CN116917319A - 用于用经修饰的pbmc治疗癌症的方法 - Google Patents

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CN116917319A CN202180094321.0A CN202180094321A CN116917319A CN 116917319 A CN116917319 A CN 116917319A CN 202180094321 A CN202180094321 A CN 202180094321A CN 116917319 A CN116917319 A CN 116917319A
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Abstract

本申请提供了用于治疗HPV相关癌症的经修饰的PBMC。所述经修饰的PBMC源自输入PBMC，其中至少一种HPV抗原已被细胞内递送。在一些实施例中，所述PBMC与如CTLA4拮抗剂和/或PD‑1/PD‑L1激动剂等检查点抑制剂组合施用。

Description

用于用经修饰的PBMC治疗癌症的方法
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年12月29日提交的美国临时申请第63/131,504号、于2021年5月18日提交的美国临时申请第63/190,194号、于2021年9月29日提交的美国临时申请第63/249,739号和于2021年11月12日提交的美国临时申请第63/278,788号的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
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以下以ASCII文本文件形式提交的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：750322003140SEQLIST.TXT，记录日期：2021年12月23日，大小：13,144字节)。
技术领域
本公开总体上涉及使用包括一种或多种人乳头瘤病毒(HPV)抗原的外周血单核细胞(PBMC)用于治疗患有HPV相关癌症的个体的方法，以及其剂量和方案。还公开了制造包括HPV抗原的此类PBMC的方法和其组合物。
背景技术
乳头瘤病毒是病毒粒子大小的直径约为55nm的小的无包膜DNA病毒。超过100种HPV基因型被完全表征，并且推测存在更多的基因型。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知原因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且是自发清除的，但是具有致癌性HPV类型之一的持续感染可以进展为癌前病变或癌症。其它HPV相关疾病可以包含寻常疣、跖疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头状瘤、疣状囊肿、喉乳头状瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。
许多已知的HPV类型导致良性病变，其中一部分是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，将HPV类型分类为十五种“高风险类型”(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知其一起表现为低度和高度宫颈病变和癌症，以及其它非生殖器癌症，如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌，以及头颈癌。最近，也描述了高风险类型HPV 16和18与乳腺癌的关联。已知分类为“低风险类型”的十一种HPV类型(HPV6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,和81)表现为良性低度宫颈病变、生殖器疣和复发性呼吸道乳头状瘤病。皮肤HPV 5型、8型和92型与皮肤癌症相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统被抑制并且相应地，抗肿瘤应答被显著削弱。参见Suresh和Burtness《美国血液学与肿瘤学杂志(Am J Hematol Oncol)》13(6):20-27(2017)。
免疫疗法通常可以分为两种主要类型的干预，被动或主动。被动方案包含施用预激活和/或工程化细胞(例如，CAR T细胞)、疾病特异性治疗抗体和/或细胞因子。主动免疫疗法策略旨在刺激体内免疫系统效应子功能。若干种目前主动方案包含使用疾病相关肽、裂解物或同种异体全细胞的疫苗接种策略，输注自体树突细胞(DC)作为肿瘤抗原递送的媒剂，以及输注免疫检查点调节剂。参见Papaioannou,Nikos E.等人《转化医学年鉴(Annalsof translational medicine)》4.14(2016)。过继免疫疗法可以用于调节免疫应答，增强抗肿瘤活性，并实现治疗或预防HPV相关癌症的目标。
由疾病相关抗原刺激的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助性T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力；然而，目前用于诱导内源性T细胞应答的方法已经面临挑战。本文的公开内容还包含用于使用包括HPV抗原的PBMC治疗患有HPV相关癌症的个体的方法、治疗、剂量和方案。还提供了用于以高通量方式有效地产生包括HPV抗原和/或佐剂的PBMC的方法，所述方法可以用于诱导对HPV抗原的稳健的T细胞应答。
在本文中引用的所有文献，包含专利申请和出版物，通过引用整体并入本文。专利公开WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO 2017041050、WO 2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO 2020/072833、WO2020/154696以及WO 2020/176789、US20180142198和US20180201889特此通过引用整体并入本文。
发明内容
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及向所述个体施用有效量的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述CTLA4的拮抗剂是与CTLA4结合的抗体。在一些实施例中，所述PD-1/PD-L1的拮抗剂是与PD-1结合的抗体或与PD-L1结合的抗体。在一些实施例中，向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体和与PD-1结合的抗体。在一些实施例中，向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体并且向所述个体施用与PD-L1结合的抗体。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗个体的HPV+复发性、局部晚期或转移性肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物与一种或多种免疫检查点抑制剂联合施用。在一些实施例中，所述检查点抑制剂是所述个体的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂是与PD-L1、CTLA-4或PD-1结合的抗体。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物与和CTLA-4结合的抗体以及和PD-1结合的抗体联合施用。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗。
在本发明的一些实施例中，本发明的PBMC包括至少一种HPV抗原，其中所述一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。在一些实施例中，所述至少一种HPV抗原包括源自HPVE6和/或E7的肽。在一些实施例中，所述至少一种HPV抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述至少一种HPV抗原包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述PBMC包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和包含SEQID NO:23的氨基酸序列的抗原。
在本发明的治疗方法的一些实施例中，所述个体是人。在一些实施例中，所述个体对HLA-A*02呈阳性。在一些实施例中，所述PBMC对HLA-A*02呈阳性。在一些实施例中，所述PBMC对于所述个体是自体的。在一些实施例中，所述个体对人免疫缺陷病毒(HIV)呈阳性。在一些实施例中，所述HPV相关癌症是头颈癌、宫颈癌、肛门癌或食道癌。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物静脉内地施用。在一些实施例中，所述CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-La的拮抗剂静脉内地、口服地或皮下地施用。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体静脉内地施用。
在本发明的治疗方法的一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的所述有效量为约0.5×106个细胞/kg至约5.0×106个细胞/kg。在一些实施例中，伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。在一些实施例中，纳武单抗的有效量为约360mg。在一些实施例中，阿特朱单抗的有效量为约1200mg。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在三周周期的第1天递送。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物进一步在第一三周周期的第2天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg、约5.0×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在所述第一三周周期的第2天施用。在一些实施例中，所述与CTLA 4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体每三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体每两个三周周期施用一次。在一些实施例中，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗，其中所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约1mg/kg的剂量在两个三周周期的所述第一三周周期的第1天施用，并且所述与PD-1结合的抗体以约360mg的剂量在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗，其中所述阿特朱单抗以约1200mg的剂量施用。在一些实施例中，向所述个体施用包括PBMC的所述组合物至少约三个月、六个月、九个月或一年。
在本发明的一些实施例中，要施用于所述个体的包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及d)约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及d)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约2.75×107个PBMC；b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH 7.4。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC/mL；b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH7.4。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约2.5×107个PBMC；b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH 7.4。在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC/mL；b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中调配物的pH为约pH 7.4。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS10。在一些实施例中，所述低温保存培养基是/>FRS。
在一些实施例中，本发明的PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。在一些实施例中，(a)约25％至约80％的所述PBMC是T细胞；(b)约1.5％至约30％的所述PBMC是B细胞；(c)约3.0％至约20％的所述PBMC是NK细胞；或者(d)约4.0％至约45％的所述PBMC是单核细胞。
在本发明的一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括以下的方法制备：a)使包括输入PBMC群体的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC群体与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入PBMC，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，所述收缩的所述直径为约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，对包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC进行调节。在一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括将所述PBMC与佐剂在约37℃下一起温育约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以使所述PBMC进行调节的方法进行调节。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
附图说明
图1示出了队列1-3的治疗方案。
图2示出了队列4的治疗方案。
图3示出了队列5的治疗方案。
图4示出了队列6的治疗方案。
图5示出了队列7的治疗方案。
图6是示出了由Cell技术产生的SQZ-PBMC-HPV-101研究产物的机制的示意图，并且示出了SQZ-PBMC-HPV疫苗直接刺激CD8 T细胞应答。
图7是临床研究设计的示意图。SQZ-PBMC-HPV在单一疗法阶段中每三周(q3w)以指定剂量(细胞/体重)进行单一疗法，或者在指定间隔(q3w，q3w x 4，q6w)与指定剂量的检查点抑制剂(阿特朱单抗、伊匹单抗(Ipi)、纳武单抗(Nivo))组合施用。
图8A-C示出了SQZ-PBMC-HPV的制造结果，分别说明了SQZ-PBMC-HPV的平均活力、平均端到端处理时间和IFN-γ分泌测定。
图9示出了所有队列的最佳总体应答(BOR)、研究生存期(天数)和皇家马斯登医院(RMH)1评分的总结。
图10A-C分别示出了在病例研究患者2治疗之后的聚集性肿瘤大小，IHC图像分析示出了中心肿瘤中的CD8 TIL的变化，并且代表性IHC图像展示了CD8 TIL。
图11A-C分别示出了在病例研究患者7治疗之后的聚集性肿瘤大小，IHC图像分析示出了中心肿瘤中的CD8 TIL的变化，并且代表性IHC图像展示了CD8 TIL。
图12示出了队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和周期2第8天(C2D8，后)时的肿瘤中的CD8+细胞的密度。
图13示出了队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时的肿瘤中的CD8+/颗粒酶B+(GZMB+)细胞的密度。
图14示出了队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时的肿瘤中的CD8+/Ki67+细胞的密度。
图15示出了队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时的肿瘤中的CD8+/Ki67-细胞的密度。
图16示出了如通过H-评分(上图)测量的队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时的肿瘤中的MHC-1的表达。在筛选(前)和C2D8(后)时的MHC-、MHC-1低、MHC-1中和MHC-1高细胞的相对比率在下图中示出。
图17示出了队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时具有PD-L1膜染色的肿瘤细胞的％。TPS表示肿瘤比例评分。
图18示出了如通过RNA ISH修饰的H-评分(上图)测量的队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时的肿瘤中的HPV16 E6的表达。在筛选(前)和C2D8(后)时的HPV16阴性、HPV 16+1、HPV 16+2、HPV 16+3和HPV 16+4细胞的相对比率在下图中示出。*表示细胞的形态不适合评分。
图19示出了如通过RNA ISH修饰的H-评分(上图)测量的队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时的肿瘤中的HPV16 E7的表达。在筛选(前)和C2D8(后)时的HPV16阴性、HPV 16+1、HPV 16+2、HPV 16+3和HPV 16+4细胞的相对比率在下图中示出。*表示细胞的形态不适合评分。
图20示出了队列1、2、3和3a中的患者在筛选(前)和C2D8(后)时肿瘤中心内的具有PD-1细胞的肿瘤细胞按区域计的％。*表示细胞的形态不适合评分。
图21示出了在筛选(前)和C2D8(后)时的患者112-068的肿瘤的CD8浸润。左图示出了中心肿瘤(CN)中的肿瘤浸润以及间质和实质中的浸润。中图示出了如通过CD8、GZMB和FoxP3测量的肿瘤中的CTL、Treg和NK功能。右图示出了呈GZMB+细胞形式的CD8+细胞的百分比。
图22示出了图21中的数据从其中得到的免疫组织化学图像的实例。
图23示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时的患者112-068的增殖/激活的细胞密度，如CD8+、CD8+/Ki67-、CD8-/Ki67+和CD8+/Ki67+细胞的密度所示。免疫组织化学在右图中示出。顶部图像是低分辨率，底部图像是高分辨率。
图24示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时具有PD-L1染色的患者112-068的肿瘤细胞的％。
图25示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时的患者112-068的肿瘤中的MHC-1和HPV16 E6和E7表位的表达。左上图示出了在筛选和C2D8时的MHC-1表达。中上图示出了在筛选和C2D8时的肿瘤中的细胞中的MHC-1的相对表达。左下图示出了HPV16 E6表达。左中图示出了HPV16 E7表达。右图示出了左图和中图中的数据从其中获得的免疫组织化学的实例。
图26示出了患者112-068的肿瘤生长动力学。
图27示出了在筛选(前)和C2D8(后)时的患者103-027的肿瘤的CD8浸润。左图示出了中心肿瘤(CN)中的肿瘤浸润以及间质和实质中的浸润。中图示出了如通过CD8、GZMB和FoxP3测量的肿瘤中的CTL、Treg和NK功能。右图示出了呈GZMB+细胞形式的CD8+细胞的百分比。
图28示出了图27中的日期从其中得到的免疫组织化学图像的实例。
图29示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时的患者103-027的增殖/激活的细胞密度，如CD8+、CD8+/Ki67-、CD8-/Ki67+和CD8+/Ki67+细胞的密度所示。免疫组织化学在右图中示出。顶部图像是低分辨率，底部图像是高分辨率。
图30示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时具有PD-L1染色的患者103-027的肿瘤细胞的％。
图31示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时的患者103-027的肿瘤中的MHC-1和HPV16 E6和E7表位的表达。左上图示出了在筛选和C2D8时的MHC-1表达。中上图示出了在筛选和C2D8时的肿瘤中的细胞中的MHC-1的相对表达。左下图示出了HPV16 E6表达。左中图示出了HPV16 E7表达。*表示细胞的形态不适合评分。右图示出了左图和中图中的数据从其中获得的免疫组织化学的实例。
图32示出了在筛选(前)和C2D8(后)时的患者103-008的肿瘤的CD8浸润。左图示出了中心肿瘤(CN)中的肿瘤浸润以及间质和实质中的浸润。中图示出了如通过CD8、GZMB和FoxP3测量的肿瘤中的CTL、Treg和NK功能。右图示出了呈GZMB+细胞形式的CD8+细胞的百分比。
图33示出了图32中的日期从其中得到的免疫组织化学的实例。
图34示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时的患者103-008的增殖/激活的细胞密度，如CD8+、CD8+/Ki67-、CD8-/Ki67+和CD8+/Ki67+细胞的密度所示。免疫组织化学在右图中示出。顶部图像是低分辨率，底部图像是高分辨率。
图35示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时具有PD-L1染色的患者103-008的肿瘤细胞的％。
图36示出了来自在筛选(前)和C2D8(后)时的患者103-008的肿瘤中的MHC-1和HPV16 E6和E7表位的表达。左上图示出了在筛选和C2D8时的MHC-1表达。中上图示出了在筛选和C2D8时的肿瘤中的细胞中的MHC-1的相对表达。左下图示出了HPV16 E6表达。左中图示出了HPV16 E7表达。右图示出了左图和中图中的数据从其中获得的免疫组织化学的实例。
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
具体实施方式
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂(如但不限于伊匹单抗)、PD-1的拮抗剂(如但不限于纳武单抗)和/或PD-L1的拮抗剂(如但不限于阿特朱单抗)。
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包括激活的PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及施用有效量的伊匹单抗、纳武单抗或阿特朱单抗中的一种或多种，其中包括所述HPV抗原的所述PBMC和/或所述一种或多种免疫检查点抑制剂以三周周期施用，其中有效量的PBMC为约0.5×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg，其中伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg，其中纳武单抗的有效量为约360mg，并且其中阿特朱单抗的有效量为约1200mg。
还提供了包括所述HPV抗原和佐剂的PBMC的组合物，以及制备所述HPV抗原和佐剂的所述PBMC的方法。在一些实施例中，所述PBMC通过包括以下的方法制备：a)使包括输入PBMC群体的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC群体与所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入PBMC，由此产生包括所述HPV抗原和所述佐剂的所述经修饰的PBMC。还提供了用于诱导对HPV抗原的免疫应答或用于治疗HPV相关癌症的组合物。还提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于刺激对HPV抗原的免疫应答或用于治疗HPV相关癌症的药物中的用途。
通用技术
本文所述或所引用的技术和程序总体上被本领域的技术人员充分理解并通常用于使用常规方法，例如，以下中描述的广泛使用的方法：《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,第4版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),2012)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；丛书《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《聚合酶链反应2：一种实用方法(PCR 2:A Practical Approach)》(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；《抗体实验室手册(Antibodies,ALaboratory Manual)》(Harlow和Lane编辑,1988)；《动物细胞的培养：基础技术和专门应用手册(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications)》(R.I.Freshney,第6版,约翰威利父子出版公司(J.Wiley和Sons),2010)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,学术出版社(AcademicPress),1998)；《细胞和组织培养概论(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,普莱纽姆出版社(Plenum Press),1998)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,约翰威利父子出版公司,1993-8)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)》,(Mullis等人编辑,1994)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)》(Ausubel等人编辑,约翰威利父子出版公司,2002)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway等人,2004)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:A Practical Approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社(IRL Press),1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》(E.Harlow和D.Lane,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood AcademicPublishers),1995)；以及《癌症：肿瘤学原理和实践(Cancer:Principles and Practiceof Oncology)》(V.T.DeVita等人编辑,J.B.利平科特出版公司(J.B.LippincottCompany),2011)
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且每当适当时，以单数形式使用的术语也将包含复数形式，并且反之亦然。如果以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则以以下阐述的定义为准。
除非另有说明，否则如本文所使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。
如本文所使用的，术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“含有(containing)”和“包含(including)”以及其它类似的形式及其语法上的等效物，旨在意思上是等效的，并且是开放式的，因为这些词语中的任何一个后面的一个或多个项目并不意味着是此类一个或多个项目的详尽列举，或者意味着仅局限于所列出的一个或多个项目。例如，“包括”组分A、B和C的制品可以由组分A、B和C组成(即，仅含有)，或者可以不仅含有组分A、B和C，还含有一种或多种其它组分。因此，意图和理解“包括”及其类似形式，以及其语法等效物，包含“基本上由…组成”或“由…组成”的实施例的公开内容。
在提供值的范围的情况下，应理解在该范围的上限与下限之间的每个插入值(到下限的十分之一单位，除非上下文清楚地另外指明)以及在所陈述范围内的任何其它所陈述的值或插入值均被涵盖在本公开内，服从所述范围中任何具体排除的限制。在所陈述的范围包含限值中的一个或两个限值的情况下，排除被包含在内的限值中的任一个或两个限值的范围也包含在本公开内。
如本文所使用的，术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”一个值或参数包含(并且描述)针对所述值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包含对“X”的描述。
如本文所使用的，“外周血单核细胞”或“PBMC”是指具有圆形细胞核的异质血细胞群体。可以在PBMC群体中发现的细胞的实例包含淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞(包含自然杀伤T细胞(NKT细胞)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞))和单核细胞，如巨噬细胞和树突细胞。如本文所使用的“多个PBMC”是指包括至少两种类型血细胞的细胞的PBMC的制剂。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞中的三种或更多种。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞中的四种或更多种。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突细胞。
PBMC可以通过本领域已知的方式分离。例如，基于PBMC与其它血细胞相比的密度，PBMC可以源自个体的外周血。在一些实施例中，使用Ficoll(例如，Ficoll梯度)，PBMC源自个体的外周血。在一些实施例中，使用细胞分离系统，PBMC源自个体的外周血。PBMC可以获自接受单采术的个体。
在一些实施例中，PBMC群体从个体中分离。在一些实施例中，多个PBMC是PBMC的自体群体，其中所述群体源自特定个体，通过本文所描述的方法中的任何方法操纵，并返回给特定个体。在一些实施例中，多个PBMC是PBMC的同种异体群体，其中所述群体源自一个个体，通过本文所描述的方法中的任何方法操纵，并施用于第二个体。
在一些实施例中，多个PBMC是PBMC的重构制剂。在一些实施例中，所述多个PBMC可以通过混合通常在PBMC群体中发现的细胞来产生；例如，通过混合T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的两种或更多种的群体。
如本文所使用的，“有效载荷”是指被递送到，如装载在PBMC中的物质。“有效载荷”、“货物”、“递送材料”和“化合物”在本文中可互换使用。在一些实施例中，有效载荷可以指蛋白质、小分子、核酸(例如，RNA和/或DNA)、脂质、碳水化合物、大分子、维生素、聚合物、荧光染料和荧光团、碳纳米管、量子点、纳米颗粒和类固醇。在一些实施例中，有效载荷可以指蛋白质或小分子药物。在一些实施例中，有效载荷可以包括一种或多种化合物。
术语“异源”在其涉及如编码序列和控制序列等核酸序列时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或附着于其上的核酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，核酸构建体的异源区域可以包含编码序列，其两侧是未在自然界中发现与编码序列相关的序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞视为异源的。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源DNA。
术语“异源”在其涉及如肽序列和多肽序列等氨基酸序列时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，肽序列的“异源”区是在另一个氨基酸分子内或与其连接的氨基酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，肽构建体的异源区可以包含肽的氨基酸序列，所述肽侧接未发现与自然界中的肽的氨基酸序列相关的序列。异源肽序列的另一实例是其中肽序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因编码的氨基酸的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用表达通常不存在于细胞中的氨基酸构建体的载体转化的细胞视为异源的。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源肽。
术语“外源”在用于指如抗原或佐剂等与细胞相关的药剂时，是指细胞外的药剂或从细胞外递送至细胞内的药剂。所述细胞可能已经存在或可能不存在药剂，并且在外源药剂被递送后可能产生或可能不产生药剂。
如本文所使用的，术语“同源”是指源自相同生物体的分子。在一些实例中所述术语是指通常在给定生物体内发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所使用的，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益或期望的结果(包含临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包含但不限于以下一项或多项：减轻由疾病引起的一种或多种症状；减轻疾病的程度；稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化)；预防或延缓疾病的传播(例如，转移)；防止或延缓疾病的复发；延缓或减慢疾病的进展；改善疾病状态；缓解疾病(部分或全部)；降低治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量；延缓疾病的发展；提高或改善生活质量；增加体重增加；和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理学结果(如例如，肿瘤体积)。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
如本文所使用的，术语“预防性治疗”是指治疗，其中已知或怀疑个体患有某种病症或处于患有所述病症的风险，但没有表现出所述病症的症状或轻微症状。接受预防性治疗的个体可以在症状发作之前接受治疗。在一些实施例中，如果个体患有癌前病变，尤其是与HPV感染相关的癌前病变，则可以对所述个体进行治疗。
如本文所使用的，“组合疗法”意指第一药剂与另一种药剂联合施用。“与…联合”是指除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式，如除了对同一个体施用如本文所描述的免疫缀合物之外还施用如本文所描述的PMBC的组合物。因此，“与…联合”是指在向个体递送另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
如本文所使用的术语“同时施用”意指组合疗法中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔不超过约15分钟，如不超过约10、5或1分钟中的任一个。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可以包含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或包含在单独的组合物中(例如，第一疗法包含在一种组合物中并且第二疗法包含在另一种组合物中)。
如本文所使用的，术语“顺序施用”是指组合疗法中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔超过约15分钟，如超过约20、30、40、50、60或更多分钟中的任一个。可以首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独的组合物中，所述单独的组合物可以包含在相同或不同的包装或试剂盒中。
如本文所使用的，术语“同时施用”意指在组合疗法中的第一疗法的施用和第二疗法的施用相互重叠。
在癌症的情况下，术语“治疗”包含杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞复制、减轻整体肿瘤负担和改善一种或多种与疾病相关的症状中的任何一种或全部。
如本文所使用的，术语“调节”可以指更改、改变、变化或以其它方式修改特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指引起更改、改变、变化或以其它方式修饰免疫应答的任何行为。在一些实例中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些实例中，“调节”是压制特定靶标的存在或活性。在其它实例中，调节核酸表达可以包含但不限于核酸转录的变化、mRNA丰度的变化(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的对应变化、mRNA翻译的变化等。
如本文所使用的，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其它方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指引起免疫应答的阻断、减少、消除或任何其它拮抗作用的任何行为。在其它实例中，核酸表达的抑制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制、基因编辑等。在其它实例中，蛋白质表达的抑制可以包含但不限于，编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的减少、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的减少等。在另一个实例中，抑制可以指减缓或停止生长的行为；例如，延缓或防止肿瘤细胞的生长。
如本文所使用的，术语“压制”可以指降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱特定靶标的存在或活动的行为。压制可以指部分压制或完全压制。例如，压制免疫应答可以指引起降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱免疫应答的任何行为。在其它实例中，核酸表达的压制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在其它实例中，蛋白质表达的压制可以包含但不限于，编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的减少、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的减少等。
如本文所使用的，术语“增强”可以指改善、加强、提高或以其它方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指引起改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性实例中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答。在其它实例中，核酸表达的增强可以包含但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的减少、mRNA翻译的增加等。在其它实例中，增强蛋白质的表达可以包含但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。
如本文所使用的，术语“诱导”可以指引发、提示、刺激、建立或以其它方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指引起引发、促使、刺激、建立或以其它方式产生期望的免疫应答的任何行为。在其它实例中，诱导核酸表达可以包含但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。在其它实例中，诱导蛋白质的表达可以包含但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，该术语包含但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可以包括糖和磷酸基(如通常可以存在于RNA或DNA中的)，或经修饰的或经取代的糖或磷酸基。多核苷酸的主链可以包括由肽键连接的重复单元，如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸(即，肽核酸)。可替代地，多核苷酸的主链可以包括合成亚基的聚合物，如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯低聚物或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。另外，通过合成互补链并在适当条件下退火链，或通过使用具有适当引物的DNA聚合酶从头合成互补链，可以从化学合成的单链多核苷酸产物中获得双链多核苷酸。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。此类氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然的氨基酸残基，并且包含但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白和其片段两者。所述术语还包含多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本发明的目的，“多肽”是指包含对天然序列进行如缺失、添加和取代等修饰的蛋白质，(通常本质上是保守的)，只要所述蛋白质维持期望的活性。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增而产生的错误。
如本文所使用的，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与抗原单独施用相比，佐剂与抗原联合施用增强对抗原的免疫应答。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡脱氧核苷酸”和“CpG ODN”在本文中是指长度为10至30个核苷酸的DNA分子，含有由磷酸盐分离的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸(在本文中也被称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开的CpG ODN含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。也就是说，CpG二核苷酸中的胞嘧啶没有甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)主链。
如本文所使用的，“药学上可接受的”或“药理上相容的”是指非生物学上或其它方面不期望的材料，例如，所述材料可以并入到施用于患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不期望的生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的组合物中的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地符合毒理学和制造测试的所需标准和/或包含在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)编写的《非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)》中。
对于本文所描述的结构和功能特性中的任何结构和功能特性，确定这些特性的方法是本领域已知的。
如本文所使用的，“微流体系统”是指其中低体积(例如，mL、nL、pL、fL)的流体被加工以实现小体积液体的离散处理的系统。本文所描述的某些实施方案包含多路复用、自动化和高通量筛选。流体(例如，缓冲液、溶液、含有效载荷的溶液或细胞悬浮液)可以被移动、混合、分离或以其它方式加工。在本文所描述的某些实施例中，微流体系统用于对悬浮在缓冲液中的细胞施加机械收缩，诱导细胞中的扰动(例如，孔)，允许有效载荷或化合物进入细胞的细胞质。
如本文所使用的，“收缩”可以指由入口部分、中心点和出口部分限定的微流体通道的一部分，其中中心点由宽度、长度和深度限定。在其它实例中，收缩可以指孔或者可以是孔的一部分。孔可以包含在表面上(例如，过滤器和/或膜)。
对于本文所描述的结构和功能特性中的任何结构和功能特性，确定这些特性的方法是本领域已知的。
治疗方法
在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。
在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及向所述个体施用有效量的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。
在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述有效量是约0.5×104个细胞/kg至约5.0×109个细胞/kg，并且其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述有效量是约0.5×106个细胞/kg至约5.0×106个细胞/kg，并且其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
在一些实施例中，所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。在一些实施例中，所述HPV相关癌症是宫颈癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌、唾液腺癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌、食道癌或头颈癌。在一些实施例中，所述HPV相关疾病是HPV相关传染性疾病。
在一些实施例中，PBMC的有效量是约0.5×104,1.0×104,0.5×105,1.0×105,0.5×106,1.0×106,0.5×107,1.0×107,0.5×108,1.0×108,0.5×109,和1.0×109个细胞/kg中的任一个。在一些实施例中，所述有效量是约0.5×104至约1.0×104、约1.0×105至约0.5×105、约0.5×105至约1.0×105、约1.0×105至约0.5×106、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109或约0.5×109至约1.0×109个细胞/kg中的任一个。在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述有效量是约0.5×106至约5×106个PBMC/kg，并且其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
在一些实施例中，所述方法进一步包括施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。示例性免疫检查点抑制剂是但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与PD-1结合的抗体、与PD-L1结合的抗体、与CTLA-4结合的抗体、与LAG3结合的抗体、与TIM-3结合的抗体、与TIGIT结合的抗体、与VISTA结合的抗体、与TIM-1结合的抗体、与B7-H4结合的抗体或与BTLA结合的抗体。在另外的实施例中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)。在另外的实施例中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种化学化合物。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种肽。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向CTLA-4。
在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述有效量是约0.5×106至约5×106个PBMC，并且其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是PD-1的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂、PD-1的拮抗剂和/或PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与CTLA-4结合的抗体。在一些实施例中，所述PD-1的拮抗剂是与PD-1结合的抗体。在一些实施例中，所述PD-L1的拮抗剂是与PD-L1结合的抗体。在一些实施例中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括与CTLA-4结合的抗体、与PD-1结合的抗体和/或与PD-L1结合的抗体。
在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及施用有效量的：CTLA-4的拮抗剂、PD-1的拮抗剂和/或PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及施用有效量的：与CTLA-4结合的抗体、与PD-1结合的抗体和/或与PD-L1结合的抗体。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。在一些实施例中，向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体。在一些实施例中，向所述个体施用与PD-L1结合的抗体。在一些实施例中，向所述个体施用与PD-1结合的抗体。
在一些方面，提供了用于刺激对个体的HPV抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种HPV抗原；其中所述至少一种HPV抗原被细胞内递送至所述PBMC。在一些实施例中，所述PBMC进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了用于减少个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种HPV抗原；其中所述至少一种HPV抗原被细胞内递送至所述PBMC。在一些实施例中，所述PBMC进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种HPV抗原；其中所述至少一种HPV抗原被细胞内递送至所述PBMC。在一些实施例中，所述PBMC进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述PBMC包括至少一种HPV抗原；其中所述至少一种HPV抗原被细胞内递送至所述PBMC。在一些实施例中，所述PBMC进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。
在一些方面，提供了一种用于刺激对个体的HPV抗原的免疫应答的方法，所述方法包括：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使得所述输入PBMC的扰动足够大以使HPV抗原或所述HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入PBMC；b)将所述扰动的PBMC与所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的PBMC；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的所述PBMC。
在一些方面，提供了一种用于减少个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使得所述输入PBMC的扰动足够大以使HPV抗原或所述HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入PBMC；b)将所述扰动的PBMC与所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的PBMC；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的所述PBMC。
在一些方面，提供了一种对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使得所述输入PBMC的扰动足够大以使HPV抗原或所述HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入PBMC；b)将所述扰动的PBMC与所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的PBMC；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的所述PBMC。
在一些方面，提供了一种用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使得所述输入PBMC的扰动足够大以使HPV抗原或所述HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入PBMC；b)将所述扰动的PBMC与所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的PBMC；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述HPV抗原或所述HPV抗原和所述佐剂的所述PBMC。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何方法、用途或组合物的一些实施例中，所述方法包括：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使得所述输入PBMC的扰动足够大以使HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述HPV抗原的经修饰的PBMC；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述HPV抗原的所述经修饰的PBMC。
在一些实施例中，本文提供了一种用于刺激对个体的HPV蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括如本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，本文提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，本文提供了一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，所述癌症是宫颈癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌、唾液腺癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌、头颈癌或食道癌。
在一些实施例中，本文提供了一种用于刺激对个体的HPV蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，本文提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，本文提供了一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。
在一些实施例中，本文提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于刺激对HPV抗原的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，本文提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于减少个体的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，本文提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。
在一些实施例中，本文提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于刺激对HPV抗原蛋白的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，本文提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于减少个体的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，本文提供了包括有效量的PBMC的组合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括PBMC的组合物中的任一种，所述PBMC包括本文所描述的至少一种HPV抗原。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物的一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，所述癌症是宫颈癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌、唾液腺癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌、头颈癌或食道癌。在一些实施例中，所述癌症是与HPV相关的癌症。在一些实施例中，所述癌症是局限性癌症。在一些实施例中，所述癌症是局限性癌症。在一些实施例中，所述癌症是局部晚期癌症。在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施例中，所述癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是液体瘤。
在一些实施例中，所述癌症不适合用手术、放射和/或化学放射疗法进行治愈性治疗。在一些实施例中，在辅助或复发性环境中，在用基于铂的方案进行先前全身化学疗法治疗之后，所述癌症已经进展。在一些实施例中，在用以下中的一种或多种进行先前化学疗法治疗之后，所述癌症已经进展：顺铂、紫杉醇、卡铂和/或5FU。在一些实施例中，在先前免疫检查点抑制剂治疗之后，所述癌症已经进展。在一些实施例中，在用以下中的一种或多种进行先前治疗之后，所述癌症已经进展：派姆单抗、贝伐单抗(bevacizumab)和/或派姆单抗。在一些实施例中，所述癌症是铂经历的。在一些实施例中，所述癌症是铂抗性的。在一些实施例中，所述个体在接受最近的先前治疗时或在完成最近的先前治疗之后患有进行性疾病。在一些实施例中，所述癌症是宫颈癌。在一些实施例中，所述癌症是复发性或转移性宫颈癌。
在一些实施例中，所述癌症不适合用手术、放射和/或化学放射疗法进行治愈性治疗。在一些实施例中，在初级、辅助或复发性环境中，在至少1次(如1、2、3、4、5次或更多次)基于铂的先前化学疗法之后，癌症已经进展，并且已经提供检查点免疫疗法。在一些实施例中，在用以下中的一种或多种进行先前化学疗法治疗之后，所述癌症已经进展：顺铂、紫杉醇、卡铂和/或5FU。在一些实施例中，在先前免疫检查点抑制剂治疗之后，所述癌症已经进展。在一些实施例中，在用以下中的一种或多种进行先前治疗之后，所述癌症已经进展：派姆单抗、贝伐单抗和/或派姆单抗。在一些实施例中，所述癌症是铂经历的。在一些实施例中，所述癌症是铂抗性的。在一些实施例中，在含铂的确定性化学放射之后或在辅助化学放射之后，所述个体复发并且复发时铂再激发被认为是无益的。在一些实施例中，所述癌症是头颈癌。在一些实施例中，所述癌症是复发性或转移性头颈癌。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述PBMC的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为在PBMC群体中具有最小直径的所述输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约5μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入PBMC的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述输入PBMC对于所述个体是自体的。在一些实施例中，所述输入PBMC对于所述个体是同种异体的。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的所述经修饰的PBMC对于所述个体是自体的。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的所述经修饰的PBMC对于所述个体是同种异体的。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，在将所述HPV抗原或所述编码所述HPV抗原的核酸引入到所述PBMC中之前调节所述PBMC。在一些实施例中，在将所述HPV抗原或所述编码所述HPV抗原的核酸引入到所述PBMC中之后调节所述PBMC。在一些实施例中，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在一些实施例中，其中所述PBMC包括B细胞，与所述未经调节的PBMC的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，与所述未经调节的多个PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，所述经调节的多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在一些实施例中，所述PBMC是人细胞。在一些实施例中，所述PBMC是具有HLA-A*02,HLA-A*01,HLA-A*03,HLA-A*24,HLA-A*11,HLA-A*26,HLA-A*32,HLA-A*31,HLA-A*68,HLA-A*29,HLA-A*23,HLA-B*07,HLA-B*44,HLA-B*08,HLA-B*35,HLA-B*15,HLA-B*40,HLA-B*27,HLA-B*18,HLA-B*51,HLA-B*14,HLA-B*13,HLA-B*57,HLA-B*38,HLA-C*07,HLA-C*04,HLA-C*03,HLA-C*06,HLA-C*05,HLA-C*12,HLA-C*02,HLA-C*01,HLA-C*08或HLA-C*16的单体型的人细胞。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述PBMC是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ或IL 21。
在一些实施例中，所述HPV抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同HPV抗原的应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其它抗原或佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，所述方法包括约3至约9次施用包括所述HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，所述方法包括约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15次中的任一种施用包括所述HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，所述方法包括根据需要连续施用包括所述HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，两次连续施用包括所述HPV抗原的所述PBMC之间的时间间隔为约1天至约30天。在一些实施例中，两次连续施用包括所述HPV抗原的PBMC之间的时间间隔为约21天。在一些实施例中，两次连续施用包括所述HPV抗原的所述PBMC之间的时间时间间隔为约1,2,3,4,5,6,7,8,10,12,14,16,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100或150天中的任一个。在一些实施例中，首次两次连续施用包括所述HPV抗原的所述PBMC之间的时间间隔为1天或2天。在一些实施例中，首次两次连续施用包括所述HPV抗原的所述PBMC之间的时间间隔为1天或2天，其中所述方法包括超过2次施用包括所述HPV抗原的所述PBMC(如但不限于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次施用)。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内、口服和/或皮下施用包括所述HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，静脉内施用包括所述HPV抗原的所述PBMC。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是polyI:C。
在一些实施例中，所述个体对HLA-A*02,HLA-A*01,HLA-A*03,HLA-A*24,HLA-A*11,HLA-A*26,HLA-A*32,HLA-A*31,HLA-A*68,HLA-A*29,HLA-A*23,HLA-B*07,HLA-B*44,HLA-B*08,HLA-B*35,HLA-B*15,HLA-B*40,HLA-B*27,HLA-B*18,HLA-B*51,HLA-B*14,HLA-B*13,HLA-B*57,HLA-B*38,HLA-C*07,HLA-C*04,HLA-C*03,HLA-C*06,HLA-C*05,HLA-C*12,HLA-C*02,HLA-C*01,HLA-C*08或HLA-C*16的表达呈阳性。
免疫检查点是所述免疫系统的调节器并且保持免疫应答处于检查。免疫检查点抑制剂可以用于促进免疫应答的增强。在一些实施例中，包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物与免疫检查点抑制剂的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含HPV抗原的所述PBMC的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内、口服和/或皮下施用所述免疫检查点抑制剂和/或包括所述HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，静脉内施用包括所述HPV抗原的所述PBMC。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内、口服和/或皮下施用所述免疫检查点抑制剂。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时至约1周施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时至约1周施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物和/或多次施用所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述HPV抗原的所述PBMC的所述组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。
示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与PD-1结合的抗体、与PD-L1结合的抗体、与CTLA-4结合的抗体、与LAG3结合的抗体、或与TIM-3结合的抗体、与TIGIT结合的抗体、与VISTA结合的抗体、与TIM-1结合的抗体、与B7-H4结合的抗体或与BTLA结合的抗体。在另外的实施例中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)。在另外的实施例中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种化学化合物。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种肽。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。
在一些实施例中，本文提供了包括至少一种HPV抗原的多个PBMC，用于根据本文所描述的方法中的任何一种方法刺激个体的免疫应答的方法。
在根据本文所描述的治疗HPV相关癌症的方法中的任一种的一些实施例中，所述治疗包含杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞复制、减轻整体肿瘤负担和改善一种或多种与疾病相关的症状中的任何一种或全部。在一些实施例中，治疗HPV相关癌症的方法在具有较低肿瘤负荷的患者中比在具有较高肿瘤负荷的患者中更有效。在一些实施例中，与具有较高肿瘤负荷的患者相比，在具有较低肿瘤负荷的患者中，治疗HPV相关癌症的方法导致以下中的一种或多种中的较高比率：杀伤癌细胞、抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减轻总体肿瘤负荷和改善与疾病相关的一种或多种症状。
包括HPV抗原的PBMC的组合物
在本文所描述的治疗方法的一些实施例中，所述PBMC包括细胞内递送的HPV抗原和佐剂。在一些实施例中，对包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC进行调节。在一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括将所述PBMC与佐剂在约37℃下一起温育约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以使所述PBMC进行调节的方法进行调节。
在一些实施例中，治疗方法包括施用有效量的包括至少一种HPV抗原的PBMC，其中包括所述至少一种HPV抗原t的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的包括HPV抗原和佐剂的PBMC，其中包括所述HPV抗原和所述佐剂的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述HPV抗原和所述佐剂的经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供了一种PBMC的组合物，所述组合物包括至少一种HPV抗原，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入PBMC的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为在PBMC群体中具有最小直径的所述输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约5μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入PMBC的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。在一些实施例中，包括所述输入PBMC的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述HPV抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同HPV抗原的应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其它抗原或佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)。
剂量和方案
在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述有效量是约0.5×106至约5×106个细胞/kg，并且其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的有效量0.5×106至约5×106个细胞/kg。在一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的所述有效量是约0.5×104,1.0×104,0.5×105,1.0×105,0.5×106,1.0×106,0.5×107,1.0×107,0.5×108,1.0×108,0.5×109和1.0×109个细胞/kg中的任一个。在一些实施例中，所述有效量是约0.5×104至约1.0×104、约1.0×105至约0.5×105、约0.5×105至约1.0×105、约1.0×105至约0.5×106、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109或约0.5×109至约1.0×109个细胞/kg中的任一个。在一些实施例中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括PBMC的组合物，其中所述有效量是约0.5×106至约5×106个细胞/kg，并且其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
在一些实施例中，其中所述方法进一步包括施用有效量的免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂靶向CTLA-4。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与CTLA-4结合的抗体。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是伊匹单抗。在一些实施例中，伊匹单抗的有效量为约0.1mg/kg至约30mg/kg。在一些实施例中，伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg中的任一个。在一些实施例中，伊匹单抗的有效量为约0.1,0.2,0.5,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,2.2,2.4,2.6,2.8,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18,20,25或30mg/kg中的任一个。在一些实施例中，伊匹单抗的有效量为约0.1至0.2、0.2至0.5、0.5至1.0、1.0至1.2、1.2至1.4、1.4至1.6、1.6至1.8、1.8至2.0、2.0至2.2、2.2至2.4、2.4至2.6、2.6至2.8、2.8至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至12、12至14、14至16、16至18、18至20、20至25或25至30mg/kg中的任一个。
在一些实施例中，其中所述方法进一步包括施用有效量的免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是PD-1的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1结合的抗体。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是纳武单抗。在一些实施例中，纳武单抗的有效量为约30mg至约1000mg。在一些实施例中，纳武单抗的有效量是约300mg至约400mg中的任一个。在一些实施例中，纳武单抗的有效量为约360mg。在一些实施例中，纳武单抗的有效量为约30、50、100、150、200、250、300、320、340、360、380、400、450、500、550、600、700、800、900或1000mg中的任一个。在一些实施例中，伊匹单抗的有效量为约30至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至320、320至340、340至360、360至380、380至400、400至450、500至550、550至600、600至700、700至800、800至900、900至1000mg中的任一个。
在一些实施例中，其中所述方法进一步包括施用有效量的免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-L1结合的抗体。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是阿特朱单抗。在一些实施例中，阿特朱单抗的有效量为约100mg至约2500mg。在一些实施例中，阿特朱单抗的有效量为约900mg至约1500mg。在一些实施例中，阿特朱单抗的有效量为约1200mg中的任一个。在一些实施例中，阿特朱单抗的有效量为约100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1150,1200,1250,1300,1400,1500,1600,1800,2000,2200或2500mg中的任一个。在一些实施例中，阿特朱单抗的有效量为约100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、700至800、800至900、900至1000、1000至1100、1100至1200、1200至1300、1300至1400、1400至1500、1500至1600、1600至1800、1800至2000、2000至2200、2200至2500mg中的任一个。
在一些实施例中，治疗方法包括向所述个体施用如本文所描述的PBMC的多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个中的任一个)周期。例如，在一些实施例中，本文提供了一种通过向个体2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次施用包括至少一种HPV抗原的PBMC来针对抗原对所述个体进行疫苗接种的方法，所述PBMC是通过使输入PBMC通过收缩以形成扰动的输入PBMC，使得所述至少一种HPV抗原进入所述PBMC而产生的。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC的任何两次连续施用之间的持续时间为至少约1天(如至少约2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间中的任一种，包含这些值之间的任何范围)。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周周期中的任一个施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周周期中的任一个中的第1天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物以3周周期施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物以6周周期施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在治疗周期中的第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20天中的一个或多个施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在治疗周期的第1天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在治疗周期的第2天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在治疗周期的第1天和第2天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在治疗周期的第1天和第3天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在治疗周期的第8天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物在三周周期的第1天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物进一步在三周周期的第2天施用。在一些实施例中，包括所述PBMC的所述组合物以3周周期施用，直到所述PBMC组合物供应耗尽为止，或施用一年。在一些实施例中，向所述个体施用包括PBMC的所述组合物至少约三个月、六个月、九个月、一年或两年。
在一些实施例中，约0.5×104,1.0×104,0.5×105,1.0×105,0.5×106,1.0×106,0.5×107,1.0×107,0.5×108,1.0×108,0.5×109,和1.0×109个细胞/kg的PBMC中的任一个在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，约0.5×104、1.0×104、0.5×105、1.0×105、0.5×106、1.0×106、0.5×107、1.0×107、0.5×108、1.0×108、0.5×109和1.0×109个细胞/kg中的任一个在每个三周周期的第2天施用。在一些实施例中，约0.5×104、1.0×104、0.5×105、1.0×105、0.5×106、1.0×106、0.5×107、1.0×107、0.5×108、1.0×108、0.5×109和1.0×109个细胞/kg中的任一个在第一三周周期的第1天和第2天施用并且约0.5×104、1.0×104、0.5×105、1.0×105、0.5×106、1.0×106、0.5×107、1.0×107、0.5×108、1.0×108、0.5×109和1.0×109个细胞/kg中的任一个在后续三周周期的第1天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在第一三周周期的第1和2天施用并且约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在后续三周周期的第1天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg在每个三周周期的第2天施用。在一些实施例中，约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在每个三周周期的第2天施用。在一些实施例中，0.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，0.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用，并且0.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第2天施用。在一些实施例中，0.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用，并且0.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第3天施用。在一些实施例中，2.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，2.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用，并且2.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第2天施用。在一些实施例中，2.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用，并且2.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第3天施用。在一些实施例中，2.5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用，并且5×106个细胞/kg在每个三周周期的第2天施用。在一些实施例中，5×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用，并且5×106个细胞/kg在每个三周周期的第3天施用。
在一些实施例中，其中所述方法进一步包括施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂靶向CTLA-4。PD-1和/或PD-L1。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体每周期施用1、2、3、4、5、6次或更多次。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体每三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体每三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体每三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体每三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体每两个三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体每两个三周周期施用一次。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体每两个三周周期施用一次。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周周期中的任一个施用。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂在1-,2-,3-,4-,5-,6-,7-,8-,9-或10周周期中的任一个中的第1天施用。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂在治疗周期中的第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20天中的一个或多个施用。
在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与CTLA-4结合的抗体，所述与CTLA-4结合的抗体在每个三周周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体施用最多四个剂量。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。在一些实施例中，所述伊匹单抗以约1mg/kg至约3mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量在每个三周周期的第1天施用。
在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1结合的抗体，所述与PD-1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续三周周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。在一些实施例中，所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗，其中所述纳武单抗以约360mg的剂量在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
在一些实施例中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括与CTLA-4结合的抗体和与PD-1结合的抗体，其中所述与CTLA-4结合的抗体在每隔三周周期的第1天(即，每个6周周期的第1天或两个三周周期的所述第一三周周期的第1天)施用，并且其中所述与PD-1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续三周周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗或所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。在一些实施例中，所述伊匹单抗以约1mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。在一些实施例中，所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约1mg/kg的剂量在每隔三周周期的第1天(即，每个6周周期的第1天或两个三周周期的所述第一三周周期的第1天)施用，并且所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗，所述纳武单抗以约360mg的剂量在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-L1结合的抗体，所述与PD-L1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续三周周期的第1天施用。在一些实施例中，所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。在一些实施例中，所述阿特朱单抗以约1200mg的剂量施用。在一些实施例中，所述与PD-1结合的抗体是阿特朱单抗，其中所述阿特朱单抗以约1200mg的剂量在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
产生包括HPV抗原的PBMC的组合物的方法
在一些实施例中，提供了用于产生包括包含至少一种HPV抗原的PBMC的组合物的方法，其中所述至少一种HPV抗原被细胞内递送至所述PBMC。例如，用于产生用于如本文所描述的治疗方法的组合物的方法。在一些实施例中，提供了用于产生包括包含HPV抗原和佐剂的PBMC的组合物的方法，其中所述HPV抗原和所述佐剂被细胞内递送至所述PBMC。
在一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括以下的方法制备：a)使包括输入PBMC群体的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC群体与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入PBMC，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC。
在一些实施例中，所述HPV抗原包括源自HPV E6的肽。在一些实施例中，所述HPV抗原包括源自HPV E7的肽。在一些实施例中，所述HPV抗原包括源自HPV E6的肽。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入PBMC的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约15μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约10μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.5μm至约4μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4μm至约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.2μm至约3.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.8μm至约4.3μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm或5.0μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，包括所述输入PBMC的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述HPV抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同HPV抗原的应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其它抗原或佐剂一起递送。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、其它抗原或所述佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)。
HPV抗原
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，所述外源抗原是HPV抗原。乳头瘤病毒是病毒粒子大小的直径约为55nm的小的无包膜DNA病毒。超过100种HPV基因型被完全表征，并且推测存在更多的基因型。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知原因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且是自发清除的，但是具有致癌性HPV类型之一的持续感染可以进展为癌前病变或癌症。其它HPV相关疾病可以包含寻常疣、跖疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头状瘤、疣状囊肿、喉乳头状瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。许多已知的HPV类型导致良性病变，其中一部分是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，将HPV类型分类为十五种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知其一起表现为低度和高度宫颈病变和癌症，以及其它非生殖器癌症，如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌，以及头颈癌。最近，也描述了高风险类型HPV 16和18与乳腺癌的关联。已知分类为“低风险类型”的十一种HPV类型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)表现为良性低度宫颈病变、生殖器疣和复发性呼吸道乳头状瘤病。皮肤HPV 5型、8型和92型与皮肤癌症相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统被抑制并且相应地，抗肿瘤应答被显著削弱。参见Suresh和Burtness,《美国血液学与肿瘤学杂志》13(6):20-27(2017)。在一些实施例中，所述外源抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同抗原的应答。在一些实施例中，多抗原的池中的抗原不会降低针对多抗原的池中的其它抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、其它抗原或所述佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽，其中所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:18-25中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:18具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:19具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ IDNO:22的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原是包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列中的至少一个的多个抗原。在一些实施例中，所述外源抗原是包括SEQ ID No:18-25中的任一个的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7或8个的多个抗原。在一些实施例中，所述外源抗原是包括与SEQ ID NO:19具有至少90％相似性的氨基酸序列和与SEQID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列的多个抗原。在一些实施例中，所述外源抗原是包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列的多个抗原。在一些实施例中，所述多个抗原包含在非共价连接的肽的池内。在一些实施例中，所述多个抗原包含在非共价连接的肽的池内，其中每个肽包括不超过一个抗原。在一些实施例中，所述多个抗原包含在非共价连接的肽的池内，其中SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:25的氨基酸序列包含在单独的肽内。
在一些实施例中，所述HPV抗原在多个多肽的池内，所述多个多肽引发针对相同和或不同HPV抗原的应答。在一些实施例中，多抗原的池中的抗原不会降低针对多抗原的池中的其它抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV抗原和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、其它抗原或所述佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-A11特异性表位组成。在一些实施例中，HPV抗原由HLA-B7特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-C8特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原包括全长HPV蛋白的部分或全部N末端结构域。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述PBMC包括包含多个免疫原性表位的多个HPV抗原。在另外的实施例中，在向个体施用包括包含所述多个免疫原性表位的所述多个抗原的所述PBMC之后，所述多个免疫原性表位中没有一个降低所述个体对其它免疫原性表位中的任何免疫原性表位的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
佐剂
如本文所使用的，术语“佐剂”可以指直接或间接调节和/或产生免疫应答的物质。在本发明的一些实施例中，将佐剂细胞内递送至PBMC群体，以形成包括所述佐剂的经修饰的PBMC。在一些情况下，与HPV抗原单独施用相比，佐剂与包括HPV抗原的PBMC联合施用增强对所述HPV抗原的免疫应答。在一些实施例中，在PBMC通过收缩之前、期间或之后，将所述PBMC与所述佐剂一起温育，以促进所述PBMC的调节(例如但不限于成熟)。佐剂可以用于加强对HPV抗原的免疫细胞应答(例如T细胞应答)的引发。示例性佐剂包含但不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、维甲酸诱导基因I(RIG-I)激动剂和TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(imiquimod)(R837)、瑞喹莫德(resiquimod)(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在特定实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN或C类CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂包括选自CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpGODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpGODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03的组。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:30))或CpG ODN 2006(也被称为CpG 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:31))寡核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。在一些实施例中，所述RIG-I激动剂包括聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)。多种佐剂也可以与HPV抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的PBMC进一步包括多于一种佐剂。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的PBMC由多于一种佐剂调节。多种佐剂也可以与HPV抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的PBMC进一步包括多于一种佐剂。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的PBMC进一步包括所述佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂的任何组合。在一些实施例中，包括所述HPV抗原的PBMC由所述佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂的任何组合调节。
PBMC内的组成细胞
在一些实施例中，本文所公开的方法提供了向有需要的个体施用有效量的包括至少一种HPV抗原的PBMC的组合物，其中所述至少一种HPV抗原是细胞内递送的。在一些实施例中，PMBC的所述组合物是免疫细胞的组合物。在一些实施例中，PBMC的所述组合物包括多个PBMC。在一些实施例中，所述PBMC是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在本发明的特定实施例中，包括所述组合物的HPV抗原的所述细胞是PBMC。如本文所使用的，PBMC可以通过如白细胞去除术等单采术从获自个体的全血中分离。还提供了通过混合来自相同个体或不同个体的不同PBMC池而重构的PBMC组合物。在其它实例中，PBMC也可以通过将不同的细胞群体混合成具有产生的分布图的混合细胞组合物来重构。在一些实施例中，用于重构PBMC的所述细胞群体是混合细胞群体(如T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的一种或多种的混合物)。在一些实施例中，用于重构PBMC的所述细胞群体是纯化细胞群体(如纯化T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞)。在另外的实例中，用于重构PBMC组合物的所述不同的细胞群体可以从相同个体(例如自体)中分离或从不同个体(例如同种异体和/或异源)中分离。
因此，在根据本文所描述的方法的一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞。在一些实施例中，所述多个PBMC包括CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞中的一种或多种。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与全血中的PBMC总数的比率基本上相同。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与来自全血的白细胞去除术产物中的PBMC总数的比率基本上相同。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与全血中的PBMC总数的比率相差不超过1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％中的任一个。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与全血中的PBMC总数的比率相差不超过10％中的任一个。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与来自全血的白细胞去除术产物中的PBMC总数的比率相差不超过1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％中的任一个。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与来自全血的白细胞去除术产物中的PBMC总数的比率相差不超过10％中的任一个。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，约25％至约80％的所述经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施例中，约1.5％至约30％的所述经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施例中，约3％至约35％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施例中，约4％至约45％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，至少约15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％或80％的所述PBMC中的任一个是T细胞。在一些实施例中，至少约25％的所述PBMC是T细胞。在一些实施例中，至少约0.5％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,4％,5％,6％,7％,7.5％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％或30％的所述PBMC中的任一个是B细胞。在一些实施例中，至少约1.5％的所述PBMC是B细胞。在一些实施例中，至少约0.5％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,4％,5％,6％,7％,7.5％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％或30％的所述PBMC中的任一个是NK细胞。在一些实施例中，至少约3％的所述PBMC是NK细胞。在一些实施例中，至少约1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,12％,14％,16％,18％,20％,25％,30％,35％,40％或45％的所述PBMC中的任一个是单核细胞。在一些实施例中，至少约4％的所述PBMC是单核细胞。在一些实施例中，至少约25％的所述PBMC是T细胞；至少约1.5％的所述PBMC是B细胞；至少约3％的所述PBMC是NK细胞；并且至少约4％的所述PBMC是单核细胞。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，不超过约40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％或90％的所述PBMC中的任一个是T细胞。在一些实施例中，不超过约80％的所述PBMC是T细胞。在一些实施例中，不超过约5％,10％,12％,14％,16％,18％,20％,22％,25％,30％,35％,40％或50％的所述PBMC中的任一个是B细胞。在一些实施例中，不超过约30％的所述PBMC是B细胞。在一些实施例中，不超过约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％或60％的所述PBMC中的任一个是NK细胞。在一些实施例中，不超过约35％的所述PBMC是NK细胞。在一些实施例中，不超过约5％,10％,12％,14％,16％,18％,20％,22％,25％,30％,35％,40％或50％的所述PBMC中的任一个是单核细胞。在一些实施例中，不超过约45％的所述PBMC是单核细胞。在一些实施例中，不超过约80％的所述PBMC是T细胞；不超过约30％的所述PBMC是B细胞；不超过约20％的所述PBMC是NK细胞；并且不超过约45％的所述PBMC是单核细胞。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，约20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％或70％至75％或75％至80％的所述经修饰的PBMC中的任一个是T细胞。在一些实施例中，约25％至约80％的所述经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施例中，约1％至1.5％、1.5％至2.5％、2.5％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％、20％至25％或25％至30％的所述经修饰的PBMC中的任一个是B细胞。在一些实施例中，约2.5％至约14％的所述经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施例中，约1％至2％、2％至3％、3％至5％、5％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％或35％至40％的所述经修饰的PBMC中的任一个是NK细胞。在一些实施例中，约3.0％至约35％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施例中，约2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％或30％至45％的所述经修饰的PBMC中的任一个是单核细胞。在一些实施例中，约4％至约45％的所述经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施例中，约25％至约80％的所述经修饰的PBMC是T细胞；约1.5％至约30％的所述经修饰的PBMC是B细胞；约3％至约35％的所述经修饰的PBMC是NK细胞；并且约4％至约45％的所述经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施例中，约25％至约80％的所述经修饰的PBMC是T细胞；约1.5％至约30％的所述经修饰的PBMC是B细胞；约3％至约20％的所述经修饰的PBMC是NK细胞；并且约4％至约45％的所述经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施例中，约25％至约70％的所述经修饰的PBMC是T细胞；约2.5％至约14％的所述经修饰的PBMC是B细胞；约3.5％至约20％的所述经修饰的PBMC是NK细胞；并且约4％至约25％的所述经修饰的PBMC是单核细胞。
如本文所使用的，PBMC也可以在处理单核血细胞(如淋巴细胞和单核细胞)的混合细胞群体的组合物之后产生。在一些情况下，PBMC是在单核血细胞的混合细胞群体中减少(如耗尽)某些亚群体(如B细胞)之后产生的。可以操纵个体中的单核血细胞的混合细胞群体中的组成，以使得细胞群体更接近同一个体中的全血中的白细胞去除术产物。在其它实施例中，单核血细胞(例如，小鼠脾细胞)的混合细胞群体中的组成也可以被操纵，以使得细胞群体更接近于从来自人全血的白细胞去除术产物分离的人PBMC。
在本发明的一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物是在PBMC中发现的细胞群体。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞中的一种或多种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ T细胞中的任一种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括100％ T细胞。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ B细胞中的任一种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括100％ B细胞。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ NK细胞中的任一种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括100％ NK细胞。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％单核细胞中的任一种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括100％单核细胞。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括至少约70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％树突细胞中的任一种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括100％树突细胞。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括至少约70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％ NK-T细胞中的任一种。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PMBC的所述组合物包括100％ NK-T细胞。
包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的可制造性
在根据本文所描述的方法或组合物中的任何一种方法或组合物的一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PBMC的活力为至少约以下中的任一个：30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％或98％。在一些实施例中，包括至少一种HPV抗原的PBMC的活力为至少约90％。
在一些实施例中，治疗方法包括施用有效量的包括至少一种HPV抗原的PBMC，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC，其中包括至少一种HPV抗原的PBMC的活力为至少约以下中的任一个：30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％或98％。
在根据本文所描述的方法或组合物中的任何一种方法或组合物的一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC的端到端处理时间(如包含以下中的一种或多种的处理：患者白细胞的淘析、处理所述PBMC的组成、产生和/或调节包括所述至少一种HPV抗原的PBMC)为约以下中的任一个：4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24小时。在一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的端到端处理时间为约15小时。
在一些实施例中，治疗方法包括施用有效量的包括至少一种HPV抗原的PBMC，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC的端到端处理时间为约以下中的任一个：4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24小时。
在一些实施例中，根据本文所描述的方法或组合物中的任何一种方法或组合物，当与所述HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC可以刺激至少约300pg/mL IFNγ分泌。在一些实施例中，当与所述HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC可以刺激至少约以下中的任一个：300,500,750,1000,1500,2000,3000,4000,5000,6000,7000或10000pg/mL IFNγ分泌。在一些实施例中，当与所述HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，至少约90％的批次的包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC可以刺激至少约300pg/mL IFNγ分泌。在一些实施例中，当与HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，至少约以下中的任一个可以刺激至少约300pg/mL IFNγ分泌：50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的批次的包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC。在一些实施例中，当与HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，100％的批次的包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC可以刺激至少约300pg/mLIFNγ分泌。
在一些实施例中，治疗方法包括施用有效量的包括至少一种HPV抗原的PBMC，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC，其中当与HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC可以刺激至少约以下中的任一个：300,500,750,1000,1500,2000,3000,4000,5000,6000,7000或10000pg/mL IFNγ分泌。
在一些实施例中，治疗方法包括施用有效量的包括至少一种HPV抗原的PBMC，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过以下制备：a)使包括输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC，其中制备至少两个或更多个批次的经修改的PBMC，其中当与HPV抗原特异性应答者T细胞共培养时，至少约以下中的任一个可以刺激至少约300pg/mL IFNγ分泌：50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的批次的包括至少一种HPV抗原的所述经修饰的PBMC。
包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的另外的修饰
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述PBMC的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的对应的PMBC的组合物相比，所述药剂增强所述PMBC的活力和/或功能。在一些实施例中，PBMC的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的对应的PBMC的组合物相比，所述药剂增强冻融循环后所述PBMC的活力和/或功能。在一些实施例中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施例中，与在任何冻融循环之前不包括所述药剂的对应的PBMC的组合物相比，冷冻保存剂和低温保存剂都不会导致包括所述药剂的PBMC的组合物中不超过10％或20％的细胞死亡。在一些实施例中，当与不含所述冷冻保存剂和所述低温保存剂的对应的PBMC的冻融循环相比时，包括所述冷冻保存剂和/或所述低温保存剂的PBMC组合物的冻融循环导致活细胞的损失减少10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，在至多1、2、3、4、5次冻融循环之后，至少约70％、约80％、约90％或约95％的所述PBMC是活的。在一些实施例中，在至多1、2、3、4、5次冻融循环之后，至少约70％、约80％或约90％的所述PBMC是活的。在一些实施例中，所述药剂是增强胞吞作用的化合物、稳定剂或辅因子。在一些实施例中，所述药剂是白蛋白。在一些实施例中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施例中，所述试剂是小鼠、牛或人白蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些实施例中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、谷氨酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、/>DMSO、CS2、/>CS5、/>CS10、/>CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、/>
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，PBMC的所述组合物包括被进一步修饰以增加共刺激分子中的一种或多种的表达的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL),B7-1(CD80),B7-2(CD86),CD70,LIGHT,HVEM,CD40,4-1BBL,OX40L,TL1A,GITRL,CD30L,TIM4,SLAM,CD48,CD58,CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的mRNA。在一些实施例中，所述共刺激分子是刺激T细胞激活的信号2效应子。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述经修饰的PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-2、IL-12、IL-21或IFNα2中的一种或多种。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC中的至少一个细胞对HLA-A2的表达呈阳性。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节MHC I类表达的另外的修饰。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节HLA-A02MHC I类的表达的另外的修饰。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节HLA-A*11MHCI类的表达的另外的修饰。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节HLA-B*07MHC I类的表达的另外的修饰。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节HLA-C*08MHC I类的表达的另外的修饰。可以导致HLA表达上调的药剂包含但不限于IFNγ、IFNα、IFNβ和辐射。
在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节MHC II类表达的另外的修饰。在一些实施例中，与响应于在同种异体上下文中施用不包括另外的修饰的对应的经修饰的PBMC而在个体中安装的先天免疫应答相比，响应于在同种异体上下文中施用经修饰的PBMC而在个体中安装的先天免疫应答降低。在一些实施例中，与不包括另外的修饰的对应的经修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期增加。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期比不包括另外的修饰的对应的经修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期大约增加10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍中的任一者。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期增加与不包括另外的修饰的对应的经修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期基本上相同。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将PBMC的所述组合物与药剂一起温育的步骤，与没有另外的温育步骤而制备的对应的PBMC相比，所述药剂增强所述PBMC的活力和/或功能。
在一些实施例中，所述组合物包括约0.5×104,1.0×104,0.5×105,1.0×105,0.5×106,1.0×106,0.5×107,1.0×107,0.5×108,1.0×108,0.5×109,1.0×109,0.5×1010,1.0×1010个PBMC/mL中的任一个。在一些实施例中，所述有效量是约0.5×104至约1.0×104、约1.0×105至约0.5×105、约0.5×105至约1.0×105、约1.0×105至约0.5×106、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109或约0.5×109至约1.0×109个PBMC/mL中的任一个。在一些实施例中，所述组合物包括约1×104,1×105,1×106,2×106,3×106,4×106,5×106,6×106,7×106,8×106,9×106,1×107,1×108个PBMC/mL中的任一个。在一些实施例中，所述组合物包括1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL。
在一些实施例中，所述组合物包括约5×104至约5×109个PBMC。在一些实施例中，所述组合物包括约5×106至约5×107个PBMC。在一些实施例中，所述组合物包括约0.5×104,1.0×104,0.5×105,1.0×105,0.5×106,1.0×106,0.5×107,1.0×107,0.5×108,1.0×108,0.5×109,1.0×109和5.0×109个PBMC中的任一个。在一些实施例中，所述组合物包括0.5×104至约1.0×104、约1.0×105至约0.5×105、约0.5×105至约1.0×105、约1.0×105至约0.5×106、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109或约1.0×109至约5×109个PBMC中的任一个。在一些实施例中，所述组合物包括约1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107和1×108个PBMC中的任一个。在一些实施例中，所述组合物包括约2×107个PBMC至约3×107个PBMC。在一些实施例中，所述组合物包括约2.1×107、2.2×107、2.3×107、2.4×107、2.5×107、2.6×107、2.7×107、2.8×107、2.9×107和3.0×107个PBMC中的任一个。在一些实施例中，所述组合物包括约2.75×107个PBMC。在一些实施例中，所述组合物包括约2.5×107个PBMC。
在一些实施例中，所述组合物包括冷冻保存培养基。在一些实施例中，所述组合物包括浓度为约20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％或85％(w/w)中的任一个的冷冻保存培养基。在一些实施例中，所述组合物包括浓度为约20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％或80％至85％(w/w)中的任一个的冷冻保存培养基。
在一些实施例中，所述组合物包括低温保存培养基。在一些实施例中，所述组合物包括百分比为约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％或70％(w/w)中的任一个的低温保存培养基。在一些实施例中，所述组合物包括百分比为约10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％或65％至70％(w/w)中的任一个的低温保存培养基。
在一些实施例中，所述组合物包括百分比为约2％、3％、4％、5％、8％或10％(w/w)中的任一个的人血清白蛋白。在一些实施例中，所述组合物包括百分比为约2％至3％、3％至5％、5％至8％或8％至10％(w/w)中的任一个的人血清白蛋白。在一些实施例中，将人血清白蛋白作为人血清白蛋白调配物添加到所述调配物中。在一些实施例中，所述调配物中的所述人血清白蛋白溶液的百分比为约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(w/w)中的任一个。在一些实施例中，所述调配物中的所述人血清白蛋白溶液的百分比为约10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％或45％至50％(w/w)中的任一个。
在一些实施例中，所述调配物的pH为约5.0至约9.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约6.0至约8.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7.4。在一些实施例中，所述调配物的pH为约5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,9.5或10中的任一个。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9或8.0中的任一个。在一些实施例中，所述调配物的pH为约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9或约9至约10中的任一个。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7至约7.1、约7.1至约7.2、约7.2至约7.3、约7.3至约7.4、约7.4至约7.5、约7.5至约7.6、约7.6至约7.7、约7.7至约7.8、约7.8至约7.9或约7.9至约8.0中的任一个。
在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括CS10。在一些实施例中，包括PBMC的组合物包含/>CS10中的约5×106至约5×107个PBMC。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；c)约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及d)约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH6.0至约pH 8.5。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；c)约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及d)约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约2.75×107个PBMC；b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 7.4。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC/mL；b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 7.4。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约2.75×107个PBMC；b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 7.4。
在一些实施例中，包括PBMC的所述组合物包括：a)约5×106个PBMC/mL；b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，其中所述调配物的pH为约pH 7.4。
用于产生包括HPV抗原的PBMC的组合物的收缩
在一些实施例中，本发明提供了包括用于刺激免疫应答的HPV抗原的PBMC的组合物。在一些实施例中，所述HPV抗原被细胞内递送至所述PBMC。将有效载荷引入到PBMC的方法是本领域已知的。
在一些实施例中，所述HPV抗原通过使所述细胞通过收缩而被引入到所述PBMC中，使得瞬时孔被引入所述细胞膜，由此允许所述HPV抗原进入所述细胞。WO 2013/059343,WO2015/023982,WO 2016/070136,WO2017041050,WO2017008063,WO 2017/192785,WO 2017/192786,WO2019/178005,WO 2019/178006,WO 2020/072833,WO 2020/154696,和WO 2020/176789提供了基于收缩将化合物递送到细胞中的实例。
在一些实施例中，将所述HPV抗原和佐剂递送到所述PBMC中，以通过使包括所述PBMC的细胞悬浮液通过收缩来产生本发明的PBMC，其中所述收缩使所述输入PBMC变形，由此引起所述输入PBMC的扰动，使得HPV抗原和佐剂进入所述扰动的输入PBMC。在一些实施例中，所述收缩包含在微流体通道内。在一些实施例中，可以在微流体通道内并联和/或串联放置多个收缩。
在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩包含入口部分、中心点和出口部分。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩的宽度是所述PBMC细胞的直径的函数。确定PBMC的直径的方法是本领域已知的；例如，高含量成像、细胞计数器或流式细胞术。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入PBMC的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为在PBMC群体中具有最小直径的所述输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。
在基于收缩将HPV抗原递送到PBMC的一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约15μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约10μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm至约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.5μm至约4μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4μm至约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.2μm至约3.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.8μm至约4.3μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm或5.0μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约4.5μm。
可能影响将所述化合物递送到所述PBMC中的参数的实例包含但不限于收缩的尺寸、收缩的进入角度、收缩的表面性质(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，细胞通过所述收缩的时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中的化合物的浓度、细胞悬浮液中的缓冲液以及PBMC在通过收缩之后恢复或温育的时间量可以影响递送的化合物进入PBMC的通道。影响将所述化合物递送到所述PBMC中的另外的参数可以包含输入PBMC在收缩中的速度、收缩中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量以及收缩中的时间。另外，包括串联和/或并联通道的多个芯片可能影响对PBMC的递送。并联的多个芯片可能有助于增强吞吐量。这些参数可以设计成控制化合物的递送。在一些实施例中，细胞浓度的范围为约10至至少约1012个细胞/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约10ng/mL至约1g/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约1pM至至少约2M或其间的任何浓度或浓度范围。
在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度为约0.01μM至约10mM。例如，在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一个。在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度大于约10mM。在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度为约0.01μM至约0.1μM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一个。在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度为约0.1μM至约1mM。在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度为约0.1μM至约10μM。在一些实施例中，与所述PBMC一起温育的HPV抗原的浓度为约1μM。
在一些实施例中，与所述扰动的输入PBMC一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约10000:1至约1:10000中的任一个。例如，在一些实施例中，与所述扰动的输入PBMC一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000中的任一个。在一些实施例中，与所述扰动的输入P一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约10000:1至约1000:1、约1000:1至约100:1、约100:1至约10:1、约10:1至约1:1、约1:1至约1:10、约1:10至约1:100、约1:100至约1:1000、约1:1000至约1:10000中的任一个。在一些实施例中，与所述扰动的输入PBMC一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约200:1。在一些实施例中，与所述扰动的输入PBMC一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约20:1。
在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约1nM至约1mM的佐剂。例如，在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一个的佐剂。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度大于约10mM中的任一个的佐剂。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约1nM至10nM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一个的佐剂。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约0.1μM至约1mM的佐剂。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约1μM的佐剂。
在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约1nM至约1mM的抗原。例如，在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一个的抗原。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度大于约10mM中的任一个的抗原。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约1nM至10nM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一个的抗原。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约0.1μM至约1mM的抗原。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括浓度为约1μM的抗原。
在一些实施例中，所述经修饰的PBMC中的抗原与佐剂的摩尔比为约10000:1至约1:10000中的任一个。例如，在一些实施例中，所述经修饰的PBMC中的抗原与佐剂的摩尔比为约10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000中的任一个。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC中的抗原与佐剂的摩尔比为约10000:1至约1000:1、约1000:1至约100:1、约100:1至约10:1、约10:1至约1:1、约1:1至约1:10、约1:10至约1:100、约1:100至约1:1000、约1:1000至约1:10000中的任一个。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC中的抗原与佐剂的摩尔比为约200:1。在一些实施例中，所述经修饰的PBMC中的抗原与佐剂的摩尔比为约20:1。
PBMC的调节
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，调节包括至少一种HPV抗原的所述PBMC。在另外的实施例中，所述PBMC是成熟的。在一些实施例中，在收缩介导的递送之后调节所述PBMC。在一些实施例中，将包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括所述收缩递送的HPV抗原的所述细胞进行调节，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经调节的细胞的组合物。在一些实施例中，在收缩介导的递送之后调节所述PBMC。在一些实施例中，将包括所述收缩递送的HPV抗原的所述PBMC与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括收缩递送的突变的HPV抗原的所述PBMC进行调节，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经调节的PBMC的组合物。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN 2006(也被称为CpG 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:31))。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
在一些方面，本文提供了一种包括至少一种HPV抗原的经调节的PBMC的组合物，所述组合物通过包括以下步骤的过程制备：a)使包括输入PBMC群体的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的宽度是所述悬浮液中的所述输入PBMC的函数，由此使得所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；b)将所述扰动的输入PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的PBMC；由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经修饰的PBMC；以及c)将包括所述收缩递送的HPV抗原的所述经修饰的PBMC与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括所述收缩递送的HPV抗原的所述经修饰的PBMC进行调节，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的经调节的PBMC的组合物。在一些实施例中，所述过程进一步包括在与所述佐剂一起温育以调节所述经修饰的PBMC之前，从所述细胞悬浮液中分离包括所述HPV抗原的所述经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
在一些实施例中，在收缩介导的递送之前调节所述PBMC。在一些实施例中，将所述PBMC与佐剂一起温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节，由此调节所述PBMC。在一些实施例中，本文提供了一种包括至少一种HPV抗原的经调节的PBMC的组合物，所述组合物通过包括以下步骤的过程制备：a)将PBMC与佐剂一起温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节，由此产生经调节的PBMC；b)使包括所述经调节的PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的宽度是所述悬浮液中的所述PBMC的直径的函数，由此使得所述PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成经调节的扰动的PBMC；以及c)将所述经调节的扰动的PBMC与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述经调节的扰动的PBMC，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述经调节的PBMC。在一些实施例中，所述过程进一步包括在使所述经调节的PBMC通过细胞变形收缩之前，将所述经调节的PBMC与所述佐剂分离。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，将包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂在约以下中的任一个的温度下一起温育：4℃、8℃、12℃、16℃、20℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂在约37℃下一起温育。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂在约37℃下一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与CpG 7909一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述CpG 7909在约37℃下一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与浓度为约0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL、0.45mg/mL或0.50mg/mL中的任一个或其间任何浓度的CpG 7909一起温育。在一些实施例中，将所述PBMC与浓度约为0.35mg/mL的CpG 7909一起温育。在一些实施例中，将所述PBMC与浓度为约0.35mg/mL的CpG 7909并在约37℃下一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。
在一些实施例中，本文提供了包括至少一种HPV抗原的经调节的多个PBMC，其通过将包括所述至少一种HPV抗原的所述多个PBMC与佐剂一起温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节来制备，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述经调节的多个PBMC。在一些实施例中，本文提供了包括至少一种HPV抗原的经调节的多个PBMC，其通过在将所述至少一种HPV抗原引入所述PBMC之前将所述多个PBMC与佐剂一起温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节来制备，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述经调节的多个PBMC。
在根据本文所描述的所述经调节的多个PBMC中的任一个的一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述PBMC与所述佐剂在约以下中的任一个的温度下一起温育：4,8,12,16,20,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40℃。在一些实施例中，将所述PBMC与佐剂在约37℃下一起温育。在一些实施例中，包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括将所述PBMC与佐剂在约37℃下一起温育约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以使所述PBMC进行调节的方法进行调节。
在根据本文所描述的经调节的多个PBMC中的任一个的一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个经修饰的PBMC中上调。在一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群体相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群体中上调。在一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个经修饰的PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD86。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86比未经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86上调超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86比未经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86上调约1.2倍至约1.5倍、约1.5倍至约1.8倍、约1.8倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约8倍、约8倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约50倍、约50倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约500倍或大于约500倍中的任一者。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达在所述经调节的多个经修饰的PBMC中增加。在一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群体相比，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达在所述经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群中增加。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达增加约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达增加约1.2倍至约1.5倍、约1.5倍至约1.8倍、约1.8倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约8倍、约8倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约50倍、约50倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约500倍或大于约500倍中的任一者。
系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了一种系统，所述系统包括用于本文所公开的方法的收缩、PBMC细胞悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种。所述系统可以包含针对上文所公开的方法描述的任何实施例，包含微流体通道或具有孔的表面，以提供细胞变形收缩、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在一些实施例中，细胞变形收缩的大小适于递送至PBMC。在一些实施例中，优化递送参数，如操作流速、细胞和化合物浓度、收缩中的细胞的速度和细胞悬浮液的组成(例如，渗透压、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)用于压制免疫应答或诱导耐受性的化合物的最大应答。
还提供了用于治疗患有与HPV相关的癌症的个体的试剂盒或制品。在一些实施例中，所述试剂盒包括PBMC，所述PBMC包括细胞内HPV抗原和细胞内佐剂。在一些实施例中，所述试剂盒包括收缩、PBMC悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种，用于产生PBMC，所述PBMC用于治疗患有如癌症等与HPV相关的疾病的个体。在一些实施例中，所述试剂盒包括在合适包装中的本文所描述的组合物(例如含有孔、细胞悬浮液和/或化合物的微流体通道或表面)。合适包装材料在本领域中是已知的，并且包含例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。可以进一步灭菌和/或密封这些制品。
本发明还提供了包括本文所描述的方法的组分的试剂盒并且可以进一步包括用于实施治疗患有与HPV相关的癌症的个体的所述方法的说明书和/或用于将至少一种HPV抗原引入到PBMC中的说明书。本文所描述的试剂盒可以进一步包含其它材料，包含其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有本文所描述的任何方法的执行说明的包装插页；例如，用于治疗患有与HPV相关的癌症的个体的说明书或用于产生PBMC以含有细胞内至少一种HPV抗原的说明书。
示例性实施例
实施例1.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括：
向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及
向所述个体施用有效量的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中所述CTLA4的拮抗剂是与CTLA4结合的抗体。
实施例3.根据实施例1或2所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1的拮抗剂是与PD-1结合的抗体或与PD-L1结合的抗体。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体和与PD-1结合的抗体。
实施例5.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体并且向所述个体施用与PD-L1结合的抗体。
实施例6.根据实施例2至5中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。
实施例7.根据实施例3、4和6中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。
实施例8.根据实施例3、4和6中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗。
实施例9.根据实施例3、4和6中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。
实施例10.一种用于治疗个体的HPV+复发性、局部晚期或转移性肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
实施例11.根据实施例10所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物与一种或多种免疫检查点抑制剂联合施用。
实施例12.根据实施例11所述的方法，其中所述检查点抑制剂是所述个体的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。
实施例13.根据实施例11或12所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂是与PD-L1、CTLA-4或PD-1结合的抗体。
实施例14.根据实施例11至13中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物与和CTLA-4结合的抗体以及和PD 1结合的抗体联合施用。
实施例15.根据实施例13所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。
实施例16.根据实施例13至15中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。
实施例17.根据实施例13、14和16中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。
实施例18.根据实施例13、14和16中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗。
实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。
实施例20.根据实施例19所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。
实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。
实施例22.根据实施例21所述的方法，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。
实施例23.根据实施例1至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。
实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列的抗原和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。
实施例25.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的方法，其中所述个体对HLA-A*02呈阳性。
实施例27.根据实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述PBMC对HLA-A*02呈阳性。
实施例28.根据实施例1至27中任一项所述的方法，其中所述PBMC对于所述个体是自体的。
实施例29.根据实施例1至28中任一项所述的方法，其中所述个体对人免疫缺陷病毒(HIV)呈阳性。
实施例30.根据实施例1至29中任一项所述的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌、宫颈癌、肛门癌或食道癌。
实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物静脉内地施用。
实施例32.根据实施例1至9和12至31中任一项所述的方法，其中所述CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂静脉内地、口服地或皮下地施用。
实施例33.根据实施例2至9和13至32中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体静脉内地施用。
实施例34.根据实施例1至33中任一项所述的方法，其中包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的所述有效量为约0.5×106个细胞/kg至约5.0×106个细胞/kg。
实施例35.根据实施例6至9和16至34中任一项所述的方法，其中伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。
实施例36.根据实施例7和17至35中任一项所述的方法，其中纳武单抗的有效量为约360mg。
实施例37.根据实施例9、15、16和19至36中任一项所述的方法，其中阿特朱单抗的有效量为约1200mg。
实施例38.根据实施例1至37中任一项所述的方法，其中包括所述PBMC的所述组合物在三周周期的第1天递送。
实施例39.根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中包括所述PBMC的所述组合物进一步在第一三周周期的第2天施用。
实施例40.根据实施例38或39所述的方法，其中约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg、约5.0×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。
实施例41.根据实施例39或40所述的方法，其中约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在所述第一三周周期的第2天施用。
实施例42.根据实施例2至9和13至41中任一项所述的方法，其中所述与CTLA 4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体每三周周期施用一次。
实施例43.根据实施例38至42中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体在每个三周周期的第1天施用。
实施例44.根据实施例38至42中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体每两个三周周期施用一次。
实施例45.根据实施例38至44中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。
实施例46.根据实施例42至45中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
实施例47.根据实施例46所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗，其中所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。
实施例48.根据实施例38至42中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约1mg/kg的剂量在两个三周周期的所述第一三周周期的第1天施用，并且所述与PD-1结合的抗体以约360mg的剂量在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
实施例49.根据实施例38至45中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
实施例50.根据实施例48所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗，其中所述阿特朱单抗以约1200mg的剂量施用。
实施例51.根据实施例1至49中任一项所述的方法，其中向所述个体施用包括PBMC的所述组合物至少约三个月、六个月、九个月或一年。
实施例52.根据实施例1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；
b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
实施例53.根据实施例1至52中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约2.75×107个PBMC；
b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
实施例54.根据实施例1至53中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；
b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
实施例55.根据实施例1至54中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC/mL；
b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
实施例56.根据实施例1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；
b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
实施例57.根据实施例1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；
b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
实施例58.根据实施例1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约2.5×107个PBMC；
b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
实施例59.根据实施例1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC/mL；
b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
实施例60.根据实施例52至59中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存培养基是CS10。
实施例61.根据实施例52至55中任一项所述的方法，其中所述低温保存培养基是FRS。
实施例62.根据实施例1至61中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的两种或更多种。
实施例63.根据实施例1至62中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。
实施例64.根据实施例1至63中任一项所述的方法，其中
(a)约25％至约80％的所述PBMC是T细胞；
(b)约1.5％至约30％的所述PBMC是B细胞；
(c)约3.0％至约20％的所述PBMC是NK细胞；或者
(d)约4.0％至约45％的所述PBMC是单核细胞。
实施例65.根据实施例1至64中任一项所述的方法，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入PBMC群体的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及
b)将扰动的输入PBMC群体与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入PBMC，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC。
实施例66.根据实施例65所述的方法，其中所述收缩的所述直径为约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。
实施例67.根据实施例1至66中任一项所述的方法，其中对包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC进行调节。
实施例68.根据实施例67所述的方法，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括将所述PBMC与佐剂在约37℃下一起温育约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以使所述PBMC进行调节的方法进行调节。
实施例69.根据实施例68所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。
实施例70.根据实施例68或69所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
实例
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内若干个实施例是可能的。将参考以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实例进一步说明了本发明，但是当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
实例1.SQZ-PBMC-HPV的安全性和耐受性的I期研究
在患有复发性、局部晚期或转移性HPV16+实体瘤的HLA A*02+患者中，对SQZ-PBMC-HPV作为单一疗法以及与(1)阿特朱单抗、(2)伊匹单抗、(3)纳武单抗和(4)纳武单抗加伊匹单抗组合使用的安全性和耐受性、抗肿瘤活性以及免疫原性和药效学效果进行1期开放标记多中心研究。
SQZ PBMC HPV是呈递外周血单核细胞(PBMC)产物的抗原，用于治疗HLA-A血清型组阳性(HLA-A*02+)患者中的人白细胞抗原(HLA)血清型的人乳头瘤病毒(HPV)菌株16阳性(HPV16+)癌症。SQZ PBMC HPV由呈递HPV16的E6和E7蛋白的免疫原性表位的自体PBMC组成。PBMC主要由T细胞、单核细胞、天然杀伤细胞和B细胞组成。PBMC-HPV药物物质被调配成含有冷冻培养基的SQZ PBMC HPV，并且然后冷冻保存。SQZ PBMC HPV在冷冻保存下储存并且在使用时解冻。
SQZ-PBMC-HPV药物物质由具有合成长肽(SLP)的自体PBMC组成，所述合成长肽含有在制造过程期间通过细胞质递送的HPV16的HLA-A*02限制性E6和E7表位。
E6 SLP：QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL(SEQ ID NO:19)
E7 SLP：QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL(SEQ ID NO:23)
然后用CpG 7909，CpG寡脱氧核苷酸使PBMC-HPV细胞成熟。在制造过程期间的PBMCHPV的这种成熟促进了在适当的情况下用抗原刺激内源性T细胞。
概述
研究群体由患有晚期HPV16+实体瘤(头颈、宫颈癌和其它肿瘤类型)的HLA-A*02+患者组成。在患者的白细胞去除术之前，必须通过实验室报告确认HLA A*02+状态和HPV16+肿瘤状态，并且必须符合所有资格标准。如果主办方认为实验室认证文件不充分，则具有当地确认的HPV16+状态的患者可以从筛选时收集的新鲜肿瘤活检中完成中心确认。
符合资格的患者在研究中心进行单次白细胞去除术。将白细胞去除术产物送至制造商，用于制造每个患者的个性化自体细胞疗法。然后将冷冻小瓶的SQZ PBMC HPV送至研究中心用于施用。
该研究分三部分进行，其中部分1由剂量递增组成，以确定SQZ-PBMC-HPV单一疗法的安全性特性和RP2D。研究的部分2将评估SQZ-PBMC-HPV在与免疫检查点抑制剂组合时的安全性和初步功效。部分3将在四个剂量扩展队列中评估SQZ-PBMC-HPV单一疗法RP2D。将至多29名患者纳入到每个第3部分队列中。
将使用最佳Simon 2阶段设计对四个剂量扩展队列进行评估。在第一阶段，纳入至多10名HIV阴性患者。如果在这10名患者中观察到至少一个应答，则纳入另外的19名患者，总共29名。
在所有队列中，以3周间隔施用SQZ PBMC-HPV，最多1年或者直到SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止或者直到满足治疗停用标准为止，以先发生者为准。
在每次施用SQZ PBMC HPV之后，观察部分1和部分2中的所有患者至少4小时。另外，每个队列中的前2名患者将在SQZ PBMC-HPV的首次施用之后经历至少23小时的观察。
根据RECIST 1.1和iRECIST在整个研究过程中进行肿瘤评估，直到疾病进展、不可接受的毒性、撤回同意书、死亡或从首次施用SQZ PBMC HPV的日期起2年，以先发生者为准。根据RECIST 1.1，经历疾病进展的患者可以继续给药，如果治疗研究者认为符合其最佳利益，以允许确认疾病进展；即，根据iRECIST的iCPD(Seymour等人,2017)。
在研究产物的最后剂量之后，将进行随访，以监测安全性和耐受性并评估总生存期。
部分1：递增阶段(SQZ-PBMC-HPV单一疗法)
递增阶段的计划剂量队列如表1所示。虽然传统的3+3设计旨在评估安全性和耐受性，但是在队列中治疗至多6名另外的患者可能是谨慎的，以进一步研究安全性和耐受性、免疫原性效应和抗肿瘤活性。在这个修改的3+3设计中，每个队列将最多有12名患者。
对于单一疗法RP2D方案，完成所有队列中的DLT评估。基于对所有可用的安全性、耐受性、免疫原性以及其它药效学和抗肿瘤数据的审查来选择RP2D方案。
一旦确定了RP2D方案，就启动部分2(组合安全性阶段)和部分3(单一疗法剂量扩展阶段)。
表1递增阶段期间的计划的单一疗法队列的总结
DLT＝剂量限制性毒性；iRECIST＝免疫治疗的实体瘤研究中纳入修改的RECIST标准；RECIST＝实体瘤缓解评估标准1.1版
a.使用SQZ-PBMC-HPV的给药将每3周持续一次，直到满足治疗停用标准为止，或者直到SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准。根据RECIST 1.1，经历疾病进展的患者可以继续给药，如果治疗研究者认为符合其最佳利益，以允许确认疾病进展；即，根据iRECIST的iCPD(Seymour等人2017)。
b.在周期1中，患者将在第1天和第2天接受SQZ-PBMC-HPV。
根据RECIST 1.1或iRECIST，在整个研究中进行肿瘤评估，直到疾病进展为止。在研究药物的最后剂量之后，将进行随访，以监测安全性和耐受性、免疫原性效应并且用于肿瘤评估。
以修改的3+3剂量递增设计对患者进行评估。至少2个剂量水平(0.5×106个活细胞/kg和2.5×106个活细胞/kg)的SQZ PBMC HPV作为单一疗法进行评估(队列1、2和3)。队列1和2中的患者在每个21天周期(单一引发)的第1天接受SQZ-PBMC-HPV；队列3中的患者在周期1(双引发)的第1天和第2天以及每个后续周期的第1天接受SQZ-PBMC-HPV(参见图1)。在每个队列中，前2名患者必须完成周期1第8天，之后才能在该队列中治疗队列中的另外的患者。
患者必须具有足够的自体药物产物，以实现至少3次完整的SQZ-PBMC-HPV剂量施用，以在队列中给药或将分配到较低剂量队列中。
虽然传统的3+3设计旨在评估安全性和耐受性，但是在队列中治疗至多6名另外的患者可能是谨慎的，以进一步研究安全性和耐受性、免疫原性效应和抗肿瘤活性。在这个修改的3+3设计中，每个队列最多有12名患者。
基于对所有可用的安全性、耐受性、免疫原性以及其它药效学和抗肿瘤数据的审查来选择RP2D方案。对于单一疗法RP2D方案，完成所有队列中的DLT评估。
在所有研究中心，患者以交错方式纳入，这意味着队列中不超过1名患者在1周内接受了SQZ PBMC-HPV的首次施用。
在单一疗法队列中，在第一剂量的SQZ PBMC-HPV之后的28天内监测患者的DLT的发生。根据修改的3+3规则，确认队列在DLT方面安全所需的最少患者数量为3名患者中的0个DLT、6名患者中的≤1个DLT、9名患者中的≤2个DLT或12名患者中的≤3个DLT。
剂量方案如下所列，但是基于对可用安全性数据的审查，如有必要，可以选择中间剂量水平：
5×106个活细胞/kg(单一引发)
5×106个活细胞/kg(双引发)
较低剂量水平(单一或双引发)
在给定剂量水平的前3名患者完成DLT观察期之后，考虑将剂量递增或扩展到6至12名患者，并且在审查安全性数据后发现可评估安全性。部分1的DLT观察期被定义为28天。
如果在整个DLT观察期内，在给定剂量水平的前3名纳入的患者中的任何患者中没有观察到DLT，则下一个更高剂量水平队列开始纳入。如果前3名患者中有1名出现DLT，则纳入3名另外的患者(在相同剂量水平下共有6名可评估患者)。如果前3名患者中有>1名或6名患者中有≥2名出现DLT，则将不会考虑另外的剂量递增并且这是最大施用剂量(MAD)。RP2D可以是先前评估的较低剂量水平或者可以选择替代的中间剂量水平用于进一步评估。基于至少6名患者的安全性数据进行RP2D确定。在研究的部分2(组合安全性阶段)和部分3(单一疗法剂量扩展阶段)中进一步评估RP2D。可替代地，基于药效学评估宣布RP2D，其中确定已实现最大生物学效应，并且患者不会受益于另外的剂量递增。
如果患者由于除安全性之外的任何原因无法完成DLT观察期或者如果药效学评估不足以确定研究治疗的生物学效应，则认为患者不可评估。在研究者与主办方之间的协商之后，部分1中被视为不可评估的患者可能会被替换。
在任何施用剂量之后发生的不良事件在后续施用时应已解决至<2级。类似地，在任何施用剂量之后发生的AESI在后续施用时应已解决至<2级。在队列3中，如果满足这些再治疗标准，则应在≥23小时观察期(即，第一剂量后16至24小时)期间进行第二次SQZ PBMC-HPV施用。将在第二引发施用之后观察患者至少4小时。2次施用之间的最小间隔应为16小时。
部分2：组合安全性阶段(SQZ-PBMC-HPV+检查点抑制剂)
一旦定义SQZ-PBMC-HPV单一疗法RP2D，就启动组合安全性阶段。基于对所有可用的安全性、耐受性、免疫原性以及其它药效学和抗肿瘤数据的审查来选择在组合安全性探索期间评估的SQZ-PBMC-HPV剂量。
队列由SQZ PBMC HPV RP2D和组合配偶体定义。SQZ-PBMC-HPV在队列4、5、6和7中的RP2D中施用。
队列4：SQZ-PBMC-HPV(RP2D)加阿特朱单抗(每3周1200mg)
队列5：SQZ-PBMC-HPV(RP2D)加伊匹单抗(每3周3mg/kg，如果耐受性允许的话，最多4个剂量)
队列6：SQZ-PBMC-HPV(RP2D)加纳武单抗(每3周360mg)
队列7(取决于对队列5和6中各自治疗的6名患者的安全性评估)：SQZ-PBMC-HPV(RP2D)加纳武单抗(每3周360mg)和伊匹单抗(每6周1mg/kg)
部分2中的纳入开始于队列4、5和6。一旦队列5和6中各自6名患者纳入并成功完成42天DLT评估期；即，<33％的患者出现DLT，则队列7开放用于纳入。基于来自两个队列的可用安全性数据，决定选择队列5和6的SQZ-PBMC-HPV剂量方案是选择队列7还是以较低剂量方案开始。如果决定队列7的较低剂量的SQZ-PBMC-HPV，则最初纳入6名患者并观察42天。如果SSC认为组合是安全的，其中<33％的患者出现DLT，则SQZ-PBMC-HPV的剂量可能会递增到完全单一疗法RP2D并且纳入可能会继续，直到纳入到至多12名患者为止。
评估所有患者的安全性和耐受性以及抗肿瘤应答的初步证据。
队列4-SQZ-PBMC-HPV加阿特朱单抗
在周期1中，根据部分1中确定的RP2D，对SQZ-PBMC-HPV进行IV施用；即在第1天和第2天作为双引发，或者在第1天作为单一引发。在周期1的第8天，在60分钟内IV施用阿特朱单抗1200mg。在后续周期中，在每个3周周期的第1天施用阿特朱单抗，然后施用SQZ PBMCHPV并且持续最多2年或直到满足治疗停用标准中的1个为止(图2)。以3周周期施用SQZPBMC HPV，直到满足治疗停用标准，或者SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准。
队列5-SQZ-PBMC-HPV加伊匹单抗
在周期1中，根据部分1中确定的RP2D，对SQZ-PBMC-HPV进行IV施用；即在第1天和第2天作为双引发，或者在第1天作为单一引发。在第1天施用SQZ PBMC HPV之前，在90分钟内IV施用3mg/kg伊匹单抗。在周期2、3和4中，在施用SQZ-PBMC-HPV之后第1天给予伊匹单抗。伊匹单抗最多施用4个周期。以3周周期给予SQZ-PBMC-HPV，直到满足停用标准为止或者直到SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止，或者至多1年，以先发生者为准(图3)。
队列6-SQZ-PBMC-HPV加纳武单抗
在周期1中，根据部分1中确定的RP2D，对SQZ-PBMC-HPV进行IV施用；即在第1天和第2天作为双引发，或者在第1天作为单一引发。在周期1第8天时，以360mg IV的剂量在30分钟内施用纳武单抗。在后续周期中，在每3周的第1天施用SQZ-PBMC-HPV，然后施用纳武单抗。纳武单抗可以每3周给予一次，至多2年或者直到满足停用标准为止。以3周周期施用SQZ-PBMC-HPV，直到满足停用标准或者SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准(图4)。
队列7-SQZ-PBMC-HPV加纳武单抗加伊匹单抗
在周期1中，根据部分1中确定的RP2D，对SQZ-PBMC-HPV进行IV施用；即在第1天和第2天作为双引发，或者在第1天作为单一引发。在施用SQZ-PBMC-HPV之前，在第1天30分钟内以1mg/kg的剂量IV施用伊匹单抗。在周期1第8天将在30分钟内施用纳武单抗360mg IV。在施用SQZ-PBMC-HPV之后，在第1天在后续3周周期内施用纳武单抗。在后续周期中施用SQZ-PBMC-HPV和纳武单抗之后，每6周施用一次伊匹单抗。纳武单抗和伊匹单抗可以从周期1第1天开始给予2年，直到满足治疗停用的标准中的1个为止。将以3周周期施用SQZ-PBMC-HPV，直到满足停用标准或者SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准。
如果由于免疫介导的AE，患者满足检查点抑制剂的停用标准，并且研究者无法确定事件是否与纳武单抗或伊匹单抗相关，则患者应停用这两种药物，并且可以继续使用SQZ-PBMC-HPV。
队列7-SQZ-PBMC-HPV加纳武单抗加伊匹单抗
在周期1中，根据部分1中确定的RP2D，对SQZ-PBMC-HPV进行IV施用；即在第1天和第2天作为双引发，或者在第1天作为单一引发。在施用SQZ-PBMC-HPV之前，在第1天30分钟内以1mg/kg的剂量IV施用伊匹单抗。在周期1第8天在30分钟内施用纳武单抗360mg IV。在施用SQZ-PBMC-HPV之后，在第1天在后续3周周期内施用纳武单抗。在后续周期中施用SQZ-PBMC-HPV和纳武单抗之后，每6周施用一次伊匹单抗。纳武单抗和伊匹单抗可以从周期1第1天开始给予2年，直到满足治疗停用的标准中的1个为止。以3周周期施用SQZ-PBMC-HPV，直到满足停用标准或者SQZ-PBMC-HPV供应耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准。
如果由于免疫介导的AE，患者满足检查点抑制剂的停用标准，并且研究者无法确定事件是否与纳武单抗或伊匹单抗相关，则患者应停用这两种药物，并且可以继续使用SQZ-PBMC-HPV。
对于部分2中的所有队列，在≥23小时观察期间进行周期1第2天的第二次SQZ-PBMC-HPV施用。在任何施用剂量之后发生的不良事件在后续施用时解决至≤2级。类似地，在任何施用剂量之后发生的AESI在后续施用时解决至<2级。如果满足这些再治疗标准，则在≥23小时观察期(即，第一剂量后16至24小时)期间进行第二次SQZ PBMC HPV施用。在第二引发施用之后观察患者至少4小时。2次施用之间的最小间隔为16小时。在每个队列中，前2名患者必须完成周期1第14天，之后才能治疗队列中的另外的患者。
在组合疗法队列中，在第一剂量的SQZ PBMC-HPV之后的42天内监测患者的DLT的发生。
在个体患者出现DLT或其它显著毒性的情况下，递减至较低SQZ PBMC-HPV剂量发生。在审查来自个体组合安全性队列中的患者的可用安全性、功效和药效学数据之后，可以确定1个或多个剂量组合不建议进行双引发。在这种情况下，可能建议停用第二(周期1第2天)SQZ-PBMC-HPV剂量。可替代地，可以探索SQZ-PBMC-HPV的较低剂量水平(剂量递减)。例如，如果在个体组合安全性队列中观察到>33％的患者出现DLT，则开放并探索评估较低SQZ-PTMC-HPV水平的队列。
部分3：单一疗法剂量扩展
一旦确定了SQZ PBMC HPV单一疗法的RP2D方案，就启动单一疗法剂量扩展阶段。患者被纳入到疾病特异性队列中，以进一步评估安全性和耐受性以及抗肿瘤应答的初步证据。SQZ PBMC HPV以RP2D施用，用于单一疗法。部分3的纳入可以与部分2并行进行。
队列8：局部晚期或转移性HPV16+头颈癌。
队列9：局部晚期或转移性HPV16+宫颈癌。
队列10：局部晚期或转移性HPV16+肛门癌。
队列11：局部晚期或转移性其它HPV16+癌症。
队列8、9、10和11并行纳入。使用最佳Simon 2阶段设计纳入4个剂量扩展队列中的每一个。在第一阶段，纳入至多10名患者。如果在这10名HIV阴性患者中观察到至少一个应答，则纳入另外的19名患者，总共29名。
给药方案和研究持续时间
所有患者在治疗开始之前进行单次白细胞去除术。患者在研究中心进行白细胞去除术；通常在SQZ PBMC HPV的初始施用之前8至14天。SQZ PBMC HPV的首次施用的时间表考虑了中心位置和运输物流。
周期被定义为21天的治疗期。
患者以3周间隔接受SQZ PBMC HPV至多1年，直到研究产物耗尽为止，或者直到满足治疗停用标准为止，以先发生者为准。
累积的临床证据表明，用免疫系统刺激剂治疗的一些受试者可以在证实临床客观应答和/或稳定疾病之前(通过常规应答标准)揭示疾病进展的迹象。已经提出了两种假设来解释这种现象。首先，肿瘤内增强的炎症可能会导致肿瘤大小的增加，这将表现为增大的指数病变和新可见的小的非指数病变。随着时间的推移，肿块的恶性和炎症部分然后可能会减少，导致临床改善的明显迹象(Wolchok等人,2009)。可替代地，在一些个体中，肿瘤生长的动力学可以最初超过抗肿瘤免疫活性。如果有足够的时间，抗肿瘤活性将占主导地位并且在临床上变得明显。因此，在每个时间点并行地评估RECIST 1.1和iRECIST是重要的。
在初始RECIST 1.1定义的进展之后，患者可以继续研究治疗，并且因此如果满足以下标准，可以根据iRECIST(Seymour等人,2017)确认疾病进展：
1.研究者评估的临床益处，并且缺乏快速疾病进展
2.研究者定义的研究药物的耐受性
3.稳定的性能状态
4.进展后的治疗将不会延迟即将进行的干预以防止快速进展疾病的严重后果。
5.缺乏疾病进展的并发症(例如，CNS转移)
临床获益的评估考虑了受试者是否临床恶化并且不太可能从继续治疗中获得进一步的益处。
单一疗法剂量扩展阶段(部分3)的治疗的持续时间取决于所选的RP2D方案。
以3周间隔施用SQZ PBMC-HPV，直到满足治疗停用标准为止，或者直到研究产物耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准。队列4、6和7中的免疫检查点抑制剂的治疗可以从周期1第1天开始持续2年。队列5中的患者可以在耗尽其SQZ-PBMC-HPV供应之前完成4个周期的伊匹单抗；在这种情况下，患者可以继续接受单一药剂SQZ PBMC-HPV，直到满足治疗停用标准为止或者直到研究产物耗尽为止，或者最多1年，以先发生者为准。
剂量限制性毒性
如果他或她1)在DLT评估期期间经历DLT，无论接受的细胞剂量如何，或2)在DLT评估期期间接受至少70％的预期剂量的SQZ-PBMC-HPV之后，在DLT评估期期间没有经历DLT，则患者被视为可以进行DLT评估。在DLT评估期期间，尚未经历DLT但接受少于70％的预期SQZ-PBMC-HPV剂量的患者被视为不可评估DLT并且被替换。
经历非IRR的DLT的患者退出研究。如果继续使用研究产物进行治疗符合患者的最佳利益，则后续治疗将由研究者与主办方协商确定。对于IRRs，调整术前用药或施用速率以使患者能够继续参加研究。
DLT被定义为AE或异常实验室值，由主要研究者评估并由SSC确认为与疾病、疾病进展、并发疾病、伴随用药/程序或环境因素无关，但与SQZ-PBMC-HPV(单独或联合)相关，在单一疗法的前28天治疗或组合疗法的前42天治疗内发生，并满足以下使用美国国家癌症研究所(NCI)不良事件通用术语标准(CTCAE)版本5.0列出的任何预定义标准。CRS和神经毒性的分级将使用美国移植和细胞治疗学会(ASTCT)共识分级，分别参见第6.2.2节和第6.2.3节。
非血液学毒性
4级或5级。
3级毒性在7天内未缓解至≤1级或基线，尽管进行了最佳支持护理，除了3级CRS或神经毒性在24小时内未缓解至≤2级之外。
持续>7天并且需要医疗干预的3级实验室值。
>3级肝毒性持续>48小时，但以下情况除外：对于基线时具有2级天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或碱性磷酸酶异常的患者，仅升高到>8×ULN持续>48小时才会被视为DLT。
肝测试异常符合海氏法则标准(Hy's law criteria)。
血液学毒性
任何5级毒性。
任何4级贫血。
任何≥3级发热性中性粒细胞减少症。
≥4级中性粒细胞减少症(绝对中性粒细胞计数<500/μL)持续>7天。
≥4级血小板减少症(<25,000/μL)。
≥3级血小板减少症(<50,000/μL)持续>7天，伴有临床上显著的出血。
至少可能与SQZ-PBMC-HPV(单独或组合)相关的导致计划的SQZ PBMC HPV施用的周期2第1天的永久停用或延迟>14天的TEAE。
在研究者和主办方判断中被视为DLT的任何其它事件。
以下事件不被视为DLT：
不伴有≥3级淀粉酶值或胰腺炎的临床症状或射线照相证据的分离的3级脂肪酶值。
在有或没有对症治疗的情况下，在24小时内改善至≤2级的3级CRS。
在有或没有适当的支持护理的情况下，在7天内缓解至≤2级的3级皮疹。
细胞产物施用后2小时内发生的在24小时内可逆转至<2级的即刻超敏反应。
在没有临床后遗症的情况下，在72小时内纠正的1级或2级电解质异常。
脱发。
可以通过调节术前用药或调整施用速率来充分管理的3级IRR将不被视为DLT，除非这些变化被视为适用于纳入研究的所有后续患者。如果修改适用于所有后续患者，则队列将重新开始进行DLT评估。经历3级输注反应的患者可以继续参加研究，同时修改其术前用药或输注速率。
如果任何队列中未达到MTD，则测试另外的细胞剂量水平或方案。在由DLT的定义涵盖但与SQZ-PBMC-HPV无关的AE的情况下，发现将由SSC进行讨论。
队列的停止标准以及停止剂量递增或进展到队列和终止研究
修改的3+3规则定义了宣布队列安全的最终决定。确认队列安全所需的最少患者数量为具有0个DLT的3名患者，其可以增加到至多12名患者，以确认队列安全(即，具有DLT的<33％的患者；例如，具有<2个DLT的6名患者，具有<3个DLT的9名患者，或具有<4个DLT的12名患者，以确认队列的安全性者为准)。如果所有队列均未表明已达到MTD，则可以测试另外的细胞剂量水平或方案。在由DLT的定义涵盖但与SQZ-PBMC-HPV无关的AE的情况下。
满足DLT的定义并且在DLT窗口之外发生的AE将不被计为DLT，而是将在给定队列的总体安全性评估和RP2D方案的选择中考虑。
队列停止规则是在同一剂量队列中，接受研究产物的至多12名患者(约33％)出现>3个DLT。如果触发停止规则，则做出以下建议之一：
将先前耐受剂量水平宣布为MTD。
在没有观察到DLT的情况下宣布剂量水平MAD水平。因此，RP2D不是MTD。
建议测试中间剂量水平。
建议方案修订，以增加患者安全性。
停止纳入和/或研究。
基于以下一般安全标准，出于患者安全性考虑，可以停止患者的给药：
被视为潜在危及生命并且由医学监查员评估为与研究产物相关的任何SAE。
向研究者或主办方表明存在重大耐受性问题的任何其它临床上显著的变化。
研究群体
患有晚期HPV16+实体瘤(头颈、宫颈癌和其它肿瘤类型)的HLA-A*02+患者。另外地，允许HIV阳性纳入组合安全性阶段。在递增阶段，应该与主办方讨论HIV+患者的纳入。
患者可能已经接受过PD-1、PD-L1或CTLA-4抑制剂(包含伊匹单抗或特异性靶向T细胞共刺激或检查点通路的任何其它抗体或药物)的先前疗法。
患者数量
患者数量取决于安全性和观察到的免疫原性效应。在单一疗法递增阶段，预期可以纳入大约9至36名DLT可评估的患者。如果所有计划的队列均未表明已达到MTD，则可以测试另外的细胞剂量水平或方案。至多总共48名可评估患者纳入组合安全性阶段(每个队列n＝12)。如果所有队列开放并且预定义的成功标准允许开放每个队列的第二阶段，则至多总共116名患者纳入扩展阶段(每个队列至多n＝29)。根据替换队列内的患者的需要，预计大约173至200名可评估患者将在研究中接受治疗。如果所有计划的队列均未表明已达到MTD，则可以测试另外的细胞剂量水平或方案。
纳入标准
1.HLA-A*02+的≥18岁的男性或女性患者，如通过来自血液的基因分型测定所确认的。
2.组织学确认为HPV16+的不可治愈或转移性实体瘤(包含但不限于宫颈肿瘤和头颈肿瘤)。
3.对于不适合用手术、放射和/或化学放射疗法进行治愈性治疗的宫颈癌，癌症必须在用基于铂的方案在辅助或复发性环境中进行先前全身化学疗法治疗之后进展。患者在接受最近的先前治疗时或在完成最近的先前治疗之后必须患有进行性疾病。
对于因复发性疾病不耐受或拒绝基于铂的全身化学疗法治疗的患者，必须记录原因。
4.对于不适合用手术、放射和/或化学放射疗法进行治愈性治疗的复发性和转移性头颈癌，癌症必须在初级、辅助或复发性环境中的至少1个先前基于铂的化学疗法之后进展，并且提供检查点免疫疗法。如果在复发时铂再激发被认为是无益的，则在含铂的确定性化学放射之后或在辅助化学放射之后的患者是符合资格的。
对于因复发性疾病不耐受或拒绝基于铂的全身化学疗法治疗的患者，必须记录原因。
5.患有除了宫颈癌或头颈癌之外的不可治愈或转移性HPV16+癌症的患者必须在至少1次可用的不可治愈性疾病的标准疗法之后取得进展，或者患者不耐受或拒绝标准疗法或者患有不存在标准疗法的肿瘤。
递增阶段(部分1)和组合安全性阶段(部分2)
a.应该与主办方讨论HIV+患者的纳入。
扩展阶段(部分3)
b.应该与主办方讨论HIV+患者，以确保每个队列的比率不超过1:6(或6的倍数)。HIV+患者必须接受过至少1次先前全身癌症疗法，否则不符合护理标准。HIV+患者必须满足以下标准才符合资格：
CD4+T细胞计数>350个细胞/mL并且在过去12个月内无获得性免疫缺陷综合征(AIDS)定义机会性感染的病史
应该与主办方讨论使用预防性抗微生物剂的患者的纳入。
6.0至1的东部肿瘤协作组(ECOG)表现状态(PS)。
7.患者必须同意进行白细胞去除术的静脉通道并且如果静脉通道有问题，则愿意插入中心线。
8.患有不可切除或转移性实体瘤的患者必须具有可以用可接受临床风险活检的病变，并且同意在筛选和周期2第8天(±2天)时进行新鲜活检。
a.只要在研究纳入之前存在病变进展的客观证据，就可以对先前受照射区域的病变进行活检。
9.根据RECIST 1.1，至少有1个可测量的病变。
a.如果在研究纳入之前存在病变进展的客观证据，则先前受照射区域的病变有资格被视为可测量的疾病。
10.在白细胞去除术之前14天内进行的以下实验室评估表明器官功能和骨髓储备充足：
a.骨髓功能：绝对中性粒细胞计数≥1000/μL；血红蛋白≤9g/dL；血小板计数≥75,000/μL。注意：在血红蛋白值<9g/dL的稳定患者中，可以利用输血来满足纳入标准。
b.肝功能：血清总胆红素≤1.5×ULN；血清AST/ALT，≤2.5×ULN(在存在肝转移的情况下≤5×ULN)；碱性磷酸酶<2.5×ULN，除了以下例外情况：肝和骨受累患者：碱性磷酸酶≤5×ULN。
i.应该与主办方讨论患有遗传性胆红素代谢病症的患者。
c.肾功能：基于尿液收集或Cockcroft-Gault评估，血清肌酐≤2.5×ULN或肌酐清除率≥30毫升/分钟。
d.凝血曲线：凝血酶原时间(PT)、国际归一化比率(INR)/部分凝血活酶时间(PTT)≤1.5×ULN。如果研究者认为患者适合研究，则在白细胞去除术之前接受稳定的维持性抗凝血疗法方案至少30天的患者的PT/INR测量结果可能为>1.5×ULN。在纳入之前，必须向主办方提供充分的理由。
11.接受免疫检查点抑制剂治疗之后患有免疫介导的内分泌疾病、需要激素替代疗法的患者是符合资格的。
a.如果每日剂量不超过10mg，则需要泼尼松(prednisone)作为激素替代疗法的一部分的患者是符合资格的。
12.有生育潜能的女性患者必须：
a.筛选时血清β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)妊娠测试呈阴性，并且
b.同意从知情同意书之时起使用双重避孕，直到最后剂量的免疫检查点抑制剂或SQZ PBMC-HPV之后至少5个月。
13.未进行输精管切除术的男性患者必须愿意从知情同意书之时起使用避孕套，直到最后剂量的免疫检查点抑制剂或SQZ PBMC HPV之后至少5个月。
14.患者能够理解并遵守方案，并已签署所需的知情同意书(ICF)。在执行相关研究程序之前，必须签署适当的ICF。如果适用，男性患者的女性伴侣理解并签署妊娠伴侣ICF。
排除标准
1.在白细胞去除术之前2周内接受抗癌疗法的治疗，包含研究性疗法。对于半衰期超过3天的先前疗法，应该与主办方讨论疗法的停用的时间。
2.根据NCI CTCAE版本5.0，出现>1级AE(2级脱发除外)的患者与先前用抗癌或研究性疗法治疗相关，在白细胞去除术之前至少2周未缓解(即≤1级或更好)。
3.来自先前免疫疗法的任何4级irAE(接受替代疗法或血清淀粉酶或脂肪酶无症状升高的内分泌疾病患者是符合资格的)、导致先前免疫疗法永久停用的任何irAE，或在白细胞去除术之前≤6个月发生的任何3级irAE的病史。
4.在过去6个月内接受非皮质类固醇免疫抑制剂治疗的患者可能不符合资格并且应该与主办方讨论。
5.患有活动性、已知或疑似自身免疫性疾病的患者可能不符合资格并且应该与主办方讨论。
6.先前接受过同种异体骨髓或实体器官移植的患者可能不符合资格并且应该与主办方讨论。
7.在白细胞去除术之前4周内进行活病毒疫苗接种。
8.在白细胞去除术之前14天内使用皮质类固醇(每天>10mg泼尼松或等效物)或其它免疫抑制药物进行全身治疗。允许吸入、鼻内、关节内和局部(包含眼部)类固醇。允许对肾上腺功能不全的患者使用类固醇替代物。允许氟可的松用于肾上腺功能不全的患者的盐皮质激素替代物。
9.具有已知的活动性中枢神经系统转移和/或癌性脑膜炎。患有先前治疗的脑转移的患者可以参加，前提是其是稳定的(在第一剂量的研究产物之前至少4周没有通过成像进展的证据并且任何神经症状已返回到基线)，没有新的或扩大的脑转移的证据，并且在白细胞去除术之前至少7天没有使用类固醇。这一例外不包含癌性脑膜炎，无论临床状态如何，都被排除在外。
10.需要类固醇的间质性肺疾病、特发性肺纤维化、肺炎(包含药物诱导的)或机化性肺炎(例如，闭塞性细支气管炎、隐源性机化性肺炎)的病史。
a.不需要肺炎的类固醇疗法的无症状肺炎患者是符合资格的。
11.临床上显著的心脏疾病，包含不稳定型心绞痛、在白细胞去除术之前6个月内的急性心肌梗塞、纽约心脏协会III或IV级充血性心力衰竭以及需要治疗的心律失常。
12.全身动脉血栓或栓塞事件，如白细胞去除术之前1个月内的脑血管意外(包含缺血性发作)。
13.在白细胞去除术前1个月内的全身静脉血栓事件(例如，深静脉血栓)或肺动脉事件(例如，肺栓塞)。
a.在接受稳定抗凝血疗法的白细胞去除术之前患有静脉血栓事件的患者是符合资格的。
14.研究者认为异常心电图(ECG)的病史或存在具有临床意义。
15.左心室射血分数(LVEF)<50％。
16.在白细胞去除术的2周内的大手术；在白细胞去除术之前>2周的大手术之后，所有手术伤口必须愈合并且无感染或裂开。
17.任何其它临床上显著的合并症，如活动性感染、已知的精神或神经障碍或任何其它病状，研究者认为可能损害对方案的遵守、干扰研究结果的解释或使患者易患安全性风险。
18.已知活动性乙型肝炎或丙型肝炎，或活动性结核分枝杆菌感染。
19.患者进入后12个月内有酒精和/或非法药物滥用史。
20.在筛选访视或纳入时正在哺乳或血清妊娠测试呈阳性的女性患者。
21.患者对SQZ PBMC HPV的任何组分有过敏或超敏反应史。
22.对嵌合、人或人源化抗体或输注蛋白(仅组合队列)的严重过敏反应史。
23.已知对阿特朱单抗、伊匹单抗、纳武单抗、中国仓鼠卵巢细胞产物或阿特朱单抗、伊匹单抗或纳武单抗调配物的任何组分(仅组合队列)的超敏反应。
白细胞去除术
白细胞去除术的目的是为每名患者提供大约10至14×109个细胞的WBC产率，以支持延长的治疗持续时间。在预期产率低的情况下，努力调整程序，例如通过处理至多15升的血液体积。根据当地程序，如果可能的话，在白细胞去除术期间进行WBC或全血细胞计数，以便可以增加处理的血液体积。如果在白细胞去除术期间不能进行WBC或全血细胞计数，则在白细胞去除术结束时采集样品，如果可能的话，以确定白细胞中的WBC计数。结果将尽快处理并且实时提供给主办方。
肿瘤应答评估和时间表
在筛选(基线)时进行肿瘤评估，并且研究者在第一剂量的SQZ PBMC HPV之后每9周(±7天)评估一次肿瘤应答，持续1年，然后每12周(±7天)评估一次，直到由RECIST和iRECIST确认的疾病进展、不可接受的毒性、撤回同意书、死亡或自SQZ PBMC HPV的首次施用的日期起2年为止，以先发生者为准。
疾病通过射线照相成像来评估。根据RECIST 1.1，经历疾病进展的患者可以继续给药，如果治疗研究者认为符合其最佳利益，以允许确认疾病进展；即，根据iRECIST的iCPD(Seymour等人,2017)。
如果患者由于除了进展之外的原因停用研究产物，则该患者应继续按照上文所列出的时间表成像。应获得射线照相评估并记录在CRF中。
在筛选和所有后续时间点时，宫颈、肛门/直肠、外阴/阴道和阴茎癌需要对躯干(胸部、腹部和骨盆)和所有已知的疾病位点进行计算机断层扫描(CT)；口咽癌需要头部、颈部、胸部以及已知受累的其它区域的CT。如果出于合理原因不能使用CT扫描或不允许进行适当的肿瘤评估，则允许进行磁共振成像(MRI)并且应在筛选期间通知主办方。同一射线照相程序用于在整个研究过程中在筛选时评估疾病位点。对于所有其它晚期实体瘤类型，研究者使用研究者认为最适合该肿瘤类型的成像模式对所有已知的疾病位点进行成像。
在筛选具有脑转移史的所有患者时需要进行脑磁共振成像，并且可以在随后的时间点对具有脑转移史的任何患者和/或出现脑转移症状的任何患者重复进行。如果患者不能耐受MRI或有MRI禁忌症，可以使用CT扫描。
同一评估者进行评估，以确保不同访视之间的内部一致性。根据研究者的判断，如果怀疑PD，应随时重复CT扫描。对于达到部分应答(PR)或完全应答(CR)的患者，应在4周后重复肿瘤评估以确认应答。
包含免疫原性测量结果的药效学评估
样品收集时间表
肿瘤活检
在白细胞去除术之前，患者经历筛选可以来自具有活性肿瘤生长的先前照射的位点的肿瘤活检(原发性肿瘤或转移)。要求所有患者在周期2第8天(±2天)时重复进行同一原发性肿瘤或转移的肿瘤活检。如果可能，在周期5第1天(+2天)时获得另外的重复肿瘤活检(给药前)；该样品是任选的。如果初步数据表明修改治疗中肿瘤活检时间点更合适，则可以考虑替代治疗中肿瘤活检时间点。
筛选时采集的新鲜肿瘤活检应来自原发性肿瘤或转移位点，并且后续活检应来自筛选时活检的同一原发性肿瘤或转移。
药效学评估
基线样品将尽可能用于细胞相关测试的纵向评估，包含但不限于通过包含四聚体染色的流式细胞术进行的免疫分型、与HPV肽(IFNγ和颗粒酶B酶联免疫斑点[ELISPOT])和循环无细胞HPV16 DNA(cfHPV DNA)共培养之后的细胞因子的T细胞产生的评估。基线肿瘤活检和所选血液样品将仅用于与处理后样品进行比较(表2)。
表2药效学和免疫原性评估
缩略语：DNA＝脱氧核酸；HPV16＝人乳头瘤病毒菌株16；IFNγ＝干扰素γ
关于通过ELISPOT检测到的内源性免疫应答的信息将告知肿瘤活检的免疫组织化学分析。
细胞因子评估
收集了所有患者的细胞因子的血液样品。2、3或4级CRS患者在2、3或4级CRS事件期间具有另外的细胞因子血浆水平。在诊断CRS时、严重程度增加时(例如，当2级CRS进展为3级时)、神经症状发作时以及出院或缓解时获得血液收集。
细胞因子组的评估包含但不限于IFNγ(IFN？)和IL 6。虽然CRS可能延迟发作，但其很少在疗法开始之后14天内出现。患者表现出的症状与该窗口外出现的CRS一致，应仔细评估其它原因。
监测细胞因子以进行药效学评估。收集基线和处理后血清样品以通过测量可以提供关于药物炎症应答的信息的细胞因子来评估抗肿瘤免疫应答。
安全性评估
通过监测根据NCI CTCAE版本5.0定义和分级的所有SAE和非严重AE和实验室异常来评估该研究的安全性。一般安全性评估包含体格检查和具体的实验室评估，包含血清化学、凝血和血细胞计数，包含差异。SAE和≥2级AESI将以快速方式报告，以便输入到安全性数据库中。
在研究进行期间，审查观察到的全部安全性事件(包含已缓解至2级的CRS事件)并且如果给定事件需要在该事件之后开始交错纳入患者，则做出决定。潜在另外的单一疗法队列(部分1)或组合安全性队列(部分2)的严格纳入要求一个或多个队列中的所有后续新纳入的患者交错1周。如果适用的话，在一些队列中可以继续进行患者的半顺序纳入。患者将在研究期间进行细胞因子释放测定。2、3或4级CRS的患者采集了另外的血液样品用于安全性实验室和细胞因子组的评估。
暴露于免疫检查点抑制剂可以增加irAE的风险，具体地自身免疫性病状。因此，irAE被早期识别并及时治疗以避免潜在的重大并发症。
所有患者在最后剂量的研究产物之后15-45天内返回诊所进行安全性随访。记录所有AE和SAE，直到最后剂量的研究产物(EOD6W)之后6周或退出研究之后45天或者直到开始另一种抗癌疗法为止，以先发生者为准。仅对研究者确定可能、很可能或肯定与SQZ-PBMC-HPV单一疗法或组合疗法相关的正在进行的SAE进行随访。
体格检查以及身高和体重
体格检查包含身高(仅筛选)、体重、一般外观的评估和以下系统的评估：皮肤、头、眼、耳、鼻、口/喉/颈、甲状腺、淋巴结、呼吸、心血管、胃肠道、四肢、肌肉骨骼、神经病学以及妇科和泌尿生殖系统，如所指示的。在白细胞去除术的24小时内在患者的体格检查期间捕获体重是特别重要的，因为患者给药是由体重确定的。
性能状态
东部肿瘤协作组量表和标准用于评估患者的性能状态，评估疾病如何影响患者的日常生活能力，并确定适当的治疗和预后。
生命体征
收集生命体征并且包含测量当患者处于坐姿时的收缩压和舒张压、心率、体温和呼吸速率。
12导联心电图
12导联ECG由具有资质的中心人员使用ECG机进行，所述ECG机确定由QTcB(由Bazett公式校正的QTc)和QTcF(由Fridericia公式校正的QTc)收集的心率、PR间隔、QRS间隔、RR间隔、QT间隔和QTc间隔。在ECG的收集期间，患者处于休息位置，在ECG收集之前至少10分钟处于安静的环境下，没有分散注意力(例如，电视、手机)。
所有ECG必须由具有资质的医生评估是否存在异常。
超声心动图
进行超声心动图或多门采集(MUGA)扫描以测量筛选时和如临床指示的LVEF。
实验室评估
将收集用于临床实验室评估的样品。表3中概述的临床实验室测试由中心进行。将表3中概述的实验室检测的样品收集在适当的试管中并按照中心的标准程序进行处理。
临床实验室变量在表3中列出。
表3临床实验室评估
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a.要求在白细胞去除术之前或当天收集这些实验室测试的结果，其中结果在白细胞去除术之前可用。
b.要求在任何肿瘤活检当天或第二天获得凝血参数的结果。
c.在基线和CRS情况下收集。
缩略语：CRS＝细胞因子释放综合征；T3＝三碘甲状腺原氨酸；T4＝甲状腺素；TSH＝促甲状腺激素
不良事件
定义
不良事件
AE是在不一定与施用的研究产物具有因果关系的患者中的任何不幸的医疗情况。因此，AE可以是与研究产物的使用在时间上相关联的任何不利和非预期的征兆(包含异常的实验室发现)、症状或疾病，而无论其是否与研究产物相关。不良事件可以是新事件或可以是已经加重或严重程度或频率恶化的预先存在的病状。
不良事件可能是体格检查、实验室测试或其它诊断研究相对于基线有临床上显著的变化。
在该研究中，如果AE的发作时间是在研究产物施用之后直至最后剂量的研究产物之后6周，则所述AE是治疗紧急事件。
严重不良事件
SAE是导致以下任何情况的任何AE：
死亡。
会立即危及生命。
需要住院或现有住院治疗延长。
导致持久或显著的残疾或无行为能力。
导致先天性异常或出生缺陷。
是可能会危及患者或可能需要医疗干预以防止上述结果中的1种的重要医疗事件。
在任何患者签署ICF后、治疗前、治疗期间或停止治疗后30天内发生的所有SAE，无论是否与研究相关，必须记录在适当的临床程序表中。
特别关注的不良事件
AESI是研究产物特有的具有科学和医学问题的AE(严重或非严重)，需要研究者持续监测并立即通知主办方。此类AE可能需要进一步研究以对其进行表征和理解。特别关注的不良事件可以在研究期间通过方案修订进行添加或删除。
以下AE被视为AESI：
提示超敏反应、细胞因子释放、全身炎症反应综合征、全身炎症激活的事件。
流感样疾病。
输液反应综合征。
与免疫疗法相关的irAE，如心肌炎、神经性irAE、免疫相关病因的转氨酶炎和肾炎。
另外，向主办方报告以下事件：
疑似SQZ-PBMC-HPV过量。
肝测试异常符合海氏法则标准，即，AST或ALT实验室值≥3×ULN并且总胆红素实验室值≥2×ULN并且同时碱性磷酸酶实验室值<2×ULN，由方案指定的或未计划的实验室测试确定。
严重程度的评估
NCI CTCAE版本5.0用于评估AE和实验室异常的严重程度并对其进行分级。ASTCT共识分级将用于CRS和ICANS。每个AE术语将映射至最新版本的药事管理医学词典(MedDRA)术语和代码。
如果CTCAE版本5.0未涵盖所述事件，则应使用表4中所示的指南来评估严重程度。
表4 CTCAE未涵盖的事件的严重程度和毒性等级
来源：(国家过敏和传染病研究所(NIAID)，2003)
缩略语：CTCAE＝通用不良事件术语标准
因果关系评估
与研究产物的关系由研究者评估。因此，AE和SAE报告表包含将因果关系归因于SQZ-PBMC-HPV、阿特朱单抗、伊匹单抗、纳武单抗或组合的选项。对于接受SQZ PBMC-HPV和免疫检查点抑制剂组合疗法的患者，对每个方案指定的疗法的因果关系进行单独评估。如果事件与免疫检查点抑制剂标记一致，则合理疑似因果关系仅归因于免疫检查点抑制剂。
AE与研究产物(即，SQZ-PBMC-HPV、阿特朱单抗、伊匹单抗、纳武单抗或组合)的关系记录如下：
明确的：AE明显与研究产物相关。
很可能的：AE可能与研究产物相关。
可能的：AE可以与研究产物相关。
不太可能：AE怀疑地与研究产物相关。
无关的：AE明显与研究产物无关。
具有医学资质的研究者确定每个AE与研究产物的关系。研究者根据他或她的医学判断，决定事件是否有合理的可能性是由研究产物引起的。如果不存在正当理由表面关系，则将AE归类为“无关”。如果有任何合理原因，即使尚未确定，怀疑研究产物与AE的发生之间可能存在因果关系，则AE被视为“相关”。
如果AE/SAE与研究产物之间的关系被确定为“明确的”、“可能的”或“很可能的”，则出于快速监管报告的目的，所述事件被视为与研究产物相关。
预期性
根据适用的产物信息(例如，SQZ-PBMC-HPV的IB或阿特朱单抗、伊匹单抗或纳武单抗的已批准标签)未列出或与特异性或严重程度不一致的AE被视为非预期的。
功效分析
定义
无进展生存期(PFS)被定义为从周期1第1天到根据RECIST 1.1首次记录客观肿瘤进展(PD、放射学)或由于任何原因的死亡的时间，以先发生者为准。无进展生存期数据将在最后一次肿瘤评估的日期进行审查，记录没有客观肿瘤进展且在分析时仍在研究中、接受了除研究产物以外的抗肿瘤治疗或在客观肿瘤进展记录之前退出治疗随访的患者没有PD。在纳入之后没有肿瘤评估并且不知道已死亡的患者将在周期1第1天进行PFS审查。PFS将通过RECIST 1.1和iRECIST标准两者评估以适应不同参与中心的不同实践。
总生存期(OS)被定义为从周期1第1天的日期到因任何原因导致的死亡的日期的时间。在没有确认死亡的情况下，生存期时间将在已知患者存活的最后日期进行审查。在周期1第1天之后缺乏数据的患者将在周期1第1天审查其生存期时间。
根据RECIST 1.1，客观应答率(ORR)被定义为CR或PR患者的比例。客观应答率将作为未确认和确认的ORR提供。确认的应答是在最初记录应答之后至少28天在重复成像研究中持续存在的应答。类似地，也将总结和报告iRECIST的iORR。
应答持续时间(DoR)被定义为从PR或CR的首次记录到由于任何原因的客观肿瘤进展或死亡的首次记录的时间。应答持续时间数据将在最后一次肿瘤评估之日进行审查，记录没有肿瘤进展且在分析时仍在研究中、接受了除研究产物以外的抗肿瘤治疗或在客观肿瘤进展记录之前退出研究随访的没有PD的患者将在最后一次肿瘤评估时进行审查。类似地，也将总结和报告iRECIST的iDoR。
一旦记录从周期1第1天直到疾病进展或死亡为止的所有肿瘤评估，则确定最佳总体应答(BOR)。通常，这是所有评估中的最佳应答；然而，在BOR确定中也将使用CR、PR和稳定疾病(SD)的确认。为了确认CR或PR，肿瘤测量结果的变化必须通过重复评估来确认，所述重复评估应在首次满足应答标准之后不少于4周(28天)。为了确认SD，必须从周期1第1天起至少12周发生；否则，BOR将取决于后续评估。最佳总体应答将按百分比进行总结并作为最佳应答时间的事件时间变量，使用纳入作为锚定日期。类似地，也将总结和报告iRECIST的iBOR。
疾病控制率(DCR)是根据RECIST 1.1在定义的时间点确定BOR为CR、PR或SD的患者比例。在基线时患有可测量疾病且有资格进行肿瘤评估的安全性群体中的所有患者将被视为在3、6和12个月时的DCR比例的分母。类似地，也将总结和报告iRECIST的iDCR。
疾病稳定12周是根据RECIST 1.1确定BOR为CR、PR或SD并维持至少12周的患者比例。在基线时患有可测量疾病且有资格进行肿瘤评估的安全性群体中的所有患者将被视为在3、6和12个月时的比例的分母。类似地，也将总结和报告iRECIST的12周SD。
分析
对安全性群体进行功效分析。还针对有记录的HLA I类表达的患者描述了抗肿瘤活性(ORR、PFS、OS)。如果符合方案群体不同于安全性群体，也将使用PP群体进行功效分析。
使用卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)方法评估中值PFS和2侧95％置信区间。除非在死亡之前接受后续抗癌疗法，否则死亡患者，无论其死因如何，均被视为发生事件。如果接受后续疗法，则将在后续疗法之前审查患者的最后一次可评估肿瘤评估的日期。撤回研究同意书的患者被视为在撤回同意书之前最后一次可评估肿瘤评估时审查。在临床数据截止日期时仍然存活的患者在最近的可评估肿瘤评估时审查。在临床数据截止日期之前丢失随访的所有患者也将被视为在丢失随访之前在最后一次可评估肿瘤评估时审查。
应答持续时间、最佳总体应答的时间和总生存期将使用与PFS相同的方法。另外，iPFS、iBOR、iDCR和使用iRECIST的iBOR时间使用类似的方法进行分析和报告。
客观应答率(ORR)以基于精确二项分布的95％置信区间的比例表示。将提供ORR的点评估和2侧95％置信区间。持续至少12周的DCR和SD将作为点评估值报告。
安全性分析
使用安全性群体分析所有安全性参数。安全性参数包含：AE、实验室评估、生命体征、ECOG、暴露、ECG、ECHO/MUGA和体格检查。
安全性的主要终点是发生任何AE和观察到的SQZ-PBMC-HPV施用的毒性的患者数量，其中使用NCI CTCAE版本5.0评估严重程度。分析中包含在首次施用SQZ-PBMC-HPV之后发生的所有AE。从签署知情同意书时开始收集不良事件；然而分析主要针对治疗中出现的AE进行。
使用描述性统计数据分析AE。对于具有给定AE的多重发生率的患者，使用最高严重程度。
不良事件
使用当前版本的MedDRA编码字典编码AE。
如果在最后剂量的研究产物之后周期1第1天至6周发生，则AE是治疗紧急事件。对于出现部分发作时间的AE，使用非缺失日期部分来确定AE是否是治疗紧急事件。如果不能确定AE相对于研究产物施用何时发生，则将AE归类为治疗紧急事件。治疗紧急事件AE还包含在研究产物的首次施用之前出现且在施用之后毒性恶化的任何AE。
本节中描述的分析是基于TEAE，为简洁起见，在本节中明确称为AE。
出于总结目的，研究者认为与研究产物可能、很可能或目前相关的不良事件被分类为相关。
总结发生任何AE、任何相关AE、任何SAE、任何相关SAE、任何3级或更高级AE、任何相关3级或更高级AE的患者的数量和百分比，以及每个类别的事件总数。总结由于AE、由于AE住院和由于AE治疗停用以及DLT和AESI导致的死亡的数量。
按系统器官分类和优选术语总结发生AE的患者的数量和百分比以及AE的总数。对于相关AE、AESI、SAE、相关SAE和≥3级AE以及相关≥3级AE，重复该表格。
在患者列表中提供了包含非TEAE的所有AE。产生导致研究产物停用的AE、导致死亡的AE、SAE、相关AE、AESI、DLT和严重AE的患者列表。
临床实验室评估
基线被定义为首次暴露于研究产物之前的最后一个非缺失值。这通常是周期第1天给药前，但可以更早。按研究访视总结实际值和相对于基线临床实验室测试的变化。
根据NCI CTCAE版本5.0和研究者确定的临床显著性对实验室检测结果进行分类。如果每个参数的每次研究访视报告了多于1个实验室结果，则选择产生最严重分类的结果进行分析。创建移位表以示出分级实验室参数相对于基线的最大变化。
所有实验室评估在列表中提供。
列出具有临床上显著的异常实验室测试结果的患者。该列表包含患者在研究访视中异常且被研究者确定为临床上显著的实验室参数的所有结果。
生命体征
线被定义为首次暴露于研究产物之前的最后一个非缺失值。按研究访视和研究时间点总结生命体征的实际值和相对于基线的变化。所有生命体征数据在患者列表中呈现。
生命体征值根据研究者确定的临床显著性进行分类。按研究访视和研究时间点总结具有非缺失结果的患者数量、具有非临床上显著的结果和临床上显著的结果的患者数量和百分比。如果每个参数的每次研究访视和研究时间点报告了多于1个生命体征结果，则选择产生最严重分类的结果进行分析。
列出具有临床上显著的生命体征值的患者。该列表包含研究者确定在研究时间点对患者临床上显著的生命体征参数的所有结果。
体格检查
列出了异常体格检查发现。
12导联ECG
ECG结果在移位表中呈现(正常、异常、不是临床上显著的、异常、临床上显著的)以示出相对于基线的最大变化。所有ECG结果在患者列表中呈现。
其它安全性变量
29T2All安全性数据在列表中提供。
在每次计划访视时，总结所收集ECOGPS和ECOGPS相对于基线的变化。以连续变量和分类变量总结ECOGPS相对于基线的变化。相对于基线降低≥1点归类为相对于基线“改善”。相对于基线增加≥1点归类为相对于基线“恶化”。ECOGPS相对于基线的改善、恶化和无变化通过在每个纳入后评估ECOGPS的时间点的治疗总结为分类变量。
药效学分析
总结了每个时间点的生物标志物相对于基线的变化和相对于基线的变化％。使用描述性和图形方法探索药效学标志物与SQZ-PBMC-HPV之间的相关性。
报告每个标志物的描述性统计数据(平均值、标准差、中值、最小值、最大值和几何平均值)。呈现了根据剂量组随时间的个体值的图。
实例2.队列1-3的分析
Cell技术已展示出将抗原直接递送至细胞质的强大能力，由此规避了大多数疫苗依赖于且能够实现高效MHC-I呈递和抗原特异性CD8 T细胞激活的交叉呈递过程。临床前数据已展示在体外和体内具有优异的CD8T细胞激活和抗肿瘤效应。
图6展示了由Cell技术产生的SQZ-PBMC-HPV-101研究产物的预期机制，并且SQZ-PBMC-HPV疫苗直接刺激CD8 T细胞应答。
1.外周血单核细胞(PBMC)通过白细胞去除术源自患者并且与HPV16E6和E7合成长肽(SLP)混合。
2.Cell技术使用PBMC的快速机械变形暂时破坏其膜并将E6和E7抗原货物直接递送至其细胞质。
3.所得抗原呈递细胞(APC)与CpG7909成熟。
4.SQZ-PBMC-HPV并非通过该过程进行基因修饰并且冷冻保存用于储存和运输给患者。
5.临床前数据已展示，鼠类SQZTMAPC归巢到淋巴器官以驱动抗原特异性CD8 T细胞激活。
6.在临床前模型中，激活的T细胞归巢到肿瘤位点，诱导肿瘤细胞死亡，并且形成提供长期保护的记忆。当对照临床前模型中的其它技术进行基准时，SQZ-PBMC-HPV已展示出疫苗效力的显著改善。
如图7所示，SQZ-PBMC-HPV-101临床研究的主要研究目标包含针对单一疗法的28天DLT期的安全性和针对与检查点抑制剂(CPI)的组合的42天DLT期的安全性。次要研究目标包含安全性和耐受性；功效(如根据RECIST 1.1的ORR)和药效学标志物。
方法
SQZ-PBMC-HPV-101纳入了在无限制的先前疗法线之后进展的不可治愈HPV16+癌症的患者(图7)。
符合资格的患者必须具有ECOG 0-1、足够的器官功能和可以在可接受的临床风险下进行活检的病变。
患者在研究中心进行单次白细胞去除术，并且在新罕布夏州朴茨茅斯小镇的龙沙公司(Lonza,Postsmouth,NH)制造SQZ-PBMC-HPV批次。SQZ-PBMC-HPV未经基因修饰。静脉到静脉时间需要约1周。
在批次释放之前进行批次表征并且包括细胞活力和IFN-γ分泌的诱导。
门诊患者SQZ-PBMC-HPV在没有先前调节方案的情况下接受每3周IV；在每个队列中，观察第一和第二患者23小时。
使用队列3引入双抗原引发(DP)并且发生在周期1第1天和第2天。
DLT期对于单一疗法为28天并且对于组合阶段为42天。
按照3+3规则进行单一疗法剂量递增。在所有队列中，将纳入至多12名患者。
在基线和C2D8时收集肿瘤活检，加工成FFPE块，使用符合资格的单一、双重和三重测定在自动化免疫组织化学染色器上进行切片和IHC染色。
每位患者的治疗持续时间由其指定剂量和其制造批次中的小瓶的数量确定。
通过RECIST 1.1和iRECIST评估应答。
患者的人口统计学、疾病特性、治疗中出现的不良事件(TEAE)
表5示出了纳入的患者的人口统计学和疾病特性。
表5：人口统计学和疾病特性
表6示出了纳入的患者的处置。
表6：患者处置
*截至方案v1.2，限制为3个剂量。在v2.0获得批准之后，患者可以接受尽可能多的剂量。
^在方案版本2.0之前，治疗限于3次施用。
1患者出院至临终关怀；随后死亡。
表7示出了2名或更多名患者报告的因果关系TEAE的总结。
表7：2名或更多名患者(任何级别)报告的所有因果关系TEAE
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SQZ-PBMC-HPV的可制造性
每位患者的制造过程<24小时并且允许从一次操作中产生多个剂量。制造和释放测试的显著改善支持约1周的静脉到静脉时间。
如图8A和B所示，SQZ-PBMC-HPV的制造示出了约90％的平均活力，并且平均端到端处理时间少于24小时。如图8C所示，从所有患者批次产生的SQZ-PBMC-HPV呈现HPV抗原，如诱导T细胞活性的能力所示，在应答T细胞IFN-γ分泌中测定。
治疗结果
治疗结果在图9中总结，示出了所有队列的最佳总体应答(BOR)、研究生存期(天数)和皇家马斯登医院(RMH)1评分的总结(基于评分的阴影)。如图9所示，所有队列3患者的RMH评分为2并且CD8肿瘤浸润淋巴细胞中无显著增加。
患者案例研究
选择具有不同肿瘤负荷的患者进行进一步的案例研究。
案例研究患者2
在队列1(0.5e6/kg q3w)中使用(1)顺铂/紫杉醇/贝伐单抗[BOR＝CR]和(2)派姆单抗[BOR＝PD]治疗之后，在诊断之后3.5年纳入患有子宫颈癌的65岁女性。
低肿瘤负荷，ECOG为0并且基线处的皇家马斯登医院(RMH)1评分为1；在研究期间持续10+个月。
肿瘤负荷1靶向病变(TL)(15mm SOD)和3个NTL(2个淋巴结，肺)。根据RECIST 1.1的最佳总体应答：SD。
图10示出了降低的肿瘤生长动力学(图10A)，而来自IHC图像分析的结果示出了中心肿瘤中的CD8 TIL增加了2倍(图10B，与筛选相比的C2D8)并且IHC图像的实例进一步展示了CD8 TIL增加(图10C，箭头)。
案例研究患者7
在队列2(2.5e6/kg q3w)中使用卡铂/5FU/派姆单抗(BOR＝PR)治疗之后，在诊断之后1年纳入患有头颈癌的67岁男性。
高肿瘤负荷，ECOG为1并且基线处的皇家马斯登医院(RMH)1评分为0；在研究期间持续3个月。
肿瘤负荷2个TL：69mm SOD；1个NTL(淋巴结)。根据RECIST 1.1的最佳总体应答：SD。
图11示出了降低的肿瘤生长动力学(图11A)，而来自IHC图像分析的结果示出了治疗中的中心肿瘤中的CD8 TIL增加了6倍(图11B，与筛选相比的C2D8)并且IHC图像的实例展示了CD8 TIL的显著增加(图11C，箭头)。
结论
安全性和耐受性
·在所有剂量水平下，SQZ-PBMC-HPV是安全且耐受性良好的，其中患者接受2至10个剂量。
·未观察到DLT或G>2治疗相关SAE。
可制造性
·所有批次在符合质量标准的cGMP下产生，在<24小时内产生多个冷冻保存的剂量，并允许静脉到静脉时间为约1周。
·基于T细胞活性的产物表征测定(IFN-γ分泌)确认所有患者批次中的抗原呈递，与个体患者的病史或RMH 1期评分无关。
生物标志物
·在患者如在案例研究中的患者2和7中观察到免疫活性增加。高剂量队列中的9名患者中有六名在基线处的RMH 1期评分为2——反映了晚期疾病和免疫受损患者。
·基于这2个案例研究，具有较低肿瘤负荷的患者，如患者2可能具有更高的临床益处可能性。
未来发展：一旦当前剂量水平的评估完成，预期将开始与免疫检查点抑制剂的安全性组合阶段。
实例3.肿瘤的生物标志物分析
评估来自实例2中描述的临床研究中纳入的患者的肿瘤样品的生物标志物的表达。在基线和周期2第8天(C2D8)时收集肿瘤活检，加工成FFPE块，使用符合资格的单一、双重和三重测定在自动化免疫组织化学染色器上进行切片和IHC染色。
该实例中描述的队列如表8所示。
表8生物标志物研究的队列
队列 治疗 加强
队列1 0.5×106个细胞/kg 单一引发(SP)
队列2 2.5×106个细胞/kg 单一引发(SP)
队列3 2.5×106个细胞/kg 双引发(DP)
队列3a 5.0×106个细胞/kg 双引发(DP)
结果
不良事件
SQZ-PBMC-HPV被视为是安全且耐受性良好的。生物标志物研究时的不良事件在表9中呈现。
表9
*常见相关AE(>1名患者)：疲劳、低血压、输注相关反应、恶心、瘙痒。M＝百万，SP＝单一引发，DP＝双引发，AE＝不良事件
没有受试者符合预定的DLT标准
2名患者报告了三个AESI：
2级细胞因子释放综合征(CRS)和1级和2级免疫相关反应
未报告相关≥3级SAE：
2级(相关的)——CRS(1名患者)
1名患者的相关AE 3+级(贫血)
一名患者由于鼻塞而延迟一次剂量
未观察到DLT、导致停用的相关AE和致命的相关AE。
生物标志物研究
总肿瘤组织中的CD8+细胞密度在图12中示出。肿瘤也被评估为沙漠型(缺乏免疫细胞)、排除型(仅外周上的免疫细胞)或炎症型。
颗粒酶B(GZMB+)细胞中的CD8+细胞密度的密度在图13中示出。CD8+/Ki67+细胞的密度在图14中示出并且CD8+/Ki67-细胞的密度在图15中示出。MHC-1表达在图16中基于H-评分示出。还示出了以下MHC类别中的细胞％，MHC-、MHC-1低、MHC-1中和MHC-1高。评分包含染色的强度和在每个强度下阳性染色细胞的比例。染色信号分为4个不同的强度类别：0：无染色；1+：弱染色(在高功率放大率下可见)；2+：中间(或中度)染色(在低功率放大率下可见)；3+：强染色(即使在低功率放大率下也很明显)。
表达PD-L1的肿瘤细胞的百分比在图17中示出。
HPV E6的表达在图18中基于H-评分示出。还示出了以下HPV类别中的细胞％，HPV-、HPV16+1、HPV16+2HPV16+3和HPV16+4。具有1-3个探针斑点的细胞＝+1，4-9个斑点＝+2，10-13个斑点＝+3并且>14个斑点＝+4。
HPV E7的表达在图19中基于H-评分示出。还示出了以下HPV类别中的细胞％，HPV-、HPV16+1、HPV16+2HPV16+3和HPV16+4。具有1-3个探针斑点的细胞＝+1，4-9个斑点＝+2，10-13个斑点＝+3并且>14个斑点＝+4。对队列1-3中的患者的活检进行PD1表达的评估(图20)。
所选患者
112-068(队列3a)的总结
患有口咽鳞状细胞癌的52岁男性纳入最高剂量队列(5.0M细胞/kg DP)。3.7年前首次诊断，之前接受了6种先前全身疗法线：顺铂、卡铂/5FU/派姆单抗(BOR＝PD)、多西他赛(docetaxel)、西妥昔单抗(cetuximab)、抗TGFβ/派姆单抗(BOR＝PD)、西妥昔单抗/紫杉醇。具有显著症状负荷的大型原发性病变。接受所有7个剂量的SQZ-PBMC-HPV，具有少数低级相关AE(G1发红、G1疲劳)。处理活检的第-28天展示了CD8浸润肿瘤增加8倍，其中PD-L1表达的反射增加。包含在最后一次肿瘤评估时具有新的皮肤病变的靶向病变(纵隔淋巴结(RECIST1.1))上确认的CR的射线照相应答。在体格检查时症状性改善(吞咽困难)和病变的宏观改善。
肿瘤从沙漠型(无免疫细胞)变为炎症型。患者示出最高CD8浸润(和CD8+细胞上的效应分子GZMB表达)。增殖(Ki67+)CD8+细胞无变化。观察到MHC-I和PD-L1的增加。患者在基线处示出肿瘤中的最高E6和E7表达并且处理后变化最大。
该患者的中心肿瘤的免疫表型的更详细分析在图21中示出。右图示出了肿瘤的间质和实质中的CD8+细胞密度。中图示出了基于三重测定中的CD8、GZMB和FoxP3的表达的肿瘤中的免疫细胞的CTL、Treg和NK功能的密度。右图示出了CD8+和GZMB+细胞的百分比。免疫组织化学进一步证实了这些结果(图22)。
增殖/激活的CD8+细胞的密度的更详细分析在图23中示出。
如图24所示，观察到PD-L1的表达增加。
如图25所示，肿瘤中的MHC-1细胞的数量增加C2D8，包含MHC-1高细胞比例的增加(左图，顶部)。相反，表达HPV16 E6和HPV16 E7的细胞的数量截止C2D8减少(左图，底部)。这些结果也通过免疫组织化学示出(右图)。
肿瘤生长动力学在图26中示出。
103-027(队列2)
该患者的肿瘤在研究开始时炎症并且炎症截止C2D8增加。CD8浸润显著增加(但在CD8+细胞上效应分子GZMB表达无变化)。如通过CD8+/Ki67+测量的，该患者具有最高增殖CD8+细胞。MHC-I和PD-L1表达没有显著变化。
该患者的免疫表型的更详细分析在图27中示出。右图示出了中心肿瘤以及肿瘤的间质和实质中的CD8+细胞密度。中图示出了基于三重测定中的CD8、GZMB和FoxP3的表达的肿瘤中的免疫细胞的CTL、Treg和NK功能的密度。右图示出了CD8+和GZMB+细胞的百分比。免疫组织化学进一步证实了这些结果(图28)。
增殖/激活的CD8+细胞的密度的更详细分析在图29中示出。
如图30所示，PD-1和PD-L1的表达保持大致相同。
如图31所示，肿瘤中的MHC-1细胞的数量保持大致相同\MHC-1高细胞的比例增加(左图，顶部)。相反，表达HPV16 E6和HPV16 E7的细胞的数量截止C2D8减少(左图，底部)。这些结果也通过免疫组织化学示出(右图)。
103-008(队列1)
该患者的肿瘤在研究开始时炎症并且炎症截止C2D8增加。观察到CD8浸润增加的趋势，但在CD8+细胞上效应分子GZMB表达无变化。未观察到增殖(Ki67+)CD8+细胞的变化。未观察到PD-L1的变化。在基线处或处理后，肿瘤中的E6和E7表达没有变化。
该患者的免疫表型的更详细分析在图32中示出。右图示出了中心肿瘤以及肿瘤的间质和实质中的CD8+细胞密度。中图示出了基于三重测定中的CD8、GZMB和FoxP3 FoxP3的表达的肿瘤中的免疫细胞的CTL、Treg和NK功能的密度。右图示出了CD8+和GZMB+细胞的百分比。免疫组织化学进一步证实了这些结果(图33)。
增殖/激活的CD8+细胞的密度的更详细分析在图34中示出。
如图35所示，PD-1的表达在C2D8处保持大致相同。在初始筛选或在C2D8时未检测到PD-L1。
如图36所示，肿瘤中的MHC-1细胞的数量保持大致相同(左图，顶部)，表达HPV16E6和HPV16 E7的细胞的数量也保持大致相同(左图，底部)。这些结果也通过免疫组织化学示出(右图)。
序列.
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/>
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序列表
<110> SQZ生物技术公司
<120> 用于用经修饰的PBMC治疗癌症的方法
<130> 75032-20031.40
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/278,788
<151> 2021-11-12
<150> US 63/249,739
<151> 2021-09-29
<150> US 63/190,194
<151> 2021-05-18
<150> US 63/131,504
<151> 2020-12-29
<160> 50
<170> Windows的FastSEQ 4.0版
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Asp Ile Arg
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Asp Ile Arg
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<223> 合成构建体
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Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
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Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
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Ile Val Thr
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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Gln Lys Pro
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Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
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Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
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Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
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Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
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Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
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<223> 合成构建体
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
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<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30

Claims (70)

1.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括：
向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原；以及
向所述个体施用有效量的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CTLA4的拮抗剂是与CTLA4结合的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1的拮抗剂是与PD-1结合的抗体或与PD-L1结合的抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体和与PD-1结合的抗体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中向所述个体施用与CTLA-4结合的抗体并且向所述个体施用与PD-L1结合的抗体。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。
7.根据权利要求3、4和6中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗(nivolumab)。
8.根据权利要求3、4和6中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗(pembrolizumab)。
9.根据权利要求3、4和6中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗(atezolizumab)。
10.一种用于治疗个体的HPV+复发性、局部晚期或转移性肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括外周血单核细胞(PBMC)的组合物，其中所述PBMC包括至少一种细胞内递送的HPV抗原。
11.根据权利要求10所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物与一种或多种免疫检查点抑制剂联合施用。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述检查点抑制剂是所述个体的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂是与PD-L1、CTLA-4或PD-1结合的抗体。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物与和CTLA-4结合的抗体以及和PD-1结合的抗体联合施用。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗。
17.根据权利要求13、14和16中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗。
18.根据权利要求13、14和16中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是派姆单抗。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包括源自HPVE6和/或E7的HLA-A2限制性肽。
22.根据权利要求21所述的方法，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包括SEQ IDNO:18-25中的任一个的氨基酸序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述个体对HLA-A*02呈阳性。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述PBMC对HLA-A*02呈阳性。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述PBMC对于所述个体是自体的。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述个体对人免疫缺陷病毒(HIV)呈阳性。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌、宫颈癌、肛门癌或食道癌。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物静脉内地施用。
32.根据权利要求1至9和12至31中任一项所述的方法，其中所述CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂静脉内地、口服地或皮下地施用。
33.根据权利要求2至9和13至32中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体静脉内地施用。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中包括所述至少一种HPV抗原的PBMC的所述有效量为约0.5×106个细胞/kg至约5.0×106个细胞/kg。
35.根据权利要求6至9和16至34中任一项所述的方法，其中伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。
36.根据权利要求7和17至35中任一项所述的方法，其中纳武单抗的有效量为约360mg。
37.根据权利要求9、15、16和19至36中任一项所述的方法，其中阿特朱单抗的有效量为约1200mg。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中包括所述PBMC的所述组合物在三周周期的第1天递送。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中包括所述PBMC的所述组合物进一步在第一三周周期的第2天施用。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg、约5.0×106个细胞/kg在每个三周周期的第1天施用。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中约0.5×106个细胞/kg、约2.5×106个细胞/kg或约5.0×106个细胞/kg在所述第一三周周期的第2天施用。
42.根据权利要求2至9和13至41中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体和/或所述与PD-1结合的抗体和/或所述与PD-L1结合的抗体每三周周期施用一次。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体在每个三周周期的第1天施用。
44.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体每两个三周周期施用一次。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述与PD-1结合的抗体是纳武单抗，其中所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。
48.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述与CTLA-4结合的抗体是伊匹单抗，其中所述伊匹单抗以约1mg/kg的剂量在两个三周周期的所述第一三周周期的第1天施用，并且所述与PD-1结合的抗体以约360mg的剂量在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
49.根据权利要求38至45中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体在所述第一三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述与PD-L1结合的抗体是阿特朱单抗，其中所述阿特朱单抗以约1200mg的剂量施用。
51.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中向所述个体施用包括PBMC的所述组合物至少约三个月、六个月、九个月或一年。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；
b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
53.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；
b)百分比为约40％至约60％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约25％至约35％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
54.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约2.75×107个PBMC；
b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC/mL；
b)百分比为约50％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约30％(w/w)的低温保存培养基；以及
d)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
56.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC至约5×107个PBMC；
b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
57.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约1×106个PBMC/mL至约1×107个PBMC/mL；
b)百分比为约65％至约95％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约3％至约8％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
58.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约2.5×107个PBMC；
b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
59.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中包括PBMC的所述组合物包括：
a)约5×106个PBMC/mL；
b)百分比为约80％(w/w)的冷冻保存培养基；
c)百分比为约5％(w/w)的人血清白蛋白，
其中调配物的pH为约pH 7.4。
60.根据权利要求52至59中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存培养基是CS10。
61.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述低温保存培养基是FRS。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的两种或更多种。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中
(a)约25％至约80％的所述PBMC是T细胞；
(b)约1.5％至约30％的所述PBMC是B细胞；
(c)约3.0％至约20％的所述PBMC是NK细胞；或者
(d)约4.0％至约45％的所述PBMC是单核细胞。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的方法，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入PBMC群体的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入PBMC的直径的函数，由此使所述输入PBMC的扰动足够大以使所述至少一种HPV抗原通过以形成扰动的输入PBMC；以及
b)将扰动的输入PBMC群体与所述至少一种HPV抗原一起温育足够长的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入PBMC，由此产生包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述收缩的所述直径为约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的方法，其中对包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC进行调节。
68.根据权利要求67所述的方法，其中包括所述至少一种HPV抗原的所述PBMC通过包括将所述PBMC与佐剂在约37℃下一起温育约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以使所述PBMC进行调节的方法进行调节。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
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