WO2018092321A1 - 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法 - Google Patents

体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018092321A1
WO2018092321A1 PCT/JP2016/084511 JP2016084511W WO2018092321A1 WO 2018092321 A1 WO2018092321 A1 WO 2018092321A1 JP 2016084511 W JP2016084511 W JP 2016084511W WO 2018092321 A1 WO2018092321 A1 WO 2018092321A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luminescence
expression
image
transcription factor
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/084511
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
竜太郎 秋吉
Original Assignee
オリンパス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オリンパス株式会社 filed Critical オリンパス株式会社
Priority to PCT/JP2016/084511 priority Critical patent/WO2018092321A1/ja
Priority to JP2018551012A priority patent/JPWO2018092321A1/ja
Publication of WO2018092321A1 publication Critical patent/WO2018092321A1/ja
Priority to US16/297,612 priority patent/US20190352727A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing reprogramming of somatic cells and a method for creating a quality evaluation standard for iPS cells using the same.
  • IPS induced pluripotent stem cells
  • reprogramming factors for example, Oct4, Klf4, Sox2, c-myc, Lin28 or L-myc.
  • iPS cells having multipotency that is, high-quality iPS cells must be 1% or less. It has been known.
  • Japanese National Publication 2010-537634 discloses a method for visually evaluating colony morphology as a method for evaluating high-quality iPS cells. This evaluation is performed after the colonies have grown sufficiently, i.e. 3 to 4 weeks after the start of induction of reprogramming. Those evaluated as having good colony morphology are still maintained, but among them, the actual number of iPS cells having pluripotency is 20 to 40%. In establishing iPS cells, in practice, at least 15 to 30 colonies must be maintained in view of the need to obtain at least three lines from one donor. As described above, in the conventional quality evaluation method, it is difficult to efficiently select iPS cells, which requires cost and labor.
  • Examples of gene expression analysis methods that cause little damage to cells include a method of analyzing a luminescence signal resulting from the expression of a luminescence reporter gene. Since expression analysis using a luminescent signal does not require excitation light, gene expression analysis with excellent quantification is possible without being affected by phototoxicity and without being influenced by autofluorescence.
  • Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2014-176364 describes a method for evaluating the state of stem cells by luminescence.
  • This document describes a method for evaluating the differentiation state at the differentiation induction stage from iPS cells to various organs by a promoter assay targeting cell differentiation marker genes or undifferentiation marker genes.
  • the amount of luminescence that reflects the amount of endogenous transcription factor is quantified.
  • the timing for evaluating the morphology of a conventional colony is after the colony has sufficiently grown, and an emphasis is placed on evaluating iPS cells after morphological maturation. Therefore, there is a need for a method with little damage to cells and high quantitativeness for analyzing the expression level of transcription factors in the initial stage of reprogramming. Moreover, in addition to the quality evaluation method by visual inspection of the colony form, a method for creating an evaluation standard for selecting high-quality iPS cells is required.
  • An object of the present invention is to provide a method for analyzing reprogramming of somatic cells having low invasiveness and high quantitativeness, and a method for creating quality evaluation criteria for iPS cells using the same.
  • a nucleic acid encoding a plurality of types of transcription factors necessary for somatic cell reprogramming, and a luminescent reporter protein configured to be expressed together with at least one of the plurality of types of transcription factors
  • a luminescence image related to luminescence resulting from the expression of the luminescent reporter protein is obtained during a culture period of a cell into which a nucleic acid encoding a nucleic acid is introduced, and the luminescence intensity of the luminescence is quantified based on the luminescence image
  • evaluating the expression state of the transcription factor expressed together with the luminescent reporter protein based on the luminescence intensity, wherein the expression state acquires pluripotency in the reprogramming process of the cells.
  • the above analysis method is used to obtain an evaluation result of the expression state of the transcription factor, and to evaluate the quality of iPS cells produced by reprogramming the cells. Obtaining an evaluation result of iPS cell quality, and creating a quality evaluation standard for iPS cells based on the relationship between the evaluation result of the expression state of the transcription factor and the evaluation result of the quality of the iPS cells.
  • a method for preparing a quality evaluation standard for iPS cells is provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a main processing flow of a somatic cell reprogramming analysis method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a main processing flow of a method for creating a quality evaluation standard for iPS cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3A is a schematic diagram showing the structure of the pCXLE-hOCT3 / 4-SfRE1 vector used in the examples.
  • FIG. 3B is a schematic diagram showing the structure of the pCXLE-hSK-OkiMado vector used in the examples.
  • FIG. 4 shows a luminescence image caused by SfRE1 luciferase, a luminescence image caused by OkiMadoluciferase, and a luminescence image and a phase-difference observation image of the cells on the first day after vector introduction. It is a figure which shows an image (Merge).
  • FIG. 5 is a diagram showing a luminescence image due to SfRE1 luciferase, a luminescence image due to OkiMadoluciferase, and a phase difference observation image for an iPS-like cell colony 8 days after vector introduction.
  • FIG. 6 is an image (Merge) obtained by enlarging the range illustrated in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the luminescence intensity resulting from the expression of SfRE1 luciferase and the luminescence intensity resulting from the expression of OkiMadoluciferase in each cell selected from the luminescence image shown in FIG.
  • FIG. 8 is a graph showing the luminescence intensity resulting from the expression of SfRE1 luciferase and the luminescence intensity resulting from the expression of OkiMadoluciferase at 5 sites in the colony selected from the luminescence image shown in FIG.
  • FIG. 9 is a bright-field image of an iPS-like cell colony stained with alkaline phosphatase 8 days after introduction of the modified vector.
  • FIG. 10 is a bright field image of an iPS-like cell colony stained with alkaline phosphatase 8 days after introduction of the control vector.
  • FIG. 1 is a diagram showing a main processing flow of a somatic cell reprogramming analysis method according to an embodiment of the present invention.
  • the method according to an embodiment of the present invention includes culturing cells (S11), acquiring a luminescence image (S12), quantifying luminescence intensity (S13), and evaluating the expression state of a transcription factor. (S14) and evaluating colony formation (S15).
  • Reprogramming refers to the phenomenon in which differentiated cells turn into pluripotent stem cells.
  • Nucleic acid encoding a plurality of types of transcription factors required for reprogramming of somatic cells and a nucleic acid encoding a luminescent reporter protein configured to be expressed together with at least one of the plurality of types of transcription factors were introduced The cells are cultured (S11).
  • the former nucleic acid is also referred to as “nucleic acid encoding a transcription factor”, and the latter nucleic acid is also referred to as “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein”.
  • a nucleic acid has the same meaning as a gene, for example, DNA.
  • the original cells into which the “nucleic acid encoding a transcription factor” and the “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” are introduced are somatic cells.
  • the somatic cells into which these nucleic acids have been introduced become iPS cells during the culture period. Can change.
  • the culture can be performed by a known method. Preferably, the culture is performed on a microscope except for the time for operations such as medium exchange.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the somatic cell culture is continuously performed over a period during which the somatic cell reprogramming analysis method is performed.
  • Somatic cells into which “nucleic acid encoding a transcription factor” and “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” have been introduced can express somatic cell reprogramming during the culture period by expressing the “nucleic acid encoding a transcription factor”. Be guided.
  • nucleic acid encoding a transcription factor and the “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” are preferably introduced in a form that can be expressed continuously without being integrated into the host chromosome.
  • a nucleic acid encoding a transcription factor” and “a nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” are preferably introduced into a somatic cell in the form of an episomal vector.
  • a commercially available episomal vector may be used, or a modified vector is prepared by incorporating a “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” into a commercially available episomal vector. May be used.
  • pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F Additional protein sequence
  • pCXLE-hSK Additional protein sequence
  • pCXLE-hUL Additional protein sequence
  • Nucleic acids encoding multiple types of transcription factors may be incorporated into individual vectors, or may be incorporated into one vector.
  • multiple types of vectors that incorporate nucleic acids encoding two types of transcription factors that are incorporated into one vector or via 2A sequences are prepared, mixed, and required for induction of iPS cells. Nucleic acid encoding all such transcription factors is introduced into somatic cells. The operation of gene introduction can be performed by a known method.
  • nucleic acid encoding a transcription factor and “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein”
  • a “nucleic acid encoding an additional factor that enhances reprogramming efficiency” may be introduced into somatic cells.
  • additional factor for increasing reprogramming efficiency factors known to increase reprogramming efficiency, for example, mouse p53 and EBNA1 into which a dominant negative mutation has been introduced, can be used.
  • Additional factors that enhance reprogramming efficiency are preferably introduced into somatic cells in the form of episomal vectors. In this case, commercially available episomal vectors such as pCE-mp53DD (Addgene) and pCXB-EBNA1 (Addgene) can be used.
  • somatic cell reprogramming As the “plural types of transcription factors necessary for somatic cell reprogramming”, a combination of transcription factors known to induce somatic cell reprogramming can be used. For example, Oct3 / 4, Klf4 , Sox2, c-myc, Lin28 and L-myc, Oct3 / 4, Klf4, Sox2, Lin28 and L-myc, Oct3 / 4, Klf4, Sox2 and c-myc, or Oct3 / 4, A combination of Klf4 and Sox2 can be mentioned.
  • the number of transcription factors required for somatic cell reprogramming is, for example, 3-6.
  • the “nucleic acid encoding a transcription factor” includes, for example, a first vector containing a nucleic acid encoding Oct3 / 4, a second vector containing a nucleic acid encoding Sox2 and a nucleic acid encoding Klf4, and L- It can be introduced into somatic cells using a vector set comprising a third vector containing a nucleic acid encoding myc and a nucleic acid encoding Lin28.
  • at least one of the first vector, the second vector, and the third vector has a “luminescent reporter protein” at a position where it can be expressed together with the “nucleic acid encoding a transcription factor” contained in the vector.
  • Encoding nucleic acid ".
  • nucleic acid encoding a transcription factor when introduced into a somatic cell using a vector set composed of the first to third vectors described above, a nucleic acid encoding mouse p53 introduced with a dominant negative mutation is included.
  • a fourth vector and a fifth vector containing a nucleic acid encoding EBNA1 may be incorporated into the vector set.
  • a “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” is configured to be expressed together with at least one of a plurality of types of transcription factors.
  • the “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” is preferably configured to be linked to a “nucleic acid encoding a transcription factor” in a polycistronic manner through, for example, the 2A sequence or IRES sequence of foot-and-mouth disease virus.
  • the “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” is preferably configured to be linked polycistronically to a “nucleic acid encoding a transcription factor” via a 2A sequence.
  • the position of the “nucleic acid encoding luminescent reporter protein” may be any position where both the transcription factor and the luminescent reporter protein can be expressed, and may be upstream of the “nucleic acid encoding the transcription factor”. It may be downstream.
  • the “luminescent reporter protein” is a protein that is used in contrast to a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP) and functions to emit light without being irradiated with excitation light.
  • the “luminescent reporter protein” is preferably a bioluminescent protein, such as luciferase.
  • Bioluminescence is desirable in that it can selectively evaluate living cells excluding cells that have been inactivated during the culture period due to apoptosis or the like because it does not shine in dead cells that have lost biological responses.
  • the “luminescent reporter protein” may be configured to be expressed with one of a plurality of types of transcription factors, or may be configured to be expressed with all types of a plurality of types of transcription factors.
  • the transcription factor expressed together with the luminescent reporter protein is at least one selected from the group consisting of Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-myc, Lin28, and L-myc.
  • the “luminescent reporter protein” When the “luminescent reporter protein” is configured to be expressed together with two or more of a plurality of types of transcription factors, the expression state of the two or more types of transcription factors can be evaluated. Thereby, reprogramming of somatic cells can be analyzed more accurately.
  • each of the luminescent reporter proteins expressed with two or more transcription factors can be distinguished from any other luminescent reporter protein. It has a light emission characteristic that allows it to be detected. That is, two or more types of luminescent reporter proteins have luminescent properties that allow them to be detected distinguishably from each other.
  • the emission characteristic is, for example, an emission wavelength. In this way, two or more types of luminescent reporter proteins have luminescent properties that allow them to be detected in a distinguishable manner from each other, so that each luminescent reporter protein is expressed in a luminescent image acquired in a later step.
  • the resulting luminescence information is distinguished from the luminescence information resulting from the expression of any other luminescent reporter protein.
  • the luminescence intensity of luminescence resulting from the expression of each luminescent reporter protein is quantified individually (that is, for each type of luminescent reporter protein) based on the luminescence image.
  • Examples of two or more luminescent reporter proteins having luminescent properties that can be detected in a distinguishable manner from each other include, for example, Eluc luciferase that produces green luminescence, CRB luciferase that produces red luminescence, and umi that produces blue luminescence
  • Eluc luciferase that produces green luminescence
  • CRB luciferase that produces red luminescence
  • umi that produces blue luminescence
  • a commercially available product such as Shiita luciferase can be used.
  • the luciferase used as the luminescent reporter protein may be a modified luciferase modified so as to have high luminescence intensity.
  • the modified luciferase for example, SfRE1 luciferase (SEQ ID NO: 1), OkiMado luciferase (SEQ ID NO: 2) and the like can be used.
  • the combination of the transcription factor and luciferase is not particularly limited.
  • the expression timing and expression level of the gene encoding the luminescent reporter protein can be regarded as corresponding to those of the transcription factor.
  • the luciferase protein generated in the cell by the expression of the luciferase gene catalyzes the luciferin provided to the cell, and as a result, the luciferin emits light. Therefore, the expression state of the transcription factor can be estimated based on the luminescence.
  • Luminescence resulting from the expression of the luminescent reporter protein is imaged to obtain a luminescence image (S12).
  • Acquiring the luminescent image is performed during the culture process (S11) (culture period), and is preferably performed in the initial stage of reprogramming.
  • the initial stage of reprogramming can include a stage before colony formation, in which cells mainly stay in two-dimensional growth.
  • the initial stage of reprogramming can include a colony formation start stage in which bulges start three-dimensionally when cells are clustered.
  • a luminescent image is, for example, a time before reprogramming is completed, and at a time earlier than the timing of evaluating the conventional colony morphology, specifically, a “nucleic acid encoding a transcription factor”. Performed at least once within 3 weeks of introduction (ie, starting reprogramming induction). More specifically, the luminescence image is acquired at least once in the period from the day when the “nucleic acid encoding the transcription factor” is introduced to 3 weeks later. In addition, the acquisition of the luminescent image is preferably performed at least once before the formation of the colony, specifically within one week after the introduction of the “nucleic acid encoding the transcription factor”. The More specifically, the luminescence image is acquired at least once in a period from the day when the “nucleic acid encoding a transcription factor” is introduced to 1 week later.
  • the acquisition of the luminescent image is preferably performed repeatedly over time. Imaging is performed continuously at arbitrary intervals. Imaging is generally performed at intervals of 10 to 30 minutes, for example, at intervals of 10 minutes. In addition, the time for one imaging is arbitrarily set. The camera exposure time for one imaging is, for example, 3 to 5 minutes, but can be appropriately adjusted so that a sufficient light emission signal can be detected.
  • the imaging interval is an arbitrary time interval that is longer than the exposure time for producing an image whose light emission image can be analyzed by the imaging device. On the other hand, since the reprogramming process is performed on a weekly basis, even if one image is taken every other day or every other week, it is possible to effectively evaluate cells before maturation into iPS cells.
  • the period during which a luminescent image can be acquired is limited to a period during which “nucleic acid encoding a transcription factor” and “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” are maintained in the cell.
  • “nucleic acid encoding a transcription factor” and “nucleic acid encoding a luminescent reporter protein” are introduced into a cell in the form of an episomal vector, imaging of luminescence is performed immediately after initiation of reprogramming induction, that is, an episomal vector is introduced. Then, it can be continued until the episomal vector is released out of the cell.
  • the emission image is acquired in a light-shielding environment. More specifically, it is preferable that the luminescent image is acquired by a method with little influence from the outside in a light-shielding environment for capturing bioluminescence.
  • the luminescent image can be acquired using a filter as appropriate under a light-shielding environment.
  • the luminescent image may be acquired without using a filter in a light-shielding environment.
  • the luminescent image is preferably obtained after spectroscopic analysis using an appropriate filter in a light-shielding environment.
  • the luminescent image can be obtained as an image in which luminescence resulting from the expression of a plurality of types of luminescent reporter proteins overlaps without being spectrally separated by a filter.
  • the light emission image can also be obtained as a color image using a color CCD camera or a color CMOS camera.
  • the luminescence image is obtained by using, for example, a filter that mainly transmits light having a specific wavelength corresponding to light emission, an image sensor that converts light transmitted through the filter into an electric signal, and an electric signal. It can be acquired using a luminescence imaging apparatus including a processing unit for creating a luminescence image.
  • a luminescence imaging apparatus including a processing unit for creating a luminescence image.
  • a luminescence imaging system LV200 having both a culture function and an imaging function can be used. By executing the imaging function at a desired timing while executing the culture function, a luminescent image can be acquired in all the steps of reprogramming.
  • an image suitable for analysis can be selected from a plurality of light emission images including the light emission images captured in the initial stage of reprogramming. It is also possible to evaluate colonies with the same degree of growth between colonies with different growth rates by selecting luminescent images at different elapsed times for multiple colonies that have started culturing simultaneously in the same culture chamber. is there.
  • a bright field image is acquired together with the luminescent image. More preferably, the bright field image is acquired at almost the same timing as the acquisition of the luminescent image.
  • a bright-field image is an image acquired using illumination light without being based on light emission, and is an image in which the position and form of cells or colonies can be observed.
  • the bright field image includes a phase difference observation image and a differential interference (DIC) observation image.
  • the bright field image may be acquired at almost the same timing as the acquisition of the luminescent image, or may be acquired at an arbitrary timing independently from the acquisition of the luminescent image.
  • LV200 luminescence imaging system
  • the luminescence intensity of the luminescence resulting from the expression of the luminescence reporter protein is quantified (S13).
  • the luminescence intensity detected in the luminescence wavelength region of the luminescent reporter protein can be quantified as it is.
  • luminescent reporter proteins When there are two or more kinds of luminescent reporter proteins to be detected, preferably, first, spectral analysis is performed with a filter, and a luminescent image is acquired for each predetermined wavelength range. Thereafter, preferably, the resulting luminescent image is subjected to unmixing processing to eliminate a portion where the luminescence wavelength regions of the plurality of types of luminescent reporter proteins overlap, and then due to the expression of the plurality of types of luminescent reporter proteins.
  • the luminescence intensity of luminescence can be separately quantified. In a later evaluation step, it is also possible to calculate the ratio of the luminescence intensity from the quantification result of the luminescence intensity resulting from the expression of the individual luminescent reporter protein obtained above.
  • the luminescence intensity may be quantified as the total value of the luminescence intensity of luminescence resulting from the expression of multiple types of luminescent reporter proteins. In this case, information on the total expression level of a plurality of types of luminescent reporter proteins can be obtained. In addition, when there are two or more types of luminescent reporter proteins to be detected, the luminescence caused by the expression of multiple types of luminescent reporter proteins is color-separated based on the color image, and then the luminescence intensity is classified by separating each luminescent information. Can also be quantified.
  • the luminescence intensity is preferably quantified repeatedly over time. In this case as well, it is possible to calculate the ratio of the luminescence intensity at each time point when the quantification of the luminescence intensity is performed in the subsequent evaluation step.
  • the quantification of the luminescence intensity and the calculation of the luminescence intensity ratio may be automated.
  • the expression state of the transcription factor expressed together with the luminescent reporter protein is evaluated (S14).
  • the evaluation of the expression state of the transcription factor preferably includes obtaining the expression level of the transcription factor from the quantification result of the luminescence intensity.
  • the luminescence intensity resulting from the expression of the luminescent reporter protein can be converted into the expression level of the transcription factor expressed together with the luminescent reporter protein.
  • the expression level of transcription factor is evaluated by obtaining the expression level of transcription factor from the luminescence intensity quantified individually (that is, for each type of luminescent reporter protein). May be included.
  • the relationship between the expression level of a specific transcription factor and the luminescence intensity of each of multiple types of luciferases can be determined in advance, and the expression level of the transcription factor can be corrected even if the co-expressed luminescent reporter protein is changed. It is preferable to keep it.
  • the expression level of the transcription factor is also quantified as the total expression level of the multiple types of transcription factor. Is done.
  • the evaluation of the expression state of a transcription factor is preferably performed on a cell at an early stage of reprogramming, more preferably on a cell within 3 weeks after introduction of a “nucleic acid encoding a transcription factor”, more preferably This is carried out on cells within one week after the introduction of “nucleic acid encoding a transcription factor”.
  • the evaluation of the expression state of the transcription factor may be performed immediately after obtaining the luminescence image, or may be performed on the luminescence image obtained in advance.
  • the evaluation of the expression state of the transcription factor is performed by obtaining the ratio of the luminescence intensity from the quantified luminescence intensity individually (that is, for each type of luminescent reporter protein). It may include. You may evaluate the expression state of a transcription factor about the quantitative result of the emitted light intensity in a temporary point. Alternatively, when acquisition of the luminescent image is repeatedly performed over time, the evaluation of the expression state of the transcription factor may be performed by evaluating the change over time of the expression state of the transcription factor expressed together with the luminescent reporter protein. .
  • the evaluation of the expression state of a transcription factor is performed by evaluating the change over time in the expression intensity of a specific transcription factor and / or the change over time in the ratio of the expression intensity of multiple types of transcription factors as the reprogramming progresses. It is possible.
  • the expression state of a transcription factor is an index for evaluating the acquisition of pluripotency in the process of cell reprogramming.
  • acquisition of pluripotency means establishment of high-quality iPS cells.
  • the colony formation may be evaluated (S15). Evaluation of colony formation (S15) can be performed by visually confirming whether colony formation has occurred. When colony formation is confirmed in the evaluation of colony formation (S15), this indicates that a “nucleic acid encoding a transcription factor” has been introduced into the cell and expressed. Moreover, it is preferable to perform colony formation evaluation (S15) from a bright-field image.
  • the bright-field image is not particularly limited as long as colony formation can be observed.
  • the bright field image is, for example, a phase difference observation image or a differential interference (DIC) observation image.
  • the evaluation of colony formation can be performed on or after the 7th day after introducing a “nucleic acid encoding a transcription factor” into a cell (that is, after starting reprogramming induction).
  • FIG. 2 is a diagram showing a main processing flow of a method for creating a quality evaluation standard for iPS cells according to an embodiment of the present invention.
  • the method according to an embodiment of the present invention includes evaluating the expression state of a transcription factor using the above-described method for analyzing somatic cell reprogramming (S14) and evaluating the quality of iPS cells (S21 and S22) and creating an iPS cell quality evaluation standard based on the relationship between the evaluation result of the expression state of the transcription factor and the evaluation result of the quality of the iPS cell (S23).
  • the evaluation of the expression state of the transcription factor is preferably performed for cells within 3 weeks after introduction of the “nucleic acid encoding the transcription factor” into the cells, more preferably for 1 week. Can be performed on within cells.
  • the evaluation of the quality of iPS cells can be preferably performed 3 to 4 weeks after the introduction of “nucleic acid encoding a transcription factor” into the cells.
  • ⁇ Quality evaluation of iPS cells From the colonies analyzed for somatic cell reprogramming, colonies showing various expression states of transcription factors are selected, and an evaluation conventionally used for evaluating the quality of iPS cells is performed (S21). Based on the result, the quality of iPS cells is comprehensively evaluated (S22). In order to evaluate the quality of iPS cells (S21 and S22), colonies showing various expression states (that is, expression patterns) of transcription factors are selected. For example, colonies showing expression patterns A, B, and C are selected. Selected.
  • the “expression pattern” may be an expression pattern of one or more types of transcription factors at a specific time point, or may be a pattern of change in expression of one or more types of transcription factors over time.
  • a specific expression pattern for example, an expression pattern showing the expression level of a transcription factor exceeding a predetermined threshold value
  • a plurality of colonies are selected, whereby transcription is performed in a later step.
  • the accuracy of the correlation between the result of evaluation of the expression state of the factor (S14) and the result of the evaluation of the quality of the iPS cells (S21 and S22) is increased. Become.
  • the quality evaluation of iPS cells can be performed according to a method similar to a known evaluation method that is usually performed for evaluating the quality of iPS cells.
  • the quality evaluation (S21 and S22) of iPS cells includes at least one selected from the group consisting of evaluation of colony morphology (S211), evaluation of reprogramming state (S212), and evaluation of differentiation potential (S213).
  • the quality evaluation of iPS cells preferably includes two or more selected from the group consisting of evaluation of colony morphology, evaluation of reprogramming status, and evaluation of differentiation ability, and more preferably includes all.
  • the quality evaluation of iPS cells includes comprehensive evaluation of a plurality of evaluation results. For example, if at least one evaluation result of a plurality of evaluations is not good, it can be comprehensively evaluated that the quality of iPS cells is not good.
  • the evaluation of the form of the colony can be performed by at least one selected from the group consisting of evaluation of the roundness of the colony, evaluation of the size of the colony, and evaluation of the clarity of the outline of the colony, for example.
  • the evaluation of the form of the colony may be performed visually, or may be digitized based on an arbitrary criterion, and the numericalization process may be automated.
  • mature iPS cells can be screened, or those that clearly show abnormal morphology among the mature iPS cells can be excluded.
  • the evaluation of the reprogramming state can be performed, for example, by analysis of alkaline phosphatase activity, karyotype analysis, or expression analysis of undifferentiated markers. This evaluation of the reprogramming state is particularly suitable for overlooking whether or not a large number of cells in the colony have matured as iPS cells, and can also be used to confirm that the reprogramming has been completed. it can.
  • Alkaline phosphatase is one of undifferentiated markers because it is highly expressed in pluripotent stem cells.
  • the alkaline phosphatase activity can be analyzed, for example, by performing alkaline phosphatase staining according to a known method. In this analysis, the presence or absence of alkaline phosphatase activity may be determined by alkaline phosphatase staining, or the alkaline phosphatase activity may be quantified.
  • Alkaline phosphatase staining is associated with the activity of alkaline phosphatase by adding a substrate solution consisting of a mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP) and nitroblue tetrazolium (NBT) after formalin fixation, for example.
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate
  • NBT nitroblue tetrazolium
  • Karyotype analysis can be performed, for example, by analyzing changes in the number and structure of chromosomes by G-band analysis.
  • the expression analysis of undifferentiated markers can be performed by RT-qPCR of undifferentiated marker genes or immunostaining of undifferentiated marker proteins.
  • undifferentiated marker for example, Nanog, Oct3 / 4, TRA1-60, TRA1-81 can be used.
  • Evaluation of the differentiation ability of iPS cells can be performed, for example, by expression analysis of three germ layer differentiation markers after induction of differentiation into three germ layer cells.
  • Differentiation marker expression analysis can be performed by RT-qPCR of differentiation markers or immunostaining of differentiation marker proteins.
  • differentiation markers for example, ectoderm markers (PAX6, MAP2), mesoderm markers ( ⁇ -SMA, Branchry), and endoderm markers (SOX17, AFP) can be used.
  • the evaluation result of the expression state of the transcription factor obtained by the above-described somatic cell reprogramming analysis method is associated with the evaluation result of the iPS cell quality obtained by the above-described iPS cell quality evaluation. Since the latter evaluation result is based on a publicly known technique, this association allows the expression state of the transcription factor in the initial stage of reprogramming (for example, within 3 weeks from the start of induction of reprogramming) to be expressed in high quality iPS. Can be associated with cells. Such association can be performed, for example, depending on whether the expression level of one or more transcription factors reaches a predetermined threshold value.
  • a standard for evaluating the quality of iPS cells can be created. Specifically, a plurality of colonies in which a transcription factor exhibits a specific expression pattern (for example, an expression pattern indicating the expression level of a transcription factor exceeding a predetermined threshold), and a quality specified by a conventional quality evaluation method. When associated with good iPS cells, this particular expression pattern can be employed as a quality assessment criterion for iPS cells. This makes it possible to perform quality evaluation for selecting iPS cells with good quality from the expression state of transcription factors in the early stage of reprogramming.
  • ⁇ Effect ⁇ As described above, according to the analysis method according to one embodiment, in an initial stage of reprogramming, for example, within a period of 3 weeks from the time of introduction of a transcription factor into a somatic cell (that is, induction of reprogramming). Quantitative analysis of somatic cell reprogramming with little damage to cells.
  • the conventional evaluation of the reprogramming state was only to visually evaluate the colony form 3 to 4 weeks after the start of reprogramming induction.
  • the expression state of the transcription factor can be evaluated.
  • it becomes possible to evaluate the expression state of transcription factors so that the initial stage of reprogramming (for example, within 3 weeks from the start of induction of reprogramming), preferably the initial stage of reprogramming (for example, induction of reprogramming). It is possible to grasp the cell state within 1 week from the start. Further, based on these evaluation results, it is possible to perform an initial screening in the initial stage of reprogramming.
  • the expression intensity of the transcription factor can be quantified by a method that is less invasive to cells than the analysis method using fluorescence. Furthermore, this analysis method is superior in quantitative performance as compared with the analysis method using fluorescence. Specifically, analysis of the expression level by luminescence without using excitation light is superior to fluorescence in the following points.
  • the intracellular half-life of the fluorescent protein is long, for example, about 20 hours are required. Therefore, it is difficult to accurately detect the timing when the expression level decreases.
  • the intracellular half-life of the luminescent reporter protein is, for example, about 3 hours. For this reason, compared with the analysis using fluorescent protein, it is excellent in the followability of the change in expression level.
  • the analysis method according to the present embodiment is not only invasive but also quantitative. Therefore, when the analysis method according to the present embodiment is performed in the initial stage of reprogramming, which is the most upstream of the iPS cell production process, a minute change in the expression level of the transcription factor is analyzed without damaging the cells. be able to.
  • the evaluation of the expression state by luminescence is superior in that it is a quantitative and objective method compared to a conventional evaluation method, that is, a method based on a sensory standard of an engineer such as visual evaluation of colony morphology. ing.
  • the expression level of the transcription factor depends on the luminescence intensity. It can be analyzed directly. Therefore, it becomes possible to grasp the actual expression level as compared with the indirect expression level evaluation by the conventional promoter assay.
  • the analysis method for example, it is possible to analyze the expression distribution of transcription factors in a cell population forming a colony from a luminescence image.
  • iPS cells when iPS cells are established, it is generally performed to physically select only a part of the cells at the center of the colony from the viewpoint of iPS cell production efficiency. Therefore, by analyzing the expression distribution of the transcription factor in the cell population forming the colony, the transcription factor is appropriately expressed from the cell population existing in the center of the colony without sorting the cells.
  • Cells can be selected based on an image displayed on display means such as image analysis or display.
  • the iPS cell establishment process for each cell that is, the state of acquisition of pluripotency, from the central part of the colony and the increase rate of the luminescence intensity and / or the luminescence amount in the peripheral part of the colony corresponding to a plurality of directions as seen from the central part I can grasp it. Furthermore, a bright-field image is acquired using a known optical system for bright-field observation, or preferably phase-contrast observation, and this bright-field image is superimposed on the luminescent image, so that cells in the reprogramming process are superimposed.
  • An index of iPS cell quality assessment associated with morphological changes can be provided. In particular, it is preferable in that it is possible to evaluate the quality of iPS cells in which the change in colony thickness is correlated with the gene expression level by repeatedly acquiring both the phase difference observation image and the luminescence image in different processes of reprogramming.
  • a high-quality iPS cell selected based on a conventional evaluation method and an initial stage of reprogramming (for example, reprogramming) Unprecedented because it is associated with the evaluation result of the expression state of the transcription factor in the first stage of reprogramming (for example, within one week from the start of induction of reprogramming), preferably within 3 weeks from the start of induction of programming. It is possible to create a new quality evaluation standard for iPS cells. In addition, if a standard is created in this way, it is possible to screen cells that are expected to become high-quality iPS cells in the early stage of reprogramming, thereby improving the establishment efficiency of high-quality iPS cells. It becomes possible.
  • Oct3 / 4 Sox2, Klf4, L-myc, and Lin28 were used as inducers of reprogramming.
  • these inducers Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 were linked to luciferase as a luminescent reporter protein, and the expression state of each inducer was evaluated from the luminescence image.
  • pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-SfRE1 pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-SfRE1 was prepared together with Oct3 / 4 so that SfRE1 luciferase was expressed as a luminescent reporter protein.
  • pCXLE-hOCT3 / 4-shp53 (Addgene) was digested with Kpn I and Bgl II, and as shown in FIG. 3A, downstream of hOCT3 / 4, SfRE1 luciferase (SEQ ID NO: 1) was inserted via the 2A sequence. ) was incorporated to prepare an expression vector.
  • pCXLE-hSK-OkiMado was prepared together with Sox2 and Klf4 so that OkiMado luciferase was expressed as a luminescent reporter protein.
  • pCXLE-hSK Additional gene
  • FIG. 3B expression was carried out by incorporating OkiMadoluciferase (SEQ ID NO: 2) downstream of KLF4 via the 2A sequence.
  • Vector was prepared.
  • an artificially synthesized sequence containing the KpnI site from which the stop codon was deleted was inserted from the inside of KLF4.
  • pCXB-EBNA1 pCXB-EBNA1 was obtained from Addgene.
  • control vector sets For the induction of reprogramming as a comparison target, the following vectors (6) and (7) were used in addition to the vectors (3) to (5). These five types of vectors are called “control vector sets”.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • AK02 Ajinomoto
  • SCF SCF
  • TPO TPO
  • Flt3-Ligand CSF
  • a 24-well culture plate was used for cell culture. The cells were seeded at a density of 2.5 ⁇ 10 6 cells / well and cultured for 7 days in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 without changing the medium.
  • modified vector set was introduced into PBMC by electroporation using Amaxa (Lonza).
  • Amaxa Limaxa
  • control vector set was introduced into PBMC in the same manner.
  • 6-well culture plates previously coated with a coating agent iMatrix, Nippi
  • a coating agent iMatrix, Nippi
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • IL3, IL6, SCF, TPO, Flt3-Ligand and CSF-containing medium AK02, Ajinomoto
  • Luminescence by the catalytic action of luciferase was observed by adding luciferin to the medium at a final concentration of 1 mM.
  • a luminescence microscope LV200 (Olympus) was used, and ImagEM (Hamamatsu Photonics) was used for the CCD camera.
  • binning was 1 ⁇ 1
  • EM-gain was 1200.
  • an objective lens with a magnification of ⁇ 20 was used and the exposure time of the camera was taken as 3 minutes to obtain a luminescence image.
  • an objective lens with a magnification of x4 or x20 was used and the exposure time of the camera was taken for 5 minutes to obtain a luminescence image.
  • Luminescence resulting from the expression of SfRE1 luciferase was spectroscopically analyzed using a 515-560HQ filter.
  • Luminescence resulting from the expression of OkiMadoluciferase was spectroscopically analyzed using a 610 ALP filter.
  • the center diagram of FIG. 4 shows a luminescence image attributed to SfRE1 luciferase, which was spectrally separated with a 515-560 HQ filter.
  • the lower diagram of FIG. 4 shows a luminescence image attributed to OkiMadoluciferase, which was spectrally separated with a 610 ALP filter.
  • the upper diagram of FIG. 4 shows an image obtained by superimposing the center diagram and the lower diagram of FIG. 4 and the phase difference observation image.
  • FIG. 5 is an image captured by an objective lens having a magnification of ⁇ 4.
  • the upper diagram of FIG. 5 shows a phase difference observation image (bright field).
  • the center diagram of FIG. 5 shows a luminescence image attributed to SfRE1 luciferase, which was spectrally separated with a 515-560 HQ filter.
  • the lower diagram of FIG. 5 shows a luminescence image attributed to OkiMadoluciferase, which was spectrally separated with a 610 ALP filter.
  • FIG. 6 shows the result of imaging with an objective lens of ⁇ 20 magnification in the range shown by the white rectangle in the upper diagram of FIG.
  • FIG. 6 shows an image obtained by superimposing a luminescence image caused by SfRE1 luciferase dispersed with a 515-560HQ filter, a luminescence image caused by OkiMadoluciferase dispersed with a 610 ALP filter, and a phase difference observation image.
  • the regions a, b, c, d, and e shown in the upper image of FIG. 4 are arbitrarily selected so as to include cells in which luminescence caused by SfRE1 luciferase and luminescence caused by OkiMadoluciferase can be confirmed from the luminescence image. It is a selection.
  • FIG. 7 shows the results obtained by quantifying and graphing the emission intensity in the wavelength region of light emission caused by SfRE1 luciferase and the emission intensity in the wavelength region of light emission caused by OkiMadoluciferase for these regions.
  • Regions f, g, h, i, and j shown in FIG. 6 are obtained by arbitrarily selecting sites where luminescence caused by SfRE1 luciferase and luminescence caused by OkiMadoluciferase were confirmed from luminescence images of iPS-like cell colonies. It is.
  • FIG. 8 shows the results obtained by quantifying and graphing the emission intensities in the wavelength region having the light emission attributed to SfRE1 luciferase and the wavelength region having the light emission attributed to OkiMadoluciferase.
  • the luminescence intensity is acquired as numerical data, it was shown that it is possible to take the ratio of the luminescence intensity of luminescence caused by the expression of a plurality of luciferases.
  • the quantified luminescence intensity reflects the expression level of the transcription factor. Therefore, by calculating in advance the relationship between the luminescence intensity of luciferase and the expression level of transcription factor that can be quantified using a technique such as RT-qPCR, the expression level of transcription factor can be calculated from the quantification of luminescence intensity. It was suggested that it was possible. Thus, it was shown that the expression state of the transcription factor can be evaluated based on the luminescence image.
  • FIG. 9 is a bright field image in which the alkaline phosphatase activity of PBMC on day 8 was detected after introduction of the modified vector set.
  • FIG. 10 is a bright field image in which the alkaline phosphatase activity of PBMC on the 8th day was detected after introducing the control vector set.
  • the iPS-like cell colony obtained by introducing the modified vector was stained and positive for alkaline phosphatase activity.
  • the expression of transcription factors in the reprogramming process can be observed and quantified from the luminescence image.
  • the quality evaluation criteria for iPS cells are created in this way, it is suggested that high-quality iPS cell colonies can be selected in a minimally invasive and quantitative manner at the initial stage of reprogramming. It was.
  • it can also be used as an evaluation method for searching for an optimal transcription factor for iPS cell growth.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Signal Processing (AREA)

Abstract

本発明の体細胞のリプログラミングの解析方法は、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞の培養期間中に、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る発光画像を取得すること（Ｓ１２）と、前記発光画像に基づいて、前記発光の発光強度を定量すること（Ｓ１３）と、前記発光強度に基づいて、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）とを含み、前記発現状態は、前記細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である。

Description

体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法
　本発明は、体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法に関する。
　ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞は、初期化因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８又はＬ－ｍｙｃ）の体細胞への導入によるリプログラミングを経て樹立される。ｉＰＳ細胞の樹立効率は低く、初期化に必要な複数種類の転写因子を導入した細胞のうち、多分化能を有するｉＰＳ細胞、即ち、品質の良いｉＰＳ細胞になるのは１％以下であることが知られている。
　日本国特表２０１０－５３７６３４号公報には、品質の良いｉＰＳ細胞の評価方法として、コロニー形態の目視による評価方法が記載されている。この評価は、コロニーが十分に成長した後、すなわち、リプログラミングの誘導開始から３乃至４週間後に実施される。コロニーの形態が良いと評価されたものはその後も維持されるが、そのうち実際に多分化能を有するｉＰＳ細胞は２０乃至４０％である。ｉＰＳ細胞を樹立する際には、１ドナーから少なくとも３系統を得ることが求められていることを考慮すると、実際には、少なくとも１５乃至３０個のコロニーを維持し続けなければならない。このように、従来の品質評価方法では、ｉＰＳ細胞を効率良く選択することが難しいため、コストや手間がかかっている。
　Eirini P. Papapetrou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009 Aug; 106(31):12756-64. Stoichiometric and temporal requirements of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc expression for efficient human iPS induction and differentiation.では、蛍光タンパク質で標識した初期化因子を細胞内に発現させ、それらの発現量を解析している。しかしこの方法は、細胞に励起光を当てて蛍光シグナルを検出するため、特に長期に及ぶ観察の場合、光毒性によって様々なダメージが細胞に与えられる。光毒性による細胞へのダメージが、ｉＰＳ細胞の作製工程の最上流に位置するリプログラミング時に生じれば、その後のステップ全てに多大な影響を及ぼすおそれがある。
　また、Eirini P. Papapetrou et al.は、初期化因子Ｏｃｔ４を含むベクターを、他の初期化因子Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃを含むベクターよりも多い量で細胞に導入して、Ｏｃｔ４を他の初期化因子よりも多量に発現させると、リプログラミング効率が向上することを報告する。
　細胞へのダメージが少ない遺伝子発現解析方法としては、例えば、発光レポーター遺伝子の発現に起因する発光シグナルを解析する方法が挙げられる。発光シグナルによる発現解析は、励起光を要さないため、光毒性の影響を受けることなく、また、自家蛍光の影響がない等、定量性に優れた遺伝子発現解析が可能である。
　日本国特開２０１４－１７６３６４号公報には、幹細胞の状態を発光によって評価する方法が記載されている。この文献には、細胞の分化マーカー遺伝子又は未分化マーカー遺伝子を標的としたプロモーターアッセイによって、ｉＰＳ細胞から各種臓器への分化誘導段階における分化状態を評価する方法が記載されている。プロモーターアッセイでは、内在性の転写因子の量を反映する発光量が定量される。
　従来のコロニーの形態を評価するタイミングは、コロニーが十分に成長した後であり、形態的に成熟した後のｉＰＳ細胞を評価することに重点が置かれている。よって、リプログラミングの初期段階における転写因子の発現量を解析するための、細胞へのダメージが少なく、定量性が高い方法が求められている。　
　また、コロニー形態の目視による品質評価方法に加えて、品質の良いｉＰＳ細胞を選択するための評価基準を作成する方法が求められている。
　本発明は、低侵襲性および高定量性を有する体細胞のリプログラミングの解析方法、及びそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様によれば、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞の培養期間中に、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る発光画像を取得することと、前記発光画像に基づいて前記発光の発光強度を定量することと、前記発光強度に基づいて、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態を評価することとを含み、前記発現状態は、前記細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である、体細胞のリプログラミングの解析方法が提供される。
　本発明の一態様によれば、上記の解析方法を用いて、前記転写因子の発現状態の評価結果を得ることと、前記細胞がリプログラミングされることで作製されたｉＰＳ細胞の品質を評価してｉＰＳ細胞の品質の評価結果を得ることと、前記転写因子の発現状態の評価結果と前記ｉＰＳ細胞の品質の評価結果との関係に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成することとを含む、ｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法が提供される。
図１は、本発明の一実施形態に係る体細胞のリプログラミングの解析方法の主な処理の流れを示した図である。 図２は、本発明の一実施形態に係るｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法の主な処理の流れを示した図である。 図３Ａは、実施例にて使用したｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ＳｆＲＥ１ベクターの構成を示す模式図である。 図３Ｂは、実施例にて使用したｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－ＯｋｉＭａｄｏベクターの構成を示す模式図である。 図４は、ベクター導入後１日目の細胞についての、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、それら発光画像と位相差観察画像とを重ね合わせた画像（Ｍｅｒｇｅ）とを示す図である。 図５は、ベクター導入後８日目のｉＰＳ様細胞コロニーについての、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、位相差観察画像とを示す図である。 図６は、図５中で図示した範囲を拡大し、発光画像と位相差観察画像とを重ね合わせた画像（Ｍｅｒｇｅ）である。 図７は、図４に示す発光画像で選択された各細胞におけるＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現に起因する発光強度を示すグラフである。 図８は、図６に示す発光画像で選択されたコロニー中の５部位におけるＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現に起因する発光強度を示すグラフである。 図９は、改変型ベクターを導入して８日後のアルカリフォスファターゼ染色したｉＰＳ様細胞コロニーの明視野画像である。 図１０は、コントロールベクターを導入して８日後のアルカリフォスファターゼ染色したｉＰＳ様細胞コロニーの明視野画像である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を説明することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。
　≪体細胞のリプログラミングの解析方法≫
　図１は、本発明の一実施形態に係る体細胞のリプログラミングの解析方法の主な処理の流れを示した図である。本発明の一実施形態に係る方法は、細胞を培養すること（Ｓ１１）と、発光画像を取得すること（Ｓ１２）と、発光強度を定量すること（Ｓ１３）と、転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）と、コロニー形成を評価すること（Ｓ１５）とを含む。「リプログラミング」は、分化細胞が多能性幹細胞に変わる現象を指す。
　＜細胞の培養＞
　体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を培養する（Ｓ１１）。以下の説明において、前者の核酸を「転写因子をコードする核酸」、後者の核酸を「発光レポータータンパク質をコードする核酸」ともいう。本明細書において、核酸は、遺伝子と同じ意味を有し、たとえばＤＮＡである。
　「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入される元の細胞は、体細胞であるが、これら核酸が導入された体細胞は、培養期間中にｉＰＳ細胞に変化し得る。培養は、既知の方法によって行うことができる。好ましくは、培地交換などの操作のための時間を除いて、顕微鏡上で培養を行う。体細胞としては、例えば、ヒト末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣという；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。細胞の培養は、体細胞のリプログラミングの解析方法を実施している期間にわたって継続して行われる。
　「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された体細胞は、培養期間中に、「転写因子をコードする核酸」を発現することで体細胞のリプログラミングが誘導される。
　「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、宿主の染色体に組み込まれずに持続的に発現可能な形態で導入されることが好ましい。例えば、「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入されることが好ましい。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているものを使用してもよいし、市販されているエピソーマルベクターに「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を組み込むことにより改変ベクターを調製してこれを使用してもよい。市販されているエピソーマルベクターとしては、例えば、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
　「複数種類の転写因子をコードする核酸」は、各々個別のベクターに組み込まれていてもよいし、１つのベクターに組み込まれていてもよい。「複数種類の転写因子をコードする核酸」を１つのベクターに組み込む場合、例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを介してポリシストロニックに連結して挿入することが好ましい。一例としては、１つのベクターに１種類、又は２Ａ配列を介して組み込まれる２種類の転写因子をコードする核酸を組み込んでなるベクターを複数種類作製し、それらを混合し、ｉＰＳ細胞の誘導に必要な全ての転写因子をコードする核酸を体細胞へ導入する。なお、遺伝子導入の操作は、既知の方法によって行うことができる。
　「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」に加えて、「リプログラミング効率を高める追加の因子をコードする核酸」を体細胞に導入してもよい。「リプログラミング効率を高める追加の因子」としては、リプログラミング効率を高めることが知られている因子、例えば、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３、ＥＢＮＡ１を使用することができる。「リプログラミング効率を高める追加の因子」は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入されることが好ましい。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているもの、例えば、ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用することができる。
　「体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子」としては、体細胞のリプログラミングを誘導することが知られている転写因子の組み合わせを使用することができ、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びＬ－ｍｙｃの組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８及びＬ－ｍｙｃの組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２及びｃ－ｍｙｃの組み合わせ、またはＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２の組み合わせが挙げられる。体細胞のリプログラミングに必要な転写因子の数は、例えば３～６種類である。
　「転写因子をコードする核酸」は、一例としては、Ｏｃｔ３／４をコードする核酸を含む第１のベクター、Ｓｏｘ２をコードする核酸とＫｌｆ４をコードする核酸とを含む第２のベクター、およびＬ－ｍｙｃをコードする核酸とＬｉｎ２８をコードする核酸とを含む第３のベクターから構成されるベクターセットを用いて、体細胞に導入することができる。ここで、第１のベクター、第２のベクター、および第３のベクターの少なくとも一つは、ベクターに含まれる「転写因子をコードする核酸」と共に発現することが可能な位置で「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を含む。また、上述の第１～第３のベクターから構成されるベクターセットを用いて「転写因子をコードする核酸」を体細胞に導入する場合、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３をコードする核酸を含む第４のベクター、およびＥＢＮＡ１をコードする核酸を含む第５のベクターをベクターセットに組み込んでもよい。
　「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成される。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを介してポリシストロニックに「転写因子をコードする核酸」と連結されるように構成されることが好ましい。例えば、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、２Ａ配列を介してポリシストロニックに「転写因子をコードする核酸」と連結されるように構成されることが好ましい。尚、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」の位置は、転写因子と発光レポータータンパク質とが共に発現可能な位置であればよく、「転写因子をコードする核酸」の上流であってもよいし、下流であってもよい。
　本明細書において「発光レポータータンパク質（luminescent reporter protein）」は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質と対比して用いられ、励起光を照射しないで光を発するように機能するタンパク質である。「発光レポータータンパク質」は、好ましくは生物発光タンパク質、たとえばルシフェラーゼである。生物発光は、生物反応が失われた死細胞では光らないので、アポトーシス等で培養期間中に失活した細胞を除いた生きた細胞を選択的に評価できる点で望ましい。
　「発光レポータータンパク質」は、複数種類の転写因子の１種類と共に発現するように構成されていてもよいし、複数種類の転写因子の全種類と共に発現するように構成されていてもよい。発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌ－ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも１つである。
　「発光レポータータンパク質」が、複数種類の転写因子の２種類以上と共に発現するように構成されている場合、２種類以上の転写因子の発現状態を評価することができる。これにより、体細胞のリプログラミングをより正確に解析することができる。
　発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子が２種類以上（たとえば、２～６種類）である場合、２種類以上の転写因子と共に発現する発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する。すなわち、２種類以上の発光レポータータンパク質は、互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する。ここで発光特性は、例えば発光波長である。このように、２種類以上の発光レポータータンパク質は、互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有するため、後の工程で取得される発光画像において、発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の情報は、他の何れの発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の情報とも分別される。また、後の定量工程では、かかる発光画像に基づいて、発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の発光強度は、個別に（すなわち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量される。
　互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する２種類以上の発光レポータータンパク質としては、例えば、緑色の発光をもたらすＥｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光をもたらすＣＲＢルシフェラーゼ、青色の発光をもたらすウミシイタケルシフェラーゼといった市販されるものを使用することができる。
　また、発光レポータータンパク質として使用されるルシフェラーゼは、高い発光強度を有するように改変された改変体ルシフェラーゼであってもよい。改変体ルシフェラーゼとしては、例えば、ＳｆＲＥ１　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１）、ＯｋｉＭａｄｏ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号２）などを使用することができる。なお、転写因子とルシフェラーゼとの組合せは特に限定されない。
　発光レポータータンパク質は転写因子と共に発現されるため、発光レポータータンパク質をコードする遺伝子の発現のタイミング及び発現量等は、転写因子のそれらに対応しているとみなすことができる。発光レポータータンパク質としてルシフェラーゼを使用した場合、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって細胞内に生じたルシフェラーゼタンパク質は、細胞に対して提供されたルシフェリンを触媒し、その結果ルシフェリンが発光する。したがって、発光に基づいて、転写因子の発現状態等を推定することができる。
　＜発光画像の取得＞
　発光レポータータンパク質の発現に起因する発光を撮像し、発光画像を取得する（Ｓ１２）。　
　発光画像を取得することは、培養処理（Ｓ１１）の期間（培養期間）中に実施され、好ましくは、リプログラミングの初期段階において実施する。ここで、リプログラミングの初期段階とは、細胞が主に二次元的な増殖に留まる、コロニー形成前の段階を含むことができる。また、リプログラミングの初期段階とは、細胞が群集化することで三次元的に隆起が始まる、コロニー形成開始段階を含むことができる。発光画像を取得することは、例えば、リプログラミングが完了する前の時期であって、従来のコロニーの形態を評価するタイミングよりも早い時期に、具体的には「転写因子をコードする核酸」を導入してから（すなわち、リプログラミングの誘導を開始してから）３週間以内に、少なくとも１回は実施される。より具体的には、発光画像を取得することは、「転写因子をコードする核酸」を導入した日～３週間後までの期間に、少なくとも１回は実施される。
　また、発光画像を取得することは、好ましくは、コロニーが形成される前に、具体的には、「転写因子をコードする核酸」を導入してから１週間以内に、少なくとも１回は実施される。より具体的には、発光画像を取得することは、「転写因子をコードする核酸」を導入した日～１週間後までの期間に、少なくとも１回は実施される。
　発光画像を取得することは、好ましくは経時的に繰り返し実施される。撮像は、任意の間隔で連続的に行なわれる。撮像は、一般的には１０～３０分の間隔、例えば１０分の間隔で実施される。また、１回の撮像の時間は任意に設定される。１回の撮像のカメラ露出時間は、例えば３乃至５分間とするが、十分な発光シグナルを検出できるように適宜調整することができる。撮像する間隔は、発光画像が撮像素子により解析可能な程度の画像を生じるための露光時間より長い任意の時間間隔である。一方、リプログラミングの過程は週単位なので、１日おき、または１週間おきに１枚づつ撮像したとしても、ｉＰＳ細胞に成熟する前の細胞を有効に評価することが可能である。
　発光画像の取得可能期間は、「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が細胞内に維持される期間に限定される。「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」をエピソーマルベクターの形態で細胞に導入した場合、発光の撮像は、リプログラミング誘導開始直後、すなわち、エピソーマルベクターを導入してから、エピソーマルベクターが細胞外へ放出されるまで継続することができる。
　発光画像を取得することは、遮光環境下において実施されることが好ましい。より具体的には、発光画像を取得することは、生物発光を撮像するための遮光環境下において、外部からの影響が少ない方法で実施されることが好ましい。発光画像は、遮光環境下で適宜フィルターを使用して取得することができる。なお、検出する発光レポータータンパク質が１種類である場合には、発光画像は、遮光環境下でフィルターを使用せずに取得してもよい。検出する発光レポータータンパク質が複数種類である場合には、発光画像は、遮光環境下で、適宜フィルターを使用して分光した後に取得することが好ましい。なお、発光画像は、フィルターで分光せず、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光が重なり合った画像として取得することも可能である。また、発光画像は、カラーＣＣＤカメラまたはカラーＣＭＯＳカメラを用いて、カラー画像として取得することも可能である。
　発光画像は、発光イメージング装置を用いて、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光を主に通過させるフィルターと、フィルターを透過した光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す処理部とを含む発光イメージング装置を用いて、取得することができる。発光イメージング装置としては、培養機能と撮像機能の両方を備えた発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス）を使用することができる。培養機能を実行している間に撮像機能を所望のタイミングで実行することで、リプログラミングの全ての過程において発光画像を取得することができる。したがって、全過程で時系列的に発光画像を取得した後に、リプログラミングの初期段階に撮像した発光画像を含む複数の発光画像の中から、解析に適している画像を選別することができる。また、同じ培養チャンバー内で同時に培養を開始した複数のコロニーについて、異なる経過時刻の発光画像を選別することで、成長速度が異なるコロニー間で成長度合いが同等のコロニー同士を評価することが可能である。
　好ましくは、発光画像とともに明視野画像を取得する。より好ましくは、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで明視野画像を取得する。明視野画像とは、発光に基づくことなく、照明光を用いて取得される画像であり、細胞又はコロニーの位置及び形態等を観察することができる画像である。明視野画像は、位相差観察画像や微分干渉（ＤＩＣ）観察画像を含む。明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得してもよいし、発光画像の取得からは独立して任意のタイミングで取得してもよい。上記発光イメージングシステム（ＬＶ２００）のような自動化されたシステムにおいては、十分な遮光条件下で、発光画像と明視野画像の両方の撮像機能を、予め指定したタイミングで切り替えながら実行することも可能である。
　＜発光強度の定量＞
　取得された発光画像に基づいて、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度を定量する（Ｓ１３）。　
　検出する発光レポータータンパク質が１種類である場合、発光レポータータンパク質の発光の波長域で検出される発光強度をそのまま定量することができる。
　検出する発光レポータータンパク質が２種類以上である場合には、好ましくは、まず、フィルターで分光し、所定の波長域毎に発光画像を取得する。その後、好ましくは、得られた発光画像に対してアンミキシング処理を行い、複数種類の発光レポータータンパク質の発光の波長域が重なり合う部分を排除した上で、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度を各々分別して定量することができる。後の評価工程において、上記で得られた個々の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度の定量結果から、発光強度の比を算出することも可能である。
　なお、発光強度は、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度の合計値として定量してもよい。この場合、複数種類の発光レポータータンパク質の全体の発現量に関する情報を得ることができる。
　また、検出する発光レポータータンパク質が２種類以上である場合には、カラー画像に基づいて複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光を色分離した後に、それぞれの発光の情報を分別して発光強度を定量することも可能である。
　発光画像を取得することが、経時的に繰り返し実施された場合、発光強度の定量は、好ましくは経時的に繰り返し行われる。この場合も、後の評価工程において、発光強度の定量が行われた各時点において発光強度の比を算出することが可能である。なお、発光強度の定量及び発光強度の比の算出は自動化してもよい。
　＜転写因子の発現状態の評価＞
　定量された発光強度に基づいて、発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子の発現状態を評価する（Ｓ１４）。転写因子の発現状態の評価は、好ましくは、発光強度の定量結果から転写因子の発現量を求めることを含む。
　使用した発光レポータータンパク質が１種類である場合には、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度をそのまま、発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子の発現量に換算することができる。
　使用した発光レポータータンパク質が複数種類である場合には、転写因子の発現状態の評価は、個別に（すなわち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量された発光強度から転写因子の発現量を求めることを含んでいてもよい。この場合、特定の転写因子の発現量と複数種類のルシフェラーゼの各々の発光強度との関係を予め求めておき、共発現する発光レポータータンパク質を変更しても、転写因子の発現量を補正できるようにしておくことが好ましい。
　複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度を、それらの合計値として定量した場合には、転写因子の発現量についても同様に、複数種類の転写因子の全体の発現量として定量される。
　転写因子の発現状態の評価は、好ましくはリプログラミングの初期段階の細胞に対して、より好ましくは「転写因子をコードする核酸」を導入してから３週間以内の細胞に対して、さらに好ましくは「転写因子をコードする核酸」を導入してから１週間以内の細胞に対して、実施する。なお、転写因子の発現状態の評価は、発光画像を取得してすぐに実施してもよいし、事前に取得した発光画像に対して実施してもよい。
　さらに、使用した発光レポータータンパク質が複数種類である場合には、転写因子の発現状態の評価は、個別に（すなわち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量された発光強度から発光強度の比を求めることを含んでいてもよい。
　転写因子の発現状態の評価は、一時点における発光強度の定量結果について実施してもよい。あるいは、発光画像の取得が、経時的に繰り返し実施された場合、転写因子の発現状態の評価は、発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子の発現状態の経時変化を評価することにより行われてもよい。
　したがって、転写因子の発現状態の評価は、リプログラミングの進行に伴う、特定の転写因子の発現強度の経時変化及び／又は複数種類の転写因子の発現強度の比の経時変化を評価することにより行うことが可能である。転写因子の発現状態は、細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である。ここで「多能性の獲得」は、品質の良いｉＰＳ細胞の樹立を意味する。多能性の獲得を評価することで、品質の良い細胞を早期に分別できるので、ｉＰＳ細胞の生産効率を飛躍的に向上させる。
　＜コロニー形成の評価＞
　上記の転写因子の発現状態の評価（Ｓ１４）に加えて、コロニー形成の評価（Ｓ１５）を行なってもよい。コロニー形成の評価（Ｓ１５）は、コロニー形成が起こっているか否かを目視で確認することにより行うことができる。コロニー形成の評価（Ｓ１５）においてコロニー形成が確認された場合、これは、「転写因子をコードする核酸」が細胞に導入され、発現していることを表す。また、コロニー形成の評価（Ｓ１５）は、明視野画像から行うことが好ましい。明視野画像は、コロニー形成を観察できれば特に限定されない。明視野画像は、例えば位相差観察画像又は微分干渉（ＤＩＣ）観察画像である。
　コロニー形成の評価は、「転写因子をコードする核酸」を細胞に導入してから（すなわち、リプログラミングの誘導を開始してから）７日目以降に行うことができる。
　≪体細胞のリプログラミングの解析方法を用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法≫
　図２は、本発明の一実施形態に係るｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法の主な処理の流れを示した図である。本発明の一実施形態に係る方法は、上述の体細胞のリプログラミングの解析方法を用いて、転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）と、ｉＰＳ細胞の品質を評価すること（Ｓ２１およびＳ２２）と、転写因子の発現状態の評価結果とｉＰＳ細胞の品質の評価結果との関係に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成すること（Ｓ２３）とを含む。
　転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）は、上述のとおり、「転写因子をコードする核酸」を細胞に導入してから、好ましくは３週間以内の細胞に対して、より好ましくは１週間以内の細胞に対して、行うことができる。ｉＰＳ細胞の品質を評価すること（Ｓ２１およびＳ２２）は、好ましくは「転写因子をコードする核酸」を細胞に導入してから３乃至４週間後に行うことができる。
　＜ｉＰＳ細胞の品質評価＞
　体細胞のリプログラミングの解析を行ったコロニーのなかから、転写因子のさまざまな発現状態を示すコロニーを選択し、ｉＰＳ細胞の品質の評価として慣用的に使用されている評価を行い（Ｓ２１）、その結果を元に、ｉＰＳ細胞の品質を総合評価する（Ｓ２２）。
　ｉＰＳ細胞の品質の評価（Ｓ２１およびＳ２２）を行うためには、転写因子のさまざまな発現状態（すなわち、発現パターン）を示すコロニーが選択され、例えば、発現パターンＡ、Ｂ、Ｃを示すコロニーが選択される。「発現パターン」は、特定の時点における一種類または複数種類の転写因子の発現パターンであってもよいし、一種類または複数種類の転写因子の経時的な発現変化のパターンであってもよい。特定の発現パターン（例えば、所定の閾値を超える転写因子の発現量を示す発現パターン）を示すコロニーについて、複数個（たとえば１０～１００個）のコロニーを選択することにより、後の工程で、転写因子の発現状態の評価（Ｓ１４）の結果とｉＰＳ細胞の品質の評価（Ｓ２１およびＳ２２）の結果との関連付けの精度が高くなり、これにより、作成されるｉＰＳ細胞の品質評価基準の精度も高くなる。
　ｉＰＳ細胞の品質評価は、ｉＰＳ細胞の品質の評価のために通常行われている公知の評価方法と同様の手法に従って行うことができる。例えば、ｉＰＳ細胞の品質評価（Ｓ２１およびＳ２２）は、コロニーの形態の評価（Ｓ２１１）、リプログラミング状態の評価（Ｓ２１２）、分化能の評価（Ｓ２１３）からなる群から選択される少なくとも１つを含む。ｉＰＳ細胞の品質評価は、好ましくは、コロニーの形態の評価、リプログラミング状態の評価、分化能の評価からなる群から選択される２つ以上を含み、より好ましくは、全てを含む。複数の評価を行った場合には、ｉＰＳ細胞の品質評価は、複数の評価結果を総合評価することを含む。例えば、複数の評価の少なくとも一つの評価結果が良くなかった場合、ｉＰＳ細胞の品質が良くないと総合的に評価することができる。
　（コロニーの形態の評価）
　コロニーの形態の評価は、例えば、コロニーの真円度の評価、コロニーの大きさの評価、及びコロニーの輪郭の明瞭度の評価からなる群から選択される少なくとも１つにより実施することができる。コロニーの形態の評価は、目視によって行なってもよいし、任意の判断基準に基づいて数値化してもよく、前記数値化の工程は自動化してもよい。コロニーの形態に基づき、成熟したｉＰＳ細胞をスクリーニングしたり、成熟後のｉＰＳ細胞の中で明らかに異常な形態を示すものを除いたりすることができる。
　（リプログラミング状態の評価）
　リプログラミング状態の評価は、例えば、アルカリフォスファターゼ活性の解析、核型解析、または未分化マーカーの発現解析により実施することができる。このリプログラミング状態の評価は、とくにコロニー内の多数の細胞がｉＰＳ細胞として成熟しているかどうかを俯瞰するのに適しており、リプログラミングが終了していることを確認するために利用することもできる。
　アルカリフォスファターゼは、多能性幹細胞で高発現するため、未分化状態のマーカーの一つである。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば、公知の手法に従ってアルカリフォスファターゼ染色を行うことにより解析することができる。この解析は、アルカリフォスファターゼ染色により、アルカリフォスファターゼ活性の有無を判定してもよいしアルカリフォスファターゼ活性を定量化してもよい。アルカリフォスファターゼ染色は、例えば、ホルマリン固定後に５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルりん酸（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の混合液からなる基質液を加えて、アルカリフォスファターゼの活性に伴う反応産物を顕微鏡により検出することにより行うことができる。
　核型解析は、例えば、Ｇ－ｂａｎｄ解析により染色体の数や構造の変化を解析することにより行うことができる。
　未分化マーカーの発現解析は、未分化マーカー遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲや未分化マーカータンパク質の免疫染色により行うことができる。未分化マーカーとしては、例えば、ＮａｎｏｇやＯｃｔ３／４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１を用いることができる。
　（分化能の評価）
　ｉＰＳ細胞の分化能の評価は、例えば、三胚葉細胞への分化を誘導した後の、三胚葉分化マーカーの発現解析によって行うことができる。
　分化マーカーの発現解析は、分化マーカーのＲＴ－ｑＰＣＲや分化マーカータンパク質の免疫染色により行うことができる。分化マーカーとしては、例えば、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６、ＭＡＰ２）、中胚葉マーカー（α－ＳＭＡ、Ｂｒａｎｃｈｙｕｒｙ）、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７、ＡＦＰ）を用いることができる。
　＜転写因子の発現状態の評価結果とｉＰＳ細胞の品質の評価結果との対応付け＞
　上述の体細胞のリプログラミングの解析方法によって得られた転写因子の発現状態の評価結果と、上述のｉＰＳ細胞の品質評価によって得られたｉＰＳ細胞の品質の評価結果との対応付けを行う。後者の評価結果は、公知技術に基づくものであるため、この対応付けにより、リプログラミングの初期段階（例えば、リプログラミングの誘導開始から３週間以内）における転写因子の発現状態を、品質の良いｉＰＳ細胞と関連づけることができる。このような関連付けは、たとえば１または２以上の転写因子の発現量が所定の閾値に到達するか否かによって行うことができる。
　品質の良いｉＰＳ細胞と、それらのリプログラミングの初期における転写因子の発現状態とを対応付けた結果に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質を評価するための基準を作成することができる。具体的には、転写因子が特定の発現パターン（例えば、所定の閾値を超える転写因子の発現量を示す発現パターン）を示す複数個のコロニーと、慣用的な品質評価方法で特定された品質の良いｉＰＳ細胞とが関連付けられた場合、この特定の発現パターンをｉＰＳ細胞の品質評価基準として採用することができる。これにより、リプログラミングの初期における転写因子の発現状態から、品質の良いｉＰＳ細胞を選択するための品質評価を行うことが可能になる。また、これにより、コロニーの形態に基づく従来の評価と比較して早い段階で、数値データに裏付けられた客観的なｉＰＳ細胞の品質評価が可能になる。上述の「体細胞のリプログラミングの解析方法による評価」に加えて、「コロニーの形態の評価」と「未分化マーカー及び／又は分化マーカーの発現確認によるｉＰＳ細胞の品質評価」とのうち少なくとも一方を行なうことにより、より正確に、品質の良いｉＰＳ細胞を選抜することが可能になる。
　≪効果≫
　以上説明したように、一実施形態にかかる解析方法によれば、リプログラミングの初期段階、例えば、体細胞への転写因子の導入（すなわち、リプログラミングの誘導開始）時点から３週間以内の期間において、細胞にダメージをほとんど与えることなく定量的に体細胞のリプログラミングを解析することができる。
　従来のリプログラミング状態の評価は、リプログラミングの誘導開始から３乃至４週間後にコロニー形態を目視で評価するのみであった。このような目視による評価に先駆けて、本実施形態の解析方法を用いると、転写因子の発現状態を評価することが可能になる。また、転写因子の発現状態の評価が可能になることで、リプログラミングの初期段階（例えば、リプログラミングの誘導開始から３週間以内）、好ましくはリプログラミングの最初期段階（例えば、リプログラミングの誘導開始から１週間以内）における細胞の状態を把握することができる。さらに、これらの評価結果に基づいて、リプログラミングの初期段階における初期スクリーニングを実施することが可能になる。
　また、一実施形態に係る解析方法によれば、励起光を使用しないため、蛍光による解析方法と比較して、細胞に対して低侵襲な方法で転写因子の発現強度を定量することができる。さらに、この解析方法は、蛍光による解析方法と比較して、定量性にも優れている。具体的には、励起光を使用しない発光による発現量の解析は、以下の点で蛍光よりも優れている。
　（ｉ）低侵襲性
　蛍光タンパク質の検出には、励起光の照射が必要である。励起光の照射は、細胞に光毒性をもたらすことが知られている。例えば、励起光は活性酸素種の生成に関与するため、活性酸素種による酸化的なＤＮＡへの損傷要因となる。また、ＧＦＰに代表される蛍光タンパク質の励起波長では、ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｌｅｂｓ（膜の水泡）や細胞分裂異常が発生する。さらに、蛍光タンパク質の発現自体が細胞死誘導の原因となる。　
　一方、励起光を使用しない発光による発現量の解析は、長期間の観察であっても細胞へのダメージは殆どない。また、発光レポータータンパク質の発現は細胞に対して無害である。
　（ｉｉ）高定量性
　定量性に影響を与える要素として、自家蛍光の有無やタンパク質の細胞内半減期の長さ、そしてタンパク質の成熟に要する時間の長さが挙げられる。
　例えば、蛍光タンパク質の検出時には、多くの場合、自家蛍光が観察される。　
　一方で、発光レポータータンパク質の検出時には、自家蛍光によるバックグラウンドが観察されないため、定量性に優れている。
　また、蛍光タンパク質の細胞内半減期は長く、例えば、２０時間程度要する。そのため、発現量が低下するタイミングを正確に検出することが困難である。　
　一方で、発光レポータータンパク質の細胞内半減期は、例えば、３時間程度である。このため、蛍光タンパク質を用いた解析と比較して発現量の変化の追従性に優れている。
　さらに、蛍光タンパク質の成熟には、最短でも３時間、最長では２０時間を要する。特に、赤色蛍光は、成熟過程で緑色蛍光を経てから赤色に成熟するため、成熟過程で緑色蛍光との区別が困難となる。　
　一方で、ルシフェラーゼなどの発光レポータータンパク質は、発現が誘導され次第即座に成熟する。そのため、発光による検出は、リプログラミングの初期段階のモニタリングに適している。
　以上のように、本実施形態に係る解析方法は、侵襲性に優れているだけでなく、定量性にも優れている。そのため、本実施形態にかかる解析方法を、ｉＰＳ細胞の作製工程の最上流であるリプログラミングの初期段階において実施すると、転写因子の発現量の微量な変動を、細胞にダメージを与えることなく解析することができる。また、発光による発現状態の評価は、従来の評価方法、すなわち目視によるコロニーの形態評価などの技術者の感覚的な基準による方法と比較して、定量的且つ客観的な方法である点で優れている。
　また、一実施形態に係る解析方法によれば、リプログラミングを誘導する目的で細胞に導入した外来性の転写因子のいくつかは発光レポータータンパク質と共に発現するため、転写因子の発現量を発光強度によって直接的に解析することができる。そのため、従来のプロモーターアッセイによる間接的な発現量評価と比較して、実際の発現量を把握することが可能になる。
　一実施形態に係る解析方法によると、例えば、コロニーを形成する細胞集団における転写因子の発現分布を発光画像から解析することが可能となる。当該技術分野では、ｉＰＳ細胞を樹立する際に、ｉＰＳ細胞の作製効率の観点から、コロニーの中心の一部の細胞のみを物理的に分取するように選択することが一般に行われている。したがって、コロニーを形成する細胞集団における転写因子の発現分布を解析することにより、細胞を分取することなく、コロニーの中心部に存在する細胞集団のなかから、転写因子が適切に発現している細胞を、画像解析またはディスプレー等の表示手段に表示された画像に基づき選抜することが可能となる。コロニーの中心部と中心部からみて複数の方角に相当するコロニーの周辺部のそれぞれにおける発光強度および／または発光量の増加率から、細胞ごとのｉＰＳ細胞樹立過程、すなわち多能性の獲得状態を把握することができる。さらに、明視野観察、このましくは位相差観察のための公知の光学系を用いて明視野画像を取得し、この明視野画像を発光画像と重ね合わせることで、リプログラミングの過程における細胞の形態的な変化と関連付けたｉＰＳ細胞の品質評価の指標を提供できる。とくに位相差観察画像と発光画像の両方をリプログラミングの異なる過程で繰り返し取得することで、コロニーの厚みの変化と遺伝子発現量とを関連付けたｉＰＳ細胞の品質評価が可能となる点で好ましい。
　さらに、一実施形態に係る解析方法を用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法によれば、従来の評価法に基づいて選抜された品質の良いｉＰＳ細胞と、リプログラミングの初期（例えば、リプログラミングの誘導開始から３週間以内）、好ましくはリプログラミングの最初期（例えば、リプログラミングの誘導開始から１週間以内）における転写因子の発現状態の評価結果とが対応付けられるため、これまでにない新たなｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成することが可能になる。また、これによって基準が作成されれば、品質の良いｉＰＳ細胞に将来なることが予想される細胞をリプログラミングの初期段階でスクリーニングすることができ、品質の良いｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることが可能になる。
　以下に、本発明の実施例を記載する。本実施例では、リプログラミングの誘導因子として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－ｍｙｃ及びＬｉｎ２８を使用した。これらの誘導因子のうちＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のそれぞれに、発光レポータータンパク質としてルシフェラーゼを連結し、各誘導因子の発現状態を発光画像から評価した。
　＜１．方法＞
　（１－１．ベクターの作成）
　リプログラミングの誘導のために、以下の５種類のエピソーマルベクターを準備した。
（１）Ｏｃｔ３／４及びＳｆＲＥ１ルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－ＳｆＲＥ１）
（２）Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－ＯｋｉＭａｄｏ）
（３）Ｌ－ｍｙｃ及びＬｉｎ２８を発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ）
（４）マウスｐ５３のドミナントネガティブ変異体を発現するベクター（ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ）
（５）ＥＢＮＡ１を発現するベクター（ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１）
　これら５種類のベクターを「改変型ベクターセット」という。転写因子については、Okita K, et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5):409-412. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.を元に選択した。
　以下に、（１）～（５）の発現ベクターの詳細を記す。
　（１）ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－ＳｆＲＥ１
　ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－ＳｆＲＥ１は、Ｏｃｔ３／４と共に、発光レポータータンパク質としてＳｆＲＥ１ルシフェラーゼが発現するように調製した。　
　具体的には、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＫｐｎ　Ｉ及びＢｇｌ　ＩＩで消化し、図３Ａに示すように、ｈＯＣＴ３／４の下流に、２Ａ配列を介してＳｆＲＥ１　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１）を組み込むことにより、発現ベクターを調製した。
　（２）ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－ＯｋｉＭａｄｏ
　ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－ＯｋｉＭａｄｏは、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に、発光レポータータンパク質としてＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼが発現するように調製した。　
　具体的には、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＳｐｈＩ及びＢｇｌ　ＩＩで消化し、図３Ｂに示すように、ＫＬＦ４の下流に、２Ａ配列を介してＯｋｉＭａｄｏ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号２）を組み込むことにより、発現ベクターを調製した。なお、図３Ｂに示されるＫｐｎＩのサイトに関しては、ＫＬＦ４の内部からＫｐｎＩサイトを含む、ストップコドンを削除した配列を人工合成して挿入した。
　（３）ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ
　ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。
　（４）ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ
　ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。
　（５）ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１
　ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。
　比較対象としてのリプログラミングの誘導については、上記（３）乃至（５）のベクターに加えて、以下の（６）及び（７）のベクターを用いた。これら５種類のベクターを「コントロールベクターセット」という。
　（６）ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３
　ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。
　（７）ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ
　ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。
　以下に、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼおよびＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの塩基配列を記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（１－２．遺伝子導入および細胞の培養）
　ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄより入手）を解凍し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ及びＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素）で培養した。細胞の培養には２４ｗｅｌｌ培養プレートを使用した。細胞を密度２．５×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行なわずに、３７℃、５％　ＣＯ２の環境下において７日間培養した。
　７日間の培養後、ＰＢＭＣに「改変型ベクターセット」を、Ａｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ）を用いたエレクトロポレーションにより導入した。コントロールとして、ＰＢＭＣに「コントロールベクターセット」を同様の手法で導入した。
　その後、事前にコーティング剤（ｉＭａｔｒｉｘ、ニッピ）でコートした６ｗｅｌｌ培養プレートに、ベクターを導入したＰＢＭＣを播種し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ及びＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素）で、３７℃、５％　ＣＯ２の環境下において一晩培養した。なお、播種密度は２×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとした。
　翌日以降、すなわち、ベクター導入後の翌々日以降については、１．５ｍＬの培地（ＡＫ０２、味の素）を一日毎に加えて培養を継続した。ベクター導入後８日目に、ｉＰＳ細胞様コロニーが形成された後、２ｍＬの培地（ＡＫ０２、味の素）に交換して培養を行った。
　（１－３．発光画像の取得）
　「改変型ベクターセット」を細胞に導入し、翌日から、ｉＰＳ細胞コロニーが形成され始めると予想される８日後まで、発光画像の取得を行なった。
　ルシフェラーゼの触媒作用による発光については、培地中にルシフェリンを終濃度１ｍＭで添加することで観察した。　
　発光画像の取得については、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス）を用い、ＣＣＤカメラにはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス）を用いた。撮像の条件としては、ｂｉｎｎｉｎｇを１×１とし、ＥＭ－ｇａｉｎを１２００とした。ベクター導入後１日目の細胞の発光については×２０の倍率の対物レンズを使用し、カメラの露出時間を３分として撮像し、発光画像を取得した。８日目のコロニーの発光については、×４又は×２０の倍率の対物レンズを使用し、カメラの露出時間を５分として撮像し、発光画像を取得した。
　ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光については、５１５－５６０ＨＱのフィルターを使用して分光した。ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現に起因する発光については、６１０ＡＬＰフィルターを使用して分光した。
　（１－４．発光強度の定量）
　ベクター導入後１日目の細胞及び８日目のｉＰＳ様細胞コロニーを撮像した発光画像のそれぞれについて、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度を定量した。定量については、画像解析ソフト（セルセンス（オリンパス））を用いた。このとき、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの波長域が重複する部分をアンミキシング処理により排除した。
　アンミキシング処理に先立ち、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼおよびＳｆＲＥ１ルシフェラーゼをそれぞれ単独で導入したＰＢＭＣの発光イメージングを行い、各ルシフェラーゼのフィルター透過率を算出した。発光成分ＯｋｉＭａｄｏについて、フィルターを使用しないときの発光イメージング結果の輝度値に対するフィルター５１５－５６０ＨＱ、６１０ＡＬＰを使用したときの発光イメージング結果の輝度値からフィルター透過率「T1o」、「T2o」を決定した。同様に、発光成分ＳｆＲＥ１についてもフィルター透過率「T1s」、「T2s」を決定した。フィルター５１５－５６０ＨＱ、６１０ＡＬＰを用いて測定されるシグナル値を「F1」、「F2」とした。各フィルター測定値は、各発光成分に対し当該フィルターを用いて計測される割合（透過率）を掛け合わせた和として表される。このことから、以下の連立方程式：
F1 = T1o・OkiMado　+ T1s・SfRE1
F2 = T2o・OkiMado　+ T2s・SfRE1
を解くことで、ＯｋｉＭａｄｏおよびＳｆＲＥ１のそれぞれの発光成分を求めることが出来る。
　（１－５．アルカリフォスファターゼ活性の評価）
　「改変型ベクターセット」を導入して８日目であり、且つ発光が確認されたｉＰＳ様細胞コロニーと、「コントロールベクターセット」を導入して８日目のｉＰＳ様細胞コロニーとを、ホルマリン固定後、市販のキットを用いてアルカリフォスファターゼ染色により処理した。
　＜２．結果及び考察＞
　（２－１．ベクター導入後１日目の細胞の発光画像の取得）
　「改変型ベクターセット」を導入した翌日のＰＢＭＣにおける発光を観察し、図４の発光画像を取得した。
　図４の中央図は、５１５－５６０ＨＱフィルターで分光した、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。　
　図４の下図は、６１０ＡＬＰフィルターで分光した、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。
　図４の上図は、図４の中央図と下図と位相差観察画像とを重ね合わせた画像を示す。
　図４に示すように、ベクター導入後１日目から、Ｏｃｔ３／４の発現を示すＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の発現を示すＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光とが確認された。これらの画像から明らかなように、発光は、ベクターが導入された細胞と推定される一部の細胞でのみ認められた。
　これらの結果から、互いに異なる波長域を有するルシフェラーゼであれば、同一の細胞内で複数のルシフェラーゼによる発光を分光して観察可能であること、そして、転写因子と共に発光レポータータンパク質が発現するように構成されたベクターを用いることで、転写因子の発現を発光画像から確認可能であることが示された。
　また、播種したＰＢＭＣ全体の中で、Ｏｃｔ３／４と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４とを発現している細胞の位置を目視により観察可能となるため、細胞の位置情報を記録しておくことで、以降の経時的な解析においても、同一の細胞を追跡可能であることが示唆された。
　（２－２．ベクター導入後８日目のｉＰＳ様細胞コロニーの発光画像の取得）
　「改変型ベクターセット」を導入後８日目のｉＰＳ様細胞コロニーにおける発光を観察し、図５及び図６に示す発光画像を取得した。
　図５は、×４の倍率の対物レンズで撮像した画像である。　
　図５の上図は位相差観察画像（ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示す。　
　図５の中央図は、５１５－５６０ＨＱフィルターで分光した、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。　
　図５の下図は、６１０ＡＬＰフィルターで分光した、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。
　図５の上図の位相差観察画像に示すように、コロニーの形成を観察することができた。このことは、位相差観察画像の取得によってコロニー形成の評価が可能であることを示している。
　図５の中央図の発光画像に示すように、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光がコロニー内に広く認められた。このことは、コロニーを形成する多くの細胞で、Ｏｃｔ３／４が発現していることを示している。
　図５の下図の発光画像に示すように、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光がコロニー内に広く認められた。このことは、コロニーを形成する多くの細胞で、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４が発現していることを示している。
　図５の上図に白四角形で図示した範囲について、×２０の倍率の対物レンズで撮像した結果を図６に示す。図６は、５１５－５６０ＨＱフィルターで分光したＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光画像と、６１０ＡＬＰフィルターで分光したＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光画像と、位相差観察画像とを重ね合わせた画像を示す。
　図５及び図６の結果から、ベクターが正常に導入された細胞が増殖し、コロニーを形成したことが示された。また、ベクター導入後、８日経っても発光画像を取得できたことから、転写因子の発現に伴うＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現は、一過的なものではなく、コロニーを形成した後にも発現が持続する長期的なものであることが示された。これらの結果から、経時的な発光画像の取得が可能であることが示唆された。
　さらに、コロニーの部位ごとの観察が可能であるため、コロニー内の各部位における転写因子の発現状態を観察することができ、コロニー内における各転写因子の発現量の均質性を視覚的に確認可能であることが明らかになった。このことは、従来のＲＴ－ｑＰＣＲによる転写因子の発現量の解析がコロニー全体に対してのみ可能であったのに対し、より高精度の解析が可能となることを示唆している。
　（２－３．発光強度の定量）
　発光画像から、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光の発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光の発光強度を定量した。
　図４の上図の画像に図示した領域ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、発光画像から、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光が確認できた細胞を含むように任意に選択したものである。これらの領域について、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度をそれぞれ定量し、グラフ化した結果を図７に示す。
　図７のグラフに示すように、領域ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅに含まれる細胞において、Ｏｃｔ３／４と共に発現したＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の発光強度と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に発現したＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の発光強度とを各々独立に定量した結果が得られた。
　この結果から、転写因子の発現に伴うルシフェラーゼの発現に起因した発光の発光強度は、各々の細胞について定量可能であることが明らかとなった。
　図６に図示した領域ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは、ｉＰＳ様細胞コロニーの発光画像から、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光が確認できた部位を任意に選択したものである。これらの領域について、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度をそれぞれ定量し、グラフ化した結果を図８に示す。
　図８のグラフに示すように、領域ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊにおいて、Ｏｃｔ３／４と共に発現したＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の発光強度と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に発現したＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の発光強度とを各々独立に定量した結果が得られた。
　この結果から、転写因子の発現に伴うルシフェラーゼの発現に起因した発光の発光強度は、コロニーを形成した状態の細胞についても定量が可能であることが明らかとなった。また、図７及び図８の結果から、ベクターの導入後１日目及び８日目で全ての転写因子に関する遺伝子発現が上昇しており、且つ定量が可能であったことから、発光強度を定量する工程は経時的に繰り返し実施することが可能であることが示された。
　また、発光強度は、数値データとして取得されるため、複数のルシフェラーゼの発現に起因した発光の発光強度の比をとることも可能であることが示された。
　さらに、ルシフェラーゼの発現は、その上流に２Ａ配列を介して連結される転写因子の発現に伴うことから、定量された発光強度は、転写因子の発現量を反映している。そのため、ルシフェラーゼの発光強度とＲＴ－ｑＰＣＲなどの手法を用いて定量され得る転写因子の発現量との関係を予め求めておくことで、発光強度の定量から転写因子の発現量を算出することも可能であることが示唆された。このように、発光画像に基づいて転写因子の発現状態を評価することが可能であることが示された。
　（２－４．リプログラミング状態の評価）
　「改変型ベクターセット」を導入したＰＢＭＣ、及び「コントロールベクターセット」を導入したＰＢＭＣにおいて、導入後８日目のリプログラミング状態を、多能性マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性の評価によって評価した。
　図９は、改変型ベクターセットを導入して８日目のＰＢＭＣのアルカリフォスファターゼ活性を検出した明視野画像である。　
　図１０は、コントロールベクターセットを導入して８日目のＰＢＭＣのアルカリフォスファターゼ活性を検出した明視野画像である。
　図９に示すように、改変型ベクターを導入して得られたｉＰＳ様細胞コロニーは染色されており、アルカリフォスファターゼ活性が陽性であった。
　この結果は、図１０に示すコントロールベクターセットを導入して得られたｉＰＳ様細胞コロニーの染色結果と同程度であった。
　これらの結果から、改変型ベクターセットを導入してｉＰＳ細胞を誘導した場合にも、コントロールベクターセットを導入してｉＰＳ細胞を誘導した場合と同程度に、良好にリプログラミングが進行することが示唆された。このことは、転写因子と共にルシフェラーゼが発現するように改変したベクターを使用しても、体細胞のリプログラミングを評価可能であることを示している。このことは、ｉＰＳ細胞の誘導に使用する転写因子とルシフェラーゼとの組合せを変更しても同様であると予想される。
　また、図５及び図６からｉＰＳ様細胞コロニーを形成する細胞の多くで発光が認められ、そのｉＰＳ様細胞コロニーはアルカリフォスファターゼ活性が陽性であったことから、発光が、リプログラミング状態と関連することが示された。また、図６のように、位相差画像を併用することで、ｉＰＳ様に成長した状態のコロニーかどうかを試薬を用いずに確認することができた。とくに、位相差画像と発光画像とを重ね合わせた場合には、コロニー内の厚みが異なる部位同士で発光強度を比較することが可能であり、総合判定の精度を高めることが示唆された。本発明の方法によれば、リプログラミング過程の転写因子の発現を発光画像から観察し、定量することが可能となる。また、その結果を、ｉＰＳ細胞の品質評価結果と対応付けることで、品質の良いｉＰＳ細胞が初期化過程で示す転写因子の発現状態の基準を作成することが可能となることが示唆される。また、そのようにしてｉＰＳ細胞の品質評価基準が作成されれば、品質の良いｉＰＳ細胞コロニーをリプログラミングの初期の段階で細胞に低侵襲且つ定量的な方法で選択可能であることが示唆された。さらに、ｉＰＳ細胞の成長に最適な転写因子を探索するための評価方法としても利用できる。

Claims (18)

  1. 　体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞の培養期間中に、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る発光画像を取得することと、
    　前記発光画像に基づいて前記発光の発光強度を定量することと、
    　前記発光強度に基づいて、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態を評価することと
    　を含み、
    　前記発現状態は、前記細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である、体細胞のリプログラミングの解析方法。
  2. 　前記転写因子の発現状態を評価することは、前記発光強度の定量結果から前記転写因子の発現量を求めることを含む請求項１に記載の方法。
  3. 　前記発光画像を取得することは、前記転写因子をコードする核酸を前記細胞に導入した後３週間以内に少なくとも１回は実施される請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記発光画像を取得することは、前記転写因子をコードする核酸を前記細胞に導入した後１週間以内に少なくとも１回は実施される請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記発光画像を取得することは、経時的に繰り返し実施され、
    　前記発現状態を評価することは、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態の経時変化を評価することである、
    請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法。
  6. 　前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌ－ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
  7. 　前記複数種類の転写因子のうち、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子は２種類以上であり、
    　２種類以上の前記転写因子と共に発現する前記発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する発光レポータータンパク質であり、
    　前記発光画像は、前記発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の情報が、他の何れの発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の情報とも分別され得る画像であり、
    　前記発光強度を定量することは、前記発光画像に基づいて、前記発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の発光強度を個別に定量することを含む、
    請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
  8. 　前記発現状態を評価することは、前記個別に定量された前記発光強度から前記転写因子の発現量を求めることを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記発現状態を評価することは、前記個別に定量された前記発光強度から発光強度の比を求めることを含む、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　前記細胞の明視野画像を取得し、前記細胞によるコロニー形成の評価を行うことをさらに含む、請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法。
  11. 　前記発光レポータータンパク質は生物発光レポータータンパク質である、請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法。
  12. 　前記発光レポータータンパク質はルシフェラーゼである、請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法。
  13. 　前記発光画像を取得することは遮光環境下で実施される、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法。
  14. 　前記転写因子をコードする前記核酸と前記発光レポータータンパク質をコードする前記核酸とは、エピソーマルベクターの形態で前記細胞へ導入される、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法。
  15. 　請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法を用いて、前記転写因子の発現状態の評価結果を得ることと、
    　前記細胞がリプログラミングされることで作製されたｉＰＳ細胞の品質を評価してｉＰＳ細胞の品質の評価結果を得ることと、
    　前記転写因子の発現状態の評価結果と前記ｉＰＳ細胞の品質の評価結果との関係に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成することと
    　を含むｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法。
  16. 　前記ｉＰＳ細胞の品質を評価することは、前記細胞が形成するコロニーの形態を評価することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記ｉＰＳ細胞の品質を評価することは、アルカリフォスファターゼ活性の解析、核型解析、又は未分化マーカーの発現解析により前記細胞のリプログラミング状態を評価することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　前記ｉＰＳ細胞の品質を評価することは、三胚葉への分化誘導後に、分化マーカーの発現解析により前記ｉＰＳ細胞の分化能を評価することを含む、請求項１５乃至１７の何れか１項に記載の方法。
PCT/JP2016/084511 2016-11-21 2016-11-21 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法 WO2018092321A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2016/084511 WO2018092321A1 (ja) 2016-11-21 2016-11-21 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法
JP2018551012A JPWO2018092321A1 (ja) 2016-11-21 2016-11-21 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法
US16/297,612 US20190352727A1 (en) 2016-11-21 2019-03-09 METHOD FOR ANALYZING SOMATIC CELL REPROGRAMMING, AND METHOD FOR SETTING UP QUALITY EVALUATION CRITERIA FOR iPS CELL USING THE METHOD

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2016/084511 WO2018092321A1 (ja) 2016-11-21 2016-11-21 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/297,612 Continuation US20190352727A1 (en) 2016-11-21 2019-03-09 METHOD FOR ANALYZING SOMATIC CELL REPROGRAMMING, AND METHOD FOR SETTING UP QUALITY EVALUATION CRITERIA FOR iPS CELL USING THE METHOD

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018092321A1 true WO2018092321A1 (ja) 2018-05-24

Family

ID=62145338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/084511 WO2018092321A1 (ja) 2016-11-21 2016-11-21 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20190352727A1 (ja)
JP (1) JPWO2018092321A1 (ja)
WO (1) WO2018092321A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200158719A1 (en) * 2017-07-28 2020-05-21 Olympus Corporation Method of specifying cell, method of producing cell population and cell specifying system
JPWO2020179071A1 (ja) * 2019-03-07 2020-09-10

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111243677B (zh) * 2020-01-07 2023-04-14 北京唐颐惠康生物医学技术有限公司 一种基于细胞质量保证的时间控制方法及系统

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012500005A (ja) * 2008-08-12 2012-01-05 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド ｉＰＳ細胞を生成するための方法
JP2014014352A (ja) * 2012-06-11 2014-01-30 Olympus Corp 幹細胞の状態を同定する方法
JP2014176364A (ja) * 2013-03-15 2014-09-25 Olympus Corp 幹細胞の解析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012500005A (ja) * 2008-08-12 2012-01-05 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド ｉＰＳ細胞を生成するための方法
JP2014014352A (ja) * 2012-06-11 2014-01-30 Olympus Corp 幹細胞の状態を同定する方法
JP2014176364A (ja) * 2013-03-15 2014-09-25 Olympus Corp 幹細胞の解析方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONAI, K. ET AL.: "Establishment of a reporter system to monitor silencing status in induced pluripotent stem cell lines", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 443, 2013, pages 104 - 112, XP028757534, DOI: doi:10.1016/j.ab.2013.08.014 *
PAPAPETROU, E. P. ET AL.: "Stoichiometric and temporal requirements of Oct4, Sox2, Kil4, and c-Myc expression for efficient human iPSC induction and differentiation", PNAS, vol. 106, no. 31, 2009, pages 12759 - 12764, XP002560045, DOI: doi:10.1073/pnas.0904825106 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200158719A1 (en) * 2017-07-28 2020-05-21 Olympus Corporation Method of specifying cell, method of producing cell population and cell specifying system
JPWO2020179071A1 (ja) * 2019-03-07 2020-09-10
WO2020179071A1 (ja) * 2019-03-07 2020-09-10 オリンパス株式会社 ｉＰＳ細胞の選定方法、及びｉＰＳ細胞の作製方法
JP7321247B2 (ja) 2019-03-07 2023-08-04 オリンパス株式会社 ｉＰＳ細胞の選定方法、ｉＰＳ細胞の作製方法、及び制御装置

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018092321A1 (ja) 2019-10-10
US20190352727A1 (en) 2019-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200191776A1 (en) Diagnostic methods for neural disorders
JP6890846B2 (ja) ｍｉＲＮＡの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法
EP2551343B1 (en) Method for monitoring state of differentiation in a stem cell
WO2018092321A1 (ja) 体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法
US20200158719A1 (en) Method of specifying cell, method of producing cell population and cell specifying system
WO2018122932A1 (ja) 細胞の選別方法、純化された細胞集団の製造方法、及び発光イメージングシステム
JP6116226B2 (ja) 幹細胞の状態を同定する方法
JP2014176364A (ja) 幹細胞の解析方法
JP6518763B2 (ja) 発光観察方法
JP7321247B2 (ja) ｉＰＳ細胞の選定方法、ｉＰＳ細胞の作製方法、及び制御装置
Xu et al. New rabies viral resources for multi-scale neural circuit mapping
WO2016189583A1 (ja) 生体試料の解析方法
WO2016189628A1 (ja) 発光測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018551012

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16921512

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16921512

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1