CN110923217B

CN110923217B - 可识别2’-o-甲基化修饰rna的核糖核酸酶r及其应用

Info

Publication number: CN110923217B
Application number: CN201911266789.4A
Authority: CN
Inventors: 阿不都热依木·阿布拉; 籍晓云
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110923217A

Abstract

本发明利用基因工程对核糖核酸酶R进行氨基酸优化，获得了可识别2’‑O‑甲基化修饰RNA的核糖核酸酶R。具体为生殖支原体来源的核糖核酸酶R氨基酸序列的第277、455、456、457、459、460、461、464、465、467、562位中的一个或多个位点的氨基酸发生突变，或者大肠杆菌来源的核糖核酸酶R氨基酸序列的第273、557氨基酸序列中的一个或多个位点的氨基酸发生突变。本发明所述的核糖核酸酶能够快速鉴定2’‑O‑甲基化修饰的RNA，能够从2’‑O‑甲基化修饰和非2’‑O‑甲基化修饰的RNA混合物中，特异性分离筛选2’‑O‑甲基化修饰的RNA，并进行富集或者纯化。本发明所述的可识别2’‑O‑RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R在生命科学研究以及医学检验过程中具有潜在应用价值。

Description

可识别2’-O-甲基化修饰RNA的核糖核酸酶R及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、基因工程以及蛋白质工程领域，具体涉及一种由基因工程改造的可识别2’-O-甲基化修饰RNA核糖核酸酶R(Ribonuclease R，RNase R)及其在检测、筛选2’-O-甲基化修饰的RNA中的应用。

背景技术

RNA的2’-O-甲基化修饰是一种由RNA甲基化酶或纤维蛋白酶介导的，在RNA核糖的2’位置上发生甲基化的化学修饰。研究表明，2’-O-RNA甲基化修饰在mRNA、tRNA、rRNA、sRNA、miRNA等分子上分布广泛并且在哺乳动物、酵母、植物、病毒等生物中普遍存在。在结构层面上，RNA的2’-O-甲基化修饰通过提高核苷酸的疏水性进而增强其稳定性。已有研究表明，2’-O-RNA甲基化影响mRNA与蛋白的结合、调控rRNA的翻译效率、参与tRNA的识别。近年来，2’-O-RNA甲基化修饰作为一类新型的RNA甲基化表观修饰，是继m6A之后的又一表观转录组学热点。

人细胞中的RNA 2’-O-甲基化修饰缺陷常常与疾病密切相关,潜在的RNA 2’-O-甲基修饰酶已经成为药物研发的新靶点。2019年法国蒙彼利埃大学Yamina课题组首次发现HIV病毒上存在2’-O-甲基化位点，其感染宿主细胞的活性受甲基转移酶FTSJ3调控。HIV病毒RNA上的2’O-甲基化修饰让它成功逃离了MDA5的感应，从而完成了免疫逃逸。因此，2’-O-甲基化修饰是哺乳动物细胞识别“自我”和“非我”RNA的重要标记。

核糖核酸酶是一类能够水解不同类型的RNA分子的蛋白质。核糖核酸酶具有一定的底物专一性和作用模式特异性。RNase R是属于RNR超家族的一类3’-5’核糖核酸外切酶，可按3’-5’方向将RNA逐步切割成单核苷酸。RNase R在生物界广泛存在，不同生物来源的RNase R具有不同的核糖核酸酶活性。例如大肠杆菌来源的核糖核酸酶R(Escherichiacoli RNase R，EcR)不具有RNA序列特异性，不能识别甲基化等表观修饰，并且在水解RNA过程中不产生任何的中间产物。生殖支原体核糖核酸酶R(Mycoplasma Genitalium RNase R，MgR)虽然能够很弱的识别RNA上的2’-O-甲基化修饰，水解反应中暂时停留在甲基化修饰位点，但是会继续降解中间产物，水解反应产物与非2’-O-甲基化修饰RNA的相同。

利用对核糖核酸酶R的改造，实现对2’-O-甲基化修饰RNA的识别，将会丰富人们对2’-O-RNA甲基化修饰的生物学功能的认知；在探索2’-O-甲基化修饰RNA在人类疾病的致病机制上具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明通过结构生物学手段，解析了核糖核酸酶R与RNA复合物的三维晶体结构，发现RNA上2’-O位置与MgR的氨基酸氢键相互作用，分析核糖核酸酶R对2’-O-甲基化修饰RNA敏感活性的关键的作用的氨基酸，利用基因工程对其进行氨基酸优化，获得了可识别2’-O-甲基化修饰RNA核糖核酸酶R。

本发明具体技术方案如下：

一种可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R，其特征在于：生殖支原体来源的核糖核酸酶R(MgR)氨基酸序列的第277、284、455、456、457、459、460、461、464、465、467、562位中的一个或多个位点的氨基酸发生一种或几种突变。

大肠杆菌来源的核糖核酸酶R(EcR)氨基酸序列的第273、557位的一个或多个位点的氨基酸发生一种或几种突变。

进一步地优选的，所述可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R为发生以下突变的生殖支原体来源的核糖核酸酶：

①第277位的脯氨酸突变为甘氨酸(SEQ ID NO:1)；

②第284位的天冬氨酸突变为丙氨酸；

③第455位的组氨酸突变为精氨酸、456位天冬氨酸突变为天冬酰胺、457位赖氨酸突变为天冬氨酸，460位苏氨酸突变为赖氨酸、461位谷氨酸突变为亮氨酸、464位天冬酰胺突变为谷氨酸、465位亮氨酸突变为半胱氨酸、467位颉氨酸突变为异亮氨酸；

④第459位的谷氨酸突变为丙氨酸；

⑤第562位的丝氨酸突变为甘氨酸(SEQ ID NO:2)；

所述可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R为发生以下突变的大肠杆菌来源的核糖核酸酶R：

⑥第273位的甘氨酸突变为脯氨酸(SEQ ID NO:3)；

⑦第557位甘氨酸突变为丝氨酸(SEQ ID NO:4)

本发明所述可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶MgR-S562G、EcR-G273P突变体，通过酶动力学实验证实，对RNA上2’-O-甲基化修饰的识别活性增强。在相同的实验条件下，MgR-S562G、EcR-G273P突变体相比野生型的MgR和EcR几乎失去了水解2’-O-甲基化修饰的RNA底物，然而对非2’-O-甲基化修饰的RNA底物的降解与野生型MgR和EcR无异。

本发明所述的可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R，特别是MgR-S562G、EcR-G273P，具有如下优点：

(1)能够快速鉴定是否是2’-O-甲基化修饰的RNA。

(2)能够从2’-O-甲基化修饰和非2’-O-甲基化修饰的RNA混合物中，特异性分离筛选2’-O-甲基化修饰的RNA。

(3)能够富集或者纯化得到2’-O-甲基化修饰RNA。

本发明所述的可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R在生命科学研究以及医学检验过程中具有潜在应用价值。

附图说明

图1.野生型MgR降解没有被2’-O-甲基化修饰的40nt-RNA底物的产物Urea-PAGE电泳分离结果图。

图2.野生型MgR降解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA的产物Urea-PAGE电泳分离结果图。

图3.野生型MgR和突变体MgR-S562G，在相同条件下，水解2’-O-甲基化修饰的30-nt RNA产物的Urea-PAGE电泳分离结果图。

图4.突变体MgR-S562G，在相同条件下水解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA及非甲基化修饰的40nt-RNA的产物Urea-PAGE电泳分离结果图。

图5.野生型EcR，在相同条件下水解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA及非甲基化修饰的16nt-RNA的产物Urea-PAGE电泳分离结果图。

图6.EcR-G273P突变体，在相同条件下水解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA以及非2’-O-甲基化的16nt-RNA的产物Urea-PAGE电泳分离结果图。

图7.不同核糖核酸酶R在相同条件下水解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA时，识别2’-O-甲基化修饰的能力比对结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，但不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1野生型MgR、EcR表达载体的构建

1.目的基因的PCR扩增引物设计。本发明中把MgR核苷酸序列(GI：504707467)、EcR的核苷酸序列(GI：928831713)人工合成后，分别重组到pET19b表达载体的Nde1和BamH1酶切位点中间。pET19b载体从EK酶切位点和BamH1酶切位点作为载体两端设计了表达载体线性化扩增引物表1，另外分别设计了MgR、EcR基因片段扩增引物(见表1)。

表1.目的基因的PCR扩增引物

2.目的基因的PCR扩增。利用诺唯赞生物公司的DNA聚合酶是

Max Super-Fidelity DNA Polymerase/P505，反应体系成分以及PCR条件如下(见表2)。

表2：PCR反应体系成分以及反应条件

3.MgR、EcR野生型核糖核酸酶R表达载体的构建。

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用PCR产物清洁试剂盒净化PCR产物，PCR反应产物净化过程完全参照试剂盒中说明书。使用诺唯赞的Clone

Ultra OneStep Cloning Kit/C115同源重组酶，将目的基因同源重组到PET19b线性载体上，构建重组表达载体(反应体系见表3)。取5μL同源重组产物加到100μL DH5α感受态细胞中，冰上静置30分钟后，42℃热激1分30秒；冰上静置3分钟后，往DH5α感受态细胞中加入700μL无抗LB液体培养基，在37℃，200rpm/min震荡培养1小时。取100μL菌液涂到含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，倒置在37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上的单克隆菌落，加入5ml的含有氨苄抗生素的LB液体培养基，37℃过夜培养，测序验证基因序列。

表3：同源重组反应体系成分表

备注：X＝(0.02*载体碱基对数量)/载体浓度；Y＝(0.04*片段碱基对数量)/插入片段浓度

实施例2本发明所述MgR以及EcR突变体核糖核酸酶R的制备

1.通过X射线晶体衍射的方法解析了MgR蛋白三位晶体结构，发现：

(1)第284位的天冬氨酸结合了一个镁离子，催化了磷酸二酯键的水解。因此拟将MgR第284位的天冬氨酸进行突变，考察其丧失水解磷酸二酯键的能力。

(2)第277位的脯氨酸与9个核苷酸RNA上的，第2个核苷酸的2’-O位置形成了氢键相互作用。因此拟将MgR的第273冬氨酸进行突变，考察分子量大的脯氨酸是否在识别2’-O-甲基化修饰过程中具有空间阻碍的能力。

(3)第455位组氨酸、456位天冬氨酸、457位赖氨酸，460位苏氨酸、461位谷氨、464位天冬酰胺、465位亮氨酸、467位颉氨酸靠近催化活性中心，通过非共价键正确定位RNA进入活性中心的方向。因此拟将MgR的上述氨基酸进行突变，考察活性中心的氨基酸是否在识别2’-O-甲基化修饰过程中起作用。

(4)第459位的谷氨酸在处甲基化RNA过中，空间构象发生了变化。因此拟将MgR的第459位的谷氨酸进行突变，考察其丧失识别2’-O-甲基化修饰的能力。

(5)第562位的丝氨酸与9个核苷酸RNA上的，第5个核苷酸的2’-O位置形成了氢键相互作用。因此拟将MgR的第562丝氨酸进行突变，考察氢键在MgR识别2’-O-甲基化修饰过程中影响。

2.本发明通过X射线晶体衍射的方法解析了EcR三位晶体结构，发现：

(6)第273位的甘氨酸与9个核苷酸RNA上的，第2个核苷酸的2’-O位置距离很近。因此拟将EcR的第277甘氨酸进行突变，考察分子量小的甘氨酸是否在识别2’-O-甲基化修饰过程中起作用。

(7)第557位的甘氨酸与9个核苷酸RNA上的，第5个核苷酸的2’-O位置形成了氢键相互作用。因此拟将MgR的第557位的丝氨酸进行突变，考察氢键在EcR不识别2’-O-甲基化修饰过程中的作用。

3.本发明针对上述的多种突变体核糖核酸酶R，分别设计了PCR定点突变引物(见表4)。利用诺唯赞的DNA聚合酶

Max Super-Fidelity DNA Polymerase，通过PCR反应循环延伸重组载体，然后用DpnI酶切延伸产物，去除反应体系中含有甲基化标记的模板质粒。利用上述构建载体相同的方法转化DH5α感受态细胞，涂平板，挑取单克隆菌落测序验证突变的核苷酸序列。

表4：制备MgR突变体PCR引物

实施例3体外分离纯化野生型以及突变体核糖核酸酶R

1.选取测序结果正确无误的重组体质粒，将其转化到BL21(DE3)感受态细胞中，加入700μL LB液体培养基并悬摇1小时后，将其置入50mL含氨苄青霉素的LB培养基中,在37℃、200rpm/min震荡培养12小时。在750mL的含有氨苄青霉素的TB培养基中，按1:50的比例接种过夜培养的菌液。在37℃、220rpm/min震荡培养大约2.5h后，利用紫外-可见分光光度计(Mettler)测量其OD600，当菌液的OD600在0.6-0.8时，将培养物放入4℃冰箱冷却10min，然后加入终浓度为0.25mM的IPTG,在16℃、200rpm/min的条件下诱导表达20小时。

2.将诱导表达20h后的培养物在5500rpm/min，4℃条件下离心15分钟收集菌体。将1.5L菌液中的菌体重悬在50mL的细胞裂解溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl,5mMMgCl2，0.1％Triton X-100,5％(vol/vol)glycerol，1mM PMSF)中，充分震荡混匀后利用低温高压细胞破碎仪(JNBIO-JN-02C)，设置压力为1400bar，重复破碎三次。将破碎后的样品4℃、15000rpm/min离心1小时，收集离心后的上清，用0.22μm的滤膜过滤，除去样品中剩余的细胞碎片。

3.使用GE AKTA Pure蛋白层析纯化仪对目的蛋白进行纯化。先用His Trap合亲和层析柱分离目的蛋白。Buffrer A溶液：50mM Tris–HCl,pH 7.5,500mM NaCl,5mM MgCl₂,5％(vol/vol)glycerol；Buffer B溶液：含有500mM咪唑的A溶液。用300mM的咪唑(60％buffer B)洗脱目的蛋白；收集的目的蛋白再通过Hiload 16/600Superdex 200pg凝胶过滤层析除去多聚体，获得单体目的核糖核酸酶R。将纯化的核糖核酸酶R样品分装到1.5ml离心管中，用液氮冷冻后-80℃保存。

4.蛋白鉴定以及浓度测定。吸取2μL蛋白样品，加入5μL 4×Protein loadingbuffer、13μL ddH2O，100℃下加热变性五分钟，冰上冷却后，取10μL样品进行SDS-PAGE检测，设置200V电压，当溴酚蓝条带移动至凝胶下缘时停止电泳。将凝胶从胶板上取下，放入蛋白染色液中染色10分钟，然后用纯水洗去多余的染液。在凝胶显影仪中观察并采集数据。使用紫外-分光光度计(Mettle)进行核糖核酸酶R浓度测定。将Buffer A溶液作为空白对照检测目的蛋白在UV280的紫外吸收值。该吸收值除以蛋白消光系数后的所得值为实际的蛋白浓度(MgR以及突变体消光系数为0.779，EcR以及突变体消光系数为0.689)。

实施例4核糖核酸酶R底物设计以及活性测定

1.核糖核酸酶R底物设计。为了在核糖核酸酶R活性测定实验中便于检测RNA底物，本发明中使用的所有RNA底物在5’端用FAM荧光素进行标记；同时为了检测核糖核酸酶R对2’-O-甲基化修饰的敏感性，部分RNA同时以人工合成的方法进行2’-O-甲基化表观修饰(RNA底物序列见表6)。

表5：不同的RNA底物序列

2.核糖核酸酶R活性测定方法。设计总反应体系为20μL，其中RNA终浓度为25μM，核糖核酸酶R终浓度为1.5mM；加入反应溶液(20mM Tris-HCl pH 8.5，100mM KCl，1mM MgCl₂)将反应体系补充至20μL。将配置好的反应体系快速混匀并离心，置于37℃孵育，进行核糖核酸酶R水解反应。为了检测核糖核酸酶R水解RNA底物随时间的产物变化，每隔特定时间点，吸取3μL反应产物，加入到终止反应溶液(4μL的2×RNA loading buffer以及1μL的10mMEDTA)中。将其混匀后在70℃下加热5分钟，置于冰上冷却后高速离心，然后使用15％的Urea-PAGE胶进行分离(Urea-PAGE胶配方见表7)。电泳过程中为了避免放热对RNA降解的影响，将电泳仪放入冰水浴中。电源调整到20mA恒流模式下，预电泳5分钟。分别吸取样品各5μL加入各上样品孔中，在20mA恒定电流下电泳大约30min。电泳结束后，将凝胶置于荧光成像仪中，进行成像与采集数据。

表6:核糖核酸酶R活性测定反应体系各组成分

表7:Urea-PAGE配方表

3.不同突变体核酸酶R的活性测定及比对分析结果。反应体系各组成分中核糖核酸酶R包括上述的所有的野生型及突变体核糖核酸酶。我们根据发明验证需要组合不同的核糖核酸酶R以及RNA底物成分。

活性测定及比对分析结果如下：

(1)野生型MgR-WT在上述活性测定实验条件下，能够彻底降解没有被甲基化修饰的40-nuocletide RNA底物(图1)。

(2)野生型MgR-WT当降解2’-O-甲基化修饰RNA底物时，暂时停留在甲基化修饰的位置并且形成中间产物，但是可识别甲基化修饰能力很弱，因此随着时间变化，底物都被降解(图2)。

(3)野生型MgR和MgR-S562G突变体，当降解相同的2’-O-甲基化修饰RNA底物时，由于MgR-S562G可识别2’-O-甲基化修饰活性增强，因此底物几乎没有被水解。然而野生型MgR，随着时间变化，把2’-O-甲基化修饰RNA底物彻底降解掉了(图3)。

(4)MgR-S562G突变体，相同条件下降解2’-O-甲基化修饰30ntRNA及非甲基化的40nt-RNA时，能够选择性的降解没有甲基化修饰的40nt-RNA。由于MgR-S562G突变体识别2’-O-甲基化修饰活性增强，因此保护甲基化修饰的底物，几乎没有被降解(图4)。

(5)野生型EcR在相同条件下，彻底降解没有被甲基化修饰的16nt-RNA底物。由于它不能特异性识别2’-O-甲基化修饰RNA底物，因此彻底降解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA底物(图5)。

(6)EcR-G273P突变体在相同条件下，降解2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA及非2’-O-甲基化的16nt-RNA的产物时，由于它能够特异性的识别2’-O-甲基化修饰的30nt-RNA，因此保护2’-O-甲基化修饰的RNA底物，几乎没有被降解。然而非2’-O-甲基化的16nt-RNA选择性都彻底被降解(图6)。

(7)本发明中的其他突变体(MgR-D284A、MgR-P277G、MgR-H455R&D456N&K457D&T460K&M461L&N464E&L465C&V467I、MgR-E459A、EcR-G557S)都与野生型核糖核酸酶R相同，未发现显著的可识别2’-O-甲基化修饰的活性(图7)。

综上所述，本发明通过基因工程获得的MgR-S562G和EcR-G273P具有很强的特异性识别RNA上的2’-O-甲基化修饰的活性。从而使它们成为了能够快速鉴定是否是2’-O-甲基化修饰的RNA；或者能够从2’-O-甲基化修饰和非2’-O-甲基化修饰的RNA混合物中，特异性分离筛选2’-O-甲基化修饰的RNA；或者能够富集或者纯化得到2’-O-甲基化修饰RNA的基因工程酶。

序列表

<110> 南京大学

<120> 可识别2’-O-甲基化修饰RNA的核糖核酸酶R及其应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Val Leu Thr Glu Leu Gln Lys Gln Ile Phe Thr Ile Val Lys

1 5 10 15

Lys Glu Asn Gly Lys Pro Ile Pro Pro Gly Ile Val Val Arg Met Met

20 25 30

Glu Asn Ser Pro Asn Phe Pro Gly Lys His Leu Ile Tyr Arg Ala Ile

35 40 45

Asp Asp Leu Leu Asp Trp Ala Ile Leu Arg Lys Ala Gly Gly Val Thr

50 55 60

Asn Gln Leu Leu Val Asn Tyr Glu Pro Ala Glu Pro Leu Leu Asp Lys

65 70 75 80

Lys Leu Gln Gly Ile Leu Thr Leu Gly Asn Lys Asn Ser Gly Phe Ile

85 90 95

Arg Ser Leu Asp Asp Asp Lys Thr Val Tyr Tyr Val His Tyr Ser Asn

100 105 110

Leu Thr Gly Ala Leu Asp Gly Asp Leu Val Glu Phe Cys Lys Leu Asp

115 120 125

Lys Pro Gln Phe Gly Asp Lys Phe Asp Ala Ala Val Ile Thr Ile Leu

130 135 140

Lys Arg Ala Arg Ile Leu Tyr Ala Gly Asn Phe Leu Val Asp Gln Asn

145 150 155 160

Glu Phe Ala Leu Glu Tyr Lys Ile Val Ala Asp Asn Pro Arg Phe Tyr

165 170 175

Leu Thr Met Ile Val Asn Pro Asp Ser Ile Pro Asn Asn Leu Ala Ser

180 185 190

Asn Thr Lys Ile Ala Phe Gln Ile Asp Glu Tyr Asp Pro Asp Asn Asn

195 200 205

Leu Cys Lys Val Ser Val Gln Gln Val Leu Gly Asn Asn Asp Asp Pro

210 215 220

Leu Ile Asn Ile Lys Ala Ile Met Leu Asp Asn Ser Ile Val Phe Glu

225 230 235 240

Thr Asn Asp Val Val Glu Gln His Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asp Thr

245 250 255

Glu Glu Gln His Lys Ala Tyr Arg Gln Asp Leu Thr Asp Leu Ala Phe

260 265 270

Val Thr Val Asp Gly Thr Thr Ser Lys Asp Leu Asp Asp Ala Ile Tyr

275 280 285

Val Lys Thr Ile Pro Thr Gly Phe Val Leu Tyr Val Ala Ile Ala Asp

290 295 300

Val Ala His Tyr Val Asn Arg Asn Ser Glu Ile Asp Ile Glu Ala Lys

305 310 315 320

His Lys Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly His Tyr Val Val Pro Met

325 330 335

Leu Pro Glu Gln Leu Ser Asn Gln Leu Cys Ser Leu Asn Pro Ala Gln

340 345 350

Lys Arg Tyr Val Val Val Cys Glu Ile Ser Phe Asp Asn Gln Gly Arg

355 360 365

Ile Lys Thr Asn Lys Leu Tyr Pro Ala Thr Ile Ile Ser Lys Asn Arg

370 375 380

Phe Ser Tyr Asp Gln Val Asn Lys Trp Leu Asn Asn Lys Ser Glu Leu

385 390 395 400

Asn Cys Asp Glu Thr Val Ile Asn Ser Leu Lys Ala Ala Phe Thr Leu

405 410 415

Ser Asp Leu Ile Gln Ala Gln Arg Gln Lys Arg Gly Thr Ile Asp Leu

420 425 430

Ser His Lys Glu Thr Glu Ile Val Val Asp Glu His Tyr Phe Pro Ile

435 440 445

Lys Ile Asn Phe Leu Val His Asp Lys Ala Glu Thr Met Ile Glu Asn

450 455 460

Leu Met Val Val Ala Asn Glu Thr Val Ala Trp Val Leu Thr Asn Asn

465 470 475 480

Lys Ile Ala Leu Pro Tyr Arg Val His Pro Arg Pro Ser Lys Lys Lys

485 490 495

Leu Gln Ser Leu Ile Glu Thr Val Gly Glu Leu Asn Ile Thr Lys Pro

500 505 510

Gln Phe Asn Leu Asp Thr Val Thr Ser Ser Gln Ile Ala Ser Trp Leu

515 520 525

Asn Glu Asn Lys Asp Asn Pro Ser Tyr Glu Ile Phe Val Ile Leu Leu

530 535 540

Leu Arg Thr Leu Gly Lys Ala Phe Tyr Ser Val Asn Pro Leu Met His

545 550 555 560

Phe Ser Ile Gly Ser Asn His Tyr Thr His Phe Thr Ser Pro Ile Arg

565 570 575

Arg Tyr Ile Asp Leu Thr Ile His Arg Leu Leu Trp Met His Leu Phe

580 585 590

Thr Pro Asp Gln Phe Thr Asp Asn Glu Arg Asp Gln Leu Lys Gln Glu

595 600 605

Leu Glu Lys Ile Ala Asp Thr Val Asn Asp Thr Glu Ile Lys Ile Ile

610 615 620

Asn Cys Glu Arg Asn Ala Asn Asp Tyr Leu Thr Thr Leu Leu Leu Ser

625 630 635 640

Lys Gln Ile Gly Lys Thr Phe Ser Gly Phe Ile Ser Ala Ile Thr Ser

645 650 655

Phe Gly Ile Phe Met Arg Met Asp Glu Asn Asn Phe Asp Gly Leu Ile

660 665 670

Lys Ile Thr Thr Ile Pro Asp Asp Phe Phe Ile Phe Glu Lys Glu Lys

675 680 685

Met Val Leu Lys Gly Arg Lys Thr Asn Lys Val Tyr Lys Ile Gly Asp

690 695 700

Arg Leu Glu Ala Lys Leu Ser Glu Ile Asp Phe Ile Gln Lys Arg Ala

705 710 715 720

Ile Leu Thr Leu Ile

725

<210> 2

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Val Leu Thr Glu Leu Gln Lys Gln Ile Phe Thr Ile Val Lys

1 5 10 15

Lys Glu Asn Gly Lys Pro Ile Pro Pro Gly Ile Val Val Arg Met Met

20 25 30

Glu Asn Ser Pro Asn Phe Pro Gly Lys His Leu Ile Tyr Arg Ala Ile

35 40 45

Asp Asp Leu Leu Asp Trp Ala Ile Leu Arg Lys Ala Gly Gly Val Thr

50 55 60

Asn Gln Leu Leu Val Asn Tyr Glu Pro Ala Glu Pro Leu Leu Asp Lys

65 70 75 80

Lys Leu Gln Gly Ile Leu Thr Leu Gly Asn Lys Asn Ser Gly Phe Ile

85 90 95

Arg Ser Leu Asp Asp Asp Lys Thr Val Tyr Tyr Val His Tyr Ser Asn

100 105 110

Leu Thr Gly Ala Leu Asp Gly Asp Leu Val Glu Phe Cys Lys Leu Asp

115 120 125

Lys Pro Gln Phe Gly Asp Lys Phe Asp Ala Ala Val Ile Thr Ile Leu

130 135 140

Lys Arg Ala Arg Ile Leu Tyr Ala Gly Asn Phe Leu Val Asp Gln Asn

145 150 155 160

Glu Phe Ala Leu Glu Tyr Lys Ile Val Ala Asp Asn Pro Arg Phe Tyr

165 170 175

Leu Thr Met Ile Val Asn Pro Asp Ser Ile Pro Asn Asn Leu Ala Ser

180 185 190

Asn Thr Lys Ile Ala Phe Gln Ile Asp Glu Tyr Asp Pro Asp Asn Asn

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Leu Cys Lys Val Ser Val Gln Gln Val Leu Gly Asn Asn Asp Asp Pro

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Leu Ile Asn Ile Lys Ala Ile Met Leu Asp Asn Ser Ile Val Phe Glu

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Val Ala His Tyr Val Asn Arg Asn Ser Glu Ile Asp Ile Glu Ala Lys

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caaaacaaaa caaaacaaaa caaaacaaaa 30

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<211> 40

<212> RNA

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<400> 26

cuuuuguuuu cuuuucuuuu guuuucuuuu guuuucuuuu 40

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<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caaaacaaaa caaaaa 16

Claims

1.一种可识别2’-O-RNA 甲基化修饰的核糖核酸酶 R，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO: 2或SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1所述的核糖核酸酶 R在非诊断目的的检测 2’-O-甲基化修饰 RNA 中的应用。