作原理示意图,编码SoNar的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,SoNar对NAD+/NADH氧化还原水平高度敏感,能够有效监测细胞内的NADH水平。
当亚细胞区室为细胞器时,生物传感器还包括至少一种第二元件,第二元件为能够在亚细胞区室内定位表达的定位蛋白元件,将第一元件与第二元件进行融合表达,能够实现细胞器内氧化还原物质的实时监测,具体地,当细胞器为线粒体时,第二元件为线粒体定位蛋白Atp5,编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;当细胞器为内质网时,第二元件为内质网定位蛋白Sec61,编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;当细胞器为细胞核时,第二元件为核定位蛋白Htb2,编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可以理解,第一元件和第二元件的组合方式不同,所能监测的氧化还原物质和细胞器也不相同,在一种具体实施方式中,所述生物传感器包括一种第一元件和至少两种第二元件,用于实现对不同细胞器中相同氧化还原物质的实时监测;例如,当编码第一元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,编码第二元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示时,能够实现线粒体和内质网内H2O2的实时监测;再例如,当编码第一元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,编码第二元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7所示时,能够实现线粒体、内质网以及细胞核内GSSG的实时监测。
在又一种具体实施方式中,所述生物传感器包括至少两种第一元件和一种第二元件,用于实现对相同细胞器中不同氧化还原物质的实时监测;例如,当编码第一元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示,编码第二元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示时,能够实现线粒体内H2O2和GSSG的实时监测;又例如,当编码第一元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示,编码第二元件的核苷酸序列如SEQID NO.6所示时,能够实现内质网内H2O2、GSSG和NADPH的实时监测。
在另一种具体实施方式中,所述生物传感器包括至少两种第一元件和至少两种第二元件,用于实现对不同细胞器中不同氧化还原物质的实时监测;例如,当编码第一元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示,编码第二元件的核苷酸序列分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6所示,且SEQ ID NO.1所示序列表达得到的第一元件和SEQ ID NO.5所示序列表达得到的第二元件进行融合表达,SEQ ID NO.2所示序列表达得到的第一元件和SEQ ID NO.6所示序列表达得到的第二元件进行融合表达时,能够实现线粒体内H2O2和内质网内GSSG的实时监测;又例如,当编码第一元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2所示,编码第二元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示,且SEQID NO.1所示序列表达得到的第一元件和SEQ ID NO.6所示序列表达得到的第二元件进行融合表达,SEQ ID NO.2所示序列表达得到的第一元件和SEQ ID NO.5所示序列表达得到的第二元件进行融合表达时,能够实现线粒体内GSSG和内质网内H2O2的实时监测。
当亚细胞区室为细胞质时,生物传感器包括第一元件,且不包括第二元件,第一元件可实现对细胞质内氧化还原物质的实时监测,第一元件的选择如前所述。
当亚细胞区室包括细胞质和至少一种细胞器时,生物传感器包括至少一种第一元件和至少一种第二元件,具体组合方式可根据实际需要进行搭配设置。
综上,本发明提供的生物传感器能够实现酵母亚细胞区室内氧化还原物质的实时动态监测,并且通过多种搭配方式,能够实现对酵母亚细胞区室内氧化还原物质的综合监测,有利于分析酵母亚细胞区室的氧化还原水平,为改善酵母胁迫抗逆性、提高生产性能提供基础。
本发明第二方面提供一种编码上述任一所述的生物传感器的核酸分子。
本发明第三方面提供一种表达载体,其包括本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明第四方面提供第一方面提供的生物传感器在实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平中的用途。
本发明第五方面提供一种实时监测酵母亚细胞内氧化还原水平的方法,包括:在酵母细胞中表达上述任一所述的生物传感器,并对酵母细胞内的氧化还原水平进行实时监测。
在一种具体实施方式中,该方法具体包括如下步骤:
步骤1、在酵母细胞中表达所述生物传感器;
步骤1.1、构建包括编码所述生物传感器的基因的表达载体;
基于所需监测的氧化还原物质和亚细胞区室,扩增编码对应元件的基因序列,例如,当需要监测线粒体和内质网中氧化还原物质H2O2的水平时,扩增编码第一元件roGFP-Tsa2ΔCR的SEQ ID NO.1所示的基因序列、编码线粒体定位蛋白Atp5的SEQ ID NO.5所示的基因序列、编码内质网定位蛋白Sec61的SEQ ID NO.5所示的基因序列,并将SEQ ID NO.1所示的基因序列、SEQ ID NO.5所示的基因序列、左右同源臂、启动子、终止子、筛选标记序列连接构建得到第一表达载体,将SEQ ID NO.1所示的基因序列、SEQ ID NO.6所示的基因序列、左右同源臂、启动子、终止子、筛选标记序列连接构建得到第二表达载体。
具体地,左右同源臂可以根据目标基因的插入位点进行设计,启动子、终止子、筛选标记序列以及序列的连接方法均可根据本领域常规技术手段进行;当亚细胞区室为细胞器时,按照左同源臂、启动子、编码定位蛋白元件的基因序列、编码生物传感元件的基因序列、终止子、筛选标记序列、右同源臂的顺序连接得到表达载体,当亚细胞区室为细胞质时,按照左同源臂、启动子、编码生物传感元件的基因序列、终止子、筛选标记序列、右同源臂的顺序连接得到表达载体。
步骤1.2、将所述表达载体转入酵母中,筛选阳性转化子,得到能够表达所述生物传感器的酵母细胞;
将步骤1.1构建好的表达载体转入酵母中,利用酵母自身的同源重组能力,将表达载体整合至酵母自身DNA序列中,实现表达载体上目标序列的表达;例如,将步骤1.1构建好的第一表达载体和第二表达载体转入酵母细胞中,经过阳性转化子筛选,得到能够表达第一元件roGFP-Tsa2ΔCR、线粒体定位蛋白Atp5和内质网定位蛋白Sec61的酵母细胞。
阳性转化子的筛选可依据本领域常规技术手段进行,例如筛选标记为抗生素抗性基因,通过筛选能够在含有抗生素的培养基上正常生产的菌株,即为阳性转化子,所使用的抗生素可以为潮霉素、诺尔丝菌素、博来霉素、G148遗传霉素中的一种或多种,此外也可以通过营养缺陷型进行筛选。
筛选结束后,还可以对酵母细胞进行测序,确定目标序列成功导入至酵母细胞中。
步骤2、对酵母细胞内的氧化还原水平进行实时监测;
将能够正确表达生物传感器的酵母进行发酵,在发酵过程中,当酵母亚细胞区室内的氧化还原物质含量发生改变时,生物传感器能够发出荧光信号,通过对发酵液进行荧光检测以及检测出的荧光强度,能够反应酵母亚细胞区室内的氧化还原物质的含量,反应酵母亚细胞区室内氧化还原水平;例如,将步骤1构建好的酵母进行发酵,由于线粒体定位蛋白Atp5和内质网定位蛋白Sec61仅在线粒体和内质网中表达,与定位蛋白连接的第一元件能够实时监测线粒体和内质网中氧化还原物质H2O2的含量,使用光谱扫描仪确定生物传感器表达的准确性,通过酶标仪检测生物传感器的荧光强度,荧光强度越高,则表明亚细胞区室内氧化还原物质H2O2的含量越高,从而实现对线粒体和内质网中H2O2水平的实时监测。
基于不同的第一元件,荧光检测时所对应的激发波长和吸收波长也不相同,具体地,第一元件roGFP-Tsa2ΔCR的激发波长为405/488nm,吸收波长为525nm;第一元件Grx1-rocherry的激发波长为570nm,吸收波长为610nm;第一元件mBFP的激发波长为389nm,吸收波长为430nm;第一元件SoNar的激发波长为510nm,吸收波长为540nm。
荧光检测过程中,通过监测激发波长为405/488nm,吸收波长为525nm两处的荧光强度比率即可反应H2O2水平,H2O2浓度越高,405/488nm处的荧光比值越大,在0-2.5mM(外源添加的H2O2溶液中H2O2的浓度)范围内,荧光比值与H2O2浓度基本呈现线性关系,其荧光比率的阈值在0.2-3之间;通过监测激发波长为570nm,吸收波长为610nm处的荧光强度可以反应GSSG水平,GSSG的含量越高,荧光强度越强,但由于实验方法的限制,暂无法精确地量化GSSG的检测限;通过监测激发波长为389nm,吸收波长为430nm处的荧光强度可以反应细胞内NADPH水平,NADPH水平越高,荧光强度越强,在0.8-2mmol/g(细胞内NADPH的摩尔数/细胞鲜重)的NADPH水平变化内,荧光强度与NADPH水平呈现线性关系;通过监测激发波长为510nm,吸收波长为540nm处的荧光强度可以反应NADH水平,NADH水平越高,荧光强度越强,在1200-2000nmol/g(细胞内NADH的摩尔数/细胞鲜重)的NADH水平变化内,荧光强度与NADH水平呈现线性关系。
综上,本发明利用生物传感器能够对酵母亚细胞区域内氧化还原水平进行实时监测,有利于分析酵母亚细胞区室的氧化还原水平,为改善酵母胁迫抗逆性、提高生产性能提供基础。
附图说明
图1为本发明提供的第一元件的工作原理示意图;
图2为本发明实施例1提供的生物传感器的荧光强度;
图3为本发明实施例2提供的生物传感器对酵母细胞的生长曲线的测定;
图4为本发明实施例4提供的生物传感器在酵母细胞内的共聚焦荧光图像和荧光强度检测结果,其中,a为生物传感器在不同亚细胞区室内的共聚焦荧光图像,b为不同温度下细胞质内H2O2水平监测结果,c为不同温度下内质网内H2O2水平监测结果,d为不同温度下线粒体内H2O2水平监测结果,e为不同温度下细胞核内H2O2水平监测结果;
图5为本发明实施例5提供的生物传感器在不同胁迫条件下不同亚细胞区室内NADPH的监测结果,其中,a为不同胁迫条件下细胞质内NADPH的监测结果,b为不同胁迫条件下细胞核内NADPH的监测结果,c为不同胁迫条件下线粒体内NADPH的监测结果,d为不同胁迫条件下内质网内NADPH的监测结果;
图6为本发明实施例6提供的生物传感器在细胞质内的监测结果;
图7a为本发明实施例7提供的生物传感器对H2O2的监测结果;
图7b为本发明实施例7提供的生物传感器对GSSG的监测结果;
图8a为本发明实施例8提供的生物传感器对H2O2的监测结果;
图8b为本发明实施例8提供的生物传感器对NADPH和NADH的监测结果;
图9为本发明实施例9提供的生物传感器对GSSG,NADPH和NADH的监测结果;
图10a为本发明实施例10提供的生物传感器对H2O2的监测结果;
图10b为本发明实施例10提供的生物传感器对GSSG与NADPH的监测结果;
图11a为本发明实施例11提供的生物传感器对H2O2的监测结果;
图11b为本发明实施例11提供的生物传感器对GSSG、NADPH和NADH的监测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明的实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1生物传感器对酵母细胞内氧化还原物质进行监测
步骤1、使用Phanta DNA聚合酶扩增左右同源臂、启动子、终止子、潮霉素抗性基因、roGFP2-TSA2ΔCR、Grx1-rocherry、mBFP和SoNar的基因片段。经琼脂糖凝胶电泳验证条带长度正确后使用凝胶回收试剂盒回收目的条带。以上述目的条带为模板,进行OE-PCR扩增完成线路构建,构建得到包括左同源臂、启动子、roGFP2-TSA2ΔCR、终止子、潮霉素抗性基因、右同源臂的roGFP2-TSA2ΔCR表达载体;包括左同源臂、启动子、Grx1-rocherry、终止子、潮霉素抗性基因、右同源臂的Grx1-rocherry表达载体;包括左同源臂、启动子、mBFP、终止子、潮霉素抗性基因、右同源臂的mBFP表达载体;包括左同源臂、启动子、SoNar、终止子、潮霉素抗性基因、右同源臂的SoNar表达载体;
左右同源臂均采用HO位点,与roGFP2-TSA2ΔCR、Grx1-rocherry、mBFP和SoNar对应的启动子分别为FBA1p、TDH3p、ENO2p、SOD1p,终止子分别为PGK1t、CYC1t、ENO1t、ADH1t;具体地,左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,启动子FBA1p的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,启动子TDH3p的核苷酸序列如SEQID NO:11所示,启动子ENO2p的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,启动子SOD1p的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,终止子PGK1t的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示,终止子CYC1t的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,终止子ENO1t的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,终止子ADH1t的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示,潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
步骤2、将构建的上述四个表达载体转化到酿酒酵母中,在含有潮霉素的固体培养基上进行阳性克隆筛选,并将筛选得到的阳性转化子进行测序验证。
步骤3、将验证成功的酵母细胞进行发酵,对发酵液进行取样,用光谱扫描确定生物传感器的准确性,用酶标仪测定生物传感器的荧光强度,检测结果如图2所示,图2中,a为第一元件roGFP2-TSA2ΔCR的监测结果,b为第一元件Grx1-rocherry的监测结果,c为第一元件mBFP的监测结果,d为第一元件SoNar的监测结果,根据图2可以看出,当酵母细胞内氧化还原水平不同时,不同生物传感器的光谱扫描的结果也有明显不同,特定的激发波长和吸收波长下对应的荧光强度也有明显改变,表明上述四个生物传感器能够实现对酵母细胞内四种氧化还原物质的实时监测。
实施例2生物传感器对酵母细胞(BY4741)生长的影响
为了检测生物传感系统的构建对菌株生长的影响,构建能够表达mBFP和SoNar的工程酵母菌株、构建能够表达roGFP2-TSA2ΔCR和Grx1-rocherry的工程酵母菌株、构建能够同时表达roGFP2-TSA2ΔCR、Grx1-rocherry、mBFP和SoNar的工程酵母菌株,构建方法可参考实施例1。
对构建好的三种工程酵母菌株和出发菌株(BY4741)进行生长曲线的测定,将上述构建的三种工程酵母菌株、出发菌株(BY4741)分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至50mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,置于摇床进行摇瓶发酵,每隔12h取样测定OD600的值,测定结果如图3所示。
根据图3可知,本发明提供的生物传感器的导入对酵母细胞的生长基本不会产生负担和毒性,但是随着生物传感器数量的增多,对酵母细胞的生长影响越大。
实施例3生物传感器内第二元件的选择
将第一元件roGFP-Tsa2ΔCR与线粒体定位蛋白进行融合表达,将第一元件SoNar与内质网定位蛋白进行融合表达,将第一元件mBFP与细胞核定位蛋白进行融合表达,各细胞器的定位蛋白选取如下:线粒体定位蛋白选取Atp5、Cox6或Cox14,内质网定位蛋白选取Sec61或Gtt1,细胞核定位蛋白选取Htb2或Nup49。
采用与实施例1相同的构建方法,构建得到成功表达上述生物传感器的酵母细胞,并在不同胁迫条件下进行发酵,观察不同定位蛋白对第一元件表达的影响,具体地,使用包括不同线粒体定位蛋白Atp5、Cox6和Cox14的生物传感器检测不同浓度乙醇下(20g/L、40g/L)H2O2的变化水平,结果发现,405nm/488nm的荧光强度分别为0.312和0.322、0.318和0.337、0.314和0.358,从ROS的水平来看并无明显差别,但共聚焦结果发现Atp5的荧光定位主要为线粒体,其靶向细胞器的效果明显优于Cox6和Cox14;
使用包括不同内质网定位蛋白Sec61或Gtt1的生物传感器同时检测20g/L和60g/L葡萄糖浓度下NADH的变化水平,结果发现,不同葡萄糖浓度条件下发酵得到的发酵液的荧光强度分别为1931和2709、1922和1466,在内质网定位蛋白Sec61存在下,具有更强的荧光强度,有助于提高NADH的监测灵敏度;
使用包括不同细胞核定位蛋白Htb2或Nup49的生物传感器同时检测细胞核内的NADPH水平,结果显示,两种定位蛋白均能靶向到细胞核内,但Nup49影响了mBFP对NADPH的检测结果。
综上,相比于其他定位蛋白,Atp5和Sec61显示出更专一、更精准的细胞器定位与ROS变化,Htb2显示出更准确的光谱扫描结果,因此,本发明确定Atp5、Sec61、Htb2作为细胞器定位蛋白进行后续研究。
实施例4对不同亚细胞区室内H2O2水平进行监测
通过将第一元件roGFP-Tsa2ΔCR在细胞质内进行表达,第一元件roGFP-Tsa2ΔCR和第二元件线粒体定位蛋白Atp5进行融合表达、第一元件roGFP-Tsa2ΔCR与第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,第一元件roGFP-Tsa2ΔCR和第二元件细胞核定位蛋白Htb2进行融合表达,对细胞质、线粒体、内质网和细胞核中H2O2的水平进行实时监测。
设计引物分别从实施例1构建成功的酵母基因组上PCR扩增包括roGFP-Tsa2ΔCR的基因线路与不同细胞器定位蛋白的目的片段,通过OE-PCR进行靶向细胞器的生物传感系统的线路构建,经琼脂糖凝胶电泳验证大小正确后使用凝胶回收试剂盒回收目的条带,将含有多个氧化还原探针的检测线路转入酿酒酵母中,筛选得到阳性转化菌株。
对工程菌株和出发菌株进行生长曲线和ROS测定,将实验构建的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃下96孔板培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至0.1mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,置于摇床进行孔板发酵(30℃),于24h时进行发酵取样,用于光谱扫描和共聚焦结果测定。
如图4中a所示,Atp5、Sec61和Htb2的共聚焦荧光图像显示了第一元件正确的靶向位置,并且将酵母细胞在30℃(对照组)和38℃下进行发酵,对不同温度下各个亚细胞区室内的H2O2水平进行实时监测,监测结果如图4中b-e所示,根据b-e可知,监测结果与细胞代谢水平基本保持一致,表明本发明提供的生物传感器具有较高的监测准确性。
实施例5对细胞器内氧化还原物质NADPH的实时监测结果
将第一元件mBFP进行表达,将第一元件mBFP与第二元件线粒体定位蛋白Atp5进行融合表达、第一元件mBFP与第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,第一元件mBFP和细胞核定位蛋白Htb2进行融合表达,对细胞质、线粒体、内质网和细胞核中NADPH的水平进行实时监测。
通过在不同胁迫条件下进行发酵培养,分别对工程菌株和出发菌株进行NADPH水平测定,将实验构建的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,在不同胁迫条件下进行孔板发酵,并在6h、12h和24h下对发酵液进行取样和荧光强度检测,荧光强度的检测参数为荧光激发波长390nm,发射波长430nm,胁迫条件主要有温度(30℃、34℃、38℃和42℃)、乙醇(2%、4%、8%)、过氧化氢(1mM、5mM、20mM)、3g/L乙酸、1M山梨醇、葡萄糖(0.2%、20%)、2% NaCl、2%甘油、0.2mM羟基脲。
检测结果如图5所示,可以看出,细胞质、内质网、线粒体和细胞核中的NADPH水平随着发酵时间而变化。与对照相比,高温、高乙醇浓度和高H2O2浓度显着增加了亚细胞区室中的NADPH水平,通过对比荧光强度的变化,可明显观察出细胞质、线粒体、内质网和细胞核内NADPH的动态变化。
实施例6对细胞质内氧化还原物质NADPH和NADH的实时监测
将第一元件SoNar和mBFP在酵母内进行表达,进行细胞质内氧化还原物质NADPH和NADH的实时监测。
采用与实施例1相同的方法,构建能够成功表达第一元件SoNar和mBFP的酵母,将构建好的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至0.1mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,置于96孔板分别在26℃和38℃发酵,于16h时进行发酵取样,并对发酵液进行荧光强度检测,检测结果如图6所示,可以看出,38℃下细胞质中的NADH和NADPH比26℃下分别降低了70.6%和49.8%。
实施例7对内质网内氧化还原物质H2O2和GSSG的实时监测
通过将第一元件roGFP-Tsa2ΔCR和第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,将第一元件Grx1-rocherry和第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,进行内质网中氧化还原物质H2O2和GSSG的实时监测。
采用与实施例1相同的方法,构建能够成功表达roGFP-Tsa2ΔCR/Sec61和Grx1-rocherry/Sec61的酵母,将构建好的的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至0.1mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,置于96孔板分别在30℃和37℃下发酵,于24h时进行发酵取样,对发酵液进行荧光强度检测。检测结果图7a-7b所示,本实施例提供的生物传感系统可以成功测量同一细胞区室中两种氧化还原物质的水平,37℃下内质网的H2O2和GSSG的水平比30℃下分别提高了58.3%和15.5%。
实施例8对细胞核内氧化还原物质H2O2、NADPH和NADH进行实时监测
将第一元件roGFP-Tsa2ΔCR和第二元件细胞核定位蛋白Htb1进行融合表达,将第一元件mBFP与第二元件细胞核定位蛋白Htb1进行融合表达,将第一元件SoNar和第二元件细胞核定位蛋白Htb1进行融合表达,进行细胞核内氧化还原物质H2O2、NADPH和NADH的实时监测。
采用与实施例1相同的方法,构建能够成功表达roGFP-Tsa2ΔCR/Htb1、SoNar/Htb1、mBFP/Htb1的酵母,将构建好的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至20mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,分别在0g/L乙酸和4g/L乙酸的胁迫条件下培养,置于30℃摇床发酵,于9h时进行发酵取样,并对发酵液进行荧光强度检测。检测结果如图8a-8b所示,结果表明,该生物传感器可以成功测量同一细胞区室中三种氧化还原物质的水平,在4g/L乙酸中细胞核的H2O2水平比无乙酸条件下提高了90.7%,细胞核中的NADH和NADPH分别降低了32.6%和38.1%。
实施例9对内质网内氧化还原物质GSSG、NADPH和NADH的实时监测
通过将第一元件Grx1-rocherry和第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,将第一元件mBFP和第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,将第一元件SoNar和第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,进行内质网中氧化还原物质GSSG、NADPH和NADH的实时监测。
采用与实施例1相同的方法,构建能够成功表达Grx1-rocherry/Sec61、SoNar/Sec61和mBFP/Sec61的酵母,将构建好的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至0.1mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,分别在0g/L乙醇和40g/L乙醇的胁迫条件下培养,置于30℃摇床发酵,于18h时进行发酵取样,对发酵液进行荧光强度检测,检测结果如图9所示。根据图9可知,该生物传感器可以成功测量同一细胞区室中三种氧化还原物质的水平,在40g/L乙醇胁迫下,内质网的氧化型谷胱甘肽水平比无乙醇条件下升高了54.0%,内质网中的NADH和NADPH分别降低了36.1%和22.8%。
实施例10对线粒体内氧化还原物质H2O2、GSSG、NADPH的实时监测
将第一元件roGFP-Tsa2ΔCR和第二元件线粒体定位蛋白Atp5进行融合表达,将第一元件Grx1-rocherry和第二元件线粒体定位蛋白Atp5进行融合表达,将第一元件mBFP和第二元件线粒体定位蛋白Atp5进行融合表达,进行线粒体中氧化还原物质H2O2、GSSG、NADPH的实时监测。
采用与实施例1相同的方法,构建能够成功表达roGFP-Tsa2ΔCR/Atp5、Grx1-rocherry/Atp5和mBFP/Atp5的酵母,将构建好的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至0.1mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,分别在30℃和42℃摇床中进行发酵培养,于12h时进行发酵取样,对发酵液进行荧光强度检测,检测结果如图10a-10b所示,可以看出,本实施例提供的生物传感器可以成功监测线粒体中三种氧化还原物质的水平,42℃下线粒体的H2O2和GSSG的水平比30℃下分别提高了11.2%和19.6%,NADPH水平降低了73.0%。
实施例11对细胞核内H2O2、细胞质内GSSG、线粒体内NADH、内质网内NADPH进行实时监测
将第一元件roGFP-Tsa2ΔCR和第二元件细胞核定位蛋白Htb1进行融合表达,将第一元件Grx1-rocherry进行表达,将第一元件SoNar与第二元件线粒体定位蛋白Atp5进行融合表达,将第一元件mBFP与第二元件内质网定位蛋白Sec61进行融合表达,对细胞核内H2O2、细胞质内GSSG、线粒体内NADH、内质网内NADPH进行实时监测。
采用与实施例1相同的方法,构建能够成功表达roGFP-Tsa2ΔCR/Htb1、Grx1-rocherry、SoNar/Atp5和mBFP/Sec61的酵母,将构建好的菌株与出发菌株分别接种于YPD液体培养基中,30℃摇床培养18h,紫外分光光度计测定OD600,转接至0.1mL新鲜的YPD液体培养基中,平衡初始OD600值为0.2,设3组平行,置于96孔板分别在0mM H2O2和10mM H2O2胁迫条件下发酵,于24h取样,对发酵液进行荧光检测,检测结果如图11a-11b所示,可以看出,本实施例提供的生物传感器可以成功测量不同亚细胞区室中不同氧化还原物质的水平,在10mMH2O2胁迫条件下,细胞核中的H2O2水平比对照提高了43.4%,细胞质中GSSG水平提高了13.0%,线粒体中NADH水平降低了35.9%,内质网中NADPH水平降低了23.3%。
综上,本发明提供的生物传感器能够实现酵母亚细胞区室内氧化还原物质的综合表征和实时动态监测,有利于分析酵母亚细胞区室的氧化还原水平,为改善酵母胁迫抗逆性、提高生产性能提供基础。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平的生物传感器,其特征在于,所述生物传感器用于监测酵母亚细胞区室内的氧化还原物质,所述氧化还原物质包括H2O2、GSSG、NADH和NADPH中的至少一种,所述亚细胞区室包括细胞器和/或细胞质,所述细胞器包括线粒体、内质网、细胞核中的至少一种;
当所述亚细胞区室为细胞质时,所述生物传感器包括至少一种第一元件,当所述亚细胞区室为细胞器时,所述生物传感器包括至少一种第一元件和至少一种第二元件;
所述第一元件为能够监测所述氧化还原物质并且能够将监测到的生物信号转换为电信号的生物传感元件,编码所述第一元件的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-4中的一种;
所述第二元件为能够在亚细胞区室内定位表达的定位蛋白元件,编码所述第二元件的核苷酸序列选自SEQ ID NO.5-7中的一种。
2.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述生物传感器包括一种第一元件和至少两种第二元件。
3.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述生物传感器包括至少两种第一元件和一种第二元件。
4.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述生物传感器包括至少两种第一元件和至少两种第二元件。
5.一种编码权利要求1-4任一项所述的生物传感器的核酸分子。
6.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体包括权利要求5所述的核酸分子。
7.权利要求1-4任一项所述的生物传感器在实时监测酵母亚细胞区室内氧化还原水平中的用途。
8.一种实时监测酵母亚细胞内氧化还原水平的方法,其特征在于,包括:在酵母细胞中表达权利要求1-4任一项所述的生物传感器,并对酵母细胞内的氧化还原水平进行实时监测。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,在酵母细胞中表达权利要求1-4任一项所述的生物传感器,具体包括如下步骤:
构建包括编码所述生物传感器的基因的表达载体;
将所述表达载体转入酵母中,筛选阳性转化子,得到能够表达所述生物传感器的酵母细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,对酵母细胞内的氧化还原水平进行实时监测,具体包括如下步骤:
将表达有所述生物传感器的酵母细胞进行发酵,对发酵液进行荧光检测,根据检测出的荧光强度,监测酵母亚细胞区室内的氧化还原水平。
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