CN113999318A - 一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组鸡干扰素融合蛋白及其制备方法以及应用，所述重组鸡干扰素融合蛋白为一种重组鸡长效干扰素融合蛋白，包含鸡干扰素和蓖麻毒素B链截短肽，所述鸡干扰素为鸡IFNα突变体蛋白，所述鸡IFNα突变体蛋白的氨基酸序列包括Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。具有半衰期长、生物学活性高的有益效果，同时降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。

Description

一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由鸡干扰素α重组蛋白及其制备方法。
背景技术
我国作为禽类养殖和禽肉生产大国，禽肉产品也是我国具有出口优势的农产品之一，近些年来，病毒性疾病感染不断威胁禽类大规模化养殖。重组鸡IFNα是一种近天然的生物活性糖蛋白，具有高效、稳定、无残留等优点，可作为理想的免疫增强剂，具有广谱抗病毒感染作用。对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、H9N2亚型禽流感病毒(AIV)等多种病毒均有显著的抗病毒活性。相对于哺乳动物Ⅰ型干扰素类细胞因子药物应用发展，禽类干扰素的应用发展进程较慢。现有的禽用干扰素多属于单一的α型或β型，作用效果单一，治疗效果不理想。此外，干扰素在临床中存在半衰期短和体内易降解等难题，限制了干扰素的临床应用。
发明内容
为了克服现有技术中的不足本发明提供了一种重组鸡干扰素融合蛋白，包含鸡干扰素和蓖麻毒素B链截短肽，所述鸡干扰素为鸡IFNα突变体蛋白，所述鸡IFNα突变体蛋白的氨基酸序列包括Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。分别对于野生型和突变蛋白做柔性分析,如果突变区域蛋白柔性提升，则将该区域的一个或几个氨基酸作为突变位点，突变为极性氨基酸。
所述极性氨基酸具有亲水性，提高蛋白等电点和稳定性，通过本发明所选择的位点进行突变，改变了天然蛋白的二硫键，制备得到的突变蛋白在保存过程中不易产生沉淀。本发明所选择的突变位点，突变蛋白与野生型蛋白相比，三维结构没有发生变化，从而维持了蛋白的生物学功能。
优选的是，突变方式包括将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第22位氨基酸天冬氨酸和/或第150位氨基酸色氨酸突变为极性氨基酸。
上述任一项优选的是，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。
上述任一项优选的是，所述重组鸡干扰素融合蛋白还包括蓖麻毒素B链截短肽，所述蓖麻毒素B链蛋白包括Seq ID NO：2所示的蓖麻毒素B链氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸的氨基酸序列。
蓖麻毒素B链(Ricin toxin，RTB)没有毒性且具有增强机体免疫反应的功能。本发明进一步优选的将鸡IFNα与RTBD1截短肽组成融合蛋白获得长效鸡干扰素，可增强鸡干扰素抗病毒活性，提高干扰素在机体血液中蛋白稳定性，进而提高干扰素于机体内药物半衰期。优选的，所述蓖麻毒素B链蛋白的氨基酸序列包括Seq ID NO：2所示的氨基酸序列，优选的，使用截短的蓖麻毒素B链蛋白，截短方式包括将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第1位氨基酸敲除、第1、2位氨基酸敲除、第1至3位氨基酸敲除；和/或将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第135至263位氨基酸序列敲除、第136至263位氨基酸序列敲除、第137至263位氨基酸序列敲除、第138至263位氨基酸序列敲除、第139至263位氨基酸序列敲除、第140至263位氨基酸序列敲除、……、第260至263位氨基酸序列敲除、第261至263位氨基酸序列敲除、第262至263位氨基酸序列敲除、第263位氨基酸序列敲除。本发明所优选的蓖麻毒素B链截短肽减小蛋白分子大小，增加在体内组织的渗透率。
上述任一项优选的是，截短的蓖麻毒素B蛋白为RTBD1，RTBD1的氨基酸序列如SeqID NO：18所示。
上述任一项优选的是，所述融合蛋白包括如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码上述任一项融合蛋白的基因，所述基因序列包含如SeqID NO：4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含有所述基因的重组载体。
本发明还提供了一种含有所述重组载体的工程菌，将所述的重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得所述基因工程菌。
本发明还提供了所述的融合蛋白在抗病毒药物中的应用。本发明的一种鸡干扰素重组融合蛋白能够应用在制备抗病毒药物中。
在本发明一项优选的实施方式中，所述鸡干扰素重组融合蛋白由鸡IFNα与RTBD1经柔性linker连接而形成。作为优选的实施方式，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。优选的，所述鸡IFNα为Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第22位氨基酸天冬氨酸和/或第150位氨基酸色氨酸突变为精氨酸。优选的，RTBD1的氨基酸序列如Seq ID NO：18所示。所获得的含有鸡IFNα突变蛋白和RTBD1的重组融合蛋白命名为mChIFNα/RTBD1。
本发明的一种鸡干扰素重组融合蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一、mChIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建；
步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
步骤三、重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白表达；
步骤四、纯化与复性。
作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
(1)生物信息学分析鸡干扰素ChIFNα潜在突变位点：通过在线公开数据库对鸡干扰素α与鸡I型干扰素受体进行同源建模，使用Z-DOCK获得分子对接结构模型，对I型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，筛选获得潜在的突变位点(突变位点的选择原则为：预测评估突变前后IFN与IFN受体间结合力的变化，推算蛋白三维结构维持的关键位点，再将众多非关键位点作为突变位点的候选进行不同天然氨基酸的定点突变，选择最终突变结果中结合力较高的位点与氨基酸)；
(2)ChIFNα突变基因克隆载体构建：选定鸡IFNα需要突变的位点，设计如Seq IDNO：5、Seq ID NO：6、Seq ID NO：7、Seq ID NO：8、Seq ID NO：9、Seq ID NO：10的核苷酸序列所示的鸡IFNα定点突变引物，以实验室构建的pMD18T-ChIFNα为模板，将Seq ID NO：1所示的鸡IFNα序列中第22位氨基酸天冬氨酸，第150位氨基酸色氨酸突变为精氨酸，增加鸡IFNα与1型干扰素受体的结合能力以增强其抗病毒活性，并将突变后的序列命名为mChIFNα。将突变后的mChIFNα连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-mChIFNα质粒；
(3)RTB截短基因克隆载体构建：设计如Seq ID NO：11和Seq ID NO：12的核苷酸序列所示的RTBD1截短引物，以pMD18T-RTB为模板，将如Seq ID NO：19所示的全长RTB序列中调取第10至402位核苷酸序列，对应RTB氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸，调取基因命名为RTBD1。将调取基因连接至pMD18T克隆载体，测序正确的产物命名为pMD18T-RTBD1质粒；
(4)mChIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建：设计Seq ID NO：13、Seq ID NO：14、Seq ID NO：15、Seq ID NO：16所示的核苷酸序列所示的含有(G4S)3linker基因的重叠PCR引物，以构建正确的上述克隆质粒pMD18T-mChIFNα与pMD18T-RTBD1为模板，扩增获得以5’-mChIFNα-linker-RTBD1-3’为正确构成的融合基因，命名为mChIFNα/RTBD1。将融合基因连接至pMD18T载体，测序正确的产物命名为pMD18T-mChIFNα/RTBD1质粒，以便下游基因工程操作。
作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：
分别对测序正确的pMD18T-ChIFNα/RTBD1质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件见表1，将双酶切产物进行胶回收；利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件见表2；
表1重组质粒双酶切体系
Figure BDA0003330952790000031
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR；将PCR鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。
作为优选的实施方式，步骤三具体包括以下步骤：
将测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-mChIFNα/RTBD1按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
作为优选的实施方式，步骤四具体包括以下步骤：
(1)离子交换层析；
(2)金属鳌合层析；
(3)rmChIFNα/RTBD1蛋白复性。
作为优选的实施方式，步骤(1)具体包括以下步骤：
使用蛋白纯化A液平衡Q柱(强阴离子交换柱)，将rmChIFNα/RTBD1包涵体溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析。
作为优选的实施方式，步骤(2)具体包括以下步骤：
使用蛋白纯化B液对装载Ni2+Chelating Sepharose的层析柱进行平衡；将离子交换层析纯化的rmChIFNα/RTBD1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化B液和蛋白纯化C液进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对chelatingSepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析。(蛋白纯化系统中梯度混合模块，为Akta蛋白纯化系统中模块，仪器厂商为美国通用公司，型号为Akta explorer。)
作为优选的实施方式，步骤(3)具体包括以下步骤：
将经两步纯化的rmChIFNα/RTBD1蛋白溶液使用蛋白复性A液进行稀释，稀释至rmChIFNα/RTBD1浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白中空纤维柱中进行透析复性，向蛋白中空纤维超滤系统中加入蛋白复性B液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rmChIFNα/RTBD1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白。
本发明的有益效果是：本发明的一种鸡干扰素重组融合蛋白，由鸡干扰素α与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成，其中，柔性linker选用(Gly4Ser)3连接肽。本发明的一种鸡干扰素重组融合蛋白比普通鸡干扰素α半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。
附图说明
图1本发明优选实施例2中鸡IFNα突变蛋白与野生型鸡IFNα蛋白三维结构比较结果
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白的制备
1、mChIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建
以对接结构模型建模-生物信息学分析-定点突变-基因截短-基因融合等顺序进行获得mChIFNα/RTBD1融合基因，具体操作步骤如下：
(1)生物信息学分析ChIFNα潜在突变位点：通过在线公开数据库对鸡干扰素α与鸡I型干扰素受体进行同源建模，使用Z-DOCK获得分子对接结构模型，对I型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，以预测的突变后不会破坏蛋白三维结构的位点为候选突变位点，筛选获得潜在的突变位点；
(2)ChIFNα突变基因克隆载体构建：设计鸡IFNα定点突变引物，以实验室构建的pMD18T-ChIFNα为模板(将Seq ID NO：17所示的鸡干扰素ChIFNα核苷酸序列构建于pMD18T载体得到pMD18T-ChIFNα是本领域常规技术，在此不进行赘述)，将鸡IFNα(ChIFNα)序列中第22位天冬氨酸，第150位氨基酸色氨酸突变为精氨酸，增加鸡IFNα与1型干扰素受体的结合能力以增强其抗病毒活性，并将突变后的序列命名为mChIFNα。将突变后的mChIFNα连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-mChIFNα质粒；
(3)RTB截短基因克隆载体构建：设计RTBD1截短引物，以实验室构建的pMD18T-RTB为模板，将全长RTB序列中调取第10至402位核苷酸序列，对应RTB氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸，调取基因命名为RTBD1。将调取基因连接至pMD18T克隆载体，测序正确的产物命名为pMD18T-RTBD1质粒；
(4)mChIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建：设计含有(G4S)3linker基因的重叠PCR引物，以构建正确的上述克隆质粒pMD18T-mChIFNα与pMD18T-RTBD1为模板，扩增获得以5’-mChIFNα-linker-RTBD1-3’为正确构成的融合基因，命名为mChIFNα/RTBD1。将融合基因连接至pMD18T载体，测序正确的产物命名为pMD18T-mChIFNα/RTBD1质粒，以便下游基因工程操作。
2、大肠杆菌重组表达载体构建
分别对上述测序正确的pMD18T-mChIFNα/RTBD1质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收。利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表2所示。
表2重组质粒连接体系
Figure BDA0003330952790000061
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞。转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR。将PCR鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。
3、重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白表达
将上述测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-mChIFNα/RTBD1按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
4、融合蛋白纯化与复性
使用两步纯化法将菌体沉淀rmChIFNα/RTBD1进行纯化。其纯化方法以先进行离子交换层析、后进行金属鳌合层析的顺序进行，具体操作步骤如下：
(1)离子交换层析：使用蛋白纯化A液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，pH 6.0)平衡Q柱，将rmChIFNα/RTBD1包涵体以蛋白纯化A液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析。
(2)金属鳌合层析：使用蛋白纯化B液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，0.5mol/L NaClpH 6.0)对装载Ni2+Chelating Sepharose进行平衡。将离子交换层析纯化的rmChIFNα/RTBD1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化B液和蛋白纯化C液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，0.5mol/L NaCl，500mmol/L Imidazole pH 8.5)进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对chelating Sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液。将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析。
(3)rmChIFNα/RTBD1蛋白复性：将经两步纯化的rmChIFNα/RTBD1蛋白溶液使用蛋白复性A液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/L DTT，pH8.5)进行稀释，稀释至rmChIFNα/RTBD1浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液(50mmol/L Tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，pH 8.5)。蛋白复性过程于4℃进行，蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液(50mmol/L Tris，pH 8.5)去除复性过程中残留的蔗糖及甘油等成分，并将rmChIFNα/RTBD1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白。
实施例2鸡IFNα突变蛋白三维结构验证
制备鸡IFNα突变蛋白(蛋白序列如Seq ID NO：20所示)，所述IFNα突变蛋白的制备方法与实施例1中融合蛋白的制备方法相同。所获得的鸡IFNα突变蛋白与野生型IFNα蛋白(蛋白序列如Seq ID NO：1所示)相比，三维结构未发生改变，如图1所示。
实施例3重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白的抗病毒检测
1、鸡新城疫病毒攻毒感染
选取18只SPF试验鸡，分组情况如表3所示，攻毒前禁饮食，肌肉注射病毒效价为105.0ELD50鸡新城疫病毒液0.2mL。本次试验中采用的病毒模型建立成功标准为：精神萎靡、鸡冠垂下、体温升高至43℃～44℃、减食或拒食、腹泻、黄绿色或黄白色血便，NDV胶体金试纸检测为强阳性。符合以上条件的患鸡，认定模型制备成功。正常组与模型对照组于攻毒前12h肌肉给予生理盐水，给药组将于攻毒前12h将100万IU rmChIFNα/RTBD1肌肉注射至鸡腿部。
表3：rmChIFNα/RTBD1鸡新城疫病毒病治疗动物分组情况
Figure BDA0003330952790000071
2、抗病毒检测
使用胶体金试纸检测鸡新城疫病毒排毒，经肌肉注射rmChIFNα/RTBD1后进行鸡新城疫病毒攻毒，发现给药组受试动物成功抵御105.0ELD50新城疫病毒攻毒，7天代谢过程中未发现排毒，无特异性临床症状，证明rmChIFNα/RTBD1成功干扰鸡新城疫病毒病发病，预防率为100％，各组排毒结果如表4所示。
表4鸡新城疫病毒排毒检测结果
Figure BDA0003330952790000081
实施例4重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白的药代动力学研究
对rmChIFNα/RTBD1进行半衰期的测定，测定方法采用细胞病变抑制法测定rmChIFNα/RTBD1的血药浓度与时间的关系；
取12只SPF试验鸡，分2组(6只/组)：长效干扰素组与普通干扰素组，其中长效干扰素组以本发明提供的rmChIFNα/RTBD1重组融合蛋白作为重组鸡长效干扰素，本发明所使用的普通干扰素(或称天然干扰素)蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO：1所示。
分别肌肉注射0.5mL 2mg/mL rmChIFNα/RTBD1与ChIFNα，注射后1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h静脉采血，血液静置4℃低温凝固后，3000r/min低温离心5min，获取上层血清；
采用细胞病变抑制法测定不同时间点血清中rmChIFNα/RTBD1浓度，利用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算相关参数；
经测定各组的半衰期如下表5所示，rmChIFNα/RTBD1的半衰期远高于ChIFNα，能够显著延长半衰期。
表5药物半衰期测定结果
Figure BDA0003330952790000082
相比较于天然干扰素2.8左右的半衰期，rmChIFNα/RTBD1半衰期的均有大幅度的提升，半衰期提高至4.07倍。
本发明公开了一种鸡干扰素重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 长春萤火虫生物科技有限公司
<120> 一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 163
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus gallus )
<400> 1
Ala Cys Asn His Leu Arg Leu Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser
1 5 10 15
Leu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro
20 25 30
Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser
35 40 45
Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu
50 55 60
Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu
85 90 95
Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro
100 105 110
Arg Asn Pro His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr
115 120 125
Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg
130 135 140
Leu Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn
145 150 155 160
Thr Arg Thr
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> 蓖麻(Ricinus communis)
<400> 2
Ala Asp Val Cys Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg
1 5 10 15
Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn
20 25 30
Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu
35 40 45
Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu
50 55 60
Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys
65 70 75 80
Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly
85 90 95
Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly
100 105 110
Asn Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser
115 120 125
Gln Gly Trp Leu Pro Thr Asn Asn Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile
130 135 140
Val Gly Leu Tyr Gly Met Cys Leu Gln Ala Asn Ser Gly Lys Val Trp
145 150 155 160
Leu Glu Asp Cys Thr Ser Glu Lys Ala Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr
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180 185 190
Thr Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly
195 200 205
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210 215 220
Leu Asn Leu Tyr Asn Gly Leu Val Leu Asp Val Arg Arg Ser Asp Pro
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Ser Ser Leu Lys Gln Ile Ile Val His Pro Val His Gly Asn Leu Asn
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260
<210> 3
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
Leu Gln Leu Leu Arg Arg Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro
20 25 30
Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser
35 40 45
Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu
50 55 60
Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu
85 90 95
Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro
100 105 110
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115 120 125
Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg
130 135 140
Leu Gln Ala Arg Ala Arg Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn
145 150 155 160
Thr Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg Asn Gly
180 185 190
Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala Ile
195 200 205
Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr
210 215 220
Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr
225 230 235 240
Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305
<210> 5
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctgcaacc accttcgcct ccaggatgcc accttctctc acgacagcct ccagctcctc 60
cggcgcatgg ctcccacact accccagctg tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc 120
aacgacacca tcctggacac cagcaacacc cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc 180
cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc cccagcactc cagcccactg gaacgacagc 240
caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg 300
gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga tggcctcgca accctcacct caccatcaaa 360
aaacacttca gctgcctcca caccttcctc caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg 420
gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcccgc ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac 480
acgcgcactg gtggcggcgg tagtggcggc ggtggcagcg gtggtggtgg ttcaatggac 540
cctgaaccga ttgttcgcat tgttggtcgc aatggcctgt gcgtggatgt gcgcgatggt 600
cgttttcata atggtaatgc cattcagctg tggccgtgta aaagcaatac cgatgcaaat 660
cagctgtgga ccctgaaacg tgataatacc attcgtagca atggcaaatg cctgaccacc 720
tatggctata gtccgggtgt ttatgtgatg atctatgatt gtaataccgc agccaccgat 780
gccacccgct ggcagatttg ggataatggt acaattatta acccgcgcag tagtctggtg 840
ctggcagcaa ccagcggcaa tagtggtaca accctgaccg ttcagaccaa tatctatgcc 900
gttagccagg gttggctgcc gacc 924
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 7
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<211> 19
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<400> 8
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catatggcct gcaaccacct t 21
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtggcggcg gtagtggcgg cggtggcagc ggtggtggtg gttcaatgga ccctgaaccg 60
a 61
<210> 15
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaaccacca ccaccgctgc caccgccgcc actaccgccg ccaccagtgc gcgtgttgcc 60
t 61
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaattcaatg gtcggcagcc aacc 24
<210> 17
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcctgcaacc accttcgcct ccaggatgcc accttctctc acgacagcct ccagctcctc 60
cgggacatgg ctcccacact accccagctg tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc 120
aacgacacca tcctggacac cagcaacacc cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc 180
cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc cccagcactc cagcccactg gaacgacagc 240
caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg 300
gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga tggcctcgca accctcacct caccatcaaa 360
aaacacttca gctgcctcca caccttcctc caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg 420
gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac 480
acgcgcact 489
<210> 18
<211> 130
<212> PRT
<213> 蓖麻(Ricinus communis)
<400> 18
Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys
1 5 10 15
Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu
20 25 30
Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys
35 40 45
Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly
50 55 60
Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala
65 70 75 80
Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn
85 90 95
Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser Gln Gly Trp Leu
115 120 125
Pro Thr
130
<210> 19
<211> 798
<212> DNA
<213> 蓖麻(Ricinus communis)
<400> 19
gcagatgttt gcatggaccc tgaaccgatt gttcgcattg ttggtcgcaa tggcctgtgc 60
gtggatgtgc gcgatggtcg ttttcataat ggtaatgcca ttcagctgtg gccgtgtaaa 120
agcaataccg atgcaaatca gctgtggacc ctgaaacgtg ataataccat tcgtagcaat 180
ggcaaatgcc tgaccaccta tggctatagt ccgggtgttt atgtgatgat ctatgattgt 240
aataccgcag ccaccgatgc cacccgctgg cagatttggg ataatggtac aattattaac 300
ccgcgcagta gtctggtgct ggcagcaacc agcggcaata gtggtacaac cctgaccgtt 360
cagaccaata tctatgccgt tagccagggt tggctgccga ccaataatac ccagccgttt 420
gttaccacca ttgttggtct gtatggcatg tgtctgcaag ccaatagtgg taaagtgtgg 480
ctggaagatt gtacaagcga aaaagccgaa cagcagtggg ccctgtatgc cgatggtagc 540
attcgcccgc agcagaatcg cgatagttgc ctgaccacag atgccaatat taaaggcacc 600
gttgttaaaa ttctgagctg cggcccggcc agtagcggcc aacgttagat gtttaaaaat 660
gatggcacca ttctgaatct gtatattggc ctggttctgg atgtgcgtcg cagcgatccg 720
agcagtctga aacagattat tgttcatccg gttcatggca atctgaatca gatttggtta 780
ccgctgtttt aagaattc 798
<210> 20
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Cys Asn His Leu Arg Leu Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser
1 5 10 15
Leu Gln Leu Leu Arg Arg Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro
20 25 30
Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser
35 40 45
Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu
50 55 60
Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu
85 90 95
Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro
100 105 110
Arg Asn Pro His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr
115 120 125
Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg
130 135 140
Leu Gln Ala Arg Ala Arg Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn
145 150 155 160
Thr Arg Thr

Claims (10)

1.一种重组鸡干扰素融合蛋白，包含鸡干扰素和蓖麻毒素B链截短肽，其特征在于，所述鸡干扰素为鸡IFNα突变体蛋白，所述鸡IFNα突变体蛋白的氨基酸序列包括Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，突变方式包括将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第22位氨基酸天冬氨酸和/或第150位氨基酸色氨酸突变为极性氨基酸。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。
4.如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述蓖麻毒素B链截短肽包括Seq ID NO：2所示的蓖麻毒素B链氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列。
6.一种编码权利要求5所述融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列包含如Seq IDNO：4所示的核苷酸序列。
7.一种含有权利要求6所述基因的重组载体。
8.一种含有权利要求7所述重组载体的基因工程菌，其特征在于，将权利要求7所述的重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得所述基因工程菌。
9.一种制备权利要求1至5任一项所述融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、mChIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组mChIFNα/RTBD1融合蛋白表达；步骤四、纯化与复性。
10.权利要求1至5任一项所述的融合蛋白在抗病毒药物中的应用。
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