KR20040048899A - 재조합 항-오스테오폰틴 항체 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
적어도 중쇄 및 경쇄중 불변부위가 인간-기원 부위로 전환되고 RGD 서열 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는 그의 단편의 결합을 저해할 수 있고, SVVYGLR 서열 부위 또는 그에 상응하는 서열 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는 그의 단편의 결합을 저해하는 항-오스테오폰틴 항체. 이 항체는 자가면역 질환 치료제, 류마티스 치료제 또는 류마티스성 관절염의 치료제로서 유용한 것이며, 자가면역 질병, 류마티스 또는 류마티스성 관절염을 치료하는 방법을 제공한다. 또 이 오스테오폰틴 항체는 류마티스의 진단약 및 진단 방법에도 유용하다.
Description
오스테오폰틴(이하,"OPN"이라 한다)은 뼈에 많이 포함되는 산성의 칼슘 결합성의 당단백질이다. 스플리싱(splicing)의 차이로 인해 3개의 인간 OPN 이소타입, 즉, 오스테오폰틴-a(이하,"OPN-a"이라 한다), 오스테오폰틴-b(이하, "OPN-b"라고 한다) 및 오스테오폰틴-c(이하,"OPN-c"라고 한다)가 자연발생적으로 형성된다고 알려져 있다(Y. Saitoh et al.,(1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63). 이 가운데, OPN-a의 전구체는 후기한 서열목록의 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 가지며, 분비에 의해 시그널 펩티드가 절단되고, I17-N314의 성숙체 OPN-a가 만들어진다고 생각되고 있다. 또 성숙체 OPN은 생체 내의 트롬빈에 의해 168번째의 아르기닌 잔기의 C-말단측에서 절단되어 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 2개가 된다.
상기한 OPN은 다종의 생리학적 병리학적으로 중요한 기능을 담당하고 있다. 예를 들면 세포부착, 세포유주, 종양형성, 면역반응 및 보체매개세포용해의 저해등의 기능을 가지고 있다. 이 다양한 기능은 다종의 세포표면 수용체에 의해 매개되고 있다. OPN은 내부에 RGD 서열을 가지며(예를 들면, OPN-a는 159번째 잔기 ~ 161번째 잔기의 서열을 갖는다), 이 RGD 서열 부위를 인식하는 αVβ3, αVβ1 및 αVβ5 등의 인테그린은 주된 OPN 수용체이며, 이 중, αVβ3, αVβ1 및 αVβ5 인테그린은 혈관의 평활근육 세포에 있어서 세포부착을 매개하고, 더욱이 αVβ3은 대식세포, 림프구, 내피세포 및 평활근육 세포 등의 유주에 관여하고 있다.
그리고 지금까지의 연구에서 OPN은 SVVYGLR 서열을 개입시켜서 α9β1, α4β1 및 α4β7 인테그린과 결합하는 것도 밝혀지고 있지만, 이들 중 α4β1은 트롬빈으로 절단되지 않고 있는 OPN(비절단형 OPN)과 트롬빈으로 절단된 N-말단 단편(절단형 OPN)의 양쪽에 결합하고, α9β1 은 트롬빈 절단형 OPN에만 결합한다는 양식의 차이도 발견되고 있다.(Y. Yokosaki et al.,(1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334 / P.M. Green et al.,(2001): FEBS Letters 503, 75-79 / S.T. Barry et al.,(2000): Experimental Cell Research 258. 342-351). 이들 α9 및 α4, β1 및 β7의 인테그린 서브유니트는 서로 아미노산 서열간의 유사성이 높다. 그리고 α4β1 및 α4β7 인테그린은 주로 림프구와 단구에서 발견되지만, 호중구에서는 극히 적게 발현되고 있는 것에 지나지 않다. 한편, α9β1은 호중구에 선택적으로 고발현하고 있으며, VCAM-1 및 Tenascin-C 등을 매개로 호중구 유주에 필수적인 기능을 담당하고 있다. 또 근육세포나 상피세포, 간세포 등에서 널리 발현하고 있다. 이와 같이 인테그린 서브유니트 α4과 α9의 세포질 도메인은 각각 미묘하게 다른 세포내 시그널 전달경로를 통해서 서로 협동해서 염증 부위로 백혈구의 유주와 응집을 촉진시키고, 그것들의 침윤활성을 증강시키는 것에 의해서 다양한 염증반응에 관여하고 있을 것으로 생각된다.
이와 같이 여러 종류의 인테그린이 백혈구의 유주를 촉진시키고, 염증반응에 관여하고 있다는 점에서 이들의 인테그린 활성을 저해하는 약제는 항-염증제로서의 유효한 유용성을 갖고 있다고 생각된다. 예를 들면 인테그린 αVβ3은 파골세포, 혈관내피세포 및 평활근육 세포 등에서 발현되고 있고, αVβ3 인테그린과 그 여러 가지 결합 리간드의 결합을 저해하는 것에 의해서, 예를 들면 관절에서는 관절파괴 억제 작용을 기대할 수 있다는 점에서 향-αVβ-3항체의 개발이 실제로 이루어지고 있다.
그러나 인테그린 패밀리에 속하는 수용체는 광범위한 조직에서 보편적으로 발현하여 생명활동 유지에 필수적인 기능을 담당하고 있기 때문에, 류마티스성 관절염 및 골관절염의 치료에 인테그린에 대한 항체를 사용하면, 다른 부위에서도 동일한 저해가 발생할 가능성과 부작용의 발생도 걱정된다.
또 WO01/71358에는 α4 인테그린과 오스테오폰틴의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법 및 스크리닝하여 수득된 물질을 사용한 염증 질병의 치료 방법 등에 대해서 개시되어 있다.
류마티스성 관절염의 병인으로서는 여러 인자가 생각되어 많은 보고가 있지만 확실한 것은 없다. 그 치료법에 있어서도 현재 알려져 있는 것은 대증 요법적인 것으로 반드시 만족할 수 있는 것은 아니었다.
따라서 류마티스성 관절염의 병인을 명확하게 하고 보다 우수한 치료법을 제공하는 것이 강하게 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 과제의 해결을 그 목적으로 하는 것이다.
또 류마티스성 관절염은 골관절염 등과 식별하기 어렵기 때문에 이를 위한 진단 방법의 제공도 본 발명의 과제의 하나이다.
본 발명은 항- 오스테오폰틴 항체 및 상기 항체를 사용한 자가면역질병, 류마티스 및 류마티스성 관절염의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 OPN에 대한 RGD 의존성 세포부착의 저해를 나타내는 도면이다.
도 2는 뮤린 항체 2K1에 의한 α9 형질전환 SW480세포와 nOPN의 RGD 의존성 및 RGD 비의존성 세포부착의 저해를 나타내는 도면이다.
도 3a는 OPN-유도 세포유주를 나타내는 도면이다.
도 3b는 항체에 의한 OPN-유도 세포유주 억제를 나타내는 도면이다.
도 4는 OPN 유전자 결핍 마우스와 정상 마우스의 각각에, 관절염 유발 항체 칵테일/LPS를 투여했을 경우의 관절염 스코어의 경시 변화를 나타내는 도면이다.
도 5는 OPN 유전자 결핍 마우스와 정상 마우스의 각각에, 관절염 유발 항체 칵테일/LPS를 투여했을 경우의 손목 부증을 비교한 도면이다.
도 6a는 분석물로서 뮤린 2K1 항체를 사용한 BIACORE-2000 센서 그램을 나타낸다.
도 6b는 분석물로서 키메라성 2K1 항체를 사용한 BIACORE-2000 센서 그램을 나타낸다.
도 7은 뮤린 2K1 항체와 주형 인간 항체의 VH 아미노산 서열을 비교한 도이다.
도 8은 뮤린 2K1 항체와 주형 인간 항체의 VL 아미노산 서열을 비교한 도이다.
도 9는 인간화된 2K1 항체의 VH 아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 그의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도이다.
도 10은 인간화된 2K1 항체의 VL 아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 그의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도이다.
도 11은 인간화된 2K1 항체의 VH 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위한 프라이머를 작제하기 위한 도식이다.
도 12는 인간화된 2K1 항체의 VL 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위한 프라이머를 작제하기 위한 도식이다.
도 13은 다양한 농도의 인간화된 2K1 항체 및 키메라성 2K1 항체의 오스테오폰틴 펩티드에 대한 결합 활성을 나타낸 도이다.
도 14은 뮤린 OPN과 NIH 3T3의 농도 의존적인 부착을 나타내는 도면이다.
도 15은 마우스 OPN과 NIH 3T3의 접착을 GRGDSP 펩타이드가 저해하는 것을 나타낸 도면이다.
도 16은 마우스 OPN과 NIH 3T3의 접착을 항체 M5가 저해하는 것을 나타낸 도면이다.
본 발명을 수행하기 위한 모드
본 발명에 따른 항-오스테오폰틴 키메라성 항체 및 항-오스테오폰틴 인간화 항체는 RGD 서열 부위를 인식하는 인테그린과 OPN 또는 그의 단편의 결합을 저해하며, 또 SVVYGLR 서열 부위 또는 그에 상응하는 서열 부위를 인식하는 인테그린과 OPN 또는 그의 단편의 결합을 저해하는 뮤린 항-오스테오폰틴 항체(이하,"OPN-저해 항체"라고 한다)(국제 출원번호 PCT/JP02/03382에 기술)의 불변 부위를 키메라성 항체(참조 유럽특허 Ep 0 125 023) 및 인간화 항체(참조 유럽특허 EP 0 239 700 또는 EP 045 126)로 유전 공학적으로 변형시켜 생성된 항체가 치료 대상인 인간 또는 동물의 항체의 불변 부위와 동일한 불변 부위를 가질 수 있도록 하여 수득할 수 있다.
각 클래스의 항체 분자는 분자량이 50,000 내지 70,000 달톤인 중쇄 및 분자량이 20,000 내지 30,000 달톤인 경쇄로 구성된 기본 구조를 공유하고 있다. 중쇄는 일반적으로 약 440개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 쇄이다. 각 클래스는 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응하는 γ,μ,α,δ 및 ε쇄로 명명되는 그 각자의 특징적인 구조를 갖는다. 추가로, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로서 분류되고, 이는 각각 γ1, γ2, γ3 또는 γ4로 명명된다. 경쇄의 경우, L 형 및 K형의 두가지 타입이 공지되어 있고, 이들 각각은 각각 λ형 및 κ형으로 명명되는 약 220개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성물은 디설파이드 결합(S-S 결합) 또는 비공유결합을 통해 함께 컨쥬게이트되어 분자량은 150,000 내지 190,000 달톤인 항체를 형성하는 두개의 동등한 중쇄 및 두개의 동등한 경쇄로 구성된다. 2가지 유형의 경쇄 각각은 모든 유형의 중쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 각 항체 분자는 일정하게 동일한 유형의 경쇄 두개 및 동일한 유형의 중쇄 두개로 구성된다.
종쇄는 분자내에서 결합하는 4개의 S-S 결합(μ 및 ε쇄 경우에는 5개의 S-S 결합)을 갖는 반면, 경쇄는 분자내에서 결합하는 2개의 S-S 결합을 갖는다. 100 내지 110개의 아미노산 잔기의 각 부위가 하나의 루프를 형성한다. 각 루프의 입체 구조는 서로 유사하고, 이는 구조 유니트 또는 부위(domain)으로 명명된다. 중쇄 및 경쇄 모두의 N-말단 부위의 아미노산 서열은, 그 부위가 동일한 동물 종의 동일한 클래스(서브클래스)로부터 유래된 경우에도 일치하지 않는다. 따라서, N-말단부위를 가변 부위로 명명한다(V 부위, 가변 부위)(각 부위는 VH및 VL로 명명한다). 각 클래스 또는 각 서브클래스에서 부위으로부터 C-말단측의 아미노산 서열은 일치하지 않는다. 따라서, 이 부위를 불변 부위로 명명한다(C 부위, 불변 부위)(각 부위는 CH1, CH2, CH3 또는 CHL로 명명한다).
항체의 항원결정부위(에피토프)는 VH및 VL로 구성된다. 이 부위의 아미노산 서열에 의해 결합 특이성이 결정된다. 한편, 보체 및 다양한 세포와의 결합을 포함하는 생물학적 활성은 각 Ig 클래스의 C 부위의 구조상의 차이를 반영한다. 경쇄 및 중쇄내 가변 부위의 가변성은 거의 양 쇄에 존재하는 3개의 작은 초-가변 부위(hyper-variable region)으로 한정된다. 이 부위는 상보성결정부위로 명명된다. 가변 부위중 남은 부분은 프레임워크 부위로 명명되고 상대적으로 불변한다. 일반적으로 각 가변부위의 상보성결정부위중 단지 5 내지 10개의 아미노산 잔기만이 항원결정부위를 형성한다.
항원을 인식할 수 있는 마우스형 가변 부위 인간형의 나머지 부위로 구성된 단백질을 키메라성 항체로 명명한다. 추가로, 본 명세서에서는 오스테오폰틴 및 그의 단편을 인식하는 키메라성 항체를 항-오스테오폰틴 키메라성 항체로 명명한다. 추가로, 항원-특이성 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 상보성결정부위(항원결정부위) 및 인간 이뮤노글로블린 분자로부터의 것으로 대체된 모든 다른 나머지 부위로 구성된 유전자 재조합 단백질을 인간화 항체로 명명한다. 또한, 본 명세서에서는 오스테오폰틴 및 그의 단편을 인식하는 인간화 항체를 항-오스테오폰틴 인간화항체로 명명한다.
본 발명에 따른 항-오스테오폰틴 키메라성 항체 및 항-오스테오폰틴 인간화 항체는 RGD 서열을 인식할 수 있는 인테그린, 예를 들면 αvβ1, αvβ3, αvβ5과 오스테오폰틴 이소폼, 예로서 OPN-a, OPN-b, OPN-c 또는 그것들의 N-말단 단편과의 결합을 저해할 수 있고, SVVYGLR 서열을 인식할 수 있는 인테그린, 예를 들면 α9β1, α4β1, α4β7과 오스테오폰틴 이소폼, 예로서 OPN-a, OPN-b, OPN-c 또는 그것들의 N-말단 단편과의 결합을 저해할 수 있는 어는 OPN-저해 항체를 사용하여 만족스럽게 작제할 수 있다. "서열 SVVYGLR 또는 그에 상응하는 서열"에서, 서열 SVVYGLR은 인간 OPN의 162번째의 세린으로부터 168번째의 아르기닌까지의 서열을 의미하고, "그에 상응하는 서열"이란 다른 포유 동물중 하나에서 유래된 OPN에서 SVVYGLR에 상응하는 서열을 의미하며, 예를 들면 돼지로부터의 SVVYGLR, 원숭이로부터의 SVAYGLR, 마우스 및 랫트로부터의 SLAYGLR, 소로부터의 SVAYGLK, 토끼로부터의 SVAYRLK이 인간로부터의 서열과 일치한다.
본 발명의 OPN-저해 항체는 생성된 항체가 상기와 같은 성질을 가지고 있는 항체라면, 어느 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면 OPN-a, OPN-b, OPN-c, 또는 그의 N-말단 단편을 항원으로서 사용하거나, 아미노산 서열 RGDSVVYGLR 또는 그에 상응하는 서열을 포함하고 있는 펩티드(이하, 이것들을 "OPN-관련 펩티드"라고 총칭한다)를 항원으로서 사용하여 제조할 수 있다. 또 여기에서 말하는 OPN의 단편이란 OPN이 프로테아제로 단백질 분해되어 형성된 OPN 단편을 말하며, 예를 들면 트롬빈 단백질 분해에 의해 형성된 단편을 포함한다.
OPN-저해 항체는 항원으로서 RGDSVVYGLR 서열을 포함하는 펩티드에 의해 바람직하게 제조된다. 더욱 바람직하게는 예를 들면 두개의 서열을 연속해서 포함하는, OPN-a의 153번째 발린 잔기로부터 시작하여 169번째 세린 잔기에서 끝나는 두개의 서열을 연속해서 포함하는 펩티드(VDTYDGRGDSVVYGLRS)를 항원으로 사용하고, 이어서, 펩티드를 통상의 방법에 따라서 처리하는 것에 의해 수득할 수 있다. 항원성을 증가시키기 위하여 생체 고분자 화합물에 결합하는 상기 OPN-관련 펩티드를 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
또, 실험 동물로 마우스를 사용하여 OPN에 관련되는 질병 등의 연구를 실시하는 경우는 마우스의 OPN에 대응하는 OPN-저해 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 항체는 바람직하게는 RGDSLAYGLR 서열을 포함하고 있는 펩티드를 항원으로 사용하는 것에 의해 제조된다.
상기 OPN-관련 펩티드에 결합하는 생체 고분자 화합물의 예로는 마그로스키스마(Macroschisma)의 헤모시아닌(이하,"KLH"이라 한다), 난백 알부민(이하, "OVA"이라 한다), 소 혈청 알부민(이하,"BSA"라고 한다), 토끼 혈청 알부민(이하,"RSA"라고 한다), 티로글로불린 등을 들 수 있고, 이 중 KLH 또는 티로글로불린이 더 바람직하다.
OPN-관련 펩티드 및 생체 고분자 화합물은 공지된 방법, 예를 들면 혼합산 무수물법(B. F. Erlanger et al.,(1954): J. Biol. Chem., 234, 1090-1094) 또는 활성화 에스테르법(A. E. Karu et al.,(1994): J. Agric. Food Chem., 42, 301-309)등의 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다.
혼합 산무수물법에서 사용할 수 있는 혼합 산무수물은 OPN-관련 펩티드를 통상의 Schotten-Baumann 반응을 실시하는 것에 의해 수득할 수 있다. 이것을 생체 고분자 화합물과 반응시키는 것에 의해서 목적으로 하는 펩티드-고분자 화합물 결합체가 제조된다. 이 혼합산 무수물법에 있어서 사용되는 할로포르메이트 에스테르로서는 예를 들면 메틸클로로프르메이트, 메틸브로모프로메이트, 에틸클로로프르메이트, 에틸브로모포르메이트, 이소부틸 클로로프로메이트 등이 포함된다. 이해 방법에 있어서의 펩티드, 에스테르할로포르메이트와 고분자 화합물의 사용 비율은 넓은 범위에서 적당하게 선택될 수 있다.
또, Schotten-Baumann 반응은 염기성 화합물의 존재 하에서 이루어지지만, 이 반응에 사용할 수 있는 염기성 화합물로서는 Schotten-Baumann 반응에 관용의 화합물, 예를 들면 트리에틸아민, 트리메틸아민, 피리딘, 디메틸 아닐린, N-메틸몰포린, 디아자비사이클로노넨(DBN), 디아자비사이클로운데센(DBU), 디아자비사이클로옥탄(DABCO) 등의 유기염기, 탄산 칼륨, 탄산 나트륨, 탄산수소 칼륨, 염화수소 나트륨 등의 무기염기 등을 사용할 수 있다.
또 상기 반응은 보통, -20℃~100℃, 바람직하게는 0℃~50℃에 이루어지고, 반응 시간은 5분~10시간 정도, 바람직하게는 5분~2시간이다.
수득된 혼합산 무수물과 생체고분자 화합물의 반응은 보통 -20℃~15O℃, 바람직하게는 0℃~100℃에서 이루어지고, 반응 시간은 5분~10시간 정도, 바람직하게는 5분~5시간이다. 혼합산 무수물법은 일반적으로 용매 중에서 수행되지만, 용매로는 혼합산 무수물법에 관용되고 있는 어떤 용매라도 사용가능하다. 구체적으로는디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등의 할로겐화 탄화수소, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소류, 디에틸에테르, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 디메톡시에탄 등의 에테르류, 아세테이트메틸, 에틸아세테이트 등의 에스테르류, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 헥사메틸인산트리아미드 등의 비프로톤성 극성 용매 등을 들 수 있다.
한편, 활성화 에스테르법은 일반적으로 아래와 같이 실시할 수 있다. 우선, OPN-관련 펩티드를 유기용매에 용해하고, 커플링제의 존재 하에서 N-하이드록시 숙신산 이미드와 반응시켜, N-하이드록시 숙신산 이미드 활성화 에스테르를 생성한다.
커플링제로서는 축합반응에 관용되어 있는 통상의 커플링제를 사용할 수 있다. 예를 들면 디사이클로헥실카보디이미드, 카보닐디이미다졸, 수용성 카보디이미드 등을 들 수 있다. 유기용매로서는 예를 들면 N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드, 디옥산 등을 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 펩티드와 N-하이드록시 숙신산 이미드 등의 커플링제의 몰비는 바람직하게는 1:10∼10:1, 가장 바람직하게는 1:1이다. 반응 온도는 0∼50℃, 바람직하게는 22∼27℃, 반응 시간은 5분∼24시간, 바람직하게는 1∼2시간이다. 반응 온도는 각각의 융점 이상 비점 이하의 온도에서 실시할 수 있다.
커플링 반응 후, 반응액을 생체 고분자 화합물을 용해한 용액에 첨가해 반응시키면, 예를 들면 생체 고분자 화합물이 유리의 아미노기를 가질 경우, 해당 아미노기와 펩티드의 카복실기의 사이에 산아미드 결합이 생성된다. 반응 온도는 0∼60℃, 바람직하게는 5∼40℃, 더욱 바람직하게는 22∼27℃이고, 반응 시간은 5분∼24시간, 바람직하게는 1∼16시간, 더욱 바람직하게는 1∼2시간이다.
상기 방법에 의한 OPN-관련 펩티드와 생체 고분자 화합물의 반응물을 투석, 탈염 칼럼 등에 의해서 정제하는 것에 의해, OPN-관련 펩티드와 생체 고분자 화합물의 결합물(이하, 단순하게 "결합물"이라고 하는 경우가 있다)를 수득할 수 있다.
다음에, 위와 같이 해서 수득된 결합물을 항원으로 사용하는 항체의 제조법 및 이 항체를 사용하는 면역 화학적 측정법에 대해서 설명한다. 또, 항체의 조제시에는 공지의 방법, 예를 들면 속생 화학실험 강좌, 면역생화학연구법(일본생화학회 편)등에 기재된 방법을 적당하게 사용할 수 있다.
상기 결합체를 사용하여 본 발명의 폴리클로날 항체를 제조하기 위해서는 이 결합물로 동물을 면역하고, 이 동물로부터 항체를 모으면 좋다.
즉, 우선, 예를 들면 OPN-관련 펩티드-티로글로불린 결합물 등의 결합물을 인산 나트륨 완충액(이하,"PBS"라고 한다)에 용해하고, 이것과 Freund 완전 어쥬반트 또는 Freund 불완전 어쥬반트 혹은 백반 등의 보조제를 혼합한 것을 면역원으로 사용하여 포유 동물을 면역한다.
면역되는 동물로서는 이 분야에서 상용되는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 말 등을 들 수 있다. 또 면역시의 면역원의 투여법은 피하주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사의 어느 것이라도 좋지만, 피하 주사 또는 복강내 주사가 바람직하다. 면역은 1회 또는 적당한 간격으로 수회, 바람직하게는 1주간 또는 5주 간격으로 여러번 실시할 수 있다. 이어서, 통상의 방법에 따라 면역한 동물로부터 혈액을 모으고, 혈청을 분리하여 폴리클로날 항체 분획을 정제하는 것에 의해, OPN-저해 항체를 수득할 수 있다.
또 통상의 방법에 따라서 상기 결합물로 동물을 면역해서 얻은 면역세포와 골수종세포를 융합시켜서 하이브리도마를 얻고, 이 하이브리도마의 배양물로부터 항체를 모으는 것에 의해서 모노클로날 항체로서 OPN-저해 항체를 얻을 수도 있다.
본 발명에 따른 항-오스테오폰틴 키메라성 항체 및 항-오스테오폰틴 인간화 항체는 상기 기술된 바와 같이 유럽특허공개 공보 EP0125023, 유럽특허공개 공보 EPO239400 및 EP045126 등을 참고하여 모노클로날 OPN-저해 항체 또는 항체-생성 하이브리도마에 기초하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따라, 특히 바람직하게 키메라성 항체 또는 인간화 항체는 WO 94/20632에 기술된 방법에 따라 뮤린 항체로부터 제조된다.
예를 들면 치료의 대상이 인간이고, OPN-저해 항체 생산동물이 마우스인 경우에는 뮤린 항체의 가변 부위가 인간 항체의 불변 부위에 컨쥬게이트된 항체(이하, "키메라성 항체"로 언급함) 및 뮤린 항체의 주로 가변 부위중 상보성결정부위 인간 항체내로 이식하여 제조된 항체(이하, "인간화 항체"로 언급함)이 바람직하게 사용된다. 항체 제조를 위해 추가로, 키메라성 항체 유전자 또는 인간화 항체 유전자가 도입된 마우스와 같은 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법 또는 파지 디스플레이(phage display) 방법이 만족스럽게 사용될 수 있다.
이렇게 하여 수득된 OPN-저해 항체가 실제로 사용될 수 있다. 추가로, OPN-저해 항체는 항체를 구성하고 항원에 대하여 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 쇄로 구성된 경쇄 및/또는 중쇄의 폴리펩티드중 적어도 일부를 갖는 단백질의 형태로도 만족스럽게 사용될 수 있다. 추가로, OPN-저해 항체는 OPN-저해 항체로부터 유래된 항체 단편 형태, 예로서,(scFv), Fab 및 F(ab')2의 형태로 사용될 수도 있다.
구체적으로 뮤린 항체로부터 키메라성 항체를 제조하기 위하여 우선 통상의 방법에 따라 항체-생성 하이브리도마(예: 실시예에 기술된 하이브리도마(FERM BP-7883))로 뮤린 항체의 가변 부위의 유전자를 클로닝하여 뉴클레오티드 서열 및 그에 의해 코딩된 아미노산 서열을 결정한다. 상기 방법에 따라 결정된 뮤린 항체의 가변 부위의 유전자 및 항체의 리더 서열 등을 인간 항체중 적절한 클래스의 불변 부위의 유전자, 바람직하게 IgG 클래스의 항체의 불변 부위의 유전자에 컨쥬게이트하여 키메라성 항체 유전자를 제조한다.
이어서, 키메라성 항체 유전자를 적절한 발현 벡터에 삽입한 후 배양 세포에 도입한다. 최종적으로, 세포를 배양하여 배양 상등액으로부터 키메라성 항체를 수득한다.
뮤린 항체의 리더 서열 및 J 부위에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 뮤린 항체 유전자중 그렇게 결정된 가변 부위를 증폭시켜 상기 유전자의 가변부위를 수반하는 단편으로서 수득한다. 바람직하게, 클로닝을 위한 제한 효소 인식 부위를 상기 유전자의 가변부위를 수반하는 이들 단편의 양 끝에 도입한다.
그렇게 제조된 유전자 단편을 인간 항체의 불변 부위를 수반하는 유전자 단편과 결찰시키고 키메라성 항체 유전자(이하, 간단하게 "키메라성 항체 유전자"로 언급함)를 작제한다. 조합물은 특정의 것으로 제한하지 않고, 최종적으로 항원과의 결합 활성을 만족스럽게 나타낼 수 있는 조합물을 포함한다. 목적에 따라 어느 서브클래스 불변 부위(예를 들면, 중쇄로서 γ1, γ2, γ3 및 γ4의 불변 부위 및 경쇄로서 λ 및 κ 쇄)가 선택될 수 있다. 불변 부위의 기능 강화 또는 축소를 위해 작제된 불변 부위 유전자와의 조합이 만족스러울 수 있다.
그렇게 수득한 키메라성 항체 유전자에 컨쥬게이트되는 발현 벡터로서, WO94/20632에 기술된 AG-γ1 및 AG-κ과 같은 발현 벡터를 사용할 수 있다. 그러나, 키메라성 항체 유전자를 발현시킬 수 있는 어느 벡터라면 족하고 특별히 제한하지 않는다. 키메라성 항체 유전자를 수반하는 발현 벡터를 작제하기 위해서는 뮤린 항체로부터 유래된 가변부위에 대한 단편의 삽입만이 요구되기 때문에 Ig 유전자를 수반하는 발현 벡터 AG-γ1 또는 AG-κ를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
발현 벡터는 예를 들면, 인산칼슘법에 의해 배양 세포로 도입될 수 있다.
그 안에 발현 벡터를 도입시키기 위한 배양 세포로서, 예를 들면, CHO-DG44 세포와 같은 배양 세포가 사용될 수 있고, 통상의 방법에 따라 배양할 수 있다.
배양 후, 배양 배지에 축적된 키메라성 항체를 예로서 단백질 A 칼럼을 사용하여 다양한 형태의 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
그렇게 수득한 키메라성 항체의 항원성을 예로서 오스테오폰틴 펩티드를 사용하는 ELISA 또는 BIAcore(BIAcore K.K.)에 의해 분석할 수 있다.
본 발명에 따라, 추가로 키메라성 항체보다는 인간 항체에 좀 더 가까운 인간화 항체를 하기 기술하는 방법에 따라 제조할 수 있다.
구체적으로, 뮤린 항체로부터 인간화 항체를 제조하기 위하여, 우선 뮤린 항체의 가변 부위중 상보적결정부위(CDR)의 아미노산 잔기를 Kabat 등의 분류법(Immunological Interest 4thed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987)에 따라 결정한다. 주로 뮤린 항체의 가변 부위중 CDR 주위의 아미노산 잔기를 주형 인간 항체에 이식하여 가변 부위에 대한 인간 항체의 프레임워크 및 뮤린 항체의 CDR을 갖는 아미노산 서열을 작제한다. 가변 부위에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 작제하여 PCR 및 유전자 재조합 기술에 의해 작제된 핵산 서열을 갖는 가변 유전자 단편을 제조한다. 이어서, 이 가변 부위 유전자는 인간 항체중 적절한 클래스의 불변 부위의 유전자, 바람직하게 IgG 클래스의 항체의 불변 부위의 유전자에 컨쥬게이트시켜 인간화 항체 유전자 제조한다. 이어서, 인간화 항체 유전자를 배양 세포에 도입하기 위하여 적절한 발현 벡터에 컨쥬게이트시킨다. 최종적으로, 배양 세포를 배양하여 배양 상등액으로부터 인간화 항체를 제조할 수 있다.
상기 기술한 인간화 항체 제조 방법에서, 뮤린 항체의 가변 부위 유전자의 상보성결정부위의 유전자는 상기 키메라성 항체의 제작에 있어 명확하게 된 마우스 항체의 가변영역 유전자로부터 상기한 Kabat 분류에 의해 상보성 결정영역의 범위로부터 결정할 수 있다.
다르게는, 주형 인간 항체의 프레임워크 유전자로서 뮤린 항체의 프레임워크부위중 아미노산 서열과 고도로 상동성인 서열을 예를 들면, 인간 점라인(germline) 항체로부터 선택한다. 이어서, 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 통상의 방법에 따라 제조하고, 이어서 만족스럽게 사용한다.
상기 뮤린 항체의 상보성결정부위 유전자와 주형 인간 항체의 플레임 워크 부위 유전자를 컨쥬게이트하여 키메라성 항체 제조와 같은 방법으로 유전자 단편을 제조한다. 이 유전자 단편과 인간 항체의 불변부위 유전자와 컨쥬게이트하여 인간화 항체 유전자(이하, 인간화 항체 유전자라 함)을 제조한다.
이 인간화 항체 유전자의 제조 후에, 인간화 항체 유전자의 발현 벡터에 도입, 발현 벡터의 배양세포에의 도입, 배양 세포의 배양, 항체의 정제 등에 있어서, 상기 키메라성 항체의 제조과 동일하게 행할 수 있다.
또한 일반적으로 상보성결정부위의 아미노산만이 치환된 인간화 항체의 경우에는 오리지날 뮤린 항체보다도 항원결합활성이 저하된 것이 많다. 여기서, 오리지날 마우스의 항체 및 상보성결정부위 주변의 아미노산의 일부를 결합시켜 이식된 것이 많다. 또한 결합활성의 상승이나 친화성 향상을 위해서, 인간 플레임 워크 부위 뿐만 아니라 가변부위의 아미노산의 변형(1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 등)을 행하는 것도 가능하고, 이와 같이 제조된 항체도 본 발명의 인간화 항체에 포함된다.
주로 뮤린 항체의 상보성결정부위 주위의 아미노산 서열이 키메라성 항체의 제조와 동일한 방식으로 이식된 주형 인간 항체의 가변부위를 발현시키는 유전자를 제조하여 인간화 항체를 수득할 수 있다.
키메라성 항체 및 인간화 항체(이하, 재조합 OPN 저해 항체라 함)은 오리지날 뮤린 항체와 동등한 항원활성을 갖고, 또한 뮤린 항체보다도 항원성의 문제나 반감기의 단축 등의 문제가 해소된 것이다.
이렇게 해서 수득된 OPN-저해 항체는 필요에 의해 더 정제된 후, 통상의 방법에 따라서 제제화되어, 류마티스성 관절염ㆍ연소성 관절 류마티스가나 만성 류마티스 등의 류마티스ㆍ건선성 관절염ㆍ건선 등의 치료, 장기 이식 후의 만성거절 반응억제, 전신성 자가면역질병ㆍ홍반성 루푸스ㆍ포도막염ㆍ베체트병ㆍ다발성 근육염ㆍ증식성 사구체신염ㆍ사르코이드증 등의 자가면역 질병의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 OPN-저해 항체는 바람직하게는 류마티스 치료제 혹은 류마티스성 관절염 치료제로 사용할 수 있다. 이들 류마티스 치료제 등의 제형의 예로는 주사제, 주입제 등의 비경구제로할 수 있고, 정맥내 투여, 피하투여 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다(자가면역질환 치료제로 하는 경우도 이것에 준한다). 또 제제화시에는 약학적으로 허용되는 범위에서 이들 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.
상기 제제화에 있어서는 OPN-저해 항체의 첨가량은 환자의 증상의 정도, 연령이나 사용하는 제제의 제형 혹은 OPN-저해 항체의 결합역가 등에 의해 다르지만, 예를 들면 0.1mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용하는 것이 좋다.
이렇게 하여 수득된 본 발명의 치료제의 유효 성분인 OPN-저해 항체는 OPN의 RGD 서열과 SVVYGLR 서열에 강하게 결합하고, OPN의 이 부분과 인테그린의 결합을 저해함으로써, 결과적으로 류마티스 및 류마티스성 관절염이나 그 이외의 자가면역질병의 증상의 증악을 억제시킬 수 있다고 기대된다.
그리고, 본 발명의 OPN 저해활성은 인테그린측이 아니라 OPN측에 특이적으로 결합하는 것이기 때문에 인테그린의 다른 중요한 기능을 저해할 염려는 적고, 부작용 문제는 회피될 것으로 기대된다.
또 본 발명의 OPN-저해 항체는 자가면역 질환 치료제를 스크리닝하는 목적으로도 사용할 수 있다. 즉, 상기한 바와 같이 OPN의 RGD 서열과 인테그린의 결합 및 SVVYGLR 서열과 인테그린의 결합을 저해하는 화합물은, 자가면역질병의 치료제가 될 수 있다. 그래서 예를 들면 소정량의 OPN과 인테그린이 존재하는 측정계내에 스크리닝해야 할 물질(시험물질)과 OPN-저해 항체를 경합적으로 첨가한 반응계를 구성하고, 사용한 OPN-저해 항체의 량에 대한 OPN-인테그린간의 결합의 저해 정도를 측정하면, 시험 물질의 자가면역 질환 치료제로서의 사용 가능성을 평가할 수 있다.
마찬가지로 OPN의 RGD 서열과 인테그린의 결합 및 SVVYGLR 서열과 인테그린의 결합을 저해하는 화합물은 류마티스 또는 류마티스성 관절염의 치료제가 될 수 있으므로, OPN-저해 항체를 사용하여 상기와 동일한 반응계를 구성하면, 류마티스 또는 류마티스성 관절염의 스크리닝에 사용할 수 있다.
또 본 발명의 OPN-저해 항체는 류마티스 진단제로서 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이 류마티스성 관절염 환자의 관절에서는 특히 트롬빈에 의해 절단된 OPN의 N-말단 단편이 고농도로 발견되고 있는 것이 판명되고 있다. 그러므로 이 OPN-저해 항체를 사용하여 샘플 중의 OPN 또는 그 N-말단 단편의 양을 측정하면, 류마티스의진단에 도움이 될 수 있다. 그 수법으로서는 방사성 동위 원소면역 측정법(RIA법), ELISA법(E. Engvall et al.,(1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439), 형광항체법, 플라크법, 스폿트법, 응집법, Ouchterlony 등의, 일반의 면역 화학적 측정법에서 사용되고 있는 여러 방법("하이브리도마법과 모노클로날 항체", 주식회사 R&D 플랜닝 발행, 제30쪽―제53쪽, 쇼오와 57년 3월5일 )을 사용할 수 있다.
상기 수법은 여러 관점에서 적당하게 선택할 수 있지만, 감도, 간편성 등의 점에서는 ELISA법이 바람직하다. 더 바람직한 방법의 예로는 예를 들면 본 발명의 OPN-저해 항체를 담체상에 고정화시키고, 본 발명의 OPN-저해 항체와는 OPN상의 다른 부위를 인식하는 항체를 표지화하는 것에 의해서, OPN 또는 그 N-말단 단편을 검출할 수 있고, 이것을 류마티스성 관절염의 진단약으로할 수 있다.
상기 항체를 표지하는데 사용되는 표지 물질로는 서양와사비 포옥시다아제(이하,"HRP"라고 한다), 알카리포스파타제(이하,"AP"라고 한다)등의 효소, 플루오레세인이소시아네이트, 로다민 등의 형광물질,32P,125I등의 방사성물질, 화학발광 물질 등을 들 수 있다.
보다 구체적인 OPN 이소폼의 검출 방법에 대해서, 샌드위치법을 예로 들어 그 순서를 설명하면 다음과 같다. 즉, 우선,(a) 본 발명의 OPN 이소폼에 대한 항체를 담체에 고정화시키고, 이어서 (b) 항체가 고정화되지 않은 담체 표면을 항원과 무관한, 예를 들면 단백질에 의해 차단한다. 그리고, (c) 여기에 각종 농도의 OPN 이소폼을 포함하는 샘플을 생서된 혼합물에 첨가하여 OPN 이소폼-항체 복합체를 생성시킨 후,(d) 표지한 항-OPN 이소폼 항체를 첨가하여 고정된 항원-항체 복합체와 결합시켜고, 마지막으로(e) 담체에 결합한 표지양을 측정함으로써, 미리 작성된 검량선에서 샘플중의 유리 OPN 이소폼의 양을 결정할 수 있다.
우선, (a)공정에 있어서, 항체를 고정화하기 위해서 사용할 수 있는 담체로는 특별한 제한은 없고, 면역화학적 측정법에 있어서 상용되는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면 폴리스틸렌제의 96-웰 마이크로타이타플레이트 혹은 아미노기 결합형의 마이크로타이타플레이트를 들 수 있다. 또 항체를 고정화시키기 위해 예를 들면 항체를 포함하는 완충액을 담체상에 첨가하고, 인큐베이션하면 좋다. 완충액으로서는 공지의 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면 10mM의 PBS를 들 수 있다. 완충액 중의 항체의 농도는 넓은 범위로 선택할 수 있지만, 보통 0.01-100㎍/㎖정도, 바람직하게는 0.1-20㎍/㎖이 적합하다. 또 완충액의 양은 담체로서 96 웰 마이크로타이타플레이트를 사용할 경우에는 300㎕/웰 이하, 더욱 바람직하게는 20-150㎕/웰 정도가 바람직하다. 또 인큐베이션의 조건에도 특히 제한은 없지만, 보통 4℃정도에서 하룻밤 인큐베이션이 적합하다.
또 (b)공정의 차단에 대해서는 다음 단계에서 첨가하는 샘플 중의 OPN에는 항원항체 반응과는 무관한 담체에 흡착되는 부분이 존재할 경우가 있으므로 그러한 비특이적 흡착을 방지할 목적으로 실시한다. 차단제로서는 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA)이나 스킴밀크 용액을 사용할 수 있다. 또는 블럭 에이스(ace)("Block-Ace", 다이니폰제약, 코드No. UK-25B)등의 차단제로서 시판되어 있는 것을 사용할 수도 있다. 구체적으로는 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 항원을 고정화한 부분에, 블럭 에이스를 적당량 첨가하고, 약 4℃에서, 하룻밤 인큐베이션한 후, 완충액으로 세정하는 것에 의해서 이루어진다. 완충액으로서는 특히 제한은 없지만, 예를 들면 10mM PBS(pH 7.2), 0.8%(w/v)NaCl, 0.02%(w/v)KCl, 0.02%(v/v) Tween20의 조성의 것이 적합하다.
이어서 (c) 공정에서, OPN 이소폼을 포함하는 샘플을 고정화된 항체와 접촉 시킴으로써, 고정화된 항체로 OPN 이소폼을 포착하여 고정화된 항체-OPN 이소폼 복합체를 생성시킨다. 반응은 한정되는 것은 아니지만, 37℃ 정도에서 약 1시간 실시하면 좋다. 반응 종료 후, 완충액로 담체를 세정하여 미반응의 단백질 등을 제거시킨다. 이 반응에 사용하는 완충액으로서는 10mM PBS(pH 7.2), 0.05%(v/v) Tween20의 조성의 것이 바람직하다.
그리고,(d) 공정에서, 고정화된 항체에 포착된 OPN 이소폼의 다른 에피토프를 인식하는 표지항체를 첨가하고, 고정화된 항체-OPN 이소폼-표지항체 복합체를 형성시킨다. 이 반응 종료 후, 완충액으로 담체를 세정하고, 미반응의 단백질등을 제거시키는 것이 바람직하다. 이 반응에 사용하는 완충액으로서는(c)공정에서 기재한 것이 사용된다.
상기(d)공정에서 사용되는 표지항체는 (a) 공정의 고정화된 항체와 다른 에피토프을 인식하는 것이 요구된다. 예를 들면 고정화된 항체로서 OPN 이소폼의 전반부위를 인식하는 폴리클로날 항체를 사용하는 경우, 효소(예를 들면, HRP 또는 AP등)을 결합한 표지항체로는 OPN 이소폼의 후반 부위를 인식하는 폴리클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 다른 부위를 인식하는 항체를 사용함으로써,선택 스플리싱에 의해 발생하는 OPN 이소폼을 고감도, 또한 특이적으로 측정할 수 있다.
(d) 공정에서 사용되는 표지항체의 량은 담체에 결합한 고정화된 항체에 대하여 약 5,000-10,000배, 바람직하게는 최종 측정시의 최대 흡광도가 1.5-2.0가 되도록 희석한 표지항체를 반응시키는 것이 바람직하다. 희석에는 완충액을 사용하는할 수 있고, 반응은 한정되는 것은 아니지만, 약 37℃에서 약 30분간 실시하고, 반응 후, 완충액으로 세정하는 것이 바람직하다. 이상의 반응에 의해 담체에 항체-OPN 이소폼-표지항체 복합체를 결합할 수 있다.
마지막으로 (e)공정에서, 고정화된 항체-OPN 이소폼-표지항체 복합체의 표지물질과 반응하는 발색 기질용액을 첨가하고, 흡광도를 측정함으로써 검량선에서 OPN의 양을 산출할 수 있다.
표지항체의 표지물로서 효소인 퍼옥시다아제를 사용할 경우에는 예를 들면 과산화 수소와 3,3',5,5'-테트라메틸벤진(TMB) 또는 o-페닐렌디아민(OPD)을 포함하는 발색 기질용액을 사용할 수 있다. 발색반응은 한정되는 것은 아니지만, 발색 기질용액을 첨가하여 약 25℃에서 약 20분간 반응시킨 후, 1N의 황산을 첨가해서 효소반응을 정지시키는 것에 의해 실시할 수 있다. TMB을 사용할 경우, 발색은 450nm의 흡광도에 의해 측정한다. 한편, 표지물로서 효소인 AP을 사용할 경우에는 p-니트로페닐인산(pNPP)을 기질로 하여 발색시키고, 2N의 NaOH를 첨가해서 효소반응을 중지하고, 415nm 에서의 흡광도를 측정하는 방법이 적합하다.
기지의 농도의 OPN 이소폼을 첨가한 반응액의 흡광도에 의해 미리 작성된 검량선을 사용하여 샘플 중의 OPN 이소폼의 농도를 산출할 수 있다.
상기한 본 발명의 OPN 이소폼의 검출 방법은 OPN의 움직임의 해명이나, OPN이 관련되는 질병의 진단, 치료를 위해서 사용되지만, 그 사용 방법의 일례로는 트롬빈에 의해 절단된 OPN의 N-말단 단편과 비절단형 OPN을 구별해서 검출하는 것에 의해, 염증이상의 유무를 검출하고, 예를 들면 류마티스과 골관절염을 구별하는 염증 이상의 검출 키트를 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 류마티스성 관절염 환자의 관절강내에서는 특히 트롬빈에 의해 절단된 OPN의 N-말단 단편이 고농도로 발견되는 경향이 있지만, 골관절염 환자에서는 그러한 경향은 유의가 낮다. 이와 같이 관절강내의 OPN 중에 차지하는 N-말단 단편의 비율이 각각의 환자에서는 다르므로, 류마티스과 골관절염을 구별해서 진단하기 위해서는 OPN 전체 중에 차지하는 N-말단 단편의 비율을 측정할 수 있으면 좋다.
보다 구체적인 예로서는 OPN의 3종의 이소폼, OPN-a, OPN- b 및 OPN-c의 전부에 공통적으로 존재하는 하기 3종의 서열에 대해서, 각각의 펩티드에 대한 항체를 제조한다.
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (1)
(C+V153에서 S169)
KSKKFRRPDIQYPDATDEC (2)
(K170에서 E187+C)
IPVKQADSGSSEEKQC (3)
(I17에서 Q31+C)
이 가운데 서열(1)은 트롬빈 절단 부위의 N-말단측에 존재하고, 트롬빈 비절단형인 전장 OPN과 N-말단측 단편상에서 공통으로 존재한다. 한편, 서열(2)은 트롬빈 절단 부위에서 C-말단측에 존재하고, 트롬빈 비절단형인 전장 OPN에서는 존재하지만, N-말단측 단편에는 포함되지 않는다. 서열(3)은 OPN N-말단측 17번째로부터 31번째까지의 아미노 잔기에 해당하며, 트롬빈 비절단형인 전장 OPN N-말단측 단편에서 공통적으로 존재한다. 류마티스 환자와 골관절염 환자의 구별을 위한 진단 키트는 상기한 3종의 서열의 펩티드 각각에 대한 항체를 사용한 2종류의 면역검출 시약으로 구성할 수 있다. 즉, 첫번째 면역검출 시약으로는 상기한 서열(3) 및(2)로 나타나는 펩티드에 대한 2종의 항체를 사용하여, 샘플 중의 양쪽의 항체에서 공통적으로 인식되는 트롬빈 비절단형 OPN을 정량한다. 이때 예를 들면 서열(3)의 펩티드에 대한 항체를 담체에 고정화시키고 환자로부터의 샘플와 반응시키고, 세정한 후, 표지항체로 서열(2)의 펩티드에 대한 항체를 첨가하여 전술한 샌드위치법과 동일한 방법으로 검출할 수 있다. 두번째의 면역검출 시약으로는 상기한 서열(1) 및(3)으로 나타내지는 펩티드에 대한 2종의 항체를 사용하여, 샘플 중의 양쪽의 항체에서 공통적으로 인식되는 트롬빈 비절단형 OPN과 트롬빈 절단에 의해 생성한 N-말단측 단편을 더한 총량을 정량한다. 이때 예를 들면 서열(1)의 펩티드에 대한 항체를 담체에 고정화시키고, 환자로부터의 샘플와 반응시키고, 세정한 후, 표지항체로 서열(3)의 펩티드에 대한 항체를 첨가해 전술의 샌드위치법과 동일한 방법으로 검출할 수 있다. 그리고 동일한 환자 샘플에 대한 상기 2종류의 면역검출 시약에의한 결과를 비교 대조함으로써, 상기 환자에 있어서의 전체 OPN 중에 차지하는 트롬빈 절단에 의해 생성한 N-말단측 단편의 비율을 확실하게 할 수 있고, 류마티스과 골관절염의 구별이 가능하게 된다.
본 발명자들은 류마티스 환자 및 골관절염 환자에서 관절강액의 OPN 농도가 높은 값을 나타내고, 류마티스 환자에 있어서 전체 OPN에 차지하는 트롬빈 절단형 N-말단 단편의 비율이 증대하는 것을 처음으로 발견하고, OPN이 이것들의 질병의 발병에 깊게 관계하고 있다고 생각하기에 이르렀다. 그리고 후술하는 참고예에서 나타내고 있는 바와 같이 OPN의 녹아웃 마우스를 사용한 실험에 의해 이 사실을 확인하였다.
또 OPN을 트롬빈으로 절단한 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 대해서, 각각의 단편을 구별해서 인식하는 항체를 제조하고, 그것들을 사용한 시험에 의해 류마티스성 관절염 환자에서는 특히 트롬빈에 의해 절단된 N-말단 단편이 관절강 내에서 높은 농도를 나타내고 있는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 류마티스성 관절염 환자에게 높은 농도로 발견되는 N-말단 단편에는 인간형 인테그린이 인식할 수 있는 RGD 서열과 SVVYGLR 서열 부위가 존재하고 있는 사실에 관심을 갖게 되었다. 이어서, 본 발명자들은 이들 양자의 서열을 동시에 차단하는 항체가 OPN과 인테그린의 결합을 폭넓게 저해하여 류마티스성 관절염이나 골관절염의 치료에 효과가 있을 것이라고 예상하였다.
OPN은 신장ㆍ태반ㆍ난소ㆍ뇌ㆍ피부 등에도 분포하지만 주로 뼈 조직에 발현되고 있다. 본 발명자들은 류마티스성 관절염의 치료시에 OPN과 인테그린의 결합을 OPN측에 의해 특이적인 방법으로 차단하는 것이 바람직하다고 생각하였다. 이때 염증에는 전술한 다방면에 걸치는 인테그린이 협동적으로 관여하고 있다고 생각되므로, 이들 다방면에 걸치는 인테그린과의 결합이 보다 폭넓게 차단되는 것이 유효하다고 생각하였다.
그래서 인간 OPN의 RGD 서열 부위와 인테그린의 결합 및 인간 OPN의 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린의 결합을 저해하는 항체를 제조하고, 세포부착 및 세포유주 등의 실험에 의해 그 효과를 확인하였다. 또 마우스 OPN의 해당 내부서열에 해당되는 합성 펩티드에 대한 항체를 취득하고, 마우스의 관절염병의 병태 모델을 사용하여 그러한 항체의 치료약으로서의 효과를 조사하였다.
보다 특히, 마우스 OPN은 인간 OPN과 아미노산 서열상에서 상동한 위치에 마우스의 인테그린에 의해서 인식되는 RGD 서열 및 SLAYGLR 서열을 가지고 있으므로, 이들 서열을 동시에 차단하는 항체로서 M5 항체를 취득하였다. 이 M5 항체와 마우스 OPN 및 그 트롬빈 분해 산물의 결합은 RGD 서열을 포함하는 GRGDSP 펩티드로 저해되며, 또 이 M5 항체는 마우스 지라으로부터의 유래된 TNF-α-활성화된 단구의 유주를 저해하는 것을 확인하였다. 이 M5 항체를 마우스의 두개관 기관배양계로 조사하였더니 뼈 파괴 억제 작용이 관찰되었다. 또 마우스의 콜라겐 관절염 모델에 상기 항체를 투여해 본 바, 확실하게 치료 효과를 나타내고 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과는 RGD 서열, SVVYGLR 서열 부위와 인간형 인테그린의 결합을 동시에 차단할 수 있는 항체가 OPN과 인테그린의 결합을 저해하여 류마티스성 관절염 등의 치료에 유효하다는 것을 강하게 시사하고 있다. 추가로, 상기 결과는 연소성 관절 류마티스나 만성 류마티스 등의 류마티스뿐 만 아니라 건선성 관절염이나 건선 치료에 대하여 가능하게는 유효할 수 있다는 것을 제시한다. 또 장기 이식 후의 만성거절은 혈관이나 기관지의 폐색성 질환과의 합병증을 특징으로 한다. 그 조직학적 검토에서 T세포 및 대식세포의 활성화가 사이토카인, 증식 인자의 생산, 혈관내피세포 장해를 유발하고, 혈관 평활근의 증식이 섬유화 등을 유발시키기 때문에 혈관 폐색에 진전되어 간다고 생각된다(P. Freese et al.,(2001): Nephrol Dial Transplant, 16, 2401-2406 / J.R. Waller et al.,(2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441 / S. R. Lehtonen et al.,(2001): Transplantation, 72, 1138-1144). 그리고 이들의 대식세포의 활성화나 혈관 평활근의 섬유화에는 OPN이 필수적인 단백질로 기능을 하고 있다는 것이 보고되고 있고(A.O'Regan et al.,(2000): Int J Exp Pathol, 81, 373-390), 본 발명의 OPN-저해 항체는 단구나 호중구의 유주를 억제함으로써, 이러한 섬유화를 향한 과정을 억제할 가능성이 있다. 따라서 장기 이식 후의 만성 거절반응을 억제하고, 장기 유착에 기여하며 또 전신성 자가면역질병, 홍반성 루푸스, 포도막염, 베체트병, 다발성 근육염, 증식성 사구체신염, 사르코이드증 등의 자가면역 질병의 치료에 대한 효과가 기대된다.
본 발명에 기초하여, 본 발명자들은 아미노산 서열 RGD 부위를 인식하는 인테그린과 OPN 또는 그의 단편의 결합을 저해할 수 있고, 또한 아미노산 서열 SVVYGLR 또는 그에 상응하는 서열 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는그의 단편의 결합을 폭넓게 저해하는 항-오스테오폰틴 항체를 발견하였다. 본 발명자들은 상기 항체에 대하여 국제출원(PCT/JP02/03382)하였다.
발명의 개시
항-오스테오폰틴 항체는 마우스(이하, "뮤린 항체"로 언급함)로부터 유래된 항체이고 인간 오스테오폰틴과 높은 수준의 친화성을 가지며, 오스테오폰틴의 말초혈 단핵구 또는 호중구 유주 활성을 저해한다. 따라서, 뮤린 항체가 주로 인간 류마티스를 포함하는 다양한 염증성 질환의 치료제로서 사용될 수 있음이 기대된다. 그러나, 마우스-유래 항체를 사용하는 한, 뮤린 항체를 인간에 투여하는 것은 항원성 유도와 같은 안전성 프로파일 및 반감기 단축과 같은 유효성과 관련하여 난점을 갖고 있다.
따라서, 본 발명자들은 그의 활성은 감소시키지 않으면서 유전자 조작 방법으로 뮤린 항체를 변형시킴으로써 최종적으로 다소 덜 불리한 항원성을 갖는 항체를 얻게 되었다.
즉, 본 발명자들은 하기 [1] 내지 [45]의 발명을 제공한다.
[1] 아미노산 서열 RGD 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는 그의 단편의 결합을 저해할 수 있고, 아미노산 서열 SVVYGLR 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는 그의 단편의 결합을 저해할 수 있는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편.
[2] [1]에 있어서, 항원으로서 부분 아미노산 서열 RGDSVVYGLRS를 포함하는 펩티드를 사용하여 수득되는 항-오스테오폰틴 항체.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 항원으로서 펩티드 VDTYDGRGDSVVYGLRS에 대하여 수득되는 항-오스테오폰틴 항체.
[4] [1] 내지 [3]중 어느 하나에 있어서, 모노클로날 항체인 항-오스테오폰틴 항체.
[5] [1] 내지 [3]중 어느 하나에 있어서, 키메라성 항체인 항-오스테오폰틴 항체.
[6] [5]에 있어서,
(a) 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 중쇄 불변부위를 포함하는 중쇄; 및
(b) 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 경쇄 불변부위를 포함하는 경쇄를 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
[7] [5] 또는 [6]에 있어서, 중쇄 (a)에서 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위가 서열 번호: 19로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
[8] [5] 또는 [6]에 있어서, 경쇄 (b)에서 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위가 서열 번호: 20으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
[9] [5] 또는 [6]에 있어서, 중쇄 (a)에서 중쇄 불변 부위가 인간 Igγ1인 항-오스테오폰틴 항체.
[10] [5] 또는 [6]에 있어서, 경쇄 (b)에서 경쇄 불변 부위가 인간 Igκ인 항-오스테오폰틴 항체.
[11] [1] 내지 [3]중 어느 하나에 있어서, 인간화 항체인 항-오스테오폰틴항체.
[12] [11]에 있어서,
(c) 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위로부터 유래된 상보성결정부위 및 인간으로부터 유래된 중쇄 가변 부위로부터 유래된 프레임워크 부위를 포함하는 중쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 중쇄 불변 부위를 포함하는 중쇄
(d) 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위로부터 유래된 상보성결정부위 및 인간으로부터 유래된 경쇄 가변 부위로부터 유래된 프레임워크 부위를 포함하는 경쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 경쇄 불변 부위를 포함하는 경쇄를 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
[13]. [11] 또는 [12]에 있어서, 중쇄 (c)에서 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위중 상보성결정부위가 서열번호 21 내지 23으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
[14]. [11] 또는 [12]에 있어서, 경쇄 (d)에서 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위중 상보성결정부위가 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
[15]. [11] 또는 [12]에 있어서, 중쇄 (c)에서 중쇄 가변 부위가 서열번호 28로 기술된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
[16]. [11] 또는 [12]에 있어서, 경쇄 (d)에서 중쇄 가변 부위가 서열번호 30으로 기술된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
[17] [11] 또는 [12]에 있어서, 중쇄 (c)에서 중쇄 불변 부위가 인간 Igγ1인 항-오스테오폰틴 항체.
[18] [11] 또는 [12]에 있어서, 경쇄 (d)에서 경쇄 불변 부위가 인간 Igκ인 항-오스테오폰틴 항체.
[19] 서열번호 19로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
[20] 서열번호 20으로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
[21] 서열번호 28로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
[22] 서열번호 30으로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
[23] [19]의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igγ1 유전자 서열을 포함하는 벡터.
[24] [20]의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igκ 유전자 서열을 포함하는 벡터.
[25] [21]의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igγ1 유전자 서열을 포함하는 벡터.
[26] [22]의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igκ 유전자 서열을 포함하는 벡터.
[27] [23] 및 [24]의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
[28] [25] 및 [26]의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
[29] [27]의 숙주 세포를 배양하고 액체 배양물로부터 항-오스테오폰틴 키메라성 항체를 회수하는 단계를 포함하는, [5] 또는 [6]의 항-오스테오폰틴 키메라성 항체를 제조하는 방법.
[30] [28]의 숙주 세포를 배양하고 액체 배양물로부터 항-오스테오폰틴 인간화 항체를 회수하는 단계를 포함하는, [11] 또는 [12]의 항-오스테오폰틴 인간화항체를 제조하는 방법.
[31] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 자가면역 질환 치료제.
[32] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 류마티스 치료제.
[33] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료제.
[34] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 골다공증 치료제.
[35] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 자가면역 질환 환자에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질병의 치료 방법.
[36] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 류마티스 환자에게 투여하는 것을 포함하는 류마티스 치료 방법.
[37] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 류마티스 관절염 환자에게 투여하는 것을 포함하는 류마티스 관절염 치료 방법.
[38] [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 골다공증 환자에게 투여하는 것을 포함하는 골다공증 치료 방법.
[39] 자가면역 질환 치료제의 제조를 위한 [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편의 용도.
[40] 류마티스 치료제의 제조를 위한 [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편의 용도.
[41] 류마티스 관절염 치료제의 제조를 위한 [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편의 용도.
[42] 골다공증 치료제의 제조를 위한 [1] 내지 [6]중 어느 하나, 또는 [11] 또는 [12]의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편의 용도.
[43] 시험 화합물이 오스테오폰틴의 RGD 서열 부위과 인테그린 사이의 결합 및/또는 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린 사이의 결합을 저해하는 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는, 자가면역 질환 치료제 스크리닝 방법.
[44] 시험 화합물이 오스테오폰틴의 RGD 서열 부위과 인테그린 사이의 결합 및/또는 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린 사이의 결합을 저해하는 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 치료제 스크리닝 방법.
[45] 시험 화합물이 오스테오폰틴의 RGD 서열 부위과 인테그린 사이의 결합 및/또는 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린 사이의 결합을 저해하는 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 치료제 스크리닝 방법.
다음에 실시예 및 참고예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예 등에 의해 제약을 받는 것은 아니다. 본 명세서중 이들 실시예에서, 달리 언급하지 않는 한, 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약을 사용하는 시험은 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예 1
GST-OPN 융합 단백질의 클로닝, 작제, 정제 및 시약:
클로닝 및 단백질 정제에 대해서는 기본적으로, 문헌(S. Kon et al.,(2000): J. Cell. Bio chem., 77, 487-498)에 기재된 방법을 따랐다.
인간 OPN의 이소폼, 즉, OPN-a 및 OPN-b에 대한 cDNA를 다음과 같이 해서 얻었다. 인간 신장암 세포주인 NRC-12세포로부터 제조된된 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하고, 그것을 주형으로 하여 하기 OPN-5, OPN-3프라이머를 사용해서 PCR을 실시하는 것에 의해, 각각 시그널 펩티드 부위를 포함하는 인간 OPN-a, OPN- b의 전장을 코딩하는 cDNA를 얻었다.
다음에 상기 문헌에 기재한 바와 같이, 이렇게 하여 클로닝한 OPN-a, OPN-b cDNA를, pGEX4T벡터(Amersham Pharmacia Biotech,Tokyo, Japan)에 GST(글루타티온S-트랜스페라아제, EC2.5.1.18)유전자와 동일한 리딩 프레임이 되도록 삽입하고, 대장균 JM109을 사용해서 GST 융합 단백질로 하여 발현시켰다(이하, 이렇게 하여 수득된 GST-OPN융합 단백질을, 각각,"GST-OPN-a","GST-OPN-b "라고 한다).
OPN-5:
5'-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3'
OPN-3:
5'-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3'
인간 OPN-c 이소폼을 코딩하는 cDNA에 대해서는 상기한 OPN-a cDNA를 주형으로 하여 2단계 PCR에 의해 제조하였다. 1단계째는 OPN-5과 하기의 OPNct-3프라이머, 하기의 OPNct-5와 OPN-3프라이머로 각각 PCR을 실시하고, 두개의 PCR 산물을 섞어 열을 가하고 서서히 냉각시키는 것에 의해 어닐링시키고, 효소를 첨가해서 신장시켰다. 이어서 2단계째로서, OPN-5과 OPN-3프라이머로 PCR을 수행하는 것에 의해 시그널 펩티드 부위를 포함하는 인간 OPN-c의 전장을 코딩하는 cDNA를 얻었다. 이 이소폼 c의 cDNA는 이소폼 a 및 b와 동일한 방법으로 pGEX4T벡터로 재조합하여, GST 융합 단백질을 제조하였다(이후,"GST-OPN-c"라고 한다).
OPNct-3 :
5'-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC -3'
OPNct-
5: 5'-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3'
OPN-a의 트롬빈 절단부위에서 아미노 말단측 절반(Ml-R168)을 코딩하는 cDNA는 상기한 OPN-a cDNA를 주형으로 하여, OPN-5과 하기의 OPNnh-3프라이머를 사용해서 PCR을 수행하는 것에 의해서 수득되었다. 이소폼 a 및 b와 동일한 방법으로 pGEX4T벡터로 재조합시키고, GST 단백질을 작제하였다(이후,"GST-N half"라고 한다).
OPNnh-3: 5'-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3'
OPN-a의 트롬빈 절단부위에서 카복실기측의 오스테오폰틴 단백질(hOPN C half)은, 2단계 PCR에 의해 OPN-a cDNA를 주형으로 하여 제조하였다. 1단계째는 OPN-5, 하기의 OPNch-3프라이머, 하기의 OPNch-5와 OPN-3프라이머로 각각 PCR을 실시하였다. 2단계째는 OPN-5와 OPN-3프라이머로 PCR을 실시하는 것에 의해 카복실기측 OPN단백질을 제조하였다. 이소폼a, b와 동일한 방법으로 pGEX4T벡터로 재조합하여, GST 단백질을 제조한다(이후,"GST-C half"라고 한다).
OPNch-3: 5'-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3'
OPNch-5: 5'-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3'
여러 종류의 재조합 GST-OPN 융합 단백질은 통상의 방법에 따라서 대장균으로 조제하고, 상기 문헌에서 말한 방법에 의해 글루타티온-세파로즈칼럼을 사용하여 정제하였다. 이 중, GST-N hal f단백질에 대해서는 연결 부분을 PreScissionㆍ프로테아제(PreScission; Amersham Pharmacia Biotech 사)으로 절단시키는 것에 의해, GST 단백질 부분을 제거하고, OPN의 아미노 말단측 절반(I17-R168)만으로 구성되는 단백질(이하,"nOPN"라고 한다)을 수득하였다.
한편, OPN-a의 전체 길이(M1-N314)을 코딩하는 cDNA에 대해서는 추가로,pCDNA3.1(+)벡터(인비트로겐사)에 삽입하고, CHO-K1 세포(다이니폰제약(주)사제)에 트랜스펙트하였다(이하,"CHO/OPN-a세포"라고 한다). 이 세포에서 수득된 당쇄 결합형의 OPN-a(이하,"CHO/OPN-a"라고 한다)에 대해서는 아래와 같이 해서 정제하였다. 즉 CHO/OPN―a세포의 배양 상층액을 DEAE-세파로즈 CL-6B칼럼(Amersham Pharmacia Biotech사)을 사용한 이온교환 크로마토그래피, ULTROGEL AcA44칼럼(BioSepra SA사)을 사용한 겔여과 크로마토그래피를 수행하고, 이것에 이어서 RESOURCE RPC칼럼(Amersham Pharmacia Biotech사)에서의 역상 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
면역감작이나 결합의 연구에 사용한 여러 종류의 펩티드는 시그마ㆍ게노시스ㆍ재팬사에서 입수하고, 혹은 펩티드 합성기(모델 432A, 파킨엘마라이프사이엔스사)에서 Fmoc(N-(9-플루오레닐)메톡시카보닐)법에 의해 화학 합성한 후, C18역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하는 하는 것에 수득하였다.
실시예 2
모노클로날 항체의 제조:
아래에 나타내는 바와 같은 인간 OPN의 내부서열에 대응하는 합성 펩티드를 준비하고, 면역에 사용하였다.
펩티드1: CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C+V153에서 S169)
펩티드2: CIDSQELSKVSREFHSH (C+I261에서 H276)
이 가운데, 펩티드1은 각각 αvβ3과 α9β1 인테그린 수용체를 인식하는 RGD와 SVVYGLR 서열을 갖는다.
이들 펩티드를 티로글로불린과 결합시키고, 통상의 방법에 따라서 마우스의 면역에 사용하였다. 계속해서, 면역된 마우스로부터 비장세포(splenocytes)를 분리하고, 폴리에틸렌글리콜을 사용해서 마우스 골수종 세포 P3-X63-Ag8-653과 세포융합을 수행하였다. 그리고 문헌(M. Kinebuchi et al.,(1991): I. Imlunol., 146, 3721-3728)에 기재된 방법에 의해, 면역에 사용한 펩티드에 반응하는 하이브리도마를 선택하였다.
펩티드 1 및 2에서 면역한 마우스로부터, 각각 2K1 및 4C1이라고 명명한 모노클로날 항체를 얻었다. 또, 모노클로날 항체 2K1을 생산하는 하이브리도마에 대해서, 2001년 6월20일자로 독립 행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켄 305-8566 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 에이아이에스티 츠쿠바 센트랄 6)에 FERM BP-7883로서 기탁하였다. 또, 모노클로날 항체53(mAb53)은, 전장 재조합 인간 OPN으로 면역하는 것에 의해 수득된 것이다(D. S. Bautista et al.,(1994): J. Biol. Chem., 269, 23280-23285).
실시예 3
OPN 및 그의 트롬빈 분해 산물과 모노클로날 항체의 반응성:
실시예 2에서 수득된 모노클로날 항체 2K1 및 4C1의 OPN 및 그 트롬빈 분해 산물에 대한 결합능을 웨스턴 블롯법을 사용해서 시험하였다. 2K1 항체는 GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c 및 GST-N half와 반응하는 것을 알 수 있었다. 또, 4C1항체는 GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c 및 GST-Chalf와 반응하는 것을 알 수 있었다. 또한 이들 모노클로날 항체는 대장균에서 생산한 당쇄 비결합형의 재조합 OPN과 결합할 뿐만 아니라, 당쇄 결합형 CHO/OPN-a 단백질 및 그 트롬빈 분해 산물(이하,"트롬빈 절단OPN"라고 한다)과도 반응하였다.
실시예 4
모노클로날 항체에 의한 OPN에 대한 세포부착의 저해:
모노클로날 항체가 OPN에 대한 세포의 부착을 저해할 것인가 아닌가를 이하 의 방법으로 조사하였다. 우선, 96 웰 플레이트를, 4℃에서 하룻밤, 여러 농도의 CHO/OPN-a으로 프리코팅하고, 이어서 10분간, 37℃의 조건에서 0.5% BSA의 PBS에 의해 비특이적 부착을 차단하기 위한 처리를 실시하였다. 인간 선섬유아세포 TIG-7 또는 인테그린 α9 서브유니트 cDNA으로 형질전환한 SW480세포(이하,"α9 형질전환 SW480세포"라고 한다)를 0.25% BSA를 포함하는 D-MEM에 현탁시키고, 세포현탁액(세포농도는 5×104세포/웰) 200㎕을, 여러 농도의 모노클로날 항체 또는 합성 펩티드의 존재 또는 비존재 하에서 CHO/OPN-a 또는 nOPN으로 프리코팅한 96 웰 플레이트에 주입하고, 1시간, 37℃에서 배양하였다.
배지를 플레이트에서 제거하고, 모든 웰을 0.25% BSA를 포함하는 D-MEM으로 2회 세정하였다. 부착한 세포는 고정시키고, 20% 메탄올 중의 0.5% 크리스탈바이오레트로 30분간 염색하였다.
모든 웰은 물로 3회 헹구고, 부착한 세포는 20% 아세테이트에 의해 용해시켰다. 각 웰로부터 수득된 생성된 상층액을 Immuno Reader로 분석하고, 590nm의 흡수를 웰에 부착한 세포의 상대적 수를 구하기 위해서 측정하였다. 모든 분석은 3회실시하고 적어도 3가지의 독립된 실험을 실시하였다. 제시되는 값은 적어도 3가지의 별도의 실험의 평균이다.
TIG-7은 OPN에 잘 부착하는 것으로 알려져 있지만, 도 1의 A에 나타나 있는 바와 같이 이 부착은 분명하게 GRGDSP 펩티드(100㎍/㎖)로 저해되며,
컨트롤 펩티드(OPN-C-말단 부분인 K296-N314)(100㎍/㎖)로 저해되지 않으므로, RGD 의존이다. 또 도1의 B에 나타나 있는 바와 같이 200㎍/㎖의 2K1 항체는 OPN에 대한 세포부착을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 또, 도 1의 C에 나타나 있는 바와 같이 2K1의 세포부착 저해효과는 mAb53이 제시하는 것에 필적하며, 농도의존적이다. 또, 2K1 및 mAb53은, TIG―7세포의 비트로넥틴(VN)이나 피브로넥틴(FN)에의 부착은 저해하지 않는다.
도 2는 nOPN 및 비트로넥틴과 α9 형질전환 SW480세포와의 부착에 대한 모노클로날 항체의 저해를 제시한 도면이다. 도 2의 A에 나타나 있는 바와 같이 1㎍/㎖의 비트로넥틴과 α9 형질전환 SW480세포와의 부착은 200μM의 GRGDSP 펩티드(RGD)로 저해된다는 점에서 RGD 의존이다. 3㎍/㎖의 nOPN에 대한 α9 형질전환 SW480세포의 부착은, 200μM의 GRGDSP 펩티드(RGD)와 항-α9β1 모노클로날 항체인 Y9A2(A. Wang et al.,(1996): Am. I. Respir. Cell Mol. Biol., 15, 664-672)를 병용하는 것에 의해 저해된다는 점에서 RGD 의존 및 비의존성의 부착이다. 또 도 2의 B는 α9 형질전환 SW480세포와 nOPN 및 비트로넥틴의 부착에 대한 2K1의 영향을 제시하고 있다. α9 형질전환 SW480세포와 비트로넥틴의 부착은, 2K1에 의해 저해되지 않지만, nOPN과의 부착은 2K1에 의해 저해된다. 이 결과 2K1은 RGD 의존성의 부착 저해능을 가지고 있다는 사실이 판명되었다.
실시예 5
모노클로날 항체에 의한 OPN-유도 단구유주의 저해:
U937세포를 사용한 세포유주 시험은 ChemoTx101-8시스템(뉴프로브사)을 사용하여 실시하였다. 세포는 0.1% BSA를 포함하는 D-MEM에서 2×106/ml이 되도록 조정하고, 필터(구멍 직경 8㎛)의 상층에 첨가하고, 하층에는 OPN단백질을 첨가하였다.
ChemoTx 플레이트는 37℃, 5% CO2존재 하에서 4시간 정치하였다. 정치후, 필터를 메탄올로 고정하고, 헤마톡실린 및 에오신(H-E)으로 염색하였다. 필터의 이면까지 유주한 세포수를 현미경 하, 배율 400배로 산정하였다. 시험은 3회 실시하고, 그 평균을 데이터로 하였다. 이 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3a는 표시된 농도에 있어서의, CHO/OPN-a, 트롬빈 절단 OPN 및 GST-Nha1f에 대한 U937세포의 세포 유주를 나타낸다. 도 3b는 50㎍/㎖의 항원 특이 정제된 2K1, mAb53 또는 컨트롤인 마우스 IgG의 존재 또는 비존재하에 1O㎍/㎖의 각 OPN을 사용한 저해 분석이다.
도3a 및 도3b에 나타나 있는 바와 같이, CHO/OPN-a, 트롬빈 절단OPN 및 GST-N half는 인간 단구세포 U937의 유주를 농도 의존적으로 유도하는(A). 2K1 항체는 CHO/OPN-a, 트롬빈 절단 OPN 및 OGST-N half에 의해 유도된 단구세포 유주를 분명하게 저해한다. 이에 대하여 mAb53은 전장 OPN에 의해 유도된 단구세포 유주를 저해할 뿐이다(B).
참고예 1
OPN과 관절염 유발:
관절염에 있어서의 OPN의 움직임을 밝히기 위해서, 통상의 방법에 따라서 O PN유전자 결핍 마우스(S. R. Rittling et al.,(1998): J. Bone Manner. Res., 13(7), 1101-1111)를 인공적으로 제조하고, 정상 서열마우스와 비교 실험을 실시하였다.
OPN 유전자 결핍 마우스(OPN-/-)과 정상 마우스(OPN+/+)의 각각에, 관절염을 유발하는 약제로서 시판되고 있는 관절염 유발용 모노클로날 항체 칵테일(상품명:관절염용 칵테일, Arthrogen-CIA(R)RmAb, Arthritogenic mAb cocktail, 이와이화학약품사)을 사용하고, 제품 첨부 서류에 따라 투여하여 관절염을 유발시키고 그 정도를 관찰하였다. 컨트롤로서는 양쪽 마우스에 생리식염수를 투여한 것을 사용하였다.
관절염의 정도는 하기에 따른 관절염 스코어와 투여 10일 후의 리스트의 부증으로 비교하였다. 이 결과를 도 4 및 도 5에 나타낸다.
도 4에 분명하게 나타나 있는 바와 같이, 관절염용 칵테일/리포포리사카라이드(이하,"LPS"라고 한다)가 투여된 정상 마우스에서는 4일째부터 관절염 스코어가 상승하고, 10일째에서 최고(12이상)에 도달하였다. 이에 비해서 OPN 유전자결핍 마우스에서는 5일째부터 관절염 스코어는 상승하였지만, 최고에서도 4이하였다. 그리고 생리식염수를 투여한 군에서는 전부에서 관절염 스코어의 상승을 볼 수 없었다.
실시예 6
2K1항체의 인간 말초혈 백혈구 유주에 대한 저해활성:
하기 방법에 의해 2K1항체의 사이토카인 활성화 인간 말초혈 백혈구 유주에 대한 저해활성을 조사하였다. 호중구 유주 저해활성에 관한 결과를 표1에, 단구 유주 저해활성에 관한 결과를 표 2에 각각 나타낸다.
<실험방법>
건강한 정상 인간 말초혈로부터 Ficoll법으로 단구면분과 호중구면분을 분리한다(PM. Daftarian et al.,(1996): Journal of Immunology, 157, 12-20). 단구는 Ficoll과 혈청의 중간층을 모으고, 플라스코에서 37℃에서 1시간 배양한 후에 부착한 세포를 사용하였다. 단구면분을 모은 나머지의 적혈구층에 3% 덱스트란-PBS를 5배량 첨가하고 적혈구를 응집시키고나서, 150×g, 4℃에서 5분간 원심하였다
응집한 적혈구가 침전하고, 상층액에는 호중구가 현탁 상태로 존재하므로, 이 분획을 500×g, 실온에서 20분간 원심하면 호중구를 얻을 수 있었다. 이와 같이 하여 수득된 단구와 호중구를 인간 TNF-a(20ng/mL)로 하룻밤 배양시키고, 활성화한 것을 유주실험에 사용하였다.
유주실험은 48-웰 마이크로케모탁시스 챔버(microchemotaxis chamber)(Neuro Probe Inc.제)를 사용하여 실시하였다. 트롬빈 절단 OPN에 2K1항체를 여러 농도로 첨가한 것을 미리 37℃에서 15분간 방치한 후, 하부 챔버(Lower chamber)에 첨가한다(인간 OPN 최종농도는 10㎍/㎖). 그 위에서 폴리카보네이트 필터(구멍 직경 5㎛)을 싣고, 추가로 상부 챔버(Upper chamber)에 50㎕의 세포현탁액(2×106세포/㎖)을 가하였다.
37℃, 5% CO2존재하에서 2시간 배양한 후 폴리카보네이트 필터를 떼어내고, 필터 상측 표면의 세포를 제거하고나서, 필터의 뒤쪽에 침윤한 세포를 Diff-Quick(Baxter사제)으로 염색하였다. 염색한 세포 수를 40배의 배율 하에서 계측하였다. 이 결과는 6웰의 평균 세포수(cells/mm3)±SD로 나타냈다.
<실험결과>
호중구유주저해:
표 1
| 트롬빈 절단 OPN농도(㎍/㎕) | 2K1 농도(㎍/㎕) | 1㎣당 평균유주세포수 |
| 0 | 0 | 400.0 ± 67.8** |
| 10 | 0 | 581.7 ± 67.1 |
| 10 | 0.4 | 566.7 ± 60.2 |
| 10 | 2 | 550.0 ± 49.0 |
| 10 | 10 | 450.0 ± 90.8** |
| 10 | 50 | 426.7 ± 30.8** |
** P <0.01(일원 AN0VA, Dunnett 테스트)
단구유주저해:
표 2
| 트롬빈 절단 OPN농도(㎍/㎕) | 2K1 농도(㎍/㎕) | 1㎣당 평균유주세포수 |
| 0 | 0 | 58.3 ± 50.8** |
| 10 | 0 | 285.0 ± 49.3 |
| 10 | 0.4 | 258.0 ± 71.9 |
| 10 | 2 | 256.7 ± 66.5 |
| 10 | 10 | 160.0 ± 56.9** |
| 10 | 50 | 75.0 ± 55.4** |
** P < 0.01(일원 ANOVA, Dunnett 테스트)
실시예 7
키메라 2K1 항체-발현 플라스미드 제조:
WO94/20632에 기술된 항-HIV 모노클로날 항체(C25 항체)의 키메라성 항체를 제조하는 방법에 따라, 실시예 2에서 수득한 바와 같이, 뮤린 2K1 항체의 중쇄 가변 부위(VH)의 유전자를 인간 Igγ1 유전자와 컨쥬게이트시키고, 그의 경쇄 가변 부위(VL)의 유전자를 인간 Igκ과 컨쥬게이트시켜 마우스-인간 키메라성 2K1 항체(종종,"키메라성 2K1 항체" 또는 "C2K1 항체"로 언급함)를 제조하였다.
먼저, ISOGE 시약(Nippon Gene)을 사용하여 뮤린 2K1 항체를 생산하는 하이브리도마의 mRNA를 추축하였다. 주형으로서 mRNA를 사용하여, pd(N)6 랜덤 헥사머 및 레디-투-고 유-프라임 퍼스트-스트랜드 비드(Ready-To-Go You-Prime First-Strand Bead)(둘 모두 Amersham Pharmacia Biotech사)를 사용하여 cDNA를 합성적으로 제조하였다.
연속하여 주형으로서의 cDNA 및 뮤린 2K1 항체의 VH 유전자의 리더 서열에 상응하는 프라이머 및 Kabat 등의 V 부위 및 J 부위의 핵산 서열 분류법(Immunological Interest 4thed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987)에 따라 작제된 바와 같은 하기의 VH 유전자의 J 부위에 상응하는 프라이머를 사용하여, VH 부위를 Ex Taq DNA 폴리머라제(TAKARA SHUZO.CO. LTD.)를 사용하여 증폭시켰다.
리더 서열에 대한 프라이머(VH)
J 부위에 대한 프라이머(VH)
리더 서열에 대한 프라이머 및 J 부위에 대한 프라이머는 각각 클로닝을 위한 제한 효소 HindIII 인식 서열 및 제한 효소 BamHI 인식 서열을 포함한다.
한편, VL 유전자와 관련하여 VH 유전자의 경우와 같은 방식으로 하기 리더 서열에 상응하는 프라이머 및 J 부위에 상응하는 프라이머를 사용하여 양 말단상에 제한 효소 HindIII 인식 부위 및 제한 효소 BamHI 인식 부위를 갖는 VL 유전자 단편을 수득하였다.
리더 서열에 대한 프라이머(VL)
J 부위에 대한 프라이머(VL)
그렇게 수득한 VH- 및 VL 유전자 단편을 HindIII 및 BamHI(모두 TAKARASHUZO CO,. LTD.로부터 입수)로 분해하고, 이어서 발현 벡터 AG-γ1 및 AG-κ내로 통합하였다(WO94/20632). 특히, AG-γ1는 β 액틴 프로모터, 인간 이뮤노글로블린 불변 부위 γ1 쇄 유전자 및 선택적 마커 네오마이신 내성 유전자(neo)를 갖는다. γ1 유전자 상류의 HindIII 인식 서열 및 BamHI 인식 서열 사이에 뮤린 21K 항체의 VH 유전자를 삽입하여, 키메라 2K1의 중쇄 발현 플라스미드를 제조할 수 있다. 추가로, AG-κ는 β 액틴 프로모터, 인간 이뮤노글로블린 불변 부위 κ 쇄 유전자 및 선택적 마커로서 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자(dhfr)를 갖는다. κ 유전자 상류의 HindIII 인식 서열 및 BamHI 인식 서열 사이에 뮤린 21K 항체의 VL 유전자를 삽입하여, 키메라 2K1의 경쇄 발현 플라스미드를 제조할 수 있다.
통상의 방법에 따라 3개의 발현 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) 균주 HB101에 도입한 후, 대량 배양하였다. 생성된 플라스미드는 EndoFree Plasmid Mega Kit(QIAGEN Inc.)로 정제하였다.
실시예 8
키메라 2K1 항체 발현:
실시예 7에서 정제된 바와 같은 키메라 2K1 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 플라스미드를 함께 혼합하고 통상의 인산칼슘법에 따라 CHO-DG44 세포주의 형질감염에 사용하였다. 0.5mg/ml Geneticin(Invitrogen) 및 투석에 의해 제조된 뉴클레오티드이 없는 FCS(Invitrogen)가 10%로 보충된 MEM 배양 배지(Invitrogen)상에서 선택하여 키메라 2K1 항체를 생산하는 형질전환 세포를 수득하였다.
2% 투석된 FCS로 보충된 500ml의 MEM 배양 배지에서 세포를 배양하였다. 생성된 배양 상등액을 단백질 A 칼럼(Amersham Biosciences, Co., Ltd.)에 통과시킨 후, PBS를 통해 투석하여 정제된 키메라 2K1 항체를 수득하였다. 정제된 키메라 2K1 항체의 농도는 DC 단백질 에세티 키트(BIO-RAD)를 사용하여 측정하였다. 마지막으로, 1.4mg의 정제된 항체를 수득하였다.
실시예 9
키메라 2K1 항체의 인간 말초혈 단핵구 유주에 대한 저해 활성:
하기 방법에 의해 실시예 8에서 수득한 정제된 키메라 2K1 항체의 사이코카인- 활성화된 인간 말초혈 단핵구 유주에 대한 저해 활성을 조사하였다.
우선, 정상인 대상자로부터 헤파린을 사용하여 채취한 혈액을 RPMI 16 배양 배지를 사용하여 2배 희석하였다. 희석된 혈액을 Ficoll-Paque(Pharmacia)상에 오버랩시킨 후, 400 x g에 주변 온도에서 30분동안 원심분리하였다. 혈장과 Ficoll-Paque 사이의 경계면에서 관찰된 백색층을 회수하고 단핵구로서 사용하였다. 수득한 단핵구를 인간 TNF-α(20ng/ml)과 함께 배양하였다. 생성된 활성화된 단핵구 유주 시험에 사용하였다.
48-웰 마이크로케모타시스 챔버(Neuro Probe Inc.)를 사용하여 유주시험을 수행하였다. 절단을 위해 인간 OPN을 2시간동안 37℃에서 송아지 트롬빈(Sigma)와 함께 반응시켰다. 다양한 농도의 2K1 키메라 혈청을 생성된 인간 트롬빈에 가하고 15분동안 37℃에 방치하고, 생성된 혼합물을 하측 챔버에 가하였다(최종 인간 OPN 농도는 10μg/mL)였다. 폴리카보네이트 필터(공극 크기 5μm)상에 위치시키고, 50㎕의 세포 현탁액(2 x 106세포/mL)을 상측 챔버에 가하였다.
2시간동안 37℃에 5% CO2의 존재하에서 배양한 후, 폴리카보네이트 필터를 제거하고, 상측 필터 표면상의 세포를 제거하고 Diff-Quick(Baxter)로 염색하였다. 40배 배율로 상측 필터 표면상의 세포를 계수하였다. 결과를 6개 웰의 평균 세포 계수(세포/mm3) ± SD로 나타낸다.
결과적으로 표 3에 나타낸 바와 같이, 키메라 2K1 항체는 트롬빈-절단형 OPN에 대하여 TNF-α 활성화된 인간 말초혈 단핵구 유주를 저해하였다.
단핵구 유조의 저해 활성:
표 3
*P<0.05
** P < 0.01(일원 ANOVA, Dunnett 테스트)
실시예 10
키메라 2K1 항체의 KD값 분석:
키메라 2K1 항체의 KD값을 하기 방법으로 분석하였다. 우선, 인간 오스테오폰틴의 부분 펩티드 GRGDSVVYGLR을 바이오틴화 키트(Dojindo Corporate)로 바이오틴화하였다. 센서 칩 SA를 BIACORE-2000에 세팅하여 리간드의 23RU를 결합시켰다(Bin-GRGDSVVYGLR). 연속하여, 분석물로서 뮤린 2K1 항체를 통과시켜 도 6a에 나타낸 바와 같은 센서 그램을 수득하였다. 추가로, 분석물로서 키메라성 2K1 항체를 통과시켜 도 6b에 나타낸 바와 같은 센서 그램을 수득하였다. 각 도면에서, 가로 축은 시간을 나타매고, 세포 축은 상대적 반응(RU)를 나타낸다. 이 센서 그램의 데이타는 BIACORE 분석 소프트웨어 BIA Evaluation Version 3.0에 의해 결과를도 6에 나타낸다. 도 6a는 다양한 농도의 뮤린 2K1 항체에서의 센서 그램이다. 도 6b는 다양한 농도의 키메라성 2K1 항체에서의 센서 그램이다.
측정 결과, 뮤린 2K1 항체의 KD 값은 1.2 x 10-10M인 반면, 키메라성 2K1 항체의 KD 값은 9.2 x 10-10M이었다. 뮤린 2K1 항체의 키메라성 제조에 기인하여 키메라성 2K1 항체의 친화성은 저하되지 않았다.
실시예 11
인간화 2K1 항체 유전자의 제조:
뮤린 2K1 항체의 VH 또는 VL중 상보성결정부위의 아미노산이 이식되는 주형 인간 항체를 뮤린 2K1 항체의 VH 및 VL의 프레임워크(FRs)의 아미노산 서열과 고도로 상동성인 아미노산을 갖는 인간 점라인으로부터 선택하였다. 특히, DP-88(기탁번호 Z49804)와 JH6(기탁번호 X69866)의 조합물을 주형 인간 VH로 선택하고, 주형 인간 VL로서 DPK-13(기탁번호 X93631)와 Jκ2(기탁번호 AJ399904)의 조합물을 선택하였다. 뮤린 2K1 항체의 VH 아미노산 서열(서열번호 19) 및 VL 아미노산 서열(서열번호 20)을 주형 인간 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열과 비교하고, 도 7 및 8에 각각 나타내었다. Kabat 등의 분류법에 따라 CDR 부위를 나타내었다.
VH의 CDR은 하기 아미노산 서열을 가졌다.
VL의 CDR은 하기 아미노산 서열을 가졌다.
CDR1(서열번호 24): RSSQSIVHSNGNTYLE
CDR1(서열번호 25): KVSNRFS
CDR1(서열번호 26): FQGSHVPLT
뮤린 2K1 항체의 VH 및 VL의 필수 아미노산 서열을 주형 인간 항체의 VH 및 VL에 이식하여 인간화 항체를 제조하였다. 특히 CDR 아미노산 서열을 뮤린 2K1 항체의 CDR 아미노산 서열로 치환하여 제조한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열을 작제하였다. 하기에 기술하는 바와 같이, 작제된 핵산 서열의 유전자 단편을 PCR 및 유전자 재조합 기술에 따라 제조하였다. VL중 FR2만을 위해 뮤린 2K1 항체에 더욱 고도로 상동성인 DPK13 아미노산 서열을 선택하였다. 남은 FR 부분에 대하여 DPK18의 아미노산 서열을 선택하였다. VH중 FR4만을 위해, JH 아미노산 서열을 선택하였다. 남은 FR 부분에 대하여 DPK-88의 아미노산 서열을 선택하였다.
그렇게 제조된 인간한 2K1 항체(이하, "R2K1 항체"로 명명함)의 VH 및 VL의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도 9(서열번호 27 및 28) 및 10(서열번호 29 및 30)에 나타낸다. 항체의 리더 서열로서, PCT94/20632에 기술된 바와 같은 인간화 항-HIV 모노클로날 항체(RC25 항체)에서 사용된 것과 동일한 서열을 사용하였다(도 9 및 10에서 밑줄로 표시). 또한, 클로닝을 위해 HindIII- 및 BamHI 인식 부위를 VH 및 VL를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 양 말단에 가하였다.
도 9 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편을 수득하기 위하여, 실제로 PCR에 의해 올리고 DNA를 사용하여 전체적으로 합성하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 구체적으로 VH에 대하여 6개의 올리고 DNAs(서열번호 31 내지 36)를 합성하여 도 9에 나타낸 바와 같은 전장의 VH 뉴클레오티드 서열을 수득하였다. DNAs를 사용하여, 하기 방법에 따라 PCR을 수행하였다. 주형으로서 각 10pmol의 6개의 올리고 DNAs 및 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Shuzo, Ltd.)의 혼합물을 사용하여, 20초동안 94℃, 30초동안 55℃, 3분동안 72℃에서의 단계를 10회 반복하였다. 주형으로서 생성된 PCR 산물 1㎕을 사용하여, 프라이머로서 도 11에 밑줄로 표시한 올리고 DNAs(서열번호 37 및 38) 및 Pyrobest DNA 폴리머라제를 사용하여, 20초동안 96℃ 및 3분동안 72℃에서의 단계를 25회 반복하여 전장의 VH를 증폭시켰다. 클로닝을 위해 생성된 DNA 단편을 Zero Blunt PCR Cloning Kit(Invitrogen)을 사용하여 pCR-Blunt 벡터에 결찰시키고 대장균(Escherichia coli)에 도입하였다. 생성된 대장균(Escherichia coli) 클론으로부터, QIAprepSpin Miniprep Kit(QIAGEN)를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 주형으로서 플라스미드 DNA, M13-M4 프라이머 및 M13-RV 프라이머(둘 모두 Takara Shuzo, Ltd.), 및 서열 반응을 위한 CEQ DTCS-Quick Start Kit(BECKMAN COULTER) 를 사용하여 클로닝된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 CEQ 2000 자동 서열기(BECKMAN COULTER)로 분석하여 작제된 바와 같은 도 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 클론을 수득하였다.
VL에 대하여 도 12에 나타낸 6개의 올리고 DNAs(서열번호 39 내지 44)를 상기 기술한 방식과 동일하게 PCR을 10회 수행하였다. 주형으로서 증폭된 산물 및 프라이머로서 도 12에 밑줄로 표시한 올리고 DNAs(서열번호 45및 46)을 갖는 올리고DNAs를 사용하여, 상기 기술한 바와 같이 PCR을 25회 수행하였다. VH의 것과 동일한 방식으로 연속 수행하여, 도 10에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 클론을 수득하였다.
실시예 12
인간화 2K1 항체-발현 플라스미드 제조:
실시예 7에 기술된 키메라 2K1 항체-발현 플라스미드를 제조하는 방식에 따라, 인간화 2K1 항체-발현 플라스미드르를 제조하였다. 실시예 11에서 제조된 인간화 2K1 항체 VH 및 VL 유전자의 클론으로부터 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하였다. 클론을 HindIII 및 BamHI로 분해하여 VH- 및 VL DNA 단편을 수득하고, 이를 벡터 AG-γ1 및 AG-κ내로 통합하였다. 인간화 2K1 항체의 중쇄 및 그렇게 제조된 그의 경쇄를 발현시키는 발현 플라스미드를 대장균(Escherichia coli)에 도입하여 대량 배양하였다. 생성된 대장균(Escherichia coli)에 기초하여, 중쇄 및 경쇄를 발현시키는 플라스미드 DNA를 형질감염을 위해 정제하였다.
실시예 13
인간화 2K1의 발현:
실시예 12에서 제조된 인간화 2K1 항체의 중쇄의 발현 플라스미드를 그의 경쇄의 발현 플라스미드와 혼합한 후, 통상의 인산칼슘법에 따라 CHO-DG44 세포주의 형질감염에 사용하였다. 0.5mg/ml Geneticin 및 10% 투석된 FCS로 보충된 MEM 배양 배지에서 3일 배양된 세포 균주의 배양 상등액을 사용하여 배지에 포함된 인간화 2K1 항체의 항원 결합 활성을 ELISA에 의해 측정하였다. 우선, 염소-유도 항-인간IgG Fc 항체(CAPPEL) 및 단백질 A-HRP(ZYMED LABORATORIES, INC.)을 사용하는 샌드위치 ELISA를 수행하여 배양 배지에 포함된 인간화 2K1 항체의 농도를 측정하였다. 이 경우, 상업적으로 이용가능한 인간 IgG1 항체(Biogenesis)의 일련의 희석액을 제조하고 표준 샘플로 사용하였다. 추가로, 키메라 2K1 항체의 농도를 상기 기술한 바에 따라 ELISA에 의해 측정하였다.
실시예 14
인간화 2K1 항체 및 키메라 2K1 항체와 오스테오폰틴 펩티드의 결합 활성 확인:
실시예 13에에서 측정된 인간화 2K1 항체 및 키메라 2K1 항체 농도에 기초하여, 인간화 2K1 항체 및 키메라 2K1 항체와 오스테오폰틴 펩티드(CVDTYDGRGDSVVYGLRS)의 결합 활성을 Kon 등의 ELISA를 참고(Journal of Cellular Biology, 88:420-432(2002))로 비교하였다.
인간화 2K1 항체 및 키메라 2K1 항체의 일련의 희석액은 마이크로틸러 플레이상에서 그에 고정된 BSA-연결 오스테오폰틴 펩티드(BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS)와 반응하였다. 이어서, BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS에 결합한 항체는 단백질 A-HRP와 반응하고, 최종적으로 TMB(Dojindo Corporate)와 결합시켜 450nm의 흡광도에 의해 측정하였다. 추가로, 음성 컨트롤으로서 플레이트상에서 그 위에 고정된 BSA와만 반응한 것을 동일한 방식으로 측정하였다. 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서, 가로 축은 항체의 농도를 나타내고, 세포 축은 흡광도를 나타내며, 여기에서, 진한 원은 BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS에 대한 키메라 2K1 항체의 결합 활성을 나타내고, 진한 네모는 BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS에 인간화 2K1 항체의 결합 활성을 나타낸다. 추가로, 음성 컨트롤으로서, BSA에 대한 키메라 2K1 항체의 결합 활성(흰색 원) 및 BSA에 대한 인간화 2K1 항체의 결합 활성(흰색 네모)도 나타낸다.
결과, 인간화 2K1 항체 및 키메라 2K1 항체는 BSA를 제외한 BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS에 대해서만 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 항체의 결합 활성은 오스페오폰틴 펩티드에 대하여 특이적인 것으로 나타났다. 추가로, BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS에 대한 양 항체의 결합 활성은 동일한 수준이다.
상기 기술한 바와 같이, 인간화 2K1 항체 및 키메라 2K1 항체는 동일한 수준의 항원 결합 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 인간화 2K1 항체는 원 뮤린 2K1 항체의 것과 일치하는 항원 결합 활성을 갖는 것이 명백하였다.
실시예 15
M5 항체의 제조:
하기에 나타나 있는 바와 같은, 마우스 OPN의 내부서열(C+V138에서 R153)에 대응하는 합성 펩티드를 준비하고, 면역에 사용하였다.
M5 펩티드:
CVDVPNGRGDSLAYGLR
이 펩티드를 티로글로글린과 결합시키고, 이것을 사용해 통상의 방법에 따라서 토끼를 면역화시켰다. 면역된 토끼의 항혈청을 채취하고 모으고, M5펩티드 N-말단의 시스테인과 티올세파로즈(Amersham Pharmacia Biotech사)를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 칼럼을 사용해서 M5 항체를 제조하였다.
실시예 16
OPN 및 그 트롬빈 분해 산물과 M5 항체의 반응성:
결합능은 웨스턴 블롯법을 사용해서 시험하였다. 사용한 OPN은 CHO세포로부터 생산된 글리코실화 폼의 재조합 마우스 OPN을 사용하였다. M5 항체는 OPN 및 그 트롬빈 분해 산물과 반응하였다.
실시예 17
M5 항체에 의한 OPN에 대한 세포부착의 저해:
M5 항체가 OPN에 대한 세포부착을 저해할 것인가 아닌가를, 문헌(S .Kon et al.,(2002):J. Cell. Biochem,. 84(2), 420-432)에 기재된 방법으로 조사하였다. OPN은, PreScissionㆍ프로테아제(Amersham Pharmacia Biotech사)에 의해 GST부를 제거한 전장 마우스 OPN(이하,"mOPN/de-GST"라고 한다)을 사용하였다. 세포는 마우스 NIH 3T3세포를 사용하였다.
도 14에 나타나 있는 바와 같이 NIH 3T3세포는 mOPN/de-GST에 대하여 농도 의존적으로 부착한다. 도 15에 나타나 있는 바와 같이 이 부착은 분명하게 GRGDSP 펩티드(100㎍/㎖)로 저해되므로 RGD 의존이다. 도 16에 나타나 있는 바와 같이, 200㎍/㎖의 M5 항체는 OPN에 대한 세포부착을 저해하는 것이 확실시 되었다.
실시예 18
M5 항체의 마우스 지라 유래 단구 유주에 대한 저해활성:
하기방법에 의해 M5 항체의 사이토카인 활성화 마우스 지라 유래 단구 유주에 대한 저해활성을 조사하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.
<실험방법>
C57BL/6 마우스의 지라세포를 슬라이드 글라스로 갈아 으깨서 단세포로 하고 나서, 플라스코에서 37℃에서 1시간 배양하여 부착된 세포를 단구로 사용하였다. 이 단구를 인간 TNF-α(20ng/㎖)에서 하룻밤 배양하고, 활성화한 것을 유주 시험에 사용하였다. 유주실험은 상기 실시예 6의 인간의 경우와 동일한 방법으로 실시하였다.
<실험결과>
M5 항체는 전장 마우스 OPN(Genzyme사)을 소 트롬빈(Sigma사 제품)으로 절단한 수득한 트롬빈 절단형 뮤린 OPN에 대한 TNF-α로 활성화한 뮤린 지라 유래 단구의 유주를 저해하였다.
표 4
** P <0.01(일원 AN0VA, Dunnett 테스트)
실시예 19
M5 항체의 뼈 파괴 억제 작용:
하기방법에 의해, M5 항체의 마우스 갈바리아 기관배양계에 있어서의 뼈 파괴 억제 작용을 조사하였다. 이 결과를 표 5에 나타낸다.
<실험방법>
생후 1일째의 새끼 마우스의 두개골을 잘라내고, 그 절반을 크기를 갖추고나서 24웰 플레이트의 각 웰에 넣었다. 이것들에 인간 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone, PTH)(1-34)을 최종농도가 10nM이 되도록 D-MEM배양액(10% 소 혈청첨가)에 첨가한 것을 가해서 뼈 파괴를 유발시켰다. M5 항체는 최종농도 200㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 37℃에서 1주간 배양한 후에, 뼈로부터 배양액 중으로 유리한 칼슘양을 칼슘 E 테스트와코(와코쥰약)으로 정량하였다.
<실험결과>
PTH 미첨가에서는 7.02mg/㎖의 칼슘값을 나타냈지만, PTH 첨가에 의해 9.11mg/㎖과 뼈로부터의 칼슘의 유리 촉진을 볼 수 있었다. M5 항체를 200㎍/㎖의 농도로 첨가해 두면, 뼈 흡수가 약 70% 저해되는 것이 확인되었다.
표 5
** P<0.01(일원 ANOVA, Dunnett 테스트)
실시예 20
M5 항체의 마우스 콜라겐 관절염 모델에 있어서의 효과:
하기 방법에 의해 M5 항체의 마우스 콜라겐 관절염 모델에 있어서의 효과를 조사하였다. 관절염 스코어에 관한 결과를 표 6에, 다리 부종에 대한 결과를 표 7에, 체중변화에 관한 결과를 표 8에, 섭취량 화에 관한 결과를 표 9에 각각 나타낸다.
<실험방법>
관절염의 유발에는 콜라겐에 특이적인 4가지의 에피토프를 인식하는 관절염 유발 항체 칵테일(상품명: 관절염용 칵테일, Arthrogen-CIF mAb, Arthritogenic mAb cocktail, 이와이화학약품사)을 사용하였다. 마우스에 이 관절염 칵테일을 정맥내 투여하고, 그 3일 후에 LPS(100㎍)을 복강내 투여하는 것에 의해서 유발시켰다. 관절염은 LPS투여 후 3일째부터 관찰되었으며, 6일째에서 최대가 되었다.
M5 항체에 대해서는 LPS투여 직전과 3일 후에, 40㎍, 150㎍ 또는 400㎍의 용량으로 정맥내 투여하였다. 그 컨트롤에는 토끼 IgG 투여군(투여량: 400㎍)을 두었다. 또 항-마우스 TNF-α항체에 대해서는 LPS투여 직전과 3일 후에, 200㎍/마우스의 용량으로 정맥내 투여하였다. 그 컨트롤에는 랫트 IgG 투여군(투여량: 200㎍)을 두었다. MTX에 대해서는 LPS투여일부터 하루 1회의 빈도로 경구(투여량: 3.2mg/kg)로 투여하였다. 이때 MTX는 0.5% 메틸셀룰로스 용액 5㎖에 용해한 것을 사용하였다. 그 컨트롤으로서는 0.5% 메틸셀룰로스 용액 5㎖을 두었다.
평가는 1군 5마리씩 관절염 스코어, 다리 부종, 체중변화, 섭취량의 4 항목에 대해서 실시하였다.
<실험결과>
M5 항체는 표 6-9에 나타낸 바와 같이, 마우스 관절염 모델(치료 효과)에 대해서, 관절염 스코어의 개선, 발병 지연이나 다리 부종의 개선등 명확한 억제 작용을 나타냈다. 관절염의 발병은 용량 의존적으로 억제되었으며, 그 정도는 항-마우스 TNF-α항체(투여량: 200㎍/마우스)투여에 의한 효과를 상회하는 것였다. 이에 대하여 MTX는 거의 약효를 나타내지 않았다.
또, 본 모델의 정상군에서는 LPS투여 후 3일만에 약 3g이라는 현저한 체중감소가 관찰되었으며, 이 경향 감소율은 약간 완화되었지만, 3-6일째까지 계속되었다. 이에 비해서, M5 항체(150㎍, 400㎍)투여군 및 항-마우스 TNF-α항체 투여군에서는 분명한 체중감소의 개선이 인정되었다. 또, 섭취량에 대해서는 LPS투여 후 3일째까지는 어느 쪽의 약제에 대해서도 심한 체중감소가 관찰되었지만, 3-6일째에 걸쳐서는 M5 항체 투여군 및 항-마우스 TNF-α항체 투여군에서 개선이 인정되었다. 관절 스코어에 대한 효과를 표 6에, 다리 부종억제 효과를 표 7에, 체중변화 및 섭취량 변화를 각각 표 8 및 표 9에 나타낸다.
표 6
** P<0.01, * P<0.05 (비파라미터적 Mann-Whitney 시험)
* P<0.05 (비파라미터적 Mann-Whitney 시험)
표 7
** P<0.01, * P<0.05(일원 ANOVA, Dunnett 테스트)
표 8
표 9
실시예 21
OPN 관련 단편 펩티드의 입수:
OPN 관련 단편 펩티드는 HPLC 크로마토그래피(chromatography) 정제한 상태의 물건을 Auspep Inc(Parkiville, Australia)로부터 구입하였다. 그들의 아미노산 서열은 하기의(1)~(3) 과 같다.
hOPN5: CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C+V153에서 S169)(1)
hOPN3: KSKKFRRPDIQYPDATDEC (K170에서 E187+C) (2)
hOPN1: IPVKQADSGSSEEKQC (I17에서 Q31+C)(3)
실시예 22
면역용 항원의 제조:
면역원으로서 OPN 관련 단편 펩티드와 티로글로불린과 결합체를 EMCS(N-(6-말레이미도카프로일옥시)-숙신이미드)법에 의해, 아래와 같이 해서 제조하였다. 또 결합체를 만들 때에는 티로글로불린과 OPN 관련 단편 펩티드와 EMCS의 몰비를 각각 1:300:400으로 하였다.
실시예 21의 각 OPN 관련 단편 펩티드 4mg을 각각 약 1㎖의 증류수에 용해하였다. 한편 1㎖의 0.01M 인산버퍼(pH 7.5)에 5mg의 티로글로불린을 용해한 것과 디메틸포름아미드에서 용해한 EMCS 80㎍/㎕를 각각 상기 몰 상당량이 되도록 혼합하고, 티로글로불린-EMCS 복합체 용액을 제조하였다. 이 복합체 용액을 3개로 나누고, 그 각각에 상기 OPN 관련 단편 펩티드 용액을 상기 몰 상당량 첨가하는 하는 것에 의해 EMCS로 가교된 OPN 관련 단편 펩티드와 싸이로글리불린의 결합체 용액을 제조하였다.
이 결합체 용액을 PBS를 사용해서 투석하고, 결합체로서 10㎍/㎕이 되도록 농도 조제하였다. 이렇게 하여 수득된 OPN 관련 단편 펩티드와 티로글로불린의 결합체를 면역용 항원으로 사용하였다.
실시예 23
스크리닝용 항원의 제조:
GST-OPN-a, GST-OPN-b, GsT-OPN-c, 트롬빈 절단부위에서 아미노기측의 OPN단편(GST-N half), 및 카복실기측의 OPN 단편(GST-C ha1f)은 각각 실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제하고, 항혈청의 OPN에 대한 반응성에 사용하였다.
실시예 24
면역감작:
면역용 항원으로 실시예 14에서 수득된 OPN-관련 단편 펩티드와 티로글로불린과의 결합체를 사용하고, 토끼에 면역을 실시하였다. 면역은 1주간, 또는 2주간 단위로 결합체 용액 100㎕(100㎍)을 투여하는 것에 의해 실시하였다. 항원은 첫회 면역에만 Freund 완전 어쥬반트와 혼화하고, 두번째부터는 Freund 불완전 어쥬반트와 혼화하였다. 8회 면역후, 채혈을 실시하고, 혈청을 분리하여 이것을 항혈청으로 하였다.
실시예 25
항혈청의 OPN에 대한 반응성:
실시예 21에서 조제한 OPN-관련 단편 펩티드를 10㎍/㎖이 되도록 0.1M 탄산 완충액(pH 9.5)에 희석하고, 50㎕/웰에서 96웰 플레이트에 고정시켰다. PBS로 세정, 0.1% BSA/PBs/0.05% NaN3용액으로 차단한 후, 실시예 16에서 얻은 항혈청의 100배 희석액을 차례로 2배 희석시켜셔 웰에 50㎕ 가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다.
반응 종료 후, 0.05% Tween20-PBS로 4회 세정 후, HRP 표지 항-토끼 IgG(IBL사)을 50㎕씩 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.4mg/㎖ 오르토페닐렌디아민(OPD)과 0.03% 과산화수소물을 포함하는 0.05M 구연산완충액(pH 4.5)을 100㎕씩 각 웰에 넣고, 실온에서 15분간 차광 상태에서 방치하여 발색시켰다. 발색 후, 1N 황산 100㎕을 각 웰에 첨가하고, 반응을 정지시켜 492nm의 흡광도를 측정하였다.
한편, 실시예 23에서 조제한 OPN 단백질을 사용하고, 웨스턴 블롯법으로 항혈청의 반응성을 조사하였다. 그 결과 OPN 관련 단편 펩티드 hOPN1 및 hOPN5에 대한 항혈청은 GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c 및 GST-N half에 반응하지만, GST-Chalf에는 반응하지 않았다. 한편, OPN 관련 단편펩티드 hOPN3에 대한 항혈청은 GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c 및 GST-Chalf에 반응하였지만, GST-N half에는 반응하지 않았다.
실시예 26
항-OPN 관련 단편 펩티드 항체와 HRP과의 결합체 제조:
OPN 관련 단편 펩티드 hOPN3과 hOPNl에 대한 항체와 HRP의 결합체 제조는 아래와 같이 제조하였다. 각 항-OPN 관련 단편 펩티드 항체 20mg을 펩신으로 분해하고, 겔여과 하는 것에 의해 항-OPN 관련 단편 펩티드 항체의 F(ab')2단편을 정제하고, 2-머캅토 에탄올을 사용하는 것에 의해 F(ab')2단편을 Fab' 단편으로 환원시켰다. HRP와 EMCS를 37℃에서 60분간 반응시키고, 겔 여과 하는 것에 의해 HRP-EMCS 결합체를 제조하고, 또 이것과 항-OPN 관련 단편 펩티드 항체 Fab' 단편을 4℃에서 하룻밤 반응시키고 겔 여과 하는 것에 의해 EMCS 가교에 의한 항-OPN 관련 단편 펩티드 항체와 HRP의 결합체를 제조하였다.
실시예 27
샌드위치 ELISA 시스템의 작제:
샌드위치 ELISA용 플레이트와 표지항체의 조합으로 1-3, 5-1의 2종류의 시스템을 제조하였다. 이 중, 1-3 시스템은 아래와 같이 제조하였다. 10 ㎍/㎖의 OPN 관련 단편 펩티드 hOPN1에 대한 항체를 10O㎕씩 96 well ELISA용 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 10% BSA/PBS/NaN3용액으로 차단을 실시하고, 이 상태를 샌드위치 ELISA용 플레이트로 하였다. 실시예 26에서 제조한 OPN 관련 단편 펩티드 hOPN3에 대한 항체와 HR과의 결합항체를 표지항체로 하였다. 이와 같이 hOPN1에 대한 항체를 사용한 고상 플레이트와 hOPN3에 대한 항체를 사용한 표지항체의 조합을 1-3 시스템으로 하였다.
동일하게 하여, hOPN5에 대한 항체를 사용한 고상 플레이트와, hOPN1에 대한 항체를 사용한 표지항체의 조합을 5-1시스템으로서 작제하였다.
실시예 28
샌드위치 ELISA시스템에 의한 시험 대상자에 있어서의 오스테오폰틴의 측정:
OPN 단백질의 측정은 아래와 같이 실시하였다. 1-3 시스템 및 5-1 시스템의 샌드위치 ELISA용 플레이트에 시험 대상자로부터 모은 혈장 및 관절강액 샘플을 포함하는 용액을 100㎕ 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 005% Tween20-PBS로 4회 세정, 각각의 시스템에 특이적인 표지항체를 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 0.05% Tween20-PBS로 6회 세정하고, TMB(Tetramethyl benzidine) 용액을 100㎕ 첨가하고, 실온, 차광 하, 30분간 방치하였다. 1N 황산으로 반응을 중지하고 흡광도 450nm로 측정하였다.
상기한 방법에 의해 측정한 류마티스 환자 관절강액(13 케이스)의 OPN값을 표 10에, 골관절염 환자 관절강액(12 케이스)의 OPN값을 표 11에 나타낸다. 류마티스 환자 혈장(16 케이스)의 OPN값을 표 12에, 골관절염 환자혈장(7 케이스)의 OPN값을 표 13에, 정상인 혈장(6 케이스)의 OPN값을 표 14에 나타낸다.
이들 결과로부터 알 수 있듯이, 혈장 중 OPN값과의 비교에 있어서, 1-3의 시스템에서는 류마티스성 관절염환자, 골관절염 환자 및 건강한 정상 사람 사이에서, 유의차는 인정되지 않았다. 그러나, 5-1의 시스템에서는 류마티스성 관절염환자, 골관절염 환자 모두 정상 인간과의 비교에 있어서, 그 측정치는 유의가 높았으며, 그 정도는 류마티스성 관절염 환자에 우위였다. 이 것은 5-1의 시스템이 반영하는 총 OPN량이 관절염 전반에 있어서의 진단의 유효 성을 시사하는 것이다.
한편, 류마티스성 관절염환자 및 골관절염 환자의 관절강액의 OPN치는 혈장에 있어서의 OPN치와 비교해서 상승하고 있었으며, 국소에서의 OPN 생산이 강하게 시사되었다.
관절강액 중 OPN치의 류마티스성 관절염환자, 골관절염 환자간에서의 비교에 있어서, 1-3 및 5-1의 어느쪽의 시스템에서도 류마티스성 관절염 환자는 골관절염 환자와 비교해서 OPN값이 유의하게 높았다.
또 새로운 지표로서 1-3시스템/5-1시스템의 OPN값 비율의 검토를 실시하였다. 이지표는트롬빈 절단 OPN의 비율을 비교할 수 있다. 류마티스성 관절염 환자의 혈장 및 관절강액의 OPN값은 1이하, 골관절염 환자에서는 2이상으로 유의차가 인정되었다. 따라서 1-3시스템/5-1시스템의 OPN값을 사용하는 것에 의해서 류마티스 환자와 골관절염 환자를 구별하는 것이 가능하게 되는 조기의 검사 방법으로서 사용할 수 있다.
표 10
표 11
표 12
표 13
표 14
Claims (45)
- 아미노산 서열 RGD 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는 그의 단편의 결합을 저해할 수 있고, 아미노산 서열 SVVYGLR 부위를 인식하는 인테그린과 오스테오폰틴 또는 그의 단편의 결합을 저해할 수 있는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편.
- 제 1항에 있어서, 항원으로서 부분 아미노산 서열 RGDSVVYGLRS를 포함하는 펩티드를 사용하여 수득되는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항원으로서 펩티드 VDTYDGRGDSVVYGLRS에 대하여 수득되는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 키메라성 항체인 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 5항에 있어서,(a) 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 중쇄 불변부위를 포함하는 중쇄; 및(b) 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 경쇄 불변부위를 포함하는 경쇄를 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 중쇄 (a)에서 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위가 서열 번호: 19로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 경쇄 (b)에서 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위가 서열 번호: 20으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 중쇄 (a)에서 중쇄 불변 부위가 인간 Igγ1인 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 경쇄 (b)에서 경쇄 불변 부위가 인간 Igκ인 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항에 있어서,(c) 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위로부터 유래된 상보성결정부위 및 인간으로부터 유래된 중쇄 가변 부위로부터 유래된 프레임워크 부위를 포함하는 중쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 중쇄 불변 부위를 포함하는 중쇄(d) 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위로부터 유래된 상보성결정부위 및 인간으로부터 유래된 경쇄 가변 부위로부터 유래된 프레임워크 부위를 포함하는 경쇄 가변 부위 및 인간으로부터 유래된 경쇄 불변 부위를 포함하는 경쇄를 갖는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 중쇄 (c)에서 마우스로부터 유래된 중쇄 가변 부위중 상보성결정부위가 서열번호 21 내지 23으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 경쇄 (d)에서 마우스로부터 유래된 경쇄 가변 부위중 상보성결정부위가 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 중쇄 (c)에서 중쇄 가변 부위가 서열번호 28로 기술된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 경쇄 (d)에서 중쇄 가변 부위가 서열번호 30으로 기술된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 중쇄 (c)에서 중쇄 불변 부위가 인간 Igγ1인 항-오스테오폰틴 항체.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 경쇄 (d)에서 경쇄 불변 부위가 인간 Igκ인 항-오스테오폰틴 항체.
- 서열번호 19로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 서열번호 20으로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 서열번호 28로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 서열번호 30으로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 제 19항의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igγ1 유전자 서열을 포함하는 벡터.
- 제 20항의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igκ 유전자 서열을 포함하는 벡터.
- 제 21항의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igγ1 유전자 서열을 포함하는 벡터.
- 제 22항의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Igκ 유전자 서열을 포함하는 벡터.
- 제 23항 및 제 24항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제 25항 및 제 26항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제 27항의 숙주 세포를 배양하고 액체 배양물로부터 항-오스테오폰틴 키메라성 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제 5항 또는 제 6항의 항-오스테오폰틴 키메라성 항체를 제조하는 방법.
- 제 28항의 숙주 세포를 배양하고 액체 배양물로부터 항-오스테오폰틴 인간화 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제 11항 또는 제 12항의 항-오스테오폰틴 인간화 항체를 제조하는 방법.
- 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항 또는 제 11항 또는 제 12항의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 자가면역 질환 치료제.
- 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항 또는 제 11항 또는 제 12항의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 류마티스 치료제.
- 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항 또는 제 11항 또는 제 12항의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료제.
- 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항 또는 제 11항 또는 제 12항의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 유효 성분으로 포함하는 골다공증 치료제.
- 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항 또는 제 11항 또는 제 12항의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 자가면역 질환 환자에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환 치료 방법.
- 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항 또는 제 11항 또는 제 12항의 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편을 류마티스 환자에게 투여하는 것을 포함하는 류마티스 치료 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 또는 제 11항 또는 제 12항중 어느 하나의 항-오스테오폰틴 항체 또는 항체로부터 유래된 항체 단편을 류마티스 관절염 환자에게 투여하는 것을 포함하는 류마티스 관절염 치료 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 또는 제 11항 또는 제 12항중 어느 하나의 항-오스테오폰틴 항체 또는 항체로부터 유래된 항체 단편을 골다공증 환자에게 투여하는 것을 포함하는 골다공증 치료 방법.
- 자가면역 질환 치료제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 6항 또는 제 11항 또는 제 12항중 어느 하나의 항-오스테오폰틴 항체 또는 항체로부터 유래된 항체 단편의 용도.
- 류마티스 치료제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 6항 또는 제 11항 또는 제 12항중 어느 하나의 항-오스테오폰틴 항체 또는 항체로부터 유래된 항체 단편의 용도.
- 류마티스 관절염 치료제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 6항 또는 제 11항 또는 제 12항중 어느 하나의 항-오스테오폰틴 항체 또는 항체로부터 유래된 항체 단편의 용도.
- 골다공증 치료제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 6항 또는 제 11항 또는 제 12항중 어느 하나의 항-오스테오폰틴 항체 또는 항체로부터 유래된 항체 단편의 용도.
- 시험 화합물이 오스테오폰틴의 RGD 서열 부위과 인테그린 사이의 결합 및/또는 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린 사이의 결합을 저해하는 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는, 자가면역 질환 치료제 스크리닝 방법.
- 시험 화합물이 오스테오폰틴의 RGD 서열 부위과 인테그린 사이의 결합 및/또는 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린 사이의 결합을 저해하는 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 치료제 스크리닝 방법.
- 시험 화합물이 오스테오폰틴의 RGD 서열 부위과 인테그린 사이의 결합 및/또는 SVVYGLR 서열 부위와 인테그린 사이의 결합을 저해하는 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 치료제 스크리닝 방법.
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