CN111763238B - 一种蛋白抗原的纯化方法、制备的蛋白抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白抗原的纯化方法，其中，该纯化方法中速离心去除表达的蛋白液中的大分子杂质，用核酸酶处理该去除大分子杂质后的蛋白液，以去除宿主菌的核酸，加入EDTA抑制核酸酶；以及用凝胶层析对该抑制了核酸酶的蛋白液进行纯化分离，以获得纯化的蛋白抗原。本发明的纯化方法能相当程度地保留免疫原性，且显著增加纯化蛋白的收率。本发明还提供了该纯化方法制备的蛋白抗原，以及用其制备的疫苗。

Description

一种蛋白抗原的纯化方法、制备的蛋白抗原及其应用
技术领域
本发明涉及含抗原的医药配制品领域，特别涉及蛋白抗原的纯化方法、及其制备的蛋白抗原和疫苗组合物。
背景技术
蛋白抗原的纯化是研究及生产中的一个关键步骤。为了去除表达过程中的杂质，一个好的蛋白抗原纯化工艺应该能有效去除各种表达过程中带来的杂蛋白、核酸及其他杂质，并且具有很好的抗原回收率；同时最大限度保留其抗原表位功能。
传统的蛋白类抗原纯化采用硫酸铵分级沉淀工艺，该工艺需要分级沉淀，费时费力；硫酸铵可能会导致某些蛋白变性，同时，操作过程中容易局部浓度过高造成不需要的蛋白沉淀，造成目的蛋白纯度不高；收率受限。
凝胶过滤柱层析纯化技术虽然能得到较为纯净的蛋白抗原，但蛋白抗原在表达过程带来的杂质直接影响着蛋白抗原的收率，同时，宿主菌的破碎、坏死或凋亡产生的部分核酸分子量与蛋白分子非常相近，当使用凝胶过滤柱层析纯化会直接影响蛋白抗原的纯度。
因此，开发一种纯化技术路线简洁、分离效率高、分离选择性好的蛋白纯化方法具有非常重要的意义。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种蛋白的纯化方法，该方法可以进行大规模蛋白纯化，获得高纯度的蛋白，降低成本投入。
本发明提供一种蛋白抗原的纯化方法，其中，所述纯化方法包括以下步骤：步骤(1)中速离心去除表达的蛋白液中的大分子杂质；步骤(2)用核酸酶处理所述步骤(1)获得的所述去除了大分子杂质后的蛋白液，以降解宿主菌的核酸；步骤(3)将所述步骤(2)核酸酶处理后的病毒液加入EDTA抑制核酸酶；以及步骤(4)用凝胶层析对所述步骤(3)的所述抑制了核酸酶的蛋白液进行纯化分离，以获得纯化的蛋白抗原。
本发明的蛋白抗原纯化方法，能相当程度地保留抗原的免疫原性，其制备的抗原蛋白具有较常规硫酸铵纯化方法制备的抗原蛋白具有更早产生高滴度抗体的趋势，且制备的抗原纯度更高，安全性高。
本发明蛋白纯化方法去除大分子杂质的处理工艺采用中速离心方式，要求低，处理条件温和，不会对蛋白结构造成二次破坏，同时具有处理量大，处理成本低的特点；本发明病毒纯化方法采用核酸酶处理蛋白液，不仅提升蛋白的纯度，而且显著增加后期纯化蛋白的收率；本发明蛋白纯化方法采用EDTA中和核酸酶，避免对目的蛋白结构造成持续破坏，最大程度保证蛋白抗原的免疫原性；本发明蛋白纯化方法可以处理多种蛋白抗原，具有广泛的适用性。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中所述表达的蛋白液经浓缩前置处理。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中的所述中速离心速率为8000rpm，所述离心时间为25min。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白抗原的纯化方法中，所述步骤(2)中所述核酸酶为Benzonase核酸酶，所述核酸酶添加量为1.5～2U/mL，所述核酸酶处理时间为30min。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白抗原的纯化方法中，所述步骤(2)中所述核酸酶添加量为1.8U/mL。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白抗原的纯化方法中，所述步骤(3)中EDTA浓度为2mmol/L。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的蛋白抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中所述蛋白抗原为猪圆环病毒蛋白、猪伪狂犬病病毒蛋白、猪细小病毒蛋白、或口蹄疫病毒蛋白。
本发明还提供了所述蛋白抗原的纯化方法制备的蛋白抗原。
本发明制备的蛋白抗原具有高纯度，安全性好，制备的疫苗无不良反应，且免疫原性较常规硫酸铵纯化方法制备的抗原蛋白具有更早产生高滴度抗体的趋势。
本发明的蛋白抗原具有良好的免疫原性，与未经纯化处理的蛋白抗原相当，制备的疫苗能进行完全保护，副反应小，适用于产业上大量生产制备疫苗。
作为本发明的一种实施方式，本发明的纯化的蛋白抗原为猪圆环病毒蛋白、猪伪狂犬病病毒蛋白、猪细小病毒蛋白、或口蹄疫病毒蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述蛋白抗原为猪圆环病毒Cap蛋白，或O型口蹄疫病毒样粒子。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪圆环病毒Cap蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述O型口蹄疫病毒样粒子由由O型口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3、VP4蛋白组装的O型口蹄疫病毒样粒子，所述O型口蹄疫病毒VP1蛋白为SEQ ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述VP2蛋白为SEQ ID No.3所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述VP3蛋白为SEQ ID No.4所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述VP4蛋白为SEQ IDNo.5所示核苷酸序列或其简并序列编码。
本发明还提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的蛋白抗原和药学上可接受的载体。
本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，不仅能进行完全保护，且副反应小。
作为本发明的一种实施方式，所述蛋白抗原为猪圆环病毒Cap蛋白，或O型口蹄疫病毒样粒子。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪圆环病毒Cap蛋白为SEQ ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述O型口蹄疫病毒样粒子由O型口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3、VP4蛋白组装的O型口蹄疫病毒样粒子，O型口蹄疫病毒VP1蛋白为SEQ ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP2蛋白为SEQ ID No.3所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP3蛋白为SEQ ID No.4所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP4蛋白为SEQ ID No.5所示核苷酸序列或其简并序列编码。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗中，所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；所述佐剂含量为5％-70％V/V。
所述佐剂的含量可以任意选自5％V/V、6％V/V、7％V/V、8％V/V、9％V/V、10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V、55％V/V、60％V/V、65％V/V、66％V/V、67％V/V、70％V/V。
本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)MontanideTMGel。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的进一步优选实施方式，所述猪圆环病毒Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml，所述药学上可接受的载体为水溶性佐剂；所述O型口蹄疫病毒样粒子含量为160μg/ml～240μg/ml，所述药学上可接受的载体为206佐剂。
作为本发明的更进一步优选实施方式，所述猪圆环病毒Cap蛋白含量为50μg/ml，所述药学上可接受的载体为水溶性佐剂；所述O型口蹄疫病毒样粒子含量为200μg/ml，所述药学上可接受的载体为206佐剂。
本发明的疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
可以根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。
优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
本发明的疫苗组合物由于抗原成分中去除了大分子蛋白和其他杂质对免疫反应的影响，且免疫后较常规硫酸铵纯化的抗原蛋白制备的疫苗具有更早产生高滴度抗体的趋势。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化
1.大分子杂质的去除
将采用高压匀质机破碎表达菌体后得到的猪圆环病毒2型Cap蛋白(猪圆环病毒2型Cap蛋白为SEQ ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码)混合液分为两份，第一份加入离心管，放入中速离心机中，以8000rpm离心25min，除去菌体碎片及部分杂质，获得初级纯化蛋白液，命名为A1；第二份加入离心管，放入高速离心机中，以13500rpm离心20min，除去菌体碎片及部分杂质，获得初级纯化蛋白液，命名为A2。
2.核酸酶处理
将上述步骤获得的蛋白液A1、A2分别分出一份，添加Benzonase核酸酶处理病毒30min，添加量为1.8U/mL，处理后的蛋白液分别命名为B1、B2。
3.EDTA抑制核酸酶
将上述步骤获得的蛋白液B1、B2分别分出一份，添加EDTA，终浓度2mmol/L，对核酸酶进行抑制，抑制后的蛋白液分别命名为C1、C2。
4.凝胶层析法纯化分离
将上述步骤获得的蛋白液A1、A2分别采用凝胶层析法进行精细纯化分离，A1经凝胶层析法纯化后收率为35％，经凝胶层析法纯化后的蛋白液命名为A11；A2经凝胶层析法纯化后收率为36％，经凝胶层析法纯化后的蛋白液命名为A21。
将上述步骤获得的蛋白液B1、B2分别采用凝胶层析法进行精细纯化分离，B1经凝胶层析法纯化后收率为88％，经凝胶层析法纯化后的蛋白液命名为B11；B2经凝胶层析法纯化后收率为89％，经凝胶层析法纯化后的蛋白液命名为B21。
将上述步骤获得的蛋白液C1、C2分别采用凝胶层析法进行精细纯化分离，C1经凝胶层析法纯化后收率为88％，经凝胶层析法纯化后的蛋白液命名为C11；C2经凝胶层析法纯化后收率为89％，经凝胶层析法纯化后的蛋白液命名为C21。
上述结果表明，经离心、核酸酶处理，后经凝胶层析法纯化或离心、核酸酶和EDTA处理，后经凝胶层析法纯化后收率较高。
实施例2猪圆环病毒2型Cap蛋白常规纯化
将实施例1得到的初级纯化蛋白液A2再分出一份，采用硫酸铵分级沉淀法进行纯化，随后进行色谱纯化，收率为40％，经色谱纯化后的蛋白液命名为B3。
实施例3猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物的制备
将实施例1制备的猪圆环病毒Cap蛋白抗原B11、B21、C11、C21，实施例2制备的猪圆环病毒Cap蛋白抗原B3分别加入到水溶性佐剂中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化剂搅拌12min，混匀。具体配比见表1。
表1 猪圆环病毒Cap蛋白疫苗组合物配比
Figure BDA0002015502980000081
实施例4猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物免疫原性试验
将28～30日经ELISA检测PCV2抗原、抗体阴性的健康仔猪30头随机分成6组，5头/组，按照表2注射疫苗，对照组接种PBS 2ml/头。
表2 猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物免疫原性试验分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
1 疫苗1 2ml/头
2 疫苗2 2ml/头
3 疫苗3 2ml/头
4 疫苗4 2ml/头
5 疫苗5 2ml/头
6 PBS 2ml/头
免疫后28天攻毒，用猪圆环病毒2型HH3株(Porcine Circovirus type2，strainHH3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201726，保藏日期为2017年6月4日，保藏地址：中国武汉·武汉大学，公开于中国专利申请CN109022368A)，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，观察临床症状见表3。
表3猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物免疫原性试验结果
Figure BDA0002015502980000091
结果显示，本发明方法制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗3)免疫仔猪，能为仔猪提供100％(5/5)保护；用常规硫酸铵沉淀纯化方法制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗5)免疫仔猪，能为仔猪提供100％(5/5)保护；仅经中速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗1)或经高速离心后添加核酸酶，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗2)免疫仔猪，虽能提供有效保护，能为仔猪提供80％(4/5)保护，但仍不能完全阻断病毒感染(出现临床症状)；经高速离心、核酸酶处理及EDTA抑制后采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗4)免疫仔猪，也不能完全阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供80％(4/5)保护；攻毒对照仔猪攻毒后全部出现临床症状。
上述结果表明本发明方法及常规提供的抗原(经硫酸铵沉淀纯化方法制备)，制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物均具有良好的免疫效果，能提供100％的保护；其他无论是通过高速离心、添加核酸酶、或通过高速离心、添加核酸酶、再添加EDTA方式处理，后通过凝胶层析法进行精细纯化分离抗原，均不能达到本发明所述方法带来的效果。
实施例5猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物安全性试验
将2～3周龄PCV2抗原、抗体阴性的健康仔猪30窝随机分成5组，6窝/组，按照表4注射疫苗。
表4 猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物安全性试验分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
7 疫苗1 4ml/头
8 疫苗2 4ml/头
9 疫苗3 4ml/头
10 疫苗4 4ml/头
11 疫苗5 4ml/头
免疫后继续饲养观察21天，观察免疫动物的反应。结果见表5。
表5 猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物安全性试验结果
组别 仔猪数量(头) 不良反应
7 82 27头出现体温升高、食欲降低，2头出现应激反应
8 87 29头出现体温升高、食欲降低，2头出现应激反应
9 85 无不良反应
10 77 无不良反应
11 73 4头出现体温升高、食欲降低，1头出现应激反应
结果显示，本发明方法制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗3)和经高速离心、核酸酶处理及EDTA抑制后采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗4)超剂量免疫仔猪，均无不良反应，安全性好；用常规硫酸铵沉淀纯化方法制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗5)超剂量免疫仔猪，出现5％左右的不良反应；仅经中速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细化分离制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗1)或高速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物(疫苗2)超剂量免疫仔猪，出现33％左右的不良反应。
上述结果表明无论中速离心还是高速离心，并经核酸酶处理及EDTA中和后采用凝胶层析法进行精细纯化分离提供的抗原，制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗组合物均有较好的安全性，但本发明方法免疫原性更好；其他纯化方法制备的疫苗在免疫原性和安全性两方面不能同时达到本发明所述方法带来的效果。
实施例6 O型口蹄疫蛋白的纯化
参照实施例1的方法将采用高压匀质机破碎表达菌体获得的O型口蹄疫蛋白混合液(由O型口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3、VP4蛋白组装的O型口蹄疫病毒样粒子，O型口蹄疫病毒VP1蛋白为SEQ ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP2蛋白为SEQ ID No.3所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP3蛋白为SEQ ID No.4所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP4蛋白为SEQ ID No.5所示核苷酸序列或其简并序列编码)放入中速离心机中，以8000rpm离心25min，除去菌体碎片及部分杂质，获得初级纯化蛋白液；将上述步骤获得的蛋白液添加Benzonase核酸酶处理病毒30min，添加量为1.8U/mL；再添加EDTA，终浓度2mmol/L，对核酸酶进行中和；中和后采用凝胶层析法进行精细纯化分离，纯化后收率为90％。
将采用高压匀质机破碎菌体获得的蛋白混合液放入高速离心机中，采用硫酸铵分级沉淀法进行纯化，随后进行色谱纯化，收率为39％。
将本发明方法纯化的蛋白及硫酸铵沉淀方法纯化处理的蛋白分别与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比1:1混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。具体配比见表6。
表6 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物配比
成分 疫苗6(本发明方法纯化) 疫苗7(硫酸铵沉淀纯化)
口蹄疫抗原(μg/ml) 200 200
206佐剂(V/V％) 50 50
实施例7 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物免疫原性试验
选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪15头，随机分为3组，每组5头，按照表7注射疫苗，对照组接种PBS 2ml/头。
表7 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物免疫原性试验分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
12 疫苗6 2ml/头
13 疫苗7 2ml/头
14 PBS 2ml/头
疫苗免疫后，每周测定抗体效价，结果见表8。
表8 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物免疫原性试验抗体情况
Figure BDA0002015502980000131
结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，两种O型口蹄疫蛋白疫苗组合物1次免疫后第14日均能达到1:128以上，且本发明方法纯化抗原制备的疫苗较硫酸铵沉淀纯化抗原制备的疫苗具有更早产生较高抗体滴度的趋势。空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。
实施例8 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物安全性试验
选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪30窝随机分成2组，15窝/组，按照表9注射疫苗。
表9 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物安全性试验分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
15 疫苗6 4ml/头
16 疫苗7 4ml/头
免疫后继续饲养观察21天，观察免疫动物的反应。结果见表10。
表10 O型口蹄疫蛋白疫苗组合物安全性试验结果
Figure BDA0002015502980000141
结果显示，本发明方法制备的O型口蹄疫蛋白疫苗组合物(疫苗6)超剂量免疫猪只，无不良反应，安全性好；用常规硫酸铵沉淀纯化方法制备的O型口蹄疫蛋白疫苗组合物(疫苗7)超剂量免疫猪只，出现7％左右的不良反应。
上述结果表明本发明方法提供的抗原不仅收率高，制备的O型口蹄疫蛋白疫苗组合物免疫原性好，安全性好；常规硫酸铵沉淀纯化制备的疫苗在免疫原性和安全性两方面不能同时达到本发明所述方法带来的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 一种蛋白抗原的纯化方法、制备的蛋白抗原及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型（PCV2）
<400> 1
atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagaaaacc 180
acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240
cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360
agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac 480
tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540
aatcagctgt ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccctt aa 702
<210> 2
<211> 639
<212> DNA
<213> O型口蹄疫病毒（O type foot-and-mouth disease virus）
<400> 2
accacttcga caggcgagtc ggctgacccc gtgactgcca ccgttgagaa ctacggcggc 60
gagacacaag tccagaggcg ccaccacaca gacgtctcat tcatattgga cagatttgtg 120
aaagtcacac caaaagactc aataaatgta ttggacctga tgcagacccc cccccacacc 180
ctagtagggg cgctcctccg cactgccact tactatttcg ctgatctaga ggtggcagtg 240
aaacacaagg gggaccttac ctgggtgcca aatggagcac ctgaagcagc cttggacaac 300
accaccaacc caacggcgta ccataaggcg ccgcttaccc ggcttgcatt gccctacacg 360
gcaccacacc gtgttttggc caccgtttac aacgggaact gcaaatacgc cgggggctca 420
ctgcccaacg tgagaggtga tctccaagtg ctggctcaga aggcggcgtg gccgctgcct 480
acttctttca actacggtgc catcaaagcc actcgggtga cagaactgct gtaccgcatg 540
aagagggccg agacgtactg tcctcggccc ctcttggctg ttcacccgag tgcggctaga 600
cacaaacaga aaatagtggc acctgtaaag cagtccttg 639
<210> 3
<211> 654
<212> DNA
<213> O型口蹄疫病毒（O type foot-and-mouth disease virus）
<400> 3
gataagaaaa ccgaggagac cactcttctc gaggaccgca tcctcaccac ccgaaacgga 60
cacaccacct cgacaaccca gtcgagtgtt ggcataacgc acgggtacgc aacagctgag 120
gattttgtga gcgggccaaa cacctctggt cttgagacca gagttatcca ggcggaacgg 180
ttctttaaaa cccacctgtt cgactgggtc accagtgatc cgttcggacg gtaccacttg 240
ttggagctcc cgactgacca caaaggtgtc tacggcagcc tgaccgactc atacgcctac 300
atgagaaacg gttgggatgt tgaagtcacc gctgtgggga accagttcaa cggaggctgc 360
ctgctggtgg ccatggtgcc tgaactttgt tccatcgagc ggagagagct gttccagctc 420
acgctcttcc cccaccagtt catcaacccc cggacgaaca tgacagccca catcaaggtg 480
ccctttgttg gcgtcaaccg ttacgatcag tacaaggtac acaagccgtg gacccttgtg 540
gttatggtcg tagccccact gactgtcaac accgaaggcg ctccgcagat caaggtgtat 600
gccaacatcg cacccaccaa cgtgcacgtc gcgggtgagt tcccttccaa agag 654
<210> 4
<211> 660
<212> DNA
<213> O型口蹄疫病毒（O type foot-and-mouth disease virus）
<400> 4
gggattttcc ctgtggcctg tagcgacggt tatggcggct tggtgacaac tgacccaaag 60
acggctgacc ccgtttacgg caaagtattc aacccccccc gcaacatgtt gccggggcgg 120
ttcaccaacc tcctggacgt ggctgaggct tgccccacgt ttctgcactt cgatggtgac 180
gtaccgtatg tgaccactaa gacggattcg gacagggtgc tcgcacaatt tgacttgtct 240
ttggcagcaa aacacatgtc aaacaccttc cttgcaggtc ttgcccagta ctacacgcag 300
tacagcggca ccatcaacct gcacttcatg ttcacaggtc ccactgacgc gaaagcgcgt 360
tacatgattg cgtatgcccc tccgggcatg gagccgccca aaacacctga ggctgctgct 420
cactgcattc acgcagagtg ggacacgggt ctgaactcaa agtttacctt ttccatcccc 480
tacctctcgg cggctgatta cgcgtacacc gcgtctggcg ctgctgagac cacaaatgtt 540
cagggatggg tctgcttatt tcaaataaca cacgggaaag ctgagggtga cgctcttgtc 600
gtgctggcca gtgctggcaa agactttgag ctgcgcctgc ctgtggacgc tcggcaacag 660
<210> 5
<211> 255
<212> DNA
<213> O型口蹄疫病毒（O type foot-and-mouth disease virus）
<400> 5
ggagccggac aatccagtcc ggctactggg tcacagaacc aatcaggcaa caccgggagt 60
atcatcaaca attactacat gcagcagtat cagaactcca tggacaccca acttggtgac 120
aatgctatca gcggaggctc caacgaggga tccacagaca caacttccac ccacacaacc 180
aacactcaga acaatgactg gttttcaaag ttggccagct ctgccttcag tggtcttttc 240
ggcgccctcc tcgcc 255

Claims (12)

1.一种蛋白抗原的纯化方法，其中，所述纯化方法为以下步骤：步骤(1)8000rpm离心25min去除表达的蛋白液中的大分子杂质；步骤(2)用核酸酶处理所述步骤(1)获得的所述去除了大分子杂质后的蛋白液，以降解宿主菌的核酸；步骤(3)将所述步骤(2)核酸酶处理后的病毒液加入EDTA抑制核酸酶；以及步骤(4)用凝胶层析对所述步骤(3)的所述抑制了核酸酶的蛋白液进行纯化分离，以获得纯化的蛋白抗原；
所述蛋白抗原为猪圆环病毒蛋白或口蹄疫病毒蛋白。
2.根据权利要求1所述的蛋白抗原的纯化方法，其中，所述步骤(1)中所述表达的蛋白液经浓缩前置处理。
3.根据权利要求1所述的蛋白抗原的纯化方法，其中，所述步骤(2)中所述核酸酶为Benzonase核酸酶，所述核酸酶添加量为1.5～2U/mL，所述核酸酶处理时间为30min。
4.根据权利要求1所述的蛋白抗原的纯化方法，其中，所述步骤(2)中所述核酸酶添加量为1.8U/mL。
5.根据权利要求1所述的蛋白抗原的纯化方法，其中，所述步骤(3)中EDTA浓度为2mmol/L。
6.根据权利要求1～5所述蛋白抗原的纯化方法制备的蛋白抗原。
7.根据权利要求6所述的蛋白抗原，其中，所述蛋白抗原为猪圆环病毒Cap蛋白，或O型口蹄疫病毒样粒子。
8.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求6或7所述的蛋白抗原和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述蛋白抗原为猪圆环病毒Cap蛋白，或O型口蹄疫病毒样粒子。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒Cap蛋白为SEQ ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述O型口蹄疫病毒样粒子是由O型口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3、VP4蛋白组装的O型口蹄疫病毒样粒子，O型口蹄疫病毒VP1蛋白为SEQ ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP2蛋白为SEQ ID No.3所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP3蛋白为SEQ ID No.4所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP4蛋白为SEQ ID No.5所示核苷酸序列或其简并序列编码。
11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml，所述药学上可接受的载体为水溶性佐剂；所述O型口蹄疫病毒样粒子含量为160μg/ml～240μg/ml，所述药学上可接受的载体为206佐剂。
12.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒Cap蛋白含量为50μg/ml，所述药学上可接受的载体为水溶性佐剂；所述O型口蹄疫病毒样粒子含量为200μg/ml，所述药学上可接受的载体为206佐剂。
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