CN116323934A - 生产临床级慢病毒载体的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于制造和纯化临床级逆转录病毒载体如慢病毒载体的改进方法。

Description

生产临床级慢病毒载体的方法
相关申请的交叉引用
本申请是要求2020年8月13日提交的美国临时申请号63/065,225的优先权权益的PCT申请；其整体通过引用明确地并入本文。
背景技术
使用工程化以表达免疫受体的T细胞的新型疗法已经产生了用于众多种难治性疾病(包括癌症和自身免疫性疾病)的有希望的免疫疗法。慢病毒载体已经在许多不同的应用中用于递送转基因，因为慢病毒能够感染非分裂细胞(Lewis和Emerman(1993)J.Virol.68:510)。另外，慢病毒载体允许转基因的非常稳定、长期的表达。
生产慢病毒载体的方法并不简单；其需要许多步骤。虽然许多方法将取得一定程度的成功，但是对于载体的临床应用而言，对不含任何生物和非生物污染物的高纯度样品的需要使这些方法进一步复杂化。载体纯化过程是临床基因转移疗法中的关键步骤，并且需要新型方法来更有效、安全且大规模地提供病毒载体。本公开文本解决了这种需要。
发明内容
本公开文本大体上涉及用于生产和纯化慢病毒载体的方法。
在一些方面，本公开文本广泛地涉及一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法包括(a)用核酸酶处理过滤除菌的慢病毒载体制剂，以及(b)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生所述慢病毒载体配制品；其中所述浓缩步骤是所述方法中的最终步骤。在一些方面，所述方法包括细胞培养上清液的澄清。在一些方面，所述澄清之后是第一核酸酶处理。在一些方面，所述核酸酶具有内切核酸酶活性。在一些方面，所述核酸酶具有外切核酸酶活性。在一些方面，所述核酸酶是来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的经修饰的核酸酶。
在一些方面，在所述第一核酸酶处理之后进行超滤/渗滤步骤。在一些方面，所述超滤/渗滤步骤包括切向流过滤。在一些方面，所述超滤/渗滤步骤包括中空纤维过滤。
在一些方面，在所述慢病毒载体制剂的过滤除菌前稀释所述慢病毒载体制剂。在一些方面，将所述慢病毒载体制剂稀释到配制缓冲液中。在一些方面，在所述超滤/渗滤步骤期间，将所述慢病毒载体制剂稀释到所述配制缓冲液中。
在一些方面，所述方法包括第二核酸酶处理。在一些方面，所述第二核酸酶处理是所述方法中的倒数第二个步骤。在一些方面，所述核酸酶具有内切核酸酶活性。在一些方面，所述核酸酶具有外切核酸酶活性。在一些方面，所述核酸酶是来自粘质沙雷氏菌的经修饰的核酸酶。
在一些方面，本公开文本大体上涉及一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法包括：(a)培养产生所述慢病毒载体的细胞；(b)从所述培养的细胞收集上清液；(c)澄清所述上清液；(d)浓缩所述澄清的上清液；(e)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒载体制剂；(f)对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌；(g)用一种或多种核酸酶处理所述过滤除菌的慢病毒载体制剂；以及(h)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物。
在一些方面，本公开文本大体上涉及一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法包括：(a)培养产生所述慢病毒载体的细胞；(b)从所述培养的细胞收集上清液；(c)澄清所述上清液；(d)浓缩所述澄清的上清液；(e)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒载体制剂；(f)对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌；以及(g)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物；其中用核酸酶处理所述澄清的上清液和/或所述慢病毒载体制剂。在一些方面，浓缩所述澄清的上清液包括用配制缓冲液交换所述浓缩的上清液。
在一些方面，用核酸酶处理所述澄清的上清液和所述慢病毒载体制剂。在一些方面，在(d)前用所述核酸酶处理所述澄清的上清液。在一些方面，在(c)之后用所述核酸酶处理所述澄清的上清液。在一些方面，所述核酸酶具有内切核酸酶活性。在一些方面，所述核酸酶具有外切核酸酶活性。在一些方面，所述核酸酶是来自粘质沙雷氏菌的经修饰的核酸酶。
在一些方面，本公开文本大体上涉及一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法按时间顺序包括以下步骤：(a)培养产生所述慢病毒载体的细胞；(b)收集包含所述慢病毒载体的上清液；(c)澄清所述上清液；(d)用核酸酶处理所述澄清的上清液；(e)浓缩所述核酸酶处理的澄清的上清液，包括用配制缓冲液交换所述浓缩的上清液；(f)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒制剂；(g)对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌；(h)用核酸酶处理所述过滤除菌的慢病毒载体制剂；以及(i)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物。
在一些方面，本公开文本大体上涉及一种用于生产病毒载体配制品的方法，所述方法包括：培养产生所述病毒载体的细胞，从所述培养的细胞收集上清液，澄清所述上清液，浓缩所述澄清的上清液，从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生病毒载体制剂，对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌，以及浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物；其中所述方法优选包括仅用单个核酸酶步骤处理所述载体，并且其中所述载体的纯化可以(1)经由一轮或多轮色谱进行，(2)经由高速离心或超速离心进行，或(3)经由浓缩溶液(诸如PEG或LENTI-X浓缩剂)进行。在一些方面，所述方法包括两个单独的核酸酶处理步骤。在一些方面，所述两个单独的核酸酶处理步骤之一被载体纯化步骤替代，所述载体纯化步骤包括经由(1)一轮或多轮色谱，(2)高速离心或超速离心，或(3)浓缩溶液(诸如PEG或LENTI-X浓缩剂)纯化载体。在一些方面，本文所述的方法包括两个单独的核酸酶处理步骤：第一核酸酶处理和第二核酸酶处理。在一些方面，所述第一核酸酶处理被载体纯化步骤替代，所述载体纯化步骤包括经由(1)一轮或多轮色谱，(2)高速离心或超速离心，或(3)浓缩溶液(诸如PEG或LENTI-X浓缩剂)纯化载体。在一些方面，所述第二核酸酶处理被载体纯化步骤替代，所述载体纯化步骤包括经由(1)一轮或多轮色谱，(2)高速离心或超速离心，或(3)浓缩溶液(诸如PEG或LENTI-X浓缩剂)纯化载体。
本文描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于在本发明内容和以下附图说明以及具体实施方式中阐述或描述或参考的那些属性和实施方案。并非旨在包括一切，并且本文描述和要求保护的发明不限于此发明内容中确定的特征或实施方案或由这些特征或实施方案限定，其仅出于说明而非限制的目的而被包括在内。另外的实施方案可以公开在以下具体实施方式中。
附图说明
图1描绘了本公开文本的病毒纯化方法的示意图。CC700的陈述相当于包含CAPTOCORE 700的柱，CAPTOCORE 700是用于纯化/精制(polish)病毒和其他大生物分子的多元色谱树脂。
图2展示了qPCR测定的结果，其中检测并量化了水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因。VSV-G检测有效地测量在载体制造过程中的多个点仍然存在的残留VSV-G的量。残留VSV-G的量通常是载体生产中留下的残留质粒污染物的量的量度。所述图是在生产载体的方法中的三个步骤之后见到的步骤去除百分比的图示。澄清之后立即收集“收获”样品。在第一切向流过滤步骤之后立即收集“TFF 1”样品。在最终切向流过滤步骤之后立即收集“TFF 2”样品，从而产生慢病毒载体生产和纯化方法的终结果。将数据归一化，使得收获样品中VSV-G的量为1％或100％，并且TFF1样品中VSV-G的量为0.16％或16％，并且TFF2样品中VSV-G的量为0.009％或0.09％。
图3展示了用于确定各种慢病毒载体滴度对经历了本公开文本的病毒纯化方法的慢病毒载体的总产率百分比的影响的测定的结果。
具体实施方式
I.概述
本申请涉及制造逆转录病毒载体(诸如慢病毒载体)的方法，以及包含这些载体的配制品，特别是以高滴度分离并且基本上没有细胞碎片、核酸降解分子和蛋白水解物质污染的那些。生产高滴度且无污染物的逆转录病毒载体(诸如慢病毒载体)的纯化配制品并不简单。诸位发明人已经鉴定了逆转录病毒载体纯化方法的多个方面，从而令人惊讶地导致增加逆转录病毒(例如，慢病毒)载体原液的滴度。
特别地，本公开文本涉及逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的制造的两个方面：(1)在过滤除菌前稀释病毒原液；和(2)在最终载体生产中去除残留DNA和基因组DNA。在最终逆转录病毒产物中不希望有残留核酸。本文所述的新病毒载体制造方法的两个方面改进了总产率以及产生了改进的终产物。
第一方面涉及逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的浓缩，其对在纯化过程中回收的载体的滴度具有超大影响。与更浓的逆转录病毒(例如，慢病毒)载体样品相比，更稀的逆转录病毒(例如，慢病毒)载体样品展现出更高的总回收百分比。令人惊讶地发现，在一个方面，逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的约2×106感染滴度(或涵盖1.5×106至2.5×106的此量的范围)导致最有效的逆转录病毒(例如，慢病毒)载体回收。
本公开文本的第二方面涉及在一个或多个阶段从逆转录病毒(例如，慢病毒)载体样品中去除宿主细胞和基因组DNA的效率，其对回收的逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的滴度也具有超大影响。具体地，令人惊讶地发现，在过滤除菌步骤之后，但在载体浓缩步骤前(使用例如切向流过滤(TFF))，对稀释的载体增加至少一种核酸酶处理增加了宿主细胞和基因组DNA去除效率。可以使用任何合适的核酸酶处理，并且本文描述了示例性处理。在一个示例性方面，为了能够增加残留核酸去除的效率，诸位发明人表明对于中空纤维或盒TFF，可以使用在约10kDa至约1,000kDa之间的分子大小来增加宿主细胞和基因组DNA去除效率。
使用本文所述的新方面的慢病毒载体制造方法的示例性流程图示于图1中。
在本文所述的示例性下游方法中，存在两个纯化步骤(例如，使用TFF)，并且在每个纯化(例如，TFF)步骤前进行核酸酶处理步骤。诸位发明人令人惊讶地表明，进行具有两个浓缩步骤的载体纯化方法另外增加了效率，其中在每个浓缩步骤前进行核酸酶处理步骤。
此外，发现在第一浓缩步骤前对澄清的上清液进行第一核酸酶步骤有助于去除残留DNA并防止过滤器(例如，TFF)堵塞。然而，在最终浓缩步骤之前的第二核酸酶处理有效地去除了残留DNA，而不会增加下游制造步骤的时间。用于每种核酸酶处理的孵育时间和温度可以不同，以使本发明纯化方法的过程时间和效率最大化。
诸位发明人表明，约750kDa至约1,000kDa的较高分子量孔截止值有效地去除了核酸酶，因此不用担心最终产物中的残留核酸酶。
在进一步的方面，核酸酶过程在降低的温度下进行，例如，所述温度不是室温，或例如30°(进行核酸酶过程的典型温度)。例如，如本文进一步描述的，核酸酶过程可以在约2℃至约8℃的“冷”温度下进行。本文描述了可以进行核酸酶过程的其他示例性温度。
将这些另外的步骤引入慢病毒载体纯化过程必然增加产生活载体所花费的时间量，从而增加已经花费约3天的过程的时间。让已经很耗时的过程再增加约一个工作日会让他人不愿走这条路。
载体纯化过程是产生临床基因转移疗法中的关键步骤，并且需要新型方法来更有效、安全且以高滴度提供病毒载体。本公开文本解决了这种需要。
II.逆转录病毒载体
在一些方面，所述病毒是逆转录病毒载体。在一些方面，所述病毒是包含目的异源转基因或核酸序列的重组逆转录病毒载体。在一些方面，所述异源转基因或核酸序列可以在用于基因疗法目的的治疗环境中使用。在一些方面，包含目的异源转基因或核酸序列的所述逆转录病毒载体可以用于转导免疫细胞。
在一些方面，所述载体靶向所需细胞类型。在一些方面，所述载体靶向在载体介导的基因转导过程中所述载体将与之融合的所需细胞类型。在进一步的方面，所需细胞类型是免疫细胞。在一些方面，所需细胞类型是T细胞、B细胞、树突细胞或抗原呈递细胞。
在一些方面，所述目的异源转基因或核酸序列可以具有治疗或诊断应用。合适的目的转基因或核酸序列可以包括但不限于编码酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体和抗氧化剂分子的序列。在一些方面，所述目的转基因或核酸序列可以包括工程化的免疫球蛋白样分子、免疫调节分子、反义RNA、微RNA、shRNA、siRNA、核酶、基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas、锌指核酸酶、TALEN)、抗原受体(例如，嵌合抗原受体、T细胞受体)、抗原、毒素、靶蛋白的跨结构域(transdomain)负突变体、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、报告蛋白(例如，荧光蛋白)及其衍生物。
在一些方面，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。在一些方面，所述慢病毒载体来自牛免疫缺陷病毒、羊关节炎脑炎病毒、马感染贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1、人免疫缺陷病毒2、杰姆布拉纳病毒(jembrana disease virus)、美洲狮慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒或维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus)。
在一些方面，所述慢病毒载体是假型化的，意味着其包含源自不同病毒的包膜糖蛋白。在一些方面，所述慢病毒载体用源自水疱性口炎病毒(VSV-G)、麻疹病毒、经修饰的麻疹病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒的包膜糖蛋白假型化。在一些方面，所述慢病毒载体用修饰的包膜糖蛋白假型化。在一些方面，所述慢病毒载体用嵌合包膜糖蛋白假型化。
在一些方面，所述慢病毒载体经修饰使得从慢病毒载体去除复制所必需的一个或多个蛋白编码区，从而使所述载体具有复制缺陷。在一些方面，所述目的异源转基因或核酸序列置换或替代病毒基因组的一部分。在一些方面，可以将所述目的异源转基因或核酸序列添加到病毒基因组中，从而使载体能够进行复制。在一些方面，所述载体是非整合载体，如美国专利申请公开号US20090014754A1中所述的。在一些方面，所述慢病毒载体经修饰使得从慢病毒载体去除复制所必需的一个或多个蛋白编码区，如美国专利申请公开号US20090075370A1中所述的。
III.逆转录病毒载体生产系统
逆转录病毒载体可以在生产细胞或包装细胞中增殖。生产细胞或包装细胞可以是逆转录病毒载体可以在其中增殖且随后进行收获的任何细胞。在一些方面，所述生产细胞或包装细胞可以是繁殖大量病毒颗粒用于随后纯化的稳定的生产细胞或宿主细胞系。在一些方面，所述生产细胞或包装细胞选自人细胞。在进一步的方面，所述人细胞是HEK293、HEK293T、HEK293FT、Te671、HT1080或CEM。在一些方面，所述生产或包装细胞选自鼠细胞。在进一步的方面，所述鼠细胞是NIH-3T3。在一些方面，所述生产细胞或包装细胞选自鼬科细胞。在进一步的方面，所述鼬科细胞是Mpf。在一些方面，所述生产细胞或包装细胞选自犬细胞。在进一步的方面，所述犬细胞是D17。在一些方面，所述生产细胞或包装细胞是HEK293细胞。在一些方面，瞬时转染可以用于在生产细胞和/或包装细胞中生成慢病毒载体。
如本文所用的术语“包装细胞”和“生产细胞”是指含有产生重组逆转录病毒或慢病毒所必需的元件的细胞，在病毒基因组中缺乏所述重组逆转录病毒或慢病毒。典型地，此类包装细胞含有一个或多个生产质粒，其能够表达病毒结构蛋白(诸如，密码子优化的gag-pol和env)，但不含包装信号。优选地，生产细胞/包装细胞源自哺乳动物细胞，并且优选地，源自灵长类细胞，诸如人细胞。在一些方面，所述人细胞是人胚肾(HEK)细胞。能够支持重组逆转录病毒或慢病毒复制的任何类型的细胞都可以用于增殖重组病毒。
在一些方面，包装/生产细胞系已经被修饰，其中缺失了原病毒的3'LTR以改进安全性。已经进行了进一步的改进，以在单独的质粒上引入gag-pol和env基因，并且可以将其进一步依序引入细胞系中以避免重组。在一些方面，将重组病毒和转基因作为第三代慢病毒系统引入包装/生产细胞系中。这种慢病毒系统作为四种单独的质粒引入细胞中：编码gag-pol的质粒、编码病毒rev基因的质粒、编码包膜糖蛋白(例如，VSV-G)的包膜质粒和编码目的转基因或核酸序列的转移质粒。
通过本领域技术人员熟知的手段和方法培养用逆转录病毒载体系统转染的细胞以增加细胞和病毒数量和/或病毒滴度，并且包括但不限于在适当的培养基中为细胞提供合适的营养。所述方法可以包括粘附至表面的生长、悬浮生长或其组合。培养可以例如在组织培养瓶、培养皿、滚瓶中或在生物反应器中使用分批、补料分批、连续系统、中空纤维等进行，以便通过细胞培养实现病毒的大规模(连续)生产，本领域优选使用能够悬浮生长的细胞。用于培养细胞的合适条件是已知的(Tissue Culture,Academic Press,Kruse和Paterson编辑(1973)；以及R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual of basictechnique,第4版(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9)。
在一些方面，使所述细胞在组织培养瓶中生长，并且随后在多层培养室中生长，以生成重组病毒颗粒生产细胞。在一些方面，所述生产细胞是增殖病毒颗粒的粘附细胞。在一些方面，所述生产细胞是增殖病毒颗粒的非粘附细胞。
在一些方面，所述细胞在足以适于培育所选细胞类型且适于生产慢病毒载体的培养基中生长。在一些方面，所述培养基是复合培养基或基本培养基。在一些方面，所述培养基补充有抗生素、哺乳动物血清(诸如胎牛血清)、pH指示剂等。在一些方面，所述培养基是无血清培养基。
IV.慢病毒载体的纯化
示例性载体纯化方法在图1中举例说明。在一些方面，所述纯化方法开始于澄清用过的细胞培养基/上清液。在进一步的方面，澄清之后是(1)一个或多个浓缩步骤，(2)一个或多个核酸酶处理步骤，(3)一个或多个纯化步骤，以及(4)一个或多个过滤除菌步骤。在进一步的方面，澄清之后是一个或两个(或更多个)浓缩步骤，(2)一个或两个(或更多个)核酸酶处理步骤，(3)一个或两个(或更多个)纯化步骤，以及(4)一个或两个(或更多个)过滤除菌步骤；其中所述步骤可以按(1)-(4)的逐步顺序进行，或者可以不按此顺序进行。在进一步的方面，澄清之后是一个或多个稀释步骤，所述稀释步骤可以紧接在澄清之后且在随后步骤之前进行，或者可以不在此时进行。
在一些方面，所述纯化方法按时间顺序包括以下步骤或由以下步骤组成：(1)澄清用过的培养基/上清液，(2)第一浓缩步骤，(3)核酸酶步骤，(4)纯化步骤，(5)过滤除菌步骤，以及(6)第二浓缩步骤。在一些方面，所述纯化方法按时间顺序包括以下步骤或由以下步骤组成：(1)澄清用过的培养基/上清液，(2)核酸酶步骤，(3)第一浓缩步骤，(4)纯化步骤，(5)过滤除菌步骤，以及(6)第二浓缩步骤。在一些方面，所述纯化方法按时间顺序包括以下步骤或由以下步骤组成：(1)澄清用过的培养基/上清液，(2)第一核酸酶步骤，(3)第一浓缩步骤，(4)纯化步骤，(5)过滤除菌步骤，(6)第二核酸酶步骤，以及(7)第二浓缩步骤。在一些方面，所述纯化方法可以包括一个或多个稀释步骤。
在一些方面，第一核酸酶处理在第一浓缩步骤之前进行。在一些方面，第二核酸酶处理在第二浓缩步骤之前进行。在一些方面，第一和第二核酸酶步骤在最终浓缩步骤之前进行。在一些方面，第一和第二核酸酶步骤不连续进行。在一些方面，第一和第二纯化步骤不连续进行。在一些方面，第一和第二纯化步骤不连续进行。在一些方面，第一和第二纯化步骤不连续进行。在一些方面，第一和第二浓缩步骤不同时进行。在一些方面，第一和第二核酸酶步骤不连续进行。在一些方面，第一和第二纯化步骤不连续进行。
在一些方面，浓缩步骤是所述方法中的最终步骤。在一些方面，如果进行第一和第二核酸酶步骤，则第一核酸酶步骤在第一浓缩步骤之前进行，并且第二核酸酶步骤在第二浓缩步骤之前进行。在一些方面，稀释步骤在第一核酸酶步骤之后或在两个核酸酶步骤之后进行。在一些方面，核酸酶步骤可以在澄清步骤之前进行。在一些方面，过滤除菌步骤和浓缩步骤在封闭式系统中进行，使得滤液从无菌过滤器直接流到浓缩装置。
在一些方面，所述过滤除菌步骤不是纯化方法的最终步骤。在一些方面，所述过滤除菌步骤不是纯化方法的倒数第二个步骤。在一些方面，所述第二核酸酶处理步骤不是在过滤除菌步骤之前进行。在一些方面，当过滤除菌步骤是纯化方法中的最终步骤时，相对于其中过滤除菌步骤不最后进行的对照或相对于图1中所示的逐步惯例，载体产率降低。
在一些方面，所述浓缩步骤是超滤步骤，当用于缓冲液交换时有时称为渗滤。在一些方面，所述超滤/渗滤步骤浓缩载体。在一些方面，所述超滤/渗滤可以是切向流过滤(TFF)的形式。在一些方面，所述超滤/渗滤膜将被选择为具有足够小以保留载体，并且足够大以有效清除杂质的孔径。
在培养用慢病毒载体转染的细胞的过程中，慢病毒载体在培育包含培养基的细胞的用过的培养基中积累。在一些方面，裂解所述培养基中的任何剩余的完整细胞，从而释放剩余的慢病毒载体。
在一些方面，使用过的培养基/细胞培养上清液澄清。澄清是从上清液中去除细胞碎片，作为开始分离慢病毒载体的手段。
在一些方面，细胞培养上清液的澄清通过过滤步骤进行以去除细胞碎片和其他杂质。合适的过滤器可以利用纤维素过滤器、再生纤维素纤维、与无机助滤剂(例如，硅藻土、珍珠岩、气相二氧化硅)组合的纤维素纤维、与无机助滤剂和有机树脂组合的纤维素纤维或其任何组合、以及聚合物过滤器(例子包括但不限于尼龙、聚丙烯、聚醚砜)，以实现有效去除和可接受的回收。通常，可优选多级方法，但不是必需的。示例性的二级或三级方法将由以下组成：用于去除大沉淀物和细胞碎片的一个或多个粗滤器，随后的标称孔径大于0.2微米但小于1微米的一个或多个二级精滤器。最佳组合可以根据沉淀物大小分布以及其他变量而变化。此外，采用相对小孔径的过滤器或离心的单级操作也可以用于澄清。更一般地，任何澄清方法可被接受用于本发明的澄清步骤中，所述澄清方法包括但不限于死端过滤、微滤、离心或助滤剂(例如，硅藻土)掺浆过滤与死端过滤或滤床过滤相结合，其提供具有合适澄清度的滤液但不会在随后的步骤中堵塞膜和/或树脂。
在一些方面，所述澄清用过滤器进行。在一些方面，所述过滤器具有跨越约0.1μm至约1.5μm之间的孔径。在一些方面，所述过滤器具有跨越约0.2μm至约1.5μm之间的孔径。在一些方面，所述过滤器具有跨越约0.45μm至约0.8μm之间的孔径。在一些方面，所述过滤器具有跨越约0.45μm至约1.5μm之间的孔径。在一些方面，所述过滤器具有约0.1μm、约0.2μm、约0.22μm、约0.45μm、约0.65μm、约0.8μm、约1.0μm、约1.2μm、约1.3μm或约1.5μm的孔径。在一些方面，最大孔径为0.1μm、0.2μm、0.22μm、0.45μm、0.65μm、0.8μm、1.0μm、1.2μm、1.3μm或1.5μm。
在一些方面，将所述澄清的上清液用核酸酶处理以降解污染核酸，诸如DNA和/或RNA，特别是来自生产细胞的污染核酸。在一些方面，所述核酸酶是DNA酶或RNA酶。在一些方面，所述核酸酶是DNA酶和RNA酶两者。
在一些方面，本公开文本的改进的终产物包含不可检测量的一种或多种核酸酶。任何合适的核酸酶都可以用于本文所述的方法中。在一些方面，所述核酸酶是BENZONASE核酸酶(EP 0229866和美国专利号5,173,418)，其降解所有形式的DNA和RNA(包括单链、双链、线性和环状)。BENZONASE核酸酶可以从Merck KGaA商购获得。BENZONASE是来自粘质沙雷氏菌的基因工程化内切核酸酶。所述蛋白质是30kDa亚基的二聚体，具有两个必需的二硫键。这种内切核酸酶攻击并降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环状)，并且在广泛的操作条件下有效。BENZONASE具有DNA酶活性和RNA酶两种活性，并且没有蛋白水解活性。
在一些方面，所述核酸酶是DENARASE核酸酶。DENARASE核酸酶可以从c-LEctaGmbH商购获得。在一些方面，所述核酸酶是本领域内常用于从制剂除去不想要的或污染DNA和/或RNA的目的的DNA酶和/或RNA酶。DENARASE在US2012/0135498中描述，作为序列标识符编号3包括在其中。DENARASE是来自粘质沙雷氏菌的基因工程化内切核酸酶。DENARASE具有DNA酶活性和RNA酶两种活性，并且没有蛋白水解活性。
在一些方面，纯化方案包括多于一种核酸酶处理。在一些方面，每种核酸酶处理仅包括单一类型的核酸酶，例如仅DENARASE。在一些方面，每种核酸酶处理可以包括一种或多种核酸酶。在一些方面，第一核酸酶处理仅包括一种类型的核酸酶，并且第二核酸酶处理包括一种或多种不同类型的核酸酶。在一些方面，第一核酸酶处理包括一种或多种不同类型的核酸酶，并且第二核酸酶处理仅包括一种类型的核酸酶。
在一些方面，所述一种或多种核酸酶是内切核酸酶。在一些方面，所述一种或多种核酸酶是外切核酸酶。在一些方面，所述一种或多种核酸酶包括内切核酸酶和外切核酸酶两者。在一些方面，所述内切核酸酶或外切核酸酶是从细菌或真菌分离的经修饰的酶。在一些方面，所述内切核酸酶或外切核酸酶是经遗传修饰的酶，其仍具有内切核酸酶和/或外切核酸酶活性。
在一些方面，本文所述的病毒纯化过程中的一个或多个在一种或多种核酸酶处理之后进行。在一些方面，所述一种或多种核酸酶处理在最终超滤/渗滤过程前在处理后进行。在一些方面，本文所述的病毒纯化过程中的一个或多个代替核酸酶处理进行。在一些方面，从病毒纯化过程中省略核酸酶处理。
在一些方面，所述核酸酶处理步骤在约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃或约15℃下进行。在一些方面，核酸酶处理紧接在澄清步骤之前或紧接在澄清步骤之后。在一些方面，核酸酶处理是纯化方案的倒数第二个步骤。
在一些方面，所述稀释步骤将慢病毒载体的样品稀释至约1×105、约2×105、约3×105、约4×105、约5×105、约6×105、约7×105、约8×105、约9×105、约1×106、约2×106、约3×106、约4×106、约5×106、约6×106、约7×106、约8×106、约9×106、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107或约9×107感染滴度单位/ml。在一些方面，所述稀释步骤将慢病毒载体的样品稀释至最大5×106感染滴度单位/ml。
在一些方面，在一个或多个核酸酶处理步骤前稀释所述量的逆转录病毒(例如，慢病毒)载体导致最终产物中逆转录病毒(例如，慢病毒)载体滴度的增加。在一些方面，这种增加是相对于其中逆转录病毒(例如，慢病毒)载体滴度未稀释的对照纯化测定增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％或至少约或高达约400％。
在一些方面，本文所述的用于纯化逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的方法导致从(1)用于产生逆转录病毒载体的质粒和/或(2)用于产生逆转录病毒载体的细胞去除留下的杂质。在一些方面，所述杂质是细胞碎片、残留细胞DNA和/或残留质粒DNA。在一些方面，VSV-G的存在的测量提供了残留质粒DNA的存在的指示。
在一些方面，本文所述的方法产生改进的终产物，其是逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的纯化样品。在一些方面，这种改进是从用于产生载体的细胞中去除残留细胞DNA。在一些方面，这种改进是去除用于将逆转录病毒核酸穿梭到用于产生载体的细胞中的残留质粒DNA。在一些方面，所述残留细胞DNA是残留核DNA。
在一些方面，与澄清后样品中存在的细胞DNA的量相比，所述改进的终产物展现出小于约0.00001％、小于约0.00005％、小于约0.0001％、小于约0.0005％、小于约0.001％、小于约0.005％、小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.1％、小于约0.5％或小于约1％的残留细胞DNA。
在一些方面，与澄清后样品中存在的质粒DNA的量相比，所述改进的终产物展现出小于约0.00001％、小于约0.00005％、小于约0.0001％、小于约0.0005％、小于约0.001％、小于约0.005％、小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.1％、小于约0.5％或小于约1％的残留质粒DNA。
在一些方面，与澄清后样品中存在的残留DNA的量相比，所述改进的终产物展现出小于约0.00001％、小于约0.00005％、小于约0.0001％、小于约0.0005％、小于约0.001％、小于约0.005％、小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.1％、小于约0.5％或小于约1％的总残留DNA。
在一些方面，在澄清之后，经由超滤/渗滤对载体悬浮液进行浓缩步骤。在一些方面，超滤/渗滤可以在纯化过程期间进行一次。在一些方面，超滤/渗滤可以在纯化过程期间进行多于一次。超滤/渗滤用于通过以如下方式迫使稀释剂穿过过滤器来浓缩载体：使得从载体制剂去除稀释剂，而载体不能穿过过滤器，并且从而以浓缩的形式保留在载体制剂中。在一些方面，所述超滤/渗滤过程是切向流过滤(TFF)，如在例如题为“PharmaceuticalProcess Filtration Catalogue”的MILLIPORE目录第177-202页(马萨诸塞州贝德福德，1995/96)中描述的。TFF广泛用于生物加工工业，用以包括病毒在内的产物的细胞收获、澄清、纯化和浓缩。所述系统由三个不同的过程流组成：进料溶液、渗透物和渗余物。根据应用，可以使用具有不同孔径的过滤器。在本发明中，渗余物含有产物(逆转录病毒或慢病毒载体)。在此，所选的特定超滤膜将具有足够小以保留载体、但足够大以有效清除杂质的孔径。根据制造商和膜类型，对于逆转录病毒载体，在100kDa与1000kDa之间的标称分子量截止值(NMWC)可能是适当的，例如具有300kDa或500kDa NMWC的膜。在优选的方面，中空纤维用于所述方法中的第一或所有TFF步骤。在一些方面，中空纤维用于所有TFF步骤。在一些方面，所述分子量截止值在约10kDa至约1,000kDa之间。在一些方面，所述分子量截止值在约10kDa至约750kDa、约10kDa至约500kDa、约10kDa至约250kDa、约10kDa至约100kDa、约100kDa至约1,000kDa、约100kDa至约750kDa、约100kDa至约500kDa、约100kDa至约250kDa、约250kDa至约1,000kDa、约250kDa至约750kDa、约250kDa至约500kDa、约500kDa至约1,000kDa、约500kDa至约750kDa、或约750kDa至约1,000kDa之间。在优选的方面，所述中空纤维是750kDa中空纤维。
在一些方面，所述载体经由高速离心过程纯化以浓缩载体。在一些方面，所述高速离心至少大于10,000×g。在一些方面，利用超速离心来纯化载体。在一些方面，所述载体通过梯度制剂(诸如蔗糖、碘克沙醇等)纯化。在一些方面，使所述载体经受一种或多种能够浓缩载体的溶液或化合物，诸如聚乙二醇(PEG)或LENTI-X浓缩剂。在一些方面，将经受一种或多种浓缩溶液或化合物的载体离心以使载体沉淀。在一些方面，将所述沉淀物重悬浮于缓冲液中，由此产生载体悬浮液。
在一些方面，所述病毒载体纯化过程包括柱纯化步骤。所述柱纯化步骤可以包括柱色谱。如本领域已知的，这个步骤将载体颗粒与细胞碎片和其他污染物分离，用于进一步纯化病毒载体颗粒。在一些方面，这个步骤可以是离子交换柱纯化，例如阴离子交换或阳离子交换。在一些方面，所述柱色谱可以是尺寸排阻色谱。在一些方面，所述柱色谱可以是亲和色谱。在一些方面，所述柱色谱可以是固定化金属离子亲和色谱。在一些方面，所述柱色谱可以包括多于一种色谱策略。在一些方面，所述色谱在开放式色谱系统中进行。在一些方面，所述色谱在封闭式色谱系统中进行。
在一些方面，本公开文本的方法不利用离子交换色谱。在一些方面，本公开文本的方法不利用阴离子交换色谱。在一些方面，本公开文本的涉及纯化慢病毒载体的方法不利用离子或阴离子交换色谱。
进行如上所述的任何或所有步骤，将载体过滤除菌。过滤除菌是医药级材料的常用方法，并且是本领域技术人员已知的。过滤除菌去除病毒载体制剂中的残留污染物。过滤除菌后污染物的水平应使得载体制剂是临床使用的。在一些方面，过滤除菌在无菌条件下进行。合适的过滤器是本领域技术人员所熟知的。在一些方面，除菌过滤器具有0.22um的孔径。
在一些方面，在过滤除菌之后但在超滤/渗滤前经由色谱纯化慢病毒载体制剂。为了减少潜在的污染事件，所述色谱优选使用封闭式系统方法进行。在一些方面，所述色谱选自离子交换色谱、多元色谱、尺寸排阻色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱。在一些方面，所述色谱可以重复两次或更多次，其中对于每次重复使用相同类型的色谱，或者对于至少一次重复使用不同类型的色谱。
V.靶细胞
在一些方面，本发明的病毒载体可以用于修饰靶细胞。在一些方面，所述病毒载体可以将目的转基因或核酸序列引入免疫细胞或免疫细胞群体。在一些方面，所述目的转基因或核酸序列编码外源抗原受体。在一些方面，所述外源抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述哺乳动物细胞可以是免疫细胞或其前体细胞。在一些方面，所述免疫细胞或其前体细胞可以是T细胞。在一些方面，所述T细胞可以是细胞毒性T细胞、调节性T细胞、NKT细胞。在示例性方面，所述T细胞是CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。
在一些方面，从来自患者的单采术样品收获免疫细胞或免疫细胞群体。在一些方面，在收获免疫细胞或免疫细胞群体前，将所述单采术样品冷冻保存。在一些方面，所述单采术样品是未被冷冻保存的来自患者的新鲜单采术样品。在一些方面，所述免疫细胞或免疫细胞群体在包括富集步骤的过程或方案期间从单采术样品获得。在一些方面，经修饰的细胞是自体细胞。在一些方面，经修饰的细胞是同种异体细胞。
在一些方面，由本发明的病毒载体修饰的免疫细胞或免疫细胞群可以用于治疗、预防或改善疾病或障碍。在一些方面，所述疾病或障碍可以包括但不限于恶性障碍，包括癌症、良性和恶性肿瘤生长、转移、血管生成；自身免疫性疾病，包括关节炎、类风湿性关节炎、过敏反应、哮喘和系统性红斑狼疮。
VI.药物组合物
本发明的药物组合物可以包含如本文所述的经遗传修饰的免疫细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂组合。此类组合物可以包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一些方面，本发明的组合物优选地经配制用于静脉内施用。在一些方面，包含逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的药物组合物适于施用于患者。在一些方面，包含逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的药物组合物适于施用于被施用于患者的细胞。
VII.定义
虽然认为以下术语被本领域普通技术人员很好地理解，但阐述以下定义以便于解释本发明所公开的主题。
术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”可以指代一个或多个/一种或多种所述实体，即可以指代复数个/复数种指代物。因此，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”、“一个或多个/一种或多种”以及“至少一个/至少一种”在本文中可互换使用。此外，通过不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”对“一个/一种要素”的提及并不排除存在多于一个/多于一种要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种要素且仅存在一个/一种要素。
在整个本说明书中提及“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一个方面(one aspect)”或“一个方面(an aspect)”意指结合所述实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本公开文本的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中各处短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在一个实施方案中(inan embodiment)”的出现不一定都指代相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
如本文所用，当在数值之前时，术语“约”或“大约”指示所述值加或减所述值的10％的范围。
如由本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。
本公开文本的各方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，对范围(诸如从1至6)的描述应该被认为已经具体地公开了子范围(诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等)以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法是本领域熟知且常用的。除非另外指示，否则本文所提供的方法和技术通常是根据本领域熟知以及如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中描述的常规方法来进行的。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书来进行的，如本领域通常所实现的或如本文所述的。本文所述的结合分析化学、合成有机化学和医药化学使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。使用标准技术进行化学合成，化学分析，药物制备、配制和递送，以及患者治疗。
如本文所用，“对照”是在实验中用于比较目的的替代性样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。如本文所用的“对照样品”或“参考样品”是指充当对照以与实验样品比较的样品或参考。例如，实验样品在小瓶中包含化合物A、B和C，并且对照可以是与实验样品相同处理的相同类型的样品，但缺少化合物A、B或C中的一种或多种。
本公开文本提供了用于制造和纯化病毒载体的新型方法和组合物。在某些方面，如本文提供的用于生产慢病毒载体配制品的方法包括用核酸酶处理过滤除菌的慢病毒载体制剂，和浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生所述慢病毒载体配制品，其中所述浓缩步骤是所述方法的最终步骤。在某些方面，如本文提供的用于生产慢病毒载体配制品的方法按时间顺序包括以下步骤：(i)培养产生所述慢病毒载体的细胞；(ii)收集包含所述慢病毒载体的上清液；(iii)澄清所述上清液；(iv)浓缩所述澄清的上清液，包括用配制缓冲液交换所述浓缩的上清液；(v)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒载体制剂；(vii)用核酸酶处理所述过滤除菌的慢病毒载体制剂；以及(viii)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物。
此外，除非另外指示，否则本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。此类技术是熟练工作者所熟知的，并且在文献中已充分解释。参见例如，Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增补本，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第四版)MR Green和J.Sambrook，以及Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual,第14章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013，第2版)。
如本文所用，术语“多核苷酸”定义为核苷酸的链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有如下常识，即核酸是多核苷酸，多核苷酸可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括而不限于重组手段(即，使用普通克隆技术和聚合酶链式反应等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列)和通过合成手段。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体的短链以及在本领域中通常称为蛋白质的有许多类型的长链。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖含有任选的指定量的指定成分(例如，如本文所提供的病毒载体)的产品，以及直接或间接由任选的指定的量的指定成分的组合产生的任何产品。
如本文所用，术语“载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将所述分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔和的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞。它们可以将大量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供在体内实现显著水平的基因转移的手段。
如本文所用，术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如在Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可以用于临床的慢病毒载体的其他例子包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0004169660160000121
基因递送技术、来自Leantgen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的，并且将是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“残留核酸”是指在澄清逆转录病毒(例如，慢病毒)载体之后存在于本公开文本的样品中的非逆转录病毒(例如，非慢病毒)核酸。类似地，术语“残留DNA”是指在澄清逆转录病毒(例如，慢病毒)载体之后存在于本公开文本的样品中的非逆转录病毒(例如，非慢病毒)核酸。残留核酸是指DNA和RNA。残留核酸是指在澄清载体之后本文所述样品中残留的与核DNA和/或质粒相对应的遗传物质。
除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”还可以包括内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有一个或多个内含子。
本发明技术并不受限于本申请中描述的特定方面，所述特定方面旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员应清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员从前面的描述中将显而易见除了本文列举的那些方法和装置外的在本发明技术范围内的功能上等同的方法和装置。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术并不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，且并不意图加以限制。
实施例
实施例1
逆转录病毒载体制造和纯化
HEK293T细胞在组织培养瓶中扩增，然后进入10层细胞工厂长达14天。在第14天，用编码第三代慢病毒载体系统的质粒转染所述细胞，并且两天后，在第16天收获含有病毒载体的培养基。
使细胞培养基澄清。在澄清之后且在第一切向流过滤(TFF)前，将澄清的培养基用DENARASE核酸酶(c-LEcta GmbH；德国莱比锡)处理，以去除残留的细胞基因组DNA并防止过滤器堵塞。然后将含载体的核酸酶处理的澄清培养基在超滤/渗滤步骤中在配制缓冲液(Tris、盐、糖和大约中性pH)中使用TFF加以浓缩。所述TFF是750kDa中空纤维柱。然后使包含载体的配制缓冲液穿过CAPTOCORE 700树脂(GE)柱以去除宿主细胞蛋白、血清蛋白、核酸和残留核酸酶。然后将所得制剂稀释，过滤除菌，并且随后再次用DENARASE核酸酶进行处理。这再次有效地去除了任何残留的污染DNA。然后作为最终超滤步骤，使载体制剂再次穿过750kDa中空纤维以去除核酸酶，从而产生最终产物。所述方法由图1展示。
为了追踪整个过程中残留DNA的去除，在所述过程的不同步骤使用定量PCR(qPCR)检测水疱性口炎病毒糖蛋白基因(VSV-G)的存在。在细胞培养上清液的澄清之后、在第一TFF步骤之后取样，然后对最终产物取样。图2展示了到过程结束时，使收获的载体中的残留DNA减少到最终产物中几乎检测不到的水平。
特别地，图2展示了qPCR测定的结果，其中检测并量化了水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因。VSV-G检测有效地测量在载体制造过程中的多个点仍然存在的残留VSV-G的量。残留VSV-G的量通常是载体生产中留下的残留质粒污染物的量的量度。下表1确定了在载体生产过程中三个步骤之后所见的步骤去除百分比。图2是表1中呈现的“rVSV DNA余量”数据的图示。澄清之后立即收集“澄清的收获”样品。在第一切向流过滤步骤之后立即收集“TFF 1”样品。在最终切向流过滤步骤之后立即收集“最终产物”样品，从而产生慢病毒载体生产和纯化方法的终结果。
Figure BDA0004169660160000131
在用第二核酸酶步骤作为所述方法的倒数第二个步骤的情况下，存在关于在TFF步骤之后将有多少残留核酸酶保留在配制品中，然后最终保留在最终产物中的问题。使用MIILLIPORESIGMA BENZONASE ELISA试剂盒II,#1016810001进行残留内切核酸酶的检测和量化，所述试剂盒是用对BENZONASE内切核酸酶具有特异性的抗体的酶联免疫吸附(ELISA)测定。在BENZONASE ELISA试剂盒II的评价期间，使用GMP级DENARASE样品测试所述测定。对于这种评价，使用BENZONASE特异性抗体测量DENARASE的多重稀释液，并且证实DENARASE的检测。表2显示，TFF步骤之后残留DENARASE核酸酶的水平几乎低于检测限，表明最终产物包含极少量的残留内切核酸酶。
Figure BDA0004169660160000132
实施例2
慢病毒滴度
使用人T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤细胞系SupT1进行慢病毒载体滴定，并且通过流式细胞术确定表达转基因的SupT1细胞的百分比。
针对每个样品中慢病毒的量来评价四个样品(通过流式细胞术评价SupT1细胞。将样品澄清、过滤除菌，并且进行本文所述的方法用于慢病毒分离和纯化。对于每个样品，通过在进行过滤除菌前稀释慢病毒的量来改变方法，使得滴度跨越1.75×106至4.84×106。图3呈现了每种慢病毒滴度及其相应的最终产率。基于图3，清楚的是在滴度与产率百分比之间不存在标准的剂量(滴度)依赖性曲线。相反，最佳滴度似乎是约2×106，在1.75×106的滴度下，最终产率略有降低。然而，慢病毒载体的最终产率在较高滴度(例如，2.55×106和4.84×106，如图3中所绘)下发生显著降低。
实施例3
残留DNA测定
使用定量PCR(QPCR)测定，用特异性靶向VSV-G的引物和探针进行残留水疱性口炎病毒糖蛋白基因(VSV-G)的检测和量化。表3中所示的结果是三次大规模运行的汇总。
残留DENARASE测定：使用Millipore Sigma BENZONASE ELISA试剂盒II,#1016810001进行残留内切核酸酶的检测和量化，所述试剂盒是用对BENZONASE内切核酸酶具有特异性的抗体的酶联免疫吸附(ELISA)测定。在BENZONASE ELISA试剂盒II的评价期间，使用GMP级DENARASE样品测试所述测定。对于这种评价，使用BENZONASE特异性抗体测量DENARASE的多重稀释液，并且证实DENARASE的检测。残留DENARASE的结果示于表3中：
Figure BDA0004169660160000141
实施例4
规模化生产
本文所述的生产临床级慢病毒载体的方法已经在美国食品药品管理局公布的药品生产管理规范(GMP)条件下以临床规模进行。临床规模定义为每批20-60名患者剂量在7×106TU/ml至8×107TU/ml之间，其中TU是转导单位。
*****
可以在不存在本文没有明确公开的任何一种或多种要素、任何一种或多种限制的情况下适当地实践本文说明性描述的方法。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当广阔且无限制地来理解。另外，本文采用的术语和表达已经被用作具有描述性而没有限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时并非意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物。应认识到，在所要求保护的本公开文本的范围内，各种修改都是可能的。因此，应当理解，尽管本公开文本已经通过优选方面和任选特征明确公开，但本文公开的其中实施的本公开文本的修改和改变可以由本领域技术人员采取，并且此类修改和改变被认为是在本公开文本的范围内。
已经在本文宽泛且概括地描述了本公开文本。落入总公开文本内的更窄的种类和亚属的分类各自也形成了方法的一部分。这包括方法的总描述，具有从属中去除任何主题的条件或否定式限制，无论切除的材料是否在本文中被明确地引述。本发明技术并不受限于本申请中描述的特定方面，所述特定方面旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员应清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员从前面的描述中将显而易见除了本文列举的那些方法和装置外的在本发明技术范围内的功能上等同的方法和装置。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术并不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，且并不意图加以限制。
本领域技术人员容易理解，本公开文本非常适于实现所提及的目的并获得所提及的目标和优点，以及其中固有的那些。本领域技术人员应想到其中的修改和其他用途。这些修改涵盖在本公开文本的精神内并且由权利要求的范围限定，权利要求阐述了本公开文本的非限制性方面。
此外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请都出于所有目的通过引用以其整体而并入。
然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请并非且也不应被视为承认或任何形式的建议它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家公知常识的一部分。

Claims (27)

1.一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法包括：
(a)用核酸酶处理过滤除菌的慢病毒载体制剂，以及
(b)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生所述慢病毒载体配制品；
其中所述浓缩步骤是所述方法中的最终步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括细胞培养上清液的澄清。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述澄清之后是第一核酸酶处理。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸酶具有内切核酸酶活性。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸酶具有外切核酸酶活性。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的经修饰的核酸酶。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中在所述第一核酸酶处理之后进行超滤/渗滤步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述超滤/渗滤步骤包括切向流过滤。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述超滤/渗滤步骤包括中空纤维过滤。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述慢病毒载体制剂的过滤除菌前稀释所述慢病毒载体制剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述慢病毒载体制剂稀释到配制缓冲液中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在根据权利要求7-9中任一项所述的超滤/渗滤步骤期间，将所述慢病毒载体制剂稀释到所述配制缓冲液中。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括第二核酸酶处理。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二核酸酶处理是所述方法中的倒数第二个步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸酶具有内切核酸酶活性。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸酶具有外切核酸酶活性。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述核酸酶是来自粘质沙雷氏菌的经修饰的核酸酶。
18.一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法包括：
(a)培养产生所述慢病毒载体的细胞；
(b)从所述培养的细胞收集上清液；
(c)澄清所述上清液；
(d)浓缩所述澄清的上清液；
(e)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒载体制剂；
(f)对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌；
(g)用一种或多种核酸酶处理所述过滤除菌的慢病毒载体制剂；以及
(h)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物。
19.一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法包括：
(a)培养产生所述慢病毒载体的细胞；
(b)从所述培养的细胞收集上清液；
(c)澄清所述上清液；
(d)浓缩所述澄清的上清液；
(e)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒载体制剂；
(f)对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌；以及
(g)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物；
其中用核酸酶处理所述澄清的上清液和/或所述慢病毒载体制剂。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中浓缩所述澄清的上清液包括用配制缓冲液交换所述浓缩的上清液。
21.根据权利要求19所述的方法，其中用核酸酶处理所述澄清的上清液和所述慢病毒载体制剂。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中在(d)前用所述核酸酶处理所述澄清的上清液。
23.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中在(c)之后用所述核酸酶处理所述澄清的上清液。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述核酸酶具有内切核酸酶活性。
25.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述核酸酶具有外切核酸酶活性。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述核酸酶是来自粘质沙雷氏菌的经修饰的核酸酶。
27.一种用于生产慢病毒载体配制品的方法，所述方法按时间顺序包括以下步骤：
(a)培养产生所述慢病毒载体的细胞；
(b)收集包含所述慢病毒载体的上清液；
(c)澄清所述上清液；
(d)用核酸酶处理所述澄清的上清液；
(e)浓缩所述核酸酶处理的澄清的上清液，包括用配制缓冲液交换所述浓缩的上清液；
(f)从所述浓缩的上清液纯化所述慢病毒载体以产生慢病毒制剂；
(g)对所述慢病毒载体制剂进行过滤除菌；
(h)用核酸酶处理所述过滤除菌的慢病毒载体制剂，以及
(i)浓缩所述核酸酶处理的慢病毒载体制剂以产生最终产物。
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