JP6739758B2 - 細胞培養用基材およびそれを用いた細胞培養方法、細胞培養器、並びに基材としての使用 - Google Patents
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Description
[1]
ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含み、
前記ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位である、
細胞培養用基材。
[2]
前記環状アセタール骨格を有するジオール単位が、一般式(1)
で表されるジオール、および一般式(2)
で表されるジオールから選ばれる少なくとも一つのジオールに由来するジオール単位である、
[1]に記載の細胞培養用基材。
[3]
前記環状アセタール骨格を有するジオール単位が、3,9−ビス(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−2,4,8,10−テトラオキサスピロ〔5.5〕ウンデカンに由来するジオール単位、または5−メチロール−5−エチル−2−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−1,3−ジオキサンに由来するジオール単位である、
[1]または[2]に記載の細胞培養用基材。
[4]
前記ジオール単位が環状アセタール骨格を有するジオール単位以外のその他のジオール単位をさらに含み、
前記その他のジオール単位が、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリメチレングリコール、1,4−ブタンジオールおよび1,4−シクロヘキサンジメタノールからなる群から選ばれる1種以上のジオールに由来するジオール単位である、
[1]〜[3]のいずれかに記載の細胞培養用基材。
[5]
前記ジカルボン酸単位が、テレフタル酸、イソフタル酸、1,4−ナフタレンジカルボン酸、1,5−ナフタレンジカルボン酸、2,6−ナフタレンジカルボン酸および2,7−ナフタレンジカルボン酸からなる群から選ばれる1種以上のジカルボン酸に由来するジカルボン酸単位である、
[1]〜[4]のいずれかに記載の細胞培養用基材。
[6]
ジオール単位中に前記環状アセタール骨格を有するジオール単位を実質的に含まないその他のポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂およびポリメチルメタクリレート−スチレン樹脂からなる群から選ばれる少なくとも1種以上の樹脂をさらに含む、
[1]〜[5]のいずれかに記載の細胞培養用基材。
[7]
前記その他のポリエステル樹脂をさらに含み、
前記その他のポリエステル樹脂が、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、イソフタル酸変性ポリエチレンテレフタレートおよび1,4−シクロヘキサンジメタノール変性ポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれる少なくとも1種以上の樹脂である、
[6]に記載の細胞培養用基材。
[8]
前記細胞培養用基材が、表面処理された基材である、
[1]〜[7]のいずれかに記載の細胞培養用基材。
[9]
[1]〜[8]のいずれかに記載の細胞培養用基材を備える、
細胞培養用容器。
[10]
ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含む基材上で細胞を培養する工程を有し、
前記ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位である、
細胞培養方法。
[11]
前記細胞を培養する工程が、前記基材上に播種された前記細胞を培養する工程である、
[10]に記載の細胞培養方法。
[12]
前記細胞培養用基材が、表面処理された基材である、
[10]または[11]に記載の細胞培養方法。
[13]
前記細胞が、付着性細胞である、
[10]〜[12]のいずれかに記載の細胞培養方法。
[14]
細胞の培養における基材としての使用であって、
前記基材は、ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含み、
前記ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位である、
基材としての使用。
に関するものである。
本実施形態の細胞培養用基材(以下、単に「基材」ともいう。)は、ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含む。そのポリエステル樹脂(以下、「本実施形態のポリエステル樹脂」ともいう。)において、ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位である。
本実施形態の細胞培養用基材の製造方法は、例えば、ジカルボン酸と環状アセタール骨格を有するジオールとを重合してポリエステル樹脂を重合する工程(重合工程)と、ポリエステル樹脂を成形して基材を得る工程(成形工程)とを有する。本実施形態の細胞培養用基材の製造方法によれば、基材の製造におけるコーティング工程が必要とされないため、基材の製造及び管理が容易である。
本実施形態の細胞培養方法は、ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含む基材上で細胞を培養する工程(培養工程)を有する。そのポリエステル樹脂において、ジオール単位中1〜100モル%が1,4−シクロヘキサンジメタノールに由来するジオール単位である。
(1)ポリエチレンテレフタレート(PET):日本ユニペット(株)製、商品名:UNIPET RT553C。
(2)スピログリコール変性PET(ポリエステル1):三菱ガス化学(株)製、商品名:ALTESTER S4500(ポリエチレンテレフタレート樹脂のジオール成分であるエチレングリコールの45モル%をスピログリコールで置換)。
(3)ジオキサングリコール変性PET(ポリエステル2):特開2014−205773号実施例記載のポリエステルDと同様の方法で製造。(ポリエチレンテレフタレート系樹脂のジオール成分であるエチレングリコールの30モル%をジオキサングリコールで置換)。
(4)NDCA、スピログリコール変性PET(ポリエステル3):特開2014−205773号実施例記載のポリエステルDと同様の方法で製造。(ポリエチレンテレフタレート系樹脂のジオール成分であるエチレングリコールの30モル%をスピログリコールで置換し、ジカルボン酸成分であるテレフタル酸の50モル%を2,6−ナフタレンジカルボン酸で置換)。
(5)ポリスチレン製ディッシュ(無処理ディッシュ(表面処理なし)):AGCテクノグラス(株)製、IWAKIブランド、径60mm、品種コード:1010−060。
(6)ポリスチレン製ディッシュ(組織培養用ディッシュ(付着性細胞用表面処理済み)):AGCテクノグラス(株)製、IWAKIブランド、径60mm、品種コード:3010−060。
(7)ポリスチレン製ディッシュ(コラーゲンType1コート(ブタ由来)):AGCテクノグラス(株)製、IWAKIブランド、径60mm、品種コード:4010−010。
PET、ポリエステル1、ポリエステル2、ポリエステル3については、住友重機械工業製射出成形機(型式:SE130DU)を用いて径50mm、高さ3mmの円盤状の射出成形体を得た。これらPET、ポリエステル1、ポリエステル2、ポリエステル3については、射出成形体を(5)ポリスチレン製ディッシュ(無処理ディッシュ(表面処理なし)に設置して用いた。射出成形体の底部に少量の滅菌済みワセリンを塗布することでディッシュ下部に接着させた。ポリスチレン、付着性細胞用表面処理を行ったポリスチレン、コラーゲンコート処理を行ったポリスチレンについては、それぞれ(5)、(6)、(7)に記載のディッシュをそのまま用いた。
参考例1で調製した細胞培養用基材に3,000細胞/cm2となるように細胞を播種し、10%FBSおよび抗生物質(100μg/mLカナマイシン、50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン)を添加したDMEM培地(gibco製)を培地として5%CO2大気下、37℃にて3日間培養を行った。
細胞の生育は、alamarBlue試験にて評価した。参考例2で培養したディッシュから培養液を除去し、DPBS(+)で洗浄後、DMEM培地4.5mLとalamarBlue溶液(ライフテクノロジーズ製)0.5mLを添加した。5%CO2大気下、37℃、遮光条件下にて所定時間静置後、培地の吸光度を測定した。モニター波長を573nm、リファレンス波長を605nmとし、モニター波長の吸光度からリファレンス波長の吸光度を減じた値を発色値として細胞生育状態の評価に用いた。細胞の種類や生育状況、継代数による影響なく評価するため、後述の比較例2に示す(6)ポリスチレン製ディッシュ(組織培養用ディッシュ(付着性細胞用表面処理済み))での値を100%とした相対値で評価した。
(スピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材の原料として(2)スピログリコール変性PET(ポリエステル1)を用いて参考例1に従って細胞培養用基材を製造し、参考例2に従って細胞にヒト線維芽細胞を用いて培養を行った。参考例3に従って細胞生育状態を評価した結果、同時に実施したポリスチレン製組織培養用ディッシュを用いた場合と比較した結果を表1に示す。
(スピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたPMEF細胞の培養)
細胞にマウス胚性線維芽細胞(ミリポア製、PMEF細胞)を用いる他は、実施例1と同様に実施した結果を表1に示す。
(ジオキサン変性ポリエステル樹脂を用いたPMEF細胞の培養)
細胞培養用基材の原料として(3)ジオキサングリコール変性PET(ポリエステル2)を用いる他は、実施例2と同様に実施した結果を表1に示す。
(NDCA、スピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材の原料として(4)NDCA、スピログリコール変性PET(ポリエステル3)を用いる他は、実施例1と同様に実施した結果を表1に示す。
(紫外線照射したスピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞播種前に細胞培養用基材を1.8mW/cm2の紫外線で20分間照射した他は実施例1と同様に実施した結果を表1に示す。また、図1に、細胞生育状態を評価した際の写真を示す。なお、下記に写真を撮影する際に用いた装置を示す。以下、写真を撮影する際は同様の装置を用いた。
・倒立位相差顕微鏡(Nikon TE200)
・写真撮影装置(Nikon DS−L1)
(紫外線照射したNDCA,スピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞播種前に細胞培養用基材を1.8mW/cm2の紫外線で20分間照射した他は実施例4と同様に実施した結果を表1に示す。また、図2に、細胞生育状態を評価した際の写真を示す。
(プラズマ処理したスピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞播種前に細胞培養用基材に酸素プラズマ処理(100W、30秒)を施た他は実施例1と同様に実施した結果を表1に示す。
(プラズマ処理およびγ線照射したスピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞播種前に細胞培養用基材に酸素プラズマ処理(100W、30秒)を施し、25kGyのγ線を照射した他は実施例1と同様に実施した結果を表1に示す。
(プラズマ処理したNDCA,スピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞播種前に細胞培養用基材に酸素プラズマ処理(100W、30秒)を施した他は実施例4と同様に実施した結果を表1に示す。
(プラズマ処理およびγ線照射NDCA,スピログリコール変性ポリエステル樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞播種前に細胞培養用基材に酸素プラズマ処理(100W、30秒)を施し、25kGyのγ線を照射した他は実施例4と同様に実施した結果を表1に示す。
(無処理ポリスチレン樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材に(5)ポリスチレン製ディッシュ(無処理ディッシュ(表面処理なし))を用いる他は実施例1と同様に行った結果を表2に示す。また、図3に、細胞生育状態を評価した際の写真を示す。
(組織培養用ポリスチレン樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材に(6)ポリスチレン製ディッシュ(組織培養用ディッシュ(付着性細胞用表面処理済み))を用いる他は実施例1と同様に行った結果を表2に示す。また、図4に、細胞生育状態を評価した際の写真を示す。
(コラーゲンコートポリスチレン樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材に(7)ポリスチレン製ディッシュ(コラーゲンType1コート(ブタ由来))を用いる他は実施例1と同様に行った結果を表2に示す。また、図5に、細胞生育状態を評価した際の写真を示す。
(PET樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材に(1)ポリエチレンテレフタレート(PET)を用いる他は実施例1と同様に行った結果を表2に示す。
(紫外線照射PET樹脂を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養)
細胞培養用基材に(1)ポリエチレンテレフタレート(PET)を用いる他は実施例5と同様に行った結果を表2に示す。
Claims (13)
- ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含み、
前記ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位であり、
前記環状アセタール骨格を有するジオール単位が、一般式(1)
で表されるジオール、および一般式(2)
で表されるジオールから選ばれる少なくとも一つのジオールに由来するジオール単位である、
細胞培養用基材。 - 前記環状アセタール骨格を有するジオール単位が、3,9−ビス(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−2,4,8,10−テトラオキサスピロ〔5.5〕ウンデカンに由来するジオール単位、または5−メチロール−5−エチル−2−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−1,3−ジオキサンに由来するジオール単位である、
請求項1に記載の細胞培養用基材。 - 前記ジオール単位が環状アセタール骨格を有するジオール単位以外のその他のジオール単位をさらに含み、
前記その他のジオール単位が、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリメチレングリコール、1,4−ブタンジオールおよび1,4−シクロヘキサンジメタノールからなる群から選ばれる1種以上のジオールに由来するジオール単位である、
請求項1又は2に記載の細胞培養用基材。 - 前記ジカルボン酸単位が、テレフタル酸、イソフタル酸、1,4−ナフタレンジカルボン酸、1,5−ナフタレンジカルボン酸、2,6−ナフタレンジカルボン酸および2,7−ナフタレンジカルボン酸からなる群から選ばれる1種以上のジカルボン酸に由来するジカルボン酸単位である、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞培養用基材。 - ジオール単位中に前記環状アセタール骨格を有するジオール単位を実質的に含まないその他のポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂およびポリメチルメタクリレート−スチレン樹脂からなる群から選ばれる少なくとも1種以上の樹脂をさらに含む、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞培養用基材。 - 前記その他のポリエステル樹脂をさらに含み、
前記その他のポリエステル樹脂が、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、イソフタル酸変性ポリエチレンテレフタレートおよび1,4−シクロヘキサンジメタノール変性ポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれる少なくとも1種以上の樹脂である、
請求項5に記載の細胞培養用基材。 - 前記細胞培養用基材が、表面処理された基材である、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞培養用基材。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞培養用基材を備える、
細胞培養用容器。 - ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含む基材上で細胞を培養する工程を有し、
前記ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位であり、
前記環状アセタール骨格を有するジオール単位が、一般式(1)
で表されるジオール、および一般式(2)
で表されるジオールから選ばれる少なくとも一つのジオールに由来するジオール単位である、
細胞培養方法。 - 前記細胞を培養する工程が、前記基材上に播種された前記細胞を培養する工程である、
請求項9に記載の細胞培養方法。 - 前記細胞培養用基材が、表面処理された基材である、
請求項9または10に記載の細胞培養方法。 - 前記細胞が、付着性細胞である、
請求項9〜11のいずれか一項に記載の細胞培養方法。 - 細胞の培養における基材としての使用であって、
前記基材は、ジカルボン酸単位とジオール単位とを含む、ポリエステル樹脂を含み、
前記ジオール単位中1〜80モル%が環状アセタール骨格を有するジオール単位であり、
前記環状アセタール骨格を有するジオール単位が、一般式(1)
で表されるジオール、および一般式(2)
で表されるジオールから選ばれる少なくとも一つのジオールに由来するジオール単位である、
基材としての使用。
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