NO20101695A1 - Immunoglobuliner med dobbelt-variabelt domene, og anvendelse derav - Google Patents

Immunoglobuliner med dobbelt-variabelt domene, og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO20101695A1
NO20101695A1 NO20101695A NO20101695A NO20101695A1 NO 20101695 A1 NO20101695 A1 NO 20101695A1 NO 20101695 A NO20101695 A NO 20101695A NO 20101695 A NO20101695 A NO 20101695A NO 20101695 A1 NO20101695 A1 NO 20101695A1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
abeta
binding
antigen
disease
Prior art date
Application number
NO20101695A
Other languages
English (en)
Inventor
Tariq Ghayur
Alfred Hahn
Bernhard Mueller
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41398843&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO20101695(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of NO20101695A1 publication Critical patent/NO20101695A1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A61P25/10—Antiepileptics; Anticonvulsants for petit-mal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen angår konstruerte multivalente og multispesifikke bindende proteiner, fremstillingsmetoder, og spesifikt til deres anvendelser i forhindring, diagnose, og/eller behandling av sykdom.

Description

IMMUNOGLOBULINER MED TO VARIABLE DOMENER OG ANVENDELSER DERAV
Referanse til Beslektede Søknader
Denne søknaden er en ikke-provisorisk søknad som krever prioritet fra U.S. Provisorisk Søknad Serie Nr. 61/130,776, innlevert juni 3, 2008 og U.S. Provisorisk Søknad Serie Nr. 61/132,951, innlevert juni 24, 2008, viss innhold herved er inkorporert ved referanse.
Teknisk område ifølge oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelsen angår multivalente og multispesifikke bindende proteiner, fremstillingsmetoder, og spesifikt deres anvendelser i diagnose, forhindring og/eller behandling av akutt og kronisk inflammatoriske sykdommer, kreft, og andre sykdommer.
Bakgrunnen for oppfinnelsen
Konstruerte proteiner, slik som multispesifikke antistoffer i stand til å binde to eller flere antigener er kjent i teknikken. Slike multispesifikke bindende proteiner kan bli fremstilt ved å bruke cellefusjon, kjemisk konjugering, eller rekombinante DNA-teknikker.
Bispesifikke antistoffer har blitt produsert ved å bruke "quadroma"-teknologi (se Milstein, C. og A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) basert på den somatiske fusjonen av to forskjellige hybridomen celle-linjer som uttrykker murine monoklonale antistoffer (mAb'er) med de ønskede spesifisitetene til det bispesifikke antistoffet. På grunn av den tilfeldige parringen av to forskjellige immunoglobulin (lg) tung- og lettkjeder innenfor den resulterende hybrid-hybridoma (eller quadroma) celle-linjen, blir opptil ti forskjellige Ig-spesier fremstilt, av hvilke bare ett er et funksjonelt bispesifikt antistoff. Nærværet av feilparrede biprodukter, og betydelig reduserte produksjonsutbytter, betyr ved sofistikerte renseprosedyrer er nødvendig.
Bispesifikke antistoffer kan også bli produsert ved kjemisk konjugering av to forskjellige mAb'er (se Staerz, U.D., et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31). Denne metoden gir ikke homogent preparat. Andre metoder har anvendt kjemisk konjugering av to forskjellige mAb'er eller mindre antistoff-fragmenter (se Brennan, M., et al. (1985) Science 229(4708): 81-3).
En annen metode anvendt for å produsere bispesifikke antistoffer er koblingen av to moder-antistoffer med en hetero-bifunksjonell krysslinker, men de resulterende bispesifikke antistoffene lider av betydelig molekylær heterogenitet fordi reaksjonen av krysslinkeren med moder-antistoffene ikke er rettet mot et spesifikt sete. For å oppnå mer homogene preparater av bispesifikke antistoffer har to forskjellige Fab-fragmenter blitt kjemisk krysslinket ved deres hengselcystein-residuer på en seterettet måte (se Glennie, M.J., et al. (1987) J. Immunol. 139(7): 2367-75). Men denne metoden resulterer i Fab'2 fragmenter, ikke hele IgG-molekyl.
Et stort utvalg av andre rekombinante bispesifikke antistoff-formater har blitt utviklet (se Kriangkum, J., et al. (2001) Biomol. Eng. 18(2): 31-40). Blant dem er tandem enkelt-kjede Fv molekyler og diabodier, og diverse derivater derav, de mest vanlig anvendte. Rutinemessig starter konstruksjonen av disse molekyler fra to enkelt-kjede Fv (scFv) fragmenter som gjenkjenner forskjellige antigener (se Economides, A.N., et al. (2003) Nat. Med. 9(1): 47-52). Tandem scFv molekyler (taFv) representerer et enkelt format ved enkelt å koble de to scFv-molekylene med en ytterligere peptid-linker. de to scFv-fragmentene tilstede i disse tandem scFv-molekylene danner separat foldete enheter. Diverse linkere kan bli anvendt for å knytte sammen de to scFv-fragmentene og linkere med en lengde på opp til 63 residuer (se Nakanishi, K., et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 423-74). Selv om moder scFv-fragmentene normalt kan bli uttrykt i løselig form i bakterier, er det imidlertid ofte observert ved tandem scFv-molekylene danner uløselige aggregater i bakterier. Følgelig blir refoldingsprotokoller eller anvendelsen av mammaliske uttrykkingssystemer rutinemessig anvendt for å produsere løselige tandem scFv-molekyler. I et nylig studie ble in vivo uttrykking av transgene kaniner og kyr av en tandem scFv rettet mot CD28 og et melanom-assosiert proteoglykan rapportert (se Gratie, J.A., et al. (1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401). I denne konstruksjonen ble de to scFv-molekylene knyttet sammen ved en CH1-linker og serumkonsentrasjoner på opp til 100 mg/L av det bispesifikke antistoffet ble funnet. Diverse strategier inkludert variasjoner i domenerekkefølgen eller ved å bruke midt-linkere med varierende lengde eller fleksibilitet ble anvendt for å tillate løselig uttrykking i bakterier. Noen få studier har nå rapportert uttrykking av løselige tandem scFv-molekyler i bakterier (se Leung, B.P., et al. (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9; Karni, A., et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40) ved å bruke enten en veldig kort Ala3-linker eller lange glycin/serin-rike linkere. I et annet nylig studie, fag-fremvisning av et tandem scFv-repertoar inneholdende randomiserte midt-linkere med en lengde på 3 eller 6 residuer ble anvendt for å berike med de molekyler som blir produsert i løselig og aktiv form i bakterier. Denne metoden resulterte i isoleringen av et tandem scFv-molekyl med en linker med 6 aminosyreresiduer (se Arndt, M. og J. Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21). Det er uklart om denne linker-sekvensen representerer en generell løsning på den løselige uttrykkingen av tandem scFv-molekylene. Iallefall demonstrerer dette studiet ved fag-fremvisning av tandem scFv-molekylene i kombinasjon med styrt mutagenese er er et kraftig verktøy for å berike med disse molekyler, som kan bli uttrykt i bakterier i en aktiv form.
Bispesifikke diabodier (Db) benytter seg av diabody-formatet for uttrykking. Diabodier blir produsert fra scFv-fragmenter ved å redusere lengden av linkeren som knytter VH- og VL-domenet til omtrent 5 residuer (se Peipp, M. og T. Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11). Denne reduksjonen av linkerstørrelse legger til rette for dimerisering av to polypeptidkjeder ved kryssoverparring av VH- og VL-domener. Bispesifikke diabodier blir produsert som uttrykker, to polypeptidkjeder med, enten strukturen VHA-VLB og VHB-VLA (VH-VL konfigurasjon), eller VLA- VHB og VLB-VHA (VL-VH konfigurasjon) innenfor den samme cellen. Et stort antall av forskjellige bispesifikke diabodier har blitt produsert tidligere og mesteparten av dem blir uttrykt i løselig form i bakterier. Imidlertid demonstrerer en nylig sammenligningsstudie ved retningen til de variabelt domenene kan påvirke uttrykking og dannelse av aktive bindingsseter (se Mack, M. et al.(1995) Proe. Nati. Acad. Sei. U S en 92(15): 7021-5). Allikevel representerer løselig uttrykking i bakterier en viktig fordel over tandem scFv-molekylene. Siden to forskjellige polypeptidkjeder blir uttrykt innenfor en enkelt celle kan imidlertid uaktive homodimerer bli produsert sammen med aktive heterodimerer. Dette nødvendiggjør innføringen av ytterligere rensetrinn for å oppnå homogene preparater av bispesifikke diabodier. En fremgangsmåte for å fremtvinge dannelsen av bispesifikke diabodier er produksjonen av "knapp-til-hull"-diabodier (se Holliger, P., T. Prospero, og G. Winter
(1993) Proe. Nati. Acad. Sei. U S en 90(14): 6444-8.18). Denne metoden ble demonstrert for en bispesifikk diabody rettet mot HER2 og CD3. En stor "knapp" ble introdusert i VH-domenet ved å bytte ut Val37 med Fe og Leu45 med Trp og et komplementært hull ble produsert i VL-domenet ved å mutere Fe98 til Met og Tyr87 til Ala, enten i de anti-HER2- eller anti-CD3-variabelt domenene. Ved å bruke denne metoden kunne produksjonen av bispesifikke diabodier bli økt fra 72% ved hjelp av moder diabodien til over 90% ved "knapp-til-hull"-diabodien. Viktig nok synker produksjonsutbyttet bare såvidt som et resultat av disse mutasjoner. Imidlertid ble en reduksjon i antigen-bindingsaktivitet observert for flere konstruksjoner. Følgelig krever denne ganske omstendelige fremgangsmåten analysen av diverse konstruksjoner for å identifisere de mutasjoner som produserer heterodimere molekyl med uforandret bindingsaktivitet. I tillegg fordrer slike fremgangsmåter muteringsmodifikasj oner av immunoglobulin-sekvensen ved den konstante regionen, og danner følgelig ikke-iboende og unaturlige former av antistoffsekvensen, noe som kan resultere i økt immunogenitet, dårlig in vivo stabillitet, så vel som uønsket farmakokinetikk.
Enkelt-kjede diabodier (scDb) representerer en alternativ strategi for å forbedre dannelsen av bispesifikke diabody-lignende molekyler (se Holliger, P. og G. Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3^1): 128-30; Wu, A.M., et al. (1996) Immunoteknologi 2(1): p. 21-36). Bispesifikke enkelt-kjede diabodier blir produsert ved å koble de to diabody-dannende polypeptidkjedene med en ytterligere midt-linker med en lengde på omtrent 15 aminosyre-residuer. Følgelig er alle molekyler med en molekylvekt tilsvarende monomere enkelt-kjede diabodier (50-60 kDa) bispesifikke. Flere studier har demonstrert ved bispesifikke enkelt-kjede diabodier blir uttrykt i bakterier i løselig og aktiv form med mesteparten av rensede molekyler tilstede som monomere (se Holliger, P. og G. Winter
(1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al. (1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36; Pluckthun, A. og P. Pack (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105; Ridgway, J.B., et al. (1996) Protein Engin. 9(7): 617-21). Følgelig kombinerer enkelt-kjede diabodier fordelene til tandem scFvs (alle monomere er bispesifikke) og diabodier (løselig uttrykking i bakterier).
Mer nylig har diabodier blitt fusjonert til Fc for å generere mer Ig-lignende molekyler, gitt navnet di-diabodier (se Lu, D., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(4): 2856-65). I tillegg har multivalent antistoff konstruksjon omfattende to Fab-repetisjoner i tungkjedet til et IgG og i stand til å binde fire antigen-molekyler blitt beskrevet (se WO 0177342A1, og Miller, K., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61).
Det eksisterer et behov i teknikken for forbedrede multivalente bindende proteiner i stand til å binde to eller flere antigener. U.S. Patent Søknad Serienr. 11/507,050 tilveiebringer en ny familie av bindende proteiner i stand til å binde to eller flere antigener med høy affinitet, som blir kalt immunoglobuliner med to variable domener (DVD-Ig™). Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre nye bindende proteiner i stand til å binde to eller flere antigener.
Sammendrag av oppfinnelsen
Denne oppfinnelsen angår multivalente bindende proteiner i stand til å binde to eller flere antigener. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en ny familie av bindende proteiner i stand til å binde to eller flere antigener med høy affinitet.
I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et bindende protein omfattende et polypeptidkjede, hvori polypeptidkjedet omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første variabelt domene, VD2 er et andre variabelt domene, C er et konstant domene, XI representerer en aminosyre eller et polypeptid, X2 representerer en Fc-region og n er 0 eller 1. I en utførelsesform er VD1 og VD2 i det bindende proteinet tungkjede variabelt domener. I en annen utførelsesform er det tungkjede variabelt domenet valgt fra gruppen bestående av et murint tungkjede variabelt domene, et humant tungkjede variabelt domene, et CDR-podet tungkjede variabelt domene, og et humanisert tungkjede variabelt domene. I nok en annen utførelsesform er VD1 og VD2 i stand til å binde det samme antigenet. I en annen utførelsesform er VD1 og VD2 i stand til å binde forskjellige antigener. I nok en annen utførelsesform er C et tungkjede konstant domene. For eksempel er XI en linker med den forutsetningen ved XI ikke er CH1. For eksempel er XI en linker valgt fra gruppen bestående av
GHEAAAVMQVQYPAS (SEKV ID NR: 26). I en utførelsesform er X2 en Fc-region. I en annen utførelsesform er X2 en variant Fc-region.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet fremvist heri et polypeptidkjede, hvori polypeptidkjedet omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første tungkjede variabelt domene, VD2 er et andre tungkjede variabelt domene, C er et tungkjede konstant domene, XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, og X2 er en Fc-region.
I en utførelsesform er VD1 og VD2 i det bindende proteinet lettkjede variable domener. I en utførelsesform er lettkjede variabelt domenet valgt fra gruppen bestående av et murint lettkjede variabelt domene, et humant lettkjede variabelt domene, et CDR-podet lettkjede variabelt domene, og et humanisert lettkjede variabelt domene. I en utførelsesform er VD1 og VD2 i stand til å binde det samme antigenet. I en annen utførelsesform er VD1 og VD2 i stand til å binde forskjellige antigener.
I en utførelsesform er C et lettkjede konstant domene. I en annen utførelsesform er XI en linker med den forutsetningen ved XI ikke er CL1. I en utførelsesform er XI en linker valgt fra gruppen bestående av AKTTPKLEEGEFSEAR (SEKV ID NR: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEKV ID NR: 2); AKTTPKLGG (SEKV ID NR: 3); SAKTTPKLGG (SEKV ID NR: 4); SAKTTP (SEKV ID NR: 5); RADAAP (SEKV ID NR: 6); RADAAPTVS (SEKV ID NR: 7); RADAAAAGGPGS (SEKV ID NR: 8); RADAAAA(G4S)4(SEKV ID NR: 9);SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEKV ID NR: 10); ADAAP (SEKV ID NR: 11); ADAAPTVSIFPP (SEKV ID NR: 12); TVAAP (SEKV ID NR: 13); TVAAPSVFIFPP (SEKV ID NR: 14); QPKAAP (SEKV ID NR: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEKV ID NR: 16); AKTTPP (SEKV ID NR: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEKV ID NR: 18); AKTTAP (SEKV ID NR: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEKV ID NR: 20); ASTKGP (SEKV ID NR: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEKV ID NR: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEKV ID NR: 23); GENKVEYAPALMALS (SEKV ID NR: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEKV ID NR: 25); og GHEAAAVMQVQYPAS (SEKV ID NR: 26). I en utførelsesform omfatter ikke det bindende proteinet X2.
I en utførelsesform omfatter både det variable tung- og det variable lettkjedet den samme linkeren. I en annen utførelsesform omfatter både det variable tung- og det variable lettkjedet forskjellige linkere. I en annen utførelsesform omfatter både det variable tung- og det variable lettkjedet en kort (omtrent 6 aminosyrer) linker. I en annen utførelsesform omfatter både det variable tung- og det variable lettkjedet en lang (større enn 6 aminosyrer) linker. I en annen utførelsesform omfatter det variable tungkjedet en kort linker og det variable lettkjedet omfatter en lang linker. I en annen utførelsesform omfatter det variable tungkjedet en lang linker og det variable lettkjedet omfatter en kort linker.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet fremvist heri et polypeptidkjede, hvori nevnte polypeptidkjede omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første lettkjede variabelt domene, VD2 er et andre lettkjede variabelt domene, C er et lettkjede konstant domene, XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, og X2 ikke omfatter en Fc-region.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et bindende protein omfattende to polypeptidkjeder, hvori nevnte første polypeptidkjede omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første tungkjede variabelt domene, VD2 er et andre tungkjede variabelt domene, C er et tungkjede konstant domene, XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, og X2 er en Fc-region; og nevnte andre polypeptidkjede omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første lettkjede variabelt domene, VD2 er et andre lettkjede variabelt domene, C er et lettkjede konstant domene, XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, og X2 ikke omfatter en Fc-region. I en bestemt utførelsesform omfatter det (DVD-Dual Variable Domain)-bindende proteint med to variable domener fire polypeptidkjeder hvori de første to polypeptidkjedene omfatter VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, henholdsvis hvori VD1 er et første tungkjede variabelt domene, VD2 er et andre tungkjede variabelt domene, C er et tungkjede konstant domene, XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, og X2 er en Fc-region; og de andre to polypeptidkj edene omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n henholdsvis, hvori VD1 er et første lettkjede variabelt domene, VD2 er et andre lettkjede variabelt domene, C er et lettkjede konstant domene, XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, og X2 ikke omfatter en Fc-region. Et slikt protein med to variable domener har fire antigen-bindende seter.
I en annen utførelsesform er de bindende proteiner fremvist heri i stand til å binde et eller flere mål. I en utførelsesform er målet valgt fra gruppen bestående av cytokiner, celleoverflate-proteiner, enzymer og reseptorer. I en annen utførelsesform er det bindende proteinet i stand til å modulere en biologisk funksjon til et eller flere mål. I en annen utførelsesform er det bindende proteinet i stand til å nøytralisere et eller flere mål. Det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen er i stand til å binde cytokiner valgt fra gruppen bestående av lymfokiner, monokiner, polypeptid hormoner, reseptorer, eller tumormarkører. For eksempel er DVD(Dual Variable Domain)-Ig ifølge oppfinnelsen i stand til å binde to eller flere av de følgende: Amyloid beta (Abeta) (sekv. 1), Abeta (sekv. 2), Abeta (sekv. 3), Tumornekrose-faktor alfa (TNF-a), interleukin ip (IL-ip), Insulin-lignende Vekstfaktor 1 (IGF1), Insulin-lignende Vekstfaktor 2 (IGF2), Interleukin 18 (IL-18), Interleukin 6 (IL-6), Reseptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE), Nerve Vekstfaktor (NGF), Epidermal Vekstfaktor Reseptor (EGFR) (sekv. 1), EGFR (sekv. 2), CD-20, og Repulsivt Veiledningsmolekyl (RGMA) (se også Tabell 2). I en spesifikk utførelsesform er det bindende proteinet i stand til å binde par med mål valgt fra gruppen bestående av Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 2); IL-ip og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2); IGF 1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF-a og Abeta (sekv.3); IL-ip og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF 1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 1); IL-ip og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-ip; NGF og IL-6; TNF-a og EGFR (sekv. 2); TNF-a og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv.
2); RGMA og TNF-a (se Eksempler 2.1 til 2.27).
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 62 og SEKV ID NR. 64; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 63 og SEKV ID NR. 65. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 62 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 63. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 64 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 65.
I en utførelsesform, det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv. 2) omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 66 og SEKV ID NR. 68; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 67 og SEKV ID NR. 69. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 66 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 67. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 68 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 69.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 70 og SEKV ID NR. 72; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 71 og SEKV ID NR. 73. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-1 p og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 70 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 71. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 72 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 73.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 74 og SEKV ID NR. 76; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 75 og SEKV ID NR. 77. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 74 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 75. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 76 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 77.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 78 og SEKV ID NR. 80; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 79 og SEKV ID NR. 81. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 78 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 79. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 80 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 81.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 2) og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 82 og SEKV ID NR. 84; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 83 og SEKV ID NR. 85. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 2) og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 82 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 83. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 2) og IL-18 en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 84 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 85.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 86 og SEKV ID NR. 88; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 87 og SEKV ID NR. 89. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 86 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 87. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 88 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 89.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv.3) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 90 og SEKV ID NR. 92; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 91 og SEKV ID NR. 93. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv.3) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 90 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 91. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv.3) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 92 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 93.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 94 og SEKV ID NR. 96; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 95 og SEKV ID NR. 97. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-1 p og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 94 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 95. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 3) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 96 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 97.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 98 og SEKV ID NR. 100; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 99 og SEKV ID NR. 101. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 98 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 99. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 100 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 101.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 102 og SEKV ID NR. 104; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 103 og SEKV ID NR. 105. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 102 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 103. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 3) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 104 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 105.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 3) og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 106 og SEKV ID NR. 108; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 107 og SEKV ID NR. 109. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 3) og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 106 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 107. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 3) og IL-18 en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 108 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 109.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 110 og SEKV ID NR. 112; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 111 og SEKV ID NR. 113. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 3) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 110 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 111. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 3) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 112 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 113.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 114 og SEKV ID NR. 116; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 115 og SEKV ID NR. 117. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 114 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 115. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og Abeta (sekv. 1) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 116 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 117.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 118 og SEKV ID NR. 120; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 119 og SEKV ID NR. 121. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 118 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 119. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IL-ip og Abeta (sekv. 1) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 120 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 121.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv.
1) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 122 og SEKV
ID NR. 124; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 123 og SEKV ID NR. 125. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 122 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 123. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IGF 1,2 og Abeta (sekv. 1) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 124 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 125.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 126 og SEKV ID NR. 128; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 127 og SEKV ID NR. 129. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 126 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 127. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og IL-18 en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 128 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 129.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 130 og SEKV ID NR. 132; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 131 og SEKV ID NR. 133. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 130 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 131. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde IL-6 og Abeta (sekv. 1) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 132 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 133.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og RAGE en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 134 og
SEKV ID NR. 136; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 135 og SEKV ID NR. 137. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og RAGE en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 134 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 135. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde Abeta (sekv. 1) og RAGE en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 136 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 137.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 138 og SEKV ID NR. 140; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 139 og SEKV ID NR. 141. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-18 en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 138 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 139. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-18 en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 140 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 141.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-1 p en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 142 og SEKV ID NR. 144; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 143 og SEKV ID NR. 145. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-1 p en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 142 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 143. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-1 p en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 144 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 145.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-6 en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 146 og SEKV ID NR. 148; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 147 og SEKV ID NR. 149. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-6 en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 146 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 147. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde NGF og IL-6 en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 148 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 149.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og EGFR (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 150 og SEKV ID NR. 152; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 151 og SEKV ID NR. 153. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og EGFR (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 150 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 151. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og EGFR (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 152 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 153.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og RAGE en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 154 og SEKV ID
NR. 156; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 155 og SEKV ID NR. 157. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og RAGE en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 154 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 155. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde TNF-a og RAGE en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 156 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 157.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde CD-20 og EGFR (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 158 og SEKV ID NR. 160; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 159 og SEKV ID NR. 161. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde CD-20 og EGFR (sekv. 1) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 158 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 159. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde CD-20 og EGFR (sekv. 1) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 160 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 161.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde CD-20 og EGFR (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 162 og SEKV ID NR. 164; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 163 og SEKV ID NR. 164. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde CD-20 og EGFR (sekv. 2) en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 162 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 163. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde CD-20 og EGFR (sekv. 2) en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 164 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 165.
I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde RGMA og TNF-a omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 166 og SEKV ID NR. 168; og en DVD lettkjede aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR. 167 og SEKV ID NR. 169. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet i stand til å binde RGMA og TNF-a en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 166 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 167. I en annen utførelsesform har det bindende proteinet i stand til å binde RGMA og TNF-a en omvendt orientering og omfatter en DVD tungkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR. 168 og en DVD lettkjede aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 169.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et bindende protein omfattende et polypeptidkjede, hvori nevnte polypeptidkjede omfatter VD1-(XI)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VD1 er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n er en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende. I en utførelsesform er Fc-regionen fraværende fra det bindende proteinet.
I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et bindende protein omfattende et polypeptidkjede, hvori nevnte polypeptidkjede omfatter VD1-(XI)n-VD2-C-(X2)n, hvori, VD1 er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et lettkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n ikke omfatter en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende. I en utførelsesform er (X2)n fraværende fra det bindende proteinet.
I en annen utførelsesform omfatter det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen første og andre polypeptidkjeder, hvori nevnte første polypeptidkjede omfatter en første VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n er en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende; og hvori nevnte andre polypeptidkjede omfatter en andre VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et lettkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n ikke omfatter en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende. I en annen utførelsesform omfatter det bindende proteinet to første polypeptidkjeder og to andre polypeptidkjeder. I nok en annen utførelsesform er (X2)n fraværende fra det andre polypeptidet. I nok en annen utførelsesform er Fc-regionen, hvis tilstede i det første polypeptidet, valgt fra gruppen bestående av opprinnelig sekvens Fc-region og en variant sekvens Fc-region. I nok en annen utførelsesform er Fc-regionen valgt fra gruppen bestående av en Fc-region fra en IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, og IgD.
I en annen utførelsesform er det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen et DVD-Ig i stand til å binde to antigener omfattende fire polypeptidkjeder, hvori, første og tredje polypeptidkjeder omfatter
VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori,VDl er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n er en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende; og hvori andre og fjerde polypeptidkjeder omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et lettkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n ikke omfatter en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende.
Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille et DVD-Ig-bindende protein ved å pre-selektere moderantistoffene. I en utførelsesform omfatter fremgangsmåten for å fremstille et Immunoglobulin med to variable domener, i stand til å binde to antigener trinnene å a) oppnå et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et første antigen; b) oppnå et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et andre antigen; c) konstruere første og tredje polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori, VD1 er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n er en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende; d) konstruere andre og fjerde polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori, VD1 er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende derav; C er et lettkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n ikke omfatter en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende; e) som uttrykker nevnte første, andre, tredje og fjerde polypeptidkjeder; slik at et immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde nevnte første og nevnte andre antigen blir fremstilt.
I nok en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et Immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde to antigener med ønskede egenskaper omfattende trinnet å a) oppnå et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et første antigen og innehar minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener; b) oppnå et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et andre antigen og innehar minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener; c) konstruere første og tredje polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VD1 er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n er en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende; d) konstruere andre og fjerde polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VD1 er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et lettkjede konstant domene; (Xl)n er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1, hvori nevnte (Xl)n er enten tilstede eller fraværende; og (X2)n ikke omfatter en Fc-region, hvori nevnte (X2)n er enten tilstede eller fraværende; e) som uttrykker nevnte første, andre, tredje og fjerde polypeptidkjeder; slik at et immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde nevnte første og nevnte andre antigen med ønskede egenskaper blir fremstilt.
I en utførelsesform blir VDFen til de første og andre polypeptidkjeder fremvist heri oppnådd fra det samme moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav. I en annen utførelsesform blir VDFen til de første og andre polypeptidkjeder fremvist heri oppnådd fra forskjellige moder-antistoffer eller antigen-bindende porsjoner derav. I en annen utførelsesform blir VD2'en til de første og andre polypeptidkjeder fremvist heri oppnådd fra det samme moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav. I en annen utførelsesform blir VD2'en til de første og andre polypeptidkjeder fremvist heri oppnådd fra forskjellige moder-antistoffer eller antigen-bindende porsjoner derav.
I en utførelsesform er det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, og det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, det samme antistoffet. I en annen utførelsesform er det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, og det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, forskjellige antistoffer.
I en utførelsesform binder det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, et første antigen og det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, binder et andre antigen. I en bestemt utførelsesform er de første og andre antigenene det samme antigenet. I en annen utførelsesform, moder-antistoffene binder forskjellige epitoper på det samme antigenet. I en annen utførelsesform de første og andre antigenene er forskjellige antigener. I en annen utførelsesform binder det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, det første antigenet med en styrke forskjellig fra styrken som det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, binder det andre antigenet. I nok en annen utførelsesform binder det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, det første antigenet med en affinitet forskjellig fra affiniteten som det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, binder det andre antigenet.
I en annen utførelsesform er det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, og det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, valgt fra gruppen bestående av, humant antistoff, CDR-podet antistoff, og humanisert antistoff. I en utførelsesform er de antigen bindende porsjoner valgt fra gruppen bestående av et Fab-fragment, et F(ab')2fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter knyttet sammen ved en disulfid-bro ved hengsel-regionen; et Fd-fragment bestående av VH- og CH1-domenene; et Fv-fragment bestående av VL- og VH-domenene fra en enkelt arm til et antistoff, et dAb-fragment, en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR), et enkelt-kjede antistoff, og diabodier.
I en annen utførelsesform innehar det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen minst en ønsket egenskap fremvist av det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav, eller det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav. Alternativt innehar det første moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav og det andre moder-antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener. I en utførelsesform er den ønskede egenskapen valgt fra en eller flere antistoff-parametre. I en annen utførelsesform er antistoff-parametrene valgt fra gruppen bestående av antigen spesifisitet, affinitet ovenfor antigen, styrke, biologisk funksjon, epitop-gjenkjenning, stabillitet, løselighet, produksjonseffektivitet, immunogenitet, farmakokinetikk, biotilgjengelighet, kryssreaktivitet for vev, og ortolog antigen-binding.I en utførelsesform er det bindende proteinet multivalent. I en annen utførelsesform er det bindende proteinet multispesifikt. De multivalente og eller multispesifikke bindende proteinene beskrevet heri har ønskelig egenskaper spesielt fra et terapeutisk standpunkt. For eksempel kan det multivalente og eller multispesifikt bindende proteinet (1) bli internalisert (og/eller katabolisert) raskere enn et bivalent antistoff av en celle som uttrykker et antigen til hvilket antistoffene binder; (2) være et agonist-antistoff; og/eller (3) indusere celledød og/eller apoptose av en celle som uttrykker et antigen som det multivalente antistoffer i stand til å binde til. "Moder-antistoffet" som tilveiebringer minst et antigen-bindende spesifisitet hos de multivalente og eller multispesifikke bindende proteinene kan være et som blir internalisert (og/eller katabolisert) av en celle som uttrykker et antigen til hvilket antistoffet binder; og/eller kan være en agonist, et celledød-induserende, og/eller apoptose-induserende antistoff, og det multivalente og eller multispesifikt bindende proteinet som beskrevet heri kan fremvise forbedring(er) i en eller flere av disse egenskaper. Videre, moder-antistoffet kan mangle enhver eller flere av disse egenskaper, men kan bli forsynt med dem når konstruert som et multivalent-bindende protein som beskrevet heri.
I en annen utførelsesform har det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen en på-hastighetskonstant (Kon) til et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av: minst omtrent 10<2>M"<1>s"<1>; minst omtrent 10<3>M"1s"<1>;minst omtrent K^m V1; minst omtrent10<5>M"<1>s"<1>; og minst omtrent 10<6>M"<1>s"1, som målt ved overflate-plasmonresonans. I en utførelsesform har det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen en på-hastighetskonstant (Kon) til et eller flere mål mellom 10<2>M"<1>s"<1>og 10<3>M"<1>s"<1>; mellom 10^ 's"1 og iCn-t<V1>; mellom lOV^<s>"<1>og 10^ 's"1; eller mellom K^M V1 og 10^ 's"1, som målt ved overflate-plasmonresonans.
I en annen utførelsesform har det bindende proteinet en av-hastighetskonstant (Koff) for et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av: på det meste omtrent 10V; på det meste omtrent 10\ på det meste omtrent 10"<5>s"'; og på det meste omtrent 10"V, som målt ved overflate-plasmonresonans. I en utførelsesform har det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen en av-hastighetskonstant (Koff) til et eller flere mål på 10"V til 10V; på 10"V<10>"V; eller på lOV10" V<1>, som målt ved overflate-plasmonresonans.
I en annen utførelsesform har det bindende proteinet en dissosieringskonstant (KD) til et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av: på det meste omtrent IO"<7>M; på det meste omtrent IO"<8>M; på det meste omtrent IO"<9>M; på det meste omtrent IO"<10>M; på det meste omtrent IO"11 M; på det meste omtrent IO"<12>M; og på det meste IO"<13>M. I en utførelsesform har det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen en dissosieringskonstant (KD) til dets mål på IO"<7>M til IO"8 M; på IO"<8>M til IO"9 M; på IO"<9>M til IO"10 M; på IO"<10>til IO"11 M; på IO"<11>M til IO"12 M; eller på IO"<12>til M 10"<13>M.
I en annen utførelsesform er det bindende proteinet beskrevet heri et konjugat videre omfattende et middel valgt fra gruppen bestående av et immunoadhesjonsmolekyl, et billedfremkallingsmiddel, et terapeutisk middel, og et cytotoksisk middel. I en utførelsesform er billedfremkallingsmiddelet valgt fra gruppen bestående av et radioaktivt merkestoff, et enzym, et fluorescerende merkestoff, et luminescerende merkestoff, et bioluminescerende merkestoff, et magnetisk merkestoff, og biotin. I en annen utførelsesform er billedfremkallingsmiddelet et radioaktivt merkestoff valgt fra gruppen bestående av: 3H 14C 35S,90Y, 99Tc,<11>'ln,<125>1,<131>1,177Lu,<166>Ho, og<153>S<m.>I nok en annen utførelsesform er det terapeutiske eller cytotoksiske middelet valgt fra gruppen bestående av en anti-metabolitt, et alkylerende middel, et antibiotika, en vekstfaktor, et cytokin, et anti-angiogent middel, et anti-mitotisk middel, et antrasyklin, toksin, og et apoptotisk middel.
I en annen utførelsesform er det bindende proteinet beskrevet heri et krystallisert bindende protein og eksisterer som en krystal. I en utførelsesform er krystallen en bærer-fri farmasøytisk kontrollert-frigjørelseskrystall. I nok en annen utførelsesform har det krystalliserte bindende proteinet en lengre halveringstid in vivo enn den løselige motparten av nevnte bindende protein. I nok en annen utførelsesform beholder det krystalliserte bindende proteinet biologisk aktivitet.
I en annen utførelsesform er det bindende proteinet beskrevet heri glykosylert. For eksempel er glykosyleringen et humant glykosyleringsmønster.
Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår en isolert nukleinsyre som koder for enhver av de bindende proteinene fremvist heri. En ytterligere utførelsesform tilveiebringer en vektor omfattende den isolerte nukleinsyren fremvist heri hvori nevnte vektor er valgt fra gruppen bestående av pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Forskning 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT med ytterligere multippel kloningsseter; pEFBOS (Mizushima, S. og Nagata, S., (1990) Nukleinsyrer Forskning Vol 18, No. 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO og pBJ. I en utførelsesform er vektoren en vektor fremvist i US Patent Søknad Serienr. 61/021,282.
I et annet aspekt blir en vertscelle transformert med vektoren fremvist heri. I en utførelsesform er vertscellen en prokaryotisk celle. I en annen utførelsesform er vertscellen E.Coli. I en beslektet utførelsesform er vertscellen en eukaryotisk celle. I en annen utførelsesform er den eukaryotiske cellen valgt fra gruppen bestående av protist-celle, dyrecelle, plantecelle og soppcelle. I nok en annen utførelsesform er vertscellen en pattedyrscelle inkludert, men ikke begrenset til, CHO, COS; NS0, SP2, PER.C6 eller en soppcelle slik som Saccharomyces cerevisiae; eller en insektscelle slik som Sf9.
I en utførelsesform blir to eller flere DVD-Ig'er, f.eks., med forskjellige spesifisiteter, produsert i en enkelt rekombinant vertscelle. For eksempel har uttrykkingen av en blanding av antistoffer blitt kalt 01igoclonics™,(Merus B.V.,Nederland) U.S. Patent Nr. 7,262,028; 7,429,486.
Et annet aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille et bindende protein fremvist heri omfattende å dyrke enhver av vertscellene også fremvist heri i et vekstmedium under betingelser tilstrekkelig for å produsere det bindende proteinet. I en utførelsesform er 50%-75% av det bindende proteinet produsert ved denne metoden et dobbelt spesifikt tetravalent bindende protein. I en bestemt utførelsesform er 75%-90% av det bindende proteinet produsert ved denne metoden et dobbelt spesifikt tetravalent bindende protein. I en bestemt utførelsesform er 90%-95% av det bindende proteinet produsert et dobbelt spesifikt tetravalent bindende protein.
En utførelsesform tilveiebringer en sammensetning for frigjørelsen av et bindende protein hvori sammensetningen omfatter en formulering som igjen omfatter et krystallisert bindende protein, som fremvist heri, og en ingrediens, og minst en polymer bærer. For eksempel er den polymere bæreren en polymer valgt fra en eller flere av gruppen bestående av: poly (akrylsyre), poly (cyanoakrylater), poly (aminosyrer), poly (anhydrider), poly (depsipeptid), poly (estere), poly (melkesyre), poly (melke-ko-glykolsyre) eller PLGA, poly (b-hydroksybutyrat), poly (kaprolakton), poly (dioksanon); poly (etylenglykol), poly ((hydroksypropyl) metakrylamid, poly [(organo)fosfazen], poly (orto-estere), poly (vinylalkohol), poly (vinylpyrrolidon), maleic kopolymere anhydrid-alkylvinyletere, pluroniske polyoler, albumin, alginat, cellulose og cellulose derivater, kollagen, fibrin, gelatin, hyaluronsyre, oligosakkarider, glykaminoglykaner, sulfat polysakkarider, blandinger og kopolymere derav. For eksempel er ingrediensen valgt fra gruppen bestående av albumin, sukrose, trehalose, laktitol, gelatin, hydroksypropyl-p- syklodekstrin, metoksypolyetylenglykol og polyetylenglykol. En annen utførelsesform tilveiebringer en metode for å behandle et pattedyr omfattende trinnet å administrere til pattedyret en effektiv mengde av sammensetningen fremvist heri.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning omfattende et bindende protein, som fremvist heri og en farmasøytisk akseptabel bærer. I en ytterligere utførelsesform den farmasøytiske sammensetningen omfatter minst et ytterligere terapeutisk middel for å behandle en forstyrrelse. For eksempel er det ytterligere middelet valgt fra gruppen bestående av: et terapeutisk middel, et billedfremkallingsmiddel, et cytotoksisk middel, en angiogenese-inhibitor (inkludert men ikke begrenset til et anti-VEGF antistoff eller en VEGF-felle), en kinase-inhibitor (inkludert men ikke begrenset til en KDR- og en TIE-2-inhibitor), en ko-stimulerende molekylblokkerer (inkludert men ikke begrenset til anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-Ig, anti-CD20), en adhesjonsmolekyl-blokkerer
(inkludert men ikke begrenset til et anti-LFA-1 antistoff, et anti-E/L selectin antistoff, en småmolekyl-inhibitor), et anti-cytokin antistoff eller funksjonelt fragment derav (inkludert men ikke begrenset til et anti-IL-18, et anti-TNF, og et anti-IL-6/cytokin reseptor antistoff), metotrexat, syklosporin, rapamycin, FK506, et detekterbart merkestoff eller rapportstoff, en TNF-antagonist, et antirevmatika, en
muskelavslapper, et narkotisk stoff, et ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel (NSAID), et analgetikum, et anestetika, et sedativ, et lokalt anestetika, en neuromuskulær blokkerer, et antimikrobisk middel, et antipsoriatisk middel, et kortikosteriod, et anabolt steroid, et erythropoietin, et immuniseringsmiddel, et immunoglobulin, et immunosuppressiv, et veksthormon, et hormonerstatningslegemiddel, et radiofarmasøytika, et antidepressiva, et antipsykotika, en stimulant, et astma-medikament, en beta-agonist, et inhalert steroid, et epinefrin eller analog, et cytokin, og en cytokin-antagonist.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å behandle en human pasient som lider av en forstyrrelse hvori målet eller målene, i stand til å bli bundet av det bindende proteinet fremvist heri er skadelig, omfattende å administrere til den menneskelige pasienten et bindende protein fremvist heri slik ved aktiviteten til målet eller målene i den menneskelige pasienten blir inhibert og en av flere symptomer blir lindret eller behandling er oppnådd. For eksempel er forstyrrelsen valgt fra gruppen omfattende artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, septisk artritt, Lyme artritt, psoriatisk artritt, reaktiv artritt, spondyloartropati, systemisk lupus erytematose, Crohns sykdom, ulcerativ kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, insulin avhengig diabetes mellitus, tyroiditt, astma, allergiske sykdommer, psoriasis, dermatitt skleroderma, transplantat-mot-vert sykdom, organtransplantat-avvisning, akutt eller kronisk immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, sarkoidose, aterosklerose, disseminert intravaskulær koagulasjon, Kawasakis sykdom, Graves sykdom, nefrotisk syndrom, kronisk utmattelsessyndrom, Wegeners granulomatose, Henoch-Schoenlein purpurea, mikroskopisk vaskulitt av nyrene, kronisk aktiv hepatitt, uveitt, septisk sjokk, toksisk sjokk syndrom, sepsis syndrom, kakeksi, smittsomme sykdommer, parasittisk sykdommer, ervervet immunsvikt syndrom, akutt transvers myelitt, Huntingtons chorea, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, hjerneslag, primær biliær cirrhose, hemolytisk anemi, maligniteter, hjertesvikt, myokardielt infarkt, Addisons sykdom, sporadisk polyglandulær mangel type I og polyglandulær mangel type II, Schmidts syndrom, voksen (akutt) respiratorisk distress syndrom, alopeki, alopeki areata, seronegativ artopati, artropati, Reiters sykdom, psoriatisk artropati, ulcerativ kolittisk artropati, enteropatisk synovitt, klamydia, yersinia og salmonella assosiert artropati, spondyloartopati, ateromatisk sykdom/arteriosklerose, atopisk allergi, autoimmun bulløs sykdom, pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigoid, lineær IgEn sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, Coombs positiv hemolytisk anemi, ervervet pernisiøs anemi, juvenil pernisiøs anemi, myalgisk encefalitt/Royal Fri Sykdom, kronisk mucokutan candidiasis, storcelle arteritt, primær skleroserende hepatitt, kryptogenisk autoimmun hepatitt, Ervervet Immunsvikt Sykdom Syndrom, Ervervet Immunsvikt Beslektede Sykdommer, Hepatitt B, Hepatitt C, vanlig variabel immunsvikt (vanlig variabel hypogammaglobulinemi), dilatert kardiomyopati, kvinnelig infertilitet, eggstokksvikt, prematur eggstokksvikt, fibrotisk lungesykdom, kryptogen fibroserende alveolitt, post-inflammatorisk interstitiell lungesykdom, interstitiell pneumonitt, bindevevssykdom assosiert interstitiell lungesykdom, blandet bindevevssykdom assosiert lungesykdom, systemisk sklerose assosiert interstitiell lungesykdom, revmatoid artritt assosiert interstitiell lungesykdom, systemisk lupus erytematose assosiert lungesykdom, dermatomiositt/polymyositt assosiert lungesykdom, Sjogrens sykdom assosiert lungesykdom, ankyloserende spondylitt assosiert lungesykdom, vaskulitisk diffus lungesykdom, hemosiderose assosiert lungesykdom, legemiddelindusert interstitiell lungesykdom, fibrose, strålingsfibrose, bronkiolitt obliterans, kronisk eosinofil lungebetennelse, lymfocytisk infiltrativ lungesykdom, postsmittsom interstitiell lungesykdom, giktisk artritt, autoimmun hepatitt, type-1 autoimmun hepatitt (klassisk autoimmun eller lupoid hepatitt), type-2 autoimmun hepatitt (anti-LKM antistoff hepatitt), autoimmun mediert hypoglykemi, type B insulinresistens med acanthosis nigricans, hypoparatyroidisme, akutt immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, kronisk immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, osteoarthrose, primær skleroserende kolangitt, psoriasis type 1, psoriasis type 2, idiopatisk leukopeni, autoimmun neutropeni, nyresykdom NOS, glomerulonefritt, mikroskopisk vasulitt av nyrene, lyme sykdom, diskoid lupus erytematose, mannlig infertilitet idiopatisk eller NOS, sædcelle autoimmunitet, multippel sklerose (alle undertyper), sympatisk oftalmi, pulmonær hypertensjon sekundært til bindevevssykdom, Goodpastures syndrom, pulmonær manifestasjon av polyarteritt nodosa, akutt revmatisk feber, revmatoid spondylitt, Stills sykdom, systemisk sklerose, Sjorgrens syndrom, Takayasus sykdom/arteritt, autoimmun trombocytopeni, idiopatisk trombocytopeni, autoimmun tyroid sykdom, hypertyroidisme, goitrous autoimmun hypotyroidisme (Hashimotos sykdom), atrofisk autoimmun hypotyroidisme, primært myxoødem, facogen uveitt, primær vaskulitt, vitiligo akutt leversykdom, kroniske leversykdommer, alkoholisk cirrhose, alkohol-indusert leverskade, koleosatatis, idiosynkratisk leversykdom, Legemiddelindusert hepatitt, Ikke-alkoholisk Steatohepatitt, allergi og astma, gruppe B streptokokk (GBS) infeksjon, mentale forstyrrelser ( f. eks., depressjon og schizofreni), Th2 Type og Thl Type medierte sykdommer, akutt og kronisk smerte (forskjellige typer av smerte), og kreftsykdommer slik som lunge, bryst, mage, blære, tykktarm, bukspyttkjertel, eggstokk, prostata og rektal kreft og hematopoietiske maligniteter (leukemi og lymfom), Abetalipoprotemi, Acrocyanose, akutte og kroniske parasittisk eller smittsomme prosesser, akutt leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi (ALLE), akutt myeloid leukemi (AML), akutt eller kronisk bakteriell infeksjon, akutt pancreatitt, akutt nyresvikt, adenokarsinomer, luftige ektopiske slag, AIDS demens-kompleks, alkohol-indusert hepatitt, allergisk konjunktivitt, allergisk kontaktdermatitt, allergisk rinitt, allotransplantat-avvisning, alfa-1-antitrypsin mangel, amyotrofisk lateral sklerose, anemi, angina pectoris, fremre horncelle degenerering, anti cd3 terapi, antifosfolipid syndrom, anti-reseptor hypersensitivitetsreaksjoner, aortiske og perifere anevrismer, aortadisseksjon, arteriell hypertensjon, arteriosklerose, arteriovenøs fistula, ataksi, atriell flimmer (vedvarende eller paroksysmal), atriell flutter, atrioventrikulær blokkering, B-celle lymfom, beintransplantat avvisning, beinmargtransplantat (BMT) avvisning, "bundle branch"-blokkering, Burkitts lymfom, Brannskader, kardielle arytmier, kardiell lammelsessyndrom, kardielle tumorer, kardiomyopati, kardiopulmonær bypass inflammasjonsrespons, brusktransplantat-avvisning, cerebellære kortikale degenerasjoner, cerebellære forstyrrelser, kaotisk eller multifokal atriell takykardi, kjemoterapi-assosierte forstyrrelser, kronisk myelocytisk leukemi (CML), kronisk alkoholisme, kroniske inflammatoriske patologier, kronisk lymfocytisk leukemi
(CLL), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), kronisk salisylatforgiftning, kolorektalt karsinom, kongestiv hjertesvikt, konjunktivitt, kontaktdermatitt, cor pulmonale, koronær arteriesykdom, Creutzfeldt-Jakob sykdom, kultur-negativ sepsis, cystisk fibrose, cytokinterapi-assosierte forstyrrelser, Demens pugilistica, demyelinerende sykdommer, dengue hemoragisk feber, dermatitt, dermatologiske tilstander, diabetes, diabetes mellitus, diabetisk ateriosklerotisk sykdom, Diffus Lewy-kropp sykdom, dilatert kongestiv kardiomyopati, forstyrrelser i det basale ganglia, Downs Syndrom i middelalder, legemiddel- indusert bevegelsesforstyrrelser indusert av legemidler som blokkerer CNS dopaminreseptorer, legemiddelfølsomhet, eksem, encefalomyelitt, endokarditt, endokrinopati, epiglottitt, epstein-barr virus infeksjon, erytromelalgi, ekstrapyramidal og cerebellære forstyrrelser, familiær hematofagocytisk lymfohistiocytose, føtalt tymus implantat avvisning, Friedreichs ataksi, funksjonell perifere arterielle forstyrrelser, sopp sepsis, gass-koldbrann, mavesår, glomerulær nefritt, transplantat-awisning av ethvert organ eller vev, gram-negativ sepsis, gram-positiv sepsis, granulomar på grunn av intracellulære organismer, hårcelle leukemi, Hallerrorden-Spatz sykdom, hashimotos tyroiditt, høyfeber, hjertetransplantasjonsavvisning, hemakromatose, hemodialyse, hemolytisk uremisk syndrom/trombolytisk trombocytopenisk purpura, blødning, hepatitt (A), "His bundle" arytmier, HIV infeksjon/HIV nevropati, Hodgkins sykdom, hyperkinetiske bevegelsesforstyrrelser, hypersensibilitetsreaksjoner, hypersensitivitet pneumonitt, hypertensjon,
hypokinetiske bevegelsesforstyrrelser, hypothalamus-hypofyse-binyre-akse evaluering, idiopatisk Addisons sykdom, idiopatisk pulmonær fibrose, antistoff-mediert cytotoksisitet, Asteni, infantil spinal muskulær atrofi, inflammasjon av aorta, influensa a, ioniserende strålingseksponering,
iridocyclitt/uveitt/optisk neuritt, iskemi- reperfusjon skade, iskemisk hjerneslag, juvenil revmatoid artritt, juvenil spinal muskulær atrofi, Kaposis sarkom, nyretransplantasjon avvisning, legionella, leishmaniasis, spedalskhet, lesjoner på det kortikospinale systemet, lipødem, levertransplantasjon avvisning, lymfederma, malaria, malignamt Lymfom, malignant histiocytose, malignant melanom, meningitt, meningococcemia, metabolisk/idiopatisk sykdommer, migrene hodepine, mitokondrien multisystem forstyrrelse, blandet bindevevssykdom, monoklonal gammopati, multippel myelom, multippel-systemdegenerasjoner (Mencel Dejerine- Thomas Shi-Drager og Machado-Josef), myAsteni gravis, mycobacterium avium intracellulære, mycobacterium tuberculose, myelodyplastisk syndrom, myokardielt infarkt, myokardielle iskemiske forstyrrelser, nasofaryngeal karsinom, neonatal kronisk lungesykdom, nefritt, nefrose, nevrodegenerativ sykdommer, nevrogene I muskulære atrofier, neutropen feber, ikke- hodgkins lymfom, okklusjon av den abdominale aorta og dens sidegrener, okklusiv arteriell forstyrrelser, okt3 terapi, orkitt/epidydimitt, orkitt/vasektomi-reversering prosedyrer, organomegali, osteoporose, bukspyttkjertel transplantasjon avvisning, bukspyttkjertel karsinom, paraneoplastisk syndrom/hyperkalsemi av ondartethet, paratyroid transplantasjon avvisning, inflammatorisk bekken sykdom, perennial rinitt, perikardiell sykdom, perifer aterlosklerotisk sykdom, perifere vaskulære forstyrrelser, peritonitt, pernisiøs anemi, pneumocystis carinii lungebetennelse, lungebetennelse, POEMS syndrom (polynevropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gammopati, og hudforandringssyndrom), postperfusjonssyndrom, post pump syndrom, post-MI kardiotomi syndrom, preeklampsi, Progressiv supranukleær parese, primær pulmonær hypertensjon, strålingsterapi, Raynauds fenomen og sykdom, Raynouds sykdom, Refsums sykdom, jevnlig smal QRS takykardi, renovaskulær hypertensjon, reperfusjon skade, restriktiv kardiomyopati, sarkomer, skleroderma, senil chorea, Senil Demens av Lewy-legemer typen, seronegativ artropatier, sjokk, sigd-celle anemi, hud allotransplantat-avvisning, hudforandringssyndrom, liten tarm transplantasjon avvisning, faste tumorer, spesifikke arytmier, spinal ataksi, spinocerebellære degenerasjoner, streptokokk myositt, strukturelle lesjoner på lillehjernen, Subakutt skleroserende panencefalitt, Synkope, syfilis i det kardiovaskulære systemet, systemisk anafalaksi, systemisk inflammatorisk respons syndrom, systemisk utbrudd juvenil revmatoid artritt, T-celle eller FAB ALLE, Telangiektasi, tromboangitt obliterans, trombocytopeni, toksisitet, transplantasjoner, traumer/blødning, type III hypersensitivitetsreaksjoner, type IV hypersensitivitet, ustabil angina, uremi, urosepsis, urtikaria, valvulære hjertesykdommer, åreknuter, ,vaskulitt, venøse sykdommer, venøs trombose, ventrikulært flimmer, virale infeksjoner og soppinfeksjoner, vital encefalitt/aseptisk meningitt, vital-assosiert hemafagocytisk syndrom, Wernicke- Korsakoff syndrom, Wilsons sykdom, xenotransplantat-avvisning av ethvert organ eller vev.
I en utførelsesform inkluderer sykdommer som kan bli behandlet eller diagnostisert med sammensetningene og metodene ifølge oppfinnelsen, men er ikke begrenset til, primære og metastatiske kreftsykdommer, inkludert karsinomer i bryst, tykktarm, rektum, lunge, orofarynks, hypofarynks, øsofagus, mave, bukspyttkjertel, lever, galleblære og galleganger, tynntarmen, urinveien (inkludert nyre, blære og urothelium), kvinnelige kjønnsorgan (inkludert livmorhals, livmor og eggstokker så vel som choriokarsinom og Trofoblastisk svangerskapssykdom), manlige kjønnsorgan (inkludert prostata, sædblærer, testikler og kimcelles vulster), endokrine kjertler (inkludert skjoldbruskkjertelen, binyrene og hypofysen), og hud, så vel som hemangiomer, melanomer, sarkomer (inkludert de som stammer fra bein og myke vev så vel som Kaposis sarkom), tumorer i hjernen, nerver, øyne, og hjernehinnene (inkludert astrocytomer, gliomer, glioblastomer, retinoblastomer, nevromer, nevroblastomer, Schwannomer, og meningiomer), faste tumorer oppstående fra hematopoietiske maligniteter slik som leukemier og lymfomer (både Hodgkins og ikke-Hodgkins lymfomer).
DVD-Ig'ene ifølge oppfinnelsen kan også behandle en eller flere av de følgende sykdommer: Akutte koronære syndromer, Akutt Idiopatisk Polyneuritt, Akutt Inflammatorisk Demyelinerende Polyradiculonevropati, Akutt iskemi, Voksen Stills Sykdom, Alopeki areata, Anafylakse, Anti-Fosfolipid Antistoff Syndrom, Aplastisk anemi, Arteriosklerose, Atopisk eksem, Atopisk dermatitt, Autoimmun dermatitt, Autoimmun forstyrrelse assosiert med Streptococcus infeksjon, autoimmun enteropati, Autoimmun hørseltap, Autoimmun Lymfoproliferativt syndrom (ALPS), Autoimmun myokarditt, autoimmun trombocytopeni (AITP), autoimmun prematur eggstokksvikt, Blefaritt, Bronchiectasis, Bulløs pemfigoid, Kardiovaskulær Sykdom, Katastrofisk Antifosfolipid Syndrom, Cøliac Sykdom, Cervikal Spondylose, Kronisk iskemi, Cicatricial pemfigoid, Klinisk isolert Syndrom (CIS) med Risiko for Multippel sklerose, Konjunktivitt, Barndom Utbrudd Psykiatrisk Forstyrrelse, Kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), Dacryocystitt, dermatomiositt, Diabetisk retinopati, Diabetes mellitus, Skiveprolaps, Skiveprolaps, Legemiddel indusert immun hemolytisk anemi, Endokarditt, Endometriose, endoftalmitt, Episkleritt, Erytema multiforme, Erytema multiforme major, Svangerskaps pemfigoid, Guillain-Barré Syndrom (GBS), Høyfeber, Hughes Syndrom, Idiopatisk Parkinsons Sykdom, idiopatisk interstitiell lungebetennelse, IgE-mediert Allergi, Immun hemolytisk anemi, Inclusion Body Myositt, Smittsom okkulær inflammatorisk sykdom, Inflammatorisk demyelinerende sykdom, Inflammatorisk hjertesykdom, Inflammatorisk nyresykdom, IPF/UIP, Iritt, Keratitt, Keratojuntivitt sicca, Kussmaul sykdom eller Kussmaul-Meier Sykdom, Landrys Paralyse, Langerhans Celle Histiocytose, Livedo reticularis, Makulær Degenerering, maligniteter, Mikroskopisk Polyangiitt, Morbus Bechterev, Motornevron Forstyrrelser, Slimhinne pemfigoid, Multippel organsvikt, MyAsteni Gravis, Myelodysplastisk Syndrom, Myokarditt, Nerverot Forstyrrelser, Nevropati, ikke-A ikke-B Hepatitt, Optisk Neuritt, Osteolyse, Eggstokk kreft, Pauciartikulær JRA, perifer arterie okklusiv sykdom (PAOD), perifer vaskulær sykdom (PVD), perifer arterie sykdom (PAD), Flebitt, Polyarteritt nodosa (eller periarteritt nodosa), Polykondritt, Polymyalgi Revmatiska, Poliose, Polyartikulær JRA, Polyendokrin Mangel Syndrom, Polymyositt, polymyalgi revmatiska (PMR), Post-Pump Syndrom, primær Parkinsonisme, prostata og rektal kreft og hematopoietiske maligniteter (leukemi og lymfom), Prostatitt, Ren rødcelle aplasi, Primær Binyrer Utilstrekkelighet, Tilbakevendende Neuromyelitt Optica, Restenose, Revmatisk hjertesykdom, SAFO (synovitt, akne, pustulose, hyperostose, og osteitt), Skleroderma, Sekundær Amyloidose, Sjokklunge, Skleritt, Isjas, Sekundær Binyrer Utilstrekkelighet, Silikonassosiert bindevevssykdom, Sneddon-Wilkinson Dermatose, spondilitt ankylosans, Stevens-Johnson Syndrom (SJS), Systemisk inflammatorisk respons syndrom, Temporær arteritt, toksoplasmisk retinitt, toksisk epidermal nekrolyse, Transvers myelitt, TRAPS (Tumornekrose-faktor Reseptor, Type 1 allergisk reaksjon, Type II Diabetes, Urtikaria, Vanlig interstitiell lungebetennelse (UIP), Vaskulitt, Vernal konjunktivitt, viral retinitt, Vogt-Koyanagi-Harada syndrom (VKH syndrom), Våt makulær degenerering, Sårtilheling, yersinia, og salmonella assosiert artropati.
I en utførelsesform blir antistoffene ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, anvendt for å behandle kreft eller i forhindringen av metastaser fra tumorene beskrevet heri enten når anvendt alene eller i kombinasjon med radioterapi og/eller andre kjemoterapeutiske midler.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å behandle en pasient som lider av en forstyrrelse omfattende trinnet å administrere enhver av de bindende proteinene fremvist heri før, samtidig, eller etter administrasjonen av et andre middel, som diskutert heri. I en bestemt utførelsesform det andre middelet er valgt fra gruppen bestående av budenosid, epidermal vekstfaktor, kortikosteroider, syklosporin, sulfasalazin, aminosalisylater, 6-merkaptopurin, azatioprin, metronidazol, lipoksygenase inhibitorer, mesalamin, olsalazin, balsalazid, antioksidanter, tromboksan-inhibitorer, IL-1 reseptor-antagonister, anti-IL-lp mAb'er, anti-IL-6 eller IL-6 reseptor mAb'er, vekstfaktorer, elastase inhibitorer, pyridinyl-imidazol forbindelser, antistoffer eller agonister of TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF, og PDGF, antistoffer of CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 eller deres ligander, metotrexat, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolat mofetil, leflunomid, NSAID'er, ibuprofen, kortikosteroider, prednisolon, fosfodiesterase-inhibitorer, adenosin-agonister, antitrombotiske midler, komplement inhibitorer, adrenergiske midler, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP kinase-inhibitorer, IL-1(3 konverterende enzym-inhibitorer, TNFa konverterende enzym-inhibitorer, T-celle signalliserings-inhibitorer, metalloproteinase inhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensin-konverterende enzym-inhibitorer, løselige cytokin-reseptorer, løselig p55 TNF reseptor, løselig p75 TNF reseptor, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, anti-inflammatoriske cytokiner, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 og TGFp. I en bestemt utførelsesform blir de farmasøytiske sammensetningene fremvist heri administrert til pasienten ved minst en måte valgt fra parenteral, subkutan, intramuskulær, intravenøs, intrartikulær, intrabronkiell, intraabdominal, intrakapsulær, intrakartilaginøst, intrakavitøst, intracelialt, intracerebralt, intracerebroventrikulært, intrakolisk, intracervikalt, intragastrisk, intrahepatisk, intramyokardielt, intraostealt, intrapelvisk, intraperikardielt, intraperitonalt, intrapleuralt, intraprostatisk, intrapulmonært, intrarektalt, intrarenalt, intraretinalt, intraspinalt, intrasynovialt, intratoraksialt, intrauterint, intravesikalt, bolus, vaginalt, rektalt, bukkalt, sublingualt, intranasalt og transdermalt.
Et aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer minst et anti-idiotype antistoff til minst et bindende protein ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Anti-idiotype antistoffet inkluderer ethvert protein eller peptid inneholdende molekyl som omfatter minst en del av et immunoglobulin molekyl slik som, men ikke begrenset til, minst en komplementært bestemmende region (CDR) til et tung- eller lettkjede eller en ligand-bindende porsjon derav, en tungkjede eller lettkjede variabel region, en tungkjede eller lettkjede konstant region, en rammeverk-region, eller enhver porsjon derav, som kan bli inkorporert inn i et bindende protein ifølge den foreliggende oppfinnelsen.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur IA er en skjematisk representasjon av Ig-konstruksjoner med to variable domener (DVD) og viser strategien for genereringen av et DVD-Ig fra to moderantistoffer; Figur IB, er en skjematisk representasjon av konstruksjoner DVDl-Ig, DVD2-Ig, og to kimeriske mono-spesifikke antistoffer fra hybridoma kloner 2D13.E3 (anti-IL-loc) og 13F5.G5 (anti-IL-lp).
Detaljert Beskrivelse av oppfinnelsen
Denne oppfinnelsen angår multivalente og/eller multispesifikke bindende proteiner i stand til å binde to eller flere antigener. Spesifikt angår oppfinnelsen immunoglobuliner med to variable domener (DVD-Ig), og farmasøytiske sammensetninger derav, så vel som nukleinsyrer, rekombinant uttrykkende vektorer og vertsceller for å lage slike DVD-Ig'er. Fremgangsmåter for å anvende DVD-Ig'ene ifølge oppfinnelsen for å detektere spesifikke antigener, enten in vitro eller in vivo er også omfattet av oppfinnelsen.
Med mindre annet er definert heri, vitenskapelige og tekniske uttrykk anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen skal ha betydningene slik det vanligvis er forstått av fagmann. Betydningen og omfanget av uttrykkene burde være klart, imidlertid, i tilfelle av enhver latent tvetydighet, tar definisjoner tilveiebrakt heri presedens over enhver ordbok eller ytre definisjon. Videre skal, medmindre nødvendig utifrå sammenhengen, singulære uttrykk inkludere flertall og flertallsuttrykk skal inkludere entall. I denne søknaden betyr anvendelsen av "eller" det samme som "og/eller" medmindre annet er hevdet. Videre er anvendelsen av uttrykket "inkludert", så vel som andre former, slik som "inkluderer" og "inkludert", ikke begrensende. Også, uttrykk slik som "element" eller "komponent" omfatter både elementer og komponenter omfattende en enhet og elementer og komponenter som omfatter mer enn en underenhet medmindre annet er spesifikt nevnt.
Generelt er nomenklaturer anvendt i forbindelse med, og teknikker for, celle- og vevsdyrking, molekylærbiologi, immunologi, mikrobiologi, genetikk og protein- og nukleinsyrekjemi og hybridisering beskrevet heri de velkjent og vanligvis anvendt i teknikken. Metodene og teknikkene ifølge den foreliggende oppfinnelsen blir generelt utført ifølge konvensjonelle metoder velkjent i teknikken og som beskrevet i diverse generelle og mer spesifikke referanser som er sitert og diskutert i den foreliggende spesifikkasjonen medmindre ellers indikert. Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker blir utført i henhold til produsentens spesifikasjoner, som vanligvis oppnådd i teknikken eller som beskrevet heri. Nomenklaturene anvendt i forbindelse med, og laboratorieprosedyrene og teknikkene for, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi, og medisinal og farmasøytisk kjemi beskrevet heri er de velkjent og vanligvis anvendt i teknikken. Standard teknikker blir anvendt for kjemisk syntese, kjemisk analyse, farmasøytisk fremstilling, formulering, og levering, og behandling av pasienter.
Slik ved den foreliggende oppfinnelsen kan lettere bli forstått, er utvalgte uttrykk definert nedenfor.
Uttrykket "polypeptid" som anvendt heri, refererer til enhver polymerkjede med aminosyrer. Uttrykkene "peptid" og "protein" er anvendt om hverandre med uttrykket polypeptid og refererer også til en polymerkjede med aminosyrer. Uttrykket "polypeptid" omfatter opprinnelige eller kunstige proteiner, proteinfragmenter og polypeptidanaloger til en proteinsekvens. Et polypeptid kan være monomert eller polymert. Anvendelse av "polypeptid" heri er ment å omfatte polypeptid og fragmenter og varianter (inkludert fragmenter av varianter) derav, medmindre på annen måte motsagt ved sammenhengen. For et antigent polypeptid, inneholder et fragment av polypeptid valgfritt minst en kontinuerlig eller ikke-lineær epitop av polypeptid. De eksakte grensene til det minst ene epitop-fragmentet kan bli bekreftet ved å bruke vanlig ferdighet i teknikken. Fragmentet omfatter minst omtrent 5 kontinuerlige aminosyrer, slik som minst omtrent 10 kontinuerlige aminosyrer, minst omtrent 15 kontinuerlige aminosyrer, eller minst omtrent 20 kontinuerlige aminosyrer. En variant av polypeptid er som beskrevet heri.
Uttrykket "isolert protein" eller "isolert polypeptid" er et protein eller polypeptid som på grunn av dets opphav eller utgangspunkt for derivatisering ikke er assosiert med naturlig assosierte komponenter som følger med det i dets opprinnelige tilstand; er hovedsaklig fri for andre proteiner fra den samme spesien; er uttrykt av en celle fra en forskjellig type; eller forekommer ikke i naturen. Følgelig vil et polypeptid som er kjemisk syntetisert, eller syntetisert i et cellulært system forskjellig fra cellen fra hvilken den naturlig kommer fra, være "isolert" fra dets naturlig assosierte komponenter. Et protein kan også bli tilveiebrakt hovedsaklig fri for naturlig assosierte komponenter ved isolering, ved å bruke proteinrensingsteknikker velkjent i teknikken.
Uttrykket "å gjenvinne" som anvendt heri, refererer til prosessen med å gjenvinne en kjemisk spesie slik som et polypeptid hovedsaklig fri for naturlig assosierte komponenter ved isolering, f.eks., ved å bruke proteinrensingsteknikker velkjent i teknikken.
"Biologisk aktivitet" som anvendt heri, refererer til enhver eller flere iboende biologiske egenskaper til et molekyl (enten naturlig tilstede som funnet in vivo, eller tilveiebrakt eller muliggjort ved rekombinante midler). Biologiske egenskaper inkluderer men er ikke begrenset til å binde reseptor; induksjon av celle-proliferering, inhibere celle-vekst, induksjon av andre cytokiner, induksjon av apoptose, og enzymatisk aktivitet. Biologisk aktivitet inkluderer også aktivitet til et Ig-molekyl.
Uttrykkene "spesifikke bindende" eller "spesifikt bindende", som anvendt heri, i referanse til interaksjonen til et antistoff, et protein, eller et peptid med en andre kjemisk spesie, betyr ved interaksjonen er avhengig av nærværet av en bestemt struktur (f.eks., et antigen determinant eller epitop) på det kjemiske spesiet; for eksempel, et antistoff gjenkjenner og binder heller til en spesifikk proteinstruktur enn til proteiner generelt. Hver et antistoff er spesifikt for epitop "A", vil nærværet av et molekyl inneholdende epitop en (eller fri, umerket A), i en reaksjon inneholdende merket "A" og antistoffet, redusere mengden av merket en bundet til antistoffet.
Uttrykket "antistoff', som anvendt heri, refererer bredt til ethvert immunoglobulin (lg) molekyl omfattet av fire polypeptidkjeder, to tung (H) kjeder og to lett (L) kjeder, eller ethvert funksjonelt fragment, mutant, variant, eller derivat derav, som beholder de essensielle epitop-bindende egenskapene til et Ig-molekyl. Slike mutante, variante, eller derivate antistoff-formater er kjent i teknikken. Ikke-begrensende utførelsesformer av slike er diskutert nedenfor.
I et fullengde antistoffer hver tungkjede omfattet av en tungkjede variabel region (forkortet heri som HCVR eller VH) og en tungkjede konstant region. Tungkjede konstant regionen består av tre domener, CH1, CH2 og CH3. Hver lettkjede består av en lettkjede variabel region (forkortet heri som LCVR eller VL) og en lettkjede konstant region. Lettkjede konstant regionen består av et domene, CL. VH og VL regionene kan videre bli delt opp i regioner med hypervariabilitet, kalt komplementaritetsbestemmende regioner (CDR), adskilt med regioner som er mer konservert, kalt rammeverk-regioner (FR). Hver VH og VL består av tre CDR'er og fire FR'er, arrangert fra amino-terminus til karboksy-terminus i følgende rekkefølge: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Immunoglobulin molekyler kan være av enhver type (f.eks., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA og IgY), klasse (f.eks., IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgAl og IgA2) eller underklasse.
Uttrykket "Fc-region" blir anvendt for å definere C-terminal regionen til et immunoglobulin-tungkjede, som kan bli fremstilt ved papain-fordøying av et intakt antistoff. Fc-regionen kan være en Fc-region med opprinnelig sekvens eller en variant Fc-region. Fc-regionen til et immunoglobulin omfatter generelt to konstant domener, et CH2 domene og et CH3 domene, og omfatter valgfritt et CH4 domene, utbyttinger av aminosyre-residuer i Fc-porsjonen for å forandre effektorfunksjonen til antistoffer kjent i teknikken (Winter, et al. US Patentnr. 5,648,260 og 5,624,821). Fc-porsjonen av et antistoff medierer flere viktige effektor-funksjoner f.eks.,cytokin-induksjon, ADCC, fagocytose, komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC) og halveringstid/ klareringshastighet til antistoff og antigen-antistoffkomplekser. I noen tilfeller er disse effektor-funksjonene ønskelige for terapeutiske antistoff men kan i andre tilfeller være unødvendige eller til og med ødeleggende, avhengig av de terapeutiske formål. Visse menneskelige IgG erotypes, spesielt IgGl og IgG3, formidler ADCC og CDC via binding til FcyRs og komplement Clq, henholdsvis. Neonatale Fc-reseptorer (FcRn) er de kritiske komponentene som bestemmer sirkulerings-halveringstiden til antistoffer. I nok en annen utførelsesform er minst en aminosyreresidu byttet ut i konstant-regionen til antistoffet, for eksempel Fc-regionen til antistoffet, slik ved effektorfunksjoner til antistoffet er forandret. Dimeriseringen av to identiske tungkjeder til et immunoglobulin er mediert av dimeriseringen av CH3 domener og er stabilisert av disulfid-bindingene innenfor hengsel-regionen (Huber et al. Nature; 264: 415-20; Ties et al 1999 J Mol Biol; 293: 67-79.). Mutasjon av cystein-residuer innenfor hengsel-regionene for å forhindre tungkjede-tungkjede disulfid-bindinger vil destabilisere dimerisering av CH3 domener. Residuer ansvarlige for CH3 dimerisering har blitt identifisert (DalPAcqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73.). Det er derfor mulig å generere et monovalent halv-Ig. Interessant nok har disse monovalente halv-Ig molekyler blitt funnet i naturen for både IgG og IgA underklasser (Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70;Biewenga et al 1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400). Støkiometrien til FcRn: lg Fc-region har blitt bestemt å være 2:1 (West et al .2000 Biochemistry 39: 9698-708), og halv Fc er tilstrekkelig for å mediere FcRn-binding (Kim et al 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548.). Mutasjoner for å forstyrre dimeriseringen av CH3 domene kan ikke ha større ødeleggende virkning på dets FcRn-binding siden residuene viktig for CH3-dimerisering er lokalisert på det indre grensesnittet til CH3 b-sheet strukturen, mens regionen ansvarlig for FcRn-binding er lokalisert på det ytre grensesnittet til CH2-CH3 domenene. Imidlertid kan det halve Ig-molekylet ha visse fordeler i vevsgjennomtrengning på grunn av dets mindre størrelse enn det til et vanlig antistoff. I en utførelsesform er minst en aminosyreresidu byttet ut i konstant-regionen til det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen, for eksempel Fc-regionen, slik ved dimeriseringen av tungkjedene er forstyrret, resulterende i halve DVD Ig-molekyler. Den anti-inflammatoriske aktiviteten til IgG er avhengig av sialylering av det N-bundete glykanet til IgG Fc-fragmentet. Den eksakte glycan-tilstanden for anti-infiammatorisk aktivitet har blitt bestemt, slik ved et passende IgGl Fc-fragment kan bli lagd, for dermed å generere en helt rekombinant, sialylert IgGl Fc med kraftig forbedret styrke (Anthony, R.M., et al. (2008) Science 320:373-376).
Uttrykket "antigen-bindende porsjon" til et antistoff (eller bare "antistoff-porsjonen"), som anvendt heri, refererer til en eller flere fragmenter til et antistoff som beholder evnen til spesifikt å binde til et antigen. Det har blitt vist ved det antigen-bindende funksjonen til et antistoff kan bli utført av fragmenter av et fullengde antistoff. Slike utførelsesformer av antistoffer kan også være bispesifikke, dobbelt spesifikke, eller multi-spesifikke formater; spesifikt bindende til to eller flere forskjellige antigener. Eksempler på bindende fragmenter omfattet innenfor uttrykket "antigen- bindende porsjon" til et antistoff inkluderer (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment bestående av VL, VH, CL og CH1 domenene; (ii) et F(ab')2fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter knyttet sammen ved en disulfid-bro ved hengsel-regionen; (iii) et Fd-fragment bestående av VH- og CH1-domenene; (iv) et Fv-fragment bestående av VL- og VH-domenene fra en enkelt arm til et antistoff, (v) et dAb-fragment (Ward et al, (1989) Natur 341:544-546, Winter et al., PCT-publikasjon WO 90/05144 Al heri inkorporert ved referanse), som omfatter et enkelt variabelt domene; og (vi) en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR). Videre, selv om de to domenene til Fv-fragmentet, VL og VH, er kodet for av separate gener kan de bli knyttet sammen, ved å bruke rekombinante metoder, av en syntetisk linker som gjør de i stand til å bli lagd som en enkelt proteinkjede hvori VL og VH-regionene parres for å danne mono valente molekyler (kjent som enkelt-kjede Fv (scFv); se f. eks., Bird et al. (1988) Science 242:423426; og Huston et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Slike enkelt-kjede antistoffer er også ment å være omfattet innenfor uttrykket "antigen-bindende porsjon" til et antistoff. Andre former av enkelt-kjede antistoffer, slik som diabodier er også omfattet. Diabodier er bivalente, bispesifikke antistoffer hvori VH og VL domener blir uttrykt på en enkelt polypeptidkjede, men ved å bruke en linker som er for kort for å muliggjøre parring mellom de to domenene på det samme kjedet, dermed tvinges domenene å parre med komplementære domener til et annet kjede og skaper to antigen-bindende seter (se f. eks., Holliger, P., et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Slike antistoff-bindende porsjoner erkjent i teknikken (Kontermann og Dubel eds., Antibodv Engineering (2001) Springer-Verlag. Ny York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5). I tillegg inkluderer enkelt-kjede antistoffer også "lineære antistoffer" omfattende et par med tandem Fv-segmenter (VH-CH1-VH-CH1) som, sammen med komplementære lettkjede polypeptider, danner et par med antigen-bindende regioner (Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995); og US
Patentnr. 5,641,870).
Uttrykket "multivalent-bindende protein" blir anvendt gjennom hele denne spesifikasjonen for å betegne et bindende protein omfattende to eller flere antigen-bindende seter. I en utførelsesform er det multivalent-bindende proteinet konstruert for å ha the tre eller flere antigen-bindende seter, og er generelt ikke et naturlig forekommende antistoff. Uttrykket "multispesifikt bindende protein" refererer til et bindende protein i stand til å binde to eller flere beslektede eller ikke-beslektede mål. Bindende proteiner med to variable domener (DVD) ifølge oppfinnelsen omfatter to eller flere antigen-bindende seter og er tetravalente eller multivalente bindende proteiner. DVD'er kan være monospesifikke, dvs., i stand til å binde et antigen eller multispesifikt, dvs. i stand til å binde to eller flere antigener. DVD-bindende proteiner omfattende to tungkjede DVD polypeptider og to lettkjede DVD polypeptider er referert til som DVD-Ig. Hver halvpart av et DVD-Ig omfatter et tungkjede DVD polypeptid, og et lettkjede DVD polypeptid, og to antigen-bindende seter. Hvert bindende sete omfatter et tungkjede variabelt domene og et lettkjede variabelt domene med totalt 6 CDR'er involvert i antigen-binding per antigen-bindende sete.
Uttrykket "bispesifikt antistoff, som anvendt heri, refererer til fullengde antistoffer som er fremstilt ved "quadroma"-teknologi (se Milstein, C. og A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40), ved kjemisk konjugering av to forskjellige monoklonale antistoffer (se Staerz, U.D., et al., Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31), eller ved knapp-i-hull eller lignende metoder som introduserer mutasjoner i Fc-regionen (se Holliger, P., T. Prospero, og G. Winter, Proe Nati Acad Sei USA, 1993. 90(14): p. 6444-8.18), resulterende i flere forskjellige immunoglobulin-spesier av hvilke bare ett er et funksjonelt bispesifikt antistoff. Ved molekylær funksjon, et bispesifikt antistoff binder et antigen (eller epitop) på en av dets to bindende armer (et par med HC/LC), og binder et annet antigen (eller epitop) på dets andre arm (et annet par med HC/LC). Ved denne definisjonen har et bispesifikt antistoff to distinkte antigen-bindende armer (både i spesifisitet og CDR-sekvenser), og er mono valent for hvert antigen det binder til.
Uttrykket "dobbelt-spesifikke antistoff', som anvendt heri, refererer til fullengde antistoffer som kan binde til forskjellige antigener (eller epitoper) i hver av dets to bindende armer (et par med HC/LC) (se PCT-publikasjon WO 02/02773). Følgelig har et dobbelt-spesifikt bindende protein to identiske antigen-bindende armer, med identisk spesifisitet og identiske CDR-sekvenser, og er bivalent for hvert antigen det binder til.
Et "funksjonelt antigen-bindende sete" til et bindende protein er et som er i stand til å binde et mål-antigen. Den antigen-bindende affiniteten til det antigen-bindende setet er ikke nødvendigvis like sterk som moder-antistoffet fra hvilket det antigen-bindende setet er avledet, men evnen til å binde antigen må være målbar ved å bruke enhver av en rekke metoder kjent for å evaluere antistoff-binding til et antigen. Videre trenger ikke den antigen-bindende affiniteten til hver av de antigen-bindende setene til et multivalent antistoff heri være kvantitativt den samme.
Uttrykket "cytokin" er et generisk uttrykk for proteiner frigjort av en celle-populasjon, som virker på en annen celle-populasjon som intercellulære mediatorer. Eksempler på slike cytokiner er lymfokiner, monokiner, og tradisjonelle polypeptid-hormoner. Inkludert blant cytokinene er veksthormon slik som menneskelig veksthormon, N-metionyl menneskelig veksthormon, og bovint veksthormon; paratyroid hormon; tyroksin; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glykoprotein-hormoner slik som hårsekkstimulerende hormon (FSH), tyroid stimulerende hormon (TSH), og luteinerende hormon (LH); hepatisk vekstfaktor; fibroblast vekstfaktor; prolaktin; placental laktogen; tumornekrose-faktor-alfa og - beta; mullerian-inhiberende stoff; mus gonadotropin-assosiert peptid; inhibin; aktivin; vaskulær endotel vekstfaktor; integrin; trombopoietin (TPO); nerve-vekstfaktorer slik som NGF-alfa; blodplate-vekstfaktor; placental vekstfaktor, transformerende vekstfaktorer (TGF'er) slik som TGF- alfa og TGF-beta; Insulin-lignende vekstfaktor-1 og -11; erythropoietin (EPO); osteoinduktive faktorer; interferoner slik som interferon-alfa, -beta og -gamma kolonistimulerende faktorer (CSF'er) slik som makrofage-CSF (M-CSF); granulocytt makrofage-CSF (GM-CSF); og granulocytt-CSF (G-CSF); interleukiner (IL'er) slik som IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33; en tumornekrose-faktor slik som TNF-alfa eller TNF-beta; og andre polypeptid faktorer inkludert LIF og kit ligand (KL), som anvendt heri inkluderer uttrykket cytokin proteiner fra naturlige kilder eller fra rekombinant cellekultur og biologisk aktive ekvivalenter av de opprinnelige sekvens cytokiner.
Uttrykket "linker" blir anvendt for å betegne polypeptider omfattende to eller flere aminosyre-residuer knyttet sammen med peptid-bindinger og blir anvendt for å knytte sammen en eller flere antigen-bindende porsjoner. Slike linker-polypeptider er velkjent i teknikken (se f. eks., Holliger, P., et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Eksempelvis inkluderer linkere, men er ikke begrenset til, AKTTPKLEEGEFSEAR (SEKV ID NR: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEKV ID NR: 2); AKTTPKLGG (SEKV ID NR: 3); SAKTTPKLGG (SEKV ID NR: 4); SAKTTP (SEKV ID NR: 5); RADAAP (SEKV ID NR: 6); RADAAPTVS (SEKV ID NR: 7); RADAAAAGGPGS (SEKV ID NR: 8); RADAAAA(G4S)4(SEKV ID NR: 9);SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEKV ID NR: 10); ADAAP (SEKV ID NR: 11); ADAAPTVSIFPP (SEKV ID NR: 12); TVAAP (SEKV ID NR: 13); TVAAPSVFIFPP (SEKV ID NR: 14); QPKAAP (SEKV ID NR: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEKV ID NR: 16); AKTTPP (SEKV ID NR: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEKV ID NR: 18); AKTTAP (SEKV ID NR: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEKV ID NR: 20); ASTKGP (SEKV ID NR: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEKV ID NR: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEKV ID NR: 23); GENKVEYAPALMALS (SEKV ID NR: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEKV ID NR: 25); og GHEAAAVMQVQYPAS (SEKV ID NR: 26).
Et "immunoglobulin konstant domene" refererer til et tung- eller lettkjede konstant domene. Menneskelig IgG-tungkjede og lettkjede konstant domene aminosyresekvenser er kjent i teknikken.
Uttrykket "monoklonale antistoff' eller "mAb" som anvendt heri refererer til et antistoff oppnådd fra en populasjon av hovedsaklig homogene antistoffer, dvs., de individuelle antistoffer omfattende populasjonen er identiske bortsett fra mulig naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i små mengder. Monoklonale antistoffer er i høy grad spesifikke, rettet mot et enkelt antigen. Videre, i motsetning til polyklonale antistoff-preparater som typisk inkluderer forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), hver mAb er rettet mot en enkelt determinant på antigenet. Modifikatoren "monoklonale" er ikke å bli konstruert som å kreve produksjon av antistoffet ved noen bestemt metode.
Uttrykket "humant antistoff', som anvendt heri, er ment å inkludere antistoffer som har variable og konstante regioner avledet fra immunoglobulin sekvenser fret menneskee kimceller. De humane antistoffene ifølge oppfinnelsen kan inkludere aminosyre-residuer ikke kodet av humane kimlinje immunoglobulin sekvenser (f.eks., mutasjoner introdusert ved tilfeldig eller sete-spesifikk mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo), for eksempel i CDR'ene og spesielt CDR3. Imidlertid er ikke uttrykket "humant antistoff', som anvendt heri, ment å inkludere antistoffer hvori CDR-sekvenser avledet fra kjønnscellene til en annen pattedyrart, slik som en mus, har blitt podet på humane rammeverksekvenser.
Uttrykket "rekombinant humant antistoff, som anvendt heri, er ment å inkludere alle humane antistoffer som blir fremstilt, uttrykt, lagd eller isolert ved rekombinante midler, slik som antistoffer uttrykt ved å bruke en rekombinant uttrykkingsvektor transfektert inn i en vertscelle (beskrevet videre i Seksjon IIC, nedenfor), antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoff-bibliotek (Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., og Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425445; Gavilondo J.V., og Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., og Chames P. (2000) Immunologi Idag 21:371-378 ), antistoffer isolert fra et dyr (f.eks., en mus) som er transgent for humane immunoglobulin gener (se, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Syrer Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. og Green L.L. (2002) Current Opinion in Bioteknologi 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Idag 21:364-370) eller antistoffer fremstilt, uttrykt, lagd eller isolert ved enhver annen metode som involverer spleising av humane immunoglobulin gensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable og konstante regioner avledet fra immunoglobulin sekvenser fret menneskee kimceller. I visse utførelsesformer er imidlertid slike rekombinante humane antistoffer utsatt for in vitro mutagenese (eller, når et dyr transgent for humane Ig-sekvenser blir anvendt, in vivo somatisk mutagenese) og følgelig er aminosyresekvensene til VH og VL regionene til de rekombinante antistoffene sekvenser som, selv om de er avledet fra og relatert til humane kimcellelinje VH og VL sekvenser, ikke kan eksistere naturlig innenfor det humane antistoff repertoaret hos kimcellelinjer in vivo.
Et "affinitetsmodnet" antistoffer et antistoff med en eller flere forandringer i en eller flere
CDR'er derav som resulterer i en forbedring i affiniteten til antistoffet for antigen, sammenlignet med et moderantistoff som ikke innehar den forandringen(e). Eksempelvis vil affinitetsmodnede antistoffer ha nanomolare eller til og med picomolare affiniteter for mål-antigenet. Affinitetsmodnede antistoffer blir produsert ved prosedyrer kjent i teknikken. Marks et al. BidlTeknologi 10:779-783 (1992) beskriver affinitetsmodning ved VH og VL domenestokking. Tilfeldig mutagenese av CDR og/eller rammeverk-residuer er beskrevet av: Barbas et al. Proe Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147- 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al, J. Mol. BioL 226:889-896 (1992) og selektiv mutasjon ved selektive mutagenese-posisjoner, kontakt- eller hypermutasjonsposisjoner med en aktivitetsforsterkende aminosyreresidu som beskrevet i US patent US 6914128B1.
Uttrykket "kimerisk antistoff refererer til antistoffer som omfatter tung- og lettkjede variabel region sekvenser fra en art og konstant region sekvenser fra en annen art, slik som antistoffer som har murine tung- og lettkjede variable regioner knyttet til humane konstantregioner.
Uttrykket "CDR-podet antistoff refererer til antistoffer som omfatter tung- og lettkjede variabel region sekvenser fra en art men hvori sekvensene til en eller flere av CDR-regionene til VH og/eller VL er byttet ut med CDR-sekvenser fra en annen art, slik som antistoffer som har murine tung- og lettkjede variable regioner hvori en eller flere av de murine CDR'ene (f.eks., CDR3) har blitt byttet ut med humane CDR-sekvenser.
Uttrykket "humanisert antistoff refererer til antistoffer som omfatter tung- og lettkjede variabel region sekvenser fra en ikke-human art (f.eks., en mus) men hvori minst en del av VH-og/eller VL-sekvensen har blitt forandret til å være mer "menneskelignende", dvs., mer lik humane kimcellelinje variable sekvenser. En type av humanisert antistoffer et CDR-podet antistoff, hvori humane CDR-sekvenser blir introdusert inn i ikke-humane VH og VL sekvenser for å erstatte de korresponderende ikke-humane CDR-sekvensene. Også "humanisert antistoffer et antistoff eller en variant, derivat, analog eller fragment derav som immunospesifikt binder til et antigen av interesse og som omfatter en rammeverk (FR) region som har hovedsaklig aminosyre-sekvensen til et humant antistoff og en komplementær-bestemmende region (CDR) som har hovedsaklig aminosyre-sekvensen til et ikke-humant antistoff. Som anvendt heri, refererer uttrykket "hovedsaklig" i sammenheng med en CDR til en CDR som har en aminosyre-sekvens minst 80%, minst 85%, minst 90%, minst 95%, minst 98% eller minst 99% identisk med aminosyre-sekvensen til et ikke-humant antistoff CDR. Et humanisert antistoff omfatter hovedsaklig alle av minst en, og typisk to, variable domener (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) hvori alle eller hovedsaklig alle av CDR-regionene tilsvarer de til et ikke-humant immunoglobulin (dvs., donor antistoff) og alle eller hovedsaklig alle av rammeverk-regionene er de fra en human immunoglobulin konsensus-sekvens. I en utførelsesform omfatter et humanisert antistoff også minst en del av en immunoglobulin konstant-region (Fc), typisk en fra et humant immunoglobulin. I noen utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff både lettkjedet så vel som minst det variable domenet av et tungkjede. Antistoffet kan også inkludere CH1, hengsel, CH2, CH3, og CH4 regionene av tungkjedet. I noen utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff bare et humanisert lettkjede. I noen utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff bare et humanisert tungkjede. I spesifikke utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff bare et humanisert variabelt domene fra et lettkjede og/eller humanisert tungkjede.
Uttrykkene "Kabat-nummerering", "Kabat-definisjoner" og "Kabat-merking" er anvendt om hverandre heri. Disse uttrykkene, som er gjenkjent i teknikken, refererer til et system for å nummerere aminosyre-residuer som er mer variable ( dvs. hypervariable) enn andre aminosyre-residuer i de tung-og lettkjede variable regionene til et antistoff, eller en antigen-bindende porsjon derav (Kabat-er al.
(1971) Ann. NY Acad, Sei. 190:382-391 og, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikasjonsnr. 91-3242). For den tungkjede variable regionen, strekker den hypervariable regionen seg fra aminosyre-posisjoner 31 til 35 for CDR1, aminosyre-posisjoner 50 til 65 for CDR2, og aminosyre-posisjoner 95 til 102 for CDR3. For lettkjede variable regionen, strekker den hypervariable regionen seg fra aminosyre-posisjoner 24 til 34 for CDR1, aminosyre-posisjoner 50 til 56 for CDR2, og aminosyre-posisjoner 89 til 97 for CDR3.
Som anvendt heri, refererer uttrykket "CDR" til den komplementaritetsbestemmende regionen innenfor antistoff variable sekvenser. Det er tre CDR'er i hver av de variable regionene til tungkjedet og lettkjedet, som er betegnet CDR1, CDR2 og CDR3, for hver av de variable regionene. Uttrykket "CDR-sett" som anvendt heri refererer til en gruppe av tre CDR'er som forekomme i en enkelt variabel region i stand til å binde antigenet. De eksakte grensene for disse CDR'er har blitt definert forskjellig ifølge forskjellig systemer. Systemet beskrevet av Kabat-(Kabat-et al., Sequences of proteins of immunological interest (National Institutes of Health, Betesda, Md. (1987) og (1991)) tilveiebringer ikke bare et entydig residu-nummereringsystem anvendbart på enhver variabel region til et antistoff, men tilveiebringer også presise residu-grenser som definerer de tre CDR'er. Disse CDR'er kan bli referert til som Kabat-CDR'er. Chotia og medarbeidere (Chotia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) og Chotia et al., Nature 342:877-883 (1989)) fant ved visse under-porsjoner innenfor Kabat-CDR'er antar nesten identiske peptidryggrads-konformasjoner, selvom de har stor variasjon på aminosyresekvens-nivået. Disse under-porsjoner ble betegnet som LI, L2 og L3 eller Hl, H2 og H3 hvor the "L" og the "H" betegner henholdsvis lettkjede og tungkjede regionene. Disse regioner kan bli referert til som Chotia CDR'er, som har grenser som overlapper med Kabat-CDR'er. Andre grenser som definerer CDR'er som overlapper med Kabat-CDR'ene har blitt beskrevet av Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) og MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). ytterligere andre definisjoner av CDR-grenser kan strengt tatt ikke følge et av systemene heri, men vil allikevel overlapper med Kabat-CDR'ene, selv om de kan bli forkortet eller forlenget i lys av prediksjon eller eksperimentelle funn ved bestemte residuer eller grupper av residuer eller til og med hele CDR'er ikke påvirker antigen-binding i betydelig grad. Metodene anvendt heri kan benytte seg av CDR'er definert ifølge ethvert av disse systemene, selv om visse utførelsesformer anvender Kabat-eller Chotia definerte CDR'er.
Som anvendt heri, refererer uttrykket "rammeverk" eller "rammeverk-sekvens" til de gjenværende sekvensene til en variabel region minus CDR'ene. Fordi den eksakte definisjonen av en CDR-sekvens kan bli bestemt ved forskjellig systemer, betydningen av en rammeverk-sekvens er gjenstand for tilsvarende forskjellige tolkninger. De seks CDR'ene (CDR-L1, -L2, og -L3 fra lettkjede og CDR-H1, -H2, og -H3 fra tungkjede) deler også rammeverk-regionene på lettkjedet og tungkjedet inn i fire under-regioner (FRI, FR2, FR3 og FR4) på hvert kjede, hvori CDR1 er posisjonert mellom FRI og FR2, CDR2 mellom FR2 og FR3, og CDR3 mellom FR3 og FR4. Uten å spesifisere de bestemte under-regioner som FRI, FR2, FR3 eller FR4, representerer en rammeverk-region, som referert av andre, de kombinerte FR'ene innenfor den variable regionen av en enkelt, naturlig forekommende immunoglobulinkjede. som anvendt heri, en FR representerer en av de fire under-regionene, og FR'er representerer to eller flere av de fire under-regionene som utgjør en rammeverk-region.
Som anvendt heri, refererer uttrykket "kimlinje antistoffgen" eller "genfragment" til en immunoglobulin-sekvens kodet av ikke-lymfoide celler som ikke har undergått modningsprosessen som fører til genetisk rearrangement og mutasjon for uttrykking av et bestemt immunoglobulin. (Se, f.eks., Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). En av fordelene tilveiebrakt av diverse utførelsesformer ifølge den foreliggende oppfinnelsen stammer fra annerkjennelsen av ved kimlinje-antistoff gener er mer sannsynlige enn modne antistoff gener å konservere essensielle aminosyre-sekvens strukturer karakteristisk for individer i teknikken, følgelig mindre sannsynlige å bli gjenkjent som fra en fremmed kilde når anvendt terapeutisk i den teknikken.
Som anvendt heri, uttrykket "nøytraliserende" refererer til å motvirke den biologiske aktiviteten til et antigen når et bindende protein spesifikt binder antigenet. I en utførelsesform, the nøytraliserende-bindende protein binder cytokinet og reduserer dets biologiske aktivitet med minst omtrent 20%, 40%, 60%, 80%, 85% eller mer.
Uttrykket "aktivitet" inkluderer aktiviteter slik som bindings-spesifisiteten og affiniteten til et DVD-Ig ovenfor to eller flere antigener.
Uttrykket "epitop" inkluderer enhver polypeptid determinant i stand til spesifikk binding til en immunoglobulin- eller T-cellereseptor. I visse utførelsesformer inkluderer epitop-determinanter kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler slik som aminosyrer, sukker-sidekjeder, fosforyl, eller sulfonyl, og, i visse utførelsesformer, kan ha spesifikke tredimensjonale strukturelle karakteristikker, og/eller spesifikke ladningskarakteristikker. En epitop er en region på et antigen som blir bundet til av et antistoff. I visse utførelsesformer, et antistoffer sagt å spesifikt binder et antigen når det gjenkjenner dets målantigen i en kompleks blanding av proteiner og/eller makromolekyler. Antistoffer er sagt å "binde til den samme epitopen" hvis antistoffene kryss-konkurrerer (en forhindrer den bindende eller modulerende virkningen til den andre). I tillegg er strukturelle definisjoner av epitoper (overlappende, lignende, identiske) informative, men funksjonelle definisjoner er ofte mer relevante siden de omfatter strukturelle (binding) og funksjonelle (modulering, konkurranse) parametere.
Uttrykket "overflate-plasmonresonans", som anvendt heri, refererer til et optisk fenomen som gjør det mulig med analysering av sanntids biospesifikke interaksjoner ved detektering av forandringer i protein konsentrasjoner innenfor en biosensor-matrise, for eksempel ved å bruke the BIAcore® system (BIAcore International AB, en GE Healthcare company, Uppsala, Sweden og Piscataway, NJ).
For videre beskrivelses, se Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al.
(1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995)7. Mol. Recognit. 8:125-131; og Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
Uttrykket "Kon", som anvendt heri, er ment å referere til på-hastighetskonstanten for assosiering av et bindende protein (f.eks., et antistoff) til antigenet for å danne f.eks., antistoff/antigen-komplekset som er kjent i teknikken. "Kon" er også kjent ved uttrykkene "assosiasjonshastighets-konstant", eller "ka", som anvendt om hverandre heri. Denne verdien indikerer bindingshastigheten til et antistoff til dets målantigen eller hastigheten av kompleksdannelse mellom et antistoff og antigen er også vist ved likningen nedenfor:
Uttrykket "K^', som anvendt heri, er ment å referere til av-hastighetskonstanten for dissosiering, eller "dissosiasjonshastighetskonstant", til et bindende protein (f.eks., et antistoff) fra f.eks., antistoff/antigen-komplekset som er kjent i teknikken. Denne verdien indikerer dissosieringshastigheten til et antistoff fra dets målantigen eller separering av Ab-Ag kompleks over tid til fritt antistoff og antigen som vist ved likningen nedenfor:
Uttrykket "KD" , som anvendt heri, er ment å referere til the "likevekt dissosiasjon konstant", og refererer til verdien oppnådd i en titreringsmåling ved likevekt, eller ved å dele dissosiasjonshastighetskonstanten (koff) på assosiasjonshastighets-konstanten (kon). Assosiasjonshastighets-konstanten, dissosiasjonshastighetskonstanten og likevektsdissosiasjonskonstanten blir brukt for å representere bindingsaffiniteten til et antistoff til et antigen. Metoder for å bestemme assosiasjons- og dissosiasjonshastighetskonstanter er velkjent i teknikken. Ved å bruke fluorescens-baserte teknikker gis høy følsomhet og muligheten for å undersøke prøver i fysiologiske buffere ved likevekt. Andre eksperimentelle tilnærminger og instrumenter slik som en BIAcore® (biomolekylær interaksjoner-analyse) assay kan bli anvendt (f.eks., instrument tilgjengelig fra BIAcore International AB, en GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Videre, en KinExA® (Kinetic Exclusion Assay) assay, tilgjengelig fra Sapidyne Instrumenter (Boise, Idaho) kan også bli anvendt.
"Merkestoff og "detekterbart merkestoff betyr en enhet knyttet til en spesifikt bindende partner, slik som et antistoff eller en analytt, f.eks., for å gjøre reaksjonen mellom medlemmer av et spesifikt bindende par, slik som et antistoff og en analytt, detekterbar, og den spesifikt bindende partneren, f.eks., antistoff eller analytt, som er merket slik blir referert til som "detekterbart merket." Følgelig refererer uttrykket "merket bindende protein", som anvendt heri, til et protein med et merkestoff inkorporert som muliggjør identifiseringen av det bindende proteinet. I en utførelsesform er merkestoffet en detekterbar markør som kan produsere et signal som er detekterbart ved visuelle
eller instrumentelle metoder, f.eks., inkorporering av en radioaktivt merken aminosyre eller tilknytning av biotinylenheter til et polypeptid som kan bli detektert ved merket avidin (f.eks., streptavidin inneholdende en fluorescent markør eller enzymatisk aktivitet som kan bli detektert ved optiske eller kolorimetriske metoder). Eksempler på merkestoffer for polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, de følgende: radioisotoper eller radionuklider (f.eks., 3H 14C<35>S,<90>Y,<99>Tc,<11>'ln,<1>251,131I,177Lu,<166>Ho, eller<153>Sm); kromogener, fluorescerende merkestoffer (f.eks., FITC, rhodamin, lanthanide fosfors), enzymatisk merkestoffer (f.eks., pepperrot peroksidase, luciferase, basisk fosfatase); kjemoluminescerende markører; biotinyl grupper; forutbestemte polypeptid-epitoper gjenkjent av en sekundær reporter (f.eks., leucin glidelåspar-sekvenser, bindende seter for sekundære antistoffer, metal-bindende domener, epitop-merker); og magnetiske midler, slik som gadolinium kelater. Representative eksempler på merkestoffer vanligvis anvendt for immunassayer inkluderer enheter som produserer lys, f.eks., acridinium-forbindelser, og enheter som produserer fluorescens, f.eks., fluorescein. Andre merkestoffer er beskrevet heri. I denne sammenhengen kan ikke enheten i seg selv bli detekterbart merket men kan bli detekterbar ved reaksjon med nok en annen enhet. Anvendelse av "detekterbart merket" er ment å omfatte den siste typen av detekterbar merking.
Uttrykket "konjugat" refererer til et bindende protein, slik som et antistoff, kjemisk knyttet til en andre kjemisk enhet, slik som et terapeutisk eller cytotoksisk middel. Uttrykket "middel" blir anvendt heri for å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl, eller et ekstrakt lagd fra biologiske materialer. I en utførelsesform inkluderer de terapeutiske eller cytotoksiske midlene, men er ikke begrenset til, pertussis toksin, taxol, cytochalasin B, gramicidin D, etidium bromid, emetine, mitomicin, etoposid, tenoposid, vincristine, vinblastine, colchicin, doksorubicin, daunorubicin, dihydroksy anthracin dione, mitoxantron, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoider, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, og puromycin og analoger eller homologer derav. Når anvendt i forbindelse med et immunoassay kan konjugat-antistoffet være et detekterbart merket antistoff anvendt som deteksjonsantistoffet.
Uttrykkene "krystall" og "krystallisert" som anvendt heri, refererer til et bindende protein (f.eks., et antistoff), eller antigen-bindende porsjon derav, som eksisterer i form av en krystall. Krystaller er en form av fast stoff, som er distinkt fra andre former slik som den amorfe faste tilstanden eller den flytende krystallformen. Krystaller består av vanlige, repeterende, tredimensjonalee rekker av atomer, ioner, molekyler (f.eks., proteiner slik som antistoffer), eller molekylære sammenstillinger (f.eks., antigen/antistoff komplekser). Disse tre-dimensjonale rekker er arrangert ifølge spesifikke matematiske sammenhenger som er godt forstått i området. Den grunnleggende enheten, eller byggeblokken, som blir repetert i en krystall blir kalt den asymmetriske enheten. Repetisjon av den asymmetriske enheten i et arrangement som konformerer med en gitt, veldefinert krystalllografisk symmetri tilveiebringer "enhetscellen" til krystallen. Repetisjon av enhetscellen ved repeterende videreføringer i alle tre dimensjoner tilveiebringer krystallen. Se
Giege, R. og Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, Ny York, Ny York, (1999)."
Uttrykket "polynukleotid" betyr en polymer form bestående av to eller flere nukleotider, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av en av typene nukleotid. Uttrykket inkluderer enkelt eller dobbelttrådede former av DNA.
Uttrykket "isolert polynukleotid" skal bety et polynukleotid (f.eks., av genomisk, cDNA, eller syntetisk opphav, eller en kombinasjon derav) som, grunnet dets opphav, det "isolerte polynukleotidet" er ikke assosiert med hele eller en del av et polynukleotid med hvilket det "isolerte polynukleotidet" er funnet i naturen; er operasjonelt knyttet til et polynukleotid som det ikke er knyttet til i naturen; eller forekommer ikke i naturen som del av en større sekvens.
Uttrykket "vektor", er ment å referere til et nukleinsyre-molekyl i stand til å transportere en annen nukleinsyre til hvilket det har blitt bundet. En type av vektor er et "plasmid", som refererer til en sirkulær dobbeltrådet DNA-sløyfe inn i hvilket ytterligere DNA-segmenter kan bli ligert. En annen type av vektor er en viral vektor, hvori ytterligere DNA-segmenter kan bli ligert inn i det virale genomet. Visse vektorer er i stand til autonom replikering i en vertscelle inn i hvilken de er introdusert (f.eks., bakterielle vektorer som har et bakterielt opphav av replikering og episomale mammaliske vektorer). Andre vektorer (f.eks., ikke-episomale mammaliske vektorer) kan bli integrert inn i genomet til en vertscelle ved introduksjon inn i vertscellen, og dermed er replicated along med the vert genome. Videre, visse vektorer er i stand til dirigerende uttrykkingen av gener til hvilket de er operativt linked. Slike vektorer er referert til heri as "rekombinant uttrykkende vektorer" (eller bare, "uttrykkingsvektorer"). Generelt, uttrykkingsvektorer of utility i rekombinante DNA-teknikker er ofte i form av plasmids. I the til stede spesifikkation, "plasmid" og "vektor" kan bli anvendt om hverandre as the plasmid er the mest vanligvis anvendt form of vektor. Imidlertid er oppfinnelsen ment å inkludere slike andre former av uttrykkingsvektorer, slik som virale vektorer (f.eks., replikeringsudyktige retrovirus, adenovirus og adeno-assosiert virus), som betjener ekvivalente funksjoner.
Uttrykket "operasjonelt sammenknyttet" refererer til en sammenstilling hvori komponentene beskrevet er i et forhold som tillater dem å fungere på deres tiltenkte måte. En kontrollsekvens "operasjonelt sammenknyttet" til en kodingssekvens er ligert på en slik måte ved uttrykking av kodingssekvensen er oppnådd under betingelser kompatible med kontrollsekvensene. "Operasjonelt sammenknyttede" sekvenser inkluderer både Uttrykking-kontrollsekvenser som er kontinuerlige med genet av interesse og Uttrykking-kontrollsekvenser som virker i trans eller på en avstand for å kontrollere genet av interesse. Uttrykket "uttrykking kontrollsekvens" som anvendt heri refererer til polynukleotid-sekvenser som er nødvendige for å oppnå uttrykkingen og prosessering av kodingssekvenser til hvilket de er ligert. Uttrykking-kontrollsekvenser inkluderer passende transkripsjonsinitierings, -terminerings, -promoterings og forsterkingssekvenser; effektive RNA-prosesseringssignaler slik som spleising og polyadenyleringssignaler; sekvenser som stabiliserer cytoplasmisk mRNA; sekvenser som forbedrer translasjonseffektivitet (dvs., Kozak konsensus-sekvens); sekvenser som forbedrer proteinstabillitet; og når ønsket, sekvenser som forbedrer proteinutsondring. Egenskapene til slike kontrollsekvenser varierer avhengig av vertsorganismen; i prokaryoter inkluderer slike kontrollsekvenser generelt promoter, ribosomal-bindende sete, og transkripsjonsterminerings-sekvens; i eukaryoter inkluderer generelt slike kontrollsekvenser promoter og transkripsjonsterminerings-sekvens. Uttrykket "kontrollsekvenser" er ment å inkludere komponenter hvis tilstedeværelse er essensielle for uttrykking og prosessering, og kan også inkludere ytterligere komponenter hvis tilstedeværelse er fordelaktig, for eksempel, leder-sekvenser og fusjonspartner-sekvenser.
"Transformasjon", refererer til enhver prosess ved hvilken eksogen DNA går inn i en vertscelle. Transformasjon kan forekomme under naturlige eller kunstige betingelser ved å bruke diverse metoder velkjent i teknikken. Transformasjon kan baseres på enhver kjent metode for innsettingen av fremmede nukleinsyre-sekvenser inn i en prokaryotisk eller eukaryotisk vertscelle. Metoden blir valgt basert på vertscellen som blir transformert og kan inkludere, men er ikke begrenset til, viral infeksjon, elektroporering, lipofeksjon, og partikkelbombardering. Slike "transformerte" celler inkluderer stabilt transformerte celler hvori det innsatte DNA er i stand til replikering enten som et autonomt replikerende plasmid eller som en del av vertskromosomet. De inkluderer også celler som forbigående uttrykker det innsatte DNA eller RNA for begrensede tidsperioder.
Uttrykket "rekombinant vertscelle" (eller bare "vertscelle"), er ment å referere til en celle inn i hvilket eksogen DNA har blitt introdusert. I en utførelsesform omfatter vertscellen flere (f.eks., multippel) nukleinsyrer som koder for antistoffer, slik som vertscellene beskrevet i US Patentnr. 7,262,028, for eksempel. Det bør bli forstått ved slike uttrykk er ment å referere ikke bare til den spesifikke cellen, men til etterkommere av slik en celle. Fordi visse modifikasjoner kan forekomme i etterfølgende generasjoner på grunn av enten mutasjon eller påvirkninger fra miljøet, trenger faktisk ikke slike etterkommere å være identiske med modercellen, men er allikevel inkludert innenfor omfanget av uttrykket "vertscelle" som anvendt heri. I en utførelsesform inkluderer vertsceller prokaryotiske og eukaryotiske celler valgt fra hvilken som helst del av alt som er levende. I en annen utførelsesform inkluderer eukaryotiske celler protist, sopp, plante og dyreceller. I en annen utførelsesform inkluderer vertsceller men er ikke begrenset til de prokaryotiske cellelinjene E.Coli; mammaliske celle-linjer CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 og PER.C6; insektscellelinjen Sf9; og soppcellen Saccharomyces cerevisiae.
Standard teknikker kan bli anvendt for rekombinant DNA, oligonukleotid syntese, og vevskultur og transformasjon (f.eks., elektroporering, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker kan bli utført i henhold til produsentens spesifikasjoner eller som vanligvis oppnådd i teknikken eller som beskrevet heri. De forutgående teknikker og prosedyrer kan generelt bli utført ifølge konvensjonelle metoder velkjent i teknikken og som beskrevet i diverse generelle og mer spesifikke referanser som er sitert og diskutert i den foreliggende spesifikkasjonen. Se f.eks., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), som er inkorporert heri ved referanse for ethvert formål.
"Transgen organisme", som kjent i teknikken, refererer til en organisme som har celler som inneholder et transgen, hvori transgenet introdusert inn i organismen (eller en stamfar av organismen) uttrykker et polypeptid ikke naturlig uttrykt i organismen. Et "transgen" er en DNA-konstruksjon, som er stabilt og operasjonelt integrert inn i genomet til en celle fra hvilken en transgen organisme utvikles, dirigerende uttrykkingen av et kodet gen-produkt i en eller flere celletyper eller vev hos den transgene organismen.
Uttrykket "regulerer"og "modulerer" er anvendt om hverandre, og, som anvendt heri, refererer til en forandring eller en endring i aktiviteten til et molekyl av interesse (f.eks., den biologiske aktiviteten til et cytokin). Modulering kan være en økning eller en minsking i størrelsen på en viss aktivitet eller funksjon hos molekylet av interesse. Eksempelvise aktiviteter og funksjoner hos et molekyl inkluderer, men er ikke begrenset til, bindingskarakteristikker, enzymatisk aktivitet, cellereseptor-aktivering, og signaltransduksjoner.
Tilsvarende er uttrykket "modulator" en forbindelse i stand til å forandre eller endre en aktivitet eller funksjon hos et molekyl av interesse (f.eks., den biologiske aktiviteten til et cytokin). For eksempel kan en modulator forårsake en økning eller nedgang i størrelsen på en viss aktivitet eller funksjon hos et molekyl sammenlignet med størrelsen på aktiviteten eller funksjonen observert i fraværet av modulatoren. I visse utførelsesformer er en modulator en inhibitor, som senker størrelsen på minst en aktivitet eller funksjon hos et molekyl. Eksempelvis inkluderer inhibitorer, men er ikke begrenset til, proteiner, peptider, antistoffer, peptibodier, karbohydrater eller små organiske molekyler. Peptibodier er beskrevet, f.eks., i WO01/83525.
Uttrykket "agonist", refererer til en modulator som, når kontaktet med et molekyl av interesse, forårsaker en økning i størrelsen på en viss aktivitet eller funksjon hos molekylet sammenlignet med størrelsen på aktiviteten eller funksjonen observert i fraværet av agonisten. Spesifikke agonister av interesse kan inkludere, men er ikke begrenset til, polypeptider, nukleinsyrer, karbohydrater, eller ethvert av andre molekyler som binder til antigenet.
Uttrykket "antagonist" eller "inhibitor", refererer til en modulator som, når kontaktet med et molekyl av interesse forårsaker en senking i størrelsen på en viss aktivitet eller funksjon hos molekylet sammenlignet med størrelsen på aktiviteten eller funksjonen observert i fraværet av antagonisten. Spesifikke antagonister av interesse inkluderer de som blokkere eller modulerer den biologiske eller immunologiske aktiviteten til antigenet. Antagonister og inhibitorer av antigener kan inkludere, men er ikke begrenset til, proteiner, nukleinsyrer, karbohydrater, eller ethvert av andre molekyler, som binder til antigenet.
Som anvendt heri refererer uttrykket "effektiv mengde" til mengden av en terapi som er tilstrekkelig for å redusere eller forbedre alvorlighetsgraden og/eller varigheten av en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav, forhindre utviklingen av en forstyrrelse, forårsake tilbakegangen av en forstyrrelse, forhindre tilbakefall, utvikling, utbrudd eller progresjonen av en eller flere symptomer assosiert med en forstyrrelse, detektere en forstyrrelse, eller forbedre eller forbedre den/de profylaktiske eller terapeutiske virkning(ene) av en annen terapi (f.eks., profylaktisk eller terapeutisk middel).
"Pasient" og "subjekt" kan bli anvendt om hverandre heri for å referere til et dyr, slik som et pattedyr, inkludert en primat (for eksempel, et menneske, en apekatt, og en sjimpanse), en ikke-primat (for eksempel, en ku, en gris, en kamel, en lama, en hest, en geit, en kanin, en sau, en hamster, et marsvin, en katt, en hund, en rotte, en mus, en hval), en fugl (f.eks., en and eller en gås), og en hai. Fortrinnsvis er pasienten eller subjektet et menneske, slik som et menneske som blir behandlet eller vurdert for en sykdom, forstyrrelse eller tilstand, et menneske i risiko for en sykdom, forstyrrelse eller tilstand, et menneske som har en sykdom, forstyrrelse eller tilstand, og/eller menneske som blir behandlet for en sykdom, forstyrrelse eller tilstand.
Uttrykket "prøve", som anvendt heri, blir anvendt i dets bredeste betydning. En "biologisk prøve", som anvendt heri, inkluderer, men er ikke begrenset til, enhver mengde av en substans fra en levende ting eller tidligere levende ting. Slike levende ting inkluderer, men er ikke begrenset til, mennesker, mus, rotter, apekatter, hunder, kaniner og andre dyr. Slike stoffer inkluderer, men er ikke begrenset til, blod, (f.eks., helt blod), plasma, serum, urin, fostervann, synovialvæske, endotelceller, leukocytter, monocytter, andre celler, organer, vev, beinmarg, lymfekjertler og milten.
"Komponent," "komponenter," og "minst en komponent," refererer generelt til et fange-antistoff, et deteksjons eller konjugatantistoff, en kontroll, en kalibrator, en serie med kalibratorer, et sensitivitetspanel, en beholder, en buffer, et fortynningsmiddel, et salt, et enzym, en ko-faktor for et enzym, et deteksjonsreagens, et forbehandlingsreagens/løsning, et substrat (f.eks., som en løsning), en stoppe-løsning, og lignende som kan bli inkludert i et prøvesett for en testprøve, slik som en pasients urin, serum eller plasma prøve, i henhold til metodene beskrevet heri og andre metoder kjent i teknikken. Følgelig, i sammenheng med den foreliggende beskrivelsen, "minst en komponent," "komponent," og "komponenter" kan inkludere et polypeptid eller andre analytter som over, slik som en sammensetning omfattende en analytt slik som polypeptid, som er valgfritt immobilisert på en fast støtte, slik som ved binding til et anti-analytt (f.eks., anti-polypeptid) antistoff. Noen komponenter kan bli i løsning eller frysetørket for rekonstituering for anvendelse i et assay.
"Kontroll" refererer til en sammensetning kjent å ikke inneholde analytt ("negativ kontroll") eller å inneholde analytt ("positiv kontroll"). En positiv kontroll kan omfatte en kjent konsentrasjon av analytt. "Kontroll," "positiv kontroll," og "kalibrator" kan bli anvendt om hverandre heri for å referere til en sammensetning omfattende en kjent konsentrasjon av analytt. En "positiv kontroll" kan bli anvendt for å fastsette karakteristikker for ytelsen til assayet og er en nyttig indikator for integriteten til reagenser (f.eks., analytter).
"Forutbestemt cutoff' og "forutbestemt nivå" refererer generelt til en assay cutoff-verdi som blir anvendt for å vurdere resultatene av diagnostiske/prognostiske/terapeutiske effekter ved å sammenligne assayresultatene mot det forutbestemte cutoff/nivå, hvor det forutbestemte cutoff/nivå allerede har blitt knyttet til eller assosiert med diverse kliniske parametere (f.eks., alvorlighetsgrad av sykdom, progresjon/ikke-progresjon/forbedring, osv.). Mens den foreliggende beskrivelsen kan tilveiebringe eksempelvis forutbestemte nivåer, er det velkjent ved cutoff verdier kan variere avhengig av egenskapene til immunoassayet (f.eks., antistoffer anvendt, osv.). Det er videre godt innenfor den vanlige evnen til en i teknikken å tilpasse beskrivelsen heri for andre immunoassayer for å oppnå immunoassay-spesifikke cutoff verdier for de andre immunoassayer basert på denne beskrivelsen. Mens den presise verdien på det forutbestemte cutoff/nivået kan variere mellom assayer, bør korrelasjoner som beskrevet heri (hvis noen) være generelt gjeldende.
"Forbehandlingsreagens," f. eks., lyserings, presipiterer og/eller oppløsningsreagens, som anvendt i et diagnostisk assay som beskrevet heri er et som lyserer enhver celle og/eller gjør løselig enhver analytt som er tilstede i en testprøve. Forbehandling er ikke nødvendig for alle prøver, som beskrevet videre heri. Blant andre ting, å gjøre analytten løselig (f.eks., polypeptid av interesse) kan medføre frigjørelse av analytten fra ethvert endogent bindende protein tilstede i prøven. Et forbehandlingsreagens kan være homogent (ikke kreve et separasjonstrinn) eller heterogent (krever et separasjonstrinn). Med anvendelse av et heterogent forbehandlingsreagens er det fjerning av utfelte analytt-bindende proteiner fra testprøven før man går videre til det neste trinnet til assayet.
"Kvalitetskontroll-reagenser" i sammenheng med immunoassayer og kit beskrevet heri, inkluderer, men er ikke begrenset til, kalibratorer, kontroller, og sensitivitetspaneler. En "kalibrator" eller "standard" blir typisk anvendt (f.eks., en eller flere, slik som et mangfold) for å fastsette kalibrerings (standard) kurver for interpolering av konsentrasjonen av en analytt, slik som et antistoff eller en analytt. Alternativt kan en enkelt kalibrator, som er nær en forutbestemt positiv/negativ cutoff, bli anvendt. Multippel kalibratorer (dvs., mer enn en kalibrator eller en varierende mengde av kalibrator(er)) kan bli anvendt i sammen for slik å omfatte et "sensitivitets panel."
"Risiko" refererer til muligheten eller sannsynligheten for ved en spesifikk hendelse skal skje enten nå eller ved et tidspunkt i fremtiden. "Risiko stratifisering" refererer til et sett av kjente kliniske
risikofaktorer som gjør ved en fagmann kan klassifisere pasienter inn i en lav, moderat, høy eller høyest risiko for å utvikle en spesifikk sykdom, forstyrrelse eller tilstand.
"Spesifikke" og "spesifisitet" i sammenheng med en interaksjon mellom medlemmer av et spesifikt bindende par (feks., et antigen (eller fragment derav) og et antistoff (eller antigen-reaktivt fragment derav)) refererer til den selektive reaktiviteten til interaksjonen. Frasen "spesifikt binder til" og analoge fraser refererer til evnen hos antistoffer (eller antigen-reaktive fragmenter derav) til å binde spesifikt til analytt (eller et fragment derav) og ikke binder spesifikt to andre enheter.
"Spesifikk bindende partner" er et medlem av et spesifikt bindende par. Et spesifikt bindende par omfatter to forskjellige molekyler, som spesifikt binder til hverandre gjennom kjemiske eller fysiske midler. Derfor, i tillegg til antigen og antistoff spesifikke bindende par i vanlig immunoassayer, kan andre spesifikke bindende par inkludere biotin og avidin (eller streptavidin), karbohydrater og lektiner, komplementære nukleotidsekvenser, effektor og reseptor molekyler, kofaktorer og enzymer, enzym-inhibitorer og enzymer, og lignende. Videre kan spesifikke bindende par inkludere medlemmer som er analoger av de originale spesifikke bindende medlemmer, for eksempel, en analytt-analog. Immunoreaktive spesifikke bindende medlemmer inkluderer antigener, antigen-fragmenter, og antistoffer, inkludert monoklonale og polyklonale antistoffer så vel som komplekser, fragmenter, og varianter (inkludert fragmenter av varianter) derav, enten isolert eller rekombinant produsert.
"Variant" som anvendt heri betyr et polypeptid som varierer fra et gitt polypeptid (f.eks., IL-18, BNP, NGAL eller HIV polypeptid eller anti-polypeptid antistoff) i aminosyresekvens ved addisjonen (f.eks., innsetting), sletting, eller konservativ substitusjon av aminosyrer, men som beholder den biologiske aktiviteten til det gitte polypeptidet (f.eks., en variant IL-18 kan konkurrere med anti-IL-18 antistoff for binding til IL-18). En konservativ substitusjon av en aminosyre, dvs., bytte ut en aminosyre med en forskjellig aminosyre med lignende egenskaper (f.eks., hydrofilitet og grad og fordeling av ladede regioner) er annerkjent i teknikken som typisk å involvere en mindre forandring. Disse mindre forandringene kan bli identifisert, delvis, ved å vurdere den hydropatiske indeksen til aminosyrer, som forstått i teknikken (se, f.eks., Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132
(1982)). Den hydropatiske indeksen til en aminosyre er basert på en vurdering av den hydrofobitet og ladning. Det er kjent i teknikken ved aminosyrer med lignende hydropatiske indekser kan bli substituert og fortsatt beholde proteinfunksjon. I et aspekt, er aminosyrer som har hydropatisk indeks på ± 2 substituerte. Hydrofiliteten til aminosyrer kan også bli anvendt for å vise substitusjoner som ville resultere i proteiner som beholder biologisk funksjon. En vurdering av hydrofiliteten til aminosyrer i sammenheng med et peptid tillater beregning av den største lokale gjennomsnitts-hydrofiliteten til det peptidet, et nyttig mål som har blitt rapportert å korrelere godt med antigenitet og immunogenitet (se, f.eks., U.S. Pat. Nr. 4,554,101, som er inkorporert heri ved referanse). Substitusjon av aminosyrer som har lignende hydrofilitetsverdier kan resultere i peptider som beholder biologisk aktivitet, for eksempel immunogenitet, som det er forstått i teknikken. I et aspekt blir substitusjoner utført med aminosyrer som har hydrofilitetsverdier innenfor ± 2 fra hverandre. Både hydrofobisitetsindeksen og hydrofilitetsverdien til aminosyrer er påvirket av den spesifikke sidekjeden til den aminosyren. I samsvar med den observasjonen er aminosyresubstitusjoner som er kompatible med biologisk funksjon forstått å være avhengig av den relative likheten av aminosyrene, og spesielt sidekjedene til de aminosyrene, som vist ved hydrofobisiteten, hydrofilitet, ladning, størrelse, og andre egenskaper. "Variant" kan også bli anvendt for å beskrive et polypeptid eller fragment derav som har blitt differensielt prosessert, slik som ved proteolyse, fosforylering, eller andre post-translasjonale modifikasjoner, men allikevel beholder dets biologiske aktivitet eller antigen reaktivitet, f.eks., evnen å binde til IL-18. Anvendelse av "variant" heri er ment å omfatte fragmenter av en variant medmindre på annen måte motsagt ved sammenhengen.
I. Generering av DVD-bindende protein
Oppfinnelsen angår bindende proteiner med to variable domener i stand til å binde et eller flere mål og fremstillingsmetoder for samme. I en utførelsesform omfatter det bindende proteinet et polypeptidkjede, hvori nevnte polypeptidkjede omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første variabelt domene, VD2 er et andre variabelt domene, C er et konstant domene, XI representerer en aminosyre eller et polypeptid, X2 representerer en Fc-region og n er 0 eller 1. Det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ved å bruke diverse teknikker. Oppfinnelsen tilveiebringer uttrykkingsvektorer, vertscelle og metoder for å generere det bindende proteinet.
A. Generering av monoklonale moderantistoffer
De variable domenene til det DVD-bindende proteinet kan bli oppnådd fra moderantistoffer, inkludert polyklonale og mAb'er i stand til å binde antigener av interesse. Disse antistoffer kan være naturlig forekommende eller kan bli fremstilt ved rekombinant teknologi.
MAb'er kan bli fremstilt ved å bruke et stort utvalg av teknikker kjent i teknikken inkludert anvendelsen av hybridoma, rekombinant, og fag-fremvisning teknologier, eller en kombinasjon derav. For eksempel kan mAb'er bli produsert ved å bruke hybridoma-teknikker inkludert de kjent i teknikken og lært, for eksempel, i Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., i: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (nevnte referanser inkorporert ved referanse i deres helhet). Uttrykket "monoklonale antistoff' som anvendt heri er ikke begrenset til antistoffer produsert gjennom hybridoma-teknologi. Uttrykket "monoklonale antistoff' refererer til et antistoff som er avledet fra en enkelt klone, inkludert enhver eukaryotisk, prokaryotisk, eller fag klone, og ikke metoden ved hvilken det er produsert. Hybridomas blir valgt, klonet og videre screenet for ønskelige karakteristikker, inkludert robust hybridoma vekst, høy antistoff-produksjon og ønskede antistoff-karakteristikker, som diskutert i Eksempel 1 under. Hybridomas kan bli dyrket og ekspandert in vivo i syngene dyr, i dyr som mangle et immunsystem, f.eks., nakne mus, eller i cellekultur in vitro. Metoder for seleksjon, kloning og ekspandere hybridomas er velkjent for de med vanlig ferdighet i teknikken. I en bestemt utførelsesform er hybridomene muse-hybridomer. I en annen utførelsesform blir hybridomene produsert i en ikke-human, ikke-mus art slik som rotter, sauer, griser, geiter, kuer eller hester. I en annen utførelsesform er hybridomene humane hybridomer, hvori et humant ikke-utsondrende myelom er fusjonert med en human celle som uttrykker et antistoff i stand til å binde et spesifikt antigen.
Rekombinante mAb'er er også fremstilt fra enkeltstående, isolerte lymfocytter ved å bruke en prosedyre referert til i teknikken som den foretrukne lymfocyttantistoff-metoden (SLAM), som beskrevet i U.S. Patentnr. 5,627,052, PCT-publikasjon WO 92/02551 og Babcock, J.S. et al. (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:7843-7848. I denne metoden, enkeltstående celler som utsondrer antistoffer av interesse,/^., blir lymfocytter avledet fra et immunisert dyr identifisert, og tung- og lettkjede variabel region cDNA'er blir reddet fra cellene ved revers transkriptase-PCR og disse variable regionene kan deretter bli uttrykt, i sammenheng med passende immunoglobulin-konstantregioner ( f. eks., humane konstantregioner), i mammaliske vertsceller, slik som COS eller CHO-celler. Vertscellene transfektert med de amplifiserte immunoglobulin-sekvensene, avledet fra in vivo valgt lymfocytter, kan deretter undergå videre analyse og seleksjon in vitro, for eksempel ved å panorere de transfekterte cellene for å isolere celler som uttrykker antistoffer til antigenet av interesse. De amplifiserte immunoglobulin-sekvensene kan videre bli manipulert in vitro, slik som ved in vitro affinitetsmodning metoder slik som de beskrevet i PCT-publikasjon WO 97/29131 og PCT-publikasjon WO 00/56772.
Monoklonale antistoffer er også produsert ved å immunisere et ikke-humant dyr omfattende noen, eller alle, av de humane immunoglobulin lokus med et antigen av interesse. I en utførelsesform er de ikke-humane dyret en XENOMOUSE transgen mus, en konstruert musetype som omfatter store fragmenter av det humane immunoglobulin loki og er mangelfull i mus antistoff-produksjon. Se, f. eks., Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) og United States Patent Nr. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 og 6,130,364. Se også WO 91/10741, publisert juli 25,1991, WO 94/02602, publisert februar 3, 1994, WO 96/34096 og WO 96/33735, begge publisert oktober 31,1996, WO 98/16654, publisert april 23,1998, WO 98/24893, publisert juni 11, 1998, WO 98/50433, publisert november 12, 1998, WO 99/45031, publisert september 10, 1999, WO 99/53049, publisert oktober 21, 1999, WO 00 09560, publisert februar 24, 2000 og WO 00/037504, publisert juni 29, 2000. Den transgene musen XENOMOUSE produserer et voksen-liknende humant repertoar av helt humane antistoffer, og genererer antigen-spesifikke humane monoklonale antistoffer. Den transgene musen XENOMOUSE inneholder omtrent 80% av det humane antistoff repertoaret gjennom introdusering av megabase størrelse, kjønnscellelinje-konfigurasjon YAC fragmenter av det humane tungkjede loki og x lettkjede loki. Se Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green og Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), beskrivelsens of som er herved inkorporert ved referanse.
In vitro metoder kan også bli anvendt for å lage moder-antistoffene, hvori et antistoff-bibliotek blir screenet for å identifisere et antistoff som har den ønskede bindingsspesifisiteten. Metoder for slik screening av rekombinant antistoff-biblioteker er velkjent i teknikken og inkluderer metoder beskrevet i, for eksempel, Ladner et al. U.S. Patentnr. 5,223,409; Kang et al. PCT Publikasjonsnr. WO
92/18619; Dower et al. PCT Publikasjonsnr. WO 91/17271; Winter et al. PCT Publikasjonsnr. WO 92/20791; Markland et al. PCT Publikasjonsnr. WO 92/15679; Breitling et al. PCT Publikasjonsnr. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT Publikasjonsnr. WO 92/01047; Garrard et al. PCT Publikasjonsnr. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/ Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum AntibodHybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) JMol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Natur 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/ Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) NucAcidRes 19:4133-4137; og Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, US patent søknad publikasjon 20030186374, og PCT Publikasjonsnr. WO 97/29131, innholdet av hver som er inkorporert heri ved referanse.
Moderantistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også bli fremstilt ved å bruke diverse fag-fremvisningsmetoder kjent i teknikken. I fag-fremvisningsmetoder blir funksjonelle antistoffdomener vist frem på overflaten av fag-partikler som bærer polynukleotid-sekvensene som koder for dem. Spesielt kan slike fag bli anvendt for å vise frem antigen-bindende domener uttrykt fra et repertoar eller kombinatorisk antistoff-bibliotek (f.eks., humant eller murint). Fag som uttrykker et antigen-bindende domene som binder antigenet av interesse kan bli valgt eller identifisert med antigen, f.eks., ved å bruke merket antigen eller antigen bundet eller fanget til en fast overflate eller kule. Fag anvendt i disse metoder er typisk filamentøse fag inkludert fd og M13-bindende domener uttrykt fra fag med Fab, Fv eller disulfid-stabiliserte Fv-antistoffdomener rekombinant fusjonert til enten fag-gen III eller gen VHI proteinet. Eksempler på fag-fremvisningsmetoder som kan bli anvendt for å lage antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer de fremvist i Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT Søknad Nr. PCT/GB91/01134; PCT-publikasjoner WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; og U.S. Pat. Nr. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 og 5,969,108; hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet.
Som beskrevet i referansene heri, etter fag seleksjon kan antistoff-kodingsregionene fra faget bli isolert og anvendt for å generere hele antistoffer inkludert humane antistoffer eller ethvert annet ønsket antigen-bindende fragment, og uttrykt i enHvis ønsket vert, inkludert mammaliske celler, insektceller, planteceller, gjær, og bakterier, f.eks., som beskrevet i detalj nedenfor. For eksempel kan teknikker for rekombinant å produsere Fab, Fab' og F(ab')2 fragmenter også bli anvendt ved å bruke metoder kjent i teknikken slik som de fremvist i PCT-publikasjon WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); og Sawai et al, AJRI 34:26-34 (1995); og Bedre et al., Science 240:1041-1043 (1988) (nevnte referanser inkorporert ved referanse i deres helhet). Eksempler på teknikker som kan bli anvendt for å produsere enkelt-kjede Fv'er og antistoffer inkluderer de beskrevet i U.S. Pat. 4,946,778 og 5,258, 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88
(1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); og Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
Alternativt til screening av rekombinante antistoff-bibliotek ved fag-fremvisning, kan andre fremgangsmåter kjent i teknikken for å screene store kombinatoriske bibliotek bli benyttet for identifiseringen av moderantistoffer. En type av alternativt uttrykkingssystem er et hvori det rekombinante antistoff-biblioteket blir uttrykt som RNA-protein fusjoner, som beskrevet i PCT Publikasjonsnr. WO 98/31700 av Szostak og Roberts, og i Roberts, R. W. og Szostak, J.W. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:12297-12302. I dette systemet blir en kovalent fusjon lagd mellom et mRNA og peptidet eller proteinet som det koder for ved in vitro oversetting av syntetiske mRNA'er som bærer puromycin, et peptidyl-akseptor antibiotika, ved deres 3'-ende. Følgelig kan et spesifikt mRNA bli anriket fra en kompleks blanding av mRNA'er ( f. eks., et kombinatorisk bibliotek) basert på egenskapene til det kodede peptidet eller proteinet,/^., antistoff, eller porsjon derav, slik som binding av antistoffet, eller porsjon derav, til det dobbelt spesifikke antigenet. Nukleinsyresekvenser som koder for antistoffer, eller porsjoner derav, gj enn vunnet fra screening av slike bibliotek kan bli uttrykt ved rekombinante midler som beskrevet heri ( f. eks., i mammaliske vertsceller) og, videre, kan bli utsatt for videre affinitetsmodning enten ved ytterligere runder med screening av mRNA-peptid fusjoner hvori mutasjoner har blitt introdusert inn i den/de opprinnelig(e) valgt(e) sekvensen(e), eller ved andre metoder for affinitetsmodning in vitro av rekombinante antistoffer, som beskrevet heri.
I en annen tilnærming kan moder-antistoffene også bli fremstilt ved å bruke gjær-fremvisningsmetoder kjent i teknikken. I gjær-fremvisningsmetoder blir genetiske metoder anvendt for å feste antistoffdomener til gjærcelleveggen og viser dem frem på overflaten av gjær. Spesielt kan slike gjær bli anvendt for å vise frem antigen-bindende domener uttrykt fra et repertoar eller kombinatorisk antistoff-bibliotek (f.eks., humant eller murint). Eksempler på gjær-fremvisningsmetoder som kan bli anvendt for å lage moder-antistoffene inkluderer de fremvist i Wittrup, et al. U.S. Patentnr. 6,699,658 inkorporert heri ved referanse.
Antistoffene beskrevet heri kan videre bli modifisert for å generere CDR-podete og humaniserte moderantistoffer. CDR-podete moderantistoffer omfatter tung- og lettkjede variabel region sekvenser fra et humant antistoff hvori en eller flere av CDR-regionene til Vh og/eller Vler byttet ut med CDR-sekvenser fra murine antistoffer i stand til å binde antigen av interesse. En rammeverk-sekvens fra ethvert humant antistoff kan virke som templatet for CDR-poding. Imidlertid fører ofte vanlig kjedeutbytting på et slikt rammeverk til noe tap av bindingsaffinitet ovenfor antigenet. Desto mer homologt et humant antistoffer til det originale murine antistoffet, desto mindre sannsynlig er muligheten for ved å kombinere de murine CDR'ene med det humane rammeverket vil introdusere forvrengninger i CDR'ene som kan redusere affinitet. Derfor, i en utførelsesform, har det humane variable rammeverket som blir valg for å erstatte det murine variable rammeverket bortsett fra CDR'ene minst en 65% sekvensidentitet med det murine antistoff variabel-region rammeverket. I en utførelsesform, har de humane og murine variable regionene bortsett fra CDR'ene minst 70% sekvensidentitet. I en bestemt utførelsesform, har de humane og murine variable regionene bortsett fra CDR'ene minst 75% sekvensidentitet. I en annen utførelsesform, har de humane og murine variable regionene bortsett fra CDR'ene minst 80% sekvensidentitet. Metoder for å produsere slike antistoffer er kjent i teknikken ( se EP 239,400; PCT-publikasjon WO 91/09967; U.S. Pat. Nr. 5,225,539; 5,530,101; og 5,585,089), veneering eller resurfacing (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), og chain shuffling (U.S. Pat. Nr. 5,565,352); og anti-idiotypiske antistoffer.
Humaniserte antistoffer er antistoff-molekyler fra ikke-humane arter antistoff som binder det ønskede antigenet som har en eller flere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) fra den ikke-humane arten og rammeverk-regioner fra et humant immunoglobulin molekyl. Kjente humane Ig-sekvenser er vist, f.eks., www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/fag/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/forskning tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/DET/DET.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05 .htm; www.library.thinkquest.org/12429/Irnmun/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathboks.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antistoff/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/tabell.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocoll.html; www.isac-net.org/seter_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mouse.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/SlideOl .html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nirnr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/struktur/stat_aim.html; www.biosci.missourdvs.du/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat-et al., Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. Health (1983), hver i sin helhet inkorporert heri ved referanse. Slike importerte sekvenser kan bli anvendt for å redusere immunogenitet eller redusere, forbedre eller modifisere binding, affinitet, på-hastighet, av-hastighet, aviditet, spesifisitet, halveringstid, eller enhver annen passende karakteristikk, som kjent i teknikken.
Rammeverk-residuer i de humane rammeverk-regionene kan bli substituert med det korresponderende residuet fra CDR-donorantistoffet for å forandre, f.eks., forbedre antigen-binding. Disse rammeverk-substitusjonene blir identifisert ved metoder velkjent i teknikken, f.eks., ved modellering av interaksjonene til CDR og rammeverk-residuene for å identifisere rammeverk-residuer viktig for antigen-binding og sekvens-sammenligning for å identifisere uvanlig rammeverk-residuer ved spesifikke posisjoner. (Se, f.eks., Queen et al., U.S. Pat. Nr. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), som er inkorporert heri ved referanse i deres helhet.) Tredimensjonale immunoglobulin modeller er vanligvis tilgjengelig og er kjent for fagmannen. Dataprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og viser sannsynlig tredimensjonale konformasjonsstrukturer av valgte kandidater av immunoglobulinsekvenser. Gransking av disse bildene tillater analyse av den sannsynlige rollen til residuene i virkningen til immunoglobulinsekvens-kandidaten, dvs., analysen av residuer som påvirker evnen til immunoglobulin-kandidaten å binde til dets antigen. På denne måten kan FR-residuer bli valgt og kombinert fra konsensus- og importsekvensene slik ved den ønskede antistoff-karakteristikken, slik som økt affinitet for mål-antigenet(ene), er oppnådd. Generelt er CDR-residuene direkte og mest hovedsaklig involvert i å påvirke antigen-binding. Antistoffer kan bli humanisert ved å bruke en rekke teknikker kjent i teknikken, slik som men ikke begrenset til de beskrevet i Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al, Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chotia og Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); PCT-publikasjon WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, U.S. Pat. Nr. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, hver i sin helhet inkorporert heri ved referanse, inkludert referanser sitert deri.
B. Kriterier for å velge monoklonale moderantistoffer
En utførelsesform ifølge oppfinnelsen angår å velge moderantistoffer med minst en eller flere egenskaper ønsket i DVD-Ig-molekylet. I en utførelsesform er den ønskede egenskapen valgt fra en eller flere antistoff-parametre. I en annen utførelsesform er antistoff-parametrene valgt fra gruppen bestående av antigen spesifisitet, affinitet ovenfor antigen, styrke, biologisk funksjon, epitop-gjenkjenning, stabillitet, løselighet, produksjonseffektivitet, immunogenitet, farmakokinetikk, biotilgjengelighet, kryssreaktivitet for vev, og ortolog antigen-binding.
Bl. Affinitet ovenfor antigen
Den ønskede affiniteten til en terapeutisk mAb kan være avhengig av egenskapene til antigenet, og det ønskede terapeutiske endepunkt. I en utførelsesform har monoklonale antistoffer høyere affiniteter (Kd = 0.01 - 0.50 pM) når de blokkerer en cytokin-cytokin reseptor-interaksjon da en slik interaksjon vanligvis er høy-affinitets interaksjoner (f.eks.,<pM - <nM ranges). I slike tilfeller bør affiniteten til mAb'et for dets mål være lik eller bedre enn affiniteten til cytokinet (ligand) for dets reseptor. På den annen side, mAb med mindre affinitet (> nM område) kan være terapeutisk effektive f.eks.,i klarering av sirkulerende potensielt patogene proteiner f.eks.,monoklonale antistoffer som binder til, fanger opp, og klarerer sirkulerende typer av A-p amyloid. I andre tilfeller, ved å redusere affiniteten til et eksisterende høy-affinitets mAb ved sete-styrt mutagenese eller ved å bruke et mAb med lavere affinitet for dets mål kunne bli anvendt for å unngå potensielle bivirkninger f.eks., kan et høy-affinitets mAb isolere/nøytralisere alle av dets tiltenkte mål, for dermed helt å tømmme/eliminere funksjonen(e) til det tilsiktede proteinet. I dette tilfellet kan et lav-affinitets mAb isolere/nøytralisere en del av målet som kan være ansvarlig for sykdomssymptomene (de patologiske eller overproduserte nivåer), og følgelig tillate en del av målet å fortsette å utføre dets normale fysiologiske funksjon(er). Det kan derfor være mulig å redusere Kd'en for å justere dose og/eller redusere bivirkninger. Affiniteten til moder-mAb'et kan spille en rolle for å målrette celleoverflate-molekyler på en passende måte for å oppnå ønsket terapeutisk resultat. For eksempel, hvis et mål er uttrykt på kreftceller med høy tetthet og på normale celler med lav tetthet, et lavere affinitets mAb vil binde et større antall av mål på tumorceller enn normale celler, resulterende i tumorcelle-eliminering via ADCC eller CDC, og kan derfor ha terapeutisk ønskelige virkninger. Følgelig kan det å velge et mAb med ønsket affinitet være relevant for både løselig og overflate mål.
Signalisering gjennom en reseptor ved interaksjon med dets ligand kan være avhengig av affiniteten til reseptor-ligand interaksjonen. Tilsvarende er det mulig å tenke seg ved affiniteten til et mAb for en overflatereseptor kunne bestemme egenskapene til intracellulær signalisering og enten kan mAb'et levere et agonist eller antagonist signal. Den affinitetsbaserte egenskapen til mAb-mediert signalisering kan ha en innvirkning på dets bivirkningsprofil. Derfor må den ønskede affiniteten og de ønskede funksjonene til terapeutisk monoklonale antistoffer være bestemt nøye ved in vitro og in vivo eksperimentering.
Den ønskede Kd'en til et bindende protein (f.eks., et antistoff) kan bli bestemt eksperimentelt avhengig av det ønskede terapeutiske resultat. I en utførelsesform blir moderantistoffer med affinitet (Kd) for et bestemt antigen lik, eller bedre enn, den ønskede affiniteten til DVD-Ig'et for det samme antigenet valgt. Den antigen-bindende affiniteten og kinetikk blir vurdert ved Biacore eller en annen lignende teknikk. I en utførelsesform har hvert moderantistoff en dissosieringskonstant (Kd) til dets antigen valgt fra gruppen bestående av: på det meste omtrent IO"<7>M; på det meste omtrent IO"<8>M; på det meste omtrent IO"<9>M; på det meste omtrent IO"<10>M; på det meste omtrent IO"<11>M; på det meste omtrent IO"12M; og på det meste IO"<13>M. Det første moderantistoffet fra hvilket VD1 blir oppnådd og det andre moderantistoffet fra hvilket VD2 blir oppnådd kan ha lignende eller forskjellig affinitet (KD) for det respektive antigen. Hvert moderantistoff har en på-hastighetskonstant (Kon) til antigenet valgt fra gruppen bestående av: minst omtrent 10<2>M"<1>s"<1>; minst omtrent 10<3>M"<1>s"<1>; minst omtrent lO^ V1; minst omtrent 10<5>M"<1>s"<1>; og minst omtrent 10<6>M"<1>s"<1>, som målt ved overflate-plasmonresonans. Det første moder-antistoffet fra hvilket VD1 blir oppnådd og det andre moder-antistoffet fra hvilket VD2 blir oppnådd kan ha lignende eller forskjellig på-hastighetskonstant (Kon) for det respektive antigen. I en utførelsesform har hvert moderantistoff en av-hastighetskonstant (Koff) til antigenet valgt fra gruppen bestående av: på det meste omtrent lOV<1>; på det meste omtrent lO^s"<1>; på det meste omtrent lOV1; og på det meste omtrent lOV<1>, som målt ved overflate-plasmonresonans. Det første moder-antistoffet fra hvilket VD1 blir oppnådd og det andre moder-antistoffet fra hvilket VD2 blir oppnådd kan ha lignende eller forskjellig av-hastighetskonstanter (Koff) for det respektive antigen.
B2. Styrke
Den ønskede affiniteten/styrken til monoklonale moderantistoffer vil være avhengig av det ønskede terapeutiske resultat. For eksempel, for reseptor-ligand (R-L) interaksjoner er affiniteten (kd) lik eller bedre enn R-L kd'en (pM området). For enkel klarering av et patologisk sirkulerende protein kan Kd'en være i lav nM område f.eks.,klarering av forskjellige typer av sirkulerende A-p peptid. I tillegg vil Kd'en også være avhengig av om målet uttrykker flere kopier av den samme epitopen f.eks. en mAb-målrettet konformasjons-epitop i Ap oligomere.
Hvor VDI og VD2 binder det samme antigenet, men distinkte epitoper, vil DVD-Ig'et inneholde 4-bindende seter for det samme antigenet, og følgelig øke aviditeten og dermed den tilsynelatende kd'en til DVD-Ig'et. I en utførelsesform blir moderantistoffer med lik eller lavere kd enn den ønsket i DVD-Ig'et valgt. Affinitetsvurderingene for et moder-mAb kan også være avhengig av om DVD-Ig'et inneholder fire eller flere identiske antigen-bindende seter (dvs.; et DVD-Ig fra en enkelt mAb). I dette tilfellet ville den tilsynelatende kd være større enn mAb'et på grunn av aviditet. Slike DVD-Ig'er kan bli anvendt for å kryssbinde overflatereseptorer, øke nøytraliseringsstyrke, forbedre klarering av patologisk proteiner osv.
I en utførelsesform blir moderantistoffer med nøytraliseringsstyrke for spesifikke antigen lik eller bedre enn det ønskede nøytraliseringspotensialet til DVD-Ig'et for det samme antigenet valgt. Nøytraliseringsstyrken kan bli vurdert ved et mål-avhengig bioassay hvor celler av passende type produserer et målbart signal (dvs. proliferering eller cytokin-produksjon) som reaksjon på mål-stimulering, og mål-nøytralisering ved hjelp av mAb'et kan redusere signalet på en dose-avhengig måte.
B3. Biologiske funksjoner
Monoklonale antistoffer kan potensielt utføre flere funksjoner. Noen av disse funksjonene er opplistet i Tabell 1. Disse funksjonene kan bli vurdert ved både in vitro assayer (f.eks., celle-baserte og biokjemiske assayer) og in vivo dyremodeller.
MAb'er med distinkte funksjoner beskrevet i eksemplene heri i Tabell 1 kan bli valgt for å oppnå ønsket terapeutisk resultat. To eller flere valgte monoklonale moderantistoffer kan deretter bli anvendt i DVD-Ig format for å oppnå to distinkte funksjoner i et enkelt DVD-Ig-molekyl. For eksempel kan et DVD-Ig bli fremstilt ved å velge et moder-mAb som nøytraliserer funksjonen til et bestemt cytokin, og å velge et moder-mAb som forbedrer klarering av et patologisk protein. Tilsvarende kan vi velge to monoklonale moderantistoffer som gjenkjenner to forskjellige celleoverflate-reseptorer, en mAb med en agonist-funksjon på en reseptor og det andre mAb'et med en antagonist-funksjon på en forskjellig reseptor. Disse to valgte monoklonale antistoffene hver med en distinkt funksjon kan bli anvendt for å konstruere et enkelt DVD-Ig-molekyl som vil inneha de to distinkte funksjonene (agonist og antagonist) til de valgte monoklonale antistoffene i et enkelt molekyl. Tilsvarende kan to antagonistiske monoklonale antistoffer til celleoverflate reseptorer hver blokkerer binding av respektive reseptorligander (f.eks.,EGF og IGF) bli anvendt i et DVD-Ig format. Motsatt kan et antagonistisk anti-reseptor mAb (f.eks.,anti-EGFR) og et nøytraliserende anti-løselig mediator (f.eks.,anti-IGFl/2) mAb bli valgt for å lage et DVD-Ig.
B4. Epitop-gjenkjenning:
Forskjellige regioner i proteiner kan utføre forskjellige funksjoner. For eksempel interagerer spesifikke regioner i et cytokin med cytokin-reseptoren for å oppnå reseptor aktivering mens andre regioner i proteinet kan være nødvendig for å stabilisere cytokinet. I dette tilfellet kan man velge et mAb som binder spesifikt til reseptorens interagerende region(er) på cytokinet og dermed blokkerer cytokin-reseptor-interaksjon. I noen tilfeller, for eksempel visse kjemokinreseptorer som binder flere ligander, kan et mAb som binder til epitopen (region på kjemokinreseptor) som interagerer med bare en ligand bli valgt. I andre tilfeller kan monoklonale antistoffer binde til epitoper på et mål som ikke er direkte ansvarlig for de fysiologiske funksjonene til proteinet, men binding av et mAb til disse regionene kan enten interferere med fysiologiske funksjoner (sterisk hindring) eller forandre konformasjonen til proteinet slik ved proteinet ikke kan fungere (mAb til reseptorer med flere ligander som forandrer reseptorkonformasjonen slik ved ingen av ligandene kan binde). Anti-cytokin monoklonale antistoffer som ikke blokkerer binding av cytokinet til dets reseptor, men blokkerer signaltransduksjoner har også blitt identifisert (f.eks., 125-2H, et anti-IL-18 mAb).
Eksempler på epitoper og mAb-funksjoner inkluderer, men er ikke begrenset til, blokkering av Reseptor-Ligand (R-L) interaksjon (nøytraliserende mAb som binder R-interagerende sete); sterisk hindring resulterende i svekket eller ingen R-binding. Et Ab kan binde målet ved et sete annet enn et reseptor-bindende sete, men fortsatt interferere med reseptor-binding og funksjoner til målet ved å indusere konformasjonsforandring og eliminere funksjon (f.eks., Xolair), binding til R men blokkere signalisering (125-2H).
I en utførelsesform må moder-mAb'et rettes mot den passende epitopen for maksimal effekt. Slike epitoper bør være konservert i DVD-Ig'et. Den bindende epitopen til et mAb kan bli bestemt ved flere metoder, inkludert ko-krystalllografi, begrenset proteolyse av mAb-antigen kompleks pluss massespektrometriskpeptidkartlegging (Legros V. et al 2000 Protein Sei. 9:1002-10), fag-fremvist peptid bibliotek (0'Connor KH et al 2005 J Immunol Methods. 299:21-35), så vel som mutagenese (Wu C. et al. 2003 J Immunol 170:5571-7).
B5. Fysikokjemiske og farmasøytiske egenskaper:
Terapeutisk behandling med antistoffer krever ofte administrasjon av høye doser, ofte flere mg/kg (på grunn av en lav styrke basert på masse som en konsekvens av en typisk høy molekylvekt). For å ta hensyn til pasient-etterfølgelse og for å addressere på en tilstrekkelig måte terapier for kroniske sykdommer og behandling av pasienter utenfor sykehuset, er subkutan (s.c.) eller intramuskulær (i.m.) administrasjon av terapeutiske mAb'er ønskelig. For eksempel, det ønskede maksimale volumet for s.c. administrasjon er -1.0 mL, og derfor er konsentrasjoner på >100 mg/mL ønskelig for å begrense antallet injiseringer per dose. I en utførelsesform blir det terapeutiske antistoffet administrert i en dose. Utviklingen av slike formuleringer er imidlertid begrenset av protein-protein interaksjoner (f.eks., aggregering, som potensielt øker risiko for immunogenitet) og av begrensninger i løpet av prosessering og levering (f.eks., viskositet). Følgelig, de store mengdene nødvendig for klinisk effekt og de assosierte utviklingsbegrensningene begrenser full utnytting av potensialet til antistoff-formulering og s.c. administrasjon i høy-dose-regimer. Det er åpenbart ved de fysikokjemiske og farmasøytiske egenskapene til et proteinmolekyl og proteinløsningen er av største viktighet, f.eks.,stabillitet, løselighet og viskositetsegenskaper.
B5.1. StabiUitet:
En "stabil" antistoff-formulering er en hvori antistoffet deri hovedsaklig beholder dets fysiske stabillitet og/eller kjemisk stabillitet og/eller biologisk aktivitet ved lagring. StabiUitet kan bli målt ved en valgt temperatur i en valgt tidsperiode. I en utførelsesform er antistoffet i formuleringen stabilt ved romtemperatur (omtrent 30°C) eller ved 40°C i minst 1 måned og/eller stabilt ved omtrent 2-8°C. i minst 1 år i minst 2 år. Videre, i en utførelsesform, er formuleringen stabil etter nedfrysing (to, f.eks., -70°C) og opptining av formuleringen, herietter referert til som en "fryse/tine syklus." I et annet eksempel kan en "stabil" formulering være en hvori mindre enn omtrent 10% og mindre enn omtrent 5% av proteinet er tilstede som et aggregat i formuleringen.
En DVD-Ig stabil in vitro ved forskjellige temperaturer i en forlenget tidsperiode er ønskelig. Man kan oppnå dette ved rask screening av moder-mAb'er stabile in vitro ved forhøyet temperatur, f.eks., ved 40°C i 2-4 uker, og deretter vurdere stabillitet. I løpet av lagring ved 2-8°C, viser proteinet stabillitet i minst 12 måneder, f.eks., minst 24 måneder. Stabillitet (% av monomert, intakt molekyl) kan bli vurdert ved å bruke diverse teknikker slik som kationeutbyttingskromatografi, størrelseseksklusjons-kromatografi, SDS-PAGE, så vel som bioaktivitetstesting. For en mer utfyllende liste med analytisk teknikker som kan bli anvendt for å analysere kovalente og konformelle modifikasjoner se Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the vurdering av protein formulations and delivery systems. I: Cleland, J. L.; Langer, R., editors. Formulation and delivery of peptides and proteins, lst edition, Washington, ACS, pg. 22-45; og Pearlman, R.; Nguyen, T. H.(1990) Analyzes of protein drugs. I: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, Ist edition, Ny York, Marcel Dekker, Inc., pg. 247-301.
Heterogenitet og aggregatdannelse: stabilliteten til antistoffet kan være slik ved formuleringen kan vise mindre enn omtrent 10%, og, i en utførelsesform, mindre enn omtrent 5%, i en annen utførelsesform, mindre enn omtrent 2%, eller, i en utførelsesform, innenfor området av 0.5% til 1.5% eller mindre i GMP-antistoffmaterialet som er tilstede som aggregat. Størrelseseksklusjons- kromatografi er en metode som er følsom, reproduserbar, og veldig robust i deteksjonen av proteinaggregater.
I tillegg til lave aggregatenivåer, må antistoffet, i en utførelsesform, være kjemisk stabilt. Kjemisk stabillitet kan bli bestemt ved ioneutbyttingskromatografi (f.eks.,kation eller anioneutbyttingskromatografi), hydrofob-interaksjonerkromatografi, eller andre metoder slik som isoelektrisk fokusering eller kapillær elektroforese. For eksempel kan den kjemiske stabilliteten til antistoffet være slik ved etter lagring i minst 12 måneder ved 2-8°C kan ikke toppen som representerer ikke-modifisert antistoff i et kationeutbyttingskromatografi øke mer enn 20%, i en utførelsesform, ikke mer enn 10%, eller, i en annen utførelsesform, ikke mer enn 5% sammenlignet med antistoffløsningen før lagringstesting.
I en utførelsesform viser moder-antistoffene strukturell integritet; riktig disulfid-bindingsdannelse, og riktig folding: Kjemisk ustabilitet på grunn av forandringer i sekundær eller tertiær struktur til et antistoff kan påvirke antistoff-aktivitet. For eksempel kan stabillitet som indikert ved aktivitet til antistoffet være slik ved etter lagring i minst 12 måneder ved 2-8°C kan aktiviteten til antistoffet minske ikke mer enn 50%, i en utførelsesform ikke mer enn 30%, eller til og med ikke mer enn 10%, eller i en utførelsesform ikke mer enn 5% eller 1% sammenlignet med antistoffløsningen før lagringstesting. Passende antigen-binding assayer kan bli anvendt for å bestemme antistoff-aktivitet.
B5.2. Løselighet:
"Løseligheten" av et mAb korrelerer med produksjonen av riktig foldet, monomert IgG. Løseligheten av IgG'et kan derfor bli vurdert ved HPLC. For eksempel vil løselig (monomert) IgG gi opphav til en enkelt topp på HPLC-kromatografen, mens uløselig (f.eks., multimert og aggregert) vil gi opphav til et mangfold av topper. En fagmann vil derfor være i stand til å detektere en økning eller nedgang i løselighet av et IgG ved å bruke rutinemessige HPLC-teknikker. For en mer utfyllende liste med analytisk teknikker som kan bli anvendt for å analysere løselighet (se Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. Editor(s): Shamlou, P. Ayazi. Process. Fast-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann, Oksford, UK og Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301). Løseligheten til et terapeutisk mAb er kritisk for formulering til høy konsentrasjon ofte nødvendig for tilstrekkelig dosering. Som skissert heri, kan løseligheter på > 100 mg/mL være nødvendig for å imøtekomme effektiv antistoff-dosering. For eksempel kan ikke antistoff-løselighet være mindre enn omtrent 5 mg/mL i tidlig forskningsfase, i en utførelsesform ikke mindre enn omtrent 25 mg/mL i senere trinn i prosessteknikk, eller i en utførelsesform ikke mindre enn omtrent 100 mg/mL, eller i en utførelsesform ikke mindre enn omtrent 150 mg/mL. Det er åpenbart for en fagmann ved de iboende egenskapene til et proteinmolekyl er viktig for de fysiko-kjemiske egenskapene til proteinløsningen, f.eks.,stabillitet, løselighet, viskositet. Imidlertid vil en fagmann sette pris på ved en stor mengde med eksipienter eksisterer som kan bli anvendt som tilsetningsstoffer for fordelaktig å påvirke karakteristikkene til den endelige proteinformuleringen. Disse eksipienter kan inkludere: (i) væskeløsemidler, koløsemidler (f.eks.,alkoholer slik som etanol); (ii) buffermidler (f.eks.,fosfat, acetat, sitrat, aminosyre buffere); (iii) sukkere eller sukker-alkoholer (f.eks.,sukrose, trehalose, fruktose, raffinose, mannitol, sorbitol, dekstraner); (iv) surfaktanter (f.eks.,polysorbat 20, 40, 60, 80, poloksamere); (v) isotonisitet modifikatorer (f.eks.,salter slik som NaCl, sukkere, sukker-alkoholer); og (vi) andre (f.eks.,konserveringsmidler, kelateringsmidler, antioksidanter, kelaterende stoffer (f.eks.,EDTA), bio-nedbrytbare polymerer, bæremolekyler (f.eks.,HSA, PEGs)
Viskositet er en parameter av høy viktighet med hensyn til antistoff-fremstilling og antistoff-prosessering (f.eks.,diafiltrering/ultrafiltrering), fyllingsavslutning prosesser (pumpeaspekter, filtreringsaspekter) og leveringsaspekter (sprøyteevne, avansert anordningslevering). Lave viskositeter muliggjør væskeløsning av antistoffet som har en høyere konsentrasjon. Dette muliggjør ved den samme dosen kan bli administrert i mindre volumer. Små injiseringsvolumer innehar fordelen av lavere smerte ved injiseringsfølelser, og løsningene trenger ikke nødvendigvis å være isotoniske for å redusere smerte ved injisering i pasienten. Viskositeten til antistoffløsningen kan være slik ved ved skjærhastigheter på 100 (l/s) er antistoffløsningsviskositet under 200 mPa s, i en utførelsesform under 125 mPa s, i en annen utførelsesform under 70 mPa s, og i nok en annen utførelsesform under 25 mPa s eller til og med under 10 mPa s.
B 5.3. Produksjonseffektivitet
Generering av et DVD-Ig som effektivt blir uttrykt i mammaliske celler, slik som Egglederceller fra kinesiske hamstre (CHO), vil i en utførelsesform trenge to monoklonale moderantistoffer som selv er uttrykt effektivt i mammaliske celler. Produksjonsutbyttet fra en stabil mammalisk linje (dvs., CHO) bør være over omtrent 0.5g/L, i en utførelsesform over omtrent lg/L, og i en annen utførelsesform i området av omtrent 2-5 g/L eller mer (Kipriyanov SM, Little M. 1999 Mol Biotechnol. 12:173-201; Carroll S, Al-Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther. 4:1821-9).
Produksjon av antistoffer og lg fusjonsproteiner i mammaliske celler er påvirket av flere faktorer. Konstruksjon av uttrykkingsvektoren via inkorporering av sterke promotorer, forsterkere og seleksjonsmarkører kan maksimere transkripsjon av genet av interesse fra en integrert vektorkopi. Identifiseringen av vektorintegrerings-seter som tillater høye nivåer av gentranskripsjon kan forsterke proteinuttrykking fra en vektor (Wurm et al, 2004, Nature Biotechnology, 2004, Vol/Iss/Pg. 22/11 (1393-1398)). Videre er produksjonsnivåer påvirket av forholdet mellom antistoff tung og lettkjeder og diverse trinn i proteinsammenstillingsprosessen og utsondring (Jiang et al. 2006, Biotechnology Progress, Jan-Feb 2006, vol. 22, no. 1, p. 313-8).
B 6. Immunogenitet
Administrasjon av en terapeutisk mAb kan resultere i visse tilfeller av en immunrespons (dvs., dannelsen av endogene antistoffer rettet mot det terapeutiske mAb). Potensielle elementer som kan indusere immunogenitet bør bli analysert i løpet av seleksjon av de monoklonale moderantistoffene, og trinn for å redusere slike risiko kan bli tatt for å optimalisere de monoklonale moderantistoffene før DVD-Ig-konstruksjon. Mus-avledede antistoffer har blitt funnet å være i høy grad immunogene i pasienter. Generering av kimeriske antistoffer omfattet av mus variable og humane konstantregioner presenterer et logisk neste trinn for å redusere immunogeniteten til terapeutiske antistoffer (Morrison og Schlom, 1990). Alternativt kan immunogenitet bli redusert ved å overføre murine CDR-sekvenser inn i et humant antistoff-rammeverk (reforming/CDR-poding/humanisering), som beskrevet for et terapeutisk antistoff av Riechmann et al., 1988. En annen metode er referert til som "resurfacing" eller "veneering", starter med de variable lette og tunge domenene fra gnager, bare overflate-tilgjengelige rammeverk-aminosyrer blir forandret til humane, mens CDR'en og begravde aminosyrer forblir fra moderantistoffet fra gnager (Roguska et al., 1996). I en annen type av humanisering, i stedet for å pode hele CDR'ene, poder en teknikk bare de "spesifisitetsbestemmende regionene" (SDR'er), definert som den undergruppen av CDR-residuer som er involvert i binding av antistoffet til dets mål (Kashmiri et al., 2005). Dette nødvendiggjør identifisering av SDR'ene enten gjennom analyse av tilgjengelig tredimensjonale strukturer av antistoff-mål komplekser eller mutasjonsanalyse av antistoff-CDR-residuene for å bestemme hvilke som interagerer med målet. Alternativt kan helt humane antistoffer ha redusert immunogenitet sammenlignet med murine, kimeriske eller humaniserte antistoffer.
En annen tilnærming for å redusere immunogeniteten til terapeutiske antistoffer er elimineringen av visse spesifikke sekvenser som er forutsagt å være immunogene. I en fremgangsmåte, etter ved et første-generasjons biologika har blitt utprøvd i mennesker og funnet å være uakseptabelt immunogent, kan B-celle epitopene bli kartlagt og deretter forandret for å unngå immundeteksjon. En annen tilnærming bruker metoder for å forutsi og fjerne potensielle T-celle epitoper. Beregningsmetoder har blitt utviklet for å skanne og å identifisere peptidsekvensene til biologiske terapeutika med potensialet for å binde til MHC-proteiner (Desmet et al., 2005). Alternativt kan en metode basert på humane dendritiske celler bli anvendt for å identifisere CD4<+>T-celle epitoper i potensielle proteinallergener (Stickler et al., 2005; S.L. Morrison og J. Schlom, Important Adv. Oncol. (1990), pp. 3-18; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. og Winter, G. " Reforming humane antistoffer for terapi." Nature (1988) 332: 323-327; Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Blåttler- W- A, Rees- A- R, Guild- B- C. en sammenligning of to murine mAb'er humanisert ved CDR-grafting og variabelt domene resurfacing.Protein engineering, {Protein-Eng}, 1996, vol. 9, p. 895-904; Kashmiri-Syed-V-S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom-Jeffrey. SDR grafting~a ny tilnærming to antistoff humanisering. Metoder (San Diego Calif), {Metoder}, Kan 2005, vol. 36, no. 1, p. 25-34; Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq-Krista, Debulpaep-Maja, Braeckman-Tessa, Lasters-Ignace. Anchor profiler of HLA-spesifikke peptider: analyse ved en ny affinitet scoring metode og eksperimentell validering. Proteiner, 2005, vol. 58, p. 53-69; Stickler-M-M, Estell- D- A, Harding- F- A. CD4+ T-celle epitop bestemmelse ved å bruke unexposed human donor perifert blod mononukleære celler. Journal of immunotherapy 2000, vol. 23, p. 654-60.)
B 7. In vivo effekt
For å generere et DVD-Ig-molekyl med ønsket in vivo effekt, er det viktig å generere og velge mAb'er med tilsvarende ønsket in vivo effekt når gitt i kombinasjon. Imidlertid kan, i noen tilfeller DVD-Ig'et fremvise in vivo effekt som ikke kan bli oppnådd med kombinasjonen av to separate mAb'er. For eksempel kan et DVD-Ig bringe to mål nærme hverandre og medføre en aktivitet som ikke kan bli oppnådd med kombinasjonen av to separate mAb'er. Ytterligere ønskelige biologiske funksjoner er beskrevet heri i seksjon B 3. Moderantistoffer med karakteristikker ønskelig i DVD-Ig-molekylet kan bli valgt basert på faktorer slik som farmakokinetikk t lA; fordeling i vev; løselighet versus celleoverflate mål; og mål konsentrasjon- løselig/tetthet -overflate.
B 8. In vivo fordeling i vev
For å generere et DVD-Ig-molekyl med ønsket in vivo fordeling i vev må, i en utførelsesform, moder-mAb'er med lignende ønsket in vivo fordeling i vev profil være valgt. Alternativt, basert på mekanismen til strategien med dobbelt-spesifikk målretting, kan det andre ganger ikke være nødvendig å velge moder-mAb'er med den tilsvarende ønskede in vivo fordelingen i vev når gitt i kombinasjon. For eksempel, i tilfellet av et DVD-Ig hvori en bindende komponent målretter DVD-Ig'et til et spesifikt sete for dermed å bringe den andre bindende komponenten til det samme målsetet. For eksempel kunne en bindingsspesifisitet til et DVD-Ig målrettes mot bukspyttkjertelen (islet-celler) og den andre spesifisiteten kunne bringe GLP1 til bukspyttkjertelen for å indusere insulin.
B 9. Isotype:
For å generere et DVD-Ig-molekyl med ønskede egenskaper inkludert, men ikke begrenset til, Isotype, effektorfunksjoner og den sirkulerende halveringstiden, i en utførelsesform blir moder-mAb'er med passende Fc-effektorfunksjoner avhengig av den terapeutiske anvendelsen og det ønskede terapeutiske endepunkt valgt. Det eksisterer fem hovedklasser av tungkjeder eller isotyper noen av hvilke har flere undergrupper og disse bestemmer virkningen eller funksjonene til et antistoff-molekyl. Disse effektorfunksjonene befinner seg i hengsel-regionen, CH2 og CH3 domener til antistoffmolekylet. Imidlertid kan også residuer i andre deler til et antistoff-molekyl ha virkninger på effektorfunksjoner. Hengsel-regionen Fc-effektorfunksjoner inkluderer: (i) antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet, (ii) komplement (Clq)-binding, aktivering og komplement-avhengig cytotoksisitet
(CDC), (iii) fagocytose/klarering av antigen-antistoff komplekser, og (iv) cytokin-frigjørelse i noen tilfeller. Disse Fc-effektorfunksjonene til et antistoff-molekyl blir mediert gjennom interaksjonen til Fc-regionen med en gruppe av klasse-spesifikke celleoverflate-reseptorer. Antistoffer av IgG 1 isotypen er mest aktive mens IgG2 og IgG4 har minimal eller ingen effektorfunksjoner. Virkningen
eller funksjonene til IgG-antistoffene blir mediert gjennom interaksjoner med tre strukturelt homologe cellulære Fc-reseptortyper (og undergrupper) (FcgRl, FcgRII og FcgRIII). Disse effektorfunksjonene til en IgGl kan bli eliminert ved å mutere spesifikke aminosyre-residuer i den lavere hengselregionen (f.eks.,L234A, L235A) som er nødvendig for FcgR og Clq-binding. Aminosyre-residuer i Fc-regionen, spesielt CH2-CH3-domenene, bestemmer også den sirkulerende halveringstiden til antistoffmolekylet. Denne Fc-funksjonen er mediert gjennom bindingen av Fc-regionen til den neonatale Fc-reseptoren (FcRn) som er ansvarlig for resirkulering av antistoff-molekyler fra de sure lysosomer tilbake til generell sirkulering.
Om et mAb skal ha en aktiv eller en uaktiv isotype vil være avhengig av det ønskede terapeutiske endepunkt for et antistoff. Noen eksempler på bruk av isotyper og ønsket terapeutisk resultat er listet opp nedenfor: a) Hvis det ønskede endepunktet er funksjonell nøytralisering av et løselig cytokin da kan en inaktiv isotype bli anvendt; b) Hvis det ønskede resultatet er klarering av et patologisk protein kan en aktiv isotype bli anvendt; c) Hvis det ønskede resultatet er klarering av proteinaggregater kan en aktiv isotype bli anvendt; d) Hvis det ønskede resultatet er å antagonisere en overflatereseptor blir en uaktiv isotype anvendt (Tysabri, IgG4; OKT3, mutert IgGl); e) Hvis det ønskede resultatet er å eliminere mål-celler blir en aktiv isotype anvendt (Herceptin, IgGl (og med forbedrede effektorfunksjoner); og f) Hvis det ønskede resultatet er å klarere proteiner fra sirkulering uten å gå inn i CNS kan en IgM-erotype bli anvendt (f.eks.,klarering av sirkulerende Ab peptidtyper).
Fc-effektorfunksjonene for et moder-mAb kan bli bestemt ved diverse in vitro metoder velkjent i teknikken.
Som diskutert, valget av isotype, og dermed virkningen eller funksjonene vil være avhengig av det ønskede terapeutiske endepunkt. I tilfeller hvor enkel nøytralisering av et sirkulerende mål er ønsket, for eksempel å blokkere reseptor-ligand interaksjoner, trenger ikke virkningen eller funksjonene være nødvendig. I slike tilfeller er isotyper eller mutasjoner i Fc-regionen til et antistoff som eliminere effektorfunksjoner ønskelig. I andre tilfeller hvor eliminering av mål-celler er det terapeutiske endepunktet, for eksempel eliminering av tumorceller, er isotyper eller mutasjoner eller de-fucosylering i Fc-regionen som forbedrer effektorfunksjoner ønskelig (Presta GL, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006; Satoh M., lida S., Shitara K. Expert Opinion Biol. Ther. 6:1161-1173, 2006). Tilsvarende, avhengig av den terapeutiske anvendelsen, kan den sirkulerende halveringstiden til et antistoff-molekyl bli redusert/forlenget ved modulerende antistoff-FcRn interaksjoner ved å introdusere spesifikke mutasjoner i Fc-regionen (DalPAcqua WF, Kiener PA, Wu H. J. Biol. Chem. 281:23514-23524, 2006; Petkova SB., Akilesh S., Sproule TJ. et al. Internat. Immunol. 18:1759-1769, 2006; Vaccaro C, Bawdon R., Wanjie S et al. PNAS 103:18709-18714, 2007).
Den publiserte informasjonen om de forskjellige residuer som påvirker de forskjellige effektorfunksjonene til et vanlig terapeutisk mAb må kanskje bli bekreftet for DVD-Ig. Det kan være mulig ved i et DVD-Ig format ytterligere (forskjellig) Fc-region residuer, andre enn de identifisert for moduleringen av monoklonale antistoff effektorfunksjoner, kan være viktig.
Alt i alt, bestemmelsen angående hvilke Fc-effektorfunksjoner (isotype) vil være kritiske i det endelige DVD-Ig-formatet vil være avhengig av sykdomsindikasjonen, terapeutisk mål, ønsket terapeutisk endepunkt og sikkerhetsvurderinger. Opplistet nedenfor er eksempelvis passende tungkjede og lettkjede konstantregioner inkludert, men ikke begrenset til:
o IgGl - allotype: Glmz
o IgGl mutant - A234, A235
o IgG2 - allotype: G2m(n-)
o Kappa - Km3
o Lambda
Fc Reseptor og Clq Studier: Sjansene for uønsket antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC) og komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC) ved antistoff-kompleksering til ethvert overuttrykt mål på cellemembraner kan bli opphevet av (for eksempel, L234A, L235A) hengselregion-mutasjonene. Disse substituerte aminosyrene, tilstede i IgGl hengselregionen til mAb, er forventet å resultere i svekket binding av mAb til humane Fc-reseptorer (men ikke FcRn), siden FcgR-binding er trodd å forekomme innenfor overlappende seter på IgGl hengselregionen. Denne trekket ved mAb kan lede til en forbedret sikkerhetsprofil i forhold til antistoffer inneholdende en villtype IgG. binding av mAb til humane Fc-reseptorer kan bli bestemt ved "flow cytometry" eksperimenter ved å bruke celle-linjer (f.eks.,THP-l, K562) og en konstruert CHO-cellelinje som uttrykker FcgRIIb (eller andre FcgRs). Sammenlignet med kontroll bestående av IgGl monoklonale antistoffer, viser mAb redusert binding til FcgRI og FcgRIIa mens binding til FcgRIIb er upåvirket. Bindingen og aktiveringen av C lq ved antigen/IgG immunkomplekser utløser den klassiske komplementkaskaden med følgende inflammatoriske og/eller immunoregulatoriske responser. C lq- bindingssetet på IgG'er har blitt lokalisert til residuer innenfor IgG-hengselregionen. Clq-binding til økende konsentrasjoner av mAb ble vurdert ved Clq ELISA. Resultatene viser ved mAb ikke er i stand til å binde til Clq, som forventet når sammenlignet med bindingen av en villtype kontroll-IgGl. Alt i alt, L234A, L235A hengselregionmutasjonen fjerner binding av mAb til FcgRI, FcgRIIa og Clq men påvirker ikke interaksjonen til mAb med FcgRIIb. Disse data antyder ved in vivo, vil mAb med mutant Fc interagere normalt med den inhiberende FcgRIIb men vil sannsynligvis misslykkes i å interagere med de aktiverende FcgRI og FcgRIIen reseptorene eller C lq.
Human FcRn-binding: Den neonatale reseptoren (FcRn) er ansvarlig for transport av IgG over placenta og for å kontrollere den katabolske halveringstiden til IgG-molekylene. Det kan være ønskelig å øke den uttrykksmessige halveringstiden til et antistoff for å forbedre effekt, å redusere dosen eller administrasjonsfrekvensen, eller for å forbedre lokalisering til målet. Alternativt kan det være fordelaktig å gjøre det omvendte som er å minske den uttrykksmessige halveringstiden til et antistoff for å redusere eksponering av hele kroppen eller for å forbedre forholdet mellom binding til målet i forhold til ikke-mål. Å skreddersy interaksjonen mellom IgG og dets bergingsreseptor, FcRn, tilbyr en måte å øke eller minske den uttrykksmessige halveringstiden til IgG. Proteiner i blodomløpet, inkludert IgG, blir tatt opp i fluidfasen gjennom mikropinocytose av visse celler, slik som de i det vaskulære endothelium. IgG kan binde FcRn i endosomer under lett sure betingelser (pH 6.0-6.5) og kan resirkulere til celleoverflaten, hvor det blir frigjort under nesten nøytrale betingelser (pH 7.0-7.4). Kartlegging av Fc-region-bindingssetet på FcRn80,16,17 viste ved to histidinresiduer som er konservert over arter, His310 og His435, er ansvarlige for pH-avhengigheten til denne interaksjonen. Ved å bruke fag-fremvisningsteknologi, ble en mus Fc-region mutasjon som øker binding til FcRn og forlenger halveringstiden til mus IgG identifisert (se Victor, G. et al.; Nature Biotechnology (1997), 15(7), 637-640). Fc-region mutasjoner som øker bindingsaffiniteten til humant IgG for FcRn ved pH 6.0, men ikke ved pH 7.4, har også blitt identifisert (se Dall'Acqua William F, et al., Journal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). Videre, i ett tilfelle, en lignende pH-avhengig økning i binding (opp til 27-ganger) ble også observert for rhesus FcRn, og dette resulterte i en togangers økning i serum halveringstid i rhesus-apekatter sammenlignet med moder-IgG'et (se Hinton, Paul R. et al., Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213-6216). Disse funnene indikerer ved det er mulig å forlenge plasmahalveringstiden til antistoff-terapeutika ved å skreddersy interaksjonen til Fc-regionen med FcRn. Motsatt kan Fc-region mutasjoner som demper interaksjon med FcRn redusere antistoff halveringstid.
B.10 Farmakokinetikk (PK):
For å generere et DVD-Ig-molekyl med ønsket farmakokinetikkprofil blir, i en utførelsesform moder-mAb'er med den tilsvarende ønskede farmakokinetikkprofil valgt. En vurdering er ved immunogen respons til monoklonale antistoffer (dvs., HAHA, human anti-humant antistoff respons; HACA, human anti-kimerisk antistoff respons) videre kompliserer farmakokinetikken til disse terapeutiske midlene. I en utførelsesform, blir monoklonale antistoffer med minimal eller ingen immunogenitet anvendt for konstruere DVD-Ig-molekyler slik ved de resulterende DVD-Ig'ene også vil ha minimal eller ingen immunogenitet. Noen av faktorene som bestemmer PK'en til et mAb inkluderer, men er ikke begrenset til iboende egenskaper til mAb'et (VH aminosyresekvens); immunogenitet; FcRn-binding og Fc-funksjoner.
PK-profilen til valgte monoklonale moderantistoffer kan lett bli bestemt i gnagere siden PK-profilen i gnagere korrelerer bra med (eller forutsier nærme) PK-profilen til monoklonale antistoffer i cynomolgus-apekatter og mennesker. PK-profilen blir bestemt som beskrevet i Eksempel seksjon I.2.2.3.A.
Etter ved de monoklonale moderantistoffene med ønskede PK-karakteristikker (og andre ønskede funksjonelle egenskaper som diskutert heri) er valgt blir DVD-Ig'et konstruert. Siden DVD-Ig-molekyler inneholder to antigen-bindende domener fra to monoklonale moderantistoffer, blir også PK-egenskapene til DVD-Ig'et vurdert. Derfor, selv om de bestemmer PK-egenskapene til DVD-Ig'et, kan PK-assayer bli anvendt som bestemmer PK-profilen basert på funksjonaliteten til begge antigen-bindende domener avledet fra de 2 monoklonale moderantistoffene. PK-profilen til et DVD-Ig kan bli bestemt som beskrevet i Eksempel 1.2.2.3.A. Ytterligere faktorer som kan påvirke PK-profilen til DVD-Ig inkluderer orienteringen til det antigen-bindende domenet (CDR); Linkerstørrelse; og Fc FcRn interaksjoner. PK-karakteristikker til moderantistoffer kan bli evaluert ved å vurdere etter-parametrene: absorpsjon, fordeling, metabolisme og utskilling.
Absorpsjon: Opp til nå skjer administrasjon av terapeutisk monoklonale antistoffer via parenterale ruter (f.eks., intravenøs [IV], subkutan [SC], eller intramuskulær [IM]). Absorpsjon av et mAb inn i den systemiske sirkulasjonen etter enten SC eller IM administrasjon fra det interstitielle rommet er primært gjennom den lymfatiske signalveien. Mettbar, presystemisk, proteolytisk nedbrytning kan resultere i variabel absolutt biotilgjengelighet etter ekstravaskulær administrasjon. Vanligvis kan økning i absolutt biotilgjengelighet med økende doser av monoklonale antistoffer bli observert på grunn av mettet proteolytisk kapasitet ved høyere doser. Absorpsjonsprosessen for et mAb er vanligvis ganske treg siden lymfefluidene trekker sakte inn i det vaskulære systemet, og varigheten av absorpsjon kan forekomme over timer til flere dager.Den absolutte biotilgjengeligheten av monoklonale antistoffer etter SC administrasjon varierer generelt fra 50% til 100%. I tilfellet av en transport-medierende struktur ved blod-hjerne barrieren målsatt av DVD-Ig-konstruksjonen kan sirkuleringstiden i plasma bli redusert på grunn av forbedret trans-cellulær transport ved blod-hjerne barrieren (BBB) inn i CNS-rommet, hvor DVD-Ig'et blir frigjort for å muliggjøre interaksjon via dets andre antigengjenkjenningssete.
Fordeling: Etter IV administrasjon følger vanligvis monoklonale antistoffer en tofaset serum (eller plasma) konsentrasjon-tid profil, begynnende med en rask fordelingsfase, etterfulgt av en treg elimineringsfase. Generelt beskriver en bieksponential farmakokinetikkmodell best denne typen av farmakokinetikkprofil. Fordelingsvolumet i det sentrale rommet (Ve) for et mAb er vanligvis likt eller litt større enn plasmavolumet (2-3 liter). Et distinkt tofaset mønster i profilen for serum (plasma) konsentrasjon versus tid kan ikke synes med andre parenterale adminstrasjonsformer, slik som IM eller SC, fordi fordelingsfasen til serum (plasma) konsentrasjon-tid kurven er maskert av den lange absorpsjonsdelen. Mange faktorer, inkludert fysikokjemiske egenskaper, sete-spesifisitet og målrettet reseptormediert opptak, bindingskapasitet til vev, og mAb-dose kan påvirke biofordeling av et mAb. Noen av disse faktorer kan bidra til ikke-lineæritet i biofordeling for et mAb.
Metabolisme og Utskilling: på grunn av molekylstørrelsen blir ikke intakte monoklonale antistoffer utskilt i urinen via nyrene. De blir primært deaktivert ved metabolisme (f.eks., katabolisme). For IgG-baserte terapeutisk monoklonale antistoffer, varierer halveringstidene typisk fra timer eller 1-2 dager til over 20 dager. Elimineringen av et mAb kan bli påvirket av mange faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, affinitet for FcRn-reseptoren, immunogeniteten til mAb'et, graden av glykosylering av mAb'et, mottageligheten av mAb'et for proteolyse, og reseptor-mediert eliminering.
B.ll Kryssreaktivitetsmønster i vev hos mennesker og toks-arterer:
Identisk flekkfargingsmønster antyder ved potensiell human toksisitet kan bli evaluert i toks-arter. Toks-arter er de dyrene hvori urelatert toksisitet blir studert.
De individuelle antistoffer blir valgt for å møte to kriterier. (1) Flekkfarging av vev passende for den kjente uttrykkingen av antistoff-målet. (2) Lignende flekkfargingsmønster mellom humant og toks-arter vev fra det samme organet.
Kriterium 1: Immuniseringer og/eller antistoff seleksjoner anvender typisk rekombinante eller syntetiserte antigener (proteiner, karbohydrater eller andre molekyler). Binding til den naturlige motpart og mot-screening mot ikke-beslektede antigener er ofte del av screeningstrakten for terapeutiske antistoffer. Imidlertid er screening mot et stort antall med antigener ofte upraktisk. Derfor hjelper studier av kryssreaktivitet i vev med humant vev fra alle hovedorganer å utelukke uønsket binding til antistoffet til ethvert ikke-beslektet antigen.
Kriterium 2: Sammenligningsstudier av kryssreaktivitet for vev med humant vev og toks-arter vev (cynomolgus-apekatter, hund, muligens gnagere og andre, de samme 36 eller 37 vev blir testet som i det humane studiet) hjelper med å validere valget av en toks-arter. I de typiske studiene av kryssreaktivitet i vev på fryste vevseksjoner kan terapeutiske antistoffer demonstrere den forventede bindingen til det kjente antigenet og/eller i en mindre grad, binding til vev basert enten på lavnivå-interaksjoner (ikke-spesifikk binding, lavnivå-binding til lignende antigener, ladningsbaserte lavnivå- interaksjoner osv.). I hvert tilfelle er den mest relevante toksikologiske dyrearten den med den høyeste graden av tilfeller med binding til humant vev og dyrevev.
Studier av kryssreaktivitet for vev følger de passende regulatoriske retningslinjene inkludert EC CPMP Guideline 111/5271/94 "Production and quality control of mAbs" og 1997 US FDA/CBER "Points to Consider i the Fremstilling and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". . Kryoseksjoner (5 um) med humant vev oppnådd ved obduksjon eller biopsi ble fiksert og tørket på objektglass. Peroksidase-flekkfargingen av vev-seksjoner ble utført, ved å bruke avidin-biotin systemet. FDAs Veiledning " Points to Consider in the Fremstilling and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Relevante referanser inkluderer Clarke J 2004, Boon L. 2002a, Boon L 2002b, Ryan en 1999.
Studier av kryssreaktivitet for vev blir ofte gjort i to trinn, med det første trinnet inkluderende kryoseksjoner av 32 vev (typisk: Binyrene, Gastrointestinalkanalen, Prostata, Blære, Hjerte, Skjelettmuskulaturen, Blodceller, Nyre, Hud, Beinmarg, Lever, Ryggmarg, Bryst, Lunge, Milten, Cerebellum, Lymfekjertler, Testikler, Hjernebarken, Eggstokker, Thymus, Tykktarm, Bukspyttkjertel, Tyroid, Endothelium, Paratyroid, Urinleder, Øye, Hypofyse, Livmor, Eggleder og Placenta) fra en menneskelig donor. I den andre fasen blir et helt kryssreaktivitetsstudie utført med opp til 38 vev (inkludert binyrer, blod, blodkar, beinmarg, cerebellum, cerebrum, cervix, øsofagus, øye, hjerte, nyre, tykktarm, lever, lunge, lymfekjertler, melkekjertler fra bryst, eggstokker, oviduct, bukspyttkjertel, paratyroid, perifere nerver, hypofyse, placenta, prostata, spyttkjertel, hud, tynntarmen, ryggmarg, milten, mave, tverrstripet muskulatur, testikler, thymus, tyroid, mandel, urinleder, urinblære, og livmor) fra 3 ikke-beslektede voksne. Studier blir typisk utført ved minimum to dosenivåer.
Det terapeutiske antistoffet (dvs. prøvegjenstanden) og isotype-tilpasset kontroll-antistoff kan bli biotinylert for avidin-biotin kompleks (ABC) deteksjon; andre deteksjonsmetoder kan inkludere tertiær antistoff deteksjon for en FITC (eller annen) merket prøvegjenstand, eller prekompleksering med et merket anti-humant IgG for en umerket prøvegjenstand.
For en kort tid blir kryoseksjoner (omtrent 5 um) med humant vev oppnådd ved obduksjon eller biopsi fiksert og tørket på objektglass. Peroksidase-flekkfargingen av vev-seksjoner blir utført, ved å bruke avidin-biotin systemet. Først (i tilfellet av et prekompleksering-deteksjonssystem), blir prøvegjenstanden inkubert med det sekundære biotinylerte anti-humane IgG og utviklet til immunkompleks. Immunkomplekset ved sluttkonsentrasjonene på 2 og 10 ug/mL med prøvegjenstand blir tilsatt på vevseksjoner på objektglass og deretter ble vevseksjonene reagert i 30 minutter med et avidin-biotin-peroksidase kit. Deretter ble DAB (3,3'-diaminobenzidine), et substrat for peroksidase-reaksjonen, tilsatt i 4 minutter for flekkfarging av vev. Antigen-Sefarose kuler blir anvendt som positive kontroll-vevseksjoner.
Enhver spesifikk flekkfarging blir vurdert å være enten en forventet (f.eks.,konsistent med antigen-uttrykking) eller uventet reaktivitet basert på kjent uttrykking av det gjeldende mål-antigenet. Enhver flekkfarging som blir vurdert spesifikk blir poengsatt for intensitet og hyppighet. Antigen eller serum konkurranse- eller blokkeringsstudier kan hjelpe videre med å bestemme om observert flekkfarging er spesifikk eller ikke-spesifikk.
Hvis to valgte antistoffer er funnet å møte utvalgskriteriene - passende flekkfarging av vev, matchende flekkfarging mellom humant vev og spesifikt vev fra toksikologiske dyr - kan de bli valgt for DVD-Ig-generering.
Studiet av kryssreaktivitet for vev må bli repetert med den endelige DVD-Ig-konstruksjonen, men mens disse studiene følger den samme protokollen som skissert heri, er de mer komplekse å evaluere fordi enhver binding kan komme fra ethvert av de to moderantistoffene, og enhver uforklart binding må bli bekreftet med komplekse antigen-konkurranse studier.
Det er lett å se ved den komplekse utførelsen av kryssreaktivitetsstudier av vev med et multispesifikt molekyl som et DVD-Ig er sterkt forenklet hvis de to moder-antistoffene er selektert for (1) funn av manglende uventet kryssreaktivitet for vev og (2) for funn av passende likhet av kryssreaktivitet for vev mellom det korresponderende humane vevet og det toksikologiske dyreart vevet.
B.12 Spesifisitet og selektivitet:
For å generere et DVD-Ig-molekyl med ønsket spesifisitet og selektivitet, må man generere og velge moder-mAb'er med den tilsvarende ønskede spesifisitet og selektivitetsprofil.
Bindingsstudier for spesifisitet og selektivitet med et DVD-Ig kan være komplekse på grunn av de fire, eller flere, bindende setene, to hver for hvert antigen. Kort fortalt, bindingsstudier ved å bruke ELISA, BIAcore. KinExA eller andre interaksjonerstudier med et DVD-Ig må overvåke bindingen av en, to eller flere antigener til DVD-Ig-molekylet. Mens BIAcore teknologi kan løse den sekvensielle, uavhengige bindingen av flere antigener, mer tradisjonelle metoder inkludert ELISA eller mer moderne teknikker som KinExA kan ikke. Derfor er det kritisk med nøye karakterisering av hvert moderantistoff. Etter ved hvert individuelle antistoff har blittkarakterisertfor spesifisitet, er bekreftelsen av spesifisitetsretensjonen til de individuelle bindende setene i DVD-Ig-molekylet sterkt forenklet.
Det er lett å se ved den komplekse utførelsen for å bestemme spesifisiteten til et DVD-Ig er sterkt forenklet hvis de to moder-antistoffene er selektert for spesifisitet før de blir kombinert inn i et DVD-Ig.
Antigen-antistoff interaksjonerstudier kan ta mange former, inkludert mange klassiske protein-protein interaksjonerstudier, inkludert ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), Massespektrometri, kjemisk kryssbinding, SEC med lysspredning, likevektsdialyse, gel-gjennomtrengning, ultrafiltrering, gel-kromatografi, large-zone analytisk SEC, mikropreparativ ultrasentrifugering (sedimenteringslikevekt), spektroskopiske metoder, titrerings-mikrokalorimetri, sedimenteringslikevekt (i analytisk ultrasentrifuge), sedimenteringshastighet (i analytisk sentrifuge), overflate-plasmonresonans (inkludert BIAcore). Relevante referanser inkluderer "Current Protocolls in Protein Science", John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) Volum 3, chapters 19 og 20, publisert av John Wiley & Sons Inc., og referanser inkludert deri og "Current Protocolls in Immunology", John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Etan M. Shevach, Warren Strober (eds.) publisert av John Wiley & Sons Inc og relevante referanser inkludert deri.
Cytokinfrigjøring i helt blod: Interaksjonen til mAb med humane blodceller kan bli undersøkt ved hjelp av et cytokinfrigjøringsassay (Wing, M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190; "Current Protocolls in Farmacology", S.J. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser, (eds.) publisert av John Wiley & Sons Inc; Madhusudan, S. Clinical Cancer Forskning
(2004), 10(19), 6528-6534; Coks, J. Methods (2006), 38(4), 274-282; Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1), 94-106). Kort fortalt, diverse konsentrasjoner av mAb blir inkubert med humant helt blod i 24 timer. Den testede konsentrasjonen bør dekke et bredt område inkludert sluttkonsentrasjoner som etterligner typisk blod nivåer i pasienter (inkludert men ikke begrenset til 100 ng/ml - 100jig/ml). Etter inkuberingen ble supernatanter og cellelysater analysert for nærværet av IL-IRa, TNF-a, IL-lb, IL-6 og IL-8. Cytokin-konsentrasjonsprofiler fremstilt for mAb ble sammenlignet med profiler produsert ved en negativ human IgG-kontroll og en positiv LPS- eller FEn-kontroll. Cytokinprofilen fremvist av mAb fra både cellesupernatanter og cellelysater var sammenlignbar med human IgG-kontroll. I en utførelsesform interagerer ikke det monoklonale antistoffet med humane blodceller for spontant å frigjøre inflammatoriske cytokiner.
Cytokinfrigjøringsstudier for et DVD-Ig er komplekse på grunn av de fire, eller flere, bindende setene, to hver for hvert antigen. Kort fortalt, cytokinfrigjøringsstudier som beskrevet heri måler virkningen av hele DVD-Ig-molekylet på helt blod eller andre celle-systemer, men kan løse hvilken del av molekylet som forårsaker cytokinfrigjøring. Når cytokinfrigjøringen har blitt detektert, må renheten av DVD-Ig-preparatet bli fastslått, fordi noen ko-rensende cellulære komponenter kan forårsake cytokinfrigjøring på egen hånd. Hvis renhet ikke er problemet, fragmentering av DVD-Ig (inkludert men ikke begrenset til fjerning av Fc-delen, separering av bindende seter osv.), må kanskje bindingssete-mutagenese eller andre metoder bli anvendt for å oppklare noen observasjoner. Det er lett å se ved denne komplekse utførelsen er sterkt forenklet hvis de to moder-antistoffene er selektert for mangel av cytokinfrigjøring før de blir kombinert inn i et DVD-Ig.
B.13 Kryssreaktivitet til andre arter for toksikologiske studier:
I en utførelsesform er de individuelle antistoffer valgt med tilstrekkelig kryssreaktivitet til passende forks arter, for eksempel, cynomolgus-apekatter. Moder-antistoffer må binde til mål hos ortologe arter (dvs. cynomolgus-apekatter) og utløse passende respons (modulering, nøytralisering, aktivering). I en utførelsesform bør kryssreaktiviteten (affinitet/styrke) ovenfor mål hos ortologe arter være innenfor 10-ganger av det humane målet. I praksis blir moder-antistoffene evaluert for flere arter, inkludert mus, rotte, hund, apekatt (og andre ikke-humane primater), så vel som sykdomsmodell-arter (dvs. sauer for astmamodell). Den akseptable kryssreaktiviteten til toks-arter fra de monoklonale moderantistoffene tillater senere toksikologistudier av DVD-Ig-Ig i den samme spesien. På grunn av det bør de to monoklonale moderantistoffene ha akseptabel kryssreaktivitet for en vanlig toks-art for derfor å tillate toksikologistudier av DVD-Ig i den samme spesien.
Moder-mAb'er kan bli valgt fra diverse mAb'er i stand til å binde spesifikke mål og velkjent i teknikken. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til anti-TNF antistoff (US Patentnr. 6,258,562), anti-IL-12 og/eller anti-IL-12p40 antistoff (US Patentnr. 6,914,128); anti-IL-18 antistoff (US
2005/0147610 Al), anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, anti-gpl20, anti-VLA4, anti-CDl la, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (f.eks., se WO2007124299) anti-Id, anti-ICAM-1, anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti DLL-4, anti-NPRl, anti-PLGF, anti-ErbB3, anti-E-selectin, anti-Fact VII, anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CDl 1/18, anti-CD14, anti-ICAM-3, anti-RON, anti CD-19, anti-CD80 (f.eks., se WO2003039486, anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrin, anti-alfa4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (f.eks., se US Patent NO: 5,789,554), anti-CD20, anti-MIF, anti-CD64 (FcR), anti-TCR alfabeta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti-gpl20, anti-CMV, anti-gpllbllla, anti-IgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, anti-IGFl,2, anti IGFR, anti-VNRintegrin, anti-IL-lalfa, anti-IL-lbeta, anti-IL-1 reseptor, anti-IL-2 reseptor, anti-IL-4, anti-IL-4 reseptor, anti-IL5, anti-IL-5 reseptor, anti-IL-6, anti- IL-6R, RANKL, NGF, DKK, alfaVbeta3, IL-17A, anti-IL-8, anti-IL-9, anti-IL-13, anti-IL-13 reseptor, anti-IL-17, og anti-IL-23; IL-23pl9; (se Presta LG. 2005 Seleksjon, design, og konstruksjon av terapeutiske antistoffer J Allergi Clin Immunol. 116:731-6 og
http:// www. path. cam. ac. uk/~ mrc7/ humanization/ antibodies. html).
Moder-mAb'er kan også være valgt fra diverse terapeutiske antistoffer godkjent for anvendelse, i kliniske studier, eller i utvikling for klinisk anvendelse. Slike terapeutiske antistoffer inkluderer, men er ikke begrenset til, rituximab (Rituxan®, IDEK/Genentech/Roche) (se for eksempel U. S. Pat. Nr. 5,736,137), et kimerisk anti-CD20 antistoff godkjent for å behandle ikke-Hodgkins lymfom; HuMax-CD20, et anti-CD20 for tiden under utvikling av Genmab, et anti-CD20 antistoff beskrevet i U.S. Pat. Nr. 5, 500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), og PRO70769 (PCT/US2003/040426, med tittelen "Immunoglobulin Varianter og Anvendelser derav"), trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (se for eksempel U.S. Pat. Nr. 5,677,171), et humanisert anti- Her2/neu antistoff godkjent for å behandle bryst kreft; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), for tiden under utvikling av Genentech; et anti-Her2 antistoff beskrevet i U.S. Pat. Nr. 4,753,894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (U.S. Pat. Nr. 4,943,533; PCT WO 96/40210), et kimerisk anti-EGFR antistoff i kliniske studier for en rekke kreftsykdommer; ABX-EGF (U.S. Pat. Nr. 6,235,883), for tiden under utvikling av Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax- EGFr (U.S. Ser. No. 10/172,317), for tiden under utvikling av Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, og EMD72000 (Merck KGaA) (U.S. Pat. Nr. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biofys. 252(2):549-60; Rodekk et al., 1987, J Celle Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Forskning) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Celle Biofys. 1993, 22(1-3): 129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada og Centro de Immunologiet molekylær, Cuba (U.S. Pat. Nr. 5,891,996; U.S. Pat. Nr. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Forskning, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proe Nati Acad Sei USA. 100(2):63944); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); og SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), et humanisert mAb for tiden godkjent for behandling av B-celle kronisk lymfocytisk leukemi; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), et anti-CD3 antistoff utviklet av Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), et anti-CD20 antistoff utviklet av IDEK/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), et anti-CD33 (p67 protein) antistoff utviklet av Celltech/Wyet, alefacept (Amevive®), et anti-LFA-3 Fc fusjon utviklet av Biogen), abciximab (ReoPro®), utviklet av Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), utviklet av Novartis, palivizumab (Synagis®), utviklet av Medimmune, infliximab (Remicade®), et anti-TNFalfa antistoff utviklet av Centocor, adalimumab (Humira®), et anti-TNFalfa antistoff utviklet av Abbott, Humicade®, et anti-TNFalfa antistoff utviklet av Celltech, golimumab (CNTO-148), en helt human TNF antistoff utviklet av Centocor, etanrcept (Enbrel®), an p75 TNF reseptor Fc fusjon utviklet av Immunex/Amgen, lenercept, an p55TNF reseptor Fc fusjon tidligere utviklet av Roche, ABX-CBL, et anti-CDl47 antistoff som blir utviklet av Abgenix, ABX-IL8, et anti-IL8 antistoff som blir utviklet av Abgenix, ABX-MA1, et anti-MUC18 antistoff som blir utviklet av Abgenix, Pemtumomab (R 1549, 90Y-muHMFGl), et anti-MUCl i utvikling ved Antisoma, Therex (RI550), et anti-MUCl antistoff som blir utviklet av Antisoma, AngioMab (AS 1405), som blir utviklet av Antisoma, HuBC-1, som blir utviklet av Antisoma, Tioplatin (AS 1407) som blir utviklet av Antisoma, Antegren® (natalizumab), et anti-alfa-4-beta-l (VLA-4) og alfa-4-beta-7 antistoff som blir utviklet av Biogen, VLA-1 mAb, et anti-VLA-1 integrin antistoff som blir utviklet av Biogen, LTBR mAb, et anti-lymfotoksin beten reseptor (LTBR) antistoff som blir utviklet av Biogen, CAT-152, et anti-TGF-p2 antistoff som blir utviklet av Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), et anti- IL-12 p40 antistoff som blir utviklet av Abbott, CAT-192, et anti-TGFpi antistoff som blir utviklet av Cambridge Antibody Technology og Genzyme, CAT-213, et anti-Eotaxinl antistoff som blir utviklet av Cambridge Antibody Technology, LymfoStat-B® et anti-Blys antistoff som blir utviklet av Cambridge Antibody Technology og Human Genome Sciences Inc., TRAIL-RlmAb, et anti-TRAIL-Rl antistoff som blir utviklet av Cambridge Antibody Technology og Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), et anti-VEGF antistoff som blir utviklet av Genentech, et anti-HER reseptor familie antistoff som blir utviklet av Genentech, Anti-Vev Faktor (ATF), et anti-Vev Faktor antistoff som blir utviklet av Genentech, Xolair® (Omalizumab), et anti-IgE antistoff som blir utviklet av Genentech, Raptiva®
(Efalizumab), et anti- CD1 la antistoff som blir utviklet av Genentech og Xoma, MLN-02 Antistoff (formerly LDP-02), som blir utviklet av Genentech og Millenium Farmaceuticals, HuMax CD4, et anti-CD4 antistoff som blir utviklet av Genmab, HuMax-IL 15, et anti-IL 15 antistoff som blir utviklet av Genmab og Amgen, HuMax-Inflam, som blir utviklet av Genmab og Medarex, HuMax-Kreft, et anti-Heparanase I antistoff som blir utviklet av Genmab og Medarex og Oksford Gco Sciences, HuMax-Lymfom, som blir utviklet av Genmab og Amgen, HuMax-TAC, som blir utviklet av Genmab, IDEK-131, og anti-CD40L antistoff som blir utviklet av IDEK Farmaceuticals, IDEK-151 (Clenoliximab), et anti- CD4 antistoff som blir utviklet av IDEK Farmaceuticals, IDEK-114, et anti-CD80 antistoff som blir utviklet av IDEK Farmaceuticals, IDEK-152, et anti- CD23 som blir utviklet av IDEK Farmaceuticals, anti-makrofage migration faktor (MIF) antistoffer som blir utviklet av IDEK Farmaceuticals, BEC2, et anti-idiotypiske antistoff som blir utviklet av Imclone, IMC-1C11, et anti-KDR antistoff som blir utviklet av Imclone, DC 101, et anti-flk-1 antistoff som blir utviklet av Imclone, anti-VE cadherin antistoffer som blir utviklet av Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), et anti-carcinoembryonic antigen (CEA) antistoff som blir utviklet av Immunomedics, LymfoCide®
(Epratuzumab), et anti-CD22 antistoff som blir utviklet av Immunomedics, AFP-Cide, som blir utviklet av Immunomedics, MyelomaCide, som blir utviklet av Immunomedics, LkoCide, som blir utviklet av Immunomedics, ProstaCide, som blir utviklet av Immunomedics, MDX-010, et anti-CTLA4 antistoff som blir utviklet av Medarex, MDX-060, et anti-CD30 antistoff som blir utviklet av Medarex, MDX-070 som blir utviklet av Medarex, MDX-018 som blir utviklet av Medarex, Osidem® (IDM-1), og anti-Her2 antistoff som blir utviklet av Medarex og Immuno-Utformet Molekyler, HuMax®-CD4, et anti-CD4 antistoff som blir utviklet av Medarex og Genmab, HuMax-IL15, et anti-IL15 antistoff som blir utviklet av Medarex og Genmab, CNTO 148, et anti-TNFa antistoff som blir utviklet av Medarex og Centocor/J&J, CNTO 1275, et anti-cytokin antistoff som blir utviklet av Centocor/J&J, MOR101 og MOR102, anti-intercellulær adhesion molekyl-1 (ICAM-1) (CD54) antistoffer som blir utviklet av MorfoSys, MOR201, et anti-fibroblast vekstfaktor reseptor
3 (FGFR-3) antistoff som blir utviklet av MorfoSys, Nuvion® (visilizumab), et anti-CD3 antistoff som blir utviklet av Protein Design Labs, HuZAF®, et anti-gamma interferon antistoff som blir utviklet av Protein Design Labs, Anti-a 5pi Integrin, som blir utviklet av Protein Design Labs, anti-IL-12, som blir utviklet av Protein Design Labs, ING-1, et anti-Ep-CAM antistoff som blir utviklet av Xoma, Xolair® (Omalizumab) et humanisert anti-IgE antistoff utviklet av Genentech og Novartis, og MLNO1, et anti-Beta2 integrin antistoff som blir utviklet av Xoma, alle av the heri-sitert referanser i dette paragraf er uttrykkelig inkorporert heri ved referanse. I en annen utførelsesform, the terapeutika inkluderer KRN330 (Kirin); huA33 antistoff (A33, Ludwig Institute for Cancer Forskning); CNTO 95 (alfa V integrins, Centocor); MEDI-522 (alfa Vp3 integrin, Medimmune); volociximab (alfa Vpi integrin, Biogen/PDL); Human mAb 216 (B-celle glycosolated epitop, NCI); BiTE MT103 (bispesifikk CD19 x CD3, Medimmune); 4G7xH22 (Bispesifikk BcellxFcgammaRl, Medarex/Merck KGa); rM28 (Bispesifikk CD28 x MAPG, US Patentnr. EP 1444268); MDX447 (EMD 82633)
(Bispesifikk CD64 x EGFR, Medarex); Catumaxomab (removab) (Bispesifikk EpCAM x anti-CD3, Trion/Fres); Ertumaxomab (bispesifikk HER2/CD3, Fresenius Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex® (WX G250) (karbonic anhydrase IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglin), Tracon); BMS-663513 (CD137 agonist, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab ( hA20)
(CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEK 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (CD3 fc reseptor, PDL Biofarma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hLLl (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEK-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (kløyvd kollagen, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Farma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4 TRAIL-R1 agonist, Human Genome Science /Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (lexatumumab) (DR5 TRAIL-R2 agonist, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIII, AVANT Immunoterapeutika); adekatumumab (MT201) (Epcam, Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (folat reseptor a, Morfotech); KW-2871 (ganglioside GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morfotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (HLA-DR beta chain, PDL Farma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); anti-IGF-lRR1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (Killer celle Ig-lignende Reseptor (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyet, Ludwig Institute of Cancer Forskning); hCBE-11 (LTBR, Biogen); HuHMFGl (MUC1, Antisoma/NCI); RAV 12 (N-linked karbohydrat epitop, Raven); CAL (paratyroid hormon-
beslektede protein (PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidylserin, Peregrine); huJ591 (PSMA, Cornell Forskning Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Forskning Foundation); GC1008 (TGFb (pan) inhibitor (IgG4), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (transferrin reseptor, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (transferrin reseptor, Salk Institute); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Forskning Lab-WO/2000/034337, University of Texas);
IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).
B. Konstruksjon av DVD-molekyler:
Immunoglobulin (DVD-Ig) molekylet med to variable domener er utformet slik ved to forskjellige lettkjede variable domener (VL) fra de to forskjellige monoklonale moderantistoffene er knyttet sammen direkte eller via en kort linker ved rekombinante DNA-teknikker, etterfulgt av lettkjede konstantdomenet. Tilsvarende omfatter tungkjedet to forskjellige tungkjede variabeldomener (VH) knyttet sammen, etterfulgt av konstantdomene CH1 og Fc-region (Fig.lA).
De variable domenene kan bli oppnådd ved å bruke rekombinante DNA-teknikker fra et moderantistoff fremstilt ved enhver av metodene beskrevet heri. I en utførelsesform er det variable domenet et murint tung eller lettkjede variabelt domene. I en annen utførelsesform er det variable domenet et CDR-podet eller et humanisert variabelt tung eller lettkjede domene. I en utførelsesform er det variable domenet et humant tung eller lettkjede variabelt domene.
I en utførelsesform blir det første og andre variable domenet knyttet direkte til hverandre ved å bruke rekombinante DNA-teknikker. I en annen utførelsesform blir de variable domenene knyttet via en linker-sekvens. I en utførelsesform blir to variable domener knyttet sammen. Tre eller flere variable domener kan også være knyttet sammen direkte eller via en linker-sekvens. De variable domenene kan binde det samme antigenet eller kan binde forskjellige antigener. DVD-molekyler ifølge oppfinnelsen kan inkludere et immunoglobulin variabelt domene og en ikke-immunoglobulin variabelt domene slik som et ligand-bindende domene til en reseptor, aktivt domene av et enzym.
DVD-molekyler kan også omfatte 2 eller flere ikke-Ig domener.
Linker-sekvensen kan være en enkelt aminosyre eller en polypeptidsekvens. I en utførelsesform er linker-sekvensene valgt fra gruppen bestående av AKTTPKLEEGEFSEAR (SEKV
ID NR: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEKV ID NR: 2); AKTTPKLGG (SEKV ID NR: 3); SAKTTPKLGG (SEKV ID NR: 4); SAKTTP (SEKV ID NR: 5); RADAAP (SEKV ID NR: 6); RADAAPTVS (SEKV ID NR: 7); RADAAAAGGPGS (SEKV ID NR: 8); RADAAAA(G4S)4(SEKV ID NR: 9);SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEKV ID NR: 10); ADAAP (SEKV ID NR: 11); ADAAPTVSIFPP (SEKV ID NR: 12); TVAAP (SEKV ID NR: 13); TVAAPSVFIFPP (SEKV ID NR: 14); QPKAAP (SEKV ID NR: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEKV ID NR: 16); AKTTPP (SEKV I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en DVD omfattende minst to av VH- og/eller VL-regionene opplistet i Tabell 2, i enhver orientering.
Detaljert beskrivelse av spesifikke DVD-Ig-molekyler i stand til å binde spesifikke mål, og fremstillingsmetoder for samme, er tilveiebrakt i eksempelseksjonene nedenfor.
C. Produksjon av DVD-proteiner
Bindende proteiner ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli produsert ved enhver av en rekke teknikker kjent i teknikken. For eksempel, uttrykking fra vertsceller, hvori uttrykkingsvektor(er) som koder for DVD tung- og lettkj edene blir transfektert inn i en vertscelle ved hjelp av standardteknikker. De forskjellige former av uttrykket "transfeksjon" er ment å omfatte et stort utvalg av teknikker vanligvis anvendt for introduseringen av eksogen DNA inn i en prokaryotisk eller eukaryotisk vertscelle,/^., elektroporering, kalsium-fosfat utfelling, DEAE-dekstran transfeksjon og lignende. Selv om det er mulig å uttrykke DVD-proteinene ifølge oppfinnelsen i enten prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller, blir DVD-proteiner uttrykt i eukaryotiske celler, for eksempel, mammaliske vertsceller, fordi slike eukaryotiske celler (og spesielt mammaliske celler) er mer sannsynlige enn prokaryotiske celler å sette sammen og utsondre et riktig foldet og immunologisk aktivt DVD-protein.
Eksempelvise mammaliske vertsceller som uttrykker de rekombinante antistoffene ifølge oppfinnelsen inkluderer Kinesisk Hamster Eggstokker (CHO-celler) (inkludert dhfr-CHO-celler, beskrevet i Urlaub og Chasin, (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, anvendt med en DHFR selektabel markør,/efo., som beskrevet i R.J. Kaufman og P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), NSO myelom celler, COS-celler, SP2 og PER.C6 celler. Når rekombinant uttrykkende vektorer som koder for DVD-proteiner er introdusert inn i mammaliske vertsceller, blir DVD-proteinene produsert ved å dyrke vertscellene i en tid tilstrekkelig for å muliggjøre uttrykking av DVD-proteinene i vertscellene eller utsondring av DVD-proteinene inn i vekstmediumet hvori vertscellene blir dyrket. DVD-proteiner kan bli gjenvunnet fra vekstmediumet ved å bruke standard proteinrensingsmetoder.
I et eksempelvis system for rekombinant uttrykking av DVD-proteiner ifølge oppfinnelsen, blir en rekombinant uttrykkingsvektor som koder for både DVD-tungkjedet og DVD-lettkjedet introdusert inn i dhfr-CHO-celler ved kalsiumfosfat-mediert transfeksjon. Inne i den rekombinante uttrykkingsvektoren, er genene til DVD tung- og lettkjedet hver operativt knyttet til CMV forsterker/AdMLP promoter regulatoriske elementer for å drive høye nivåer av transkripsjon av genene. Den rekombinante uttrykkingsvektoren bærer også et DHFR-gen, som tillater for seleksjon av CHO-celler som har blitt transfektert med vektoren ved å bruke metotrexat seleksjon/forsterking. De valgte transformant vertscellene blir dyrket for å muliggjøre uttrykking av DVD tung- og lettkjedene og intakt DVD-protein blir gjenvunnet fra vekstmediumet. Standard molekylærbiologi-teknikker blir anvendt for å fremstille den rekombinante uttrykkingsvektoren, transfektere vertscellene, velge for transformanter, dyrke vertscellene og gjenvinne DVD-proteinet fra vekstmediumet. Enda videre tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å syntetisere et DVD-protein ifølge oppfinnelsen ved å dyrke en vertscelle ifølge oppfinnelsen i et passende vekstmedium til et DVD-protein ifølge oppfinnelsen er syntetisert. Metoden kan videre omfatte isolating DVD-proteinet fra vekstmediumet.
Et viktig trekk ved DVD-Ig er ved det kan bli produsert og renset på en lignende måte som et konvensjonelt antistoff. Produksjonen av DVD-Ig resulterer i et homogent, enkeltstående
hovedprodukt med ønsket dobbelt-spesifikk aktivitet, uten noen sekvensmodifikasjon av den konstante regionen eller kjemiske modifikasjoner av noe slag. Andre tidligere beskrevne metoder for å generere "bi-spesifikke", "multi-spesifikke", og "multi-spesifikke multivalente" full-lengde bindende proteiner leder ikke til et enkelt primært produkt men leder i stedet til den intracellulære eller utsondrede produksjonen av en blanding av sammensatte uaktive, mono-spesifikke, multi-spesifikke, multivalente, full-lengde bindende proteiner, og multivalente full-lengde bindende proteiner med en kombinasjon av forskjellige bindende seter. Som et eksempel, basert på utformingen beskrevet av Miller og Presta (PCT-publikasjon WO2001/077342(Al), er det 16 mulige kombinasjoner av tung- og lettkjeder. Følgelig er bare 6.25% av protein sannsynlig å være i den ønskede aktive formen, og ikke som et enkelt hovedprodukt eller et enkelt primært produkt sammenlignet med de andre 15 mulige kombinasjonene. Separering av den ønskede, fullt aktive formen av proteinet fra uaktive og delvis aktive former av proteinet ved å bruke standard kromatograif-teknikker, typisk anvendt i stor-skala fremstilling er ennå ikke demonstrert.
Overraskende fører utformingen av de "dobbelt-spesifikke multivalente full-lengde bindende proteinene" ifølge den foreliggende oppfinnelsen til et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener som primært setter seg sammen til de ønskede "dobbelt-spesifikke multivalente full-lengde bindende proteinene".
Minst 50%, minst 75% og minst 90% av de sammensatte, og uttrykte immunoglobulin-molekylene med to variable domener er det ønskede dobbelt-spesifikke tetravalente proteinet. Dette aspektet ifølge oppfinnelsen forbedrer spesielt den kommersielle anvendelsen av oppfinnelsen. Den foreliggende oppfinnelsen inkluderer derfor en metode for å uttrykke et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener i en enkelt celle for å lede til et enkelt primært produkt bestående av et "dobbelt-spesifikt tetravalent full-lengde bindende protein".
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en metode som uttrykker et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener i en enkelt celle for å lede til et "primært produkt" bestående av et "dobbelt-spesifikt tetravalent full-lengde bindende protein", hvor det "primære produktet" er mer enn 50% av alle de sammensatte proteinene, omfattende et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer metoder som uttrykker et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener i en enkelt celle for å lede til et enkelt "primær produkt" bestående av et "dobbelt-spesifikt tetravalent full-lengde bindende protein", hvor det "primære produktet" er mer enn 75% av av alle de sammensatte proteinene, omfattende et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer metoder som uttrykker et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener i en enkelt celle for å lede til et enkelt "primær produkt" bestående av et "dobbelt-spesifikt tetravalent full-lengde bindende protein", hvor det "primære produktet" er mer enn 90% av alle de sammensatte proteinene, omfattende et lettkjede med to variable domener og et tungkjede med to variable domener.
II. Derivatiserte DVD-bindende proteiner:
En utførelsesform tilveiebringer et merket bindende protein hvori det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen er derivatisert eller knyttet til et annet funksjonelt molekyl (f.eks., et annet peptid eller protein). For eksempel kan et merket bindende protein ifølge oppfinnelsen bli avledet ved funksjonelt å knytte et bindende protein ifølge oppfinnelsen (ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiasjon eller andre metoder) til en eller flere andre molekylære enheter, slik som et annet antistoff (f.eks., et bispesifikt antistoff eller en "diabody"), et detekterbart middel, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel, og/eller et protein eller peptid som kan formidle assosiering av det bindende proteinet med et annet molekyl (slik som en streptavidin-kjerneregion eller en polyhistidin-markør).
Nyttige detekterbare midler med hvilke et bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli derivatisert inkluderer fluorescerende forbindelser. Eksempelvis fluorescerende detekterbare midler inkluderer fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rhodamin, 5-dimetylamin-l-naftalensulfonylklorid, fycoerythrin og lignende. Et bindende protein kan også bli derivatisert med detekterbare enzymer, slik som basisk fosfatase, pepperrot peroksidase, glukose oksidase og lignende. Når et bindende protein er derivatisert med et detekterbart enzym, blir det detektert ved å tilsette ytterligere reagenser som enzymet bruker for å produsere et detekterbart reaksjonsprodukt. For eksempel, når det detekterbare middelet pepperrot peroksidase er tilstede, fører tilsetningen av hydrogenperoksid og diaminobenzidin til et farget reaksjonsprodukt, som er detekterbart. Et bindende protein kan også bli derivatisert med biotin, og detektert gjennom indirekte måling av avidin- eller streptavidin-binding.
En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et krystallisert bindende protein og formuleringer og sammensetninger omfattende slike krystaller. I en utførelsesform har det krystalliserte bindende proteinet en lengre halveringstid in vivo enn den løselige partneren til det bindende proteinet. I en annen utførelsesform beholder det bindende proteinet biologisk aktivitet etter krystallisering.
Krystallisert bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli produsert ifølge metoder kjent i teknikken og som fremvist i WO 02072636, inkorporert heri ved referanse.
En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et glykosylert bindende protein hvori antistoffet eller antigen-bindende porsjon derav omfatter en eller flere karbohydrat residuer. Begynnende in vivo protein-produksjon kan undergå videre prosessering, kjent som post-translasjonale modifikasjoner. Spesielt kan sukker (glykosyl) residuer bli tilsatt enzymatisk, en prosess kjent som glykosylering. De resulterende proteinene som bærer kovalent sammenkoblede oligosakkarid-sidekjeder er kjent som glykosylerte proteiner eller glykoproteiner. Antistoffer er glykoproteiner med en eller flere karbohydrat-residuer i Fc-domenet, så vel som det variable domenet. Karbohydrat-residuer i Fc-domenet har viktig virkning på virkningen eller funksjonen til Fc-domenet, med minimal virkning på antigen-binding eller halveringstid til antistoffet (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). Motsatt kan glykosylering av det variable domenet ha en virkning på den antigen-bindende aktiviteten til antistoffet. Glykosylering i det variable domenet kan ha en negativ virkning på antistoff bindingsaffinitet, sannsynligvis på grunn av sterisk hindring (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), eller resultere i økt affinitet for antigenet (Wallick, S.C, et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
Et aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot å generere glykosyleringssete-mutanter hvori det O- eller N-tilknyttede glykosyleringssetet til det bindende proteinet har blitt mutert. En fagmann kan generere slike mutanter ved å bruke standard velkjente teknologier. Glykosyleringssete-mutanter som beholder den biologiske aktiviteten men har økt eller senket bindingsaktivitet er et annet formål ifølge den foreliggende oppfinnelsen.
I nok en annen utførelsesform blir glykosyleringen til antistoffet eller antigen-bindende porsjon ifølge oppfinnelsen modifisert. For eksempel kan et aglykosylert antistoff bli lagd (dvs., antistoffet mangler glykosylering). Glykosylering kan bli forandret for å, for eksempel, øke affiniteten til antistoffet for antigen. Slike karbohydrat-modifikasjoner kan bli oppnådd ved, for eksempel, å forandre en eller flere seter for glykosylering innenfor antistoff-sekvensen. For eksempel kan en eller flere aminosyre-substitusjoner bli lagd som resulterer i eliminering av en eller flere variabel region glykosyleringsseter for dermed å eliminere glykosylering ved det setet. Slik aglykosylering kan øke affiniteten til antistoffet for antigen. En slik tilnærming er beskrevet i videre detalj i PCT-publikasjon WO2003016466A2, og U.S. Pat. Nr. 5,714,350 og 6,350,861, hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet.
Videre eller alternativt, kan et modifisert bindende protein ifølge oppfinnelsen bli lagd som har en forandret type av glykosylering, slik som et hypofucosylert antistoff som har reduserte mengder av fucosyl-residuer (se Kanda, Yutaka et al., Journal of Biotechnology (2007), 130(3), 300-310.) eller et antistoff som har økte halverende GlcNAc-strukturer. Slike forandrede glykosyleringsmønstre har blitt demonstrert å øke ADCC-evnen til antistoffer. Slike karbohydrat-modifikasjoner kan bli oppnådd ved, for eksempel, å uttrykke antistoffet i en vertscelle med forandret glykosyleringsmaskineri. Celler med forandret glykosyleringsmaskineri har blitt beskrevet i teknikken og kan bli anvendt som vertsceller hvori å uttrykke rekombinante antistoffer ifølge oppfinnelsen for dermed å produsere et antistoff med forandret glykosylering. Se, for eksempel, Shields, R. L. et al.
(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, så vel som, Europeisk patentNo: EP 1,176,195; PCT-publikasjoner WO 03/035835; WO 99/54342 80, hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet.
Protein-glykosylering er avhengig av aminosyre-sekvensen til proteinet av interesse, så vel som vertscellen hvori proteinet er uttrykt. Forskjellig organismer kan produsere forskjellig glykosyleringsenzymer (f.eks., glykosyltransferaser og glykosidaser), og har forskjellige substrater (nukleotidsukkere) tilgjengelig. På grunn av slike faktorer kan protein-glykosyleringsmønstre, og sammensetningen av glykosyl-residuer, variere avhengig av vertssystemet hvori det bestemte proteinet blir uttrykt. Glykosyl-residuer nyttige i oppfinnelsen kan inkludere, men er ikke begrenset til, glukose, galaktose, mannose, fucose, n-acetylglukosamin og sialsyre. I en utførelsesform omfatter det glykosylerte bindende proteinet glykosyl-residuer slik ved glykosyleringsmønsteret er humant.
Det er kjent for fagmannen ved forskjellig protein-glykosylering kan resultere i forskjellige protein-karakteristikker. For eksempel kan effekten av et terapeutisk protein produsert i en mikroorganisme-vert, slik som gjær, og glykosylert ved å bruke den endogene signalveien til gjær bli redusert sammenlignet med den til det samme proteinet uttrykt i en pattedyrscelle, slik som en CHO-cellelinje. Slike glykoproteiner kan også være immunogene i mennesker og viser redusert halveringstid in vivo etter administrasjon. Spesifikke reseptorer i mennesker og andre dyr kan kjenne igjen spesifikke glykosyl-residuer og promotere den raske klareringen av proteinet fra blodomløpet. Andre ugunstige virkninger kan inkludere forandringer i protein-folding, løselighet, mottakelighet for proteaser, trafikkering, transport, kompartementalisering, utsondring, gjenkjenning ved andre proteiner eller faktorer, antigenitet, eller allergenisitet. Følgelig kan en fagmann velge et terapeutisk protein med en spesifikk sammensetning og glykosyleringsmønster, for eksempel er glykosyleringssammensetning og -mønster identiske, eller minst lignende, til den produsert i humane celler eller i teknikken-spesifikke celler av det tilsiktede subjektdyret.
Uttrykking av glykosylerte proteiner forskjellige fra de til en vertscelle kan bli oppnådd ved å genetisk modifisere vertscellen til å uttrykke heterologe glykosyleringsenzymer. Ved å bruke teknikker kjent i teknikken kan en fagmann generere antistoffer eller antigen-bindende porsjoner derav som viser human protein-glykosylering. For eksempel har gjærstammer blitt genetisk modifisert for å uttrykke ikke-naturlig forekommende glykosyleringsenzymer slik ved glykosylerte proteiner (glykoproteiner) produsert i disse gjærstammene fremviser protein-glykosylering identisk med den til dyreceller, spesielt humane celler (U.S patent søknader 20040018590 og 20020137134 og PCT-publikasjon WO2005100584 A2).
I tillegg til de bindende proteinene er den foreliggende oppfinnelsen også rettet mot anti-idiotypiske (anti-Id) antistoffer spesifikke for slike bindende proteiner ifølge oppfinnelsen. Et anti-Id antistoffer et antistoff, som gjenkjenner unike determinanter generelt assosiert med den antigen-bindende regionen til et annet antistoff. Anti-Id'en kan bli fremstilt ved å immunisere et dyr med det bindende proteinet eller en CDR-inneholdende region derav. Det immuniserte dyret vil kjenne igjen, og respondere til de idiotypiske determinantene til det immuniserende antistoffet og produsere et anti-Id antistoff. Det er lett å se ved det kan være lettere for å generere anti-idiotypiske antistoffer til de to eller flere moderantistoffene inkorporert inn i et DVD-Ig-molekyl; og bekrefte bindingsstudier ved metoder velkjent i teknikken (f.eks.,BIAcore, ELISA) å verifisere ved anti-idiotypiske antistoffer spesifikke for idiotypen til hvert moderantistoff også kjenner igjen idiotypen (f.eks.,antigen-bindende sete) i sammenheng med DVD-Ig'et. Anti-Id'eniotypiske antistoffer spesifikke for hver av de to eller flere antigen-bindende seter til et DVD-Ig tilveiebringer ideelle reagenser for å måle DVD-Ig konsentrasjoner av et humant DVD-Ig i pasientserum; DVD-Ig-konsentrasjonsassayer kan bli etablert ved å bruke et "sandwich assay ELISA format" med et antistoff til en første antigen-bindende region belagt på den faste fasen (f.eks.,BIAcore chip, ELISA plate osv.), skyllt med skylle-buffer, inkubering med serum-prøven, et annet rensetrinn og til slutt inkubering med et annet anti-idiotypisk antistoff til det andre antigen-bindende setet, selv merket med et enzym for kvantifisering av bindingsreaksjonen. I en utførelsesform, for et DVD-Ig med mer enn to forskjellige bindende seter, anti-idiotypiske antistoffer til de to ytterste bindende setene (mest distal og proksimal fra den konstante regionen) vil ikke bare hjelpe med å bestemme DVD-Ig-konsentrasjonen i humant serum men også dokumentere integriteten til molekylet in vivo. Hvert anti-Id-antistoff kan også bli anvendt som et "immunogen" for å indusere en immunrespons i nok et annet dyr, produserende et såkalt anti-anti-Id antistoff.
Videre vil det settes pris på av en fagmann ved et protein av interesse kan bli uttrykt ved å bruke et bibliotek med vertsceller genetisk konstruert for å uttrykke diverse glykosyleringsenzymer, slik ved medlemsvertsceller i biblioteket produserer proteinet av interesse med varierende glykosyleringsmønstre. En fagmann kan deretter velge å isolere proteinet av interesse med bestemte nye glykosyleringsmønstre. I en utførelsesform, utviser proteinet som har et spesielt valgt nytt glykosyleringsmønster forbedrede eller forandrede biologiske egenskaper.
III. Anvendelser av DVD-Ig
Gitt deres evne for å binde til to eller flere antigener kan de bindende proteinene ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å detektere antigener ( f. eks., i en biologisk prøve, slik som serum eller plasma), ved å bruke et konvensjonelt immunoassay, slik som et "enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA), et radioimmunoassay (RIA) eller vev-immunohistokjemi. DVD-Ig'et blir direkte eller indirekte merket med en detekterbar substans for å legge til rette for deteksjon av bundet eller ikke-bundet antistoffet. Passende detekterbare stoffer inkluderer diverse enzymer, prostetiske grupper, fluorescerende materialer, luminescerende materialer og radioaktive materialer. Eksempler på passende enzymer inkluderer pepperrot peroksidase, basisk fosfatase, p-galaktosidase, eller acetylkolinesterase; eksempler på passende komplekser av prostetiske grupper inkluderer streptavidin/biotin og avidin/biotin; eksempler på passende fluorescerende materialer inkluderer umbelliferone, fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rhodamin, diklortriazinylamin fluorescein, dansyl klorid eller fycoerythrin; et eksempel på et luminescerende materiale inkluderer luminol; og eksempler på passende radioaktive materialer inkluderer 3H 14C<3>5S,90Y,9<9>Tc,<11>'ln,12<5>1,1<31>1,177Lu,<166>Ho, eller153Sm.
I en utførelsesform er de bindende proteinene ifølge oppfinnelsen i stand til å nøytralisere aktiviteten til antigener både in vitro og in vivo. Følgelig kan slike DVD-Ig'er bli anvendt for å inhibere antigenaktivitet,/efo., i en cellekultur inneholdende antigenene, i pasienter eller i andre mammaliske subjekter som har antigenene med hvilke et bindende protein ifølge oppfinnelsen kryssreagerer. I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å redusere antigen-aktivitet i en pasient som lider av en sykdom eller forstyrrelse hvori antigen-aktiviteten er skadelig. Et bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli administrert til en menneskelig pasient for terapeutisk formål.
Som anvendt heri, uttrykket "en forstyrrelse hvori antigen-aktivitet er skadelig" er ment å inkludere sykdommer og andre forstyrrelser hvori nærværet av antigenet i en pasient som lider av forstyrrelsen har blitt vist å være eller er mistenkt å være enten ansvarlige for patofysiologien til forstyrrelsen eller en faktor som bidrar til en forverring av forstyrrelsen. Følgelig, en forstyrrelse hvori antigen-aktivitet er skadelig er en forstyrrelse hvori reduksjon av antigen-aktivitet er forventet å lindre symptomene og/eller progresjonen av forstyrrelsen. Slike forstyrrelser kan bli påvist, for eksempel, ved en økning i konsentrasjonen av antigenet i et biologisk fluid fra en pasient som lider av forstyrrelsen ( f. eks., en økning i konsentrasjonen av antigen i serum, plasma, synovialvæske, osv. hos pasienten). Ikke-begrensende eksempler på forstyrrelser som kan bli behandlet med de bindende proteinene ifølge oppfinnelsen inkluderer de forstyrrelser diskutert nedenfor og i seksjonen som vedrører farmasøytiske sammensetninger av antistoffene ifølge oppfinnelsen.
DVD-Ig'ene ifølge oppfinnelsen kan binde et antigen eller flere antigener. Slike antigener inkluderer, men er ikke begrenset til, målene opplistet i databasene etter, hvilke databaser er inkorporert heri ved referanse. Disse måldatabasene inkluderer disse opplistet: Terapeutisk mål (http://xin.cz3.nus.edu.sg/gruppe/cjttd/ttd.asp);
Cytokiner og cytokin reseptorer (http://www.cytokinwebfacts.com/,
http://www.copewithcytokins.de/cope.cgi, og
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokin.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html);
Kjemokiner (http://cytokin.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
Kjemokinreseptorer og GPCRs (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Reseptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);
Olfaktoriske Reseptorer (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
Reseptorer (http://www.iufar-db.org/iufar-rd/list/index.htm);
Kreft-mål (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);
Utsondrede proteiner som potensielle antistoff-mål (http://spd.cbi.pku.edu.cn/);
Proteinkinaser (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), og
Humane CD markører (http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/CD_tabell_final_locked.pdf) og (Zola H, 2005 CD molekyler 2005: human celle differensiering molekyler Blod, 106:3123-6).
DVD-Ig'er er nyttige som terapeutiske midler for samtidig å blokkere to forskjellige mål for å forbedre effekt/sikkerhet og/eller øke pasientdekning. Slike mål kan inkludere løselige mål (TNF) og Celleoverflate-reseptor mål (VEGFR og EGFR). Det kan også bli anvendt for å indusere redirigert cytotoksisitet mellom tumorceller og T-celler (Her2 og CD3) for kreftterapi, eller mellom autoreaktive celler og effektorceller for autoimmunsykdom eller transplantasjon, eller mellom enhver mål-celle og effektor-celle for å eliminere sykdomsforårsakende celler i enhver gitt sykdom.
I tillegg kan DVD-Ig bli anvendt for å utløse reseptor-gruppering og aktivering når det er utformet for å målrette to forskjellige epitoper på den samme reseptoren. Dette kan ha en fordel i fremstilling av agonistisk og antagonistisk anti-GPCR terapeutika. I dette tilfellet kan DVD-Ig bli anvendt for å målrette to forskjellige epitoper (inkludert epitoper på både krkke-regionene og det ekstracellulære domenet) på en celle for gruppering/signalisering (to celleoverflate-molekyler) eller signalisering (på et molekyl). Tilsvarende kan et DVD-Ig-molekyl bli utformet for å utløse CTLA-4 ligering, og et negativt signal ved å målrette to forskjellige epitoper (eller 2 kopier av den samme epitopen) av CTLA-4 ekstracellulære domenet, for å lede til nedregulering av immunresponsen. CTLA-4 er et klinisk validert mål for terapeutisk behandling av en rekke immunologiske forstyrrelser. CTLA-4/B7 interaksjoner regulerer negativt T-celle aktivering ved å dempe cellesyklus-progresjon, IL-2 produksjon, og proliferering av T-celler etter aktivering, og CTLA-4 (CD 152) engasjement kan nedregulere T-celle aktivering og promotere induksjonen av immuntoleranse. Imidlertid har strategien med å dempe T-celle aktivering ved agonistisk antistoff engasjement av CTLA-4 vært misslykket siden CTLA-4 aktivering krever ligering. Den molekylære interaksjonen av CTLA-4/B7 er i "skewed zipper arrays", som demonstrert ved krystallstruktur-analyse (Stamper 2001 Nature 410:608). Imidlertid har ingen av de for tiden tilgjengelige CTLA-4-bindende reagenser ligeringsegenskaper, inkludert anti-CTLA-4 mAb'er. Det har vært flere forsøk på å addressere dette problemet. I et tilfelle ble et cellemedlem-bundet enkelt-kjede antistoff fremstilt, og inhiberte betydelig allogen avvisning i mus (Hwang 2002 JI 169:633). I et annet tilfelle ble kunstig APC overflate-koblet enkelt-kjede antistoff til CTLA-4 fremstilt og demonstrert å dempe T-celle-responser (Griffin 2000 JI 164:4433). I begge tilfellene ble CTLA-4 ligering oppnådd ved tett lokaliserte medlem-bundet antistoffer i kunstige systemer. Mens disse eksperimenter tilveiebringer "proof-of-concept" for immun nedregulering ved å utløse CTLA-4 negativ signalisering, reagensene anvendt i disse rapportene er ikke passende for terapeutisk anvendelse. For dette formål kan CTLA-4 ligering bli oppnådd ved å bruke et DVD-Ig-molekyl, som målretter to forskjellige epitoper (eller 2 kopier av den samme epitopen) av CTLA-4 ekstracellulære domenet. Rasjonalet er ved avstanden mellom to bindende seter i et IgG, omtrent 150-170Å, er for stort for aktiv ligering av CTLA-4 (30-50 Å mellom 2 CTLA-4 homodimere). Imidlertid er avstanden mellom de to bindende setene på DVD-Ig (en arm) mye kortere, også i området av 30-50 Å, tillatende riktig ligering av CTLA-4.
Tilsvarende kan DVD-Ig målrette to forskjellige medlemmer av et celleoverflatereseptor-kompleks (f.eks.,IL-12R alfa og beta). Videre kan DVD-Ig målrette CR1 og et løselig protein/patogen for å drive rask klarering av det målrettede løselige protein/patogen.
Videre kan DVD-Ig'er ifølge oppfinnelsen bli anvendt for vev-spesifikk levering (målrett en vevsmarkør og en sykdomsmediator for forbedrede lokal PK følgelig høyere effekt og/eller lavere toksisitet), inkludert intracellulær levering (målrette en internaliserende reseptor og et intracellulært molekyl), levering til innsiden av hjernen (målrette transferrin reseptor og en CNS-sykdomsmediator for å krysse blod-hjerne barrieren). DVD-Ig kan også gjøre tjeneste som et bærerprotein for å levere et antigen til en spesifikk plassering via binding til en ikke-nøytraliserende epitop av det antigenet og også for å øke halveringstiden til antigenet. Videre kan DVD-Ig bli utformet for enten å være fysisk knyttet til medisinske anordninger implantert i pasienter eller målrette disse medisinske anordninger (se Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus eluerende stenter. Advanced Drug DeliveryReviews (2006), 58(3), 437-446; Overflate belegg for biologisk aktivering og funksjonalisering av medisinske anordninger, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Overflate og Belegg Teknologi (2006), 200(22-23), 6318-6324; Legemiddel/ anordning kombinasjoner for lokal legemiddel terapier og infeksjon profylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of cytokinet nettverk i the implantering of orthopedic anordnings., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L., Bio-nedbrytbare Systemer i Vev Engineering og Regenerative Medicine (2005), 377-397). Kort fortalt å dirigere passende typer av celler til setet til et medisinsk implantat kan promotere tilheling og gjenopprette normal vev funksjon. Alternativt, inhibering av mediatorer (inkludert men ikke begrenset til cytokiner), frigjort ved anordningsimplantering ved en DVD koblet til eller målrettet mot en anordning er også tilveiebrakt. For eksempel har stenter blitt anvendt for år i interventional kardiology for å klarere blokkerte arterier og for å forbedre strømmen av blod til hjertemuskelen. Imidlertid, tradisjonelle bart metall stenter har blitt kjent for å forårssake restenose (re-innsnevring av arterien i et behandlet område) i noen pasienter og kan lede til blodpropper. Nylig har et anti-CD34 antistoff belagt stent blitt beskrevet som redusert restenose og forhindrer blodpropper fra å oppstå ved å fange endotel progenitor celler (EPC) sirkulerende i hele blodet. Endotelceller er celler som line blodkars, tillater blod å strømme lett. EPCene fester seg til den harde overflaten til stenten og danner et glatt lag som ikke bare promoterer tilheling men forhindrer restenose og blodpropper, komplikasjoner tidligere assosiert med anvendelsen av stenter (Aoji et al. 2005 J Am Coll Kardiol. 45(10):1574-9). I tillegg til å forbedre resultat for pasienter som må ha stenter, er det også implikasjoner for pasienter som må ha kardiovaskulær bypass kirurgi. For eksempel, en prostetisk vaskulær kanal (kunstig arterie) belagt med anti-EPC antistoffer ville eliminere the behov å anvende arteries fra pasienter legs eller arms for bypass kirurgi grafts. Dette ville redusere kirurgi- og anestesitidene, som igjen vil redusere koronært kirurgi dødsfall. DVD-Ig er utformet på en slik måte ved det binder til en celleoverflate markør (slik som CD34) så vel som et protein (eller en epitop av enhver type, inkludert men ikke begrenset til proteiner, lipider og polysakkarider) som har blitt belagt på den implanterte anordningen for å legge til rette for celle-rekrutteringen. Slike metoder kan også bli brukt på andre medisinske implantater generelt. Alternativt kan DVD-Ig'er bli belagt på medisinske anordninger og ved implantering og frigjøre alle DVD'er fra anordningen (eller ethvert annet behov som kan trenge ytterligere frisk DVD-Ig, inkludert aldring og denaturering av det allerede opplastede DVD-Ig) anordningen kunne bli reladet ved systemisk administrasjon av ny DVD-Ig til pasienten, hvor DVD-Ig'et er utformet for å binde til et mål av interesse (et cytokin, en celleoverflate markør (slik som CD34) osv.) med ett sett av bindende seter og til et mål belagt på anordningen (inkludert et protein, en epitop av enhver type, inkludert men ikke begrenset til lipider, polysakkarider og polymerer) med det andre. Denne teknologien har fordelen av å forlenge nyttigheten av belagte implantater.
A. Anvendelse av DVD-Ig'er i diverse sykdommer
DVD-Ig-molekyler ifølge oppfinnelsen er også nyttig som terapeutiske molekyler for å behandle diverse sykdommer. Slike DVD-molekyler kan binde et eller flere mål involvert i en spesifikk sykdom. Eksempler på slike mål i diverse sykdommer er beskrevet nedenfor.
1. Humane Autoimmune og Inflammatoriske Responser
Mange proteiner har blitt impliserte i generelt autoimmune og inflammatoriske responser, inkludert C5, CCL1 (1-309), CCL11 (eotaxin), CCL13 (mcp4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 / eotaxin-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LEX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (endotel Monocyte-aktiverende cytokin), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, ILIORB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, ILI RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRÅDD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orfl0 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, ILIORB, IL11, ILI IRA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH IL, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF1 IA, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, og RNF110 (ZNF144). I et aspekt, DVD-Ig'er i stand til å binde en eller flere av målet opplistet heri er tilveiebrakt.
2. Astma
Allergisk astma erkarakterisert vednærværet av eosinofili, "goblet"-celle metaplasi, epitelcelle forandringer, luftvei hyperreaktivitet (AHR), og Th2 og Thl cytokin-uttrykking, så vel som forhøyet serum IgE nivåer. Det er nå vidt akseptert ved luftvei-inflammasjon er nøkkelfaktoren som ligger under patogenesen til astma, som involverer et komplekst samspill av inflammatoriske celler slik som T-celler, B-celler, eosinofils, mastceller og makrofager, og av deres utsondrede mediatorer inkludert cytokiner og kjemokiner. Kortikosteroider er den mest viktige anti-inflammatoriske behandlingen for astma idag, imidlertid er deres virkningsmekanisme ikke-spesifikk og uro over sikkerheten eksisterer, spesielt i den yngre pasientpopulasjonen. Utviklingen av mer spesifikke og målrettede terapier er derfor berettiget. Det er økende bevis ved IL-13 i mus hermer etter mange av trekkene ved astma, inkludert AHR, slim hypersekresjon og luftvei-fibrose, uavhengig av eosinofil inflammasjon (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105). IL-13 har blitt implisert å ha en sentral rolle i å forårsake patologiske responser assosiert med astma. Utviklingen av anti-IL-13 mAb terapi for å redusere virkningene av IL-13 i lungen er en spennende ny tilnærming som tilbyr betydelig løfte som en ny behandling for astma. Imidlertid er andre mediatorer av differensielle immunologiske signalveier også involvert i astma patogenese, og å blokkere disse mediatorer, i tillegg til IL-13, kan tilby ytterligere terapeutisk nytte. Slike mål-par inkluderer, men er ikke begrenset til, IL-13 og et pro-inflammatorisk cytokin, slik som tumornekrose-faktor-a (TNF-a). TNF-a kan forsterke den inflammatoriske responsen i astma og kan bli knyttet til sykdomsalvorlighetsgrad (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Forskning (2001), 31 (New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). Dette antyder ved å blokkere både IL-13 og TNF-a kan ha gunstig virkninger, spesielt i alvorlig luftvei sykdom. I en annen utførelsesform binder DVD-Ig'et ifølge oppfinnelsen målet IL-13 og TNFa og blir anvendt for å behandle astma.
Dyremodeller slik som OVA-indusert astma musemodell, hvor både inflammasjon og AHR kan bli vurdert, er kjent i teknikken og kan bli anvendt for å bestemme evnen til diverse DVD-Ig-molekyler for å behandle astma. Dyremodeller for å studere astma er vist i CofFman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77,263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873; og Snibson, et al., Journal of the Britth Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. I tillegg til rutinemessig sikkerhetsvurderinger av disse mål-par kan spesifikke prøver for graden av immunundertrykking være berettiget og hjelpsomt i å velge det beste mål-par (se Luster et al, Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biologic standardization
(1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257).
Basert på rasjonalet fremvist heri og ved å bruke den samme evalueringsmodellen for effekt og sikkerhet kan andre par med mål som DVD-Ig-molekyler kan binde og være nyttige for å behandle astma bli bestemt. I en utførelsesform inkluderer slike mål, men er ikke begrenset til, IL-13 og IL-lbeta, siden IL-lbeta også er impliserte i inflammatorisk respons i astma; IL-13 og cytokiner og kjemokiner som er involvert i inflammasjon, slik som IL-13 og IL-9; IL-13 og IL-4; IL-13 og IL-5; IL-13 og IL-25; IL-13 og TARC; IL-13 og MDC; IL-13 og MIF; IL-13 og TGF-p; IL-13 og LHR agonist; IL-13 og CL25; IL-13 og SPRR2a; IL-13 og SPRR2b; og IL-13 og ADAM8. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også DVD-Ig'er i stand til å binde et eller flere mål involvert i astma valgt fra gruppen bestående av CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamin og histamin reseptorer, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ILI 1, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, og Chitinase.
3. Revmatoid artritt
Revmatoid artritt (RA), en systemisk sykdom, erkarakterisert veden kronisk inflammatorisk reaksjon i synovium i ledd og er assosiert med degenerering av brusk og erosjon av juxta-artikulært ben, Mange pro-inflammatoriske cytokiner inkludert TNF, kjemokiner, og vekstfaktorer blir uttrykt i syke ledd. Systemisk administrasjon av anti-TNF antistoff eller sTNFR fusjonsprotein til musemodeller av RA ble vist å være anti-inflammatorisk og ledd-beskyttende. Kliniske undersøkelser hvori aktiviteten til TNF i RA-pasienter ble blokkert med intravenøst administrert infliximab (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Sammendrag av kliniske studier i revmatoid artritt ved å bruke infliximab, et anti-TNFalfa behandling. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:161-4), et kimerisk anti-TNF mAb, har tilveiebrakt bevis ved TNF regulerer IL-6, IL-8, MCP-1, og VEGF produksjon, rekruttering av immun og inflammatoriske celler inn i ledd, angiogenese, og reduksjon av blodnivåer av matrix metalloproteinases-1 og -3. En bedre forståelse av den inflammatoriske signalveien i revmatoid artritt har ledet til identifisering av andre terapeutisk mål involvert i revmatoid artritt. Lovende behandlinger slik som interleukin-6 antagonister (IL-6 reseptor antistoff MRA, utviklet av Chugai, Roche (se Nishimoto, Norihiro et al., Arthritis & Rheumatism (2004), 50(6), 1761-1769), CTLA4Ig (abatacept, Genovese Mc et al 2005 Abatacept for revmatoid artritt refractory to tumornekrose-faktor alfa inhibering. N Engl J Med. 353:1114-23.), og anti-B-celle terapi (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for revmatoid artritt. N Engl J Med. 351:1909) har allerede blitt utprøvd i randomiserte kontrollerte studier i løpet av det siste året. Andre cytokiner har blitt identifisert og har blitt vist å være av nytte i dyremodeller, inkludert interleukin-15 (terapeutisk antistoff HuMax-IL_15, AMG 714 se Baslund, Bo et al., Arthritis & Rheumatism (2005), 52(9), 2686-2692), interleukin-17, og interleukin-18, og kliniske studier av disse midler er for tiden under vei. Dobbelt-spesifikke antistoff terapi, ved å kombinere anti-TNF og en annen mediator, har stort potensiale i å forsterke klinisk effekt og/eller pasientdekning. For eksempel, å blokkere både TNF og VEGF kan potensielt fjerne inflammasjon og angiogenese, begge av hvilke er involvert i patofysiologi hos RA. Å blokkere andre par med mål involvert i RA inkludert, men ikke begrenset til, TNF og IL-18; TNF og IL-12; TNF og IL-23; TNF og IL-lbeta; TNF og MIF; TNF og IL-17; og TNF og IL-15 med spesifikke DVD-Ig'er er også påtenkt. I tillegg til rutinemessig sikkerhetsvurderinger av disse mål-par, kan spesifikke prøver for graden av immunundertrykking være berettiget og hjelpsomt i å velge det beste mål-par (se Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biologic standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). Om et DVD Ig-molekyl vil være nyttig for behandlingen av revmatoid artritt kan bli vurdert ved å bruke pre-kliniske dyr- RA-modeller slik som den kollagen-induserte artritt musemodellen. Andre nyttig modeller er også velkjent i teknikken (se Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2): 114-22). Basert på kryssreaktiviteten til moder-antistoffene for human- og musortologer (f.eks.,reaktivitet for humant og mus TNF, humant og mus IL-15 osv.) valideringsstudier i mus CIA-modellen kan bli utført med "matchet surrogat antistoff' avledet DVD-Ig-molekyler; Kort fortalt kan et DVD-Ig basert på to (eller flere) mus-mål spesifikke antistoffer bli matchet så langt det lar seg gjøre til karakteristikkene til de humane eller humaniserte moderantistoffene anvendt for humant DVD-Ig-konstruksjon (lignende affinitet, lignende nøytraliseringsstyrke, lignende halveringstid osv.).
4. SLE
Det immunopatogene kjennetegnet for SLE er den polyklonale B-celle aktiveringen, som fører til hyperglobulinemi, autoantistoff-produksjon og immunkompleks-dannelse. Det fundamentale avviket ser ut til å være svikten av T-celler i å undertrykke de forbudte B-celle klonene på grunn av generalisert T-celle dysregulering. I tillegg er B og T-celle interaksjon lagt til rette for av flere cytokiner slik som IL-10 så vel som ko-stimulatoriske molekyler slik som CD40 og CD40L, B7 og CD28 og CTLA-4, som initierer det andre signalet. Disse interaksjoner sammen med svekket fagocytisk klarering av immun komplekser og apoptotisk materiale, opprettholder immunresponsen med resulterende vev-skade. De følgende målene kan være involvert i SLE og kan potensielt bli anvendt for DVD-Ig tilnærming for terapeutisk intervensjon: B-celle målrettede terapier: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, og NT5E.; ko-stimulatoriske signaler: CTLA4 eller B7.1/B7.2; inhibering av B-celle overlevelse: BlyS, BAFF; Komplement inaktivering: C5; Cytokin modulering: hovedprinsippet er ved netto biologika-respons i ethvert vev er resultatet av en balanse mellom lokale nivåer av proinflammatoriske eller anti-inflammatoriske cytokiner (se Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). SLE er ansett å være en Th-2 drevet sykdom med dokumenterte økninger i serum IL-4, IL-6, IL-10. DVD-Ig'er i stand til å binde et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, og TNF-a er også påtenkt. Kombinasjon av mål diskutert heri vil forbedre terapeutisk effekt for SLE hvilket kan bli utprøvd i en rekke lupus prekliniske modeller (se Peng SL
(2004) Methods Mol Med.;102:227-72). Basert på kryssreaktiviteten til moder-antistoffene for human- og musortologer (f.eks.,reaktivitet for humant og mus CD20, humant og mus Interferon alfa osv.) valideringsstudier i en mus lupus modell kan bli utført med "matchet surrogat antistoff avledet DVD-Ig-molekyler; Kort fortalt kan et DVD-Ig basert på to (eller flere) mus-mål spesifikke antistoffer bli matchet så langt det lar seg gjøre til karakteristikkene til de humane eller humaniserte moderantistoffene anvendt for humant DVD-Ig-konstruksjon (lignende affinitet, lignende nøytraliseringsstyrke, lignende halveringstid osv.).
5. Multippel sklerose
Multippel sklerose (MS) er en kompleks human autoimmun-type sykdom med en hovedsaklig ukjent etiologi. Immunologisk ødeleggelse av myelin basisk protein (MBP) gjennom hele nervesystemet er den viktigste patologien til multippel sklerose. MS er en sykdom med komplekse patologier, som involverer infiltrering av CD4+ og CD8+ T-celler og med respons innenfor det sentrale nervesystemet. Uttrykking i CNS av cytokiner, reaktive nitrogenspesier og kostimulator-molekyler har alle blitt beskrevet i MS. Av stor viktighet er immunologiske mekanismer som bidrar til utviklingen av autoimmunitet. Spesielt, antigen-uttrykking, cytokin og leukocytt interaksjoner, og regulatoriske T-celler, som hjelper med å balansere/modulere andre T-celler slik som Thl og Th2 celler, er viktige områder for terapeutisk mål-identifisering. IL-12 er et proinflammatorisk cytokin som er produsert ved APC og promoterer differensiering av Thl effektor-celler. IL-12 er produsert i lesjonene under utvikling i pasienter med MS så vel som i EAE-påvirket dyr. Tidligere ble det vist ved interferens i IL-12 signalveier effektivt forhindrer EAE i gnagere, og ved in vivo nøytralisering av IL-12p40 ved å bruke et anti-IL-12 mAb har gunstig virkninger i den myelin-induserte EAE modellen i vanlig silkeaper.
TWEAK er et medlem av TNF-familien, iboende uttrykt i sentralnervesystemet (CNS), med pro-inflammatoriske, proliferative eller apoptotiske virkninger avhengig av celletyper. Dets reseptor, Fnl4, er uttrykt i CNS av endotelceller, reaktive astrocytter og nevroner. TWEAK og Fnl4 mRNA uttrykking øker i ryggmargen i løpet av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). Anti-TWEAK antistoff behandling i myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) indusert EAE i C57BL/6 mus resulterte i en reduksjon av sykdomsalvorlighetsgrad og leukocytt infiltrering når mus ble behandlet etter den innledende fasen.
Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår DVD-Ig-molekyler i stand til å binde en eller flere, for eksempel to, mål valgt fra gruppen bestående av IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52, og CCR2. En utførelsesform inkluderer et dobbelt-spesifikt anti-IL-12/TWEAK DVD lg som et terapeutisk middel gunstig for behandlingen av MS.
Flere dyremodeller for å vurdere nytten av DVD-molekylene for å behandle MS er kjent i teknikken (se Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol.8(3): 197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al, (1995) Neurol Clin. 13(1):51-73; og 't Hart BA, et al, (2005) J Immunol 175(7):4761-8. Basert på kryssreaktiviteten til moder-antistoffene for humane og dyreart ortologer (f.eks.,reaktivitet for humant og mus IL-12, humant og mus TWEAK osv.) valideringsstudier i mus EAE-modellen kan bli utført med "matchet surrogat antistoff' avledet DVD-Ig-molekyler; Kort fortalt kan et DVD-Ig basert på to (eller flere) mus-mål spesifikke antistoffer bli matchet så langt det lar seg gjøre til karakteristikkene til de humane eller humaniserte moderantistoffene anvendt for humant DVD-Ig-konstruksjon (lignende affinitet, lignende nøytraliseringsstyrke, lignende halveringstid osv.). Det samme konseptet gjelder for dyremodeller i andre ikke-gnager arter, hvor et "matchet surrogat antistoff avledet DVD-Ig ville bli valgt for den forventede farmakologien og muligens sikkerhet studier. I tillegg til rutinemessig sikkerhetsvurderinger av disse mål-par kan spesifikke prøver for graden av immunundertrykking være berettiget og hjelpsomt i å velge det beste mål-par (se Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biologic standardization (1992), 77 99-102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). ILegemidler.3(4):442-6).
MS er imidlertid ikke bare en imunologisk sykdom men har en veldig viktig nevrodegenerativ komponent. Sykdomsprogresjon i MS er på grunn av akkumulert tap og skade av aksoner og de endelige sykdomsresultatene for pasientene er bestemt ved disse nevrodegenerative prosesser (Compston A. & Coles A. (2008) Lancet 372: 1502 - 1517; Trapp BD. & Nave KA. (2008) Annu.Rev. Neuroscience 31: 247 - 269). Flere mekanismer kan stå for aksonal skade i MS. Overdreven frigjørelse av nevrotransmitteren glutamat med assosiert kalsium-mediert neurotoksisitet, nitrogenmonoksid-frigjøring og etterfølgende akson-skade, tap av nevrotrofisk støtte, massiv akkumulering av frastøtende eller aksonvekst-inhiberende molekyler som RGM A, NOGO A, Semaforins, Efrins, kan bidra til akson-dirigert nevrodegenerering og tap av vellykket akson-regenerering. Å målrette i et enkelt DVD lg molekyl nøytraliserende aktiviteter rettet mot komponenter som RGM A, NOGO A, Semaforins, Efrins med nøytraliserende aktiviteter rettet mot pro-inflammatoriske cytokiner som IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52, og CCR2 ville muliggjøre det samtidige fokuset på inflammasjon og nevro-regenerering, et mål ennå ikke oppnådd av noen av de nåværende terapeutiske MS-prinsipler. Stimulerende nevro-regenerering kan kompensere funksjonelle svekkelser forårsaket av den massive aksonale nevrodegenereringen observert i MS, noe som gkør gjenvinningen av tapte cerebrale funksjoner mulig.
6. Sepsis
Patofysiologien til sepsis er initiert av komponentene i den ytre membranen til både gram-negative organismer (lipopolysaccharide [LPS], lipid A, endotoksin) og gram-positive organismer (lipoteichoic syre, peptidoglycan). Disse ytre-membran komponentene er i stand til å binde til CD 14-reseptoren på overflaten av monocytter. På grunn av de nylig beskrevne toll-like reseptorene, blir et signal så sendt til cellen, for å lede til den endelige produksjon av de proinflammatoriske cytokinene tumornekrose-faktor-alfa (TNF-alfa) og interleukin-1 (IL-1). Overveldende inflammatorisk og immun responser er essensielle trekk ved septisk sjokk og spiller en sentral rolle i patogenesen av vev-skade, multippel organsvikt, og død indusert av sepsis. Cytokiner, spesielt tumornekrose-faktor (TNF) og interleukin (IL-1), har blitt vist å være kritiske mediatorer av septisk sjokk. Disse cytokiner har en direkte toksisk virkning på vev; de aktiverer også fosfolipase A2. Disse og andre virkninger leder til økte konsentrasjoner av blodplate-aktiverende faktor, promotering av nitrogenmonoksid syntase aktivitet, promotering av vev infiltrering av nevtrofiler, og promotering av nøytrofil aktivitet.
Behandlingen av sepsis og septisk sjokk forblir en klinisk gåte, og nylige prospektive forsøk med biologiske responsmodifikatorer (dvs. anti-TNF, anti-MIF) rettet mot den inflammatoriske responsen har vist bare beskjeden klinisk nytte. Nylig har interessen skiftet mot terapier rettet mot å reversere de medfølgende periodene med immunundertrykking. Studier i forsøksdyr og kritisk syke pasienter har demonstrert ved økt apoptose av lymfoide organer og noen parenchymale vev bidra til denne immunundertrykkingen, anergy, og organ system dysfunksjon. I løpet av sepsis-syndromer kan lymfocytt apoptose bli utløst av fraværet av IL-2 eller av frigjørelsen av glukokortikoider, granzymer, eller de såkalte 'død' cytokinene: tumornekrose-faktor alfa eller Fas ligand. Apoptose går via auto-aktivering av cytosolisk og/eller mitokondrien kaspaser, som kan være påvirket av de pro- og anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien. I forsøksdyr, ikke bare kan behandling med inhibitorer av apoptose forhindre lymfoid celle apoptose; det kan også forbedre resultat. Selv om kliniske studier med anti-apoptotisk midler forblir fjernt grunnet for en stor del i tekniske problemer assosiert med deres administrasjon og vev-målretting, representerer inhibering av lymfocytt apoptose et attraktivt terapeutisk mål for den septiske pasienten. Likeledes kan et dobbelt-spesifikt middel som målretter både inflammatorisk mediator og en apoptotisk mediator, ha ytterligere nytte. Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår DVD-Ig'er i stand til å binde et eller flere mål involvert i sepsis, i en utførelsesform to mål, valgt fra gruppen bestående TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, Toll-like reseptorene, TLR-4, vev faktor, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOKS1, midkine, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, og TREM1. Effekten av slike DVD-Ig'er for sepsis kan bli vurdert i prekliniske dyremodeller kjent i teknikken (se Buras JA, et al.,(2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65 og Calandra T, et al, (2000) Nat Med. 6(2): 164-70).
7. Nevrologiske forstyrrelser
7.1. Nevrodegenerative sykdommer
Nevrodegenerative sykdommer er enten kroniske i hvilket tilfelle de vanligvis er alders-avhengige eller akutte (f.eks., hjerneslag, traumatisk hjerneskade, ryggmargskade, osv.). De erkarakterisert vedprogressivt tap av nevronale funksjoner (nevronal celledød, akson-tap, neuritisk dystrofi, demyelinering), tap av mobilitet og tap av hukommelse. Fremvoksende kunnskap om mekanismene som ligger under kronisk nevrodegenerative sykdommer (f.eks., Alzheimers sykdom) viser en kompleks etiologi og en rekke faktorer har blitt anerkjent å bidra til deres utvikling og progresjon f.eks.,alder, glykemisk status, amyloid produksjon og multimerisering, akkumulering av "advanced glycation end-products" (AGE) som binder til deres reseptor RAGE (reseptor for AGE), økt oksidativt stress i hjernen, minsket cerebralt blodomløp, neuroinflammasjon inkludert frigjørelse av inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, nevronal dysfunksjon og mikroglial aktivering. Følgelig representerer disse kronisk nevrodegenerative sykdommer en kompleks interaksjon mellom flere celletyper og mediatorer. Behandling strategier for slike sykdommer er begrenset og består for det meste av enten å blokkere inflammatorisk prosesser med ikke-spesifikke anti-inflammatorisk midler (f.eks., kortikosteroider, COKS inhibitorer) eller midler for å forhindre tap av nevroner og/eller synaptiske funksjoner. Disse behandlinger mislykkes i å stoppe sykdomsprogresjon. Nylige studier foreslår ved mer målrettede terapier slik som antistoffer til løselig A-b peptid (inkludert de A-b oligomere former) ikke bare kan hjelpe å stoppe sykdomsprogresjon men kan hjelpe å opprettholde hukommelse og andre kognitive funksjoner også. Disse foreløpige observasjoner foreslår ved spesifikke terapier målrette mer enn en sykdomsmediator (f.eks.,A-b og et pro-inflammatorisk cytokin slik som TNF) kan tilveiebringe enda bedre terapeutisk effekt for kronisk nevrodegenerative sykdommer enn observert ved å målrette en enkelt sykdomsmekanisme (f.eks.,løselig A-b alene) (se CE. Sheferd, et al, Neurobiol Aging. 2005 Okt 24; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11:3335; William L. Klein.; Neurochem Int. 2002 ;41:345; Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005 ;2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005;11:556-61; Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13; og Eliezer Masliah, et al, Neuron. 2005;46:857).
DVD-Ig-molekylene ifølge oppfinnelsen kan binde et eller flere mål involvert i Kronisk nevrodegenerative sykdommer slik som Alzheimers. Slike mål inkluderer, men er ikke begrenset til, enhver mediator, løselig eller Celleoverflate, impliserte i AD patogenese f.eks. AGE (S100 A, amfoterin), pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks., IL-1), kjemokiner (f.eks., MCP 1), molekyler som inhiberer nerve regenerering (f.eks., Nogo, RGM A), molekyler som forbedrer neurite vekst (nevrotrofiner) og molekyler som kan formidle transport ved blod-hjerne barrieren (f.eks., transferrin reseptor, insulin reseptor eller RAGE). Effekten av DVD-Ig-molekyler kan bli validert i pre-kliniske dyremodeller slik som den transgene musen som over-uttrykker amyloid forløper protein eller RAGE og utvikler Alzheimers sykdomsliknende symptomer. I tillegg kan DVD-Ig-molekyler bli konstruert og utprøvd for effekt i dyremodellene og det beste terapeutiske DVD-Ig'et kan bli valgt for utprøving i menneskelige pasienter. DVD-Ig-molekyler kan også bli anvendt for behandling av andre nevrodegenerative sykdommer slik som Parkinsons sykdom. Alfa-Synuclein er involvert i Parkinsons patologi. Et DVD-Ig i stand til målrette alfa-synuclein og inflammatoriske mediatorer slik som TNF, IL-1, MCP-1 kan vise seg som effektiv terapi for Parkinsons sykdom og er påtenkt i oppfinnelsen.
Alternativt et DVD-Ig i stand til målrette alfa-synuclein og RGM en kunne ikke bare halt the patologisk progress i the substantia nigra of Parkinson sykdom pasienter men kunne også resulterer i regenerative vekst of damaged neurites fordi RGM en har blitt nylig vist å være strongly upregulated i dette område i PD pasienter (Bossers K. et al. (2009) Brain Pathol. 19: 91 - 107).
7.2 Nevronal Regenerering og Ryggmargskade
Til tross for en økning i kunnskap om de patologiske mekanismene, er ryggmargskade (SCI) fortsatt en ødeleggende tilstand og representerer en medisinsk indikasjonkarakterisert vedet høyt medisinsk behov. De fleste ryggmargskader er konfusjons- eller kompressjonsskader og den primære skaden er vanligvis etterfulgt av sekundære skademekanismer (inflammatoriske mediatorer f.eks., cytokiner og kjemokiner) som forverrer den innledende skaden og resulterer i betydelig enlargement av lesjonsområdet, noen ganger mer enn 10-ganger. Disse primær og sekundær mekanismer i SCI ligner veldig på de i hjerneskade forårsaket på andre måter, f.eks., traumer og hjerneslag. Ingen tilfredsstillende behandling eksisterer og høy dose bolus injisering av metylprednisolon (MP) er den anvendte terapien innenfor et smalt tidsvindu på 8 timer etter skade. Denne behandlingen, imidlertid, er bare ment for å forhindre sekundær skade uten å forårsake noen betydelig funksjonell gjenvinning. Den er sterkt kritisert for mangelen av utvetydig effekt og alvorlig ugunstige virkninger, som immunundertrykking med etterfølgende infeksjoner og alvorlig histopatologiske muskelforandringer. Ingen andre legemidler, biologika eller små molekyler, stimulerende det endogene regenerative potensialet er godkjent, men lovende behandlingsprinsipper og legemiddel kandidater har vist effekt i dyremodeller av SCI i senere år og første lovende kliniske data har blitt presentert nylig. I en stor grad mangelen av funksjonell gjenvinning i human SCI er forårsaket av faktorinhiberende neurite-vekst, ved lesjon seter, i arr vev, i myelin så vel som på skade-assosierte-celler. Slike faktorer er de myelin-assosierte proteinene NogoA, OMgp og MAG, RGM A, det arr-assosierte CSPG (Kondroitin Sulfat Proteoglykaner) og inhiberende faktorer på reaktive astrocytter (some semaforins og efrins). Imidlertid, ved lesjonssetet er ikke bare vekst inhiberende molekyler funnet men også neurite vekst stimulerende faktorer som nevrotrofiner, laminin, LI og andre. Dette ensemblet av neurite vekst inhiberende og vekst promoterende molekyler kan forklare at å blokkere enkelte faktorer, som NogoA eller RGM A, resulterte i betydelig funksjonell gjenvinning i gnager SCI modeller, fordi en reduksjon av de inhiberende påvirkninger kunne skifte balansen fra vekst-inhibering til vekst promotering. Imidlertid, gjenvinningen observert med å blokkere et enkelt neuriteutvekst-inhiberende molekyl var ikke komplett. For å oppnå raskere og mer uttalt gjenvinningen enten å blokkere to neuriteutvekst-inhiberende molekyler f.eks. Nogo og RGM A, eller å blokkere et neuriteutvekst-inhiberende molekyl og forsterke funksjoner of et neuriteutvekst-forsterkende molekyl f.eks. Nogo og nevrotrofiner, eller å blokkere et neuriteutvekst-inhiberende molekyl f.eks.,Nogo og et pro-inflammatorisk molekyl f.eks.,TNF, kan være ønskelig (se McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003;26:193; Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sei. 2005;233:43; Milan Makwanal, et al., FEBS J. 2005;272:2628; Barry J. Dickson, Science. 2002;298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005;79:273; Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al, J. Neurochem.2004; 91; 1018).
I et aspekt, DVD-Ig'er i stand til å binde mål-par slik som NgR og RGM A; NogoA og RGM A; MAG og RGM A; OMGp og RGM A; RGM en og RGM B; RGM en og Semaforin 3A; RGM en og Semaforin 4; CSPGs og RGM A; aggrecan, midkine, neurocan, versican, fosfacan, Te38 og TNF-a; AB globulomer-spesifikke antistoffer kombinert med antistoffer promoterende dendritt & akson-utvekst er tilveiebrakt. Dendritt patologi og akson skade, eller neuritisk dystrofi er et veldig tidlig tegn på AD og det er kjent at NOGO en begrenser dendritt vekst og at de andre molekylene assosiert med myelin og nevnt over feks., RGM A, MAG, OMGp hemmer aksonal gjenvekst. Man kan kombinere slike typer av ab med enhver av SCI-kandidatene (myelin-proteiner) Ab. Andre DVD-Ig mål kan inkludere enhver kombinasjon av NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG eller Omgp. Videre mål kan også inkludere enhver mediator, løselig eller Celleoverflate, impliserte i inhibering av neurite f.eks. Nogo, Ompg, MAG, RGM A, semaforins, efrins, løselig A-b, pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks., IL-1), kjemokiner (f.eks., MIP la), molekyler som inhiberer nerve regenerering. Effekten av anti-nogo / anti-RGM en eller lignende DVD-Ig-molekyler kan bli validert i pre-kliniske dyremodeller av ryggmargskade. I tillegg kan disse DVD-Ig-molekyler bli konstruert og utprøvd for effekt i dyremodellene og det beste terapeutiske DVD-Ig'et kan bli valgt for utprøving i menneskelige pasienter. I tillegg kan DVD-Ig-molekyler bli konstruert som målrettes til to distinkte ligand-bindende seter på en enkelt reseptor f.eks., Nogo reseptor som binder tre ligand Nogo, OMGp, og MAG og RAGE som binder A-b og S100 A. Videre, neurit-utvekst inihibitorer f.eks., nogo og nogo reseptor, spiller også en rolle i å forhindre nerve regenerering i immunologiske sykdommer som multippel sklerose. Inhibering av nogo-nogo reseptor-interaksjon har blitt vist å forbedre gjenvinning i dyremodeller av multippel sklerose. Derfor, DVD-Ig-molekyler som kan blokkere funksjonen til en immun mediator f.eks., et cytokin som IL-12 og et neurit-utvekst inhibitor molekyl f.eks., nogo eller RGM kan tilby raskere og større effekt enn å blokkere enten et immun eller et neurit-utvekst inhibitor molekyl alene.
Generelt krysser ikke antistoffer blod-hjerne barrieren (BBB) på en effektiv og relevant måte. Imidlertid, i visse nevrologiske sykdommer, f.eks., hjerneslag, traumatisk hjerneskade, multippel sklerose, osv., BBB kan bli svekket og tillater for økt penetrering av DVD-Ig'er og antistoffer inn i hjernen. I andre nevrologisk tilstander, hvor BBB lekkasjer ikke forekommer, kan man anvende målrettingen av endogene transport systemer, inkludert bærer-medierte transportere slik som glukose og aminosyre bærere og reseptor-mediert transcytose-formidlende celle strukturer/reseptorer ved det vaskulære endothelium av BBB, følgelig muligjørende trans-BBB transport av DVD-Ig'et. Strukturer ved BBB muligjørende slik transport inkluderer men er ikke begrenset til insulin-reseptoren, transferrin reseptor, LRP og RAGE. I tillegg, strategier som muliggjør anvendelsen av DVD-Ig'er også as shuttles for å transportere potensielle legemidler inn i CNS inkludert lav molekylvekt legemidler, nanopartikler og nukleinsyrer (Coloma MJ, et al. (2000) Pharm Res. 17(3):266-74; Boado RJ, et al. (2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55).
DVD-Ig'er i stand til å binde de etterfølgende par med mål for å behandle nevrologisk sykdom er påtenkt: Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF og Abeta (sekv. 2); IL-lb og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2); IGF 1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF og Abeta (sekv.3); IL-lb og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF og Abeta (sekv. 1); IL-lb og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-lb; NGF og IL-6; TNF og EGFR (sekv. 2); TNF og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv. 2); RGMA og TNF (se Eksempler 2.1 to 2.27)
8. Onkologiske forstyrrelser
Monoklonalt-antistoff terapi har stått frem som en viktig terapeutisk modalitet for kreft (von Mehren, M, et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69). Antistoffer kan utøve antitumor virkninger ved å indusere apoptose, redirigert cytotoksisitet, interferere med ligand-reseptor-interaksjoner, eller forhindre uttrykkingen av proteiner som er kritiske for den neoplastiske fenotypen. I tillegg kan antistoffer målrette komponenter i tumor-mikromiljøet, for å forstyrre vitale strukturer slik som dannelsen av tumor-assosiert vaskulatur. Antistoffer kan også målrette reseptorer hviss ligander er vekstfaktorer, slik som epidermal-vekstfaktor reseptoren. Antistoffet inhiberer følgelig naturlige ligander, som stimulerer celle vekst, fra å binde til målrettede tumorceller. Alternativt kan antistoffer indusere et anti-idiotype nettverk, komplement-mediert cytotoksisitet, eller antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Anvendelsen av dobbelt-spesifikke antistoff som målrettes mot to separate tumor mediatorer vil sannsynligvis gi ytterligere nytte sammenlignet med en mono-spesifikk terapi.
I en annen utførelsesform er en DVD ifølge oppfinnelsen i stand til å binde VEGF og fosfatidylserin; VEGF og ErbB3; VEGF og PLGF; VEGF og ROB04; VEGF og BSG2; VEGF og CDCP1; VEGF og ANPEP; VEGF og c-MET; HER-2 og ERB3; HER-2 og BSG2; HER-2 og CDCP1; HER-2 og ANPEP; EGFR og CD64; EGFR og BSG2; EGFR og CDCP1; EGFR og ANPEP; IGF IR og PDGFR; IGF IR og VEGF; IGF IR og CD20; CD20 og CD74; CD20 og CD30; CD20 og DR4; CD20 og VEGFR2; CD20 og CD52; CD20 og CD4; HGF og c-MET; HGF og NRP1; HGF og fosfatidylserin; ErbB3 og IGF IR; ErbB3 og IGF 1,2; c-Met og Her-2; c-Met og NRP1; c-Met og IGF IR; IGF1,2 og PDGFR; IGF1,2 og CD20; IGF1,2 og IGF IR; IGF2 og EGFR; IGF2 og HER2; IGF2 og CD20; IGF2 og VEGF; IGF2 og IGF IR; IGF1 og IGF2; PDGFRa og VEGFR2; PDGFRa og PLGF; PDGFRa og VEGF; PDGFRa og c-Met; PDGFRa og EGFR; PDGFRb og VEGFR2; PDGFRb og c-Met; PDGFRb og EGFR; RON og c-Met; RON og MTSP1; RON og MSP; RON og CDCP1; VGFR1 og PLGF; VGFR1 og RON; VGFR1 og EGFR; VEGFR2 og PLGF; VEGFR2 og NRP1; VEGFR2 og RON; VEGFR2 og DLL4; VEGFR2 og EGFR; VEGFR2 og ROB04; VEGFR2 og CD55; LP A og SIP; EFB2 og RON; CTLA4 og VEGF; CD3 og EPCAM; CD40 og IL6; CD40 og IGF; CD40 og CD56; CD40 og CD70; CD40 og VEGFR1; CD40 og DR5; CD40 og DR4; CD40 og APRIL; CD40 og BCMA; CD40 og RANKL; CD28 og MAPG; CD80 og CD40; CD80 og CD30; CD80 og CD33; CD80 og CD74; CD80 og CD2; CD80 og CD3; CD80 og CD19; CD80 og CD4; CD80 og CD52; CD80 og VEGF; CD80 og DR5; CD80 og VEGFR2; CD22 og CD20; CD22 og CD80; CD22 og CD40; CD22 og CD23; CD22 og CD33; CD22 og CD74; CD22 og CD19; CD22 og DR5; CD22 og DR4; CD22 og VEGF; CD22 og CD52; CD30 og CD20; CD30 og CD22; CD30 og CD23; CD30 og CD40; CD30 og VEGF; CD30 og CD74; CD30 og CD19; CD30 og DR5; CD30 og DR4; CD30 og VEGFR2; CD30 og CD52; CD30 og CD4; CD138 og RANKL; CD33 og FTL3; CD33 og VEGF; CD33 og VEGFR2; CD33 og CD44; CD33 og DR4; CD33 og DR5; DR4 og CD137; DR4 og IGF1,2; DR4 og IGF IR; DR4 og DR5; DR5 og CD40; DR5 og CD137; DR5 og CD20; DR5 og EGFR; DR5 og IGF 1,2; DR5 og IGFR, DR5 og HER-2, og EGFR og DLL4. Andre mål kombinasjoner inkluderer en eller flere medlemmer av EGF/erb-2/erb-3 familien. Andre mål (en eller flere) involvert i onkologiske sykdommer som DVD-Ig'er kan binde inkluderer, men er ikke begrenset til de valgt fra gruppen bestående av: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF IR, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENOl, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOKS5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRHl, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRHl, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9,
MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1,
CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, EN02, EN03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIPI, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAU, KRT2A, MIB1, PARTI, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2,
TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAGI, KDR,
LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAU, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EFB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-cadherin), CDKN1B (p27Kipl), CDKN2A (pl6INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenin), CTSB (cathepsin B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (Gelsolin), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glycoprotein 130), ITGA6 (a6 integrin), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspin), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (trombospondin-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerase lia), TP53, AZGP1 (sink-a-glycoprotein), BPAG1 (plectin), CDKN1A (p21Wapl/Cipl), CLDN7 (claudin-7), CLU (clusterin), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectin), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 integrin), ITGB4 (b 4 integrin), KLF5 (GC Boks BP), KRT19 (Keratin 19), KRTHB6 (hair-spesifikke type II keratin), MACMARCKS, MT3 (metallotionectin-III), MUC1 (mucin), PTGS2 (COKS-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipofilin B), SCGB2A1 (mammaglobin 2), SCGB2A2 (mammaglobin 1), SPRR1B (Spri), THBS1, THBS2, THBS4, og TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fofatidylserine, ROB04, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR,
VEGFR1, MTSP1, MSP, EFB2, EFA1, EFA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA,
MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1, og CD59.
IV. Farmasøytiske sammensetninger
Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger omfattende et bindende protein, ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. De farmasøytiske sammensetningene omfattende bindende proteiner ifølge oppfinnelsen er for anvendelse i, men ikke begrenset til, å diagnosere, å detektere, eller å monitorere en forstyrrelse, i å forhindre, å behandle, å håndtere, eller å forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav, og/eller i forskning. I en spesifikk utførelsesform omfatter en sammensetning en eller flere bindende proteiner ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelsesform omfatter den farmasøytiske sammensetningen en eller flere bindende proteiner ifølge oppfinnelsen og en eller flere profylaktiske eller terapeutiske midler andre enn bindende proteiner ifølge oppfinnelsen for å behandle en forstyrrelse. I en utførelsesform, de profylaktiske eller terapeutiske midler kjent å være nyttig for eller som har blitt eller for tiden blir anvendt i forhindringen, behandling, håndtering, eller forbedring av en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav. I henhold til disse utførelsesformer, kan sammensetningen videre omfatte en bærer, fortynner eller eksipient.
De bindende proteinene ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert inn i farmasøytiske sammensetninger passende for administrasjon til et subjekt. Typisk omfatter den farmasøytiske
sammensetningen et bindende protein ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Som anvendt heri, "farmasøytisk akseptabel bærer" inkluderer enhver og alle løsemidler, dispersjonsmedia, belegg, antibakteriske og antifungale midler, isotonisk og absorpsjon forsinkende midler, og lignende som er fysiologisk kompatible. Eksempler på farmasøytisk akseptable bærere inkluderer en eller flere av vann, saltløsning, Fosfatbufret saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol og lignende, så vel som kombinasjoner derav. I noen utførelsesformer, isotoniske midler, for eksempel, sukkere, polyalkoholer slik som mannitol, sorbitol, eller natriumklorid, er inkludert i sammensetningen. Farmasøytisk akseptable bærere kan videre omfatte små mengder av hjelpestoffer slik som fuktende eller emulserende midler, konserveringsmidler eller buffere, som forbedrer holdbarheten eller effektiviteten til antistoffet eller antistoff-porsjonen.
Diverse levering systemer er kjent og kan bli anvendt for å administrere en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen eller kombinasjonen av en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen og et profylaktisk middel eller terapeutisk middel nyttig for forhindre, å håndtere, å behandle, eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav, f.eks., innkapsling i liposomer, mikropartikler, mikrokapsler, rekombinante celler i stand til å uttrykke antistoffet eller antistoff fragment, reseptor- mediert endocytose (se, f.eks., Wu og Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), konstruksjon av en nukleinsyre som en del av en retroviral eller andre vektor, osv. Metoder for å administrere et profylaktisk eller terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, parenteral administrasjon (f.eks., intradermal, intramuskulær, intraperitonalt, intravenøs og subkutan), epidural-administrasjon, intratumoral administrasjon, og slimhinnel administrasjon (f.eks., intranasale og orale ruter). I tillegg, pulmonær administrasjon kan bli anvendt, f.eks., ved anvendelse av en inhalator eller forstøver, og formulering med et aerosolerende middel. Se, f.eks., U.S. Pat. Nr. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; og 4,880,078; og PCT Publikasjonsnrs. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; og WO 99/66903, hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet. I en utførelsesform, et bindende protein ifølge oppfinnelsen, kombinasjonsterapi, eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen er administrert ved å bruke Alkermes AIR® pulmonær legemiddel levering teknologi (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). I en spesifikk utførelsesform, profylaktiske eller terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen er administrert intramuskulært, intravenøst, intratumorert, oralt, intranasalt, pulmonært, eller subkutant. De profylaktiske eller terapeutiske midler kan bli administrert ved enhver praktisk rute, for eksempel ved infusjon eller bolus injisering, ved absorpsjon gjennom epithele eller mucokutane overflater (f.eks., oral slimhinne, rektal og intestinal slimhinne, osv.) og kan bli administrert sammen med andre biologisk aktive midler. Administrasjon kan være systemisk eller lokal.
I en utførelsesform kan spesifikk binding av antistoff-koblet karbon nanorør (CNTs) til tumorceller in vitro, etterfulgt av deres i høy grad spesifikke ablasjon med nær-infrarødt (NTR) lys bli anvendt for å målrette tumorceller. For eksempel kan biotinylerte polare lipider bli anvendt for å fremstille stabil, biokompatibel, noncytotoksisk CNT dispersjoner som deretter blir knyttet til en eller to forskjellige neutralite avidin-derivatisert DVD-Ig'er rettet mot en eller flere tumor antigener (f.eks., CD22) (Chakravarty, P. et al. (2008) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 105:8697-8702.
I en spesifikk utførelsesform kan det være ønskelig for å administrere de profylaktiske eller terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen lokalt til området i behov av behandling; dette kan bli oppnådd ved, for eksempel, og ikke som en begrensning, lokal infusjon, ved injisering, eller ved hjelp av et
implantat, nevnte implantat er i et porøst eller ikke-porøst material, inkludert membraner og matriser, slik som sialastiske membraner, polymerer, fibrøse matriser (f.eks., Tissuel®), eller kollagen matriser. I en utførelsesform, en effektiv mengde av en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen antagonister er administrert lokalt til det påvirkede området til et subjekt for å forhindre, behandle, håndtere, og/eller forbedre en forstyrrelse eller et symptom derav. I en annen utførelsesform, en effektiv mengde av en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen er administrert lokalt til det påvirkede området i kombinasjon med en effektiv mengde av en eller flere terapier (f.eks., en eller flere profylaktiske eller terapeutiske midler) andre enn et bindende protein ifølge oppfinnelsen til et subjekt for å forhindre, behandle, håndtere, og/eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav.
I en annen utførelsesform kan det profylaktiske eller terapeutiske middelet bli levert i et kontrollert frigjørelses eller vedvarende frigjørelses system. I en utførelsesform kan en pumpe bli anvendt for å oppnå kontrollert eller vedvarende frigjørelse (se Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). I en annen utførelsesform, polymermaterialer kan bli anvendt for å oppnå kontrollert eller vedvarende frigjørelse av terapiene ifølge oppfinnelsen (se f.eks., Medical Application of Contolled Release, Langer og Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen og Ball (eds.), Wiley, Ny York (1984); Ranger og Peppas, 1983, J., Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61; se også Levy et al., 1985, Science 228:190; I løpet av et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. Nr. 5,679,377; U.S. Pat. Nr. 5, 916,597; U. S. Pat. Nr. 5,912,015; U.S. Pat. Nr. 5,989,463; U.S. Pat. Nr. 5,128,326; PCT Publikasjonsnr. WO 99/15154; og PCT Publikasjonsnr. WO 99/20253. Eksempler på polymerer anvendt i formuleringer for vedvarende frigjørelse inkluderer, men er ikke begrenset til, poly(2-hydroksy etyl metakrylat), poly(metyl metakrylat), poly(akrylsyre), poly(etylen-co-vinyl acetat), poly(metakrylsyre), polyglykolider (PLG), polyanhydrider, poly(N- vinyl pyrrolidon), poly(vinylalkohol), polyakrylamid, poly(etylenglykol), polylaktider (PLA), poly(laktid-co-glykolider) (PLGA), og polyortoestere. I en utførelsesform er polymeren anvendt i en vedvarende frigjørelses formulering inert, fri for lekkbare urenheter, stabil ved lagring, steril, og bio-nedbrytbare. I nok en annen utførelsesform, et kontrollert eller vedvarende frigjørelses system kan bli plassert i nærhet av det profylaktiske eller terapeutiske målet, og må følgelig bare ha en del av systemisk dose (se, f.eks., Goodson, i Medical Application of Contolled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Kontrollert frigjørelses systemer er diskutert i oversiktsartikkelen av Langer (1990, Science 249:1527-1533). Enhver teknikk kjent for fagmannen kan bli anvendt for å produsere vedvarende frigjørelse formuleringer omfattende en eller flere terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen. Se, f.eks., U. S. Pat. Nr. 4,526, 938, PCT-publikasjon WO 91/05548, PCT-publikasjon WO 96/20698, Ning et al. , 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft By using a Sustained Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al, 1995, "Antibody-mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emultions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Bio-degradeable Polymer Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'1. Symp. Kontroll. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, og Lam et al., 1997, "Mikroencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proe. Int'1. Symp. Kontroll Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760, hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet.
I en spesifikk utførelsesform, hvor sammensetningen ifølge oppfinnelsen er en nukleinsyre som koder for et profylaktisk eller terapeutisk middel, nukleinsyren kan bli administrert in vivo for å promotere uttrykking av dets kodete profylaktiske eller terapeutiske middel, ved å konstruere det som en del av en passende nukleinsyre-uttrykkingsvektor og å administrere det slik at det blir intracellulært, f.eks., ved anvendelse av en retroviral vektor (se U. S. Pat. Nr. 4,980,286), eller ved direkte injisering, eller ved anvendelse av mikropartikkelbombardering (f.eks., en genpistol; Biolistic, Dupont), eller belegging med lipider eller celleoverflate reseptorer eller transfeksjonsmidler, eller av å administrere det i sammenkobling til et homeoboks-liknende peptid som er kjent å gå inn i kjernen (se, f.eks., Joliot et al, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:1864-1868). Alternativt, en nukleinsyre kan bli introdusert intracellulært og inkorporert innenfor vertscelle DNA for uttrykking av homolog rekombinasjon.
En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen er formulert for å være kompatibel med dets tiltenkte administrasjonsform. Eksempler på adminstrasjonsformer inkluderer, men er ikke begrenset til, parenteral, f.eks., intravenøs, intradermal, subkutan, oral, intranasal (f.eks., inhalering), transdermal (f.eks., topisk), transmukosal, og rektal administrasjon. I en spesifikk utførelsesform, sammensetningen er formulert i henhold til rutinemessige prosedyrer som en farmasøytisk sammensetning tilpasset for intravenøs, subkutan, intramuskulær, oral, intranasal, eller topisk administrasjon til mennesker. Typisk, sammensetninger for intravenøs administrasjon er løsninger i steril isotonisk vandig buffer. Hvor nødvendig, kan sammensetningen inkludere også et oppløsningsmiddelog et lokalt anestetika slik som lignocamne for å lette smerte ved injiseringssetet.
Hvis sammensetningene ifølge oppfinnelsen skal bli administrert topisk kan sammensetningene bli formulert i form av en salve, krem, transdermalt plaster, lotion, gel, shampoo, spray, aerosol, løsning, emulsjon, eller andre form velkjent for en fagmann. Se, f.eks., Remingtons Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). I en utførelsesform, for ikke-spraybare topiske doseformer, viskøs til halvfaste eller faste former omfattende en bærer eller en eller flere eksipienter kompatible med topisk anvendelse og som har en dynamisk viskositet større enn vann blir anvendt. Passende formuleringer inkluderer, uten begrensning, løsninger, suspensjoner, emulsjoner, kremer, ointments, pulvere, linimenter, salver, og lignende, som er, Hvis ønsket, sterilisert eller blandet med hjelpestoffer (f.eks., konserveringsmidler, stabilisatorer, fuktingsmidler, buffere, eller salter) for å påvirke diverse egenskaper, slik som, for eksempel, osmotisk trykk. Andre passende topiske doseformer inkluderer spraybare aerosol preparater hvori den aktive ingrediensen, i en utførelsesform, i kombinasjon med et fast stoff eller inert væskebærer, er pakket i en blanding med et trykksatt flyktig middel (f.eks., et drivmiddel på gassform, slik som freon) eller i en klemmeflaske. Fuktighetsmidler eller fuktmidler kan også være tilsatt til farmasøytiske sammensetninger og doseformer hvis ønsket. Eksempler på slike ytterligere ingredienser er velkjent i teknikken.
Hvis metoden ifølge oppfinnelsen omfatter intranasal administrasjon av en sammensetning, kan sammensetningen bli formulert på en aerosol form, spray, tåke eller i form av dråper. Spesielt kan profylaktiske eller terapeutiske midler for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen bli praktisk levert i form av en aerosolspray-presentasjon fra trykksatte beholdere eller en forstøver, med anvendelsen av et passende drivmiddel (f.eks., diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller annen passende gass). I tilfellet av en trykksatt aerosol kan doseenheten bli bestemt ved å tilveiebringe en ventil for å levere en oppmålt mengde. Kapsler og kassetter (bestående av, f.eks., gelatin) for anvendelse i en inhalator eller insufflator kan bli formulert inneholdende en pulverblanding av forbindelsen og en passende pulverbase slik som laktose eller stivelse.
Hvis metoden ifølge oppfinnelsen omfatter oral administrasjon, sammensetninger kan bli formulert oralt i form av tabletter, kapsler, cachets, gelcaps, løsninger, suspensjoner, og lignende.
Tabletter eller kapsler kan bli fremstilt ved konvensjonelle måter med farmasøytisk akseptable eksipienter slik som bindende midler (f.eks., pregelatinert maisstivelse, polyvinylpyrrolidon, eller
hydroksypropyl metylcellulose); fyllstoffer (f.eks., laktose, mikrokrystallinsk cellulose, eller kalsium hydrogen fosfat); smøremidler (f.eks., magnesiumstearat, talkum, eller silika); disintegreringsmidler (f.eks., potetstivelse eller natrium stivelse glykolat); eller fuktingsmidler (f.eks., natriumlaurylsulfat).
Tablettene kan bli belagt ved metoder velkjent i teknikken. Væskepreparater for oral administrasjon kan ta form av, men ikke begrenset til, løsninger, siruper eller suspensjoner, eller de kan bli presentert som et tørt produkt for rekonstituering med vann eller andre passende vehikel før anvendelse. Slike væskepreparater kan bli fremstilt ved konvensjonelle måter med farmasøytisk akseptable tilsetningsstoffer slik som suspenderende midler (f.eks., sorbitol sirup, cellulose derivater, eller hydrogenerte spiselige fett); emulserende midler (f.eks., lecithin eller acacia); ikke-vandige vehikler (f.eks., mandelolje, oljeholdige estere, etyl alkohol, eller fraksjonerte vegetabilske oljer); og konserveringsmidler (f.eks., metyl eller propyl-p- hydroksybenzoater eller sorbinsyre). Preparatene kan også inneholde buffer salter, smaksstoffer, fargestoffer, og søtningsmidler ettersom det passer. Preparater for oral administrasjon kan bli passende formulert for treg frigjørelse, kontrollert frigjørelse, eller vedvarende frigjørelse av et profylaktisk eller terapeutisk middel(ler).
Metoden ifølge oppfinnelsen kan omfatte pulmonær administrasjon, f.eks., ved anvendelse av en inhalator eller forstøver, av en sammensetning formulert med et aerosolerende middel. Se, f.eks., U.S. Pat. Nr. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; og 4,880,078; og PCT Publikasjonsnrs. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; og WO 99/66903, hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet. I en spesifikk utførelsesform, et bindende protein ifølge oppfinnelsen, kombinasjonsterapi, og/eller sammensetning ifølge oppfinnelsen er administrert ved å bruke Alkermes AIR® pulmonær legemiddel levering teknologi (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
Metoden ifølge oppfinnelsen kan omfatte administrasjon av en sammensetning formulert for parenteral administrasjon ved injisering (f.eks., ved bolus injisering eller kontinuerlig infusjon). Formuleringer for injisering kan bli presentert i enhetsdoseform (f.eks., i ampuller eller i multi-dose beholdere) med et tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan ta slike former som suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljeholdige eller vandige vehikler, og kan inneholde formuleringsmidler slik som suspenderende, stabiliserende og/eller dispergerende midler. Alternativt, den aktive ingrediensen kan bli i pulver form for rekonstituering med en passende vehikel (f.eks., sterilt pyrogenfritt vann) før anvendelse.
Metodene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte administrasjon av sammensetninger formulert som depot preparater. Slike langtvirkende formuleringer kan bli administrert ved implantering (f.eks., subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injisering. Følgelig, for eksempel, sammensetningene kan bli formulert med passende polymere eller hydrofobe materialer (f.eks., som en emulsjon i en akseptabel olje) eller ionebytte-materiale, eller som svakt løselige derivater (f.eks., som et svakt løselig salt).
Metodene ifølge oppfinnelsen omfatter administrasjon av sammensetninger formulert som
nøytrale- eller salt-former. Farmasøytisk akseptable salter inkluderer de dannet med anioner slik som de avledet fra saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, osv., og de dannet med kationer slik som de avledet fra natrium, kalium, ammonium, kalsium, jernhydroksider, isopropylamin, trietylamin, 2- etylamino etanol, histidin, prokain, osv.
Generelt er ingrediensene til sammensetningene levert enten hver for seg eller blandet sammen i enhetsdoseform, for eksempel, som et tørt frysetørket pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder slik at en ampulle eller dosepose indikerer mengden av aktivt middel. Hvor administrasjonsmodus er infusjon kan sammensetningen bli levert med en infusjonsflaske inneholdende sterilt farmasøytisk-grad vann eller saltløsning. Hvor administrasjonsmodus er ved injisering, en ampulle med sterilt vann for injisering eller saltløsning kan bli tilveiebrakt slik at ingrediensene kan bli blandet før administrasjon.
Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen også at en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midlene, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen er pakket i en hermetisk forseglet beholder slik at en ampulle eller dosepose indikerer mengden av midlet. I en utførelsesform, en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midlene, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen er levert som et tørt sterilisert frysetørket pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder og kan bli rekonstituert (f.eks., med vann eller saltløsning) til den passende konsentrasjonen for administrasjon til et subjekt. I en utførelsesform, en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midler eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen er levert som et tørt sterilt frysetørket pulver i en hermetisk forseglet beholder ved en enhetsdose på minst 5 mg, minst 10 mg, minst 15 mg, minst 25 mg, minst 35 mg, minst 45 mg, minst 50 mg, minst 75 mg, eller minst 100 mg. De frysetørkede profylaktiske eller terapeutiske midler eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen bør bli lagret ved mellom 2° C. og 8° C. i dets originale beholder og de profylaktiske eller terapeutiske midlene, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen bør bli administrert innenfor 1 uke, f.eks., innenfor 5 dager, inneni 72 timer, innenfor 48 timer, innenfor 24 timer, innenfor 12 timer, innenfor 6 timer, innenfor 5 timer, innenfor 3 timer, eller inneni 1 time etter å ha blitt rekonstituert. I en alternativ utførelsesform, en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midler eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen er levert i væskeform i en hermetisk forseglet beholder som indikerer mengden og konsentrasjon av midlet. I en utførelsesform, væskeformen til den administrerte sammensetningen er levert i en hermetisk forseglet beholder minst 0.25 mg/ml, minst 0.5 mg/ml, minst 1 mg/ml, minst 2.5 mg/ml, minst 5 mg/ml, minst 8 mg/ml, minst 10 mg/ml, minst 15 mg/kg, minst 25 mg/ml, minst 50 mg/ml, minst 75 mg/ml eller minst 100 mg/ml. Væskeformen bør bli lagret ved mellom 2° C. og 8° C. i dets originale beholder.
De bindende proteinene ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert inn i en farmasøytisk sammensetning passende for parenteral administrasjon. I en utførelsesform, antistoffet eller antistoff-porsjoner vil bli fremstilt som en injiserbar løsning inneholdende 0.1-250 mg/ml-bindende protein. Den injiserbare løsningen kan bestå av enten en væske eller frysetørket doseform i en grå eller gul "ampulle", ampulle eller pre-fyllt sprøyte. Bufferen kan være L-histidin (1-50 mM), optimalt 5-lOmM, ved pH 5.0 til 7.0 (optimalt pH 6.0). Andre passende buffere inkluderer men er ikke begrenset til, natriumsuksinat, natrium sitrat, natriumfosfat eller kaliumfosfat. Natriumklorid kan bli anvendt for å modifisere toksisiteten til løsningen ved en konsentrasjon på 0-300 mM (optimalt 150 mM for en væske dose form). Kryobeskyttelsesmidler kan bli inkludert for en frysetørket doseform, primært 0-10% sukrose (optimalt 0.5-1.0%). Andre passende kryobeskyttelsesmidler inkluderer trehalose og laktose. Fyllmidler kan bli inkludert for en frysetørket doseform, primært 1-10% mannitol (optimalt 2-4%). Stabilisatorer kan bli anvendt i både væske og frysetørket doseformer, primært 1-50 mM L-Metionine (optimalt 5-10 mM). Andre passende fyllmidler inkluderer glysin, arginin, kan bli inkludert som 0-0.05% polysorbat-80 (optimalt 0.005-0.01%). Ytterligere surfaktanter inkluderer men er ikke begrenset til polysorbat 20 og BRIJ surfaktanter. Den farmasøytiske sammensetningen omfattende de bindende proteinene ifølge oppfinnelsen fremstilt som en injiserbar løsning for parenteral administrasjon, kan videre omfatte et middel nyttig som en adjuvant, slik som de anvendt for å øke absorpsjonen, eller dispersjonen av et terapeutisk protein (f.eks., antistoff). En spesielt nyttig adjuvant er hyaluronidase, slik som Hylenx® (rekombinant human hyaluronidase). Tilsetning av hyaluronidase i den injiserbare løsningen forbedrer human biotilgjengelighet etter parenteral administrasjon, spesielt subkutan administrasjon. Det tillater også for større volumer ved injiseringsstedet (dvs. større enn 1 ml) med mindre smerte og ubehag, og minimum tilfeller av injiseringssted-reaksjoner. (se WO2004078140, og US2006104968 inkorporert heri ved referanse).
Sammensetningene ifølge denne oppfinnelsen kan være i en rekke former. Disse inkluderer, for eksempel, væske, halvfast og faste doseformer, slik som væskeløsninger ( f. eks., injiserbare og infusjonsbare løsninger), dispersjoner eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, liposomer og stikkpiller. Den valgte formen er avhengig av den tilsiktede administrasjonsmodus og terapeutisk anvendelse. Typiske sammensetninger er i form av injiserbar eller infusjonerbare løsninger, slik som sammensetninger lignende de anvendt for passiv immunisering av mennesker med andre antistoffer. Det valgte administrasjonsmodus er parenteral ( f. eks., intravenøs, subkutan, intraperitonalt, intramuskulær). I en utførelsesform er antistoffet administrert ved intravenøs infusjon eller injisering. I en annen utførelsesform er antistoffet administrert ved intramuskulær eller subkutan injisering.
Terapeutiske sammensetninger må typisk være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Sammensetningen kan bli formulert som en løsning, mikroemulsjon, dispersjon, liposome, eller andre ordnede strukturer passende for høy legemiddel konsentrasjon. Sterile injiserbar løsninger kan bli fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen ( dvs., antistoff eller antistoff-porsjonen) i den nødvendige mengden i et passende løsemiddel med en eller en kombinasjon av ingredienser listet opp heri, som nødvendig, etterfulgt av filtrert sterilisering. Generelt er dispersjoner fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen inn i en steril vehikel som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de nødvendige andre ingredienser fra de listet opp heri. I tilfellet av sterile, frysetørkede pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare løsninger, er fremstillingsmetodene vakuum tørking og spray-tørking som gir et pulver av den aktive ingrediensen pluss enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere steril-filtrert løsning derav. Den riktige fluiditeten til en løsning kan bli opprettholdt, for eksempel, ved anvendelsen av et belegg slik som lecithin, ved opprettholdelsen av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfellet av dispersjon og ved anvendelsen av surfaktanter. Forlenget absorpsjon av injiserbare sammensetninger kan bli oppnådd ved inkludert, i sammensetningen, et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel, monostearat-salter og gelatin.
De bindende proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert ved en rekke metoder kjent i teknikken, selv om det for mange terapeutiske anvendelser, i en utførelsesform, er ruten/administrasjonsmoduset subkutan injisering, intravenøs injisering eller infusjon. Som det vil bli satt pris på av fagmannen, ruten og/eller administrasjonsmodus vil variere avhengig av de ønskede resultatene. I visse utførelsesformer, den aktive forbindelsen kan bli fremstilt med en bærer som vil beskytte forbindelsen mot rask frigjørelse, slik som en kontrollert frigjørelses formulering, inkludert implantater, transdermalt plastere, og mikroinnkapslet levering systemer. Bio-nedbrytbare, biokompatible polymerer kan bli anvendt, slik som etylen vinyl acetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere, og polymelkesyre. Mange metoder for fremstillingen av slike formuleringer er patentert eller generelt kjent for fagmannen. S&, f. eks., Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Ny York, 1978.
I visse utførelsesformer kan et bindende protein ifølge oppfinnelsen bli oralt administrert, for eksempel, med en inert fortynner eller en assimilerbar spiselig bærer. Forbindelsen (og andre ingredienser, hvis ønsket) kan også bli lukket inn i gelatinkapsel med hardt eller mykt skall, komprimert inn i tabletter, eller inkorporert direkte inn i subjektets diett. For oral terapeutisk administrasjon, forbindelsene kan bli inkorporert med eksipienter og anvendt i form av inntakbar tabletter, bukkal tabletter, troches, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, wafers, og lignende. For å administrere en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved andre enn parenteral administrasjon, kan det være nødvendig å belegge forbindelsen med, eller ko-administrere forbindelsen med, et materiale for å forhindre dets inaktivering.
Supplerende aktive forbindelser kan også være inkorporert inn i sammensetningene. I visse utførelsesformer, et bindende protein ifølge oppfinnelsen er koformulert med og/eller koadministrert med en eller flere ytterligere terapeutiske midler som er nyttig for å behandle forstyrrelser med bindende protein ifølge oppfinnelsen. For eksempel, et bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli koformulert og/eller koadministrert med et eller flere ytterligere antistoffer som binder andre mål ( f. eks., antistoffer som binder andre cytokiner eller som binder celleoverflate-molekyler). Videre, en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt i kombinasjon med to eller flere av de forutgående terapeutiske midler. Slike kombinasjonsterapier kan fordelaktig benytte seg av lavere doser av de administrerte terapeutiske midler, følgelig unngå mulig toksisiteter eller komplikasjoner assosiert med de forskjellige monoterapier.
I visse utførelsesformer, et bindende protein er knyttet til en halveringstid-forlengende vehikel kjent i teknikken. Slike vehikler inkluderer, men er ikke begrenset til, Fc-domenet, polyetylenglykol, og dekstran. Slike vehikler er beskrevet, f.eks., i U.S. Søknad Serienr. 09/428,082 og publisert PCT Søknad Nr. WO 99/25044, som er herved inkorporert ved referanse for ethvert formål.
I en spesifikk utførelsesform, nukleinsyresekvenser som koder for et bindende protein ifølge oppfinnelsen eller en annen profylaktisk eller terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen er administrert for å behandle, forhindre, håndtere, eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav ved hjelp av geneterapi. Geneterapi refererer til terapi utført ved administrasjonen til et subjekt av en uttrykt eller uttrykkbar nukleinsyre. I denne utførelsesformen ifølge oppfinnelsen produserer nukleinsyren deres kodete antistoff eller profylaktisk eller terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen som medierer en profylaktisk eller terapeutisk virkning.
Enhver av metodene for geneterapi tilgjengelig i teknikken kan bli anvendt ifølge den foreliggende oppfinnelsen. For generelle oversiktsartikler om metodene for geneterapi, se Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu og Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); og Morgan og Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Kan, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215. Metoder vanligvis kjent i teknikken av rekombinant DNA teknologi som kan bli anvendt er beskrevet i Ausubel et al. (eds.), Current Protocolls In Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); og Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Detaljert beskrivelse av diverse metoder for geneterapi er vist i US20050042664 Al som er inkorporert heri ved referanse.
De bindende proteinene ifølge oppfinnelsen er nyttige i behandling av diverse sykdommer hvori målet som er gjenkjent ved de bindende proteinene er ødeleggende. Slike sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, revmatoid artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, septisk artritt, Lyme artritt, psoriatisk artritt, reaktiv artritt, spondyloartropati, systemisk lupus erytematose, Crohns sykdom, ulcerativ kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, insulin avhengig diabetes mellitus, tyroiditt, astma, allergiske sykdommer, psoriasis, dermatitt skleroderma, transplantat-mot-vert sykdom, organtransplantat-avvisning, akutt eller kronisk immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, sarkoidose, aterosklerose, disseminert intravaskulær koagulasjon, Kawasakis sykdom, Graves sykdom, nefrotisk syndrom, kronisk utmattelsessyndrom, Wegeners granulomatose, Henoch-Schoenlein purpurea, mikroskopisk vaskulitt av nyrene, kronisk aktiv hepatitt, uveitt, septisk sjokk, toksisk sjokk syndrom, sepsis syndrom, kakeksi, smittsomme sykdommer, parasittisk sykdommer, ervervet immunsvikt syndrom, akutt transvers myelitt, Huntingtons chorea, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, hjerneslag, primær biliær cirrhose, hemolytisk anemi, maligniteter, hjertesvikt, myokardielt infarkt, Addisons sykdom, sporadisk, polyglandulær mangel type I og polyglandulær mangel type II, Schmidts syndrom, voksen (akutt) respiratorisk distress syndrom, alopeki, alopeki areata, seronegativ artopati, artropati, Reiters sykdom, psoriatisk artropati, ulcerativ kolittisk artropati, enteropatisk synovitt, klamydia, yersinia og salmonella assosiert artropati, spondyloartopati, ateromatisk sykdom/arteriosklerose, atopisk allergi, autoimmun bulløs sykdom, pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigoid, lineær IgEn sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, Coombs positiv hemolytisk anemi, ervervet pernisiøs anemi, juvenil pernisiøs anemi, myalgisk encefalitt/Royal Fri Sykdom, kronisk mucokutan candidiasis, storcelle arteritt, primær skleroserende hepatitt, kryptogenisk autoimmun hepatitt, Ervervet Immunsvikt Sykdom Syndrom, Ervervet Immunsvikt Beslektede Sykdommer, Hepatitt B, Hepatitt C, vanlig variabel immunsvikt (vanlig variabel hypogammaglobulinemi), dilatert kardiomyopati, kvinnelig infertilitet, eggstokksvikt, prematur eggstokksvikt, fibrotisk lungesykdom, kryptogen fibroserende alveolitt, post-inflammatorisk interstitiell lungesykdom, interstitiell pneumonitt, bindevevssykdom assosiert interstitiell lungesykdom, blandet bindevevssykdom assosiert lungesykdom, systemisk sklerose assosiert interstitiell lungesykdom, revmatoid artritt assosiert interstitiell lungesykdom, systemisk lupus erytematose assosiert lungesykdom, dermatomiositt/polymyositt assosiert lungesykdom, Sjogrens sykdom assosiert lungesykdom, ankyloserende spondylitt assosiert lungesykdom, vaskulitisk diffus lungesykdom, hemosiderose assosiert lungesykdom, legemiddelindusert interstitiell lungesykdom, fibrose, strålingsfibrose, bronkiolitt obliterans, kronisk eosinofil lungebetennelse, lymfocytisk infiltrativ lungesykdom, postsmittsom interstitiell lungesykdom, giktisk artritt, autoimmun hepatitt, type-1 autoimmun hepatitt (klassisk autoimmun eller lupoid hepatitt), type-2 autoimmun hepatitt (anti-LKM antistoff hepatitt), autoimmun mediert hypoglykemi, type B insulinresistens med acanthosis nigricans, hypoparatyroidisme, akutt immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, kronisk immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, osteoarthrose, primær skleroserende kolangitt, psoriasis type 1, psoriasis type 2, idiopatisk leukopeni, autoimmun neutropeni, nyresykdom NOS, glomerulonefritt, mikroskopisk vasulitt av nyrene, lyme sykdom, diskoid lupus erytematose, mannlig infertilitet idiopatisk eller NOS, sædcelle autoimmunitet, multippel sklerose (alle undertyper), sympatisk oftalmi, pulmonær hypertensjon sekundært til bindevevssykdom, Goodpastures syndrom, pulmonær manifestasjon av polyarteritt nodosa, akutt revmatisk feber, revmatoid spondylitt, Stills sykdom, systemisk sklerose, Sjorgrens syndrom, Takayasus sykdom/arteritt, autoimmun trombocytopeni, idiopatisk trombocytopeni, autoimmun tyroid sykdom, hypertyroidisme, goitrous autoimmun hypotyroidisme (Hashimotos sykdom), atrofisk autoimmun hypotyroidisme, primært myxoødem, facogen uveitt, primær vaskulitt, vitiligo akutt leversykdom, kroniske leversykdommer, alkoholisk cirrhose, alkohol-indusert leverskade, koleosatatis, idiosynkratisk leversykdom, Legemiddelindusert hepatitt, Ikke-alkoholisk Steatohepatitt, allergi og astma, gruppe B streptococci (GBS) infeksjon, mentale forstyrrelser ( f. eks., depressjon og schizofreni), Th2 Type og Thl Type medierte sykdommer, akutt og kronisk smerte (forskjellige typer av smerte), og kreftsykdommer slik som lunge, bryst, mage, blære, tykktarm, bukspyttkjertel, eggstokk, prostata og rektal kreft og hematopoietiske maligniteter (leukemi og lymfom), Abetalipoprotemi, Acrocyanose, akutte og kroniske parasittisk eller smittsomme prosesser, akutt leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi (ALLE), akutt myeloid leukemi (AML), akutt eller kronisk bakteriell infeksjon, akutt pancreatitt, akutt nyresvikt, adenokarsinomer, luftige ektopiske slag, AIDS demens-kompleks, alkohol-indusert hepatitt, allergisk konjunktivitt, allergisk kontaktdermatitt, allergisk rinitt, allotransplantat-avvisning, alfa-1-antitrypsin mangel, amyotrofisk lateral sklerose, anemi, angina pectoris, fremre horncelle degenerering, anti cd3 terapi, antifosfolipid syndrom, anti-reseptor hypersensitivitetsreaksjoner, aordiske og perifere aneurismer, aortadisseksjon, arteriell hypertensjon, arteriosklerose, arteriovenøs fistula, ataksi, atriell flimmer (vedvarende eller paroksysmal), atriell flutter, atrioventrikulær blokkering, B-celle lymfom, beintransplantat avvisning, beinmargtransplantat (BMT) avvisning, "bundle branch"-blokkering, Burkitts lymfom, Brannskader, kardielle arytmier, kardiell lammelsessyndrom, kardielle tumorer, kardiomyopati, kardiopulmonær bypass inflammasjonsrespons, brusktransplantat-avvisning, cerebellære kortikale degenerasjoner, cerebellære forstyrrelser, kaotisk eller multifokal atriell takykardi, kjemoterapi-assosierte forstyrrelser, chromic myelocytisk leukemi (CML), kronisk alkoholisme, kroniske inflammatoriske patologier, kronisk lymfocytisk leukemi (CLL), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), kronisk salisylatforgiftning, kolorektalt karsinom, kongestiv hjertesvikt, konjunktivitt, kontaktdermatitt, cor pulmonale, koronær arteriesykdom, Creutzfeldt-Jakob sykdom, kultur-negativ sepsis, cystisk fibrose, cytokinterapi-assosierte forstyrrelser, Demens pugilistica, demyelinerende sykdommer, dengue hemoragisk feber, dermatitt, dermatologiske tilstander, diabetes, diabetes mellitus, diabetisk ateriosklerotisk sykdom, Diffus Lewy-kropp sykdom, dilatert kongestiv kardiomyopati, forstyrrelser i det basale ganglia, Downs Syndrom i middelalder, legemiddel- indusert bevegelsesforstyrrelser indusert av legemidler som blokkerer CNS dopaminreseptorer, legemiddelfølsomhet, eksem, encefalomyelitt, endokarditt, endokrinopati, epiglottitt, epstein-barr virus infeksjon, erytromelalgi, ekstrapyramidal og cerebellære forstyrrelser, familiær hematofagocytisk lymfohistiocytose, føtalt tymus implantat avvisning, Friedreichs ataksi, funksjonell perifere arterielle forstyrrelser, sopp sepsis, gass-koldbrann, mavesår, glomerulær nefritt, transplantat-awisning av ethvert organ eller vev, gram-negativ sepsis, gram-positiv sepsis, granulomar på grunn av intracellulære organismer, hårcelle leukemi, Hallerrorden-Spatz sykdom, hashimotos tyroiditt, høyfeber, hjertetransplantasjonsavvisning, hemakromatose, hemodialyse, hemolytisk uremisk syndrom/trombolytisk trombocytopenisk purpura, blødning, hepatitt (A), "His bundle" arytmier, HIV infeksjon/HIV nevropati, Hodgkins sykdom, hyperkinetiske bevegelsesforstyrrelser, hypersensibilitetsreaksjoner, hypersensitivitet pneumonitt, hypertensjon,
hypokinetiske bevegelsesforstyrrelser, hypothalamus-hypofyse-binyre-akse evaluering, idiopatisk Addisons sykdom, idiopatisk pulmonær fibrose, antistoff-mediert cytotoksisitet, Asteni, infantil spinal muskulær atrofi, inflammasjon av aorta, influensa a, ioniserende strålingseksponering, iridocyclitt/uveitt/optisk neuritt, iskemi- reperfusjon skade, iskemisk hjerneslag, juvenil revmatoid artritt, juvenil spinal muskulær atrofi, Kaposis sarkom, nyretransplantasjon avvisning, legionella, leishmaniasis, spedalskhet, lesjoner på det kortikospinale systemet, lipødem, levertransplantasjon avvisning, lymfederma, malaria, malignamt Lymfom, malignant histiocytose, malignant melanom, meningitt, meningococcemia, metabolisk/idiopatisk, migrene hodepine, mitokondrien multisystem forstyrrelse, blandet bindevevssykdom, monoklonal gammopati, multippel myelom, multippel-systemdegenerasjoner (Mencel Dejerine- Thomas Shi-Drager og Machado-Josef), myAsteni gravis, mycobacterium avium intracellulære, mycobacterium tuberculose, myelodyplastisk syndrom, myokardielt infarkt, myokardielle iskemiske forstyrrelser, nasofaryngeal karsinom, neonatal kronisk lungesykdom, nefritt, nefrose, nevrodegenerativ sykdommer, nevrogene I muskulære atrofier, neutropen feber, ikke- hodgkins lymfom, okklusjon av den abdominale aorta og dens sidegrener, okklusive arterielle forstyrrelser, okt3 terapi, orkitt/epidydimitt, orkitt/vasektomi-reversering prosedyrer, organomegali, osteoporose, bukspyttkjertel transplantasjon avvisning, bukspyttkjertel karsinom, paraneoplastisk syndrom/hyperkalsemi av ondartethet, paratyroid transplantasjon avvisning, inflammatorisk bekken sykdom, perennial rinitt, perikardiell sykdom, perifer aterlosklerotisk sykdom, perifere vaskulære forstyrrelser, peritonitt, pernisiøs anemi, pneumocystis carinii lungebetennelse, lungebetennelse, POEMS syndrom (polynevropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gammopati, og hudforandringssyndrom), postperfusjonssyndrom, post pump syndrom, post-MI kardiotomi syndrom, preeklampsi, Progressiv supranukleær parese, primær pulmonær hypertensjon, strålingsterapi, Raynauds fenomen og sykdom, Raynouds sykdom, Refsums sykdom, jevnlig smal QRS takykardi, renovaskulær hypertensjon, reperfusjon skade, restriktiv kardiomyopati, sarkomer, skleroderma, senil chorea, Senil Demens av Lewy-legemer typen, seronegativ artropatier, sjokk, sigd-celle anemi, hud allotransplantat-avvisning, hudforandringssyndrom, liten tarm transplantasjon avvisning, faste tumorer, spesifikke arytmier, spinal ataksi, spinocerebellære degenerasjoner, streptokokk myositt, strukturelle lesjoner på lillehjernen, Subakutt skleroserende panencefalitt, Synkope, syfilis i det kardiovaskulære systemet, systemisk anafalaksi, systemisk inflammatorisk respons syndrom, systemisk utbrudd juvenil revmatoid artritt, T-celle eller FAB ALLE, Telangiektasi, tromboangitt obliterans, trombocytopeni, toksisitet, transplantasjoner, traumer/blødning, type III
hypersensitivitetsreaksjoner, type IV hypersensitivitet, ustabil angina, uremi, urosepsis, urtikaria, valvulære hjertesykdommer, åreknuter, ,vaskulitt, venøse sykdommer, venøs trombose, ventrikulært flimmer, virale infeksjoner og soppinfeksjoner, vital encefalitt/aseptisk meningitt, vital-assosiert hemafagocytisk syndrom, Wernicke- Korsakoff syndrom, Wilsons sykdom, xenotransplantat-avvisning av ethvert organ eller vev. (se Peritt et al. PCT publikasjonsnr. WO2002097048A2, Leonard et al., PCT publikasjonsnr. W09524918 Al, og Salfeld et al, PCT publikasjonsnr. WO00/56772A1).
DVD-Ig'ene ifølge oppfinnelsen kan også behandle en eller flere av de følgende sykdommer: Akutte koronære syndromer, Akutt Idiopatisk Polyneuritt, Akutt Inflammatorisk Demyelinerende Polyradiculonevropati, Akutt iskemi, Voksen Stills Sykdom, Alopeki areata, Anafylakse, Anti-Fosfolipid Antistoff Syndrom, Aplastisk anemi, Arteriosklerose, Atopisk eksem, Atopisk dermatitt, Autoimmun dermatitt, Autoimmun forstyrrelse assosiert med Streptococcus infeksjon, Autoimmun hørseltap, Autoimmun Lymfoproliferativt syndrom (ALPS), Autoimmun myokarditt, autoimmun trombocytopeni (AITP), Blefaritt, Bronchiectasis, Bulløs pemfigoid, Kardiovaskulær Sykdom, Katastrofisk Antifosfolipid Syndrom, Cøliac Sykdom, Cervikal Spondylose, Kronisk iskemi, Cicatricial pemfigoid, Klinisk isolert Syndrom (CIS) med Risiko for Multippel sklerose, Konjunktivitt, Barndom Utbrudd Psykiatrisk Forstyrrelse, Kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), Dacryocystitt, dermatomiositt, Diabetisk retinopati, Diabetes mellitus, Skiveprolaps, Skiveprolaps, Legemiddel indusert immun hemolytisk anemi, Endokarditt, Endometriose, endoftalmitt,, Episkleritt, Erytema multiforme, Erytema multiforme major, Svangerskaps pemfigoid, Guillain-Barré Syndrom (GBS), Høyfeber, Hughes Syndrom, Idiopatisk Parkinsons Sykdom, idiopatisk interstitiell lungebetennelse, IgE-mediert Allergi, Immun hemolytisk anemi, Inclusion Body Myositt, Smittsom okkulær inflammatorisk sykdom, Inflammatorisk demyelinerende sykdom, Inflammatorisk hjertesykdom, Inflammatorisk nyresykdom, IPF/UIP, Iritt, Keratitt, Keratojuntivitt sicca, Kussmaul sykdom eller Kussmaul-Meier Sykdom, Landrys Paralyse, Langerhans Celle Histiocytose, Livedo reticularis, Makulær Degenerering, maligniteter, Mikroskopisk Polyangiitt, Morbus Bechterev, Motornevron Forstyrrelser, Slimhinne pemfigoid, Multippel organsvikt, MyAsteni Gravis, Myelodysplastisk Syndrom, Myokarditt, Nerverot Forstyrrelser, Nevropati, ikke-A ikke-B Hepatitt, Optisk Neuritt, Osteolyse, Eggstokk kreft, Pauciartikulær JRA, perifer arterie okklusiv sykdom (PAOD), perifer vaskulær sykdom (PVD), perifer arterie sykdom (PAD), Flebitt, Polyarteritt nodosa (eller periarteritt nodosa), Polykondritt, Polymyalgi Revmatiska, Poliose, Polyartikulær JRA, Polyendokrin Mangel Syndrom, Polymyositt, polymyalgi revmatiska (PMR), Post-Pump Syndrom, primær parkinsonisme, prostata og rektal kreft og hematopoietiske maligniteter (leukemi og lymfom), Prostatitt, Ren rødcelle aplasi, Primær Binyrer Utilstrekkelighet, Tilbakevendende Neuromyelitt Optica, Restenose, Revmatisk hjertesykdom, SAFO (synovitt, akne, pustulose, hyperostose, og osteitt), Skleroderma, Sekundær Amyloidose, Sjokklunge, Skleritt, Isjas, Sekundær Binyrer Utilstrekkelighet, Silikonassosiert bindevevssykdom, Sneddon-Wilkinson Dermatose, spondilitt ankylosans, Stevens-Johnson Syndrom (SJS), Systemisk inflammatorisk respons syndrom, Temporær arteritt, toksoplasmisk retinitt, toksisk epidermal nekrolyse, Transvers myelitt, TRAPS (Tumornekrose-faktor Reseptor, Type 1 allergisk reaksjon, Type II Diabetes, Urtikaria, Vanlig interstitiell lungebetennelse (UIP), Vaskulitt, Vernal konjunktivitt, viral retinitt, Vogt-Koyanagi-Harada syndrom (VKH syndrom), Våt makulær degenerering, og Sårtilheling.
De bindende proteinene ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å behandle mennesker som lider av autoimmunsykdommer, spesielt de assosiert med inflammasjon, inkludert, revmatoid artritt, spondylitt, allergi, autoimmun diabetes, autoimmun uveitt. I en utførelsesform, de bindende proteinene ifølge oppfinnelsen eller antigen-bindende porsjoner derav, blir anvendt for å behandle revmatoid artritt, Crohns sykdom, multippel sklerose, insulin avhengig diabetes mellitus og psoriasis.
I en utførelsesform, sykdommer som kan bli behandlet eller diagnostisert med sammensetningene og metodene ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, primære og metastatiske kreftsykdommer, inkludert karsinomer i bryst, tykktarm, rektum, lunge, orofarynks, hypofarynks, øsofagus, mave, bukspyttkjertel, lever, galleblære og galleganger, tynntarmen, urinveien (inkludert nyre, blære og urothelium), kvinnelige kjønnsorgan (inkludert livmorhals, livmor og eggstokker så vel som choriokarsinom og Trofoblastisk svangerskapssykdom), manlige kjønnsorgan (inkludert prostata, sædblærer, testikler og kimcellesvulster), endokrine kjertler (inkludert skjoldbruskkjertelen, binyrene og hypofysen), og hud, så vel som hemangiomer, melanomer, sarkomer (inkludert de som stammer fra bein og myke vev så vel som Kaposis sarkom), tumorer i hjernen, nerver, øyne, og hjernehinnene (inkludert astrocytomer, gliomer, glioblastomer, retinoblastomer, nevromer, nevroblastomer, Schwannomer, og meningiomer), faste tumorer oppstående fra hematopoietiske maligniteter slik som leukemier og lymfomer (både Hodgkins og ikke-Hodgkins lymfomer).
I en utførelsesform blir antistoffene ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, anvendt for å behandle kreft eller i forhindringen av metastaser fra tumorene beskrevet heri enten når anvendt alene eller i kombinasjon med radioterapi og/eller andre kjemoterapeutiske midler.
Antistoffene ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan bli kombinert med midler som inkluderer men er ikke begrenset til, antineoplastisk midler, radioterapi, kjemoterapi slik som DNA-alkylerende midler, cisplatin, karboplatin, anti-tubulin midler, paclitaxel, docetaxel, taxol, doksorubicin, gemcitabine, gemzar, anthrasyklins, adriamycin, topoisomerase I inhibitorer, topoisomerase II inhibitorer, 5-fluoruracil (5-FU), leucovorin, irinotecan, reseptor tyrosinkinase-inhibitorer (f.eks., erlotinib, gefitinib), COKS-2 inhibitorer (f.eks., celecoxib), kinase-inhibitorer, og siRNA'er.
Et bindende protein ifølge oppfinnelsen kan også bli administrert med en eller flere ytterligere terapeutiske midler nyttige i behandlingen av diverse sykdommer.
Et bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt alene eller i kombinasjon for å behandle slike sykdommer. Det bør bli forstått at de bindende proteinene kan bli anvendt alene eller i kombinasjon med et ytterligere middel, f.eks., et terapeutisk middel, nevnte ytterligere middel som blir valgt av fagmannen for dets tiltenkte formål. For eksempel, det ytterligere middelet kan bli et terapeutisk middel kjent i teknikken som å være nyttig for å behandle sykdommen eller tilstand som blir behandlet av antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Det ytterligere middelet kan også være et middel som formidler en nyttig egenskap til den terapeutiske sammensetningen f.eks., et middel som påvirker viskositeten til sammensetningen.
Det skal videre forstås at kombinasjonene som skal være inkludert innenfor denne oppfinnelsen er de kombinasjoner nyttig for deres påtenkte formål. Midlene angitt nedenfor er illustrerende for formål og ikke ment å være begrensende. Kombinasjonene, som er en del ifølge denne oppfinnelsen, kan være antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen og minst ett ytterligere middel valgt fra listene nedenfor. Kombinasjonen kan også inkludere mer enn ett ytterligere middel, f.eks., to eller tre ytterligere midler hvis kombinasjonen slik den er ved den dannede sammensetningen kan utføre dens tilsiktede funksjon.
Kombinasjoner for å behandle autoimmune og inflammatoriske sykdommer er ikke-steroide anti-inflammatorisk legemiddel(midler) også referert til som NSAID'er som inkluderer legemidler som ibuprofen. Andre kombinasjoner er kortikosteroider inkludert prednisolon; de velkjente bivirkningene av steroidbruk kan bli redusert eller til og med eliminert ved å trappe ned den nødvendige steroiddosen når man behandler pasienter i kombinasjon med the DVD-Ig'er ifølge denne oppfinnelsen. Ikke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for revmatoid artritt med som et antistoff, eller antistoff-porsjonen, ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: cytokin-dempende anti-inflammatorisk legemiddel(midler) (CSAIDs); antistoffer til eller antagonister ovenfor andre humane cytokiner eller vekstfaktorer, for eksempel, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, interferoner, EMAP-II, GM-CSF, FGF, og PDGF. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflate-molekyler slik som CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA eller deres ligander inkludert CD154(gp39 eller CD40L).
Kombinasjoner av terapeutiske midler kan interferere ved forskjellige punkter i den autoimmune, og etterfølgende inflammatoriske, kaskaden; eksempler inkluderer TNF antagonister som kimeriske, humaniserte eller humane TNF antistoffer, Adalimumab, (PCT Publikasjonsnr. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, og løselig p55 eller p75 TNF reseptorer, derivater derav,
(p75TNFRlgG (Enbrel™) eller p55TNFRlgG (Lenercept), og også TNFa konverterende enzym (TACE) inhibitorer; tilsvarende IL-1 inhibitorer (Interleukin-1-konverterende enzym-inhibitorer, IL-1RA osv.) kan være effektive av den samme grunnen. Andre kombinasjoner inkluderer Interleukin 11. Nok en annen kombinasjon inkluderer nøkkelspillere til autoimmunresponsen som kan virke parallelt til, avhengig av eller i samarbeid med IL-12 funksjon; spesielt er IL-18 antagonister inkludert IL-18 antistoffer eller løselig IL-18 reseptorer, eller IL-18-bindende proteiner. Det har blitt vist at IL-12 og IL-18 har overlappende men distinkte funksjoner og en kombinasjon av antagonister ovenfor begge kan være mest effektivt. Nok en annen kombinasjon er ikke-uttømmende anti-CD4 inhibitorer. Ytterligere andre kombinasjoner inkluderer antagonister ovenfor den kostimulerende signalveien CD80 (B7.1) eller CD86 (B7.2) inkludert antistoffer, løselig reseptorer eller antagonistiske ligander.
De bindende proteinene ifølge oppfinnelsen kan også bli kombinert med midler, slik som metotrexat, 6-MP, azatioprin sulfasalazin, mesalazin, olsalazin klorkinin/hydroksyklorkin, pencillamin, aurotiomalate (intramuskulær og oral), azatioprin, cochicine, kortikosteroider (oral, inhalert og lokal injisering), beta-2 adrenoreceptor agonister (salbutamol, terbutalin, salmeteral), xanthiner (teofyllin, aminofyllin), kromoglykat, nedokromil, ketotifen, ipratropium og oksitropium, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolat mofetil, leflunomid, NSAID'er, for eksempel, ibuprofen, kortikosteroider slik som prednisolon, fosfodiesterase-inhibitorer, adenosin-agonister, antitrombotiske midler, komplement inhibitorer, adrenergiske midler, midler som interfererer med signalisering av proinflammatoriske cytokiner slik som TNF-aeller IL-1 (f.eks.,IRAK, NIK, IKK, p38 eller MAP kinase-inhibitorer), IL-lp konverterende enzym-inhibitorer, TNFakonverterende enzym (TACE) inhibitorer, T-celle signalliserings-inhibitorer slik som kinase-inhibitorer, metalloproteinase inhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensin-konverterende enzym-inhibitorer, løselige cytokin-reseptorer og derivater derav (f.eks.,løselig p55 eller p75 TNF reseptorer og derivatene p75TNFRIgG (Enbrel™ og p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-lRI, sIL-lRH, sIL-6R), anti-inflammatoriske cytokiner (f.eks.,IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 og TGFp), celecoxib, folsyre, hydroksyklorkinsulfat, rofecoxib, etanrcept, infliximab, naproksen, valdecoxib, sulfasalazin, metylprednisolon, meloksicam, metylprednisolon acetat, gull natrium tiomalat, aspirin, triamcinolon acetonid, propoksyfen napsylat/apap, folat, nabumeton, diklofenac, piroksicam, etodolac, diklofenac natrium, oksaprozin, oksycodon hel, hydrocodon bitartrat/apap, diklofenac natrium/misoprostol, fentanyl, anakinra, human rekombinant, tramadol hel, salsalat, sulindac, cyanocobalamin/fa/pyridoksin, acetaminofen, natrium alendronat, prednisolon, morfinsulfat, lidokain hydroklorid, indometacin, glukosamin sulfTkondroitin, amitriptylin hel, sulfadiazin, oksycodon hcl/acetaminofen, olopatadin hel, misoprostol, natrium naproksen, omeprazol, syklofosfamid, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, Anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, KM85, CDC-801, og Mesopram. Kombinasjoner inkluderer metotrexat eller leflunomid og i moderate eller alvorlige tilfeller av revmatoid artritt, syklosporin.
Dcke-begrensende ytterligere midler som også kan bli anvendt i kombinasjon med et bindende protein for å behandle revmatoid artritt inkluderer, men er ikke begrenset til, de følgende: ikke-steroide anti-inflammatorisk legemiddel(midler) (NSAID'er); cytokin-dempende anti-inflammatorisk legemiddel(midler) (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (humanisert anti-TNFa antistoff; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (kimeriske anti-TNFa antistoff; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/etanrcept (75 kD TNF reseptor-IgG fusjonsprotein; Immunex; se f. eks., Arthritis & Rheumatism
(1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44,235A); 55 kdTNF-IgG (55 kD TNF reseptor-IgG fusjonsprotein; Hoffmann-LaRoche); IDEK-CE9.1/SB 210396 (ikke-uttømmende primatized anti-CD4 antistoff; IDEK/SmithKline; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, Sl 85); DAB 486-IL-2 og/eller DAB 389-IL-2 (IL-2 fusjonsproteiner; Seragen; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (humanisert anti-IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (anti-inflammatorisk cytokin; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; rekombinant IL-10, anti-inflammatorisk cytokin; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 og/eller IL-4 agonister ( f. eks., agonist antistoffer); IL-1RA (IL-1 reseptor antagonist; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret<®>/Amgen); TNF-bp/s-TNF (løselig TNF-bindende protein; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Fysiol. - Hjerte og Circulatory Fysiology (1995) Vol. 268, pp. 37^12); R973401 (fosfodiesterase Type IV inhibitor; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); MK-966 (COKS-2 Inhibitor; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S81); Iloprost (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S82); metotrexat; thalidomide (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282) og thalidomide-beslektede legemidler ( f. eks., Celgen); leflunomid (anti-inflammatorisk og cytokin inhibitor; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); tranexamic syre (inhibitor av plasminogen aktivering; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284); T-614 (cytokin inhibitor; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); prostaglandin El (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); Tenidap (ikke-steroide anti-inflammatorisk legemiddel; se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280); Naproksen (ikke-steroide anti-inflammatorisk legemiddel; se f. eks., Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloksicam (ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel); Ibuprofen (ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel); Piroksicam (ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel); Diklofenac (ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel); Indometacin (ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel); Sulfasalazin (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); Azatioprin (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); ER inhibitor (inhibitor av enzymet interleukin-1(3 konverterende enzym); zap- 70 og/eller lek inhibitor (inhibitor av the tyrosinkinase zap-70 eller lek); VEGF inhibitor og/eller VEGF-R inhibitor (inhibitorer av vaskulær endotel celle vekstfaktor eller vaskulær endotel celle vekstfaktor reseptor; inhibitorer av angiogenese); kortikosteroid anti-inflammatoriske legemidler ( f. eks., SB203580); TNF-convertase inhibitorer; anti-IL-12 antistoffer; anti-IL-18 antistoffer; interleukin-11 (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S296); interleukin-13 (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S308); interleukin -17 inhibitorer (se f. eks., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), Sl20); gull; penicillamin; klorkin; klorambucil; hydroksyklorkin; syklosporin; syklofosfamid; total lymfoid bestråling; anti-thymocyte globulin; anti-CD4 antistoffer; CD5-toksiner; oralt-administrert peptider og kollagen; lobenzarit dinatrium; Cytokin Regulating Midler (CRAs) HP228 og HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 antisense fosforotioat oligo-deoksynukleotider (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); løselig komplement reseptor 1 (TP10; T Celle Sciences, Inc.); prednison; orgotein; glycosaminoglycan polysulfat; minosykline; anti-IL2R antistoffer; marine og botaniske lipider (fettsyrer fra fisk og plantefrø; se f. eks., DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofin; fenylbutazone; meclofenamsyre; flufenamsyre; intravenøs immunoglobulin; zileuton; azaribin; mycofenolsyre (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamycin); amiprilose (therafectin); cladribin (2-klordeoksyAdenosin); metotrexat; bcl-2 inhibitorer (se Bruncko, Milan et al., Journal of Medicinal Chemistry (2007), 50(4), 641-662); antiviraler og immunmodulerende midler.
I en utførelsesform, det bindende proteinet eller antigen-bindende porsjon derav, er administrert i kombinasjon med en av de følgende midler for behandlingen av revmatoid artritt: småmolekyl-inhibitor av KDR, småmolekyl-inhibitor av Tie-2; metotrexat; prednison; celecoxib; folsyre; hydroksyklorkinsulfat; rofecoxib; etanrcept; infliximab; leflunomid; naproksen; valdecoxib; sulfasalazin; metylprednisolon; ibuprofen; meloksicam; metylprednisolon acetat; gull natrium tiomalat; aspirin; azatioprin; triamcinolon acetonid; propxyfene napsylat/apap; folat; nabumeton; diklofenac; piroksicam; etodolac; diklofenac natrium; oksaprozin; oksycodon hel; hydrocodon bitartrat/apap; diklofenac natrium/misoprostol; fentanyl; anakinra, human rekombinant; tramadol hel; salsalat; sulindac; cyanocobalamin/fa/pyridoksin; acetaminofen; natrium alendronat; prednisolon; morfinsulfat; lidokain hydroklorid; indometacin; glukosamin sulfat/kondroitin; syklosporin; amitriptylin hel; sulfadiazine; oksycodon hcl/acetaminofen; olopatadin hel; misoprostol; natrium naproksen; omeprazol; mykofenolat mofetil; syklofosfamid; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCI0469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801; og mesopram.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for inflammatorisk tarmsykdom med hvilke et bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: budenosid; epidermal vekstfaktor; kortikosteroider; syklosporin, sulfasalazin; aminosalisylater; 6-merkaptopurin; azatioprin; metronidazol; lipoksygenase inhibitorer; mesalamin; olsalazin; balsalazid; antioksidanter; tromboksan-inhibitorer; IL-1 reseptor-antagonister; anti-IL-lp mAb'er; anti-IL-6 mAb'er; vekstfaktorer; elastase inhibitorer; pyridinyl-imidazol forbindelser; antistoffer til eller antagonister ovenfor andre humane cytokiner eller vekstfaktorer, for eksempel, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-H, GM-CSF, FGF, og PDGF. Antistoffer ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflate-molekyler slik som CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 eller deres ligander. Antistoffene ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan også bli kombinert med midler, slik som metotrexat, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolat mofetil, leflunomid, NSAID'er, for eksempel, ibuprofen, kortikosteroider slik som prednisolon, fosfodiesterase-inhibitorer, Adenosin agonister, antitrombotiske midler, komplement inhibitorer, adrenergiske midler, midler som interfererer med signalisering av proinflammatoriske cytokiner slik som TNFa eller IL-1 (f.eks.,IRAK, NIK, IKK, p38 eller MAP kinase-inhibitorer), IL-lp konverterende enzym-inhibitorer, TNFa konverterende enzym-inhibitorer, T-celle signalliserings-inhibitorer slik som kinase-inhibitorer, metalloproteinase inhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensin-konverterende enzym-inhibitorer, løselige cytokin-reseptorer og derivater derav (f.eks.,løselig p55 eller p75 TNF reseptorer, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) og anti-inflammatoriske cytokiner (f.eks.,IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 og TGFp) og bcl-2 inhibitorer.
Eksempler på terapeutiske midler for Crohns sykdom hvori et bindende protein kan bli kombinert inkluderer de følgende: TNF antagonister, for eksempel, anti-TNF antistoffer, Adalimumab (PCT Publikasjonsnr. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, TNFR-Ig konstruksjoner, (p75TNFRIgG (ENBREL) og p55TNFRIgG (LENERCEPT)) inhibitorer og PDE4 inhibitorer. Antistoffer ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan bli kombinert med kortikosteroider, for eksempel, budenosid og dexametason. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen eller antigen-bindende porsjoner derav, kan også bli kombinert med midler slik som sulfasalazin, 5-aminosalisylsyre og olsalazin, og midler som interfererer med syntesen eller virkningen av proinflammatoriske cytokiner slik som IL-1, for eksempel, IL-1 p konverterende enzym-inhibitorer og IL-Ira. Antistoffer ifølge oppfinnelsen eller antigen-bindende porsjon derav kan også bli brukt sammen med T-celle-signaliserende inhibitorer, for eksempel, tyrosinkinase-inhibitorer 6-merkaptopuriner. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan bli kombinert med IL-11. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen, eller antigen-bindende porsjoner derav, kan bli kombinert med mesalamin, prednison, azatioprin, merkaptopurin, infliximab, metylprednisolon natriumsuksinat, difenoksylat/atrop sulfat, loperamid hydroklorid, metotrexat, omeprazol, folat, ciprofloksacin/dekstrose-vann, hydrocodon bitartrat/apap, tetrasyklin hydroklorid, fluocinonid, metronidazol, timerosal/borsyre, kolestyramin/sukrose, ciprofloksacin hydroklorid, hyoscyamin sulfat, meperidin hydroklorid, midazolam hydroklorid, oksycodon hcl/acetaminofen, prometazin hydroklorid, natriumfosfat, sulfametoksazol/trimetoprim, celecoxib, polykarbofil, propoksyfen napsylat, hydrokortison, multivitaminer, balsalazid dinatrium, kodein fosfat/apap, colesevelam hel, cyanocobalamin, folsyre, levofloksacin, metylprednisolon, natalizumab og interferon-gamma
Deke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for multippel sklerose med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: kortikosteroider; prednisolon; metylprednisolon; azatioprin; syklofosfamid; syklosporin; metotrexat; 4-aminopyridin; tizanidin; interferon-pla (AVONEX; Biogen); interferon-plb (BETASERON; Chiron/Berlex); interferon a-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferon-a (Alfa Wassermann/J&J), interferon plA-HVIS (Serono/Inhale Terapeutika), Peginterferon a 2b (Enzon/Schering-Plough), Kopolymer 1 (Cop-1; COPAKSON; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); hyperbarisk oksygen; intravenøst immunoglobulin; clabribine; antistoffer til eller antagonister ovenfor andre humane cytokiner eller vekstfaktorer og deres reseptorer, for eksempel, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, og PDGF. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflate-molekyler slik som CD2, CD3, CD4, CD8, CD 19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 eller deres ligander. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen, kan også bli kombinert med midler, slik som metotrexat, syklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolat mofetil, leflunomid, NSAID'er, for eksempel, ibuprofen, kortikosteroider slik som prednisolon, fosfodiesterase-inhibitorer, adenosin-agonister, antitrombotiske midler, komplement inhibitorer, adrenergiske midler, midler som interfererer med signalisering av proinflammatoriske cytokiner slik som TNFa eller IL-1 (f.eks.,IRAK, NIK, IKK, p38 eller MAP kinase-inhibitorer), IL-lp konverterende enzym-inhibitorer, TACE inhibitorer, T-celle signalisering inhibitorer slik som kinase-inhibitorer, metalloproteinase inhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopuriner, angiotensin-konverterende enzym-inhibitorer, løselige cytokin-reseptorer og derivater derav (f.eks.,løselig p55 eller p75 TNF reseptorer, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R), anti-inflammatoriske cytokiner (f.eks.,IL-4, IL-10, IL-13 og TGFp) og bcl-2 inhibitorer.
Eksempler på terapeutiske midler for multippel sklerose i hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer interferon-p, for eksempel, IFNpla og IFNplb; copakson, kortikosteroider, kaspase-inhibitorer, for eksempel inhibitorer av kaspase-1, IL-1 inhibitorer, TNF inhibitorer, og antistoffer til CD40 ligand og CD80.
De bindende proteinene ifølge oppfinnelsen, kan også bli kombinert med midler, slik som alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantron, xaliproden hydroklorid, fampridin, glatiramer acetat, natalizumab, sinnabidol, a-immunokin NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, kjemokinreseptor-antagonister, BBR-2778, calagualin, CPI-1189, LEM (liposominnkapslet mitoxantron), THC.CBD (kannabinoid agonist) MBP-8298, mesopram (PDE4 inhibitor), MNA-715, anti-IL-6 reseptor antistoff, neurovax, pirfenidon allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-Rl, talampanel, teriflunomid,TGF-beta2, tiplimotid, VLA-4 antagonister (for eksempel, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), interferon gamma antagonister, IL-4 agonister.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Angina med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: aspirin, nitroglyserin, isosorbid mononitrat, metoprolol suksinat, atenolol, metoprolol tartrat, amlodipin besylat, diltiazem hydroklorid, isosorbid dinitrat, klopidogrel bisulfat, nifedipine, atorvastatin kalsium, kaliumklorid, furosemid, simvastatin, verapamil hel, digoksin, propranolol hydroklorid, karvedilol, lisinopril, spironolakton, hydroklortiazide, enalapril maleat, nadolol, ramipril, enoksaparin natrium, heparin natrium, valsartan, sotalol hydroklorid, fenofibrate, ezetimib, bumetanid, losartan kalium, lisinopril/hydroklortiazide, felodipine, kaptopril, bisoprolol fumarat.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Ankyloserende Spondylitt med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: ibuprofen, diklofenac og misoprostol, naproksen, meloksicam, indometacin, diklofenac, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazin, Metotrexat, azatioprin, minosyklin, prednison, etanrcept, infliximab.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Astma med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: albuterol, salmeterol/fluticason, montelukast natrium, fluticason propionat, budesonid, prednison, salmeterol xinafoat, levalbuterol hel, albuterol sulfat/ipratropium, prednisolon natriumfosfat, triamcinolon acetonid, beklometason dipropionat, ipratropium bromid, azithromycin, pirbuterol acetat, prednisolon, teofyllin vannfri, metylprednisolon natriumsuksinat, clarithromycin, zafirlukast, formoterol fumarat, influensa virus vaksine, metylprednisolon, amoksicillin trihydrat, flunisolid, allergi injisering, cromolyn natrium, fexofenadin hydroklorid, flunisolid/mentol, amoksicillin/clavulanat, levofloksacin, inhaleringshjelpende anordning, guaifenesin, dexametason natriumfosfat, moksifloksacin hel, doksysyklin hyclate, guaifenesin/d-metorfan, p-efedrin/cod/klorfenir, gatifloksacin, cetirizin hydroklorid, mometason furoat, salmeterol xinafoat, benzonatat, cefalexin, pe/hydrocodon/klorfenir, cetirizin hcl/pseudoefed, fenylefrine/cod/prometazin, kodein/prometazin, cefprozil, dexametason, guaifenesin/pseudoefedrin, klorfeniramin/hydrocodon, nedokromil natrium, terbutalin sulfat, epinefrin, metylprednisolon, metaproterenol sulfat.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for COPD med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: albuterol sulfat/ipratropium, ipratropium bromid, salmeterol/fluticason, albuterol, salmeterol xinafoat, fluticason propionat, prednison, teofyllin vannfri, metylprednisolon natriumsuksinat, montelukast natrium, budesonid, formoterol fumarat, triamcinolon acetonid, levofloksacin, guaifenesin, azithromycin, beklometason dipropionat, levalbuterol hel, flunisolid, ceftriakson natrium, amoksicillin trihydrat, gatifloksacin, zafirlukast, amoksicillin/clavulanat, flunisolid/mentol, klorfeniramin/hydrocodon, metaproterenol sulfat, metylprednisolon, mometason furoat, p-efedrin/cod/klorfenir, pirbuterol acetat, p-efedrin/loratadin, terbutalin sulfat, tiotropium bromid, (R,R)-formoterol, TgAAT, Cilomilast, Roflumilast.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for HCV med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: Interferon-alfa-2a, Interferon-alfa-2b, Interferon-alfa conl, Interferon-alfa-nl, Pegylert interferon-alfa-2a, Pegylert interferon-alfa-2b, ribavirin, Peginterferon alfa-2b + ribavirin, Ursodeoksycholsyre, Glycyrrhizsyre, Thymalfasin, Maxamin, VX-497 og enhver forbindelse som blir brukt for å behandle HCV gjennom intervensjon med de følgende målene: HCV polymerase, HCV protease, HCV helikase, HCV IRES (intern ribosominngangssete).
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Idiopatisk Pulmonær Fibrose med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: prednison, azatioprin, albuterol, kolchicin, albuterol sulfat, digoksin, gamma interferon, metylprednisolon sod succ, lorazepam, furosemid, lisinopril, nitroglyserin, spironolakton, syklofosfamid, ipratropium bromid, actinomycin d, alteplase, fluticason propionat, levofloksacin, metaproterenol sulfat, morfinsulfat, oksycodon hel, kaliumklorid, triamcinolon acetonid, tacrolimus vannfri, kalsium, interferon-alfa, metotrexat, mykofenolat mofetil, Interferon-gamma-lp.
Ikke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Myokardielt Infarkt med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: aspirin, nitroglyserin, metoprolol tartrat, enoksaparin natrium, heparin natrium, klopidogrel bisulfat, karvedilol, atenolol, morfinsulfat, metoprolol suksinat, warfarin natrium, lisinopril, isosorbid mononitrat, digoksin, furosemid, simvastatin, ramipril, tenecteplase, enalapril maleat, torsemid, retavas, losartan kalium, quinapril hel/mag carb, bumetanid, alteplase, enalaprilat, amiodaron hydroklorid, tirofiban hel m-hydrat, diltiazem hydroklorid, kaptopril, irbesartan, valsartan, propranolol hydroklorid, fosinopril natrium, lidokain hydroklorid, eptifibatid, cefazolin natrium, atropin sulfat, aminoheksansyre, spironolakton, interferon, sotalol hydroklorid, kaliumklorid, docusat natrium, dobutamin hel, alprazolam, pravastatin natrium, atorvastatin kalsium, midazolam hydroklorid, meperidin hydroklorid, isosorbid dinitrat, epinefrin, dopamin hydroklorid, bivalirudin, rosuvastatin, ezetimib/simvastatin, avasimib, cariporid.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Psoriasis med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: småmolekyl-inhibitor av KDR, småmolekyl-inhibitor av Tie-2, kalsipotrien, klobetasol propionat, triamcinolon acetonid, halobetasol propionat, tazaroten, metotrexat, fluocinonid, betametason diprop forsterket, fluocinolon acetonid, acitretin, tjæreshampoo, betametason valerat, mometason furoat, ketoconazol, pramoksin/fluocinolon, hydrokortison valerat, flurandrenolid, urea, betametason, klobetasol propionat/emoll, fluticason propionat, azithromycin, hydrokortison, fuktighetgivende formel, folsyre, desonid, pimecrolimus, kulltjære, diflorason diacetat, etanrcept folat, melkesyre, metokssalen, hc/vismut subgal/znoks/resor, metylprednisolon acetat, prednison, solkrem, halcinonid, salisylsyre, anthralin, klokortolon pivalat, kullekstrakt, kulltjære/salisylsyre, kulltjære/salisylsyre/svovel, desoksimetason, diazepam, mykgjører, fluocinonid/mykgjører, mineralolje/lakserolje/na lact, mineralolje/peanøttolje, petroleum/isopropyl myristat, psoralen, salisylsyre, såpe/tribromsalan, timerosal/borsyre, celecoxib, infliximab, syklosporin, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB, sulfasalazin.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Psoriatisk Artritt med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: metotrexat, etanrcept, rofecoxib, celecoxib, folsyre, sulfasalazin, naproksen, leflunomid, metylprednisolon acetat, indometacin, hydroksyklorkinsulfat, prednison, sulindac, betametason diprop forsterket, infliximab, metotrexat, folat, triamcinolon acetonid, diklofenac, dimetylsulfoksid, piroksicam, diklofenac natrium, ketoprofen, meloksicam, metylprednisolon, nabumeton, tolmetin natrium, kalsipotrien, syklosporin, diklofenac natrium/misoprostol, fluocinonid, glukosamin sulfat, gull natrium tiomalat, hydrocodon bitartrat/apap, ibuprofen, natrium risedronat, sulfadiazin, tioguanin, valdecoxib, alefacept, efalizumab og bcl-2 inhibitorer.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Restenose med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: sirolimus, paclitaxel, everolimus, tacrolimus, Zotarolimus, acetaminofen.
Dcke-begrensende eksempler på terapeutiske midler for Isjas med hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: hydrocodon bitartrat/apap, rofecoxib, syklobenzaprin hel, metylprednisolon, naproksen, ibuprofen, oksycodon hcl/acetaminofen, celecoxib, valdecoxib, metylprednisolon acetat, prednison, kodein fosfat/apap, tramadol hcl/acetaminofen, metaxalon, meloksicam, metocarbamol, lidokain hydroklorid, diklofenac natrium, gabapentin, dexametason, carisoprodol, ketorolac trometamin, indometacin, acetaminofen, diazepam, nabumeton, oksycodon hel, tizanidin hel, diklofenac natrium/misoprostol, propoksyfen napsylat/apap, asa/oksycod/oksycodon ter, ibuprofen/hydrocodon bit, tramadol hel, etodolac, propoksyfen hel, amitriptylin hel, carisoprodol/kodein fos/asa, morfinsulfat, multivitaminer, natrium naproksen, orfenadrin sitrat, temazepam.
Eksempler på terapeutiske midler for SLE (Lupus) i hvilke bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan bli kombinert inkluderer de følgende: NSAID'er, for eksempel, diklofenac, naproksen, ibuprofen, piroksicam, indometacin; COX2 inhibitorer, for eksempel, Celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; anti-malariamidler, for eksempel, hydroksyklorkin; Steroids, for eksempel, prednison, prednisolon, budenosid, dexametason; Cytotoksisks, for eksempel, azatioprin, syklofosfamid, mykofenolat mofetil, metotrexat; inhibitorer av PDE4 eller purinsyntese inhibitor, for eksempel Cellcept. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen, kan også bli kombinert med midler slik som sulfasalazin, 5-aminosalisylsyre, olsalazin, Imuran og midler som interfererer med syntesen, produksjonen eller virkningen av proinflammatoriske cytokiner slik som IL-1, for eksempel, kaspase-inhibitorer like IL-lp konverterende enzym-inhibitorer og IL-Ira. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan også bli brukt sammen med T-celle-signaliserende inhibitorer, for eksempel, tyrosinkinase-inhibitorer; eller molekyler som mål T-celle aktivering molekyler, for eksempel, CTLA-4-IgG eller anti-B7 familie antistoffer, anti-PD-1 familie antistoffer. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen, kan bli kombinert med IL-11 eller anti-cytokin antistoffer, for eksempel, fonotolizumab (anti-IFNg antistoff), eller anti-reseptor reseptor antistoffer, for eksempel, anti-IL-6 reseptor antistoff og antistoffer til B-celleoverflate-molekyler. Antistoffer ifølge oppfinnelsen eller antigen-bindende porsjon derav kan også bli brukt sammen med LJP 394 (abetimus), midler som uttømmer eller deaktiverer B-celler, for eksempel, Rituximab (anti-CD20 antistoff), lymfostat-B (anti-BlyS antistoff), TNF antagonister, for eksempel, anti-TNF antistoffer, Adalimumab (PCT Publikasjonsnr. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, TNFR-Ig konstruksjoner, (p75TNFRIgG (ENBREL<*>og p55TNFRIgG (LENERCEPT)) og bcl-2 inhibitorer, fordi bcl-2 overekspresjon i transgen mus har blitt demonstrert å forårssake en lupus-liknende fenotype (se Marquina, Regina et al., Journal of Immunology (2004), 172(11), 7177-7185), inhibering er derfor forventet å ha terapeutisk effekt.
De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan inkludere en "terapeutisk effektiv mengde" eller en "profylaktisk effektiv mengde" av et bindende protein ifølge oppfinnelsen. En "terapeutisk effektiv mengde" refererer til en mengde effektiv, ved doser og for tidsperioder nødvendig, for å oppnå det ønskede terapeutiske resultat. En terapeutisk effektiv mengde av det bindende proteinet kan bli bestemt av en fagmann og kan variere ifølge faktorer slik som sykdomstilstanden, alder, kjønn, og vekten til individet, og evnen til det bindende proteinet til å utløse en ønsket respons i individet. En terapeutisk effektiv mengde er også en hvori enhver toksisk eller ødeleggende virkning av antistoffet, eller antistoff-porsjonen, er oppveid ved de terapeutisk gunstige virkningene. En "profylaktisk effektiv mengde" refererer til en mengde effektiv, ved doser og for tidsperioder nødvendig, for å oppnå det ønskede profylaktiske resultat. Typisk, siden en profylaktisk dose blir anvendt i subjekter før eller ved et tidlig stadie av sykdommen, vil den profylaktisk effektive mengden være mindre enn den terapeutisk effektive mengden.
Dose-regimer kan bli justert for å tilveiebringe den optimale ønskede responsen ( f. eks., en terapeutisk eller profylaktisk respons). For eksempel, et enkelt bolus kan bli administrert, flere oppdelte doser kan bli administrert over tid eller dosen kan bli proporsjonalt redusert eller økt som indikert ved kravene til den terapeutiske situasjonen. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale sammensetninger i doseenhetsform for enkel administrasjon og dose-enhetlighet. Doseenhetsform som anvendt heri refererer til fysisk adskilte enheter egnet som enhetsdoser for de mammaliske subjektene som skal behandles; hver enhet inneholdende en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet for å produsere den ønskede terapeutiske virkningen i assosiasjon med den nødvendige farmasøytiske bæreren. Spesifikasjonen for doseenhetsformene ifølge oppfinnelsen er diktert ved og direkte avhengig av (a) de unike karakteristikkene til den aktive forbindelsen og den bestemte terapeutiske eller profylaktiske virkningen som skal oppnås, og (b) begrensningene iboende i formuleringsteknikken av en slik aktiv forbindelse for behandlingen av følsomhet i individer.
Et eksempelvis, ikke-begrensende område for en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et bindende protein ifølge oppfinnelsen er 0.1-20 mg/kg, for eksempel, 1-10 mg/kg. Det skal legges merke til at dose verdier kan variere med typen og alvorlighetsgrad av tilstanden som skal forbedres. Det skal bli videre forstått at for ethvert bestemt subjekt bør spesifikke dose-regimer bli justert over tid ifølge det individuelle behov og den profesjonelle vurderingen til personen som administrerer eller overvåker administrasjonen av sammensetningene, og at doseområdene presentert heri, bare er eksempelvise og er ikke ment for å begrense omfanget eller utøvelsen av den krevde sammensetningen.
V. Diagnostikk
Beskrivelsen heri tilveiebringer også diagnostiske anvendelser. Dette er videre belyst nedenfor.
I. Assay-metode
Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer også en metode for å bestemme tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av en analytt (eller et fragment derav) i en testprøve ved å bruke minst et DVD-Ig som beskrevet heri. Ethvert passende assay som er kjent i teknikken kan bli anvendt i metoden. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, immunoassay, slik som sandwich immunoassay (f.eks., monoklonale, polyklonale og/eller DVD-Ig sandwich immunoassayer eller enhver variasjon derav (f.eks., monoklonale/DVD-Ig, DVD-Ig/polyklonale, osv.), inkludert radioisotop-deteksjon (radioimmunoassay (RIA)) og enzym-deteksjon (enzym immunoassay (EIA) eller enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) (f.eks., Quantikine ELISA assayer, R&D Systems, Minneapolis, MN))), kompetitive inhiberingsimmunoassay (f.eks., forover og revers), fluorescens polarisering immunoassay (FPIA), enzym multiplisert immunoassay teknikk (EMIT), bioluminescens resonansenergi-o ver føring (BRET), og homogenet kjemiluminescens assay, osv. I et SELDI-basert immunoassay, et fangstreagens som spesifikt binder en analytt (eller et fragment derav) av interesse er knyttet til overflaten av en massespektrometri probe, slik som et pre-aktivert proteinchip array. Analytten (eller et fragment derav) blir så spesifikt fanget på biochip'en, og den fangede analytten (eller et fragment derav) er detektert ved massespektrometri. Alternativt kan analytten (eller et fragment derav) bli eluert fra fangst-reagenset og detektert ved tradisjonell MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisering) eller av SELDI. Et kjemoluminescent mikropartikkel-immunoassay, spesielt et som anvender en ARCHITECT® automatisert analysator (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), er et eksempel på et foretrukket immunoassay.
Metoder velkjent i teknikken for å samle inn, håndtere og prosessere urin, blod, serum og plasma, og andre kroppsvæsker, blir anvendt i utøvelsen av den foreliggende beskrivelsen, for eksempel, når et DVD-Ig som beskrevet heri blir anvendt som et immunodiagnoserende reagens og/eller i et analytt immunoassay kit. Testprøven kan omfatte videre enheter i tillegg til analytten av interesse, slik som antistoffer, antigener, haptener, hormoner, legemidler, enzymer, reseptorer, proteiner, peptider, polypeptider, oligonukleotider og/eller polynukleotider. For eksempel kan prøven være en helt-blod prøve oppnådd fra et subjekt. Det kan være nødvendig eller ønsket at en testprøve, spesielt helt blod, blir behandlet før immunoassay som beskrevet heri, f.eks., med et forbehandlingsreagens. Selv i tilfeller hvor forbehandling ikke er nødvendig (f.eks., de fleste urinprøver), kan forbehandling valgfritt bli gjort (f.eks., som en del av et regime på en kommersiell platform).
Forbehandlingsreagenset kan være ethvert reagens passende for anvendelse med immunoassayet og kit ifølge oppfinnelsen. Forbehandlingen omfatter valgfritt: (a) en eller flere løsemidler (f.eks., metanol og etylenglykol) og valgfritt, salt, (b) en eller flere løsemidler og salt, og valgfritt, detergent, (c) detergent, eller (d) detergent og salt. Forbehandlingsreagenser er kjent i teknikken, og slike forbehandlinger kan bli anvendt, f.eks., som anvendt for assayer på Abbott TDx, AxSYM®, og ARCHITECT® analysatorer (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), som beskrevet i litteraturen (se, f.eks., Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), og Wallemacq et al., Evaluation of the Novel AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)), og/eller som kommersielt tilgjengelig. Videre kan forbehandling bli gjort som beskrevet i Abbotts U.S. Pat. Nr. 5,135,875, European Pat. Pub. No. 0 471 293, U.S Provisorisk Pat. App. 60/878,017, innlevert desember 29, 2006, og U.S. Pat. App. Pub. Nr. 2008/0020401 (inkorporert ved referanse i sin helhet for sin lære angående forbehandling). Forbehandlingsreagenset kan være et heterogent middel eller et homogent middel.
Med anvendelse av et heterogent forbehandlingsreagens, presipiterer forbehandlingsreagenset analytt-bindende protein (f.eks., protein som kan binde til en analytt eller et fragment derav) tilstede i prøven. Et slikt forbehandlingstrinn omfatter å fjerne ethvert analytt-bindende protein ved å separere fra det utfelte stoffet av analytt-bindende protein fra supernatanten til blandingen dannet ved tilsetning av forbehandlingsmiddelet til prøven. I et slik assay blir supernatanten til blandingen uten bindende protein anvendt i assayet, fortsettende direkte til antistoff-fangingstrinnet.
Med anvendelse av et homogent forbehandlingsreagens er det ikke noe slikt separasjonstrinn. Hele blandingen av test-prøve og forbehandlingsreagens blir kontaktet med en merket spesifikt bindende partner for analytten (eller et fragment derav), slik som et merket anti-analytt antistoff (eller et antigen-reaktivt fragment derav). Forbehandlingsreagenset anvendt for et slikt assay blir typisk fortynnet i den forbehandlete test-prøve blandingen, enten før eller i løpet av fangst ved den første spesifikt bindende partneren. Til tross for slik fortynning er en viss mengde av forbehandlingsreagenset fortsatt til stede (eller forblir) i testprøve-blandingen i løpet av fangst. Ifølge oppfinnelsen kan den merkede spesifikt bindende partneren være et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav).
I et heterogent format, etter at testprøven blir oppnådd fra et subjekt, blir en første blanding fremstilt. Blandingen inneholder testprøven som blir vurdert for en analytt (eller et fragment derav) og en første spesifikt bindende partner, hvori den første spesifikt bindende partneren og enhver analytt inneholdt i testprøven danner et første spesifikt bindende partner-analytt kompleks. Fortrinnsvis er den første spesifikt bindende partneren et anti-analytt antistoff eller et fragment derav. Den første spesifikt bindende partneren kan være et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) som beskrevet heri. Rekkefølgen hvori testprøven og den første spesifikt bindende partneren blir tilsatt for å danne blandingen er ikke kritisk. Fortrinnsvis er den første spesifikt bindende partneren immobilisert på en fast fase. Den faste fasen anvendt i immunoassayet (for den første spesifikt bindende partneren og, valgfritt, den andre spesifikt bindende partneren) kan være enhver fast fase kjent i teknikken, slik som, men ikke begrenset til, en magnetisk partikkel, en kule, et reagensrør, en mikrotiter-plate, en kuvette, en membran, et stilasmolekyl, en film, et filterpapir, en plate og en chip.
Etter at blandingen inneholdende det første spesifikt bindende partner-analytt komplekset er dannet blir enhver ikke-bundet analytt fjernet fra komplekset ved å bruke enhver teknikk kjent i teknikken. For eksempel, den ikke-bundete analytten kan bli fjernet ved vasking. Ønsket, imidlertid, den første spesifikt bindende partneren er tilstede i overskudd i forhold til enhver analytt tilstede i testprøven, slik at all analytt som er tilstede i testprøven er bundet til den første spesifikt bindende partneren.
Etter at enhver ikke-bundet analytt er fjernet blir en andre spesifikt bindende partner tilsatt til blandingen for å danne et første spesifikt bindende partner-analytt-andre spesifikt bindende partner kompleks. Den andre spesifikt bindende partneren er fortrinnsvis et anti-analytt antistoff som binder til en epitop på analytten som er forskjellig fra epitopen på analytten som er bundet til den første spesifikt bindende partneren. Videre, også fortrinnsvis, er den andre spesifikt bindende partneren merket med eller inneholder en detekterbar markør som beskrevet over. Den andre spesifikt bindende partneren kan være et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) som beskrevet heri.
Enhver passende detekterbar markør som er kjent i teknikken kan bli anvendt. For eksempel kan den detekterbare markøren være en radioaktiv markør (slik som 3H, 1251, 35S, 14C, 32P, og 33P), en enzymatisk markør (slik som pepperrot peroksidase, basisk peroksidase, glukose 6-fosfat dehydrogenase, og lignende), en kjemiluminescerende markør (slik som acridinium estere, tioestere, eller sulfonamider; luminol, isoluminol, fenanthridinium estere, og lignende), et fluorescerende merkestoff (slik som fluorescein (f.eks., 5-fluorescein, 6-karboksyfluorescein, 3'6-karboksyfluorescein, 5(6)-karboksyfluorescein, 6-heksaklor-fluorescein, 6-tetraklorfluorescein, fluorescein isotiocyanat, og lignende)), rhodamin, fycobiliproteiner, R-fycoerythrin, kvanteprikker (f.eks., sinksulfid-"capped" kadmiumselenid), en termometrisk markør, eller en immuno-polymerase kjedereaksjon markør. En introduksjon til merkestoffer, merkingsprosedyrer og deteksjon av merkestoffer er funnet i Polak og Van Noorden, Introduksjon to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), og i Haugland, Handbook of Fluorescent Probes og Research Kjemikalier (1996), som er en kombinert håndbok og katalog publisert av Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Et fluorescerende merkestoff kan bli anvendt i FPIA (se, f.eks., U.S. Patentnr.. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, og 5,352,803, som er herved inkorporert ved referanse i deres helhet). En acridinium-forbindelse kan bli anvendt som en detekterbar markør i et homogent eller heterogent kjemiluminescerende assay (se, f.eks., Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); og Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)).
En foretrukket acridinium-forbindelse er et acridinium-9-karboksamid. Metoder for å fremstille acridinium 9-karboksamider er beskrevet i Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114
(1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., I Luminescence Bioteknologi: Instrumenter og Søknader; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); og U.S. Pat. Nr. 5,468,646, 5,543,524 og 5,783,699 (hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet for deres lære angående samme). En annen foretrukket acridinium-forbindelse er en acridinium-9-karboksylat arylester. Et eksempel på en acridinium-9-karboksylat arylester er 10-metyl-9-(fenoksykarbonyl)acridinium fluorsulfonat (tilgjengelig fra Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Metoder for å fremstille acridinium 9-karboksylat aryl estere er beskrevet i McCapra et al., Fotochem. Fotobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); og U.S. Patentnr. 5,241,070 (hver av hvilke er inkorporert heri ved referanse i deres helhet for deres lære angående samme). Videre detaljer angående acridinium-9-karboksylat aryl ester og dets anvendelse er vist i US 2008-0248493.
Kjemiluminescerende assayer (f.eks., ved å bruke acridinium som beskrevet over eller andre kjemiluminescerende midler) kan bli utført i henhold til metodene beskrevet i Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Mens ethvert passende assay-format kan bli anvendt, et mikroplate chemiluminometer (Mithras LB-940, Berthold Teknologier U.S.A., LLC, Oak Ridge, TN) muliggjør hurtig assay av flere prøver med lite volum.
Rekkefølgen hvori testprøven og den spesifikt bindende partneren(e) blir tilsatt for å danne blandingen for kjemiluminescerende assay er ikke kritiske. Hvis den første spesifikt bindende partneren er detekterbart merket med et kjemiluminescerende middel slik som en acridinium-forbindelse, dannes detekterbart merket første spesifikt bindende partner-analytt komplekser. Alternativt, hvis en andre spesifikt bindende partner blir anvendt og den andre spesifikt bindende partneren er detekterbart merket med et kjemiluminescerende middel slik som en acridinium-forbindelse, dannes detekterbart merket første spesifikt bindende partner-analytt-andre spesifikt bindende partner komplekser. Enhver ikke-bundet spesifikt bindende partner, enten merket eller umerket, kan bli fjernet fra blandingen ved å bruke enhver teknikk kjent i teknikken, slik som vasking.
Hydrogenperoksid kan bli fremstilt in situ i blandingen eller tilveiebrakt eller levert til blandingen (f.eks., kilden for hydrogenperoksidet er en eller flere buffere eller andre løsninger som er kjent å inneholde hydrogenperoksid) før, samtidig med, eller etter tilsetningen av en acridinium-forbindelse som beskrevet over. Hydrogenperoksid kan bli fremstilt in situ på en rekke måter som vil være åpenbare for en fagmann.
Ved den samtidige eller etterfølgende tilsetningen av minst en basisk løsning til prøven, et detekterbart signal, nemlig, et kjemiluminescerende signal, indikerende for nærværet av analytt er fremstilt. Den basiske løsningen inneholder minst en base og har en pH større enn eller lik til 10, fortrinnsvis, større enn eller lik 12. Eksempler på basiske løsninger inkluderer, men er ikke begrenset til, natriumhydroksid, kaliumhydroksid, kalsiumhydroksid, ammoniumhydroksid, magnesiumhydroksid, natriumkarbonat, natriumbikarbonat, kalsiumhydroksid, kalsiumkarbonat, og kalsiumbikarbonat. Mengden av basisk løsning tilsatt til prøven er avhengig av konsentrasjonen av den basiske løsningen. Basert på konsentrasjonen av den basiske løsningen anvendt, en fagmann kan lett bestemme mengden av basisk løsning å tilsette til prøven.
Det kjemiluminescerende signalet som er fremstilt kan bli detektert ved å bruke rutinemessige teknikker kjent for fagmannen. Basert på intensiteten av signalet fremstilt, mengden av analytt i prøven kan bli kvantifisert. Spesifikt, mengden av analytt i prøven er proporsjonal med intensiteten av signalet fremstilt. Mengden av analytt til stede kan bli kvantifisert ved å sammenligne mengden av lys fremstilt med en standardkurve for analytt eller ved sammenligning med en referansestandard. Standardkurven kan bli fremstilt ved å bruke serielle fortynninger eller løsninger med kjente konsentrasjoner av analytt ved massespektroskopi, gravimetriske metoder, og andre teknikker kjent i teknikken. Mens det overnevnte er beskrevet med vekt på anvendelse av en acridinium-forbindelse som det kjemiluminescerende middelet, kan en med vanlig ferdighet i teknikken lett tilpasse denne beskrivelsen for anvendelse av andre kjemiluminescerende midler.
Analytt immunoassayer generelt kan bli utført ved å bruke ethvert format kjent i teknikken, slik som, men ikke begrenset til, et sandwich format. Spesifikt, i et immunoassay-format, blir minst to antistoffer anvendt for å separere og kvantifisere analytt, slik som human analytt, eller et fragment derav i en prøve. Mer spesifikt, de minst to antistoffene binder to forskjellige epitoper på en analytt (eller et fragment derav) under dannelse av et immunkompleks, som er referert til som en "sandwich." Generelt, i immunoassayene en eller flere antistoffer kan bli anvendt for å fange analytten (eller et fragment derav) i testprøven (disse antistoffer er ofte referert til som et "capture" antistoff eller "capture" antistoffer) og en eller flere antistoffer kan bli anvendt for å binde en detekterbar (nemlig, kvantifiserbar) markør til sandwich'en (disse antistoffer er ofte referert til som "deteksjons-antistoffet," "deteksjons-antistoffene," "konjugatet," eller "konjugatene"). Følgelig, i sammenheng med et sandwich immunoassay-format, et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) som beskrevet heri kan bli anvendt som et fange-antistoff, et deteksjons-antistoff, eller begge deler. For eksempel, et DVD-Ig som har et domene som kan binde en første epitop på en analytt (eller et fragment derav) kan bli anvendt som et fange-antistoff og/eller en annen DVD-Ig som har et domene som kan binde en andre epitop på en analytt (eller et fragment derav) kan bli anvendt som et deteksjons-antistoff. I denne sammenhengen, et DVD-Ig som har et først domene som kan binde en første epitop på en analytt (eller et fragment derav) og et andre domene som kan binde en andre epitop på en analytt (eller et fragment derav) kan bli anvendt som et fange-antistoff og/eller et deteksjons-antistoff. Alternativt, et DVD-Ig som har et først domene som kan binde en epitop på en første analytt (eller et fragment derav) og et andre domene som kan binde en epitop på en andre analytt (eller et fragment derav) kan bli anvendt som et fange-antistoff og/eller et deteksjons-antistoff for å detektere, og valgfritt kvantifisere, to eller flere analytter. I det tilfellet at en analytt kan være tilstede i en prøve i mer enn en form, slik som en monomert form og en dimer/multimer form, som kan være homomerisk eller heteromerisk, et DVD-Ig som har et domene som kan binde en epitop som er bare eksponert på den monomere formen og en annen DVD-Ig som har et domene som kan binde en epitop på en forskjellig del av en dimer/multimer form kan bli anvendt som fangst-antistoffer og/eller deteksjon-antistoffer, dermed muligjørende deteksjonen, og valgfri kvantifisering, av forskjellige former av en gitt analytt. Videre, å anvende DVD-Ig'er med forskjellige affiniteter innenfor et enkelt DVD-Ig og/eller mellom DVD-Ig'er kan tilveiebringe en aviditetsfordel. I sammenheng med immunoassayer som beskrevet heri kan det generelt være hjelpsomt eller ønsket å inkorporere en eller flere linkere innenfor strukturen til et DVD-Ig. Når til stede, bør optimalt linkeren være av tilstrekkelig lengde og strukturell fleksibilitet for å muliggjøre binding av en epitop ved de indre domenene så vel som binding av en annen epitop ved de ytre domenene. I denne sammenhengen, hvis et DVD-Ig kan binde to forskjellige analytter og en analytt er større enn den andre, er det ønsket at den større analytten er bundet ved de ytre domenene.
Generelt sagt, en prøve som blir utprøvd for (for eksempel, mistenkt å inneholde) analytt (eller et fragment derav) kan bli kontaktet med minst et fangst-antistoff (eller antistoffer) og minst et deteksjons-antistoff (som kan være et andre deteksjons-antistoff eller et tredje deteksjons-antistoff eller til og med et etterfølgende nummerert antistoff, f.eks., som når fangst- og/eller deteksjons-antistoffet omfatter flere antistoffer) enten samtidig eller sekvensielt og i enhver rekkefølge. For eksempel kan testprøven først bli kontaktet med minst et fangst-antistoff og deretter (sekvensielt) med minst et deteksjons-antistoff. Alternativt kan testprøven først bli kontaktet med minst et deteksjons-antistoff og deretter (sekvensielt) med minst et fangst-antistoff. I nok et annet alternativ kan testprøven bli kontaktet samtidig med et fange-antistoff og et deteksjons-antistoff.
I sandwich assay-formatet, en prøve mistenkt å inneholde analytt (eller et fragment derav) er først brakt i kontakt med minst et første fangst-antistoff under betingelser som tillater dannelsen av et første antistoff/analytt kompleks. Hvis mer enn et fangst-antistoff blir anvendt, et første fangst-antistoff/analytt kompleks omfattende to eller flere fangst-antistoffer er dannet. I et sandwich-assay, antistoffene, dvs., fortrinnsvis, det minst ene fangst-antistoffet, blir anvendt i molart overskudd i forhold til den maksimale mengden av analytt (eller et fragment derav) forventet i testprøven. For eksempel, fra omtrent 5 ug til omtrent 1 mg med antistoff per mL med buffer (f.eks., mikropartikkel-beleggingsbuffer) kan bli anvendt.
Kompetitive inhiberingsimmunoassayer, som er ofte anvendt for å måle små analytter fordi binding ved bare et antistoff er nødvendig, omfatter sekvensielle og klassiske formater. I et sekvensielt kompetitivt inhiberingsimmunoassay et fange-antistoff til en analytt av interesse er belagt på en brønn i en mikrotiter-plate eller annen fast støtte. Når prøven inneholdende analytten av interesse blir tilsatt til brønnen, binder analytten av interesse til fangst-antistoffet. Etter vasking blir en kjent mengde av merket (f.eks., biotin eller pepperrot peroksidase (HRP)) analytt tilsatt til brønnen. Et substrat for en enzymatisk markør er nødvendig for å generere et signal. Et eksempel på et passende substrat for HRP er 3,3',5,5'-tetrametylbenzidine (TMB). Etter vasking, blir signalet fremstilt ved den merkede analytten målt og er inverst proporsjonalt med mengden av analytt i prøven. I et klassisk kompetitivt inhiberingsimmunoassay blir et antistoff til en analytt av interesse belagt på en fast støtte (f.eks., en brønn i en mikrotiterplate). Imidlertid, i motsetning til det sekvensielle kompetitive inhiberingsimmunoassayet, blir prøven og den merkede analytten tilsatt til brønnen samtidig. Enhver analytt i prøven konkurrerer med merket analytt for binding til fangst-antistoffet. Etter vasking, blir signalet fremstilt ved den merkede analytten målt og er inverst proporsjonalt med mengden av analytt i prøven.
Valgfritt, før man kontakter testprøven med det minst ene fangst-antistoffet (for eksempel, det første fangst-antistoffet), det minst ene fangst-antistoffet kan bli bundet til en fast støtte, som legger til rette for separeringen av det første antistoff/analytt (eller et fragment derav) komplekset fra testprøven. Substratet til hvilket fangst-antistoffet er bundet kan være enhver passende fast støtte eller fast fase som legger til rette for separering av fangst-antistoff-analytt komplekset fra prøven.
Eksempler inkluderer en brønn i en plate, slik som en mikrotiterplate, et reagensrør, en porøs gel (f.eks., silikagel, agarose, dekstran, eller gelatin), en polymerfilm (f.eks., polyakrylamid), kuler (f.eks., polystyren-kuler eller magnetiske kuler), en strimmel av et filter/membran (f.eks., nitrocellulose eller nylon), mikropartikler (f.eks., latex partikler, magnetiserbare mikropartikler (f.eks., mikropartikler som har jernoksid- eller kromoksid-kjerner og homo- eller hetero-polymer belegg og radius på omtrent 1-10 mikron). Substratet kan omfatte et passende porøst materialet med en passende overflate-affinitet for å binde antigener og tilstrekkelig porøsitet for å tillate tilgang av deteksjon-antistoffer. Et mikroporøst materiale er generelt foretrukket, selv om et gelatinøst materiale i en hydratisert tilstand kan bli anvendt. Slike porøse substrater er fortrinnsvis i form av ark som har en tykkelse på omtrent 0.01 til omtrent 0.5 mm, fortrinnsvis omtrent 0.1 mm. Mens porestørrelsen kan variere ganske mye, porestørrelsen er fortrinnsvis fra omtrent 0.025 til omtrent 15 mikron, mer fortrinnsvis fra omtrent 0.15 til omtrent 15 mikron. Overflaten av slike substrater kan bli aktivert ved kjemiske prosesser som forårsaker kovalent sammenkobling av et antistoff til substratet. Irreversibel binding, generelt ved absorbsjon gjennom hydrofobe krefter, av antigenet eller antistoffet til substratet er resultatet; alternativt, et kjemisk koblingsmiddel eller andre midler kan bli anvendt for å ko valent binde antistoffet til substratet, forutsatt at slik binding ikke interfererer med evnen til antistoffet for å binde til analytt. Alternativt, antistoffet kan bli bundet med mikropartikler, som har blitt tidligere belagt med streptavidin (f.eks., DYNAL® Magnetisk Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA) eller biotin (f.eks., ved å bruke Power-BindTM-SA-MP streptavidin-belagt mikropartikler (Seradyn, Indianapolis, I)) eller anti-art-spesifikke monoklonale antistoffer. Hvis nødvendig kan substratet bli derivatisert for å tillate reaktivitet med diverse funksjonelle grupper på antistoffet. Slik derivatisering krever anvendelsen av visse koblingsmidler, eksempler på som inkluderer, men er ikke begrenset til, maleinanhydrid, N-hydroksysuksinimid, og l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimide. Hvis ønsket, en eller flere fangst-reagenser, slik som antistoffer (eller fragmenter derav), hver av hvilke er spesifikke for analytt(er) kan bli knyttet til faste faser i forskjellige fysiske eller addresserbare plasseringer (f.eks., slik som i en biochip-konfigurasjon (se, f.eks., U.S. Pat. Nr. 6,225,047; Int'1 Pat. App. Pub. Nr. WO 99/51773; U.S. Pat. Nr. 6,329,209; Int'1 Pat. App. Pub. Nr. WO 00/56934, og U.S. Pat. Nr. 5,242,828). Hvis fangst-reagenset er knyttet til en massespektrometri probe som den faste støtten kan mengden av analytt bundet til proben bli detektert ved laser-desorbsjonsionisering massespektrometri. Alternativt kan en enkelt kolonne bli pakket med forskjellig kuler, som er derivatisert med det ene eller flere fangst-reagenser, for dermed å fange analytten på et enkelt sted (se, antistoff-derivatisert, kule-basert teknologier, f.eks., xMAP teknologien til Luminex (Austin, TX)).
Etter at testprøven som blir analysert for analytt (eller et fragment derav) er brakt i kontakt med det minst ene fangst-antistoffet (for eksempel, det første fangst-antistoffet), blir blandingen inkubert i å muliggjøre dannelsen av et første antistoff (eller multippel antistoff)-analytt (eller et fragment derav) kompleks. Inkuberingen kan bli utført ved en pH på fra omtrent 4.5 til omtrent 10.0, ved en temperatur på fra omtrent 2°C til omtrent 45 °C, og i en periode fra minst omtrent ett (1) minutt til omtrent atten (18) timer, fortrinnsvis fra omtrent 1 til omtrent 24 minutter, mest fortrinnsvis i omtrent 4 til omtrent 18 minutter. Immunoassayet beskrevet heri kan bli utført i ett trinn (dvs. testprøven, minst et fangst-antistoff og i det minste et deteksjons-antistoff er alle tilsatt sekvensielt eller samtidig til en reaksjonsbeholder) eller i mer enn ett trinn, slik som to trinn, tre trinn, osv.
Etter dannelse av (første eller flere) fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav) komplekset, blir komplekset så kontaktet med minst et deteksjons-antistoff under betingelser som tillater for dannelsen av et (første eller flere) fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav)/andre deteksjon-antistoff kompleks. Selv om det er benevnt det "andre" antistoff for klarhet (f.eks., andre deteksjon-antistoff), er faktum at, når flere antistoffer blir anvendt for fangst og/eller deteksjon, det minst ene deteksjons-antistoffet kan være det andre, tredje, fjerde, osv. antistoffet anvendt i immunoassayet. Hvis fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav) komplekset blir kontaktet med mer enn ett deteksjons-antistoff, blir deretter et (første eller flere) fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav)/(flere) deteksjons-antistoff kompleks dannet. Som med fangst-antistoffet (f.eks., det første fangst-antistoffet), når det minst ene (f.eks., andre og enhver etterfølgende) deteksjons-antistoffet er brakt i kontakt med fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav) komplekset, en periode med inkubering under betingelser lignende de beskrevet over er nødvendig for dannelsen av (første eller flere) fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav)/(andre eller flere) deteksjons-antistoff komplekset. Fortrinnsvis, minst et deteksjons-antistoff inneholder en detekterbar markør. Den detekterbare markøren kan bli bundet til det minst ene deteksjons-antistoffet (f.eks., det andre deteksjon-antistoffet) før, samtidig med, eller etter dannelsen av (første eller flere) fangst-antistoff/analytt (eller et fragment derav)/(andre eller flere) deteksjons-antistoff komplekset. Enhver detekterbar markør kjent i teknikken kan bli anvendt (se diskusjon over, inkludert Polak og Van Noorden (1997) og Haugland (1996) referanser).
Den detekterbare markøren kan bli bundet til antistoffene enten direkte eller gjennom et koblingsreagens. Et eksempel på et koblingsreagens som kan bli anvendt er EDAC (l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimide, hydroklorid), som er kommersielt tilgjengelig fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Andre koblingsmidler som kan bli anvendt er kjent i teknikken. Metoder for å binde en detekterbar markør til et antistoffer kjent i teknikken. Videre, mange detekterbar merkestoffer kan bli kjøpt eller syntetisert som allerede inneholder ende-grupper som legger til rette for koblingen av den detekterbare markøren til antistoffet, slik som CPSP-Acridinium Ester (dvs., 9-[N-tosyl-N-(3-karboksypropyl)]-10-(3-sulfopropyl)acridinium karboksamid) eller SPSP-Acridinium Ester (dvs., N10-(3-sulfopropyl)-N-(3-sulfopropyl)-acridinium-9-karboksamid).
(første eller flere) fangst-antistoff/analytt/(andre eller flere) deteksjons-antistoff komplekset kan bli, men må ikke bli, separert fra resten av testprøven før kvantifisering av markøren. For eksempel, hvis det minst ene fangst-antistoffet (f.eks., det første fangst-antistoffet) er bundet til en fast støtte, slik som en brønn eller en kule, separasjon kan bli oppnådd ved å fjerne fluidet (til testprøven) fra kontakt med den faste støtten. Alternativt, hvis det minst første fangst-antistoffet er bundet til en fast støtte, kan det samtidig bli kontaktet med den analytt-inneholdende prøven og det minst en andre deteksjons-antistoffet for å danne et første (flere) antistoff/analytt/andre (flere) antistoff kompleks, etterfulgt av fjerning av fluidet (test prøve) fra kontakt med den faste støtten. Hvis det minst ene første fangst-antistoffet ikke er bundet til en fast støtte, da trenger ikke det (første eller flere) fangst-antistoff/analytt/(andre eller flere) deteksjons-antistoff komplekset å bli fjernet fra testprøven for kvantifisering av mengden av markøren.
Etter dannelse av det merkede fangst-antistoff/analytt/deteksjons-antistoff komplekset (f.eks., det første fangst-antistoffet/analytt/andre deteksjon-antistoff kompleks), blir mengden av markør i komplekset kvantifisert ved å bruke teknikker kjent i teknikken. For eksempel, hvis en enzymatisk markør blir anvendt, blir det merkede komplekset reagert med et substrat for markøren som gir en kvantifiserbar reaksjon slik som utviklingen av farge. Hvis markøren er en radioaktiv markør, markøren er kvantifisert ved å bruke passende metoder, slik som en scintilleringsteller. Hvis markøren er et fluorescerende merkestoff, markøren er kvantifisert ved å stimulere markøren med et lys av en farge (som er kjent som den "eksiterende bølgelengden") og å detektere en annen farge (som er kjent som "emisjonsbølgelengden") som blir emittert av markøren som reaksjon på stimuleringen. Hvis markøren er en kjemiluminescerende markør, markøren er kvantifisert ved å detektere lyset som blir sendt ut enten visuellt eller ved å bruke luminometere, røntgenfilm, høyhastighets fotografisk film, et CCD kamera, osv. Når mengden av markøren i komplekset har blitt kvantifisert, konsentrasjonen av analytt eller et fragment derav i testprøven er bestemt ved passende metoder, slik som ved anvendelse av en standardkurve som har blitt fremstilt ved å bruke serielle fortynninger av analytt eller et fragment derav med kjent konsentrasjon. Foruten å bruke serielle fortynninger av analytt eller et fragment derav, standardkurven kan bli fremstilt gravimetrisk, ved massespektroskopi og ved andre teknikker kjent i teknikken.
I et kjemiluminescerende mikropartikkel assay ved bruk av ARCHITECT® analysator, bør konjugat-fortynningens pH være omtrent 6.0 +/- 0.2, mikropartikkel-beleggingsbufferen bør bli opprettholdt ved omtrent romtemperatur (dvs., ved fra omtrent 17 til omtrent 27 5C), mikropartikkel-beleggingsbufferen pH bør være omtrent 6.5 +/- 0.2, og mikropartikkelfortynningens pH bør være omtrent 7.8 +/- 0.2. Faste stoffer er fortrinnsvis mindre enn omtrent 0.2%, slik som mindre enn omtrent 0.15%, mindre enn omtrent 0.14%, mindre enn omtrent 0.13%, mindre enn omtrent 0.12%, eller mindre enn omtrent 0.11%, slik som omtrent 0.10%.
FPIAs er basert på kompetitivt bindende immunoassay prinsipper. En fluorescerende merket forbindelse, når eksitert med et lineært polarisert lys, vil sende ut fluorescens som har en polariseringsgrad inverst proporsjonalt med dets rotasjonshastighet. Når et fluorescerende merket tracer-antistoff kompleks er eksitert med et lineært polarisert lys, forblir det utsendte lyset i høy grad polarisert fordi fluoroforen er forhindret fra å rotere mellom tiden lys er absorbert og tiden lys er sendt ut. Når en "fri" tracer-forbindelse (dvs., en forbindelse som ikke er bundet til et antistoff) blir eksitert ved lineært polarisert lys, dets rotasjon er mye raskere enn det korresponderende tracer-antistoff konjugat produsert i et kompetitivt bindende immunoassay. FPIAs er fordelaktig over RIAs av den grunn at det ikke er noen radioaktive stoffer som må ha spesiell håndtering og avhending. I tillegg er FPIAs homogene assayer som kan lett og hurtig bli utført.
I lys av det overstående, en metode for å bestemme tilstedeværelsen, mengde, eller konsentrasjon av analytt (eller et fragment derav) i en testprøve er tilveiebrakt. Metoden omfatter å analysere testprøven for en analytt (eller et fragment derav) ved et assay (i) ved å anvende (i') minst en av et antistoff, et fragment av et antistoff som kan binde til en analytt, en variant til et antistoff som kan binde til en analytt, et fragment av en variant til et antistoff som kan binde til en analytt, og et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) som kan binde til en analytt, og (ii') minst en detekterbar markør og (ii) omfattende å sammenligne et signal fremstilt ved den detekterbare markøren som en direkte eller indirekte indikasjon på tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av analytt (eller et fragment derav) i testprøven til et signal fremstilt som en direkte eller indirekte indikasjon på tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av analytt (eller et fragment derav) i en kontroll eller kalibrator. Kalibratoren er valgfritt del av en serie med kalibratorer, hvori hver av kalibratorene er forskjellige fra de andre kalibratorene ved konsentrasjonen av analytt.
Metoden kan omfatte (i) å kontakte testprøven med minst en første spesifikt bindende partner for analytt (eller et fragment derav) valgt fra gruppen bestående av et antistoff, et fragment av et antistoff som kan binde til en analytt, en variant til et antistoff som kan binde til en analytt, et fragment av en variant til et antistoff som kan binde til en analytt, og et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) som kan binde til en analytt for å danne et første spesifikt bindende partner/analytt (eller fragment derav) kompleks, (ii) å kontakte det første spesifikt bindende partneren/analytt (eller fragment derav) kompleks med minst en andre spesifikt bindende partner for analytt (eller fragment derav) valgt fra gruppen bestående av et detekterbart merket anti-analytt antistoff, et detekterbart merket fragment av et anti-analytt antistoff som kan binde til analytt, en detekterbart merket variant av et anti-analytt antistoff som kan binde til analytt, et detekterbart merket fragment av en variant av et anti-analytt antistoff som kan binde til analytt, og et detekterbart merket DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) for å danne et første spesifikt bindende partner/analytt (eller fragment derav)/andre spesifikt bindende partner kompleks, og (iii) å bestemme tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av analytt i testprøven ved å detektere eller måle signalet fremstilt ved den detekterbare markøren i det første spesifikt bindende partneren/analytt (eller fragment derav)/andre spesifikt bindende partner komplekset dannet i (ii). En metode hvori minst en første spesifikt bindende partner for analytt (eller et fragment derav) og/eller minst en andre spesifikt bindende partner for analytt (eller et fragment derav) er et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) som beskrevet heri kan bli foretrukket.
Alternativt kan metoden omfatte å kontakte testprøven med minst en første spesifikt bindende partner for analytt (eller et fragment derav) valgt fra gruppen bestående av et antistoff, et fragment av et antistoff som kan binde til en analytt, en variant til et antistoff som kan binde til en analytt, et fragment av en variant til et antistoff som kan binde til en analytt, og et DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav) og samtidig eller sekvensielt, i hvilken som helst rekkefølge, å kontakte testprøven med minst en andre spesifikt bindende partner, som kan konkurrere med analytt (eller et fragment derav) for binding til den minst en første spesifikt bindende partner og som er valgt fra gruppen bestående av en detekterbart merket analytt, et detekterbart merket fragment av analytt som kan binde til den første spesifikt bindende partneren, en detekterbart merket variant av analytt som kan binde til den første spesifikt bindende partneren, og et detekterbart merket fragment av en variant av analytt som kan binde til den første spesifikt bindende partneren. Enhver analytt (eller et fragment derav) tilstede i testprøven og den minst en andre spesifikt bindende partner konkurrerer med hverandre for å danne henholdsvis et første spesifikt bindende partner/analytt (eller fragment derav) kompleks og en første spesifikt bindende partner/andre spesifikt bindende partner kompleks. Metoden omfatter videre å bestemme tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av analytt i testprøven ved å detektere eller måle signalet fremstilt ved den detekterbare markøren i det første spesifikt bindende partneren/andre spesifikt bindende partner komplekset dannet i (ii), hvori signalet fremstilt ved den detekterbare markøren i det første spesifikt bindende partneren/andre spesifikt bindende partner komplekset er inverst proporsjonalt med mengden eller konsentrasjon av analytt i testprøven.
Metodene over kan videre omfatte å diagnosere, prognosere, eller vurdere effekten av en terapeutisk/profylaktisk behandling av en pasient fra hvem testprøven ble oppnådd. Hvis metoden videre omfatter å vurdere effekten av en terapeutisk/profylaktisk behandling av pasienten fra hvem testprøven ble oppnådd, omfatter metoden valgfritt videre å modifisere den terapeutiske/profylaktiske behandlingen av pasienten etter behov for å forbedre effekt. Metoden kan bli tilpasset for anvendelse i et automatisert system eller et halvautomatisert system.
Med hensyn til assay-metodene (og kit for dette), kan det være mulig å anvende kommersielt tilgjengelig anti-analytt antistoffer eller metoder for produksjon av anti-analytt som beskrevet i litteraturen. Kommersielle kilder for diverse antistoffer inkluderer, men er ikke begrenset til, Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA), og R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN).
Generelt kan et forutbestemt nivå bli anvendt som en referanse for å vurdere resultater oppnådd ved å analysere en testprøve for analytt eller et fragment derav, f.eks., for å detektere sykdom eller risiko for sykdom. Generelt når man gjør en slik sammenligning, blir det forutbestemte nivå oppnådd ved å kjøre et bestemt assay et tilstrekkelig antall ganger og under passende betingelser slik at en sammenkobling eller assosiering av tilstedeværelse av analytt, mengde eller konsentrasjon med en bestemt fase av, eller slutt på, en sykdom, forstyrrelse eller tilstand eller med bestemte kliniske indisier kan bli lagd. Typisk, blir det forutbestemte nivå oppnådd med analyser av referansesubj ekter (eller populasjoner av subjekter). Analytten målt kan inkludere fragmenter derav, degraderingsprodukter derav, og/eller produkter fra enzymatisk spalting derav.
Spesielt, med hensyn til et forutbestemt nivå som anvendt for å monitorere sykdomsprogresjon og/eller behandling, mengden eller konsentrasjon av analytt eller et fragment derav kan bli "uforandret," "gunstig" (eller "gunstig forandret"), eller "ugunstig" (eller "ugunstig forandret"). "Forhøyet" eller "økt" refererer til en mengde eller en konsentrasjon i en testprøve som er høyere enn et typisk eller normalt nivå eller område (f.eks., forutbestemt nivå), eller er høyere enn et annet referansenivå eller område (f.eks., tidligere eller grunnlinje prøve). Uttrykket "senket" eller "redusert" refererer til en mengde eller en konsentrasjon i en testprøve som er lavere enn et typisk eller normalt nivå eller område (f.eks., forutbestemt nivå), eller er lavere enn et annet referansenivå eller område (f.eks., tidligere eller grunnlinje prøve). Uttrykket "forandret" refererer til en mengde eller en konsentrasjon i en prøve som er forandret (økt eller senket) over et typisk eller normalt nivå eller område (f.eks., forutbestemt nivå), eller over et annet referansenivå eller område (f.eks., tidligere eller grunnlinje prøve).
Det typiske eller normale nivå eller område for analytt er definert i henhold til standard praksis. Fordi nivåene av analytt i noen tilfeller vil være veldig lavt, et såkalt forandret nivå eller forandring kan bli ansett å ha skjedd når det er enhver netto forandring sammenlignet med det typiske eller normale nivå eller område, eller referansenivå eller område, som ikke kan bli forklart ved eksperimentell feil eller prøve-variasjon. Følgelig, nivået målt i en bestemt prøve vil bli sammenlignet med nivået eller område av nivåer bestemt i lignende prøver fra et såkalt normalt subjekt. I denne sammenhengener et "normalt subjekt" et individ uten detekterbar sykdom, for eksempel, og en "normal" (noen ganger benevnt "kontroll") pasient eller populasjon er en som ikke fremviser detekterbar sykdom, henholdsvis, for eksempel. Videre, gitt at analytt ikke er rutinemessig funnet ved et høyt nivå i mesteparten av den menneskelige befolkning, et "normalt subjekt" kan bli ansett som et individ med ingen betydelig detekterbar økt eller forhøyet mengde eller konsentrasjon av analytt, og en "normal" (noen ganger benevnt "kontroll") pasient eller populasjon er en(s) som fremvise(s) ingen betydelig detekterbar økt eller forhøyet mengde eller konsentrasjon av analytt. Et "tilsynelatende normalt subjekt" er en hvori analytt ikke ennå har blitt, eller for tiden blir, vurdert. Nivået av en analytt er nevnt å være "forhøyet" når analytten er normalt udetekterbar (f.eks., det normale nivå er null, eller innenfor et område på fra omtrent 25 til omtrent 75 percentilen for normale populasjoner), men er detektert i en testprøve, så vel som når analytten er tilstede i testprøven ved et høyere enn normalt nivå. Følgelig, inter alia, beskrivelsen tilveiebringer en screenings-metode for et subjekt som har, eller med risiko for å ha, en spesifikk sykdom, forstyrrelse, eller tilstand. Assay-metoden kan også involvere analysen av andre markører og lignende.
Følgelig kan metodene beskrevet heri også bli anvendt for å bestemme om et subjekt har eller risikerer å utvikle en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand. Spesifikt kan en slik metode omfatte trinnet å: (a) bestemme konsentrasjonen eller mengden av analytt (eller et fragment derav) i en testprøve fra et subjekt (f.eks., ved å bruke metodene beskrevet heri, eller metoder kjent i teknikken); og (b) sammenligne konsentrasjonen eller mengden av analytt (eller et fragment derav) bestemt i trinn (a) med et forutbestemt nivå, hvori, hvis konsentrasjonen eller mengden av analytt bestemt i trinn (a) er gunstig med hensyn til et forutbestemt nivå, da er subjektet bestemt til ikke å ha eller være ved risiko for en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand. Imidlertid, hvis konsentrasjonen eller mengden av analytt bestemt i trinn (a) er ugunstig med hensyn til det forutbestemte nivå, da er subjektet bestemt å ha eller være ved risiko for en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand.
Videre, tilveiebrakt heri er en metode for å monitorere progresjonen av sykdom i et subjekt. Optimalt omfatter metoden trinnene å: (a) bestemme konsentrasjonen eller mengden av analytt i en testprøve fra et subjekt; (b) bestemme konsentrasjonen eller mengden av analytt i en senere test-prøve fra subjektet; og (c) sammenligne konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (b) med konsentrasjonen eller mengden av analytt bestemt i trinn (a), hvori hvis konsentrasjonen eller mengden bestemt i trinn (b) er uforandret eller er ugunstig når sammenlignet med konsentrasjonen eller mengden av analytt bestemt i trinn (a), da er sykdommen i subjektet bestemt å ha fortsatt, utviklet seg eller blitt verre. Ved sammenligning, hvis konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (b) er gunstig når sammenlignet med konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (a), da er sykdommen i subjektet bestemt å ha stoppet opp, gått tilbake eller forbedret.
Valgfritt omfatter metoden videre å sammenligne konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (b), for eksempel, med et forutbestemt nivå. Videre omfatter valgfritt metoden å behandle subjektet med en eller flere farmasøytiske sammensetninger i en tid hvis sammenligningen viser at konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (b), for eksempel, er ugunstig forandret med hensyn til det forutbestemte nivå.
Fortsatt videre kan metodene bli anvendt for å overvåke behandling i et subjekt som mottar behandling med en eller flere farmasøytiske sammensetninger. Spesifikt involverer slike metoder å tilveiebringe en første test-prøve fra et subjekt før subjektet har blitt administrert en eller flere farmasøytiske sammensetninger. Så blir konsentrasjonen eller mengden av analytt i en første test-prøve fra et subjekt bestemt (f.eks., ved å bruke metodene beskrevet heri eller som kjent i teknikken). Etter at konsentrasjonen eller mengden av analytt er bestemt, valgfritt konsentrasjonen eller mengden av analytt blir så sammenlignet med et forutbestemt nivå. Hvis konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i den første test-prøven er lavere enn det forutbestemte nivå, da er subjektet ikke behandlet med en eller flere farmasøytiske sammensetninger. Imidlertid, hvis konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i den første test-prøven er høyere enn det forutbestemte nivå, da blir subjektet behandlet med en eller flere farmasøytiske sammensetninger i en tid. Tidsperioden som subjektet blir behandlet med det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger kan bli bestemt av en fagmann (for eksempel kan tidsperioden være fra omtrent syv (7) dager til omtrent to år, fortrinnsvis fra omtrent fjorten (14) dager til omtrent ett (1) år).
I løpet av behandlingen med det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger, blir andre og etterfølgende test-prøver deretter oppnådd fra subjektet. Antallet test-prøver og tiden hvori nevnte test-prøver er oppnådd fra subjektet er ikke kritiske. For eksempel kunne en andre test-prøve bli oppnådd syv (7) dager etter at subjektet er først administrert det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger, en tredje test-prøve kunne bli oppnådd to (2) uker etter at subjektet er først administrert det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger, en fjerde test-prøve kunne bli oppnådd tre (3) uker etter at subjektet er først administrert det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger, en femte test-prøve kunne bli oppnådd fire (4) uker etter at subjektet er først administrert det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger, osv.
Etter hver andre eller etterfølgende test-prøve blir oppnådd fra subjektet blir konsentrasjonen eller mengden av analytt bestemt i den andre eller etterfølgende test-prøve er bestemt (f.eks., ved å bruke metodene beskrevet heri eller som kjent i teknikken). Konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i hver av den andre og etterfølgende test-prøver blir så sammenlignet med konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i den første test-prøven (f.eks., testprøven som ble opprinnelig valgfritt sammenlignet med det forutbestemte nivå). Hvis konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (c) er gunstig når sammenlignet med konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (a), da er sykdommen i subjektet bestemt å ha stoppet opp, gått tilbake eller forbedret, og subjektet should continue å være administrert the en eller farmasøytiske sammensetninger of trinn (b). Imidlertid, hvis konsentrasjonen eller mengden bestemt i trinn (c) er uforandret eller er ugunstig når sammenlignet med konsentrasjonen eller mengden av analytt som bestemt i trinn (a), da er sykdommen i subjektet bestemt å ha fortsatt, utviklet seg eller blitt verre, og subjektet bør bli behandlet med en høyere konsentrasjon av det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger administrert til subjektet i trinn (b) eller subjektet bør bli behandlet med en eller flere farmasøytiske sammensetninger som er forskjellig fra det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger administrert til subjektet i trinn (b). Spesifikt, subjektet kan bli behandlet med en eller flere farmasøytiske sammensetninger som er forskjellig fra det ene eller flere farmasøytiske sammensetninger som subjektet tidligere hadde mottatt for å minske eller senke nevnte subjekts analytt nivå.
Generelt, for assayer hvori gjentakende testing kan bli gjort (f.eks., å monitorere sykdomsprogresjon og/eller respons for behandling), en andre eller etterfølgende test-prøve blir oppnådd en tid etter at den første test-prøven har blitt oppnådd fra subjektet. Spesifikt, en andre test-prøve fra subjektet kan bli oppnådd minutter, timer, dager, uker eller år etter den første test-prøven har blitt oppnådd fra subjektet. For eksempel, den andre test-prøven kan bli oppnådd fra subjektet ved en tidsperiode på omtrent 1 minutt, omtrent 5 minutter, omtrent 10 minutter, omtrent 15 minutter, omtrent 30 minutter, omtrent 45 minutter, omtrent 60 minutter, omtrent 2 timer, omtrent 3 timer, omtrent 4 timer, omtrent 5 timer, omtrent 6 timer, omtrent 7 timer, omtrent 8 timer, omtrent 9 timer, omtrent 10 timer, omtrent 11 timer, omtrent 12 timer, omtrent 13 timer, omtrent 14 timer, omtrent 15 timer, omtrent 16 timer, omtrent 17 timer, omtrent 18 timer, omtrent 19 timer, omtrent 20 timer, omtrent 21 timer, omtrent 22 timer, omtrent 23 timer, omtrent 24 timer, omtrent 2 dager, omtrent 3 dager, omtrent 4 dager, omtrent 5 dager, omtrent 6 dager, omtrent 7 dager, omtrent 2 uker, omtrent 3 uker, omtrent 4 uker, omtrent 5 uker, omtrent 6 uker, omtrent 7 uker, omtrent 8 uker, omtrent 9 uker, omtrent 10 uker, omtrent 11 uker, omtrent 12 uker, omtrent 13 uker, omtrent 14 uker, omtrent 15 uker, omtrent 16 uker, omtrent 17 uker, omtrent 18 uker, omtrent 19 uker, omtrent 20 uker, omtrent 21 uker, omtrent 22 uker, omtrent 23 uker, omtrent 24 uker, omtrent 25 uker, omtrent 26 uker, omtrent 27 uker, omtrent 28 uker, omtrent 29 uker, omtrent 30 uker, omtrent 31 uker, omtrent 32 uker, omtrent 33 uker, omtrent 34 uker, omtrent 35 uker, omtrent 36 uker, omtrent 37 uker, omtrent 38 uker, omtrent 39 uker, omtrent 40 uker, omtrent 41 uker, omtrent 42 uker, omtrent 43 uker, omtrent 44 uker, omtrent 45 uker, omtrent 46 uker, omtrent 47 uker, omtrent 48 uker, omtrent 49 uker, omtrent 50 uker, omtrent 51 uker , omtrent 52 uker, omtrent 1.5 år, omtrent 2 år, omtrent 2.5 år, omtrent 3.0 år, omtrent 3.5 år, omtrent 4.0 år, omtrent 4.5 år, omtrent 5.0 år, omtrent 5.5. år, omtrent 6.0 år, omtrent 6.5 år, omtrent 7.0 år, omtrent 7.5 år, omtrent 8.0 år, omtrent 8.5 år, omtrent 9.0 år, omtrent 9.5 år eller omtrent 10.0 år etter den første test-prøven fra subjektet blir oppnådd.
Når anvendt for å overvåke sykdomsprogresjon kan assayet over bli anvendt for å overvåke progresjonen av sykdom i subjekter som lider av akutte tilstander. Akutte tilstander, også kjent som kritiske tilstander, refererer til akutte, livstruende sykdommer eller andre kritiske medisinske tilstander som involverer, for eksempel, det kardiovaskulære systemet eller det ekskretoriske systemet. Typisk refererer kritiske tilstander til de tilstander som må ha akutt medisinsk intervensjon i sykehusomgivelser (inkludert, men ikke begrenset til, legevakten, overvåkingsenhet, traumasenter, eller andre øyeblikkelig hjelp omgivelser) eller administrasjon av ambulansepersonell eller annet ute-basert medisinsk personnel. For kritiske tilstander blir gjentakende monitorering generelt gjort innenfor en kortere tidsperiode, nemlig, minutter, timer eller dager (f.eks., omtrent 1 minutt, omtrent 5 minutter, omtrent 10 minutter, omtrent 15 minutter, omtrent 30 minutter, omtrent 45 minutter, omtrent 60 minutter, omtrent 2 timer, omtrent 3 timer, omtrent 4 timer, omtrent 5 timer, omtrent 6 timer, omtrent 7 timer, omtrent 8 timer, omtrent 9 timer, omtrent 10 timer, omtrent 11 timer, omtrent 12 timer, omtrent 13 timer, omtrent 14 timer, omtrent 15 timer, omtrent 16 timer, omtrent 17 timer, omtrent 18 timer, omtrent 19 timer, omtrent 20 timer, omtrent 21 timer, omtrent 22 timer, omtrent 23 timer, omtrent 24 timer, omtrent 2 dager, omtrent 3 dager, omtrent 4 dager, omtrent 5 dager, omtrent 6 dager eller omtrent 7 dager), og den innledende analysen blir likeledes generelt gjort innenfor en kortere tidsperiode, f.eks., omtrent minutter, timer eller dager fra utbruddet av sykdommen eller tilstanden.
Assayene kan også bli anvendt for å overvåke progresjonen av sykdom i subjekter som lider av kroniske eller ikke-akutte tilstander. Ikke-kritiske eller, ikke-akutte tilstander, refererer til andre tilstander enn akutt, livstruende sykdom eller andre kritiske medisinske tilstander som involverer, for eksempel, det kardiovaskulære systemet og/eller det ekskretoriske systemet. Typisk, ikke-akutte tilstander inkluderer de med lengre-uttrykk eller kronisk varighet. For ikke-akutte tilstander, gjentakende monitorering blir generelt gjort med en lengre tidshorisont, f.eks., timer, dager, uker, måneder eller år (f.eks., omtrent 1 time, omtrent 2 timer, omtrent 3 timer, omtrent 4 timer, omtrent 5 timer, omtrent 6 timer, omtrent 7 timer, omtrent 8 timer, omtrent 9 timer, omtrent 10 timer, omtrent 11 timer, omtrent 12 timer, omtrent 13 timer, omtrent 14 timer, omtrent 15 timer, omtrent 16 timer, omtrent 17 timer, omtrent 18 timer, omtrent 19 timer, omtrent 20 timer, omtrent 21 timer, omtrent 22 timer, omtrent 23 timer, omtrent 24 timer, omtrent 2 dager, omtrent 3 dager, omtrent 4 dager, omtrent 5 dager, omtrent 6 dager, omtrent 7 dager, omtrent 2 uker, omtrent 3 uker, omtrent 4 uker, omtrent 5 uker, omtrent 6 uker, omtrent 7 uker, omtrent 8 uker, omtrent 9 uker, omtrent 10 uker, omtrent 11 uker, omtrent 12 uker, omtrent 13 uker, omtrent 14 uker, omtrent 15 uker, omtrent 16 uker, omtrent 17 uker, omtrent 18 uker, omtrent 19 uker, omtrent 20 uker, omtrent 21 uker, omtrent 22 uker, omtrent 23 uker, omtrent 24 uker, omtrent 25 uker, omtrent 26 uker, omtrent 27 uker, omtrent 28 uker, omtrent 29 uker, omtrent 30 uker, omtrent 31 uker, omtrent 32 uker, omtrent 33 uker, omtrent 34 uker, omtrent 35 uker, omtrent 36 uker, omtrent 37 uker, omtrent 38 uker, omtrent 39 uker, omtrent 40 uker, omtrent 41 uker, omtrent 42 uker, omtrent 43 uker, omtrent 44 uker, omtrent 45 uker, omtrent 46 uker, omtrent 47 uker, omtrent 48 uker, omtrent 49 uker, omtrent 50 uker, omtrent 51 uker, omtrent 52 uker, omtrent
1.5 år, omtrent 2 år, omtrent 2.5 år, omtrent 3.0 år, omtrent 3.5 år, omtrent 4.0 år, omtrent 4.5 år, omtrent 5.0 år, omtrent 5.5. år, omtrent 6.0 år, omtrent 6.5 år, omtrent 7.0 år, omtrent 7.5 år, omtrent
8.0 år, omtrent 8.5 år, omtrent 9.0 år, omtrent 9.5 år eller omtrent 10.0 år), og den innledende analysen blir likeledes generelt gjort innenfor en lengre tidsperiode, f.eks., omtrent timer, dager, måneder eller år fra utbruddet av sykdommen eller tilstanden.
Videre kan analysene over bli utført ved å bruke en første test-prøve oppnådd fra et subjekt hvor den første test-prøven blir oppnådd fra en kilde, slik som urin, serum eller plasma. Valgfritt kan analysene over deretter bli repetert ved å bruke en andre test-prøve oppnådd fra subjektet hvor den andre test-prøven blir oppnådd fra en annen kilde. For eksempel, hvis den første test-prøven ble oppnådd fra urin, kan den andre test-prøven bli oppnådd fra serum eller plasma. Resultatene oppnådd fra assayene ved å bruke den første test-prøven og den andre test-prøven kan bli sammenlignet. Sammenligningen kan bli anvendt for å vurdere statusen til en sykdom eller tilstand i subjektet.
Videre, den foreliggende beskrivelsen angår også metoder for å bestemme om et subjekt predisponert for eller lidende av en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand vil ha nytte fra behandling. Spesielt, beskrivelsen angår analytt companion diagnostic metoder og produkter. Følgelig, metoden of "å monitorere behandlingen av sykdom i et subjekt" som beskrevet heri videre optimalt kan også omfatter å velge eller identifying kandidater for terapi.
Følgelig, spesielt utførelsesformer, beskrivelsen tilveiebringer også en metode for å bestemme om et subjekt som har, eller har risiko for, en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand er en kandidat for terapi. Generelt er subjektet en som har opplevd symptom på en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand eller som faktisk har blitt diagnostisert å ha, eller som er ved risiko for, en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand, og/eller som demonstrerer en ugunstig konsentrasjon eller mengde av analytt eller et fragment derav, som beskrevet heri.
Metoden omfatter valgfritt et assay som beskrevet heri, hvor analytt er vurdert før og etter behandling av et subjekt med en eller flere farmasøytiske sammensetninger (f.eks., spesielt med et legemiddel relatert til en virkningsmekanisme som involverer analytt), med immunosuppressive terapi, eller av immunoabsorpsjon terapi, eller hvor analytt er vurdert etter slik behandling og konsentrasjonen eller mengden av analytt er sammenlignet mot et forutbestemt nivå. En ugunstig konsentrasjon av mengde av analytt observert etter behandling bekrefter at subjektet ikke vil nytte fra å motta videre eller fortsatt behandling, mens en gunstig konsentrasjon eller mengde av analytt observert etter behandling bekrefter at subjektet vil nytte fra å motta videre eller fortsatt behandling. Denne bekreftelsen hjelper med håndtering av kliniske studier, og gir forbedret pasientpleie.
Det er åpenbart, selvom visse utførelsesformer heri er fordelaktige når anvendt for å vurdere en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand som diskutert heri kan assayene og kifene bli anvendt for å vurdere analytt i andre sykdommer, forstyrrelser og tilstander. Assay-metoden kan også involvere analysen av andre markører og lignende.
Assay-metoden kan også bli anvendt for å identifisere en forbindelse som forbedrer en gitt sykdom, forstyrrelse eller tilstand. For eksempel, en celle som uttrykker analytt kan bli kontaktet med en kandidat forbindelse. Nivået på uttrykking av analytt i cellen kontaktet med forbindelsen kan bli sammenlignet med som i en kontroll celle ved å bruke assay-metoden beskrevet heri.
H. Kit
Et kit for å analysere en testprøve for tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av en analytt (eller et fragment derav) i en testprøve er også tilveiebrakt. Kifet omfatter minst en komponent for å analysere testprøven for analytten (eller et fragment derav) og instruksjoner for å analysere testprøven for analytten (eller et fragment derav). Den minst ene komponenten for å analysere testprøven for analytten (eller et fragment derav) kan inkludere en sammensetning omfattende et anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav), som er valgfritt immobilisert på en fast fase.
Kifet kan omfatte minst en komponent for å analysere testprøven for en analytt ved immunoassay, f.eks., kjemiluminescerende mikropartikkel immunoassay, og instruksjoner for å analysere testprøven for en analytt ved immunoassay, f.eks., kjemiluminescerende mikropartikkel immunoassay. For eksempel kan kifet omfatte minst en spesifikt bindende partner for en analytt, slik som et anti-analytt, monoklonalt/polyklonalt antistoff (eller et fragment derav som kan binde til analytten, en variant derav som kan binde til analytten, eller et fragment av en variant som kan binde til analytten) eller et anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav), hvorav begge kan være detekterbart merket. Alternativt eller videre kan kifet omfatte detekterbart merket analytt (eller et fragment derav som kan binde til et anti-analytt, monoklonalt/polyklonalt antistoff eller et anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav)), som kan konkurrere med enhver analytt i en testprøve for binding til et anti-analytt, monoklonalt/polyklonalt antistoff (eller et fragment derav som kan binde til analytten, en variant derav som kan binde til analytten, eller et fragment av en variant som kan binde til analytten) eller et anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment, en variant, eller et fragment av en variant derav), enten of som kan være immobilisert på en fast støtte. Kifet kan omfatte en kalibrator eller kontroll, f.eks., isolert eller renset analytt. Kifet kan omfatte minst en beholder (f.eks., rør, mikrotiterplater eller strimler, som allerede kan være belagt med en første spesifikt bindende partner, for eksempel) for å utføre assayet, og/eller en buffer, slik som en assay-buffer eller en vaskebuffer, hvorav begge kan være tilveiebrakt som en konsentrert løsning, en substrat-løsning for den detekterbare markøren (f.eks., en enzymatisk markør), eller en stoppe-løsning. Fortrinnsvis omfatter kifet alle komponenter, dvs., reagenser, standarder, buffere, fortynnere, osv., som er nødvendig for å utføre assayet. Instruksjonene kan være på papirform eller datamaskin-lesbar form, slik som en disk, CD, DVD, eller liknende.
Hvilke som helst antistoffer, slik som et anti-analytt antistoff eller et anti-analytt DVD-Ig, eller tracer kan inkorporere en detekterbar markør som beskrevet heri, slik som en fluorofor, en radioaktiv enhet, et enzym, en biotin/avidin markør, en kromofor, en kjemiluminescerende markør, eller liknende, eller kifet kan inkludere reagenser for å utføre detekterbar merking. Antistoffene, kalibratorer og/eller kontroller kan bli tilveiebrakt i separate beholdere eller ferdiglevert i et passende assay-format, for eksempel, i mikrotiterplater.
Valgfritt inkluderer kifet kvalitetskontroll komponenter (for eksempel, sensitivitetspaneler, kalibratorer, og positiv kontroller). Fremstilling av kvalitetskontroll-reagenser er velkjent i teknikken og er beskrevet på vedleggsark for en rekke immunodiagnoserende produkter. Sensitivitetspanelmedlemmer blir valgfritt anvendt for å fastsette karakteristikker for ytelsen til assayet, og videre er valgfritt nyttige indikatorer for integriteten til immunoassay kit reagensene, og standardiseringen av assayer.
Kifet kan også valgfritt inkludere andre reagenser nødvendig for å utføre et diagnostisk assay eller legger til rette for kvalitetskontroll vurderinger, slik som buffere, salter, enzymer, enzym co-faktorer, enzym substrater, deteksjonsreagenser, og lignende. Andre komponenter, slik som buffere og løsninger for isoleringen og/eller behandling av en testprøve (f.eks., forbehandlingsreagenser), kan også være inkludert i kifet. Kifet kan videre inkludere en eller flere andre kontroller. En eller flere av komponentene til kifet kan bli frysetørket, i hvilket tilfelle kifet kan videre omfatte reagenser passende for rekonstitueringen av de frysetørkede komponenter.
De forskjellige komponenter i kifet er valgfritt tilveiebrakt i passende beholdere som nødvendig, f.eks., en mikrotiterplate. Kifet kan videre inkludere beholdere for å oppbevare eller lagre en prøve (f.eks., en beholder eller kassett for en urinprøve). Hvor passende kan kifet valgfritt også inneholde reaksjonsbeholder, blandingskar, og andre komponenter som legger til rette for fremstillingen av reagenser eller testprøven. Kifet kan også inkludere en eller flere instrumenter for å hjelpe med å oppnå en testprøve, slik som en sprøyte, pipette, pinsett, måleskje, eller liknende.
Hvis den detekterbare markøren er minst en acridinium-forbindelse kan kifet omfatte minst et acridinium-9-karboksamid, minst en acridinium-9-karboksylat aryl ester, eller enhver kombinasjon derav. Hvis den detekterbare markøren er minst en acridinium-forbindelse kan kifet også omfatte en kilde med hydrogenperoksid, slik som en buffer, en løsning, og/eller minst en basisk løsning. Hvis ønsket kan kifet inneholder en fast fase, slik som en magnetisk partikkel, kule, reagensglass, mikrotiterplate, kuvette, membran, stilasmolekyl, film, filterpapir, plate eller chip.
HI. Tilpasning av Kit og Metode
Kifet (eller komponenter derav), så vel som metoden for å bestemme tilstedeværelsen, mengde eller konsentrasjon av en analytt i en testprøve ved et assay, slik som et immunoassay som beskrevet heri, kan bli tilpasset for anvendelse i en rekke automatiserte og halvautomatiserte systemer
(inkludert de hvori den faste fasen omfatter en mikropartikkel), som beskrevet, f.eks., i U.S. Patentnr.. 5,089,424 og 5,006,309, og som kommersielt markedsført, f.eks., ved Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) as ARCHITECT®.
Noen av forskjellene mellom et automatisert eller halvautomatisert system sammenlignet med et ikke-automatisert system (f.eks., ELISA) inkluderer substratet til hvilket den første spesifikt bindende partneren (f.eks., et anti-analytt, monoklonalt/polyklonalt antistoff (eller et fragment derav, en variant derav, eller et fragment av en variant derav) eller et anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment derav, en variant derav, eller et fragment av en variant derav) er knyttet til; enten vei, sandwich dannelse og analytt reaktivitet kan bli påvirket), og lengden og timingen av fangsten, deteksjon og/eller ethvert valgfritt vasketrinn. Mens et ikke-automatisert format, slik som et ELISA, kan trenge en relativt lengre inkuberingstid med prøve og fangstreagens (f.eks., omtrent 2 timer), et automatisert eller halvautomatisert format (f.eks., ARCHITECT®, Abbott Laboratories) kan ha en relativt kortere inkuberingstid (f.eks., omtrent 18 minutter for ARCHITECT®). Tilsvarende, mens et ikke-automatisert format, slik som et ELISA, kan inkubere et deteksjons-antistoff, slik som konjugatreagensene, for en relativt lengre inkuberingstid (f.eks., omtrent 2 timer), et automatisert eller halvautomatisert format (f.eks., ARCHITECT®) kan ha en relativt kortere inkuberingstid (f.eks., omtrent 4 minutter for the ARCHITECT®).
Andre platformer tilgjengelig fra Abbott Laboratories inkluderer, men er ikke begrenset til, AxSYM®, IMx® (se, f.eks., U.S. Pat. Nr. 5,294,404, som er herved inkorporert ved referanse i dets helhet), PRISM®, EIA (kule), og Quantum™ II, så vel som andre platformer. Videre kan assayene, kit og kit komponenter bli anvendt i andre formater, for eksempel, på elektrokjemiske eller andre håndholdte eller point-of-care assaysystemer. Den foreliggende beskrivelsen er, for eksempel, anvendbar på det kommersielle Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) elektrokjemisk immunoassaysystem som utfører sandwich immunoassayer. Immunosensorer og deres metoder for fremstilling og bruk i engangs test-anordninger er beskrevet, for eksempel i, U.S. Patentnr. 5,063,081, U.S. Pat. App. Pub. Nr. 2003/0170881, U.S. Pat. App. Pub. Nr. 2004/0018577, U.S. Pat. App. Pub. Nr. 2005/0054078, og U.S. Pat. App. Pub. Nr. 2006/0160164, som er inkorporert i deres helhet ved referanse for deres lære angående samme.
Spesielt, med hensyn til tilpasningen av et analytt-assay til I-STAT® systemet, er konfigurasjon som følger foretrukket. En mikrofremstilt silisium-chip blir fremstilt med et par med gull amperometriske arbeidselektroder og en sølv-sølvklorid referanseelektrode. På en av arbeidselektrodene, polystyren-kuler (0.2 mm diameter) med immobilisert anti-analytt, monoklonalt/polyklonalt antistoff (eller et fragment derav, en variant derav, eller et fragment av en variant derav) eller anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment derav, en variant derav, eller et fragment av en variant derav), blir festet til et polymerbelegg av mønstret polyvinylalkohol over elektroden. Denne chip'en blir satt sammen i en I-STAT® kassett med et fluidformat passende for immunoassay. På en del av veggen til prøveholdekammeret til kassetten er det et lag omfattende en spesifikt bindende partner for en analytt, slik som et anti-analytt, monoklonalt/polyklonalt antistoff (eller et fragment derav, en variant derav, eller et fragment av en variant derav som kan binde analytten) eller et anti-analytt DVD-Ig (eller et fragment derav, en variant derav, eller et fragment av en variant derav som kan binde analytten), hvorav begge kan være detekterbart merket. Innenfor fluid-lommen til kassetten er et vandig reagens som inkluderer p-aminofenol fosfat.
Ved bruk, en prøve mistenkt å inneholde en analytt blir tilsatt til holde-kammeret til prøve-kassetten, og kassetten blir satt inn i I-STAT® avleseren. Etter at den spesifikt bindende partneren for en analytt har oppløst inn i prøven, tvinger et pumpe-element innenfor kassetten prøven inn i en kanal inneholdende chip'en. Her blir det ristet for å promotere dannelse av sandwich'en. I det nest-siste trinnet til assayet, bli fluid tvunget ut av lommen og inn i kanalen for å vaske prøven av chip'en og inn i et avfallskammer. I det siste trinnet til assayet reagerer den basiske fosfatase-markøren med p-aminofenol fosfat for å spalte fosfat-gruppen og tillate den frigjorte p-aminofenolen å bli elektrokjemisk oksidert ved arbeidselektroden. Basert på målt strøm er avleseren i stand til å beregne mengden av analytt i prøven ved hjelp av en innebygd algoritme og fabrikk-bestemt kalibreringskurve.
Det sier seg selv at metodene og kit som beskrevet heri nødvendigvis omfatter andre reagenser og metoder for å utføre immunoassayet. For eksempel, omfattet er diverse buffere som er kjent i teknikken og/eller som lett kan bli fremstilt eller optimalisert for anvendelse, f.eks., for vasking, som en konjugat-fortynner, mikropartikkel-fortynner, og/eller som en kalibrator-fortynner. En eksempelvis konjugat-fortynner er ARCHITECT® konjugat-fortynner anvendt i visse kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) og inneholdende 2-(N-morfolin)etansulfonsyre (MES), et salt, en protein-blokkerer, et antimikrobisk middel, og en detergent. En eksempelvis kalibrator-fortynner er ARCHITECT® human kalibrator-fortynner anvendt i visse kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), som omfatter en buffer inneholdende MES, andre salt, en protein-blokkerer, og et antimikrobisk middel. Videre, som beskrevet i U.S. Patent Søknad Nr. 61/142,048 innlevert desember 31, 2008 kan forbedret signalgenerering bli oppnådd, f.eks., i et I-Stat kassett-format, ved å bruke en nukleinsyre-sekvens knyttet til signal-antistoffet som en signalforsterker.
Det vil være åpenbart for fagmannen at andre passende modifikasjoner og tilpasninger av metodene ifølge oppfinnelsen beskrevet heri er åpenbare og kan bli lagd ved å bruke passende
ekvivalenter uten å gå bort ifra omfanget til oppfinnelsen eller utførelsesformene fremvist heri. Vi har nå beskrevet den foreliggende oppfinnelsen i detalj, det samme vil bli tydeligere forstått ved referanse til de følgende eksemplene, som er bare inkludert for illustrasjonsformål og er ikke ment å begrensene oppfinnelsen.
EKSEMPLIFISERING
Eksempel 1: Design, Konstruksjon, og Analyse av et DVD- Ig
Eksempel 1.1: Assayer Anvendt for å identifisere og Karakterisere Moderantistoffer og DVD- Ig
De etterfølgende assayer ble anvendt gjennom hele eksemplene for å identifisere og karakterisere moderantistoffer og DVD-Ig, medmindre annet er nevnt.
Eksempel 1.1.1: Assayer Anvendt For å bestemme Binding og Affinitet av Moderantistoffer og DVD- Ig for Deres Mål- Antigen( er)
Eksempel 1.1.1.A: Direkte bindende ELISA
Enzym-sammenkoblet Immunosorbent Assayer for å screene for antistoffer som binder et ønsket mål-antigen ble utført som følger. Høyt-bindende ELISA-plater (Corning Costar # 3369, Acton, MA) ble belagt med lOOjjL/brønn med lOjjg/ml av ønsket mål-antigen (R&D Systems, Minneapolis, MN) eller ønsket mål-antigen ekstra-cellulært domene / FC fusjonsprotein (R&D Systems, Minneapolis, MN) eller monoklonalt mus anti-polyHistidin antistoff (R&D Systems # MAB050, Minneapolis, MN) i Fosfatbufret saltløsning (10X PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, MA) over natten ved 4°C. Plater ble vasket fire ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20. Plater ble blokkert ved tilsetningen av 300 jxL/brønn blokkeringsløsning (fettfritt tørt melkepulver, diverse forskjellige leverandører, fortynnet til 2% i PBS) i 1/2 time ved romtemperatur. Plater ble vasket fire ganger etter blokkering med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Alternativt, ett hundre mikro liter per brønn med 10 jjg/ml med Histidin (His) merket ønsket mål-antigen (R&D Systems, Minneapolis, MN) ble tilsatt til ELISA-plater belagt med monoklonalt mus anti-polyHistidin antistoff som beskrevet over og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønner ble vasket fire ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Ett hundre mikroliter med antistoff eller DVD-Ig preparater fortynnet i blokkeringsløsning som beskrevet over ble tilsatt til den ønskede mål-antigen platen eller ønsket mål-antigen / FC fusjon plate eller anti-polyHistidin antistoff / His-merket ønsket mål-antigen platen fremstilt som beskrevet over og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønner ble vasket fire ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Ett hundre mikroliter med 10ng/mL geit anti-humant IgG -FC spesifikt HRP konjugert antistoff (Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL) ble tilsatt til hver brønn av den ønskede mål-antigen platen eller anti-polyHistidine antistoff / Histidin-merket ønsket mål-antigen plate. Alternativt, ett hundre mikroliter med 10 ng/mL geit anti-humant IgG -kappa lettkjede spesifikt HRP konjugert antistoff (Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL) ble tilsatt til hver brønn av ønsket mål-antigen / FC fusjon platen og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket 4 ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Ett hundre mikroliter med forbedret TMB-løsning (Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetningen av 50 jjL IN svovelsyre. Plater ble avlest spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm.
Tabell 3 inneholder en liste med antigenene anvendt i direkte-bindingsassayet.
Tabell 4 inneholder bindingsdata uttrykt som EC50 i nM for de antistoffer og DVD-Ig-konstruksjoner utprøvd i det direkte bindende ELISA-assayet.
I det direkte bindende ELISA ble binding noen ganger ikke observert, sannsynligvis fordi det antistoff-bindende setet på mål-antigenet ble enten "maskert" eller antigenet blir "fordreid" når belagt på plastoverflaten. Den manglende evnen til et DVD-Ig for å binde dets mål kan også være på grunn av sterisk begrensning påtvunget DVD-Ig ved det direkte bindende ELISA format. Moder-antistoffene og DVD-Ig'er som ikke bandt i det direkte bindende ELISA format bandt til mål-antigen i andre ELISA-formater, slik som FACS, Biacore eller bioassay. Ikke-binding av et DVD-Ig ble også gjenvunnet ved å justere linker-lengden mellom de to variable domenene til DVD-Ig'et, som vist tidligere.
Binding av alle DVD konstruksjoner ble holdt og sammenlignbar med moderantistoffer. Alle N-terminal variable domener bandt med en lignende høy affinitet som moder-antistoffet så vel som de C-terminal variable domener til DVD konstruksjonene DVD289, DVD291, DVD294 og DVD296.
Eksempel 1.1.1.B: AB 1- 42 ELISA
ELISA-assayer ble utført for å screene for antistoffer som binder et ønsket mål-antigen som følger. Maxisorb NUNC Immuno plater ble belagt med lOOjiL/brønn med ljxg/ml of AB 1-42 fortynnet i beleggingsbuffer over natten ved 6°C. Plater ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20. Blokkeringsløsning ble fremstilt ved å oppløse blokkeringsreagenset for ELISA
(Roche) i 100 mL vann og deretter fortynnet videre 1:10 før anvendelse. Plater ble blokkert ved tilsetningen av 265 jxL/brønn blokkeringsløsning i 2 timer ved romtemperatur. Plater ble vasket tre ganger etter blokkering med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Antistoff eller DVD-Ig'er ble fortynnet til 100 ng/uL i PBST + 0.5% BSA og serielt fortynnet 1:3. Ett hundre mikroliter med antistoff eller DVD-Ig preparater ble tilsatt til platen og inkubert i 2 time ved romtemperatur. Brønner ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Til hundre mikroliter med anti-human POD fortynnet 1:5000 ble tilsatt til hver brønn av platen og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Ett hundre mikroliter med TMB-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 10 minutter. TMB-løsning ble fremstilt ved å blande 20 mL 100 mM natrium-acetat pH 4.9 med 200 jjL TMB-løsning (Roche #92817060) og 29.5 jiL 3% H202. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetningen av 50 jxL IN svovelsyre. Plater ble avlest spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm. Resultater er tilveiebrakt i Tabell 5.
Binding av alle DVD konstruksjoner ble holdt og sammenlignbar med moderantistoffer. Alle N-terminal variable domener bandt med en lignende høy affinitet som moder-antistoffet.
Eksempel 1.1.l.C: AB 20- 42 ELISA
ELISA-assayer ble utført for å screene for antistoffer som binder et ønsket mål-antigen som
følger. AB 20-42 globulomer og PBS ved 37°C ble forvarmet i 1 minutt. Høyt-bindende ELISA-plater (Corning Costar #3369, Acton, MA) ble belagt med lOOjjL/brønn med 2jjg/ml of Ap 20-42 globulomer fortynnet i PBS over natten ved 4°C. Plater ble blokkert med 320 pL/brønn med 100% superblock PBS buffer (Thermo Scientific, #37515) og inkubert i 45 minutter ved romtemperatur. Plater ble vasket tre ganger etter blokkering med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Antistoff eller DVD-Ig'er ble fortynnet til 2000 ng/mL, 1000 ng/mL, 200 ng/mL, 40 ng/mL, 8 ng/mL, 1.6 ng/mL og 0.32 ng/mL i 10% superblock i PBS. Ett hundre mikroliter med antistoff eller DVD-Ig preparater ble tilsatt til platen i triplikat og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Brønner ble vasket fem ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Ett hundre mikroliter med geit anti-human HRP konjugert antistoff (Pierce #31412) fortynnet 1:40,000 ble tilsatt til hver brønn av platen og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Plater ble vasket fem ganger med PBS inneholdende 0.02% Tween 20.
Ett hundre mikroliter med TMB-løsning (Invitrogen-Zymed; #00-2023) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 5 minutter.. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetningen av 100 jjL 2N svovelsyre. Plater ble avlest spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm. Resultater er vist i Tabell 6.
Binding av alle DVD konstruksjoner ble holdt og var sammenlignbar med moderantistoffer.
Eksempel 1.1.1.D: Fangst- ELISA
ELISA-plater (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) blir inkubert over natten ved 4°C med anti-human Fc antistoff (5 u g/ml i PBS, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Plater blir vasket tre ganger i vaskebuffer (PBS inneholdende 0.05% Tween 20), og blokkert i 1 time ved 25°C i blokkeringsbuffer (PBS inneholdende 1% BSA). Brønner blir vasket tre ganger, og serielle fortynninger av hvert antistoff eller DVD-Ig i PBS inneholdende 0.1% BSA blir tilsatt til brønnene og inkubert ved 25°C i 1 time. Brønnene blir vasket tre ganger, og biotinylert antigen (2nM) blir tilsatt til platene og inkubert i 1 time ved 25°C. Brønnene blir vasket tre ganger og inkubert i 1 time ved 25°C med streptavidin-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD). Brønnene blir vasket tre ganger, og 100 u 1ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) blir tilsatt per brønn. Etter fargeutviklingsreaksjonen er stoppet med IN HCL og absorbans ved 450nM er målt. Resultater er vist i Tabell 7.
Eksempel 1.1.l.E: Affinitets- bestemmelse Ved å bruke BIACORE Teknologi
BIACORE Metoder:
BIACORE-assayet (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) bestemmer affiniteten til antistoffer eller DVD-Ig med kinetiske målinger av på-hastighet og av-hastighetskonstanter. Binding av antistoffer eller DVD-Ig til et mål-antigen (for eksempel, et renset rekombinant mål-antigen) er bestemt ved overflate-plasmonresonans-baserte målinger med et Biacore® 1000 eller 3000 instrument (Biacore® AB, Uppsala, Sweden) ved å bruke rennende HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, og 0.005% surfaktant P20) ved 25° C. Alle kjemikalier er oppnådd fra Biacore® AB (Uppsala, Sweden) eller ellers fra en forskjellig kilde som beskrevet i teksten. For eksempel, omtrent 5000 RU med geit anti-mus IgG, (Fcy), fragment spesifikke polyklonale antistoff (Pierce Bioteknologi Inc, Rockford, IL) fortynnet i 10 mM natriumacetat (pH 4.5) er direkte immobilisert over en CM5 forskningsstandard biosensor chip ved å bruke et standard aminkoblings-kit ifølge produsentens instruksjoner og prosedyrer ved 25 jxg/ml. Ureagerte enheter på biosensor-overflaten er blokkert med etanolamin. Modifisert karboksymetyl dekstran overflate i strømningscelle 2 og 4 blir anvendt som en reaksjonsoverflate. Ikke-modifisert karboksymetyl dekstran uten geit anti-mus IgG i strømningscelle 1 og 3 blir anvendt som referanseoverflaten. For kinetisk analyse, hastighetsligninger avledet fra 1:1 Langmuir-binding modellen er tilpasset samtidig til assosiasjons- og dissosiasjonsfasene til alle åtte injiseringer (ved å bruke global fit analyse) med anvendelsen av Biaevaluation 4.0.1 programvare. Rensede antistoffer eller DVD-Ig er fortynnet i HEPES-bufret saltløsning for fangst over geit anti-mus IgG spesifikke reaksjonsoverflater. Antistoffer eller DVD-Ig som skal fanges som en ligand (25 jig/ml) er injisert over reaksjonsmatriser ved en strømningshastighet på 5 jxl/min. Assosiasjons- og dissosiasjonshastighetskonstantene, k„n (M^s<1>) og koff(s<1>) er bestemt under en kontinuerlig strømningshastighet på 25 jjl/min. Hastighetskonstanter er avledet ved å lage kinetiske bindingsmålinger ved forskjellig antigen konsentrasjoner varierende fra 10 - 200 nM. Likevektsdissosiasjonskonstanten (M) til reaksjonen mellom antistoffer eller DVD-Ig'er og mål- antigenet blir så beregnet fra de kinetiske hastighetskonstantene ved den etterfølgende formelen: KD= kofl/kon. Binding blir målt som en funksjon av tid og kinetiske hastighetskonstanter blir beregnet. I dette assayet, på-hastigheter så raske som IO<6>M"V og av-hastigheter så trege som IO"<6>s"<1>kan bli målt. Resultater er vist i Tabell 8.
Binding av alle DVD-Ig-konstruksjonerkarakterisert vedBiacore teknologi ble holdt og sammenlignbar med den til moderantistoffer. Alle N-terminal variable domener bandt med en lignende høy affinitet som moder-antistoffet.
Eksempel 1.1.2: Assayer Anvendt For å bestemme funksjonell Aktivitet Av Moderantistoffer Og DVD- Ig
Eksempel 1.1.2.A: Cytokin Bioassay
Evnen til et anti-cytokin eller et anti-vekstfaktor moderantistoff eller DVD-Ig inneholdende anti-cytokin eller anti-vekstfaktor sekvenser til å inhibere eller nøytralisere et mål cytokin eller vekstfaktor bioaktivitet er analysert ved å bestemme det inhiberende potensialet til antistoffet eller DVD-Ig. For eksempel, evnen til et anti-IL-4 antistoff for å inhibere IL-4 mediert IgE produksjon kan bli anvendt. For eksempel, humane naive B-celler er isolert fra perifert blod, henholdsvis, bufferbelegg ved Ficoll-paque tetthetssentrifugering, etterfulgt av magnetisk separasjon med MACS kuler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) spesifikke for human slgD FITC merket geit F(ab)2 antistoffer etterfulgt av anti-FITC MACS kuler. Magnetisk sorterte naive B-celler er justert til 3 x IO<5>celler per ml i XV15 og utplatet i 100 ul per brønn i 96-brønn plater i en 6 x 6 array i sentrum av platen, omringet ved PBS-fyllte brønner i løpet av de 10 dagene med dyrking ved 37° C i nærværet av 5% CO2. En plate hver er fremstilt per antistoff som skal testes, bestående av 3 brønner hver av ikke-induserte og induserte kontrollere og quintuplicate repetisjoner av antistoff-titreringer startende ved 7 ug/ml og kjørende i 3-gangs fortynning ned til 29 ng/ml sluttkonsentrasjoner tilsatt i 50ul fire ganger konsentrert pre-fortynning. For å indusere IgE produksjon, rhIL-4 ved 20 ng/ml pluss anti-CD40 monoklonale antistoff (Novartis, Basel, Switzerland) ved 0.5 ug/ml sluttkonsentrasjoner i 50 ul hver blir tilsatt til hver brønn, og IgE konsentrasjoner er bestemt på slutten av dyrkingsperioden ved en standard sandwich ELISA-metode.
Eksempel 1.1.2.B: Cytokinfrigjøringsassay
Evnen til et moderantistoff eller DVD-Ig for å forårssake cytokinfrigjøring er analysert, perifert blod blir trukket fra tre friske donorer ved venepunktur inn i hepariserte vakutainer rør. Helt blod blir fortynnet 1:5 med RPMI-1640 medium og plassert i 24-brønn vevskultur plater ved 0.5 mL per brønn. Anti-cytokin-antistoffene (f.eks., anti-IL-4) er fortynnet inn i RPMI-1640 og plassert i platene ved 0.5 mL/brønn for å gi sluttkonsentrasjoner på 200, 100, 50, 10, og 1 ug/mL. Den siste fortynningen av helt blod i dyrkingsplatene er 1:10. LPS og FA blir tilsatt til separate brønner ved 2ug/mL og 5ug/mL sluttkonsentrasjon som en positiv kontroll for cytokinfrigjøring. Polyklonalt humant IgG er anvendt som negativ kontroll antistoff. Eksperimentet blir utført i duplikat. Plater blir inkubert ved 37°C ved 5% C02. Tjuefire timer senere innholdet av brønnene er overført til reagensrør og spunnet i 5 minutter ved 1200 rpm. Celle-frie supernatanter er samlet og fryst for cytokin assayer. Celler igjen på platene og i reagensrørene blir lysert med 0.5 mL med lyseringsløsning, og plassert ved -20°C og tint. 0.5 mL med medium blir tilsatt (for å bringe volumet til det samme nivået som de celle-frie supernatantprøvene) og celle-preparatene er samlet og fryst for cytokin assayer. Celle-frie supernatanter og cellelysater er analysert for cytokin nivåer ved ELISA, for eksempel, for nivåer av IL-8, IL-6, IL-ip, IL-IRA, eller TNF-a.
Eksempel 1.1.2.C: Cytokin Kryssreaktivitetsstudie
Evnen til et anti-cytokin moderantistoff eller DVD-Ig rettet mot et cytokin av interesse å kryss-reagere med andre cytokiner er analysert. Moderantistoffer eller DVD-Ig er immobilisert på en Biacore biosensor matrix. Et anti-human Fc mAb er kovalent bundet via frie amin-grupper til dekstran-matrisen ved først å aktivere karboksyl-grupper på matrisen med lOOmM N-hydroksysuksinimid(NHS) og 400mM N-Etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimide hydroklorid (EDC). Omtrent 50uL av hvert antistoff eller DVD-Ig preparat ved en konsentrasjon på 25ug/mL, fortynnet i natriumacetat, pH 4.5, er injisert over den aktiverte biosensoren og frie aminer på proteinet er bundet direkte til de aktiverte karboksyl-gruppene. Typisk, 5000 Resonance Enheter (RU's) er immobilisert. Ureagert matrix EDC-estere er deaktivert ved en injisering av 1 M etanolamin. En andre strømningscelle er fremstilt som en referansestandard ved å immobilisere human IgG l/K ved å bruke standard aminkobling kit. SPR målinger blir utført ved å bruke CM biosensor-chip'en. Alle antigener å være analysert på biosensor-overflaten er fortynnet i HBS-EP running buffer inneholdende 0.01% P20.
For å undersøke cytokin-bindingsspesifisiteten, overskudd cytokin av interesse (lOOnM, f.eks., løselig rekombinant human) er injisert over anti-cytokin moderantistoffet eller DVD-Ig immobilisert biosensor overflate (5 minutters kontakttid). Før injisering av cytokinet av interesse og umiddelbart etterpå, HBS-EP buffer alene strømmer gjennom hver strømningscelle. Netto-forskjellen i signalene mellom grunnlinjen og punktet tilsvarende til omtrent 30 sekunder etter fullføring av cytokin-injisering er tatt for å representere den endelige bindingsverdien. Igjen, responsen er målt i Resonance Enheter. Biosensor matriser er regenerert ved å bruke lOmM HC1 før injisering av den neste prøven hvor en bindingshendelse er observert, ellers ble renningsbuffer injisert over matrisene. Humane cytokiner (f.eks., IL-la, IL-1B, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNF-a, TNF-p, og IFN-y, for eksempel) er også samtidig injisert over den immobilisert mus IgGl/K referanseoverflaten for å måle enhver ikke-spesifikk-bindende bakgrunn. Ved fremstilling av en referanse og reaksjonsoverflate, Biacore kan automatisk trekke fra referanseoverflatedata fra reaksjonsoverflatedata for å eliminere mesteparten av forandringen i den refraktive indeks og injiseringsstøy. Følgelig er det mulig å fastslå den virkelige bindingsresponsen tillagt en anti-cytokin antistoff eller DVD-Ig-bindende reaksjon.
Når et cytokin av interesse er injisert over immobilisert anti-cytokin antistoff, betydelig binding er observert. lOmM HC1 regenerering fjerner helt alle ikke-kovalent assosierte proteiner. Undersøkelse av sensorgrammet viser at ved immobilisert anti-cytokin antistoff eller DVD-Ig-binding til løselig cytokin er sterk og robust. Etter å ha bekreftet det forventede resultatet med cytokinet av interesse, panelet med gjenværende rekombinant humane cytokiner er utprøvd, for hvert antistoff eller DVD-Ig hver for seg. Mengden av anti-cytokin antistoff eller DVD-Ig bundet eller ikke-bundet cytokin for hver injiseringssyklus er målt. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter blir anvendt for å bestemme spesifisitetsprofilen av hvert antistoff eller DVD-Ig. Antistoffer eller DVD-Ig med den forventede bindingen til cytokinet av interesse og ingen binding til ethvert annet cytokin er selektert.
Eksempel 1.1.2.D: Kryssreaktivitet for vev
Studier av kryssreaktivitet for vev er gjort i tre trinn, med det første trinnet inkluderende kryoseksjoner av 32 vev, andre trinn inkludert opp til 38 vev, og the 3"<1>trinn inkludert ytterligere vev fra 3 ikke-beslektede voksne som beskrevet nedenfor. Studier blir typisk utført ved to dose nivåer.
Trinn 1: Kryoseksjoner (omtrent 5 um) med humant vev (32 vev (typisk: Binyrene, Gastrointestinalkanalen, Prostata, Blære, Hjerte, Skjelettmuskulaturen, Blodceller, Nyre, Hud, Beinmarg, Lever, Ryggmarg, Bryst, Lunge, Milten, Cerebellum, Lymfekjertler, Testikler, Hjernebarken, Eggstokker, Thymus, Tykktarm, Bukspyttkjertel, Tyroid, Endothelium, Paratyroid, Urinleder, Øye, Hypofyse, Livmor, Eggleder og Placenta) fra en menneskelig donor oppnådd ved obduksjon eller biopsi) blir fiksert og tørket på objektglass. Peroksidase-flekkfargingen av vev-seksjoner blir utført, ved å bruke avidin-biotin systemet.
Trinn 2: Kryoseksjoner (omtrent 5 um) med humant vev 38 vev (inkludert binyrer, blod, blodkar, beinmarg, cerebellum, cerebrum, cervix, øsofagus, øye, hjerte, nyre, tykktarm, lever, lunge, lymfekjertler, melkekjertler fra bryst, eggstokker, oviduct, bukspyttkjertel, paratyroid, perifere nerver, hypofyse, placenta, prostata, spyttkjertel, hud, tynntarmen, ryggmarg, milten, mave, tverrstripet muskulatur, testikler, thymus, tyroid, mandel, urinleder, urinblære, og livmor) fra 3 ikke-beslektede voksne oppnådd ved obduksjon eller biopsi) blir fiksert og tørket på objektglass. Peroksidase-flekkfargingen av vev-seksjoner blir utført, ved å bruke avidin-biotin systemet.
Trinn 3: Kryoseksjoner (omtrent 5 um) av cynomolgus-apekatter vev (38 vev (inkludert binyrer, blod, blodkar, beinmarg, cerebellum, cerebrum, cervix, øsofagus, øye, hjerte, nyre, tykktarm, lever, lunge, lymfekjertler, melkekjertler fra bryst, eggstokker, oviduct, bukspyttkjertel, paratyroid, perifere nerver, hypofyse, placenta, prostata, spyttkjertel, hud, tynntarmen, ryggmarg, milten, mave, tverrstripet muskulatur, testikler, thymus, tyroid, mandel, urinleder, urinblære, og livmor) fra 3 ikke-beslektede voksen apekatts oppnådd ved obduksjon eller biopsi) blir fiksert og tørket på objektglass. Peroksidase-flekkfargingen av vev-seksjoner blir utført, ved å bruke avidin-biotin systemet.
Antistoffet eller DVD-Ig er inkubert med det sekundære biotinylerte anti-humane IgG og utviklet til immunkompleks. Immunkomplekset ved sluttkonsentrasjonene på 2 og 10 ug/mL med antistoff eller DVD-Ig blir tilsatt på vevseksjoner på objektglass og deretter vevseksjonene blir reagert i 30 minutter med et avidin-biotin-peroksidase kit. Deretter, DAB (3,3'-diaminobenzidine), et substrat for peroksidase-reaksjonen, er anvendt i 4 minutter for flekkfarging av vev. Antigen-Sefarose kuler blir anvendt som positive kontroll-vevseksjoner. Mål-antigen og humant serum blokkeringsstudier gjøre tjeneste som ytterligere kontroller. Immunkomplekset ved sluttkonsentrasjonene på 2 og 10 ug/mL med antistoff eller DVD-Ig er pre-inkubert med mål-antigen (sluttkonsentrasjon av 100 ng/ml) eller humant serum (sluttkonsentrasjon 10%) i 30 minutter, og deretter tilsatt på vevseksjonene på objektglass og deretter vevseksjonene blir reagert i 30 minutter med et avidin-biotin-peroksidase kit. Deretter, DAB (3,3'-diaminobenzidine), et substrat for peroksidase-reaksjonen, er anvendt i 4 minutter for flekkfarging av vev.
Enhver spesifikk flekkfarging blir vurdert å være enten en forventet (f.eks., konsistent med antigen-uttrykking) eller uventet reaktivitet basert på kjent uttrykking av det gjeldende mål-antigenet. Enhver flekkfarging som blir vurdert spesifikk blir poengsatt for intensitet og hyppighet. Flekkfargingen av vev mellom trinn 2 (humant vev) og trinn 3 (cynomolgus-apekatter vev) er enten vurdert å være lignende eller forskjellig.
Eksempel 1.1.2.E: Inhibering av HUVEC Proliferering/ Overlevelse ved VEGF Moderantistoff og DVD- Ig- konstruksioner
Før plating for assayet blir normale humane vaskulære endotelceller fra navlestreng eller HUVEC (avsnitt 2-6) bevart i EBM-2 (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD) supplementert med EGM-2 SingleQuots (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, #CC-4176). HUVEC celler blir platet med 10,000 celler/brønn på kollagen-belagte svarte 96-brønn plater i (IOOjjI) EMB-2 med 0.1% FBS i fraværet av vekstfaktorer. Dagen etter blir mediet byttet ut med 0.1% FBS i fraværet av vekstfaktorer. Dagen etter blir mediet byttet ut med lOOjxl of EMB-2 (uten vekstfaktorer eller serum) og inkubert i fire timer før tilsetningen av VEGF og antistoffer/DVD-Ig'er. Anti-VEGF monoklonale antistoffer eller DVD-Ig'er (ved sluttkonsentrasjoner på 67 nM, 6.7 nM og 0.67 nM) er fortynnet i EMB-2 med 0.1% BSA og er pre-inkubert med rekombinant human VEGF165(50ng/ml) i 1 time ved 25°C i 50jjl. Antistoff/DVD-Ig og VEGF blandinger blir deretter tilsatt til cellene (50jjl), og platene ble inkubert ved 37 °C i en fuktet, 5% C02atmosfære i 72 timer. Celle overlevelse/proliferering er målt indirekte ved å vurdere ATP-nivåer ved å bruke et ATPlite kit (Perkin Eimer, Waltham, MA) ifølge produsentens instruksjoner.
Eksempel 1.1.2.F: IL- 1 q/ B Bioassay og Nøytraliseirngsassay
MRC5 celler ble platet ved 1.5-2 x IO<4>celler per brønn i en 100 jjL volum og inkubert over natten ved 37°C, 5% C02. En 20 jig/mL arbeidsstandard med antistoff (4x konsentrert) ble fremstilt i komplett MEM medium. En åtte-punkts seriell fortynning ble utført (5 jjg/mL-0.0003 jjg/mL) i komplett MEM i Marsh fortynningsplater. Sekstifem jxL /brønn med hver antistoff-fortynning ble tilsatt i fire eksemplarer til en 96-brønn v-bunn (Costar# 3894) plate og 65 jxL av en 200 pg/mL løsning med IL-la eller IL-lp eller 65 jxL av en blandet løsning inneholdende en 50 pg/mL løsning med både IL-1 a og IL-lp ble også tilsatt. Kontrollbrønner mottok 65 jjL 200 pg/ml med IL-la eller IL-lp eller 50 pg/mL blandet IL-la/p (4x konsentrert) pluss 65 jjL MEM media og medie-kontrollbrønner mottok 130 jjL med media. Etter en 1 time inkubering, 100 jjL av Ab/Ag-blandingen ble tilsatt til MRC5-cellene. Alle brønn-volumer ble lik 200 jxL. Alle plate reagenser ble deretter lx konsentrert. Etter en 16-20 timer inkubering, brønn-innholdet (150 jjL) ble overført til en 96-brønn rund-bunnet plate (Costar# 3799) og plassert i en -20°C fryser. Supernatantene ble utprøvd for hIL-8 nivåer ved å bruke et humant IL-8 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN) eller hIL-8 kjemiluminescens kit (MDS). Nøytraliseringsstyrke ble bestemt ved å beregne prosent inhibering i forhold til IL-la, IL-lp, eller the IL-la/p alene kontrollverdien. Resultater er vist i Tabell 9.
Alle DVD-Ig'er inneholdende VDs fra AB032 i enten den N-terminale eller C-terminale posisjon viste nøytralisering i MRC5 IL-1Ia/6 nøytraliseringsassay.
Eksempel 1.1.2.G: Nøytralisering av huTNFq
L929 celler ble dyrket til en halv-konfluent tetthet og høstet ved å bruke 0.05% tryspin (Gibco#25300). Cellene ble vasket med PBS, tellet og resuspendert ved 1E6 celler/mL i assaymedia inneholdende 4 jig/mL actinomycin D. Cellene ble sådd i en 96-brønn plate (Costar#3599) ved et volum på 50 jxL og 5E4 celler/brønn. DVD-Ig'et™ og kontroll IgG ble fortynnet til en 4x konsentrasjon i assaymedia og seriell 1:3 fortynninger ble utført. HuTNFa ble fortynnet til 400 pg/mL i assaymedia. Antistoff prøve (200 pL) ble tilsatt til huTNFa (200 pL) i et 1:2 fortynningsskjema og latt inkubere i 0.5 time ved romtemperatur.
DVD-Ig'et™ / huTNFa løsning ble tilsatt til de platede cellene ved 100 pL for en
sluttkonsentrasjon på 100 pg/mL huTNFa og 25 nM - 0.00014 nM DVD-Ig™. Platene ble inkubert i 20 timer ved 37°C, 5 % C02. For å kvantifisere viabiliteten, 100 jxL ble fjernet fra brønnene og 10 jjL of WST-1 reagens (Roche cat# 11644807001) ble tilsatt. Plater ble inkubert under assay-betingelser i 3.5 timer, sentrifugert ved 500 xg og 75 jxL supernatant overført til en ELISA plate (Costar cat#3369). Platene ble avlest ved OD 420-600 nm på en Spectromax 190 ELISA plateavleser. Resultatene er
tilveiebrakt i Tabell 10.
Alle DVD-Ig'er inneholdende VDs fra AB017 i enten den N-terminale eller C-terminale posisjon viste nøytralisering i TNFa nøytraliseringsassay.
Eksempel 1.1.2.H: IL- 6 indusert pSTAT3 Assay
TF-1 celler blir dyrket i DMEM med 2 mM 1-glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/mL Pen/strep, 1.5g/L natriumbikarbonat, 4.5 g/L glukose, 1 mM natrium pyruvate, 10% FBS, og 2 ng/mL GM-CSF. TF-1 celler blir platet med 1.5-2 x IO<5>celler per brønn i en 10 jxL volum og inkubert over natten ved 37°C, 5% C02i assay-medium. (komplett DMEM minus GM-CSF). Celler er platet inn i en 96 lÅ brønn hvit assay-plate. En 500 jig/mL arbeidsstandard med antistoff (4x konsentrert) er fremstilt i PBS. Antistoffer og DVD-Ig'er er seriellt fortynnet 1:5 i assay-medium i Marsh fortynningsplater. Fem uL /brønn med hver antistoff-fortynning blir tilsatt i triplikat til den 96 lA brønn hvit assay-platen inneholdende cellene. Celler og antistoffer eller DVD-Ig'er er pre-inkubert i 30 minutter. IL-6 er fremstilt ved 10jig/mL standardløsning i endotoksin-fri D-PBS (0.1% BSA) og en arbeidsstandard med 100 ng/mL (4x konsentrasjon) fremstilt med assaymedia. Fem jxL/brønn med 100 ng/mL IL-6 blir tilsatt til hver brønn. Plater blir inkubert i 30 minutter ved 37°C. Celler blir lysert ved å tilsette 5jiL med 5X cellelyseringsbuffer til alle brønner og platene blir ristet i 10 minutter ved romtemperatur. Plater er fryst ved -20°C og pSTAT3 SureFire Assayet ble kjørt (Perkin Eimer).
Platen er tint ved romtemperatur og 30 jjL/ brønn med reaksjonsbuffer pluss Aktiveringsbuffer-blanding inneholdende Alfa Screen Akseptor Beeds (40 deler reaksjonsbuffer, 10 deler aktivering buffer og 1 del akseptorkuler) blir tilsatt til hver brønn. Platen er forseglet med folie for å beskytte den fra lys og er ristet forsiktig i 2 timer ved 37°C. Fortynningsbuffer (12.5jiL/ brønn) inneholdende Alfa Screen Donorkuler (20 deler fortynningsbuffer til 1 del donorkuler) blir tilsatt til hver brønn. Platen er forseglet med folie og ristet forsiktig i 2 timer ved 37°C. Platen er brakt til romtemperatur og avlest på Alfa Screen plateavleseren.
Eksempel 1.1.2.1: Vekst Inhiberende Virkning av en Tumorreseptor Monoklonalt Antistoff eller DVD- Ig' er In vitro
Tumorreseptor monoklonale antistoffer eller DVD-Ig'er fortynnet i D-PBS-BSA (Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning med 0.1%BSA) 20jjL blir tilsatt til humane tumorceller ved sluttkonsentrasjoner på 0.01 jjg/mL-100 jig/mL i 180uL. Platene blir inkubert ved 37 °C i en fuktet, 5% CO2atmosfære i 3 dager. Antallet levende celler i hver brønn er kvantifisert ved å bruke MTS reagenser ifølge produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WT) for å bestemme prosent tumorvekst inhibering. Brønner uten antistoff-behandlingen blir anvendt som kontroller for 0% inhibering mens brønner uten celler er ansett å vise 100% inhibering.
Eksempel 1.1.2.J: Tumoricidal Virkning av en Moder eller DVD- Ig Antistoff In vitro
Moderantistoffer eller DVD-Ig som binder to mål-antigener på tumorceller kan bli analysert for tumoricidal aktivitet. Kort fortalt, moderantistoffer eller DVD-Ig er fortynnet i D-PBS-BSA (Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning med 0.1%BSA) og tilsatt til humane tumorceller ved sluttkonsentrasjoner på 0.01 ug/mL til 100 ug/mL 200uL. Platene blir inkubert ved 37 °C i en fuktet, 5% CO2atmosfære i 3 dager. Antallet levende celler i hver brønn er kvantifisert ved å bruke MTS reagenser ifølge produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WI) for å bestemme prosent tumorvekst inhibering. Brønner uten antistoff-behandlingen blir anvendt som kontroller for 0% inhibering mens brønner uten celler ble vurdert til å vise 100% inhibering.
For vurdering av apoptose, kaspase-3 aktivering er bestemt ved den etterfølgende protokollen: antistoff-behandlede celler i 96-brønn plater blir lysert i 120 jjl of lx lyseringsbuffer (1.67mM Hepes, pH 7.4, 7mM KC1, 0.83mM MgCl2, 0.1 ImM EDTA, 0.1 ImM EGTA, 0.57% CHAPS, ImM DTT, lx protease-inhibitor cocktail tablet; EDTA-fri; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) ved romtemperatur med risting i 20 minutter. Etter celle-lysering, 80 jjl av en kaspase-3 reaksjonsbuffer (48mM Hepes, pH 7.5, 252mM sukrose, 0.1% CHAPS, 4mM DTT, og 20 pM Ac-DEVD-AMC substrat; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA) blir tilsatt og platene blir inkubert i 2 timer ved 37°C. Platene blir avlest på en 1420 VICTOR Multilabel Counter (Perkin Eimer Life Sciences, Downers Grove, IL) ved å bruke de etterfølgende innstillingene: eksitering- 360/40, emisjon- 460/40. En økning av fluorescens enheter fra antistoff-behandlede celler i forhold til isotype antistoff kontro 11-behandlet celler er indikerende for apoptose.
Eksempel 1.1.2.K: Inhibering av Celle- proliferering ved Moderantistoff og DVD- Ig-konstruksjoner
U87-MG humane glioma tumorceller blir platet med 2,000 celler/brønn i 100 jjl i 96-brønn plater i RPMI medium supplementert med 5% føtalt kalveserum, og inkubert ved 37°C, 5% C02over natten. Dagen etter blir cellene behandlet med serielle fortynninger av antistoff eller DVD-Ig'er (0.013 nM til 133 nM dose område), og inkubert ved 37 °C i en fuktet, 5% C02atmosfære for 5 dager. Celle overlevelse/proliferering er målt indirekte ved å vurdere ATP-nivåer ved å bruke et ATPlite kit (Perkin Eimer, Waltham, MA) ifølge produsentens instruksjoner.
Eksempel 1.1.2.L: VEGF Moderantistoff og DVD- Ig- konstruksioner Forhindre VEGFww Interaksjon med VEGFR1
ELISA-plater (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) blir inkubert over natten ved 4°C med 100 jol PBS inneholdende rekombinant VEGFR1 ekstra-cellulær domene-Fc fusjonsprotein (5jig/ml, R&D systemer, Minneapolis, MN). Plater blir vasket tre ganger i vaskebuffer (PBS inneholdende 0.05% Tween 20), og blokkert i 1 time ved 25°C i blokkeringsbuffer (PBS inneholdende 1% BSA). Serielle fortynninger av hver antistoff/DVD-Ig i PBS inneholdende 0.1% BSA blir inkubert med 50jxl med 2nM biotinylert VEGF i 1 time ved 25°C. Antistoffet/DVD-Ig-biotinylert VEGF blandinger (100^1) blir deretter tilsatt til de VEGFRl-Fc belagte brønnene og inkubert ved 25°C i 10 minutter. Brønnene blir vasket tre ganger, og deretter inkubert i 1 time ved 25°C med lOOjxl streptavidin-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD). Brønnene blir vasket tre ganger, og 100^1 ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) blir tilsatt per brønn. Etter fargeutviklingsreaksjonen er stoppet med IN HCL og absorbans ved 450nM er målt.
Eksempel 1.1.2.M: Inhibering av Reseptor Fosforylering ved Moderantistoffer eller DVD- Ig-konstruksioner In vitro
Humane karsinom celler er platet i 96-brønn plater ved 40,000 celler/brønn i 180jjl serum-fri medium (DMEM+ 0.1% BSA), og inkubert over natten ved 37°C, 5% C02. Costar EIA plater (Lowell, MA) er belagt med 100 jxl/brønn med reseptorfangst-Ab (4jxg/ml sluttkonsentrasjon), og inkubert over natten ved romtemperatur under risting. Dagen etter, reseptor antistoff-belagt ELISA-plater blir vasket (tre ganger med PBST = 0.05% Tween 20 i PBS, pH 7.2 - 7.4), og 200pl blokkeringsløsning blir tilsatt (1% BSA, 0.05% NaN3 i PBS, pH 7.2 - 7.4.) for å blokkere i 2 timer ved romtemperatur på en vuggemaskin. Humane tumorceller er ko-inkubert med antistoffer eller DVD-Ig'er og ligand. Monoklonale antistoffer eller DVD-Ig'er fortynnet i D-PBS-BSA (Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning med 0.1%BSA) blir tilsatt til Humane karsinom celler ved sluttkonsentrasjoner på 0.01 jig/mL-100 jig/mL. Vekstfaktorer er samtidig tilsatt til cellene ved konsentrasjoner av 1-lOOng/mL (200jjL), og celler blir inkubert ved 37°C i en fuktet, 5% C02atmosfære i 1 time. Celler blir lysert i 120jjl/brønn med kald celle-ekstraksjonsbuffer (10 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM natrium orthovanadate, 1% Triton X-100, 10% Glyserol, 0.1% SDS, og protease-inhibitor cocktail), og inkubert ved 4°C i 20 minutter med risting. Cellelysater (IOOjjI) blir tilsatt til ELISA-platen, og inkubert over natten ved 4°C med forsiktig risting. Dagen etter, ELISA-plater blir vasket, og 100 jjl/brønn med pTyr-HRP deteksjons-Ab blir tilsatt (p-IGFIR ELISA kit, R&D System # DYC1770, Minneapolis, MN), og plater blir inkubert i 2 timer ved 25°C i mørket. Plater er utviklet for å bestemme fosforylering per produsentens instruksjoner.
Eksempel 1.1.2.N: Inhibering av VEGFR2 ( KDR) Fosforylering Ved VEGF Moderantistoff Og DVD- Ig- konstruksioner
NIH3T3-celler som uttrykker humant VEGFR2 (KDR) blir platet med 20,000 celler/brønn (lOOjxl) i 96-brønn plater i DMEM supplementert med 10% FBS. Dagen etter, cellene blir vasket to ganger med DMEM og serum-sultet i tre timer i DMEM uten FBS. Anti-VEGF moderantistoff eller DVD-Ig'er (ved sluttkonsentrasjoner på 67 nM, 6.7 nM og 0.67 nM) fortynnet i DMEM med 0.1%BSA er pre-inkubert med rekombinant human VEGFi65(50ng/ml) i 1 time ved 25°C. Disse antistoff/DVD-Ig og VEGF blandinger blir deretter tilsatt til cellene, og platene blir inkubert ved 37°C i en fuktet, 5% C02atmosfære i 10 minutter. Celler blir vasket to ganger med er kald PBS og lysert ved tilsetning av lOOul/ brønn med cellelyseringsbuffer (Cell Signaling, Boston, MA) supplementert med 0.1% NP40. Duplikat prøver er samlet og 170ul blir tilsatt til brønner av ELISA-plater tidligere belagt med anti-VEGFR2 antistoff (R&D systemer, AF357, Minneapolis, MN) og inkubert ved 25°C med forsiktig risting i to timer. Brønnene blir vasket fem ganger med vaskebuffer (PBS inneholdende 0.05% Tween 20), og inkubert med 50jxl of of 1:2000 fortynning av biotinylert anti-fosfotyrosine antistoff (4G10; Millipore, Billerica, MA) i 1 time ved 25°C. Brønnene blir vasket fem ganger med PBS inneholdende 0.05% Tween 20, og deretter inkubert i 1 time ved 25°C med streptavidin-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD). Brønnene blir vasket tre ganger med streptavidin-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD)). Brønnene blir vasket tre ganger med PBS inneholdende 0.05% Tween 20, og 100^1 ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) blir tilsatt per brønn. Etter fargeutviklingsreaksjonen er stoppet med IN HCL og absorbans ved 450nM ble målt.
Eksempel 1.1.2.0: Effekt av et DVD- Ig På The Vekst Of Human Karsinom Subkutan Flank Xenografts
A-431 humane epidermoide karsinom celler er dyrket in vitro til 99% viabillitet, 85% konfluens i vevsdyrkingsflasker. SCID hunkjønnede mus (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA)
ved 19-25 gram er injisert subkutant inn i høyre flanke med 1 x IO<6>humane tumorceller (1:1 matrigel) på studiedag 0. Administrasjon (IP, QD, 3x/ uke) med human IgG kontroll eller DVD-Ig ble igangsatt etter at mus er størrelse-matchet inn i grupper av mus med gjennomsnittlige tumorvolumer på omtrent 200 to 320 mm<3>. Tumorene er målt to ganger i uken med start på omtrent dag 10 etter tumorcelle-injisering.
Eksempel 1.1.2.P: Binding av Monoklonale Antistoffer til overflaten av Humane tumorcelle-linjer som vurdert ved" flow cytometry"
Stabile celle-linjer som overuttrykker et celleoverflate-antigen av interesse eller humane tumorcelle-linjer ble høstet fra vevdyrkingsflasker og resuspendert i Fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende 5% føtalt kalveserum (PBS/FBS). Før flekkfarging, humane tumorceller ble inkubert med (lOOul) humant IgG ved 5 ug/ml i PBS/FCS. 1-5 xlO5 celler ble inkubert med antistoff eller DVD-Ig (2 ng/mL) i PBS/FBS i 30-60 minutter. Celler ble vasket to ganger og lOOul of F(ab')2 geit anti human IgG, Fcy- fycoerythrin (1:200 fortynning i PBS) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat.#109-116-170) ble tilsatt. Etter en 30 minutters inkubering, celler ble vasket to ganger og resuspendert i PBS/FBS. Fluorescens ble målt ved å bruke en Becton Dickinson FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Tabell 11 viser FACS data for DVD-Ig'et konstruksjoner. Det geometriske gjennomsnitt er n-roten til multipliseringsproduktet av n fluorescerende signaler (al x a2 x a3....an). Med log-transformert data det geometriske gjennomsnitt blir anvendt for å normalisere vektingen av data-fordelingen. Den etterstående tabellen inneholder FACS geometriske gjennomsnittet for moderantistoffer og DVD-Ig-konstruksjoner.
Alle DVD'er viste binding til deres celleoverflate-mål. De N-terminale domenene til DVD'er bandt deres mål på celleoverflaten så godt som eller bedre enn moder-antistoffet. Binding kan bli gjenvunnet eller forbedret ved å justere linker-lengde.
Eksempel 1.1.2.Q: Binding av Moder Reseptor Antistoff og DVD- Ig- konstruksioner til overflaten av Humane tumorcelle- linjer som vurdert ved" flow cytometry"
Stabile celle-linjer som overuttrykker celleoverflate reseptorer eller humane tumorcelle-linjer er høstet fra vevdyrkingsflasker og resuspendert i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning (DPBS) inneholdende 1% føtalt kalveserum (DPBS/FCS). 1-5 xlO<5>celler blir inkubert med lOOpL antistoffer eller DVD-Ig'er (10ug/mL) i DPBS/FCS i 30-60 minutter. Celler blir vasket to ganger og 50pl geit anti-human IgG-fycoerythrin (1:50 fortynning i DPBS/BSA) (Southern Biotech Associates, Birmingham, AL cat#2040-09) blir tilsatt. Etter 30-45 minutter inkubering, celler blir vasket to ganger og resuspendert i 125uL/brønn 1% formaldehyd i DPBS/FCS. Fluorescens ble målt ved å bruke en Becton Dickinson LSRII (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Eksempel 1.2: Generering av Monoklonale moderantistoffer til et humant Antigen av interesse
Murine moder-mAb'er i stand til å binde til og nøytralisere et humant antigen av interesse og en variant derav er oppnådd som følger:
Eksempel 1.2.A: Immunisering av Mus Med et humant Antigen av interesse
Tyve mikrogram med rekombinant renset human antigen (f.eks., IGF 1,2) blandet med komplett Freunds adjuvant eller Immunoeasy adjuvant (Qiagen, Valencia, CA) er injisert subkutant inn i fem 6-8 uker-gamle Balb/C, fem C57B/6 mus, og fem AJ mus på Dag 1. På dager 24, 38, og 49, tyve mikrogram med rekombinant renset human antigen variant blandet med ikke-komplett Freunds adjuvant eller Immunoeasy adjuvant er injisert subkutant inn i de samme mus. På dag 84 eller dag 112 eller dag 144, mus er injisert intravenøst med 1 ug rekombinant renset human antigen av interesse.
Eksempel 1.2.B: Generering av en Hybridoma
Splenocytter oppnådd fra de immuniserte musene beskrevet i Eksempel 1.2.A er fusjonert med SP2/0-Ag-14 celler ved en forhold på 5:1 ifølge den etablerte metoden beskrevet i Kohler, G. og Milstein (1975) Nature, 256:495 for å generere hybridomas. Fusjons-produkter er platet i seleksjons-media inneholdende azaserine og hypoksanthine i 96-brønn plater ved en tetthet på 2.5xl0<6>milt-celler per brønn. Syv til ti dager etter fusjon, makroskopiske hybridoma kolonier er observert. Supernatant fra hver brønn inneholdende hybridoma kolonier er utprøvd ved ELISA for nærværet av antistoff til antigenet av interesse (som beskrevet i Eksempel 1.1.1 ,A). Supernatanter som viser antigen-spesifikk aktivitet blir deretter utprøvd for aktivitet (som beskrevet i assayene i Eksempel 1.1.2), for eksempel, evnen til å nøytralisere antigenet av interesse i et bioassay slik som som beskrevet i Eksempel 1.1.2.1).
Eksempel 1.2.C: Identifisering Og Karakterisering av Monoklonale moderantistoffer til et humant mål- antigen av interesse
Eksempel 1.2.Cl: Analysering av nøytraliserende aktivitet hos monoklonale moderrantistoff
Hybridoma supernatanter er analysert for nærværet av moderantistoffer som binder et antigen av interesse, fremstilt ifølge Eksempler 1.2.A og 1.2.B, og er også i stand til å binde en variant av antigenet av interesse ("antigen variant"). Supernatanter med antistoffer positive i begge assayer blir deretter utprøvd for deres antigen nøytraliseringsstyrke, for eksempel, i cytokin-bioassayet fra Eksempel 1.1.2.1. Hybridomene som produserer antistoffer med IC50verdier i bioassayet mindre enn 1000pM, i en utførelsesform, mindre enn 100pM er oppskalert og klonet ved begrenset fortynning. Hybridom-cellene er ekspandert inn i media inneholdende 10% lav IgG føtalt kalveserum (Hyclone #SH30151, Logan, UT). I gjennomsnitt, 250 mL av hver hybridoma supernatant (avledet fra en klonepopulasjon) er høstet, konsentrert og renset ved protein-affinitetskromatografi, som beskrevet i Harlow, E. og Lane, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual". Evnen til rensede mAb'er for å inhibere aktiviteten til dets målantigen er bestemt, for eksempel, ved å bruke cytokin-bioassayet som beskrevet i Eksempel 1.1.2.1.
Eksempel 1.2.C.2: Analyse av Moder Monoklonale Antistoff Kryssreaktivitet for Cvnomolgus mål- antigen av interesse
For å bestemme om de valgte mAb'ene beskrevet heri kjenner igjen cynomolgus-antigen av interesse blir BIACORE analyse utført som beskrevet heri (Eksempel 1.1.1 .G) ved å bruke rekombinant cynomolgus mål-antigen. I tillegg kan også nøytraliseringsstyrken til mAb'er mot rekombinant cynomolgus-antigen av interesse bli målt i cytokin-bioassayet (Eksempel 1.1.2.1). MAb'er med god cyno-kryssreaktivitet (I en utførelsesform, innenfor 5-ganger reaktiviteten for humant antigen) er selektert for future karakterisering.
Eksempel 1.2.D: Bestemmelse av Aminosyre- sekvensen til Den variable regionen For Hvert Murint Anti- Humant Monoklonalt Antistoff
Isolering av cDNA'ene, uttrykking og karakterisering av de rekombinante anti-human murine mAb'ene er utført som følger. For hver aminosyresekvens-bestemmelse, omtrent 1 x 10<6>hybridom-celler er isolert ved sentrifugering og prosessert for å isolere total RNA med Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) etter produsentens instruksjoner. Total RNA er utsatt for første-streng DNA-syntese ved å bruke "SuperScript First-Strand Synthesis"-Systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA) per produsentens instruksjoner. Oligo(dT) blir anvendt for å prime først-streng syntesen for å velge for poly(A)+ RNA. Første-streng cDNEt-produktet blir så amplifisert ved PCR med primere utformet for amplifisering av murine immunoglobulin variable regioner (Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI). PCR-produkter er oppløst på en agarose gel, kuttet ut, renset, og deretter sub-klonet med TOPO Klonings-kit inn i pCR2.1-TOPO vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) og transformet til TOP10 kjemisk kompetent E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). Koloni-PCR blir utført på transformantene for å identifisere kloner inneholdende "insert". Plasmid-DNA er isolert fra kloner inneholdende "insert" ved å bruke et QIAprep Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA), "inserts" i plasmidene er sekvenser på begge strengene for å bestemme de variable tung- eller variable lettkjede DNA-sekvensene ved å bruke M13 forover og M13 revers primere (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). Variable tung og variable lettkjede sekvenser hos mAb'ene blir identifisert. I en utførelsesform, seleksjonskriteriene for et panel med kandidat mAb'er for neste trinns utvikling (humanisering) inkluderer det følgende: Antistoffet inneholder ikke noe/noen N-linkede glykosyleringsseter (NXS), bortsett fra standard en i CH2 ■ Antistoffet inneholder ikke noe/noen ekstra cysteiner i tillegg til de vanlige cysteinene i alle antistoff ■ Antistoff-sekvensen er på linje med de nærmeste humane kimlinje-sekvensene for VH og VL og enhver uvanlig aminosyre bør bli sjekket for forekomst i andre naturlige humane antistoffer ■ N-terminal Glutamin (Q) er forandret til Glutaminsyre (E) hvis det ikke påvirker aktiviteten til antistoffet. Dette vil redusere heterogenitet på grunn av syklisering av Q ■ Effektiv signalsekvens spalting er bekreftet ved Masse-spektrofotometri. Dette kan bli gjort med COS celle- eller 293 celle-materiale ■ Proteinsekvensen er kontrollert for risikoen for deamidering av Asn som kunne resultere i tap av aktivitet
■ Antistoffet har et lavt nivå av aggregering
■ Antistoffet har løselighet >5-10 mg/ml (i forskningsfase); >25 mg/ml
■ Antistoffet har en normal størrelse (5-6 nm) ved Dynamisk Lysspredning (DLS)
■ Antistoffet har en lav ladningsheterogenitet
■ Antistoffet mangler cytokinfrigjøring (se Eksempel 1.1.2.B)
■ Antistoffet har spesifisitet for det tiltenkte cytokinet (se Eksempel 1.1.2.C)
■ Antistoffet mangler uventet kryssreaktivitet for vev (se Eksempel 1.1.2.D)
■ Antistoffet har likhet mellom human og cynomolgus kryssreaktivitet for vev (se Eksempel 1.1.2.D)
Eksempel 1.2.2: Rekombinante Humaniserte Moderantistoffer
Eksempel 1.2.2.1: Konstruksjon Og Uttrykking av Rekombinante Kimeriske Anti- Human Moderantistoffer
DNA'et som koder for Tungkjede konstant regionen i murine anti-human moder-mAb'er er byttet ut med et cDNEt-fragment som koder for den humane IgGl-konstantregionen inneholdende 2 hengselregion arninosyre-mutasjoner ved homolog rekombinasjon i bakterier. Disse mutasjoner er en leucine til alanine forandring ved posisjon 234 (EU nummerering) og en leucine til alanine forandring ved posisjon 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). Lettkjede konstant regionen av hver av disse antistoffer er byttet ut med en human kappa konstantregion. Fullengde kimeriske antistoffer er forbigående uttrykt i COS-celler ved ko-transfeksjon av kimeriske tung og lettkjede cDNAs ligert inn i pBOS-uttrykkingsplasmidet (Mizushima og Nagata, Nucleic Acid Research 1990, Vol 18, pg 5322). Cellesupernatanter inneholdende rekombinant kimerisk antistoffer renset ved Protein A Sepharose kromatografi og bundet antistoff er eluert ved tilsetning av syre buffer. Antistoffer er nøytralisert og dialysert inn i PBS.
Tungkjedet cDNA som koder for et kimerisk mAb er co-transfektert med dets kimeriske lettkjede cDNA (begge ligert i pBOS-vektoren) inn i COS-celler. Celle supernatant inneholdende rekombinant kimerisk antistoff blir renset ved Protein A Sepharose kromatografi og bundet antistoffer eluert ved tilsetning av syre buffer. Antistoffer er nøytralisert og dialysert inn i PBS.
De rensede kimeriske anti-human moder-mAb'ene blir deretter utprøvd for deres evne til å binde (ved Biacore) og for funksjonell aktivitet, f.eks., for å inhibere den cytokin-induserte produksjonen av IgE som beskrevet i Eksempler 1.1.1 .G og 1.1.2.B. Kimeriske mAb'er som opprettholde aktiviteten til moder hybridoma mAb'ene er selektert for senere utvikling.
Eksempel 1.2.2.2: Konstruksjon Og Uttrykking av Humanisert Anti Human Moderantistoffer Eksempel 1.2.2.2.A: Seleksjon av Humant antistoff- rammeverk
Hver murine variable tung og variable lettkjede gen-sekvens er hver for seg innrettet mot 44 humant immunoglobulin kimlinje variable tungkjede eller 46 kimlinje variable lettkjede sekvenser (avledet fra NCBI lg Blast website ved http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) ved å bruke Vektor NTI programvare.
Humanisering er basert på aminosyresekvens homology, CDR-klynge analyse, hyppighet av anvendelse blant uttrykte humane antistoffer, og tilgjengelig informasjon på krystallstrukturene av humane antistoffer. Med hensyn til mulig virkninger på antistoff binding, VH- VL parring, og andre faktorer, blir murine residuer mutert til humane residuer hvor murine og humane rammeverk-residuer er forskjellig, med noen få unntak. Ytterligere humaniserings-strategier er utformet basert på en analyse av human kimlinje antistoff sekvenser, eller en undergruppe derav, som innehar en høy grad av homologi, dvs., sekvens-likhet, med den faktiske aminosyresekvens til de murine antistoff variable regioner.
Homologi-modellering blir anvendt for å identifisere residuer unike for de murine antistoff-sekvensene som er forutsagt å være kritiske for strukturen til antistoffet kombinere sete, CDR'ene. Homologi-modellering er en beregningsmetode hvormed omtrentlige tredimensjonale koordinater er fremstilt for et protein. Kilden for innledende koordinater og veiledning for deres videre forfining er et andre protein, referanseproteinet, for hvilket de tredimensjonale koordinatene er kjent og viss sekvens er relatert til sekvensen til det første proteinet. Forholdet mellom sekvensene til de to proteinene blir anvendt for å generere et samsvar mellom referanseproteinet og proteinet for hvilket koordinater er ønsket, mål-proteinet. De primære sekvensene til referanse- og mål-proteinene er innrettet med koordinater for identiske porsjoner av de to proteinene overført direkte fra referanseproteinet til mål-proteinet. Koordinater for ikke-samsvarende porsjoner av de to proteinene, f.eks., fra residu-mutasjoner, innsettinger, eller slettelser, er konstruert fra generiske struktur-templater og energi-forfinet for å sikre samsvar med de allerede overført modell-koordinater. Denne beregnede proteinstrukturen kan videre bli forfinet eller anvendt direkte i modellerings-studier. Kvaliteten til modellstrukturen er bestemt ved nøyaktigheten av påstanden at referanse- og mål-proteinene er beslektede og presisjonen med hvilken sekvensinnrettingen er konstruert.
For de murine mAb'ene blir en kombinasjon av BLAST-søking og visuell inspeksjon anvendt for å identifisere passende referansestrukturer. Sekvensidentitet på 25% mellom referanse- og mål-aminosyresekvensene er ansett som minimum nødvendig for å forsøke en homologi-modelleringsøvelse. Sekvensinnrettinger er konstruert manuelt og modellkoordinater er fremstilt med programmet Jackal (se Petrey, D. et al. (2003) Proteins 53 (Suppl. 6): 430^135).
De primære sekvensene til de murine og humane rammeverk-regionene til de valgte antistoffene deler betydelig identitet. Residu-posisjoner som varierer er kandidater for inklusjon av det murine residuet i den humaniserte sekvensen for å beholde den observerte bindingsstyrken til det murine antistoffet. En liste med rammeverk-residuer som varierer mellom de humane og murine sekvensene er konstruert manuelt. Tabell 12 viser rammeverk-sekvensene valg for dette studiet.
Sannsynligheten for at en gitt rammeverk-residu ville påvirke bindings-egenskapene til antistoffet er avhengig av dets nærhet til CDR-residuene. Derfor, ved å bruke modellstrukturene, residuene som varierer mellom de murine og humane sekvensene er rangert ifølge deres avstand fra ethvert atom i CDR'ene. De residuer som faller innenfor 4.5 Å av ethvert CDR-atom blir identifisert som mest viktig og er anbefalt å være kandidater for retensjon av det murine residuet i det humaniserte antistoffetet (dvs., tilbake-mutasjon).
/ silico konstruert humaniserte antistoffer er konstruert ved å bruke oligonukleotider. For hver variable region cDNA, 6 oligonukleotider av 60-80 nukleotider hver er utformet for å overlappe hverandre ved 20 nukleotider ved 5' og/eller 3' enden av hver oligonukleotid. I en "annealing" reaksjon, alle 6 oligonukleotider er kombinert, kokt, og sammensmeltet i nærværet av dNTPs. DNEn polymerase I, Stort (Klenow) fragment (Ny England Biolabs #M0210, Beverley, MA.) blir tilsatt for å fylle inn de omtrent 40bp hullene mellom de overlappende oligonukleotidene. PCR blir utført for å amplifisere hele variable region genet ved å bruke to ytterste primere inneholdende overhengende sekvenser komplementære til de multiple kloningssetene i en modifisert pBOS vektor (Mizushima, S. og Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 17). PCR-produktene avledet fra hver cDNA sammensetning blir separert på en agarose gel og båndet tilsvarende den forutsagte variable region cDNA størrelsen er kuttet ut og renset. Den variable tung regionen blir satt inn iet cDNEt-fragment som koder for den humane IgGl-konstantregionen inneholdende 2 hengselregion aminosyre-mutasjoner ved homolog rekombinasjon i bakterier. Disse mutasjoner er en leucine til alanine forandring ved posisjon 234 (EU nummerering) og en leucine til alanine forandring ved posisjon 235 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657). Det variable lettkjedet region er satt sammen med den humane kappa konstant regionen ved homolog rekombinasjon. Bakteriell kolonier er isolert og Plasmid-DNA ekstrahert. cDNA "inserts" er sekvensert i deres helhet. Riktig humanisert tung- og lettkjeder tilsvarende hvert antistoffer co-transfektert inn i COS-celler to forbigående produsere fullengde humanisert anti-human antistoffer. Cellesupernatanter inneholdende rekombinant kimerisk antistoffer renset ved Protein A Sepharose kromatografi og bundet antistoffer eluert ved tilsetning av syre buffer. Antistoffer er nøytralisert og dialysert inn i PBS.
Eksempel 1.2.2.3: Karakterisering av Humaniserte antistoffer
Evnen til renset humaniserte antistoffer til å inhibere en funksjonell aktivitet er bestemt, f.eks., ved å bruke cytokin-bioassayet som beskrevet i Eksempler 1.1.2.A. Bindingsaffinitetene til de humaniserte antistoffene til rekombinant humant antigen er bestemt ved å bruke overflate-plasmonresonans (Biacore®) måling som beskrevet i Eksempel 1.1.l.B. IC50 verdiene fra bioassayene og affiniteten til de humaniserte antistoffene er rangert. De humaniserte mAb'ene som fullt opprettholder aktiviteten til moder hybridoma mAb'ene er selektert som kandidater for senere utvikling. De topp 2-3 mest gunstige humaniserte mAb'ene er viderekarakterisert.
Eksempel 1.2.2.3.A: Farmakokinetikk Analyse av Humaniserte antistoffer
Farmakokinetikk studier er utført i Sprague-Dawley rotter og cynomolgus-apekatter. Hannkjønnede og hunkjønnede rotter og cynomolgus-apekatter er dosert intravenøst eller subkutant med en enkelt dose på 4mg/kg mAb og prøver er analysert ved å bruke antigen fangst-ELISA, og farmakokinetikk parametere er bestemt ved ikke-kompartmental analyse. Kort fortalt, ELISA-plater er belagt med geit anti-biotin antistoff (5 mg/ml, 4°C, over natten), blokkert med Superblock (Pierce), og inkubert med biotinylert human antigen ved 50 ng/ml i 10% Superblock TTBS ved romtemperatur i 2 timer. Serum prøver er serielt fortynnet (0.5% serum, 10% Superblock i TTBS) og inkubert på platen i 30 minutter ved romtemperatur. Deteksjon er utført med HRP-merket geit anti humant antistoff og konsentrasjoner er bestemt med hjelp av standardkurver ved å bruke fire parameter logistisk tilpasning. Verdier for farmakokinetikk-parametrene er bestemt ved ikke-kompartmental modell ved å bruke WinNonlin programvare (Farsight Corporation, Mountain View, CA). Humanisert mAb'er med god farmakokinetikkprofil (Tl/2 er 8-13 dager eller bedre, med lav klaring og utmerket biotilgjengelighet 50-100%) er selektert.
Eksempel 1.2.2.3.B: Fysikokjemiske Og In vitro Stabillitet Analyse av Humanisert Monoklonale Antistoffer
Størrelseseksklusj ons-kromatografi
Antistoffer er fortynnet til 2.5 mg/mL med vann og 20 mL er analysert på et Shimadzu HPLC-system ved å bruke en TSK gel G3000 SWXL kolonne (Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k). Prøver er eluert fra kolonnen med 211 mM natriumsulfat, 92 mM natriumfosfat, pH 7.0, ved en strømningshastighet på 0.3 mL/minutter. HPLC-systemets operasjonsbetingelser er som følger:
Tabell 13 inneholder renhetsdata for moderantistoffer og DVD-Ig-konstruksjoner uttrykt som prosent monomer (uaggregert protein med forventet molekylvekt) som bestemt ved protokollen over.
DVD-Ig'er viste en utmerket SEC-profil med mest DVD-Ig visende >90% monomer. Denne DVD-Ig profilen er lignende de observert for moderantistoffer.
SDS-PAGE
Antistoffer er analysert ved natrium dodekyl sulfat - polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) under både reduserende og ikke-reduserende betingelser. Adalimumab lot AFP04C blir anvendt som en kontroll. For reduserende betingelser, prøvene blir blandet 1:1 med 2X tris glysin SDS-PAGE prøve buffer (Invitrogen, cat# LC2676, lot# 1323208) med 100 mM DTT, og varmet ved 60°C i 30 minutter. For ikke-reduserende betingelser, prøvene blir blandet 1:1 med prøve buffer og varmet ved 100°C i 5 minutter. De reduserte prøvene (10 mg per bane) blir satt på en 12% forstøpt tris-glysin gel (Invitrogen, cat# EC6005boks, lot# 6111021), og de ikke-reduserte prøvene (10 mg per bane) blir satt på en 8%-16% forstøpt tris-glysin gel (Invitrogen, cat# EC6045boks, lot# 6111021). SeeBlue Pluss 2 (Invitrogen, cat#LC5925, lot# 1351542) blir anvendt som en molekylvekt markør. Gelene blir kjørt i en XC ell SureLock mini celle gel boks (Invitrogen, cat# EI0001) og proteinene blir separert ved først å sette på en spenning på 75 for å stable prøvene i gelen, etterfulgt av en konstant spenning på 125 til fargefronten nådde bunnen av gelen. Kjøre-bufferen anvendt er IX tris glysin SDS buffer, fremstilt fra en 10X tris glysin SDS buffer (ABC, MPS-79-080106)). Gelene er flekkfarget over natten med kolloidal blå flekkfarge (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) og avfarget med Milli-Q vann til bakgrunnen er klarert. De flekkfargede gelene blir deretter skannet ved å bruke en Epson Uttrykkings-skanner (modell 1680, S/N DASX003641).
Sedimenteringshastighet Analyse
Antistoffer blir satt inn i prøvekammeret til hver av tre standard to-sektors karbon epon senterstykke. Disse senterstykkene har en 1.2 cm optisk-veilengde og er bygd med safir-vinduer. PBS blir anvendt for en referanse buffer og hvert kammer inneholdt 140 uL. Alle prøver er undersøkt samtidig ved å bruke en 4-hulls (AN-60Ti) rotor i en Beckman ProteomeLab XL-I analytisk ultrasentrifuge (seriell # PL106C01).
Kjøre-betingelser er programmert og sentrifuge-kontroll blir utført ved å bruke ProteomeLab (v5.6). Prøvene og rotor blir latt termisk ekvilibrere en tid før analyse (20.0 ±0.1 °C). Bekreftelse av riktig cellefylling blir utført ved 3000 rpm og et enkelt skann er målt for hver celle. Sedimenteringshastighets-betingelsene er som følger:
Prøve-celle Volum: 420 mL
Referanse-celle Volum: 420 mL
Temperatur: 20°C
Rotorhastighet: 35,000 rpm
Tid: 8:00 timer
UV Bølgelengde: 280 nm
Radiell Trinn Størrelse: 0.003 cm
Datainnsamling: Et datapunkt per trinn uten signalgjennomsnitt.
Totalt antall skann: 100
LC-MS molekylvekt måling av intakte antistoffer
Molekylvekt av intakte antistoffer er analysert ved LC-MS. Hvert antistoff blir fortynnet til omtrent 1 mg/mL med vann. Et 1100 HPLC (Agilent) system med en protein mikrofelle (Michrom Bioresources, Inc, cat# 004/25109/03) blir anvendt for å avsalte og introdusere 5 mg av prøven inn i et API Qstar pulsar i massespektrometer (Applied Biosystems). En kort gradient blir anvendt for å eluere prøvene. Gradienten blir kjørt med mobilfase en (0.08% FA, 0.02% TFA i HPLC vann) og mobilfase B (0.08% FA og 0.02% TFA i acetonitril) ved en strømningshastighet på 50 mL/minutt. Massespektrometeret blir operert ved 4.5 kvolts spray-spenning med et skann-område fra 2000 til 3500 masse til ladningsforhold.
LC-MS molekylvekt måling av antistoff lys og tungkjeder
Molekylvekt måling av antistoff lettkjede (LC), tungkjede (HC) og deglykosylert HC er analysert ved LC-MS. Et antistoff blir fortynnet til 1 mg/mL med vann og prøven er redusert til LC og HC med en sluttkonsentrasjon på 10 mM DTT i 30 minutter ved 37°C. For å deglykosylere antistoffet, 100 mg til antistoffet er inkubert med 2 mL med PNGase F, 5 mL med 10% N-oktylglukosid i et totalvolum på 100 mL over natten ved 37 °C. Etter deglykosylering prøven er redusert med en sluttkonsentrasjon på 10 mM DTT i 30 minutter ved 37°C. Et Agilent 1100 HPLC system med en C4 kolonne (Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069) blir anvendt for å avsalte og introdusere prøven (5 mg) inn i et API Qstar pulsar i massespektrometer (Applied Biosystems). En kort gradient blir anvendt for å eluere prøven. Gradienten blir kjørt med mobilfase en (0.08% FA, 0.02% TFA i HPLC vann) og mobilfase B (0.08% FA og 0.02% TFA i acetonitril) ved en strømningshastighet på 50 mL/minutt. Massespektrometeret blir operert ved 4.5 kvolts spray-spenning med et skann-område fra 800 til 3500 masse til ladningsforhold.
Peptidkartlegging
Antistoffer denaturert i 15 minutter ved romtemperatur med en sluttkonsentrasjon på 6 M guanidin hydroklorid i 75 mM ammoniumbikarbonat. De denaturerte prøvene er redusert med en sluttkonsentrasjon på 10 mM DTT ved 37°C i 60 minutter, etterfulgt av alkylering med 50 mM jodeddiksyre (IAA) i mørket ved 37°C i 30 minutter. Etter alkylering, prøven er dialysert over natten mot fire liter med 10 mM ammoniumbikarbonat ved 4°C. Den dialyserte prøven blir fortynnet til 1 mg/mL med 10 mM ammoniumbikarbonat, pH 7.8 og 100 mg of antistoff er enten fordøyd med trypsin (Promega, cat# V5111) eller Lys-C (Roche, cat# 11 047 825 001) ved en 1:20 (w/w) trypsin/Lys-C:antistoff ratio ved 37°C i 4 hrs. Det fordøyde produktet er "quenchet" med 1 mL med 1 N HC1. For peptidkartlegging med massespektrometer deteksjon, 40 mL med det fordøyde produktet blir separert ved omvendt-fase høytrykks væskekromatografi (RFPLC) på en C18 kolonne (Vydac, cat# 218TP51, S/N NE9606 10.3.5) med et Agilent 1100 HPLC system. Peptid-separasjonen blir kjørt med en gradient ved å bruke mobilfase en (0.02% TFA og 0.08% FA i HPLC-kvalitet vann) og mobilfase B (0.02% TFA og 0.08% FA i acetonitril) ved en strømningshastighet på 50 mL/minutter. API QSTAR Pulsar massespektrometeret blir operert i positivt modus ved 4.5 kvolts spray-spenning og et skann-område fra 800 til 2500 masse til ladningsforhold.
Disulfid Bindingskartlegging
For å denaturere antistoffet, 100 mL til antistoffet er blandet med 300 mL med 8 M guanidin HC1 i 100 mM ammoniumbikarbonat. pH'en er kontrollert for å forsikre at den er mellom 7 og 8 og prøvene er denaturert i 15 minutter ved romtemperatur i en sluttkonsentrasjon på 6 M guanidin HC1. En del av den denaturerte prøven (100 mL) blir fortynnet til 600 mL med Milli-Q vann for å gi en endelig guanidin-HCl konsentrasjon av 1 M. Prøven (220 mg) er fordøyd med enten trypsin
(Promega, eat # V5111, lot# 22265901) eller Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lot# 12808000) ved en 1:50 trypsin eller 1:50 Lys-C: antistoff (w/w) forhold (4.4 mg enzym: 220 mg prøve) ved 37°C i omtrent 16 timer. En ytterligere 5 mg med trypsin eller Lys-C blir tilsatt til prøvene og fordøying er latt fortsette for en ytterligere 2 timer ved 37°C. Fordøyingene blir stoppet ved å tilsette 1 mL med TFA til hver prøve. Fordøyde prøver blir separert ved RFPLC ved å bruke en C18 kolonne (Vydac, cat# 218TP51 S/N NE020630-4-1A) på et Agilent HPLC system. Separasjonen blir kjørt med den samme gradienten anvendt for peptidkartlegging ved å bruke mobilfase en (0.02% TFA og 0.08% FA i HPLC-kvalitet vann) og mobilfase B (0.02% TFA og 0.08% FA i acetonitril) ved en strømningshastighet på 50 mL/minutt. HPLC-operasjonsbetingelsene er de samme som de anvendt for peptidkartlegging. API QSTAR Pulsar massespektrometeret blir operert i positivt modus ved 4.5 kvolts spray-spenning og et skann-område fra 800 til 2500 masse til ladningsforhold. Disulfid-bindinger blir tilordnet ved å matche de observerte MW ene til peptider med de forutsagte MW ene til tryptisk eller Lys-C peptider knyttet sammen ved disulfid-bindinger.
Fri sulfhydryl bestemmelse
Metoden anvendt for å kvantifisere frie cysteiner i et antistoffer basert på reaksjonen til Ellmans reagens, 5,50- ditio-bis (2-nitrobenzosyre) (DTNB), med sulfhydryl grupper (SH) som gir opphav til et karakteristisk kromofort produkt, 5-tio-(2-nitrobenzosyre) (TNB). Reaksjonen er illustrert i formelen:
Absorbansen til TNB- er målt ved 412 nm ved å bruke et Cary 50 spectrofotometer. En absorbanskurve er plottet ved å bruke fortynninger av 2 mercaptoetanol (b-ME) som den frie SH-standarden og konsentrasjonene av de frie sulfhydryl-gruppene i proteinet er bestemt fra absorbans ved 412 nm av prøven.
B-ME-standardløsningen er fremstilt ved en seriell fortynning av 14.2 M b-ME med HPLC-kvalitet vann til en sluttkonsentrasjon på 0.142 mM. Deretter standarder i triplikat for hver konsentrasjon er fremstilt. Antistoff blir konsentrert til 10 mg/mL ved å bruke et amicon ultra 10,000 MWCO sentrifuge-filter (Millipore, cat# UFC801096, lot# L3KN5251) og bufferen er forandret til formuleringsbufferen anvendt for adalimumab (5.57 mM natriumfosfat monobasisk, 8.69 mM natriumfosfat dibasisk, 106.69 mM NaCl, 1.07 mM natrium sitrat, 6.45 mM sitronsyre, 66.68 mM mannitol, pH 5.2, 0.1% (w/v) Tween). Prøvene blir blandet på en ristemaskin ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter 180 mL med 100 mM Tris buffer, pH 8.1 blir tilsatt til hver prøve og standard etterfulgt av tilsetningen av 300 mL med 2 mM DTNB i 10 mM fosfatbuffer, pH 8.1. Etter grundig blanding, prøvene og standarder er målt for absorpsjon ved 412 nm på et Cary 50 spectrofotometer. Standardkurven blir oppnådd ved å plotte mengden av fri SH og OD412nm til b-ME standardene. Fri SH-innhold av prøver er beregnet basert på denne kurven etter subtraksjon av blinprøven.
Svak Kationeutbyttingskromatografi
Antistoff blir fortynnet til 1 mg/mL med 10 mM natriumfosfat, pH 6.0. Ladningsheterogenitet er analysert ved å bruke et Shimadzu HPLC-system med en WCX-10 ProPac analytisk kolonne (Dionex, cat# 054993, S/N 02722). Prøvene blir satt på kolonnen i 80% mobilfase en (10 mM natriumfosfat, pH 6.0) og 20% mobilfase B (10 mM natriumfosfat, 500 mM NaCl, pH 6.0) og eluert ved en strømningshastighet på 1.0 mL/minutt.
Oligosakkarid-profilering
Oligosakkarider frigjort etter PNGase F behandling av antistoffer derivatisert med 2-aminobenzamid (2-AB) merking reagens. De fluorescent-merkede oligosakkaridene blir separert ved normal fase høy-hastighetsvæskekromatografi (NFPLC) og de forskjellige former av oligosakkarider erkarakterisertbasert på retensjonstid sammenligning med kjente standarder.
Antistoffet er først fordøyd med PNGaseF for å spalte N-linkede oligosakkarider fra Fc-porsjonen av tungkjedet. Antistoffet (200 mg) er plassert i et 500 mL Eppendorf-rør sammen med 2 mL PNGase F og 3 mL med 10% N-oktylglukosid. Fosfatbufret saltløsning blir tilsatt for å bringe det endelige volumet til 60 mL. Prøven er inkubert over natten ved 37°C i en Eppendorf termoblander satt til 700 RPM. Adalimumab lot AFP04C er også fordøyd med PNGase F som en kontroll.
Etter PNGase F behandling, prøvene blir inkubert ved 95 °C i 5 minutter i en Eppendorf termoblander satt til 750 RPM for å felle ut proteinene, deretter prøvene er plassert i en Eppendorf sentrifuge i 2 minutter ved 10,000 RPM for å spinne ned de utfelte proteinene. Supernatanten inneholdende oligosakkaridene blir overført til et 500 mL Eppendorf-rør og tørket i en speed-vac ved 65°C.
Oligosakkaridene er merket med 2AB ved å bruke et 2AB merkings-kit kjøpt fra Prozyme (cat# GKK-404, lot# 132026). Merkingsreagenset er fremstilt ifølge produsentens instruksjoner. Eddiksyre (150 mL, tilveiebrakt i kit) blir tilsatt til DMSO-ampullen (tilveiebrakt i kit) og blandet ved å pipettere løsningen opp og ned flere ganger. Eddiksyre/DMSO blandingen (100 mL) er overført til en ampulle med 2-AB fargestoff (rett før anvendelse) og blandet til fargestoffet er helt oppløst. Fargestoff-løsningen blir så tilsatt til en ampulle med reduktanter (tilveiebrakt i kit) og blandet godt (merking reagens). Merkingsreagenset (5 mL) blir tilsatt til hver tørket oligosakkarid prøve ampulle, og blandet grundig. Reaksjonsampullene er plassert i en Eppendorf termoblander satt til 65 °C og 700-800 RPM i 2 timer med reaksjon.
Etter merkings-reaksjonen, overskuddet fluorescent fargestoff blir fjernet ved å bruke GlycoClean S Kassetter fra Prozyme (cat# GKI-4726). Før tilsetting av prøvene, kassettene blir vasket med 1 mL med milli-Q vann fulgt av 5 vaskinger med 1 mL 30% eddiksyre løsning. Rett før tilsetting av prøvene, 1 mL med acetonitril (Burdick og Jackson, cat# AH015-4) blir tilsatt til kassettene.
Etter at all acetonitrilen har passert gjennom kassetten, prøven er satt på i sentrum av den nylig vaskede platen og latt absorbere på platen i 10 minutter. Platen blir vasket med 1 mL med acetonitril etterfulgt av fem vaskinger med 1 mL med 96% acetonitril. Kassettene er plassert over en 1.5 mL Eppendorf rør og de 2-AB merkede oligosakkaridene er eluert med 3 vaskinger (400 mL hver vasking) med milli Q vann.
Oligosakkaridene blir separert ved å bruke en Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) kolonne koblet til et Shimadzu HPLC-system. Shimadzu HPLC-systemet besto av en system kontroller, degasser, binære pumper, autosampler med en prøvekjøler, og en fluorescens detektor.
Stabillitet ved forhøyet temperaturer
Bufferen med antistoffer enten 5.57 mM natriumfosfat monobasisk, 8.69 mM natriumfosfat dibasisk, 106.69 mM NaCl, 1.07 mM natrium sitrat, 6.45 mM sitronsyre, 66.68 mM mannitol, 0.1%
(w/v) Tween, pH 5.2; eller 10 mM histidin, 10 mM metionine, 4% mannitol, pH 5.9 ved å bruke Amicon ultra sentrifugal-filtere. Sluttkonsentrasjonen av antistoffene er justert til 2 mg/mL med de passende buffere. Antistoffløsningener blir deretter filter-sterilisert og 0.25 mL porsjoner er fremstilt under sterile betingelser. Porsjonene blir latt stå ved enten -80°C, 5°C, 25°C, eller 40°C i 1, 2 eller 3 uker. På slutten av inkuberingsperioden, prøvene er analysert ved størrelseseksklusjons-kromatografi og SDS-PAGE.
Stabilitetsprøvene er analysert ved SDS-PAGE under både reduserende og ikke-reduserende betingelser. Prosedyren anvendt er den samme som beskrevet heri. Gelene er flekkfarget over natten med kolloidal blå flekkfarge (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) og avfarget med Milli-Q vann til bakgrunnen er klarert. De flekkfargede gelene blir deretter skannet ved å bruke en Epson Uttrykkings-skanner (modell 1680, S/N DASX003641). For å oppnå mer sensitivitet, de samme geler er sølv-flekkfarget ved å bruke sølv-flekkfarging kit (Owl Scientific) og de anbefalte prosedyrene gitt ved produsenten blir anvendt.
Eksempel 1.2.2.3.C: Effekt av Et humanisert Monoklonalt Antistoff Alene Eller I Kombinasjon Med Kjemoterapi På Veksten av Humane Karsinom Xenografter
Humane kreftceller er dyrket in vitro til 99% viabillitet, 85% konfluens i vevsdyrkingsflasker. SCID hunkjønn eller hankjønn mus (Charles Rivers Labs) ved 19-25 gram, er øremerket og barbert. Mus blir deretter inokulert subkutant inn i høyre flanke med 0.2 ml of 2 x IO6 humane tumorceller (1:1 matrigel) på studiedag 0. Administrasjon (IP, Q3D/ uke) av vehikel (PBS), humanisert antistoff, og/eller kjemoterapi er initiert etter at mus er størrelse-matchet inn i separate bur av mus med gjennomsnittlige tumorvolumer på omtrent 150 til 200 mm<3>. Tumorene er målt ved et par med pinsetter to ganger hver uke startende på omtrent dag 10 etter inokulering og tumor-volumene beregnet ifølge formelen V = L x W<2>/2 (V: volum, mm<3>; L: lengde, mm; W: bredde, mm). Reduksjon i tumorvolum er sett i dyr behandlet med mAb alene eller i kombinasjon med kjemoterapi i forhold til tumorer i dyr som mottok bare vehikel eller en isotype kontroll mAb.
Eksempel 1.2.2.3.D: FACS Basert Redirigert Cytotoksisitet ( rCTL) Assay
Humane CD3+ T-celler ble isolert fra tidligere fryst isolert perifert blod mononukleære celler (PBMC) med en negativ-seleksjon berikende kolonne (R&D Systems, Minneapolis, MN; Cat.#HTCC-525). T-celler ble stimulerte i 4 dager i kolber (vent cap, Corning, Acton, MA) belagt med 10jjg/mL anti-CD3 (OKT-3, eBioscience, Inc., San Diego, CA) og 2ug/mL anti-CD28 (CD28.2, eBioscience, Inc., San Diego, CA) i D-PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) og dyrket i 30U/mL IL-2 (Roche) i komplett RPMI 1640 media (Invitrogen, Carlsbad, CA) med L-glutamin, 55mM P-ME, Pen/Strep, 10% FBS). T-celler ble deretter hvilt over natten i 30U/mL IL-2 før ved å bruke i assay. DoHH2 eller Raji mål-celler ble merket med PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ifølge produsentens instruksjoner. RPMI 1640 media (uten fenol, Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende L-glutamin og 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) ble anvendt gjennom hele rCTL-assayet. (Se Dreier et al. (2002) Int J Cancer 100:690).
Effektor T-celler (E) og mål (T) ble platet ved en endelig celle-konsentrasjon på 10<5>og IO<4>celler/brønn i 96-brønn plater (Costar #3799, Acton, MA), henholdsvis for å gi et E:T forhold på 10:1. DVD-Ig-molekyler ble fortynnet for å oppnå konsentrasjon-avhengig titreringskurver. Etter inkubering over natten blir cellene pelletert og vasket med D-PBS en gang før resuspensjon i FACS buffer inneholdende 0.1% BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1% natriumazid og 0.5ug/mL propidium jodid (BD) i D-PBS. FACS data ble samlet på en FACS Canto II maskin (Becton Dickinson, San Jose, CA) og analysert i Flowjo (Treestar). Prosenten av mål i live i DVD-Ig'et behandlede prøver delt på prosenten av totale mål (kontroll, ingen behandling) ble beregnet for å bestemme prosent spesifikk lysering. IC50s ble beregnet i Prism (Grafpad).
Et CD3 / CD20 DVD-Ig ble utprøvd for redirigert toksisitet og viste in vitro tumor-dreping med en IC50 = 325pM. Sekvensen av dette CD3 / CD20 DVD-Ig ble fremvist i US Patent Søknad Serienr. 20070071675.
Eksempel 1.4: Generering av et DVD- Ig
DVD-Ig-molekyler i stand til å binde to antigener er konstruert ved å bruke to monoklonale moderantistoffer, en mot human antigen A, og det andre mot human antigen B, valgt som beskrevet heri.
Eksempel 1.4.1: Generering av et DVD- Ig Som har To Linker- lengder
En konstant region inneholdende ni Fc med mutasjoner ved 234, og 235 for å eliminere ADCC/CDC effektorfunksjoner blir anvendt. Fire forskjellig anti-A/B DVD-Ig-konstruksjoner er fremstilt: 2 med kort linker og 2 med lang linker, hver i to forskjellige domene orienteringer: Va-Vb-C og Vb-Va-C (se Tabell 14). Linker-sekvensene, avledet fra den N-terminale sekvensen til humant Cl/Ck eller CH1 domene, er som følger:
For DVD AB konstruksjoner:
lettkjede (hvis anti-A har X):Kort linker: QPKAAP (SEKV ID NR: 15); Lang linker:
QPKAAPSVTLFPP (SEKV ID NR: 16)
lettkjede (hvis anti-A har ic):Kort linker: TVAAP (SEKV ID NR: 13); Lang linker:
TVAAPSVFIFPP (SEKV ID NR: 14)
tungkjede (yl): Kort linker: ASTKGP (SEKV ID NR: 21); Lang linker: ASTKGPSVFPLAP
(SEKV ID NR: 22)
For DVDBA konstruksjoner:
lettkjede (hvis anti-B har X):Kort linker: QPKAAP (SEKV ID NR: 15); Lang linker:
QPKAAPSVTLFPP (SEKV ID NR: 16)
lettkjede (hvis anti-B har k):Kort linker: TVAAP (SEKV ID NR: 13); Lang linker:
TVAAPSVFIFPP (SEKV ID NR: 14)
tungkjede (yl): Kort linker: ASTKGP (SEKV ID NR: 21); Lang linker: ASTKGPSVFPLAP
(SEKV ID NR: 22)
Tung og lettkjede konstruksjoner er sub-klonet inn i pBOS-uttrykkingsvektoren, og uttrykt i COS-celler, etterfulgt av rensing ved Protein A kromatografi. de rensede materialene er utsatt for SDS-PAGE og SEC analyse.
Tabell 14 beskriver tungkjedet og lettkjede konstruksjoner anvendt for å uttrykke hvert anti-A/B DVD-Ig protein.
Eksempel 1.4.2: Molekylær kloning av DNA konstruksjoner for DVDABSL og DVDABLL
For å generere tungkjede konstruksjoner DVDABHC-LL og DVDABHC-SL, VH domene av et antistoffer PCR amplifisert ved å bruke spesifikke primere (3' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis); mens VH domene til B antistoffer amplifisert ved å bruke spesifikke primere (5' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis). Begge PCR-reaksjonene blir utført ifølge standard PCR teknikker og prosedyrer. De to PCR produktene er gel-renset, og anvendt sammen som overlappende templat for den etterfølgende overlappende PCR-reaksjonen. De overlappende PCR-produktene er sub-klonet inn i Srf I og Sal I dobbelt-fordøyd pBOS-hCyl,z ikke-mammalsk uttykkingsvektor (Abbott) ved å bruke standard homolog rekombinasjon fremgangsmåte.
For å generere lettkjede konstruksjoner DVDABLC-LL og DVDABLC-SL, VL domene av et antistoff er PCR amplifisert ved å bruke spesifikke primere (3' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis); mens VL domene of B antistoff er amplifisert ved å bruke spesifikke primere (5' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis). Begge PCR-reaksjonene blir utført ifølge standard PCR teknikker og prosedyrer. De to PCR produktene er gel-renset, og anvendt sammen som overlappende templat for den etterfølgende overlappende PCR-reaksjonen ved å bruke standard PCR tilstander. De overlappende PCR-produktene er sub-klonet inn i Srf I og Ikke I dobbelt-fordøyd pBOS-hCk mammaliske uttrykking vektor (Abbott) ved å bruke standard homolog rekombinasjon fremgangsmåte. Lignende tilnærming har blitt anvendt for å generere DVDBASL og DVDBALL som beskrevet nedenfor:
Eksempel 1.4.3: Molekylær kloning av DNA konstruksjoner for DVDBASL og DVDBALL
For å generere tungkjede konstruksjoner DVDBAHC-LL og DVDBAHC-SL, VH domenet til antistoff B er PCR amplifisert ved å bruke spesifikke primere (3' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis); mens VH domenet til antistoff A er amplifisert ved å bruke spesifikke primere (5' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis). Begge PCR-reaksjonene blir utført ifølge standard PCR teknikker og prosedyrer. De to PCR produktene er gel-renset, og anvendt sammen som overlappende templat for den etterfølgende overlappende PCR-reaksjonen ved å bruke standard PCR tilstander. De overlappende PCR-produktene er sub-klonet inn i Srf I og Sal I dobbelt-fordøyd pBOS-hCyl,z ikke-mammalsk uttykkingsvektor (Abbott) ved å bruke standard homolog rekombinasjon fremgangsmåte.
For å generere lettkjede konstruksjoner DVDBALC-LL og DVDBALC-SL, VL domenet til antistoff B er PCR amplifisert ved å bruke spesifikke primere (3' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis); mens VL domenet til antistoff A er amplifisert ved å bruke spesifikke primere (5' primere inneholder kort/lang liner-sekvens for SL/LL konstruksjoner, henholdsvis). Begge PCR-reaksjonene blir utført ifølge standard PCR teknikker og prosedyrer. De to PCR produktene er gel-renset, og anvendt sammen som overlappende templat for den etterfølgende overlappende PCR-reaksjonen ved å bruke standard PCR tilstander. De overlappende PCR-produktene er sub-klonet inn i Srf I og Ikke I dobbelt-fordøyd pBOS-hCk mammaliske uttrykking vektor (Abbott) ved å bruke standard homolog rekombinasjon fremgangsmåte.
Eksempel 1.4.4: Konstruksjon og Uttrykking av Ytterligere DVD- Ig
Eksempel 1.4.4.1: Fremstilling av DVD- Ig vektor konstruksjoner
Moderantistoff aminosyresekvenser for spesifikke antistoffer, som kjenner igjen spesifikke antigener eller epitoper derav, for inkorporering i et DVD-Ig kan bli oppnådd ved fremstilling av hybridomas som beskrevet over eller kan bli oppnådd ved å sekvensere kjente antistoff-proteiner eller nukleinsyrer. I tillegg kan kjente sekvenser bli oppnådd fra litteraturen. Sekvensene kan bli anvendt for å syntetisere nukleinsyrer ved å bruke standard DNA syntese eller amplikasjonsteknologier og å sette sammen de ønskede antistoff-fragmentene inn i uttrykkingsvektorer, ved å bruke standard rekombinant DNA teknologi, for uttrykking i celler.
For eksempel, nukleinsyre kodoner ble bestemt fra aminosyre-sekvenser og oligonukleotid DNA ble syntetisert ved Blue Heron Biotechnology, Inc. rwww. blueheronbio. com") Bothell, WA USA. Oligonukleotidene ble satt sammen inn i 300-2,000 base par dobbelttrådede DNA-fragmenter, klonet inn i en plasmid-vektor og sekvens-verifisert. Klonede fragmenter ble satt sammen ved å bruke en enzymatisk prosess for å gi det komplette genet og sub-klonet inn i en uttrykkingsvektor. (Se 7,306,914; 7,297,541; 7,279,159; 7,150,969; 20080115243; 20080102475; 20080081379; 20080075690; 20080063780; 20080050506; 20080038777; 20080022422; 20070289033; 20070287170; 20070254338; 20070243194; 20070225227; 20070207171; 20070150976; 20070135620; 20070128190; 20070104722; 20070092484;20070037196; 20070028321; 20060172404; 20060162026; 20060153791;20030215458;20030157643).
En gruppe av fybE vektorer (US Patent Søknad Serienr. 61/021,282) ble anvendt for moderantistoff og DVD-Ig kloning. VI, avledet fra pJP183; fybE-hCgl,z,non-a V2, ble anvendt for kloning av antistoff og DVD tungkjeder med en vill-type konstant region. V2, avledet fra pJP191; fybE-hCk V2, ble anvendt for kloning av antistoff og DVD lettkjeder med en kappa konstant region. V3, avledet fra pJP192; fybE-hCl V2, ble anvendt for kloning av antistoff og DVD'er lettkjeder med en lambda konstant region. V4, bygd med et lambda signal peptid og en kappa konstant region, ble anvendt for kloning av DVD lettkjeder med en lambda-kappa hybrid V domene. V5, bygd med et kappa signal peptid og en lambda konstant region, ble anvendt for kloning av DVD lettkjeder med en kappa-lambda hybrid V domene. V7, avledet fra pJP183; fybE-hCgl,z,non-a V2, ble anvendt for kloning av antistoff og DVD tungkjeder med en (234,235 AA) mutant konstant region.
Med referanse til Tabell 15, en rekke vektorer ble anvendt i kloningen av moder-antistoffene og DVD-Ig VH og VL kjeder .
Eksempel 1.4.4.2: Transfeksjon Og Uttrykking I 293 Celler
DVD-Ig-vektorkonstruksjonene er transfektert inn i 293-celler for produksjon av DVD-Ig protein. 293 transient transfeksjonsprosedyren anvendt er en modifikasjon av metodene publisert i Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2):E9 og Fam et al. (2005) Biotech. Bioengineering 90(3):332-44. Reagenser som ble anvendt i transfeksjonen inkludert: • HEK 293-6E celler (human embryonisk nyre-cellelinje som stabilt uttrykker EBNA1; oppnådd fra Nastional Research Council Canada) dyrket i engangs Erlenmeyer kolber i en fuktet inkubator satt ved 130 rpm, 37°C og 5% C02. • Vekstmedium: FreeStyle 293 Uttrykkingsmedium (Invitrogen 12338-018) pluss 25 ug/mL Geneticin (G418) (Invitrogen 10131-027) og 0.1% Pluronic F-68 (Invitrogen 24040-032). • Transfeksjonsmedium: FreeStyle 293 Uttrykkingsmedium pluss 10 mM HEPES (Invitrogen 15630-080). • Polyetylenimine (PEI) standardløsning: 1 mg/mL steril standardløsning, pH 7.0, fremstilt med lineær 25kDa PEI (Polysciences) og lagret ved mindre enn -15°C.
Tryptone Næringsmedium: 5% w/v steril standardløsning av Tryptone NI (Organotechnie,
19554) i FreeStyle 293 Uttrykkingsmedium.
Celle- preparat for transfeksjon: Omtrent 2-4 timer før transfeksjon, HEK 293-6E celler er høstet ved sentrifugering og resuspendert i vekstmedium ved en celle tetthet på omtrent 1 million levedyktige celler per mL. For hver transfeksjon, 40 mL med celle-suspensjonen er overført til en engangs 250-mL Erlenmeyer kolbe og inkubert i 2 - 4 timer.
Transfeksjon: Transfeksjonsmediumet og PEI standardløsning er forvarmet til romtemperatur (RT). For hver transfeksjon, 25 ug med Plasmid-DNA og 50ug med polyetylenimine (PEI) er kombinert i 5 mL med transfeksjonsmedium og inkubert i 15 - 20 minutter ved RT for å tillate DNA'et:PEI komplekser å bli dannet. For BR3-Ig transfeksjonene, 25ug med BR3-Ig plasmid blir anvendt per transfeksjon. Hver 5-mL DNA:PEI kompleks blanding blir tilsatt til en 40-mL dyrking fremstilt tidligere og returnert til den fuktede inkubatoren satt ved 130 rpm, 37°C og 5% C02. Etter 20-28 timer, 5 mL med Tryptone Næringsmedium blir tilsatt til hver transfeksjon og dyrkingene blir fortsatt i seks dager.
Tabell 16 inneholder utbyttedata for moderantistoffer eller DVD-Ig-konstruksjoner uttrykt som milligram per liter i 293 celler.
Alle DVD'er uttrykt godt i 293 celler. DVD'er kunne lett bli renset over en protein A kolonne. I de fleste tilfeller >5 mg/L renset DVD-Ig kunne lett bli oppnådd fra supernatanter av 293 celler.
Eksempel 1.4.5: Karakterisering og Kandidat- seleksion av A/ B DVD- Ig' er
Bindingsaffinitetene til anti-A/B DVD-Ig'er er analysert på Biacore mot både protein A og protein B. De tetravalente egenskapene til DVD-Ig'et er undersøkt ved multippel-bindende studier på Biacore. Mens, nøytraliseringsstyrken til DVD-Ig'ene for protein A og protein B blir vurdert ved bioassayer, henholdsvis, som beskrevet heri. DVD-Ig-molekylene som best beholder affiniteten og styrken til de opprinnelige moder-mAb'ene er selektert for grundige fysikokjemiske og bio-analytisk
(rotte PK) karakteriseringer som beskrevet heri for hver mAb. Basert på samlingen av analyser, det endelige kandidat-DVD-Ig'et er kjørt videre inn i CHO stabil cellelinje utvikling, og det CHO-avledete materialet blir anvendt i stabillitet, farmakokinetikk og effekt studier i cynomolgus-apekatter, og preformuleringsaktiviteter.
Eksempel 2: Generering og Karakterisering av Immunoglobuliner med to variable domener iDVTMgl
Immunoglobuliner med to variable domener (DVD-Ig) ble fremstilt ved å bruke moderantistoffer med kjente aminosyresekvenser ved å syntetisere polynukleotid fragmenter som koder for DVD-Ig variable tung og DVD-Ig variable lettkjede sekvenser og å klone fragmentene inn i en fybC-D2 vektor ifølge Eksempel 1.4.4.1. DVD-Ig-konstruksjonene ble klonet inn i og uttrykt i 293-celler som beskrevet i Eksempel 1,4.4.2. DVD-Ig-proteinet ble renset ifølge standardmetoder. Funksjons-karakteristikker ble bestemt ifølge metodene beskrevet i Eksempel 1.1.1 og 1.1.2 som indikert. DVD-Ig VH og VL kjeder for DVD-Ig'ene ifølge oppfinnelsen er tilveiebrakt nedenfor.
Eksempel 2.1: Generering av Abeta ( sekv. 1) og Abeta ( sekv. 3) DVD- Ig' er
Eksempel 2.2: Generering av TNF og Abeta f sekv. 2) DVD- Ig' er
Eksempel 2.3: Generering av IL- 1 beta og Abeta ( sekv. 2) DVD- Ig* er
Eksempel 2.4: Generering av Abeta ( sekv. 1) og Abeta ( sekv. 2) DVD- Ig' er
Eksempel 2.5: Generering av IGF 1, 2 og Abeta f sekv. 2) DVD- Ig^ r
Eksempel 2.6: Generering av Abeta f sekv. 2) og IL- 18 DVD- Ig* er
Eksempel 2.7: Generering av IL- 6 og Abeta ( sekv. 2) DVD- Ig' er
Eksempel 2.8: Generering av TNF og Abeta f sekv . 3) DVD- Ig' er
Eksempel 2.9: Generering av IL- 1 beta og Abeta ( sekv. 3) DVD- Ig* er
Eksempel 2.10: Generering av Abeta f sekv. 1) og Abeta f sekv. 3) DVD- Ig' er
Eksempel 2.11: Generering av IGF1, 2 og Abeta ( sekv. 3) DVD- Ig* er
Eksempel 2.12: Generering av Abeta ( sekv. 3) og IL- 18 DVD- Ig^ r
Eksempel 2.13: Generering av IL- 6 og Abeta ( sekv. 3) DVD- Ig* er
Eksempel 2.14: Generering av TNF og Abeta f sekv. 1) DVD- Ig* er
Eksempel 2.15: Generering av IL- lbeta og Abeta ( sekv. 1) DVD- Ig' er
Eksempel 2.16: Generering av IGF1, 2 og Abeta ( sekv. 1) DVD- Ig* er
Eksempel 2.17: Generering av Abeta ( sekv. 1) og IL- 18 DVD- Ig^ r
Eksempel 2.18: Generering av IL- 6 og Abeta ( sekv. 1) DVD- Ig* er
Eksempel 2.19: Generering av Abeta ( sekv. 1) og RAGE DVD- Ig' er
Eksempel 2.20: Generering av NGF og IL- 18 DVD- Ig^ r
Eksempel 2.21: Generering av NGF og IL- 1 beten DVD- Ig' er
Eksempel 2.22: Generering av NGF og IL- 6 DVD- Ig' er
Eksempel 2.23: Generering av TNF og EGFR ( sekv. 2) DVD- Ig* er
Eksempel 2.24: Generering av TNF og RAGE DVD- Ig* er
Eksempel 2.25: Generering av CD- 20 og EGFR ( sekv. 1) DVD- Ig* er
Eksempel 2.26: Generering av CD- 20 og EGFR ( sekv. 2) DVD- Ig* er
Eksempel 2.27: Generering av RGMA og TNF DVD- Ig' er
Eksempel 2.28: Kloningsvektor- sekvenser Anvendt for å Klone Moderantistoff og DVD- Ig Sekvenser
Den foreliggende oppfinnelsen inkorporerer ved referanse i deres helhet teknikker velkjent i området for molekylærbiologi og legemiddellevering. Disse teknikker inkluderer, men er ikke begrenset til, teknikker beskrevet i de følgende publikasjoner: Ausubel et al. (eds.), Current Protocolls In Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocolls In Molecular Biology (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X).
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen og Ball (eds.), Wiley, Ny York (1984);
Giege, R. og Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oksford University Press, Ny York, Ny York, (1999);
Goodson, i Medical Application of Contolled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984);
Hammerling, et al., i: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);
Kabat-et al., Sequences of proteins of immunological interest (National Institutes of Health, Betesda, Md. (1987) og (1991);
Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikasjonsnr. 91-3242;
Kontermann og Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Ny York. 790 pp. (ISBN 3-54041354-5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);
Lu og Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analyzes (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X).
Medical Application of Contolled Release, Langer og Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla.
(1974);
Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An introduction to Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studier i Mikrobiologi; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-013184).
Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Ny York, 1978
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (oversatt av Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).
Inkorporering ved referanse
Innholdet av alle siterte referanser (inkludert litteraturreferanser, patenter, patent søknader, og nettsteder) som kan være sitert gjennom hele denne søknaden er herved uttrykkelig inkorporert ved referanse i deres helhet, det er også referansene sitert deri. Praksisen ifølge den foreliggende oppfinnelsen vil anvende, medmindre ellers indikert, konvensjonelle teknikker i immunologi, molekylærbiologi og cellebiologi, som er velkjent i teknikken.
Ekvivalenter
Oppfinnelsen kan bli utført i andre spesifikke former uten å gå bort fra ånden eller essensielle karakteristikker derav. De forutgående utførelsesformene skal derfor bli vurdert i alle hensyn som illustrative heller enn begrensende av oppfinnelsen beskrevet heri. Omfanget av oppfinnelsen er følgelig indikert ved de vedlagte krav heller enn ved den forutgående beskrivelsen, og alle forandringer som kommer innenfor betydningen og ekvivalensområdet til kravene er derfor ment å være omfattet heri.

Claims (76)

1. Et bindende protein omfattende et polypeptidkjede, hvori nevnte polypeptidkjede omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VD1 er et første tungkjede variabelt domene; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene; C er et tungkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 er en Fc-region; og n er 0 eller 1; hvori det bindende proteinet er i stand til å binde et par med antigener valgt fra gruppen bestående av Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 2); IL-ip og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv.
1) og Abeta (sekv. 2); IGF1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF-a og Abeta (sekv.3); IL-ip og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 1); IL-ip og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-ip; NGF og IL-6; TNF-a og EGFR (sekv. 2); TNF-a og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv. 2); RGMA og TNF-a.
2. Det bindende proteinet ifølge krav 1, hvori VD1 og VD2 omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, og 56.
3. Et bindende protein omfattende et polypeptidkjede, hvori nevnte polypeptidkjede omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VD1 er et første lett tungkjede variabelt domene; VD2 er et andre lett tungkjede variabelt domene; C er et lettkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 ikke omfatter en Fc-region; og n er 0 eller 1; hvori det bindende proteinet er i stand til å binde et par med antigener valgt fra gruppen bestående av Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 2); IL-ip og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv.
1) og Abeta (sekv. 2); IGF1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF-a og Abeta (sekv.3); IL-ip og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 1); IL-ip og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-ip; NGF og IL-6; TNF-a og EGFR (sekv. 2); TNF-a og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv. 2); RGMA og TNF-a.
4. Det bindende proteinet ifølge krav 3, hvori VD1 og VD2 lettkjede variable domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 29, 31, 33, 35, 37, 39,41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, og 57.
5. Det bindende proteinet ifølge krav 1 eller 3, hvori n er 0.
6. Et bindende protein omfattende første og andre polypeptidkjeder, hvori nevnte første polypeptidkjede omfatter en første VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første tungkjede variabelt domene; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene; C er et tungkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; og X2 er en Fc-region; og hvori nevnte andre polypeptidkjede omfatter en andre VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VD1 er et første lettkjede variabelt domene; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene; C er et lettkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 ikke omfatter en Fc-region; og n er 0 eller 1, hvori det bindende proteinet er i stand til å binde et par med antigener valgt fra gruppen bestående av Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 2); IL-ip og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2); IGF1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF-a og Abeta (sekv.3); IL-ip og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 1); IL-ip og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-ip; NGF og IL-6; TNF-a og EGFR (sekv. 2); TNF-a og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv. 2); RGMA og TNF-a.
7. Det bindende proteinet ifølge krav 6, hvori VD1 og VD2 tungkjede variabelt domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46,48, 50, 52, 54, og 56 og hvori VDl og VD2 lettkjede variable domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, og 57.
8. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, eller 6, hvori XI eller X2 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR 1-26.
9. Det bindende proteinet ifølge krav 6, hvori det bindende proteinet omfatter to første polypeptidkjeder og to andre polypeptidkjeder.
10. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, eller 6, hvori Fc-regionen er valgt fra gruppen bestående av opprinnelig sekvens Fc-region og en variant sekvens Fc-region.
11. Det bindende proteinet ifølge krav 10, hvori Fc-regionen er valgt fra gruppen bestående av en Fc-region fra en IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, og IgD.
12. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, eller 6, hvori nevnte VDl til det første polypeptidkjedet og nevnte VDl til det andre polypeptidkjedet er oppnådd henholdsvis fra det samme første og andre moderantistoffet, eller antigen-bindende porsjon derav.
13. Det bindende proteinet ifølge krav 1,3, eller 6, hvori nevnte VDl til det første polypeptidkjedet og nevnte VDl til det andre polypeptidkjedet er oppnådd henholdsvis fra et forskjellig første og andre moderantistoff, eller antigen-bindende porsjon derav.
14. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, eller 6, hvori nevnte VD2 til det første polypeptidkjedet og nevnte VD2 til det andre polypeptidkjedet er oppnådd henholdsvis fra det samme første og andre moderantistoffet, eller antigen-bindende porsjon derav.
15. Det bindende proteinet ifølge krav 1,3, eller 6, hvori nevnte VD2 til det første polypeptidkjedet og nevnte VD2 til det andre polypeptidkjedet er oppnådd henholdsvis fra forskjellig første og andre moderantistoff, eller antigen-bindende porsjon derav.
16. Det bindende proteinet ifølge ethvert av kravene 13-15, hvori nevnte første og nevnte andre moder-antistoffer binder forskjellige epitoper på nevnte antigen.
17. Det bindende proteinet ifølge ethvert av kravene 13-15, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte første antigen med en styrke forskjellig fra styrken som nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte andre antigen.
18. Det bindende proteinet ifølge ethvert av kravene 13-15, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte første antigen med en affinitet forskjellig fra affiniteten som nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte andre antigen.
19. Det bindende proteinet ifølge ethvert av kravene 13-15, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, og nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, er valgt fra gruppen bestående av et humant antistoff, et CDR-podet antistoff, og et humanisert antistoff.
20. Det bindende proteinet ifølge ethvert av kravene 13-15, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, og nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, er valgt fra gruppen bestående av et Fab-fragment; et F(ab')2fragment; et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter knyttet sammen ved en disulfid-bro ved hengsel-regionen; et Fd-fragment bestående av VH- og CH1-domenene; et Fv-fragment bestående av VL- og VH-domenene fra en enkelt arm til et antistoff; et dAb-fragment; en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR); et enkelt-kjede antistoff; og en "diabody".
21. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, eller 6, hvori nevnte bindende protein innehar minst en ønsket egenskap fremvist av nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, eller nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav.
22. Det bindende proteinet ifølge krav 22, hvori nevnte ønsket egenskap er valgt fra en eller flere antistoff-parametre.
23. Det bindende proteinet ifølge krav 21, hvori nevnte antistoff-parametre er valgt fra gruppen bestående av antigen spesifisitet, affinitet ovenfor antigen, styrke, biologisk funksjon, epitop-gjenkjenning, stabillitet, løselighet, produksjonseffektivitet, immunogenitet, farmakokinetikk, biotilgjengelighet, kryssreaktivitet for vev, og ortolog antigen-binding.
24. Et bindende protein i stand til å binde to antigener omfattende fire polypeptidkjeder, hvori to polypeptidkjeder omfatter VDl-(XI)n-VD2-C-(X2)n, hvori VDl er et første tungkjede variabelt domene; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene; C er et tungkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; og X2 er en Fc-region; og hvori to polypeptidkjeder omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VDl er et første lettkjede variabelt domene; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene; C er et lettkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 ikke omfatter en Fc-region; og n er 0 eller 1; hvori VDl og VD2 tungkjede variabelt domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,46,48, 50, 52, 54, og 56 og hvori VDl og VD2 lettkjede variable domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:. 29, 31, 33, 35, 37, 39,41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, og 57.
25. Et bindende protein i stand til å binde to antigener omfattende fire polypeptidkjeder, hvori to polypeptidkjeder omfatter VDl-(XI)n-VD2-C-(X2)n, hvori VDl er et første tungkjede variabelt domene; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene; C er et tungkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 er en Fc-region; og n er 0 eller 1; og hvori to polypeptidkjeder omfatter VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VDl er et første lettkjede variabelt domene; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene; C er et lettkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 ikke omfatter en Fc-region; og n er 0 eller 1; hvori DVD-Ig'et binder minst et antigen valgt fra gruppen bestående av Amyloid beta (Abeta) (sekv.
1), Abeta (sekv. 2), Abeta (sekv. 3), Tumornekrose-faktor alfa (TNF-a), interleukin ip (IL-1B), Insulin-lignende Vekstfaktor 1 (IGF1), Insulin-lignende Vekstfaktor 2 (IGF2), Interleukin 18 (IL-18), Interleukin 6 (IL-6), Reseptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE), Nerve Vekstfaktor (NGF), Epidermal Vekstfaktor Reseptor (EGFR) (sekv. 1), EGFR (sekv. 2), CD-20, og Repulsivt Veiledningsmolekyl (RGMA).
26. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, 6, 24, eller 25, hvori nevnte bindende protein har en på-hastighetskonstant (Kon) for nevnte et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av: minst omtrent 10^ 's"1; minst omtrent 10^ 's"1; minst omtrentlO^^s"<1>; minst omtrent 10<5>M"<1>s"<1>; og minst omtrent 106M xs<!>, som målt ved overflate-plasmonresonans.
27. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, 6, 24, eller 25, hvori nevnte bindende protein har en av-hastighetskonstant (Koff) for nevnte et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av: på det meste omtrent lOV1; på det meste omtrent lOV1; på det meste omtrent lOV1; og på det meste omtrent 10" V, som målt ved overflate-plasmonresonans.
28. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, 6, 24, eller 25, hvori nevnte bindende protein har en dissosieringskonstant (KD) for nevnte et eller flere mål valgt fra gruppen bestående av: på det meste omtrent IO"<7>M; på det meste omtrent IO"<8>M; på det meste omtrent IO"<9>M; på det meste omtrent IO"<10>M; på det meste omtrent IO"<11>M; på det meste omtrent IO"12M; og på det meste 10"13M.
29. Et bindende protein-konjugat omfattende et bindende protein ifølge ethvert av kravene 1,3,6, 24, eller 25, nevnte bindende protein-konjugat videre omfattende et middel valgt fra gruppen bestående av; et immunoadhesjonsmolekyl, et billedfremkallingsmiddel, et terapeutisk middel, og et cytotoksisk middel.
30. Det bindende protein-konjugatet ifølge krav 29, hvori nevnte middel er et billedfremkallingsmiddel valgt fra gruppen bestående av et radioaktivt merkestoff, et enzym, et fluorescerende merkestoff, et luminescerende merkestoff, et bioluminescerende merkestoff, et magnetisk merkestoff, og biotin.
31. Det bindende protein-konjugatet ifølge krav 30, hvori nevnte billedfremkallingsmiddel er et radioaktivt merkestoff valgt fra gruppen bestående av: 3H 14C 35S,<90>Y,<99>Tc,<11>'ln,<1>251,<131>1,<177>Lu,166Ho, og153Sm.
32. Det bindende protein-konjugatet ifølge krav 30, hvori nevnte middel er et terapeutisk eller cytotoksisk middel valgt fra gruppen bestående av; en anti-metabolitt, et alkylerende middel, et antibiotika, en vekstfaktor, et cytokin, et anti-angiogent middel, et anti-mitotisk middel, et antrasyklin, toksin, og et apoptotisk middel.
33. Det bindende proteinet ifølge krav 1, 3, 6, 24, eller 25, hvori nevnte bindende protein er et krystallisert bindende protein.
34. Det bindende proteinet ifølge krav 33, hvori nevnte krystall er en bærer-fri farmasøytisk kontrollert-frigjørelseskrystall.
35. Det bindende proteinet ifølge krav 33, hvori nevnte bindende protein har en lengre halveringstid in vivo enn den løselige motparten av nevnte bindende protein.
36. Det bindende proteinet ifølge krav 33, hvori nevnte bindende protein beholder biologisk aktivitet.
37. En isolert nukleinsyre som koder for en bindende-protein aminosyresekvens ifølge ethvert av kravene 1, 3, 6,24, eller 25.
38. En vektor omfattende en isolert nukleinsyre ifølge krav 37.
39. Vektoren ifølge krav 38, hvori nevnte vektor er valgt fra gruppen bestående av pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO, og pBJ.
40. En vertscelle omfattende en vektor ifølge krav 38.
41. Vertscellen ifølge krav 40, hvori nevnte vertscelle er en prokaryotisk celle.
42. Vertscellen ifølge krav 41, hvori nevnte vertscelle er E.Coli.
43. Vertscellen ifølge krav 40, hvori nevnte vertscelle er en eukaryotisk celle.
44. Vertscellen ifølge krav 43, hvori nevnte eukaryotiske celle er valgt fra gruppen bestående av protist-celle, dyrecelle, plantecelle og soppcelle.
45. Vertscellen ifølge krav 43, hvori nevnte eukaryotiske celle er en dyrecelle valgt fra gruppen bestående av; en pattedyrscelle, en fuglecelle, og en insektscelle.
46. Vertscellen ifølge krav 45, hvori nevnte vertscelle er en CHO-celle.
47. Vertscellen ifølge krav 45, hvori nevnte vertscelle er COS.
48. Vertscellen ifølge krav 43, hvori nevnte vertscelle er en gjærcelle.
49. Vertscellen ifølge krav 48, hvori nevnte gjærcelle er Saccharomyces cerevisiae.
50. Vertscellen ifølge krav 45, hvori nevnte vertscelle er en insekt Sf9 celle.
51. En fremgangsmåte for å fremstille et bindende protein, omfattende å dyrke en vertscelle beskrevet i ethvert av kravene 40-50 i vekstmedium under betingelser tilstrekkelig for å produsere det bindende proteinet
52. Metoden ifølge krav 51, hvori 50%-75% av det bindende proteinet produsert er et dobbelt spesifikt tetravalent bindende protein.
53. Metoden ifølge krav 51, hvori 75%-90% av det bindende proteinet produsert er et dobbelt spesifikt tetravalent bindende protein.
54. Metoden ifølge krav 51, hvori 90%-95% av det bindende proteinet produsert er et dobbelt spesifikt tetravalent bindende protein.
55. Et protein produsert ifølge metoden i krav 51.
56. En farmasøytisk sammensetning omfattende det bindende proteinet fra ethvert av kravene 1-36 og 55, og en farmasøytisk akseptabel bærer.
57. Den farmasøytiske sammensetningen i krav 56 videre omfattende minst et ytterligere terapeutisk middel.
58. Den farmasøytiske sammensetningen i krav 57, hvori nevnte ytterligere terapeutiske middel er valgt fra gruppen bestående av: Terapeutisk middel, billedfremkallingsmiddel, cytotoksisk middel, angiogenese-inhibitorer; kinase-inhibitorer; blokkerere av ko-stimulerende molekyl; adhesjonsmolekyl-blokkerere; anti-cytokin antistoff eller funksjonelt fragment derav; metotrexat; syklosporin; rapamycin; FK506; detekterbar markør eller reporter; en TNF-antagonist; et antirevmatika; en muskelavslapper, et narkotisk stoff, et ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel (NSAID), et analgetikum, et anestetika, et sedativ, et lokalt anestetika, en neuromuskulær blokkerer, et antimikrobisk middel, et antipsoriatisk middel, et kortikosteriod, et anabolt steroid, et erythropoietin, et immuniseringsmiddel, et immunoglobulin, et immunosuppressiv, et veksthormon, et hormonerstatningslegemiddel, et radiofarmasøytika, et antidepressiva, et antipsykotika, en stimulant, et astma-medikament, en beta-agonist, et inhalert steroid, et epinefrin eller analog, et cytokin, og en cytokin-antagonist.
59. En metode for å behandle et subjekt for en sykdom eller en forstyrrelse ved å administrere til subjektet det bindende proteinet fra ethvert av kravene 1-36 og 55 slik at behandling er oppnådd.
60. Metoden i krav 59, hvori nevnte forstyrrelse er valgt fra gruppen omfattende revmatoid artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, septisk artritt, Lyme artritt, psoriatisk artritt, reaktiv artritt, spondyloartropati, systemisk lupus erytematose, Crohns sykdom, ulcerativ kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, insulin avhengig diabetes mellitus, tyroiditt, astma, allergiske sykdommer, psoriasis, dermatitt skleroderma, transplantat-mot-vert sykdom, organtransplantat-avvisning, akutt eller kronisk immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, sarkoidose, aterosklerose, disseminert intravaskulær koagulasjon, Kawasakis sykdom, Graves sykdom, nefrotisk syndrom, kronisk utmattelsessyndrom, Wegeners granulomatose, Henoch-Schoenlein purpurea, mikroskopisk vaskulitt av nyrene, kronisk aktiv hepatitt, uveitt, septisk sjokk, toksisk sjokk syndrom, sepsis syndrom, kakeksi, smittsomme sykdommer, parasittisk sykdommer, ervervet immunsvikt syndrom, akutt transvers myelitt, Huntingtons chorea, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, hjerneslag, primær biliær cirrhose, hemolytisk anemi, maligniteter, hjertesvikt, myokardielt infarkt, Addisons sykdom, sporadisk, polyglandulær mangel type I og polyglandulær mangel type II, Schmidts syndrom, voksen (akutt) respiratorisk distress syndrom, alopeki, alopeki areata, seronegativ artopati, artropati, Reiters sykdom, psoriatisk artropati, ulcerativ kolittisk artropati, enteropatisk synovitt, klamydia, yersinia og salmonella assosiert artropati, spondyloartopati, ateromatisk sykdom/arteriosklerose, atopisk allergi, autoimmun bulløs sykdom, pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigoid, lineær IgEn sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, Coombs positiv hemolytisk anemi, ervervet pernisiøs anemi, juvenil pernisiøs anemi, myalgisk encefalitt/Royal Fri Sykdom, kronisk mucokutan candidiasis, storcelle arteritt, primær skleroserende hepatitt, kryptogenisk autoimmun hepatitt, Ervervet Immunsvikt Sykdom Syndrom, Ervervet Immunsvikt Beslektede Sykdommer, Hepatitt B, Hepatitt C, vanlig variabel immunsvikt (vanlig variabel hypogammaglobulinemi), dilatert kardiomyopati, kvinnelig infertilitet, eggstokksvikt, prematur eggstokksvikt, fibrotisk lungesykdom, kryptogen fibroserende alveolitt, post-inflammatorisk interstitiell lungesykdom, interstitiell pneumonitt, bindevevssykdom assosiert interstitiell lungesykdom, blandet bindevevssykdom assosiert lungesykdom, systemisk sklerose assosiert interstitiell lungesykdom, revmatoid artritt assosiert interstitiell lungesykdom, systemisk lupus erytematose assosiert lungesykdom, dermatomiositt/polymyositt assosiert lungesykdom, Sjogrens sykdom assosiert lungesykdom, ankyloserende spondylitt assosiert lungesykdom, vaskulitisk diffus lungesykdom, hemosiderose assosiert lungesykdom, legemiddelindusert interstitiell lungesykdom, fibrose, strålingsfibrose, bronkiolitt obliterans, kronisk eosinofil lungebetennelse, lymfocytisk infiltrativ lungesykdom, postsmittsom interstitiell lungesykdom, giktisk artritt, autoimmun hepatitt, type-1 autoimmun hepatitt (klassisk autoimmun eller lupoid hepatitt), type-2 autoimmun hepatitt (anti-LKM antistoff hepatitt), autoimmun mediert hypoglykemi, type B insulinresistens med acanthosis nigricans, hypoparatyroidisme, akutt immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, kronisk immunsykdom assosiert med organ-transplantasjon, osteoarthrose, primær skleroserende kolangitt, psoriasis type 1, psoriasis type 2, idiopatisk leukopeni, autoimmun neutropeni, nyresykdom NOS, glomerulonefritt, mikroskopisk vasulitt av nyrene, lyme sykdom, diskoid lupus erytematose, mannlig infertilitet idiopatisk eller NOS, sædcelle autoimmunitet, multippel sklerose (alle undertyper), sympatisk oftalmi, pulmonær hypertensjon sekundært til bindevevssykdom, Goodpastures syndrom, pulmonær manifestasjon av polyarteritt nodosa, akutt revmatisk feber, revmatoid spondylitt, Stills sykdom, systemisk sklerose, Sjorgrens syndrom, Takayasus sykdom/arteritt, autoimmun trombocytopeni, idiopatisk trombocytopeni, autoimmun tyroid sykdom, hypertyroidisme, goitrous autoimmun hypotyroidisme (Hashimotos sykdom), atrofisk autoimmun hypotyroidisme, primært myxoødem, facogen uveitt, primær vaskulitt, vitiligo akutt leversykdom, kroniske leversykdommer, alkoholisk cirrhose, alkohol-indusert leverskade, koleosatatis, idiosynkratisk leversykdom, Legemiddelindusert hepatitt, Dcke-alkoholisk Steatohepatitt, allergi og astma, gruppe B streptococci (GBS) infeksjon, mentale forstyrrelser ( f. eks., depressjon og schizofreni), Th2 Type og Thl Type medierte sykdommer, akutt og kronisk smerte (forskjellige typer av smerte), og kreftsykdommer slik som lunge, bryst, mage, blære, tykktarm, bukspyttkjertel, eggstokk, prostata og rektal kreft og hematopoietiske maligniteter (leukemi og lymfom) Abetalipoprotemi, Acrocyanose, akutte og kroniske parasittisk eller smittsomme prosesser, akutt leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi (ALLE), akutt myeloid leukemi (AML), akutt eller kronisk bakteriell infeksjon, akutt pancreatitt, akutt nyresvikt, adenokarsinomer, luftige ektopiske slag, AIDS demens-kompleks, alkohol-indusert hepatitt, allergisk konjunktivitt, allergisk kontaktdermatitt, allergisk rinitt, allotransplantat-avvisning, alfa-1- antitrypsin mangel, amyotrofisk lateral sklerose, anemi, angina pectoris, fremre horncelle degenerering, anti cd3 terapi, antifosfolipid syndrom, anti-reseptor hypersensitivitetsreaksjoner, aordiske og perifere aneurismer, aortadisseksjon, arteriell hypertensjon, arteriosklerose, arteriovenøs fistula, ataksi, atriell flimmer (vedvarende eller paroksysmal), atriell flutter, atrioventrikulær blokkering, B-celle lymfom, beintransplantat avvisning, beinmargtransplantat (BMT) avvisning, "bundle branch"-blokkering, Burkitts lymfom, Brannskader, kardielle arytmier, kardiell lammelsessyndrom, kardielle tumorer, kardiomyopati, kardiopulmonær bypass inflammasjonsrespons, brusktransplantat-avvisning, cerebellære kortikale degenerasjoner, cerebellære forstyrrelser, kaotisk eller multifokal atriell takykardi, kjemoterapi-assosierte forstyrrelser, chromic myelocytisk leukemi (CML), kronisk alkoholisme, kroniske inflammatoriske patologier, kronisk lymfocytisk leukemi (CLL), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), kronisk salisylatforgiftning, kolorektalt karsinom, kongestiv hjertesvikt, konjunktivitt, kontaktdermatitt, cor pulmonale, koronær arteriesykdom, Creutzfeldt-Jakob sykdom, kultur-negativ sepsis, cystisk fibrose, cytokinterapi-assosierte forstyrrelser, Demens pugilistica, demyelinerende sykdommer, dengue hemoragisk feber, dermatitt, dermatologiske tilstander, diabetes, diabetes mellitus, diabetisk ateriosklerotisk sykdom, Diffus Lewy-kropp sykdom, dilatert kongestiv kardiomyopati, forstyrrelser i det basale ganglia, Downs Syndrom i middelalder, legemiddel- indusert bevegelsesforstyrrelser indusert av legemidler som blokkerer CNS dopaminreseptorer, legemiddelfølsomhet, eksem, encefalomyelitt, endokarditt, endokrinopati, epiglottitt, epstein-barr virus infeksjon, erytromelalgi, ekstrapyramidal og cerebellære forstyrrelser, familiær hematofagocytisk lymfohistiocytose, føtalt tymus implantat avvisning, Friedreichs ataksi, funksjonell perifere arterielle forstyrrelser, sopp sepsis, gass-koldbrann, mavesår, glomerulær nefritt, transplantat-awisning av ethvert organ eller vev, gram-negativ sepsis, gram-positiv sepsis, granulomar på grunn av intracellulære organismer, hårcelle leukemi, Hallervorden-Spatz sykdom, hashimotos tyroiditt, høyfeber, hjertetransplantasjonsavvisning, hemakromatose, hemodialyse, hemolytisk uremisk syndrom/trombolytisk trombocytopenisk purpura, blødning, hepatitt (A), "His bundle" arytmier, HIV infeksjon/HIV nevropati, Hodgkins sykdom, hyperkinetiske bevegelsesforstyrrelser, hypersensibilitetsreaksjoner, hypersensitivitet pneumonitt, hypertensjon, hypokinetiske bevegelsesforstyrrelser, hypothalamus-hypofyse-binyre-akse evaluering, idiopatisk Addisons sykdom, idiopatisk pulmonær fibrose, antistoff-mediert cytotoksisitet, Asteni, infantil spinal muskulær atrofi, inflammasjon av aorta, influensa a, ioniserende strålingseksponering, iridocyclitt/uveitt/optisk neuritt, iskemi- reperfusjon skade, iskemisk hjerneslag, juvenil revmatoid artritt, juvenil spinal muskulær atrofi, Kaposis sarkom, nyretransplantasjon avvisning, legionella, leishmaniasis, spedalskhet, lesjoner på det kortikospinale systemet, lipødem, levertransplantasjon avvisning, lymfederma, malaria, malignamt Lymfom, malignant histiocytose, malignant melanom, meningitt, meningococcemia, metabolisk/idiopatisk, migrene hodepine, mitokondrien multisystem forstyrrelse, blandet bindevevssykdom, monoklonal gammopati, multippel myelom, multippel-systemdegenerasjoner (Mencel Dejerine- Thomas Shi-Drager og Machado-Josef), my Asteni gravis, mycobacterium avium intracellulære, mycobacterium tuberculose, myelodyplastisk syndrom, myokardielt infarkt, myokardielle iskemiske forstyrrelser, nasofaryngeal karsinom, neonatal kronisk lungesykdom, nefritt, nefrose, nevrodegenerativ sykdommer, nevrogene I muskulære atrofier, neutropen feber, ikke- hodgkins lymfom, okklusjon av den abdominale aorta og dens sidegrener, okklusive arterielle forstyrrelser, okt3 terapi, orkitt/epidydimitt, orkitt/vasektomi-reversering prosedyrer, organomegali, osteoporose, bukspyttkjertel transplantasjon avvisning, bukspyttkjertel karsinom, paraneoplastisk syndrom/hyperkalsemi av ondartethet, paratyroid transplantasjon avvisning, inflammatorisk bekken sykdom, perennial rinitt, perikardiell sykdom, perifer aterlosklerotisk sykdom, perifere vaskulære forstyrrelser, peritonitt, pernisiøs anemi, pneumocystis carinii lungebetennelse, lungebetennelse, POEMS syndrom (polynevropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gammopati, og hudforandringssyndrom), postperfusjonssyndrom, post pump syndrom, post-MI kardiotomi syndrom, preeklampsi, Progressiv supranukleær parese, primær pulmonær hypertensjon, strålingsterapi, Raynauds fenomen og sykdom, Raynouds sykdom, Refsums sykdom, jevnlig smal QRS takykardi, renovaskulær hypertensjon, reperfusjon skade, restriktiv kardiomyopati, sarkomer, skleroderma, senil chorea, Senil Demens av Lewy-legemer typen, seronegativ artropatier, sjokk, sigd-celle anemi, hud allotransplantat-avvisning, hudforandringssyndrom, liten tarm transplantasjon avvisning, faste tumorer, spesifikke arytmier, spinal ataksi, spinocerebellære degenerasjoner, streptokokk myositt, strukturelle lesjoner på lillehjernen, Subakutt skleroserende panencefalitt, Synkope, syfilis i det kardiovaskulære systemet, systemisk anafalaksi, systemisk inflammatorisk respons syndrom, systemisk utbrudd juvenil revmatoid artritt, T-celle eller FAB ALLE, Telangiektasi, tromboangitt obliterans, trombocytopeni, toksisitet, transplantasjoner, traumer/blødning, type III hypersensitivitetsreaksjoner, type IV hypersensitivitet, ustabil angina, uremi, urosepsis, urtikaria, valvulære hjertesykdommer, åreknuter, ,vaskulitt, venøse sykdommer, venøs trombose, ventrikulært flimmer, virale infeksjoner og soppinfeksjoner, vital encefalitt/aseptisk meningitt, vital-assosiert hemafagocytisk syndrom, Wernicke- Korsakoff syndrom, Wilsons sykdom, xenotransplantat-avvisning av ethvert organ eller vev, Akutte koronære syndromer, akutt idiopatisk polyneuritt, akutt inflammatorisk demyelinerende polyradiculonevropati, akutt iskemi, voksen Stills sykdom, alopeki areata, Anafylakse, anti-fosfolipid antistoff syndrom, aplastisk anemi, arteriosklerose, atopisk eksem, atopisk dermatitt, autoimmun dermatitt, autoimmun forstyrrelse assosiert med streptococcus infeksjon, autoimmun enteropati, autoimmun hearing tap, autoimmun lymfoproliferativt syndrom (ALPS), autoimmun myokarditt, autoimmun prematur eggstokksvikt, blefaritt, bronchiectasis, Bulløs pemfigoid, kardiovaskulær sykdom, katastrofisk antifosfolipid syndrom, Cøliac sykdom, Cervikal spondylose, kronisk iskemi, cicatricial pemfigoid, klinisk isolert syndrom (cis) med risiko for multippel sklerose, kon junktivitt, Barndom utbrudd Psykiatrisk forstyrrelse, kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), dacryocystitt, dermatomiositt, diabetisk retinopati, diabetes mellitus, Skiveprolaps, Skiveprolaps, legemiddel indusert immun hemolytisk anemi, endokarditt, endometriose, endoftalmitt, episkleritt, Erytema multiforme, Erytema multiforme major, Svangerskaps pemfigoid, Guillain-Barré syndrom (GBS), høyfeber, Hughes syndrom, idiopatisk Parkinsons sykdom, idiopatisk interstitiell lungebetennelse, IgE-mediert allergi, immun hemolytisk anemi, inclusion body myositt, Smittsom okkulær inflammatorisk sykdom, inflammatorisk demyelinerende sykdom, inflammatorisk hjertesykdom, inflammatorisk nyresykdom, IPF/UIP, iritt, keratitt, keratojuntivitt sicca, Kussmaul sykdom eller Kussmaul-Meier sykdom, Landrys Paralyse, Langerhans celle histiocytose, livedo reticularis, makulær degenerering, mikroskopisk polyangiitt, morbus bechterev, Motornevron forstyrrelser, slimhinne pemfigoid, multippel organsvikt, myAsteni gravis, myelodysplastisk syndrom, myokarditt, Nerverot forstyrrelser, nevropati, ikke-A ikke-B hepatitt, optisk neuritt, osteolyse, eggstokk kreft, Pauciartikulær JRA, perifer arterie okklusiv sykdom (PAOD), perifer vaskulær sykdom (PVD), perifer arterie, sykdom (PAD), flebitt, polyarteritt nodosa (eller periarteritt nodosa), polykondritt, polymyalgi revmatiska, poliose, Polyartikulær JRA, polyendokrin mangel syndrom, polymyositt, polymyalgi revmatiska (PMR), post-pump syndrom, primær Parkinsonisme, prostata og rektal kreft og hematopoietiske maligniteter (leukemi og lymfom), prostatitt, Ren rødcelle aplasi, primær binyrer utilstrekkelighet, tilbakevendende neuromyelitt optica, restenose, revmatisk hjertesykdom, safo (synovitt, akne, pustulose, hyperostose, og osteitt), skleroderma, sekundær amyloidose, Sjokklunge, skleritt, isjas, sekundær binyrer utilstrekkelighet, Silikonassosiert bindevevssykdom, sneddon-wilkinson dermatose, spondilitt ankylosans, Stevens-Johnson syndrom (SJS), systemisk inflammatorisk respons syndrom, temporær arteritt, toksoplasmisk retinitt, toksisk epidermal necrolyse, transvers myelitt, TRAPS (tumornekrose-faktor reseptor, type 1 allergisk reaksjon, type II diabetes, urtikaria, vanlig interstitiell lungebetennelse (UIP), vaskulitt, vernal konjunktivitt, viral retinitt, Vogt-Koyanagi-Harada syndrom (VKH syndrom), våt makulær degenerering, sårtilheling, yersinia og salmonella assosiert artropati.
61. Metoden ifølge krav 60, hvori nevnte å administrere til subjektet er ved minst en måte valgt fra parenteral, subkutan, intramuskulær, intravenøs, intrartikulær, intrabronkiell, intraabdominal, intrakapsulær, intrakartilaginøst, intrakavitøst, intracelialt, intracerebralt, intracerebroventrikulært, intrakolisk, intracervikalt, intragastrisk, intrahepatisk, intramyokardielt, intraostealt, intrapelvisk, intraperikardielt, intraperitonalt, intrapleuralt, intraprostatisk, intrapulmonært, intrarektalt, intrarenalt, intraretinalt, intraspinalt, intrasynovialt, intratoraksialt, intrauterint, intravesikalt, bolus, vaginalt, rektalt, bukkalt, sublingualt, intranasalt og transdermalt.
62. En metode for å generere et immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde to antigener omfattende trinnet å a) oppnå et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et første antigen; b) oppnå et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et andre antigen; c) konstruere første og tredje polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VDl er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 er en Fc-region; og n er 0 eller 1; og d) konstruere andre og fjerde polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori VDl er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende derav; C er et lettkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 ikke omfatter en Fc-region; og n er 0 eller 1; og e) som uttrykker nevnte første, andre, tredje og fjerde polypeptidkjeder; slik at et immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde nevnte første og nevnte andre antigen blir fremstilt, hvori det bindende proteinet er i stand til å binde et par med antigener valgt fra gruppen bestående av Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 2); IL-ip og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2); IGF 1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF-a og Abeta (sekv.3); IL-1 p og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF 1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 1); IL-ip og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-ip; NGF og IL-6; TNF-a og EGFR (sekv. 2); TNF-a og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv. 2); RGMA og TNF-a.
63. Metoden i krav 62, hvori VDl og VD2 tungkjede variabelt domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 28, 30, 32, 34, 36, 38,40,42,44,46, 48, 50, 52, 54, og 56 og hvori VDl og VD2 lettkjede variable domener omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, og 57.
64. Metoden i krav 62, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, og nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, er valgt fra gruppen bestående av et humant antistoff, et CDR-podet antistoff, og et humanisert antistoff.
65. Metoden i krav 62, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, og nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, er valgt fra gruppen bestående av et Fab-fragment, en F(ab')2fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter knyttet sammen ved en disulfid-bro ved hengsel-regionen; et Fd-fragment bestående av VH- og CH1-domenene; et Fv-fragment bestående av VL- og VH-domenene fra en enkelt arm til et antistoff, et dAb-fragment, en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR), et enkelt-kjede antistoff, og diabodier.
66. Metoden i krav 62, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav innehar minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener.
67. Metoden i krav 62, hvori nevnte andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav innehar minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener.
68. Metoden i krav 62, hvori Fc-regionen er valgt fra gruppen bestående av en opprinnelig sekvens Fc-region og en variant sekvens Fc-region.
69. Metoden i krav 62, hvori Fc-regionen er valgt fra gruppen bestående av en Fc-region fra en IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, og IgD.
70. Metoden i krav 66, hvori nevnte ønsket egenskap er valgt fra en eller flere antistoff-parametre.
71. Metoden i krav 67, hvori nevnte ønsket egenskap er valgt fra en eller flere antistoff-parametre.
72. Metoden i krav 70, hvori nevnte antistoff-parametre er valgt fra gruppen bestående av antigen spesifisitet, affinitet ovenfor antigen, styrke, biologisk funksjon, epitop-gjenkjenning, stabillitet, løselighet, produksjonseffektivitet, immunogenitet, farmakokinetikk, biotilgjengelighet, kryssreaktivitet for vev, og ortolog antigen-binding.
73. Metoden i krav 71, hvori nevnte antistoff-parametre er valgt fra gruppen bestående av antigen spesifisitet, affinitet ovenfor antigen, styrke, biologisk funksjon, epitop-gjenkjenning, stabillitet, løselighet, produksjonseffektivitet, immunogenitet, farmakokinetikk, biotilgjengelighet, kryssreaktivitet for vev, og ortolog antigen-binding.
74. Metoden i krav 62, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte første antigen med en forskjellig affinitet enn affiniteten som nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte andre antigen.
75. Metoden i krav 62, hvori nevnte første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte første antigen med en forskjellig styrke enn styrken som nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav, binder nevnte andre antigen.
76. En metode for å generere et immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde to antigener med ønskede egenskaper omfattende trinnet å a) oppnå et første moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et første antigen og innehar minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener; b) oppnå et andre moderantistoff eller antigen-bindende porsjon derav, i stand til å binde et andre antigen og innehar minst en ønsket egenskap vist av immunoglobulinet med to variable domener; c) konstruere første og tredje polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VDl er et første tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre tungkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et tungkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 er en Fc-region; og n er 0 eller 1; d) konstruere andre og fjerde polypeptidkjeder omfattende VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, hvori; VDl er et første lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte første moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; VD2 er et andre lettkjede variabelt domene oppnådd fra nevnte andre moder-antistoff eller antigen-bindende porsjon derav; C er et lettkjede konstant domene; XI er en linker med den forutsetningen at den ikke er CH1; X2 ikke omfatter en Fc-region; og n er 0 eller 1; e) som uttrykker nevnte første, andre, tredje og fjerde polypeptidkjeder; slik at et immunoglobulin med to variable domener i stand til å binde nevnte første og nevnte andre antigen med ønskede egenskaper blir fremstilt, hvori det bindende proteinet er i stand til å binde et par med antigener valgt fra gruppen bestående av Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 2); IL-ip og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 2); IGF1,2 og Abeta (sekv. 2); Abeta (sekv. 2) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 2); TNF-a og Abeta (sekv.3); IL-1 p og Abeta (sekv.
3); Abeta (sekv. 1) og Abeta (sekv. 3); IGF 1,2 og Abeta (sekv. 3); Abeta (sekv. 3) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 3); TNF-a og Abeta (sekv. 1); IL-ip og Abeta (sekv. 1); IGF1,2 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og IL-18; IL-6 og Abeta (sekv. 1); Abeta (sekv. 1) og RAGE; NGF og IL-18; NGF og IL-ip; NGF og IL-6; TNF-a og EGFR (sekv. 2); TNF-a og RAGE; CD-20 og EGFR (sekv. 1); CD-20 og EGFR (sekv. 2); RGMA og TNF-a.
NO20101695A 2008-06-03 2010-12-03 Immunoglobuliner med dobbelt-variabelt domene, og anvendelse derav NO20101695A1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13077608P 2008-06-03 2008-06-03
US13295108P 2008-06-24 2008-06-24
PCT/US2009/046130 WO2009149185A2 (en) 2008-06-03 2009-06-03 Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO20101695A1 true NO20101695A1 (no) 2011-03-03

Family

ID=41398843

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20101695A NO20101695A1 (no) 2008-06-03 2010-12-03 Immunoglobuliner med dobbelt-variabelt domene, og anvendelse derav

Country Status (24)

Country Link
US (3) US9109026B2 (no)
EP (1) EP2297208A4 (no)
JP (2) JP5723769B2 (no)
KR (1) KR20110016959A (no)
CN (1) CN102112494A (no)
AR (1) AR072000A1 (no)
AU (1) AU2009256246B2 (no)
BR (1) BRPI0913366A8 (no)
CA (1) CA2725666A1 (no)
CL (1) CL2010001425A1 (no)
CO (1) CO6331348A2 (no)
DO (1) DOP2010000369A (no)
EC (1) ECSP10010643A (no)
IL (1) IL209490A0 (no)
MX (1) MX2010013236A (no)
NO (1) NO20101695A1 (no)
NZ (1) NZ589436A (no)
PE (1) PE20100054A1 (no)
RU (1) RU2010153578A (no)
SG (1) SG191625A1 (no)
TW (1) TW201006485A (no)
UY (1) UY31861A (no)
WO (1) WO2009149185A2 (no)
ZA (1) ZA201008561B (no)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2390425T3 (es) 2000-12-22 2012-11-12 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Uso de moléculas de orientación repulsivas (RGM) y sus moduladores
PT1392359E (pt) 2001-05-11 2010-01-27 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP2009510002A (ja) 2005-09-30 2009-03-12 アボット ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 反発誘導分子（ｒｇｍ）タンパク質ファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びその機能的断片、及びそれらの使用
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
EP2126127B1 (en) 2007-01-25 2016-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
CN101896503B (zh) 2007-08-14 2018-05-22 路德维格癌症研究所有限公司 靶向egf受体的单克隆抗体175及其衍生物和用途
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
AU2009245354C1 (en) * 2008-05-09 2016-05-19 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
US9109026B2 (en) * 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BRPI0923359B8 (pt) 2008-12-12 2021-05-25 Boehringer Ingelheim Int molécula de anticorpo anti-igf, método para a produção da mesma, molécula de dna, vetor de expressão, e composição farmacêutica e método in vitro para inibir a ligação do igf-1 e do igf-2 ao receptor de igf-1 e ao receptor de insulina ir-a
CN105254758A (zh) 2009-03-05 2016-01-20 Abbvie公司 Il-17结合蛋白
EP2419447B1 (en) * 2009-04-17 2017-08-23 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
CN102459347A (zh) * 2009-05-01 2012-05-16 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CA2760246A1 (en) 2009-05-08 2010-11-11 Weilan Ye Humanized anti-egfl7 antibodies and methods using same
JP5903382B2 (ja) 2009-08-29 2016-04-13 アッヴィ・インコーポレイテッド 治療用ｄｌｌ４結合タンパク質
MX2012002651A (es) 2009-09-01 2012-05-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
PE20121531A1 (es) * 2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US8871205B2 (en) * 2009-11-25 2014-10-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for the treatment of immune disorders
CA2780069C (en) 2009-12-08 2018-07-17 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
GB201000467D0 (en) * 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
CN105037543B (zh) 2010-03-02 2020-11-03 Abbvie 公司 治疗性dll4结合蛋白
MA34025B1 (fr) 2010-03-03 2013-02-01 Boehringer Ingelheim Int Polypeptides se liant au bêta-a
CA2803392A1 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8741288B2 (en) * 2010-07-07 2014-06-03 Chang Gung Medical Foundation, Linkou Branch Protein markers for detecting liver cancer and method for identifying the markers thereof
UY33492A (es) * 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US20130115215A1 (en) * 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
AU2011288464B2 (en) 2010-08-10 2015-10-29 Glycotope Gmbh Fab-glycosylated antibodies
JP5997154B2 (ja) 2010-08-16 2016-09-28 ノビミューン エスアー 多重特異性多価抗体の生成方法
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120263722A1 (en) * 2010-11-04 2012-10-18 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9783602B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
AR084210A1 (es) * 2010-12-08 2013-05-02 Abbott Lab PROTEINAS DE UNION AL TNF-a
EA201391248A1 (ru) 2011-03-01 2014-05-30 Эмджен Инк. Биспецифические связывающие агенты
EP2710042A2 (en) 2011-05-16 2014-03-26 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
HUE038225T2 (hu) * 2011-08-23 2018-10-29 Roche Glycart Ag Bispecifikus, T-sejtaktiváló antigénkötõ, molekulák
EP3388451A1 (en) 2011-09-29 2018-10-17 Apo-T B.V. Multi specific binding molecules targeting aberrant cells
MX2014008102A (es) * 2011-12-30 2014-09-25 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual contra receptores.
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
KR101477130B1 (ko) * 2012-01-11 2015-01-06 연세대학교 산학협력단 용해성 rage를 유효성분으로 포함하는 심근염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2013105856A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Apo-T B.V. Aberrant cell-restricted immunoglobulins provided with a toxic moiety
MY194587A (en) 2012-01-27 2022-12-05 Abbvie Inc Composition and method for the diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
AU2013281327A1 (en) * 2012-06-26 2015-01-22 Apo-T B.V. Binding molecules targeting pathogens
WO2014037811A2 (en) 2012-09-07 2014-03-13 The Governors Of The University Of Alberta Methods and compositions for diagnosis of inflammatory liver disease
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
CN104884472B (zh) 2012-11-01 2021-10-15 艾伯维公司 抗-vegf/dll4双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2014078502A1 (en) * 2012-11-16 2014-05-22 Novartis Ag Use of il-1 beta binding antibodies for treating peripheral arterial disease
WO2014081202A1 (ko) 2012-11-21 2014-05-30 주식회사 파멥신 Vegfr-2와 dll4를 표적으로 하는 이중표적항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2014089209A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Abbvie, Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins
WO2014116846A2 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
WO2014166029A1 (zh) * 2013-04-07 2014-10-16 永卓博济(上海)生物医药技术有限公司 针对表皮生长因子受体的抗体
US9388243B2 (en) * 2013-05-29 2016-07-12 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of target membrane protein depletion
KR102190220B1 (ko) * 2013-05-29 2020-12-14 삼성전자주식회사 타겟 특이적 세포막 단백질 제거용 조성물
EP3757130A1 (en) 2013-09-26 2020-12-30 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
EP2899543A1 (en) 2014-01-28 2015-07-29 Predemtec GmbH Biomarker and methods for early diagnosis of Alzheimer's disease
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
WO2015120389A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Patara Pharma, LLC Mast cell stabilizers treatment for systemic disorders
PT3104854T (pt) 2014-02-10 2020-06-26 Respivant Sciences Gmbh Estabilizadores de mastócitos para tratamento de doença pulmonar
US9376490B2 (en) * 2014-04-01 2016-06-28 National Cheng Kung University Treatment of inflammatory pain using IL-20 antagonists
US20160002343A1 (en) * 2014-06-11 2016-01-07 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
CN114306605A (zh) 2014-07-03 2022-04-12 耶鲁大学 Dickkopf2(Dkk2)抑制作用抑制肿瘤形成
WO2016004197A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using cobalt
US20160185848A1 (en) 2014-07-09 2016-06-30 Abbvie Inc. Methods for modulating the glycosylation profile of recombinant proteins using sugars
KR102259232B1 (ko) * 2014-08-25 2021-05-31 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
EP3925622A1 (en) 2014-09-13 2021-12-22 Novartis AG Combination therapies
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
JP6725532B2 (ja) * 2015-04-29 2020-07-22 インスティテュート フォー リサーチ イン バイオメディシン 多重特異性抗体によるサイトカインの非常に強力な中和およびその利用
US20180291097A1 (en) * 2015-06-04 2018-10-11 Craig Basson Use of il-1 beta binding antibodies to treat peripheral arterial disease
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
KR101916959B1 (ko) * 2015-07-13 2018-11-08 김동구 정자의 성 감별용 항체 및 이의 용도
US10265296B2 (en) 2015-08-07 2019-04-23 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of systemic disorders treatable with mast cell stabilizers, including mast cell related disorders
US10238625B2 (en) 2015-08-07 2019-03-26 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of mast cell related disorders with mast cell stabilizers
CA2998183A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Methods for treating relapsing forms of multiple sclerosis
RU2018122255A (ru) * 2015-11-27 2019-12-19 Аблинкс Нв Полипептиды, ингибирующие cd40l
WO2017096262A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Jomoco, Corp. Compositions and methods to mitigate or prevent an immune response to an immunogenic therapeutic molecule in non-human primates
NZ743881A (en) * 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
TW202408592A (zh) 2016-03-02 2024-03-01 日商衛材R&D企管股份有限公司 基於艾日布林之抗體-藥物結合物及使用方法
JP2019509737A (ja) 2016-03-11 2019-04-11 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． ＴＧＦβ１結合性免疫グロブリンおよびその使用
US10870701B2 (en) 2016-03-15 2020-12-22 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
WO2018044942A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Patara Pharma, LLC Cromolyn compositions for treatment of chronic cough due to idiopathic pulmonary fibrosis
JP2019531308A (ja) 2016-10-07 2019-10-31 レシュピファント サイエンシス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクター ハフトゥングＲｅｓｐｉｖａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｍｂｈ 肺線維症の治療のためのクロモリン組成物
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN117398457A (zh) 2017-01-06 2024-01-16 供石公司 亚型特异性、背景许可性TGFβ1抑制剂及其用途
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
WO2018152326A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Engineered transferrin receptor binding polypeptides
EP4273258A3 (en) * 2017-02-20 2024-01-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
US11939385B2 (en) 2017-05-16 2024-03-26 ALX Oncology Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
JP7394767B2 (ja) 2018-01-12 2023-12-08 ジェンザイム・コーポレーション ポリペプチドの定量化方法
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
CA3100608A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Anti-muc1 antibody-drug conjugate
US20210198370A1 (en) * 2018-05-31 2021-07-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Bi-specific antibodies and use thereof
EP3820896A1 (en) 2018-07-11 2021-05-19 Scholar Rock, Inc. TGFbeta1 INHIBITORS AND USE THEREOF
RS62914B1 (sr) 2018-07-11 2022-03-31 Scholar Rock Inc Izoform selektivni inhibitori tgfbeta1 i njihova upotreba
CA3105988A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Abhishek Datta High-affinity, isoform-selective tgf.beta.1 inhibitors and use thereof
WO2020106771A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Exosome Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing exosome loaded therapeutics for the treatment of multiple oncological disorders
CN111423512B (zh) * 2019-01-10 2024-01-05 北京比洋生物技术有限公司 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物
CN111458396B (zh) * 2019-01-18 2022-07-08 成都康弘生物科技有限公司 一种蛋白的电荷异质性检测方法
CN112274650A (zh) * 2019-07-24 2021-01-29 江苏集萃分子工程研究院有限公司 基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用
CA3167427A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. Tgfb inhibitors and use thereof
US20230050148A1 (en) 2020-01-11 2023-02-16 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
CN116348487A (zh) 2020-07-23 2023-06-27 欧萨尔普罗席纳有限公司 抗淀粉样β抗体
WO2022157773A2 (en) * 2021-01-21 2022-07-28 Biolojic Design Ltd. Dual binding antibodies, methods of producing dual binding antibodies, and uses thereof
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
WO2022256723A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
WO2023288277A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Scholar Rock, Inc. Ltbp complex-specific inhibitors of tgfb1 and uses thereof

Family Cites Families (349)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4753894A (en) * 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
EP0590689B2 (fr) 1985-03-30 2006-08-16 KAUFFMAN, Stuart A. Procédé d'obtention d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombinaison d'ADN
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
ATE111083T1 (de) 1986-10-22 1994-09-15 Abbott Lab Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze.
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5241070A (en) 1988-09-26 1993-08-31 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5063081A (en) 1988-11-14 1991-11-05 I-Stat Corporation Method of manufacturing a plurality of uniform microfabricated sensing devices having an immobilized ligand receptor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2057923A1 (en) 1989-05-16 1990-11-17 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AT396939B (de) 1990-05-29 1993-12-27 Alois Dipl Ing Dr Jungbauer Komplexes virales antigen von hiv-1 bindendes rekombinantes protein
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5135875A (en) 1990-08-15 1992-08-04 Abbott Laboratories Protein precipitation reagent
CA2048302A1 (en) 1990-08-15 1992-02-16 Victoria P. Meucci Solubilization reagent for biological test samples
JP3306063B2 (ja) 1990-08-24 2002-07-24 イグジス， インコーポレイテッド ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する方法
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5780279A (en) 1990-12-03 1998-07-14 Genentech, Inc. Method of selection of proteolytic cleavage sites by directed evolution and phagemid display
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
AU9166691A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
AU1545692A (en) 1991-03-01 1992-10-06 Protein Engineering Corporation Process for the development of binding mini-proteins
US5558864A (en) 1991-03-06 1996-09-24 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Humanized and chimeric anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
DE69231828T3 (de) 1991-03-18 2008-06-19 New York University Spezifisch gegen menschlichen Tumornekrosefaktor gerichtete monoklonale und chimäre Antikörper
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
AU668349B2 (en) 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
ATE221379T1 (de) 1991-05-01 2002-08-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur behandlung infektiöser respiratorischer erkrankungen
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
CA2069530A1 (en) 1991-06-03 1992-12-04 Cass J. Grandone Reagent pack for immunoassays
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5352803A (en) 1992-03-30 1994-10-04 Abbott Laboratories 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives
ES2148225T3 (es) 1992-03-30 2000-10-16 Abbott Lab Reactivos y procedimientos que permiten la deteccion y la cuantificacion de la tiroxina en muestras de fluido.
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
AU6132994A (en) 1993-02-02 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
WO1995001997A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation RECOMBINANT AND HUMANIZED IL-1β ANTIBODIES FOR TREATMENT OF IL-1 MEDIATED INFLAMMATORY DISORDERS IN MAN
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
EP0659766A1 (en) 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
US5565352A (en) 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
ES2247204T3 (es) 1994-01-31 2006-03-01 Trustees Of Boston University Bancos de anticuerpos policlonales.
ZA95960B (en) 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
PL181342B1 (pl) 1994-03-17 2001-07-31 Merck Patent Gmbh Jednolancuchowe anty-EGFR Fv i przeciwciala anty-EGFR, czasteczka DNA, sposoby wytwarzania jednolancuchowego przeciwciala anty-EGFR i przeciwciala anty-EGFR oraz kompozycja farmaceutyczna PL PL PL PL PL PL PL
IL109632A (en) 1994-05-11 2007-03-08 Yeda Res & Dev Modulators of the function of tnf receptors
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
WO1996004925A1 (en) 1994-08-12 1996-02-22 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
GB9504344D0 (en) * 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5641870A (en) * 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) * 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
WO1996033266A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic dna deletions
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996040210A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US7060808B1 (en) 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
US5916597A (en) 1995-08-31 1999-06-29 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition and method using solid-phase particles for sustained in vivo release of a biologically active agent
AU6873396A (en) 1995-10-16 1997-05-07 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6331431B1 (en) 1995-11-28 2001-12-18 Ixsys, Inc. Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
CA2243459C (en) * 1996-02-09 2002-09-17 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human tnf.alpha.
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6015884A (en) 1996-03-28 2000-01-18 The Johns Hopkins University Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins
WO1997038102A1 (en) * 1996-04-04 1997-10-16 Unilever Plc Multivalent and multispecific antigen-binding protein
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6699658B1 (en) * 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6986890B1 (en) * 1996-11-21 2006-01-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibody
US7258857B2 (en) * 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
PT954282E (pt) 1997-01-16 2005-06-30 Massachusetts Inst Technology Preparacao de particulas para inalacao
JP3692542B2 (ja) 1997-01-21 2005-09-07 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション Ｒｎａ−蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜
US6057098A (en) * 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
PT1325932E (pt) 1997-04-07 2005-06-30 Genentech Inc Anticorpos anti-vegf
US6884879B1 (en) * 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US6235883B1 (en) * 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU8691398A (en) 1997-08-04 1999-02-22 Ixsys, Incorporated Methods for identifying ligand specific binding molecules
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
AU2152299A (en) 1997-10-27 1999-05-24 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
CN103641885A (zh) 1998-05-06 2014-03-19 基因技术股份有限公司 用离子交换层析纯化蛋白质
DE69907456T2 (de) 1998-06-24 2004-03-25 Advanced Inhalation Research, Inc., Cambridge Grosse poröse partikel ausgestossen von einem inhalator
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
RS51309B (sr) 1998-12-23 2010-12-31 Pfizer Inc. Humana monoklonalna antitela za ctla-4
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CZ303725B6 (cs) 1999-03-25 2013-04-03 Abbott Gmbh & Co. Kg Lidské protilátky, které se vází na lidský IL-12 a zpusoby jejich produkce
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
CN1119415C (zh) 1999-06-04 2003-08-27 长春迈灵生物工程有限公司 抗ca125双功能基因工程抗体的克隆与表达
US6531580B1 (en) 1999-06-24 2003-03-11 Ixsys, Inc. Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same
HU230586B1 (hu) 1999-06-25 2017-02-28 Genentech, Inc. Anti-ErbB antitest/maytansinoid konjugátumok alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására
WO2001032712A2 (en) 1999-11-03 2001-05-10 Maxygen, Inc. Antibody diversity generation
TWI335336B (no) 2000-02-10 2011-01-01 Abbott Gmbh & Co Kg
HUP0300024A2 (en) 2000-02-24 2003-05-28 Genentech Inc Caspase activated prodrugs therapy
AU3985701A (en) 2000-02-25 2001-09-03 Us Health Anti-EGFRviii SCFVS with improved cytotoxicity and yield, immunotoxins based thereon, and methods of use thereof
HUP0300919A2 (hu) 2000-03-24 2003-07-28 Micromet Ag Többfunkciós polipeptidek NKG2D receptor komplex epitóp kötőhellyel
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
WO2001083525A2 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
BR0110927A (pt) 2000-05-19 2003-03-11 Scancell Ltd Anticorpo, ácido nucléico, vetor, célula, método de fabricar um anticorpo, composição farmacêutica, uso de um anticorpo ou de um ácido nucleico, e, método para o tratamento ou profilaxia do câncer
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
PE20020132A1 (es) 2000-06-29 2002-03-04 Abbott Lab Anticuerpos de especificidad doble y metodos para la elaboracion y el uso de los mismos
EP1294904A1 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
US20090081234A1 (en) * 2000-08-07 2009-03-26 George Heavner Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses for treatment of depression and related conditions
GB0020685D0 (en) * 2000-08-22 2000-10-11 Novartis Ag Organic compounds
EP1343820A4 (en) * 2000-10-13 2005-09-14 Uab Research Foundation ANTI-EPIDERMIC GROWTH FACTOR RECEPTOR SINGLE CHAIN ANTIBODY
US6818392B2 (en) 2000-12-06 2004-11-16 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus and uses thereof
IL156618A0 (en) 2000-12-28 2004-01-04 Altus Biologics Inc Crystals of whole antibodies and fragments thereof, methods for the preparation thereof and diagnostic kits utilizing the same
EP2275446A3 (en) 2001-01-05 2012-08-15 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
WO2002097048A2 (en) 2001-05-30 2002-12-05 Centocor, Inc. ANTI-p40 IMMUNOGLOBULIN DERIVED PROTEINS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
CA2448956C (en) 2001-05-30 2017-10-03 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders
KR20090125840A (ko) * 2001-06-13 2009-12-07 젠맵 에이/에스 표피 성장 인자 수용체 (ｅｇｆｒ)에 대한 인간 모노클로날 항체
DE60233509D1 (de) * 2001-06-20 2009-10-08 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
JP4249013B2 (ja) 2001-07-31 2009-04-02 佑 本庶 Ｐｄ−１に対し特異性を有する物質
CA2451998A1 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Anti-a.beta. antibodies
US7247304B2 (en) 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
KR20040048899A (ko) * 2001-09-25 2004-06-10 가부시키가이샤 멘에키세이부츠 켄큐죠 재조합 항-오스테오폰틴 항체 및 그의 용도
EP1438400B1 (en) 2001-10-01 2009-06-17 Dyax Corp. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003039486A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
WO2004039826A1 (en) 2001-11-14 2004-05-13 Centocor, Inc. Anti-il-6 antibodies, compositions, methods and uses
US7452539B2 (en) 2001-12-19 2008-11-18 Genentech, Inc. Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea
ATE417858T1 (de) 2002-02-05 2009-01-15 Genentech Inc Proteinaufreinigung
US20030224397A1 (en) 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7657380B2 (en) 2003-12-04 2010-02-02 Xencor, Inc. Methods of generating variant antibodies with increased host string content
US7419821B2 (en) 2002-03-05 2008-09-02 I-Stat Corporation Apparatus and methods for analyte measurement and immunoassay
JP2005535572A (ja) 2002-04-12 2005-11-24 メディミューン，インコーポレーテッド 組換え抗インターロイキン−９抗体
JP2006512891A (ja) 2002-04-18 2006-04-20 ジェネンコー・インターナショナル・インク 糸状菌における機能性抗体の生産
EP1501369B1 (en) 2002-04-26 2015-06-24 Genentech, Inc. Non-affinity purification of proteins
US20030206898A1 (en) 2002-04-26 2003-11-06 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
US7438911B2 (en) 2002-04-30 2008-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody against human insulin-like growth factor
KR101086533B1 (ko) 2002-05-24 2011-11-23 쉐링 코포레이션 중화 사람 항-ｉｇｆｒ 항체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20040018577A1 (en) 2002-07-29 2004-01-29 Emerson Campbell John Lewis Multiple hybrid immunoassay
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
RS20050834A (en) * 2002-08-19 2007-12-31 Abgenix Inc., Antibodies directed to monocyte chemo-attractant protein-1 (mcp-1) and uses thereof
DK2332996T3 (en) 2002-09-11 2014-12-15 Genentech Inc Purification of anti-Her2 antibodies
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
CA2508375C (en) 2002-12-02 2014-05-27 Abgenix, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CN102746399B (zh) 2002-12-24 2016-03-02 里纳特神经系统学公司 抗ngf抗体及其使用方法
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
WO2004065417A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
JP3803790B2 (ja) 2003-02-17 2006-08-02 株式会社東北テクノアーチ 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
DK2163643T3 (en) 2003-03-05 2015-03-23 Halozyme Inc Soluble hyaluronidaseglycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, pharmaceutical compositions and uses thereof covered
US7638605B2 (en) 2003-05-01 2009-12-29 ImClone, LLC Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EP1629012B1 (en) * 2003-05-31 2018-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
RS53476B (en) 2003-07-18 2014-12-31 Amgen Fremont Inc. Hepatocyte Growth Factor Binders
EP3095793B1 (en) * 2003-07-28 2020-03-25 Genentech, Inc. Reducing protein a leaching during protein a affinity chromatography
US20050026881A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-03 Robinson Cynthia B. Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with an anti-IgE antibody for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US7662928B2 (en) * 2003-08-08 2010-02-16 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-FcRn antibodies for treatment of auto/allo immune conditions
US20050042664A1 (en) 2003-08-22 2005-02-24 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
CA2536408A1 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US7682833B2 (en) 2003-09-10 2010-03-23 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with improved sample closure
US7723099B2 (en) 2003-09-10 2010-05-25 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with immuno-reference electrode
US20060134105A1 (en) * 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
BRPI0415765A (pt) * 2003-10-24 2006-12-26 Medtronic Inc técnicas para tratar desordens neurológicas pela atenuação da produção de mediadores pró-inflamatórios
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
WO2005051295A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-09 Anp Technologies, Inc. Asymmetrically branched polymer conjugates and microarray assays
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
US7691379B2 (en) 2004-04-12 2010-04-06 Medimmune, Llc Anti-IL-9 antibody formulations
JP2007535317A (ja) 2004-04-15 2007-12-06 グライコフィ， インコーポレイテッド 下等真核生物におけるガラクトシル化された糖タンパク質の産生
EP1773881A4 (en) 2004-05-13 2008-08-06 Imclone Systems Inc Inhibition of macrophage-stimulating protein receptor (RON)
WO2006020258A2 (en) 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody
CA2574881C (en) 2004-08-04 2013-01-08 Amgen Inc. Antibodies to dkk-1
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
PL1773885T3 (pl) * 2004-08-05 2010-09-30 Genentech Inc Humanizowani antagoniści anty c-met
CN101052654A (zh) * 2004-08-19 2007-10-10 健泰科生物技术公司 具有改变的效应子功能的多肽变体
GB0419424D0 (en) 2004-09-02 2004-10-06 Viragen Scotland Ltd Transgene optimisation
KR101364276B1 (ko) * 2004-09-03 2014-02-20 제넨테크, 인크. 인간화 항-베타７ 길항제 및 그의 용도
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
US7910100B2 (en) * 2004-10-01 2011-03-22 Max-Planck-Gesellschaft zur Forderung der Wissen Antibodies directed to the mammalian EAG1 ion channel protein
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
NZ554520A (en) * 2004-10-22 2010-03-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
US20060253100A1 (en) 2004-10-22 2006-11-09 Medtronic, Inc. Systems and Methods to Treat Pain Locally
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
PE20061401A1 (es) 2004-12-15 2006-12-23 Neuralab Ltd ANTICUERPOS Aß PARA MEJORAR LA COGNICION
US7973140B2 (en) 2004-12-21 2011-07-05 Medimmune Limited Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
AU2006208286A1 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
KR101335798B1 (ko) 2005-02-15 2013-12-02 듀크 유니버시티 항-ｃｄ19 항체 및 종양학에서 이의 용도
EP1860119B1 (en) * 2005-02-28 2011-08-03 Institute for Antibodies Co., Ltd. ANTI-IgSF4 ANTIBODY AND UTILIZATION OF THE SAME
ES2565481T3 (es) 2005-03-24 2016-04-05 Thrombogenics N.V. Anticuerpo anti-PlGF novedoso
AU2006232920B2 (en) 2005-04-06 2011-09-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US7807159B2 (en) 2005-04-25 2010-10-05 Amgen Fremont Inc. Antibodies to myostatin
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
JP5047947B2 (ja) 2005-05-05 2012-10-10 デューク ユニバーシティ 自己免疫疾患のための抗ｃｄ１９抗体治療
EP1885388B1 (en) 2005-05-10 2013-09-11 Biogen Idec MA Inc. Treating and evaluating inflammatory disorders
WO2006130429A2 (en) 2005-05-27 2006-12-07 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of cancer
PL2460831T3 (pl) 2005-05-27 2017-05-31 Biogen Ma Inc. Przeciwciała wiążące tweak
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
EP1896577A2 (en) 2005-06-24 2008-03-12 Novozymes A/S Lipases for pharmaceutical use
AU2006265002B2 (en) 2005-06-30 2012-09-20 Centocor, Inc. Anti-IL-23 antibodies, compositions, methods and uses
CA2618482C (en) 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US20070041905A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20090215992A1 (en) 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
TWI615407B (zh) * 2005-08-26 2018-02-21 羅齊克雷雅公司 具有經改變細胞傳訊活性之改質抗原結合分子
US7906116B2 (en) * 2005-09-01 2011-03-15 Parkash Gill Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4
EP1933714B1 (en) * 2005-09-21 2020-03-18 The Regents of The University of California Systems and compositions for local imaging and treatment of pain
EP1926752A2 (en) * 2005-09-23 2008-06-04 Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) Antibodies with simultaneous subsite specificities to protein and lipid epitopes
CA2625440C (en) 2005-10-11 2023-06-13 Micromet Ag Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
WO2007048849A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Novo Nordisk A/S Fusion proteins that bind effector lymphocytes and target cells
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
PE20070684A1 (es) 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
EP1957541A2 (en) 2005-11-21 2008-08-20 Laboratoires Serono SA Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
PL2289909T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał
US7939637B2 (en) 2005-12-13 2011-05-10 Medimmune Limited Insulin-like growth factor antibodies and uses thereof
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
AU2007227292B2 (en) * 2006-03-17 2012-04-12 Biogen Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
BRPI0708970A2 (pt) * 2006-03-21 2011-06-21 Wyeth Corp método para o tratamento de um sujeito com uma doença ou transtorno caracterizado por depósito amilóide de a-beta; método de inibição ou redução da acumulação de depósito amilóide de a-beta em um sujeito; método de inibição ou redução da neurodegeneração em um sujeito; e método de inibição ou redução do declìnio cognitivo, ou de melhora da cognição, em um sujeito
US20070232556A1 (en) 2006-03-31 2007-10-04 Montine Thomas J Methods and compositions for the treatment of neurological diseases and disorders
EP2010213A4 (en) 2006-04-10 2010-08-11 Abbott Biotech Ltd USE AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF JUVENIL RHEUMATOID ARTHRITIS
CA2648223A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Novartis Ag Use of il-i antibodies for treating ophthalmic disorders
SMP200800064B (it) 2006-04-21 2009-11-06 Novartis Ag Composizioni farmaceutiche di anticorpi anti-cd40 antagonista
US20080118978A1 (en) * 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
CN101058609B (zh) * 2006-05-26 2011-04-13 神州细胞工程有限公司 人源抗体及其表达
BRPI0712223A2 (pt) * 2006-06-02 2012-07-10 Aveo Pharmaceuticals Inc proteìnas de ligação ao fator de crescimento de hepatócito (hgf)
RU2008152435A (ru) * 2006-06-06 2010-07-20 Дженентек, Инк. (Us) Композиции и способы регулирования развития сосудов
WO2008060705A2 (en) 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008005469A2 (en) * 2006-06-30 2008-01-10 Schering Corporation Igfbp2 biomarker
CL2007002070A1 (es) * 2006-07-14 2008-02-08 Ac Immune S A Genentech Inc Anticuerpo quimerico o humanizado, o fragmentos de ellos, que se adhieren especificamente a por lo menos un epitopo en la proteina beta-amiloide; molecula de acido nucleico que lo codifica; composicion que lo comprende; su uso para tratar enfermedade
US7883855B2 (en) 2006-07-21 2011-02-08 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
AU2007285976B2 (en) 2006-08-14 2011-08-18 Xencor, Inc Optimized antibodies that target CD19
AU2007351514B2 (en) 2006-09-08 2013-02-21 Abbvie Inc. Interleukin -13 binding proteins
EA018260B1 (ru) 2006-09-29 2013-06-28 Онкомед Фармасьютикалз, Инк. Антитела к дельта-подобному лиганду 4 человека и их применение
WO2008057240A2 (en) * 2006-10-27 2008-05-15 Abbott Biotechnology Ltd. Crystalline anti-htnfalpha antibodies
MY157948A (en) * 2006-11-02 2016-08-30 Genentech Inc Humanized anti-factor d antibodies
WO2008079326A2 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
WO2008100995A1 (en) 2007-02-14 2008-08-21 Vaccinex, Inc. Humanized anti-cd100 antibodies
PT2716301T (pt) 2007-02-16 2017-07-04 Merrimack Pharmaceuticals Inc Anticorpos contra erbb3 e suas utilizações
TWI417299B (zh) * 2007-03-22 2013-12-01 Biogen Idec Inc 包括抗體、抗體衍生物及抗體片段之專一性地結合至ｃｄ１５４之結合蛋白及其用途
US7906293B2 (en) 2007-04-09 2011-03-15 Abbott Laboratories Acridinium phenyl esters useful in the analysis of biological
RU2009140134A (ru) * 2007-04-23 2011-05-27 Вайет (Us) Способы и композиции для лечения и мониторинга лечения связанных с ил-13 нарушений
GB0708002D0 (en) * 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
EP2164992B1 (en) 2007-05-30 2016-05-04 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
US8227201B2 (en) * 2007-06-27 2012-07-24 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University BETA2-microglobulin and C reactive protein (CRP) as biomarkers for peripheral artery disease
AU2008282218A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
RU2010107994A (ru) 2007-08-08 2011-09-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Композиции и способы кристаллизации антител
JP5485152B2 (ja) 2007-08-15 2014-05-07 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 単一特異性および多特異性抗体ならびに使用方法
WO2009052400A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian ngal and uses thereof
AU2008337100B2 (en) 2007-12-17 2013-02-28 Pfizer Limited Treatment of interstitial cystitis
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
EP2282769A4 (en) * 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
AU2009245354C1 (en) * 2008-05-09 2016-05-19 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9109026B2 (en) * 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8741287B2 (en) 2008-06-18 2014-06-03 Abbott Laboratories PlGF-1 assay and kits and components thereof
KR20110031369A (ko) * 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2728909A1 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 binding proteins and uses thereof
US9273136B2 (en) 2008-08-04 2016-03-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human anti-human NKG2D monoclonal antibodies
AU2009298499A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Abbvie Inc. Improved method of RNA display
CN102300879A (zh) 2008-12-04 2011-12-28 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CN105254758A (zh) 2009-03-05 2016-01-20 Abbvie公司 Il-17结合蛋白
CN102459347A (zh) 2009-05-01 2012-05-16 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
BRPI1012195A2 (pt) * 2009-05-01 2018-04-24 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
MX2012002651A (es) * 2009-09-01 2012-05-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
UY32920A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis
UY32949A (es) 2009-10-15 2011-02-28 Abbott Lab Proteínas de unión a il-1
PE20121531A1 (es) * 2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011084714A2 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF
CN105037543B (zh) 2010-03-02 2020-11-03 Abbvie 公司 治疗性dll4结合蛋白
CA2803392A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY33492A (es) * 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CN103298834A (zh) * 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CA2809433A1 (en) * 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2816803A1 (en) 2010-11-02 2012-05-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120263722A1 (en) 2010-11-04 2012-10-18 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
RU2014120981A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Иммунные связывающие агенты против склеростина
US20130171059A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2014008102A (es) 2011-12-30 2014-09-25 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual contra receptores.
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
EP2297208A2 (en) 2011-03-23
EP2297208A4 (en) 2012-07-11
ZA201008561B (en) 2016-01-27
RU2010153578A (ru) 2012-07-20
JP2015119711A (ja) 2015-07-02
WO2009149185A2 (en) 2009-12-10
CL2010001425A1 (es) 2011-04-08
KR20110016959A (ko) 2011-02-18
ECSP10010643A (es) 2011-02-28
CO6331348A2 (es) 2011-10-20
AU2009256246A1 (en) 2009-12-10
AR072000A1 (es) 2010-07-28
US20090304693A1 (en) 2009-12-10
US20160032000A1 (en) 2016-02-04
MX2010013236A (es) 2011-02-24
BRPI0913366A2 (pt) 2015-11-24
UY31861A (es) 2010-01-05
NZ589436A (en) 2012-12-21
PE20100054A1 (es) 2010-03-03
TW201006485A (en) 2010-02-16
BRPI0913366A8 (pt) 2017-07-11
IL209490A0 (en) 2011-01-31
CA2725666A1 (en) 2009-12-10
SG191625A1 (en) 2013-07-31
DOP2010000369A (es) 2010-12-31
JP5723769B2 (ja) 2015-05-27
US9109026B2 (en) 2015-08-18
JP2012500621A (ja) 2012-01-12
US20150183867A1 (en) 2015-07-02
AU2009256246B2 (en) 2013-07-18
CN102112494A (zh) 2011-06-29
WO2009149185A3 (en) 2010-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011293253B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010289527C1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2011361720B2 (en) IL-1 -alpha and -beta bispecific dual variable domain immunoglobulins and their use
AU2010310565B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010319850B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2011274515B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256250B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010306677B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256246B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012061374A2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG178148A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2722466A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013219136A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013211542A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013270483A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013206151A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: ABBVIE INC., US

FC2A Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application