JP2024521711A - 改善された免疫細胞集団を産生する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、改善された免疫細胞集団を産生する方法に関する。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０２１年５月１９日に出願されたＡＵ２０２１／９０１４９６からの優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、改善された免疫細胞集団を産生する方法に関する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、がんを治療することが困難な患者の治療において顕著な進歩を遂げているが、ＣＡＲ－Ｔの不十分な持続性は、依然として重要な課題である。注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の不十分な持続性は、がんを有する患者における持続的な臨床寛解と逆相関する。ナイーブ、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）表現型を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の頻度は、エフェクター（ＴＥ）及びエフェクターメモリー（ＴＥＭ）表現型を有する、より良好な持続性ＣＡＲ－Ｔ細胞を達成する能力を有する、臨床的有効性の重要な予測因子であることが示されている（ＭｃＬｅｌｌａｎ ａｎｄ Ａｌｉ Ｈｏｓｓｅｉｎｉ Ｒａｄ，２０１９）。ＴＥ及びＴＥＭ細胞は、インビトロで優れた腫瘍殺傷能力を示すが、それらは、低い自己再生能力を有し、ニッチホーミング及び生存の能力が低下しており、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）又は疲弊に対してより脆弱である（ＭｃＬｅｌｌａｎ ａｎｄ Ａｌｉ Ｈｏｓｓｅｉｎｉ Ｒａｄ，２０１９）。

したがって、ＣＡＲ－Ｔ療法で使用するためのＣＡＲ－Ｔ細胞集団などの改善された免疫細胞の集団が必要とされている。

本発明者らは、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤が、インビボで投与されるとき、その治療を必要とする対象における従来のＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を改善することができることを示した。本発明者らはまた、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を使用して、培養された免疫細胞の特性を改善することができることを示した。

したがって、一態様では、本発明は、対象における免疫応答を修飾する方法であって、対象に免疫細胞の集団を投与することを含み、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生され、好ましくは、免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

ある実施形態では、本方法は、対象におけるＴ細胞免疫応答、樹状細胞免疫応答、ナチュラルキラー細胞免疫応答、又は骨髄細胞若しくはマクロファージ免疫応答を修飾するためのものである。

更なる態様では、本発明は、対象における免疫応答を修飾するための薬品の調製における免疫細胞の集団の使用であって、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生され、好ましくは、免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである、使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象における免疫応答の修飾に使用するための免疫細胞の集団であって、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生され、好ましくは、免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである、免疫細胞の集団を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞応答を修飾する方法であって、対象に、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団を投与することを含み、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中でＣＡＲ－Ｔ細胞を培養することを含む方法を使用して産生される、方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞応答を修飾するための薬品の調製におけるキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団の使用であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中でＣＡＲ－Ｔ細胞を培養することを含む方法を使用して産生される、使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞応答の修飾に使用するためのキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中でＣＡＲ－Ｔ細胞を培養することを含む方法を使用して産生される、Ｔ細胞の集団を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾する方法であって、
ａ）対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することと、
ｂ）ステップａ）の少なくとも約１８時間後に、対象に、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団を投与することと、を含む、方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の調製におけるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、治療は、
ａ）対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することと、
ｂ）ステップａ）の少なくとも約１８時間後に、対象に、好ましくは、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団を投与することと、を含む、使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答の修飾に使用するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤であって、
ａ）対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することと、
ｂ）ステップａ）の少なくとも約１８時間後に、対象に、好ましくは、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団を投与することと、を含む、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を提供する。

ある実施形態では、免疫応答の修飾又はＴ細胞応答の修飾は、セントラルメモリー細胞（Ｔ_ＣＭ）の濃縮を含む。ある実施形態では、Ｔ_ＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＴ細胞を含む。

更なる態様では、本発明は、対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾する方法であって、
ａ）対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することと、
ｂ）対象に、樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団を投与することと、を含む、方法を提供する。

ある実施形態では、細胞の集団が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の約１８時間～約７２時間後に投与される。ある実施形態では、細胞の集団が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の約２４時間～約７２時間後に投与される。ある実施形態では、細胞の集団が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の約２４時間～約４８時間後に投与される。

本発明者らは、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性を低減させ、したがって、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発生を低減させるために使用されることができることを決定した。したがって、更なる態様では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を低減させる方法であって、対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤並びに／又はＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することを含み、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で培養されている、方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を低減させるための薬品の調製におけるＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤並びに／又はＣＡＲ－Ｔ細胞の使用であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地で培養されている、使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を低減させるのに使用するためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤並びに／又はＣＡＲ－Ｔ細胞であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地で培養されている、ＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤並びに／又はＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。

ある実施形態では、キメラ抗原受容体が、ＣＤ２８ｚ共刺激ドメインを含む。

本発明に使用することができるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の例としては、トリシリビン（ＴＣＮ）、トリシリビン５’－モノホスフェート（ＴＣＮ－Ｐ）、ＡＫＴ阻害剤ＶＩＩＩ、ＭＫ－２２０６、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ－００６８、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＧＳＫ２１１０１８３塩酸塩から選択される１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤が、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐである。

ある実施形態では、免疫細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞が、１ｋｇ当たり約２０万、１ｋｇ当たり約５０万、１ｋｇ当たり約７０万、１ｋｇ当たり約１００万、１ｋｇ当たり約１２０万、１ｋｇ当たり約１５０万、１ｋｇ当たり約１７０万、１ｋｇ当たり約２００万、１ｋｇ当たり約２２０万、１ｋｇ当たり約２５０万、１ｋｇ当たり約２７０万、１ｋｇ当たり約３００万以上の投薬量で投与される。別の実施形態では、免疫細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞が、１ｋｇ当たり約２０～５０万、１ｋｇ当たり約５０～７０万、１ｋｇ当たり約７０～１００万、１ｋｇ当たり約１００～１２０万、１ｋｇ当たり約１２０～１５０万、１ｋｇ当たり約１５０～１７０万、１ｋｇ当たり約１７０～２００万、１ｋｇ当たり約２００～２２０万、１ｋｇ当たり約２２０～２５０万、１ｋｇ当たり約２５０～２７０万、又は１ｋｇ当たり約２７０～３００万の投薬量で投与される。別の実施形態では、免疫細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞が、１ｋｇ当たり５０～２００万の投薬量で投与される。

ある実施形態では、対象が、免疫枯渇されている。免疫枯渇を提供する方法の例としては、リンパ枯渇化学療法又は放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、対象が、がん、感染症、又は炎症性疾患を有する。

ある実施形態では、感染症が、細菌、真菌、原虫、又はウイルス感染症である。ある実施形態では、感染症が、ウイルス感染症である。ある実施形態では、ウイルス感染症が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＣＢ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症などの慢性ウイルス感染症である。

ある実施形態では、対象が、がんを有する。ある実施形態では、対象が、乳がん又は結腸がんなどの固形腫瘍を有する。

ある実施形態では、対象が、低抗原存在量に関連するがんを有する。ある実施形態では、対象が、
ｉ）低ＣＤ３３＋芽球が優性である急性骨髄性白血病、又は
ｉｉ）低レベルのＣＤ１９及び／若しくはＣＤ２０を有するびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫を有する。

ある実施形態では、対象が、動物である。ある実施形態では、対象が、哺乳動物である。ある実施形態では、対象が、ヒトである。

対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、対象が、薬品の少なくとも１８時間後に、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団とともに投与される、使用も提供される。

対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団の使用であって、対象が、薬品の少なくとも１８時間前に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されるか、又は投与されている、使用も提供される。

対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、薬品が、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、使用も提供される。

対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用も提供される。

対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む、免疫細胞の集団の使用であって、対象が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されているか、又は投与される、使用も提供される。

対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団の産生に使用するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤も提供される。

対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答の修飾に使用するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤であって、対象が、薬品の少なくとも１８時間後に、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団とともに投与される、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤も提供される。

ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体の投与を更に含む。有利には、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞、好ましくは、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤で前処置されたＣＡＲ－Ｔ細胞と組み合わせたチェックポイント阻害剤の投与は、がんを有する対象又はがんを有する疑いのある対象の腫瘍成長及び／又は生存に対する相乗効果を実証する。

したがって、一態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための方法であって、対象に、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、及びチェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体を投与することを含み、好ましくは、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、方法が提供される。好ましくは、免疫細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤並びにチェックポイント阻害剤で前処置されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、任意選択的に、同時に、又は連続的に投与することを含む。この実施形態では、治療の効果（すなわち、腫瘍成長及び／又は生存）は、各治療の個々の効果と比較して相乗的である。

別の実施形態では、本方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤、並びにチェックポイント阻害剤を、任意選択的に、同時に、又は連続的に投与することを含む。この実施形態では、治療の効果（腫瘍の成長及び／又は生存に対する）は、各治療単独の個々の効果と比較して相乗的である。ある実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤で前処置されない。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための方法であって、対象に、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体並びにＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することを含む、方法が提供される。この実施形態では、治療の効果（腫瘍の成長及び／又は生存に対する）は、各治療単独の個々の効果と比較して相乗的である。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための、薬品の調製における、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、及びチェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体の使用であって、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、使用が提供される。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための、薬品の調製における、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団の使用であって、対象が、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体とともに投与されているか、又は投与され、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、使用が提供される。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための、薬品の調製における、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体の使用であって、対象が、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団とともに投与されているか、又は投与され、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、使用が提供される。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答の修飾に使用するための、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、及びチェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体であって、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、免疫細胞の集団及びチェックポイント阻害剤が提供される。

ある実施形態では、免疫応答又はＴ細胞免疫応答の修飾は、対象の生存期間を、ＣＡＲ－Ｔ細胞並びに／又はＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤を受けていない対象と比較して増加させる。ある実施形態では、生存期間は、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞並びに／又はＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤を受けていない対象と比較して、３、６、９、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６ヶ月又はそれ以上増加する。

ある実施形態では、対象は、がん、感染症、又は炎症性疾患などの疾患又は障害を有すると診断されているか、又は有する疑いがある。ある実施形態では、対象は、結腸がん又は乳がんを有すると診断されているか、又は有する疑いがある。したがって、ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象を、がん、好ましくは結腸がん若しくは乳がん、感染症、又は炎症性疾患などの疾患又は障害を有するか、又は有する疑いがあると診断するステップを含む。

ある実施形態では、本方法又は使用は、任意選択的に、化学療法、放射線療法、手術、骨髄移植、薬物療法、凍結アブレーション、又は高周波アブレーションからなる群から選択される追加の治療剤の投与を更に含み得る。

ある実施形態では、免疫細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、並びに／又はチェックポイント阻害剤は、連続的に、又は同時に投与され得る。

本発明者らはまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造プロセス中に加えて、ＡＫＴ阻害剤をアジュバントとして使用することによって、がんに対する治療の有効性が増加し得ることを有利に見出した。

したがって、ある態様では、対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞免疫応答を修飾するための方法であって、対象に、
（ｉ）免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団と、
（ｉｉ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤と、を投与することを含み、
免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、方法が提供される。

ある実施形態では、本方法は、本発明の免疫細胞を含む細胞集団を産生するステップを更に含む。

ある実施形態では、対象に投与されるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、又は約３．０ｍｇ／ｋｇ以上である。別の実施形態では、対象に投与されるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～３．０ｍｇ／ｋｇ以上である。好ましくは、対象に投与されるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の用量は、約２ｍｇ／ｋｇである。

ある実施形態では、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤は、対象に、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回以上、静脈内投与される。別の実施形態では、ＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、免疫細胞、又はチェックポイント阻害剤は、連続的に、又は同時に投与され得る。好ましくは、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の第１の用量は、免疫細胞及び／又はチェックポイント阻害剤の投与と同時に投与される。

ある実施形態では、本方法は、脾臓におけるＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増加を提供する。別の実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の存在下で培養されず、かつＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されないＴ細胞と比較して、より低いパーセンテージの調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。別の実施形態では、腫瘍Ｔ_ＲＥＧ細胞は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の存在下で培養されず、かつＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されないＴ細胞と比較して、約５０％低減する。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞免疫応答を修飾するための、薬品の調製における、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、並びにＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、使用が提供される。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための、薬品の調製における、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団の使用であって、対象が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されているか、又は投与され、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、使用が提供される。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための、薬品の調製における、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、対象が、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団とともに投与されているか、又は投与され、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、使用が提供される。

別の態様では、対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞免疫応答の修飾に使用するための、免疫細胞、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、並びにＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤であって、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、免疫細胞の集団並びにＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤が提供される。

対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答の修飾に使用するための、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団であって、対象が、薬品の少なくとも１８時間前に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されるか、又は投与されている、免疫細胞の集団も提供される。

対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤も提供される。

対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための、樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む、細胞の集団の使用であって、対象が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されているか、又は投与される、使用も提供される。

別の態様では、本発明は、免疫細胞を含む細胞集団を産生する方法であって、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含み、好ましくは、免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、骨髄細胞、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

ある実施形態では、免疫細胞は、トランスジェニックである。ある実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体を含む。ある実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）である。

ある実施形態では、本方法は、
ａ）対象から単離された免疫細胞の集団から、Ｔ細胞濃縮細胞集団を産生することと、
ｂ）Ｔ細胞濃縮細胞集団を、キメラＴ細胞受容体をコードするベクターで形質転換することと、
ｃ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で、ステップｂ）で得られた細胞を培養することと、を含む。

ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を含む。

ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも約１０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも約１５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも約２０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも約２５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも約２５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の約１０％～約６０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の約１０％～約５０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の約１０％～約４０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞の約１０％～約３０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。

ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の少なくとも約０．８％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の少なくとも約１．５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の少なくとも約２．５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の少なくとも約３．５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の少なくとも約４．５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の約０．８％～約１５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の約０．８％～約１０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の約０．８％～約５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。

ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約０．３７％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約１％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約２％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約３％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約４％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の約０．３７％～約１５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の約０．３７％～約１０％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。ある実施形態では、本方法を使用して産生される総リンパ球の約０．３７％～約５％は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である。

ある実施形態では、Ｔ_ＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＴ細胞を含む。

ある実施形態では、Ｔ_ＳＣＭ細胞は、ＣＤ２７^＋ＣＤ９５^＋Ｔ細胞を含む。

ある実施形態では、本方法は、Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞について、培養された細胞を濃縮することを更に含む。そのような細胞を細胞の集団から選択する方法は、抗体ベースの細胞選別を使用するなど、当該技術分野で既知である。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも高いパーセンテージのＴ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭを産生する。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少ないパーセンテージの調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。

ある実施形態では、Ｔ_ＲＥＧ細胞は、ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞である。

ある実施形態では、本方法は、同じ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養される場合よりも、１つ以上の炎症性サイトカインの発現が少ない細胞の集団を産生する。ある実施形態では、１つ以上の炎症性サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、又は両方である。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも高いパーセンテージのナイーブＴ細胞を産生する。

本発明者らは、本発明の方法を使用して、ウイルス感染症を標的とする改善されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生することができることを決定した。したがって、ある実施形態では、キメラ抗原受容体は、ウイルス抗原に結合する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＣＡＲ－Ｔ細胞の集団よりも高い抗ウイルス活性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を産生する。

代替の実施形態では、Ｔ細胞は、トランスジェニックではなく、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞の集団よりも高い抗ウイルス活性を有する。

別の実施形態では、本方法は、
ａ）対象から単離された免疫細胞の集団から、樹状細胞濃縮細胞集団を産生することと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を抗原に曝露することと、
ｃ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で細胞を培養することと、を含む。したがって、本発明の方法を使用して、樹状細胞ワクチンを産生することができる。ある実施形態では、抗原は、がん抗原、又はウイルス抗原などの病原体の抗原である。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同じ条件下で培養される樹状細胞よりも多くの樹状細胞を産生する。

更なる実施形態では、本方法は、
ａ）対象から単離された免疫細胞の集団から、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）濃縮細胞集団を産生することと、
ｂ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で、ステップａ）からの細胞を培養することと、を含む。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＮＫ細胞の集団よりも高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞の集団を産生する。

ある実施形態では、ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体を含み、本方法は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）濃縮細胞集団を、キメラ抗原受容体をコードするベクターで形質転換することを更に含む。

ある実施形態では、培養培地中のＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の濃度は、約０．５μＭ～９μＭ、約１μＭ～約７μＭ、約１μＭ～約５μＭ、又は約１μＭ～３μＭである。別の実施形態では、培養培地中のＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の濃度は、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、又は約９μＭである。

ある実施形態では、細胞は、動物細胞である。ある実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。ある実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

ある実施形態では、培養細胞、又は免疫細胞を含むその亜集団（目的の特定の細胞種類について更に濃縮されているなど）を対象に投与する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法を使用して産生される細胞の集団であって、好ましくは、免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生された、細胞の集団を提供する。

更なる態様では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞集団であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも１０％が、ＣＤ８＋ Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である、細胞集団を提供する。

ある実施形態では、細胞集団は、培養後に選別されないなど、選別されていない。

ある実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞の２５％未満は、Ｔ_ＲＥＧである。

ある実施形態では、免疫細胞集団、好ましくは本発明のキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、ＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、並びに／又はチェックポイント阻害剤は、医薬組成物の形態で投与される。ある態様では、したがって、本発明の免疫細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。

ある実施形態では、医薬組成物は、免疫細胞、好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団、並びにＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む。ある実施形態では、医薬組成物は、免疫細胞、好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団及びチェックポイント阻害剤を含む。

本明細書における任意の実施形態は、別段の定めがない限り、任意の他の実施形態に準用されるものとする。

本発明は、例示のみを目的とする本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。機能的に等価な産生物、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本発明の範囲内である。

本明細書全体を通して、別段の定めがない限り、又は文脈上別段の必要がない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群への言及は、１つ及び複数（すなわち、１つ以上）のそれらのステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群を包含するように解釈されなければならない。

本発明は、以下の非限定的な例によって、及び添付の図面を参照して説明される。

マウスＴ細胞の生存能力に対する様々なＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐ濃度の影響。 形質導入後のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖に対する繰り返しＴＣＮ曝露の影響。 マウスＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるセントラルメモリー表現型（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ）に対する繰り返しＴＣＮ曝露の影響。 マウスＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮγ及びＴＮＦα産生に対するＴＣＮ処置の影響。ＴＣＮ曝露で前処置されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、２：１及び１：１のエフェクター：標的比（Ａ）で同等のレベルのＩＦＮγを産生する。同様の傾向が、同じエフェクター：標的比でのＴＮＦαの放出で観察された（Ｂ）。 腫瘍抗原への曝露の非存在下での、マウスＣＡＲ－Ｔ細胞における早期活性化マーカーの発現に対する繰り返しＴＣＮ曝露の影響。ＴＣＮ前処置は、マウスＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上でＰＤ－１（Ａ）及びＣＤ６９（Ｂ）の発現を増加させた。 ＴＣＮで前処置されたマウスＣＡＲ－Ｔ細胞は、鈍化した腫瘍抗原指向性細胞傷害（Ａ）を発揮するが、ＴＣＮ前処置は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の継続的な生存に影響を及ぼさない。 ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞において、ＣＡＲ－Ｔ形質導入効率（Ｈｅｒ２^ＰＥ）は変化しなかった。 ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐのいずれかで処置したときのセントラルメモリー表現型への移行を示すフローサイトメトリー等高線図。 図８に由来する定量化フローサイトメトリーデータ（２４時間）。セントラルメモリーＴ（Ｔ_ＣＭ）細胞表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞において、平均１１％（対照、ビヒクル）から１７％（ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ）に増加し、エフェクターＴ（Ｔ_Ｅ）細胞の同時低減（８％対５％、ｎ＝３）（Ａ）を伴った。ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐ処置に対するこの応答のパターンは、３人のドナー全てにわたって保存された（Ｂ）。 ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐへの短時間の曝露（２４時間）は、エフェクターＴ（Ｔ_Ｅ）細胞のセントラルメモリーＴ（Ｔ_ＣＭ）細胞への持続した移行を少なくとも３日間もたらした。これは、３人全てのＰＢＭＣドナーにわたって一貫していた。 図１０に由来する定量化フローサイトメトリーデータ（３日）。２４時間の処置期間後、セントラルメモリーＴ（Ｔ_ＣＭ）細胞表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞において増加したままであり（９％対１６％、対照／ビヒクル対ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐ）、これは、エフェクターＴ（Ｔ_Ｅ）細胞の低減（３５％対２３％、ｎ＝３）（Ａ）を伴った。ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐ処置に対するこの応答のパターンは、３人のドナー全てにわたって保存された（Ｂ）。 ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐによる前処置は、ＣＣＲ７＋ Ｔ_ＣＭを平均９％から１６％に増加させ、ＣＣＲ７＋ Ｔ_Ｅの３５％から２３％への低減を伴った。 ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐによる前処置は、処置後２４時間で、ＣＤ４ Ｔ_ＣＭ（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）にいかなる影響も及ぼさなかった。 ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐによる前処置が、ＣＤ４＋ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ４＋ Ｔ_Ｅに影響を与えなかった、図１４に由来する定量化フローサイトメトリーデータ（２４時間）。 ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐによる前処置は、処置後２４時間で、ＣＤ４ Ｔ_ＣＭ（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）にいかなる影響も及ぼさなかった。 ＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐによる前処置が、ＣＤ４＋ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ４＋ Ｔ_Ｅに影響を与えなかった、図１５に由来する定量化フローサイトメトリーデータ（３日間）。 ＴＣＮ前処置は、ＣＡＲ－Ｔ細胞における調節Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞亜集団（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を低減した。 ＣＡＲ－Ｔ細胞機能に対するＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐ前処置のインビボ効果を測定するためのプロトコルの概要。 ＣＡＲ－Ｔ製造中のＴＣＮ－Ｐ前処置は、セントラルメモリーＴ細胞の濃縮をもたらす。２００，０００個の腫瘍細胞が乳房脂肪パットに同所移植され、２０００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞が６日後に尾静脈注射を介して投与された、Ｅ０７７１－ｈＨｅｒ２乳がんモデルの例示的な表現。腫瘍が＞１２０ｍｍ^２であったとき、又は他の人道的エンドポイントに到達したときに、動物を人道的に殺処分した（Ａ）。ＴＣＮ－Ｐ事前条件付けが、製造プロセス中にＣＤ４：ＣＤ８ Ｔ細胞比に影響を与えなかった（Ｂ、上部パネル）が、ＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ＋ セントラルメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する優先的な濃縮をもたらした（Ｂ、下部パネル）ことを示す代表的なフローサイトメトリー等高線図。動物は、同じ割合のＣＤ４：ＣＤ８ Ｔ ＣＡＲ＋細胞を受けた（Ｃ）。未処置のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与は、腫瘍体積を低減させ、動物の生存期間を２日間延長したが、腫瘍制御は、ＴＣＮ－Ｐ事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞によって最も有意に低減した。生存期間も１４日間増加した（Ｄ）。これは、生存の確率の有意な改善につながった（Ｅ、ｐ＝０．００１２）。 腫瘍成長の低減は、ＣＡＲ－Ｔ投与後の持続したセントラルメモリー表現型に対応した。動物の別個のコホートを同じ乳房腫瘍モデルに供し、全ての動物をＣＡＲ－Ｔ処置後８日目に犠牲にし、腫瘍測定を２～３日ごとに行った（Ａ）。代表的なフローサイトメトリー分析は、ＴＣＮ－Ｐによる事前条件付けが、セントラルメモリー表現型（下部パネル）を持続させながら、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｂ、上部パネル）と比較して循環ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を増加させ、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞（中央パネル）を低減させることができることを示した。腫瘍内ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は有意に変化しなかった（Ｃ）、しかしながら、より多くの数の脾臓内ＣＤ４＋ Ｔ細胞が、事前条件付けされた群で観察された（Ｄ）。腫瘍対照の変化は、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファ産生の有意な変化とは関連しなかった（Ｅ）。 循環Ｔ細胞に対するＴＣＮ－Ｐ事前条件付けの影響。事前条件付けは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞数に有意な影響を与えなかった（Ａ～Ｂ）。ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞に有意な変化は観察されなかった（Ｃ）が、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔの数は、事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物において有意により高かった（Ｄ、ｐ＝０．０００９）。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物においてより高かった（Ｅ～Ｆ、ｐ＜０．０００１）。これは、ＣＤ８＋（Ｇ、ｐ＜０．０００１）及びＣＤ４＋（Ｈ、ｐ＝０．００２９）エフェクターメモリーＴ細胞の低減と同時であった。 腫瘍内及び脾内Ｔ細胞に対するＴＣＮ－Ｐ事前条件付けの影響。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞の腫瘍内パーセンテージ及び脾内パーセンテージに有意な変化は観察されなかった（Ａ、Ｃ）。ＣＤ１０１＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍内パーセンテージに変化は観察されなかったが（Ｂ）、ＣＤ１０１＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の脾内レベルは、事前条件付けされた群においてより低く、事前条件付けが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞における枯渇に対する保護効果を付与したことを示唆した（Ｄ）。 ＰＤ－１チェックポイント阻害薬と組み合わせたＴＣＮ－Ｐ事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍に対する抗腫瘍有効性を改善する。Ａ）Ｈｅｒ２＋トランスジェニックマウスに２．５^ｅ５Ｅ０７７１－ｈＨｅｒ２を接種した。マウスを、腫瘍接種の５日後に、２０ｍｍ^２の平均腫瘍サイズを有するように無作為に割り付けた。それらは、未処置のままに放置したか、又は以下の療法で処置した：抗ＰＤ－１（ａＰＤ１）、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞＋２Ａ３）、抗ＰＤ－１を有するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ＋ａＰＤ１）、ＴＣＮ－Ｐ事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰＴＸ－２＋２Ａ３）、及び抗ＰＤ－１チェックポイント阻害薬と組み合わせたＴＣＮ－Ｐ事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰＴＸ－２＋ａＰＤ１）。腫瘍成長を２～３日ごとに測定した（ｍｍ^２）。各処置群は、６匹のマウスからなる。Ｂ）これらの処置におけるマウスの生存曲線。 ＣＡＲ－ＴのネオアジュバントとしてのＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐのインビボ有効性を測定するためのプロトコルの概要。 ＴＣＮ－Ｐのアジュバント効力。Ｈｅｒ２＋トランスジェニックマウスに２．５^ｅ５ＭＣ－３８－ｈＨｅｒ２を接種した。マウスを、腫瘍接種の５日後に、２０ｍｍ２の平均腫瘍サイズを有するように無作為に割り付けた。処置として、３～４日ごとに、５、２５又は５０ｍｇ／ＫｇでＤＭＳＯ（ビヒクル対照）又はＴＣＮ－Ｐのいずれかを腹腔内注射した。腫瘍成長を２～３日ごとに測定した（ｍｍ^２）。各処置群は、６匹のマウスからなる。ＴＣＮ－Ｐは、投薬量依存性の抗腫瘍効果を有する。 ＴＣＮ－Ｐは、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性を増強する。Ａ）Ｈｅｒ２＋トランスジェニックマウスに２．５^ｅ５ＭＣ－３８－ｈＨｅｒ２を接種した。それらを、腫瘍接種の５日後に、２０ｍｍ^２の平均腫瘍サイズを有するように無作為に割り付けた。それらを、未処置のまま放置したか、又は３～４日ごとにＴＣＮ－Ｐ（２５ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内注射、２０^ｅ６抗ヒトＨｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注射、及び２０×１０^６抗ヒトＨｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞と２５ｍｇ／ＫｇのＴＣＮ－Ｐとを静脈内注射（３～４日ごとに注射）の併用処置を含む処置レジメンの対象とした。腫瘍成長を２～３日ごとに測定する（ｍｍ^２）。各処置群は、６匹のマウスからなる。Ｂ）個々のマウスの腫瘍成長（Ｎ＝６／処置群）。Ｃ）ＴＣＮ－Ｐは、固形ＭＣ－３８－ｈＨｅｒ２腫瘍を保有するマウスの生存を向上させる。ＣＡＲ－Ｔ細胞とＴＣＮ－Ｐ（２５ｍｇ／Ｋｇ）の併用療法を受けた腫瘍保有マウスは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のみでの処置と比較して、生存期間中央値が６日間増加したことを示した。 ＣＡＲ－Ｔ治療のためのアジュバントとしてのＴＣＮ－Ｐ。ＣＡＲ－Ｔ治療及び３日ごとのアジュバントＴＣＮ－Ｐ同時投与の開始の約６日前に、２５０，０００個のＭＣ－３８腫瘍細胞を皮下移植するＭＣ－３８結腸がんモデルの例示的な表現（Ａ）。暫定データは、ＴＣＮ－Ｐアジュバント療法が、ＣＡＲ－Ｔ指向性腫瘍低減を有意に改善した（＊ｐ＜０．０５）が、最も有効なレジメンは、ＴＣＮ－Ｐアジュバント及びＴＣＮ－Ｐ事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞の併用であったことを示す。 Ａ）ＴＣＮ－Ｐ前処置及びＴＣＮ－Ｐアジュバント療法の併用は、処置後１４日目までに、脾臓におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞の有意な蓄積及び／又は拡大をもたらした（ｐ＜０．０００１）。Ｂ）ＴＣＮ－Ｐの投与により、腫瘍内Ｔｒｅｇが５０％低減した。

一般的な技法及び定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有すると解釈されるものとする（例えば、細胞培養、分子遺伝学、ＣＡＲ－Ｔ技術、免疫学、及び生化学）。

別段の指示がない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、並びにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂を含む）などの情報源の文献全体で記載及び説明されている。

「及び／又は」、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味又はいずれかの意味を明示的にサポートするように解釈されるものとする。

本明細書で使用される場合、反対に述べられない限り、約という用語は、指定された値の＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％を指す。

本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群を含めることを暗示するが、任意の他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群を除外することを暗示しないことが理解される。

本出願で使用される場合、「又は」という用語は、排他的な「又は」ではなく、包括的な「又は」を意味することが意図される。すなわち、特に指定されない限り、又は文脈から明らかでない限り、「ＸはＡ又はＢを採用する」は、自然な包括的順列のいずれかを意味することが意図される。すなわち、ＸがＡを採用する、ＸがＢを採用する、又はＸがＡ及びＢの両方を採用する場合、「ＸがＡ又はＢを採用する」は、前述の例のいずれかの下で満たされる。更に、Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ、並びに／又は同様のものは、一般に、Ａ若しくはＢを意味するか、又はＡ及びＢの両方を意味する。加えて、本出願及び添付の特許請求の範囲で使用される「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、特に指定されない限り、又は単数形を指すことが文脈から明確でない限り、一般に「１つ以上」を意味すると解釈され得る。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物であり得る。一実施形態では、動物は、脊椎動物である。例えば、動物は、哺乳動物、鳥類、脊索動物、両生類、又は爬虫類であり得る。例示的な対象には、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。ある実施形態では、本発明の方法は、獣医使用のためのものである。

対象の「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患若しくは状態、疾患若しくは状態の症状、又は疾患若しくは状態のリスク（若しくは感受性）を遅延させる、減速させる、安定化させる、治す、治癒する、緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、緩和する（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更する、是正する、悪化を軽減させる、改善する、向上させる、又は影響を与えることを目的として、本発明の免疫細胞の集団、又はその組成物を適用又は投与することを含む。「治療すること」という用語は、軽減、寛解、悪化の速度の減少、疾患の重症度の減少、安定化、症状の減少、又は傷害、病理学的状態若しくは状態を対象に対してより許容可能にすること、変性若しくは減少の速度の遅延、変性の最終点を衰弱しにくくすること、又は対象の身体的若しくは精神的幸福を向上させることなどの任意の客観的若しくは主観的パラメータを含む、傷害、病理学的状態、又は状態の治療又は改善の成功の任意の徴候を指す。

本明細書で使用される場合、「予防すること」又は「予防」は、疾患又は障害を獲得するリスク（又は疾患若しくは障害に対する感受性）の可能性の少なくとも低減（すなわち、疾患に曝露され得るか、又は疾患の素因となり得るが、疾患の症状をまだ経験していないか、又は表示していない患者において、疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つを発症させないこと）を指すことを意図している。そのような患者を同定するための生物学的及び生理学的パラメータが本明細書に提供され、医師によっても周知である。例えば、乳がんを有することが疑われる対象の場合、対象は、がんの家族歴を有し得、がんを引き起こす可能性が高いが、疾患の明らかな症状を示さない突然変異を有すると同定されている。この場合、本発明の免疫細胞又はその組成物は、対象における疾患（例えば、乳がん）に関連する１つ以上の症状の発現を予防するのに有用性を有すると企図される。

本明細書で使用される場合、「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法、治療用抗体、及びハプロ同一同種移植と関連している、発熱及び多臓器機能障害を特徴とする急性全身性炎症症候群を指す。

本明細書で使用される場合、「濃縮された集団」又はその変形は、対象から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団などの、細胞の開始集団からいくつかの種類の細胞を除去するか、又は少なくともその表現を低減させるように処理された細胞の集団を指す。特定の細胞型を正又は負に選択する方法は、濃縮又は除去される特定の細胞型の細胞表面タンパク質に選択的に結合する抗体を含む磁気ビーズを使用するなど、当該技術分野で周知である。ある実施形態では、出発細胞集団（ＰＢＭＣなど）と比較した場合、集団が濃縮されている細胞型は、出発集団と比較して、濃縮された集団において、例えば、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、又は５０倍以上の表現を有する。

本明細書で使用される場合、「同一の条件」という用語は、同じ細胞集団が、亜集団のうちの１つに対する阻害剤の存在とは別に、全く同じ培養手順に曝露されたときに、例えば、２つの同一の亜集団に分割することを意味する相対的な用語である。

本明細書で使用される「併用療法」、「併用投与」、又は「同時投与」などの用語は、選択された治療剤の単一の対象への投与を包含することを意味し、薬剤が、同じ若しくは異なる投与経路によって、又は同じ若しくは異なる時間に投与される治療レジメンを含むことを意図している。

阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＰＨドメインタンパク質」という用語は、ＰＨドメインを含むタンパク質を指す。プレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）又は（ＰＨＩＰ）は、細胞内シグナル伝達に関与する、又は細胞骨格の構成要素としての多数のタンパク質に存在する、約１００～１２０個のアミノ酸のタンパク質ドメインである。全て、Ｎ末端プレクストリンＰＨドメインのＮＭＲ構造において最初に観察された同じβ－サンドイッチ折り畳み構造を共有する。タンパク質のアミノ末端半分は、β３／β４ループ内の追加の短いαヘリックス（βスペクトリンＰＨドメインに特異的）を伴って、４本鎖βシートを形成する。タンパク質のもう一つの半分は、第１のシートにほぼ直交するβシート蛇行（β５～β７鎖）を形成する。２枚のシートは、ドメインの疎水性コアで満たされている「サンドイッチ」を形成する。一実施形態では、ＰＨドメインタンパク質は、小Ｇタンパク質である。別の実施形態では、ＰＨドメインタンパク質は、セリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼである。別の実施形態では、ＰＨドメインタンパク質は、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）である。別の実施形態では、ＰＨドメインタンパク質は、Ｇタンパク質受容体キナーゼである。本発明の方法を使用して阻害され得るＰＨドメインタンパク質の例には、オキシステロール結合タンパク質１、オキシステロール結合タンパク質２、スペクトリンベータ鎖、非赤血球１、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質２７、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＡＫＴ、又はそれらの１つ以上の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本発明に有用なＰＨドメインタンパク質の阻害剤の例としては、Ｄ－３－デオキシ－ミオ－イノシトール、例えばＤ－３－デオキシ－ホスファチジル－ミオ－イノシトール１－［（Ｒ）－２－メトキシ－３－オクタデシルオキシプロピルリン酸水素］（ＤＰＩＥＬ、ＰＸ－３１６）などのホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体（ＰＩＡ）；エデルホシン、ミルテホシン、及びペリホシンなどのアルキルリン脂質（ＡＰＬ）；Ｉｎｓ（１，３，４，５，６）ペンタキスリン酸（ＩＰ５）、Ｉｎｓ（１，４，５，６）テトラキスリン酸（ＩＰ４）、フィチン酸（ＩＰ６）、２－Ｏ－ベンジー－ｍｙｏ－イノシトール１，３，４，５，６－ペンタキスリン酸（２－Ｏ－Ｂｎ－ＩｎｓＰ_５）、ジホスホイノシトールペンタキスリン酸（５－ＰＰ－ＩＰ５）などのイノシトールリン酸（ＩＰ）；イノシトールリン酸－６－キナーゼ１（ＩＰ６Ｋ１）；ジアゾ－スルホ－アミド阻害剤、例えばＮＳＣ３４８９００（ＰＨ－３１６）及び４－ドデシル－Ｎ－（１，３，４－チアジアゾール－２－イル）ベンゼンスルホンアミド（例えばＰＨ－４２７）などのスルホンアミド；トリシリビン（三環式ジヌクレオシド、ＮＳＣ１５４０２０、ＴＣＮ、ＡＫＴ／ＰＫＢシグナル伝達阻害剤－２、ＡＰＩ－２）、トリシリビンホスフェート（ＮＳＣ２８０５９４；トリシリビン５’－モノホスフェート；ＴＣＮ－Ｐ）、ＡＰＩ－１（ＮＳＣ１７７２２３－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン）などのプリン／ピリミジン類似体；Ｔｒｐ８０（例えば、ＭＫ－２２０６、ＳＣ６６）、チルカリ酸、ＰＩＴｅｎｉｎ（ＰＩＴ）、ペプチド模倣物（例えば、ＮＨ２－ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ－ＣＯＯＨなどのＡＫＴ－ｉｎ）、１，２，３－トリアゾール－４－イルメタノールベースのアンタゴニストを介してＰＨドメイン内でのみ相互作用するアロステリック化合物などの他の阻害剤、並びにそれらの塩、エステル、類似体、変異体、及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＰＨドメインタンパク質阻害剤は、トリシリビン（ＴＣＮ）又はトリシリビン５’－モノホスフェート（ＴＣＮ－Ｐ）である。

タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られるＡＫＴは、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写、及び細胞移動などの複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすセリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼである。ＡＫＴ１は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路及び他のシグナル伝達経路に関与する。本発明で使用するためのＡＫＴ阻害剤の例としては、ＭＫ－２２０６ ２ＨＣｌ（８－［４－（１－アミノシクロブチル）フェニル］－９－フェニル［１，２，４］トリアゾロ［３，４］－ｆ］［１，６］ナフト－ヒリジン－３（２Ｈ）－オン二塩酸塩）；ペリホシン（１，１－ジメチル－４［（オクタデシルオキシ）ヒドロキシホスフィニル］オキシ］－ピペリジニウム内部塩、ＫＲＸ－０４０１）；ＧＳＫ６９０６９３（４－［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－７－［［（３Ｓ）－ピペリジン－３－イル］メトキシ］イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－４－イル］－２－メチルブト－３－イン－２－－オール）；イパタセルチブ（（２Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－１－｛４－［（５Ｒ，７Ｒ）－７－ヒドロキシ－５－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル］－１－ピペラジニル｝－３－（イソプロピルアミノ）－１－プロパノン－、ＧＤＣ－００６８）；ＡＺＤ５３６３（４－アミノ－Ｎ－［（１Ｓ）－１－（４－クロロフェニル）－３－ヒドロキシプロピル］－１－（７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］－ピリミジン－４－イル）ピペリジン－４－カルボキサミド）；ＰＦ－０４６９１５０２（２－アミノ－８－［４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシピリジン－３－イル）－４－メチルピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オン）；ＡＴ７８６７（４－（４－クロロフェニル）－４－［４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル］ピペリジン）；トリシリビン（５－メチル－１－（β－Ｄ－リボフラノシル）－１，５－ジヒドロ－１，４，５，６，８－ペンタアザアセナフチレン－３－アミン）；トリシリビン５’－モノホスフェート；ＣＣＴ１２８９３０（４－（４－クロロベンジル）－１－（７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イル）－４－ピペリジンアミン）－；Ａ－６７４５６３（（２Ｓ）－１－［５－（３－メチル－２Ｈ－インダゾール－５－イル）ピリジン－３－イル］オキシ－３－フェニルプロパン－２－アミン）；ＰＨＴ－４２７（４－ドデシル－Ｎ－（１，３，４－チアジアゾール－２－イル）ベンゼンスルホンアミド）；ＡＫＴｉ－１／２（３－［１－［［４－（７－フェニル－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｇ］キノキサリン－６－イル）フェニル］メチル］ピペリジン－４－イル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－オン）；アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３、Ｎ－［（２Ｓ）－１－アミノ－３－（３－フルオロフェニル）プロパン－２－イル］－５－クロロ－４－（４－クロロ－２－メチルピラゾール－３－イル））チオフェン－２－カルボキサミド）；ＡＴ１３１４８（（１Ｓ）－２－アミノ－１－（４－クロロフェニル）－１－［４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル］エタノール）；［０１８９］ミルテホシン（ヘキサデシル２－（トリメチルアザニウムミル）エチルホスフェート）；ホノキオール（２－（４－ヒドロキシ－３－プロパ－２－エニルフェニル）－４－プロパ－２－エニルフェノール）；ＴＩＣ１０類似体（２，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロ－１０－［（２－メチルフェニル）メチル］－７－（フェニルメチル）－イミダゾ［１，２－ａ］ピリド［４，３－ｄ］ピリミジン－５（３Ｈ）－オン）；ＡＫＴ阻害剤ＶＩＩＩ（１，３－ジヒドロ－１－（１－（（４－（６－フェニル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｇ］キノキサリン－７－イル）フェニル）メチル）－４－ピペリジニル）－２Ｈ－ベンズイミダゾール－２－オン）；ウプロセルチブ（ＧＳＫ２１４１７９５）；ＴＩＣ１０（２，４，６，７，８，９－ヘキサヒドロ－４－［（２－メチルフェニル）メチル］－７－（フェニルメチル）－イミダズ－オ［１，２－ａ］ピリド［３，４－ｅ］ピリミジン－５（１Ｈ）－オン）；カピバセルチブ（ＡＺＤ５３６３）及びＭＳ－２２２（エチル－３－アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩）、並びにそれらの塩、エステル、類似体、変異体、及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、トリシリビン、トリシリビン５’－モノホスフェート、ＡＫＴ阻害剤ＶＩＩＩ、ＭＫ－２２０６、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ－００６８、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＧＳＫ２１１０１８３塩酸塩、並びにそれらの塩、エステル、類似体、変異体、及び誘導体である。ある実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、トリシリビン（ＴＣＮ）又はトリシリビン５’－モノホスフェート（ＴＣＮ－Ｐ）である。

ＡＫＴ及び／又はＰＨドメインタンパク質の活性の阻害は、１００％未満、例えば、約１０％～約９５％、例えば、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は活性の別のパーセント阻害、例えば、約１０％～約９５％であり得る。阻害剤は、例えば、小分子、ペプチド、タンパク質（抗体など）、核酸、又はそれらの組み合わせであり得る。

免疫細胞
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という語句は、抗原の認識時に免疫応答に影響を及ぼすか、又は免疫応答を誘導することができる細胞を指す。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、骨髄細胞、又は樹状細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、それらが投与される対象に対して自己又は同種であり得る。ある実施形態では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞などのＣＡＲ発現細胞の集団を提供する。

本明細書で使用される場合、「免疫応答を修飾する」又は「Ｔ細胞免疫応答を修飾する」という語句は、抗原の認識時に免疫応答を誘導又は増加させる免疫細胞又はＴ細胞の能力を指す。免疫応答又はＴ細胞応答のそのような修飾は、本明細書に記載されるがん、感染症、又は炎症性疾患の治療に十分であると理解されるであろう。

本明細書で使用される場合、「細胞傷害性活性」という語句は、ＮＫ細胞などの免疫細胞が生細胞を破壊する能力を指す。

本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、体液性免疫及び細胞性免疫の両方を含む。免疫応答は、抗抗原抗体の発症、抗原特異的Ｔ細胞の拡大、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増加、抗腫瘍又は抗腫瘍抗原遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答の発症、病原体のクリアランス、病原体及び／又は腫瘍の成長及び／又は広がりの抑制、腫瘍低減、転移の低減又は排除、再発までの時間の増加、病原体又は腫瘍を含まない生存期間の増加、並びに生存時間の増加のうちの１つ以上として現れることができる。免疫応答は、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、単球、及び／又はマクロファージ）の活性化、サイトカイン産生、ケモカイン産生、特異的細胞表面マーカー発現、特に共刺激分子の発現のうちの１つ以上によって媒介され得る。免疫応答は、体液性、細胞性、Ｔｈ１若しくはＴｈ２応答、又はそれらの組み合わせを特徴とし得る。ある実施形態では、免疫応答は、自然免疫応答である。

Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することによって、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞にはいくつかのサブセットがあり、各々が異なる機能を有する。

ある実施形態では、Ｔ細胞は、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）Ｔ細胞であるか、又はそれを含む。Ｔ_ＣＭ細胞は、リンパ節を巡回し、既知の病原体に対するセントラル免疫サーベイランスを提供するが、一次組織免疫サーベイランスを行うものとして説明されていない。ある実施形態では、本発明の方法を使用して産生されるＴ_ＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＴ細胞を含む。そのような細胞はまた、ＣＣＲ７＋であり得る。

ある実施形態では、Ｔ細胞は、セントラルメモリー幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞であるか、又はそれを含む。Ｔ_ＳＣＭ細胞は、幹細胞様の自己再生能力、並びにメモリー及びエフェクターサブセットの全スペクトルを再構成する多能性能力を備えた、メモリーリンパ球のまれなサブセットである。ある実施形態では、Ｔ_ＳＣＭ細胞は、ＣＤ２７^＋ＣＤ９５^＋Ｔ細胞を含む。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも高いパーセンテージのＴ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭを産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約２５％多いセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約５０％多いセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約７５％多いセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも、約２５％～約９０％多くのセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を産生する。

本明細書で使用される場合、調節Ｔ細胞（Ｔ_ＲＥＧ）又はその変形は、免疫寛容の維持に重要であるＴ細胞の集団を指す。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞媒介免疫をシャットダウンし、胸腺内の負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋ Ｔ_ＲＥＧ細胞の２つの主要なクラス－Ｆｏｘｐ３＋及びＦｏｘｐ３－が記載されている。

ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少ないパーセンテージの調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約５％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約１０％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約１５％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約２０％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約２５％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも約５％～約３０％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、本方法は、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも約５％～約２５％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、Ｔ_ＲＥＧ細胞は、ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞である。

本明細書で使用される場合、「ナイーブＴ細胞」という用語は、成熟し、胸腺によって放出されたが、対応する抗原にまだ遭遇していないＴ細胞の集団を指す。言い換えれば、ナイーブＴ細胞は、成熟と活性化との間の段階にある。ナイーブＴ細胞は、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）及びＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）の表面発現、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ４４、又はＣＤ６９の非存在、及びメモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在を一般に特徴としている。それらはまた、サブユニットＩＬ－７受容体－α、ＣＤ１２７、及びコモン－γ鎖、ＣＤ１３２からなる機能的ＩＬ－７受容体を発現する。

機能的内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を欠くＴ細胞は、例えば、その表面上にいかなる機能的ＴＣＲも発現しないように操作されてもよく、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作されてもよく、又はその表面上にほとんど機能的ＴＣＲを産生しないように操作されてもよい。代替的に、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットのうちの１つ以上の変異形態又は切断形態の発現によって、実質的に障害のあるＴＣＲを発現することができる。「実質的に障害のあるＴＣＲ」という用語は、このＴＣＲが、宿主において有害な免疫反応を誘発しないことを意味する。

本明細書に記載のＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作されることができる。例えば、本明細書に記載のＴ細胞は、Ｔ細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩが下方調節されるように操作されることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ及び機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩを欠くことができる。

機能的ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を欠く修飾されたＴ細胞は、ＴＣＲ又はＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の好適な手段によって得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用したＴＣＲ及び／又はＨＬＡのノックダウンを含むことができる。

ナチュラルキラー細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、感染した細胞及び形質転換された細胞を殺傷することができるＣＤ５６ ＣＤ３大顆粒リンパ球であり、先天性免疫系の重要な細胞サブセットを構成する。細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対する細胞傷害を発揮し、ＭＨＣ－Ｉ－陰性細胞を根絶することもできる。ある実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ＣＤ１２７－ＮＫｐ４６＋Ｔ－ｂｅｔ＋Ｅｏｍｅｓ＋である。ある実施形態では、細胞傷害性ＮＫ細胞ＣＤ５６^ｄｉｍ ＣＤ１６＋。

樹状細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。樹状細胞は、ＣＤ３４＋幹細胞から骨髄に起源し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現する、特化された抗原提示細胞の異質の群である。成熟樹状細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などのエフェクター免疫細胞をプライミング、活性化、及び拡大することができる。樹状細胞療法は、当該分野で既知である（例えば、Ｓａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７を参照されたい）。簡潔に述べると、樹状細胞は、患者から単離されてもよく、疾患特異的抗原、例えば、がん特異的抗原に曝露されてもよく、又はＣＡＲ若しくは疾患特異的抗原を発現するように遺伝子改変されてもよく、次いで、患者に戻して注入されて、エフェクター免疫細胞、例えば、Ｔ細胞をプライミング、活性化、及び拡大する。

骨髄細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、骨髄細胞である。顆粒球、単球、マクロファージ、及び樹状細胞は、集合的に骨髄細胞と呼ばれる白血球のサブグループを表す。それらは、血液及びリンパ系を通して循環し、様々なケモカイン受容体を介して、組織損傷及び感染の部位に迅速に動員される。組織内で、それらは、貪食及び炎症性サイトカインの分泌のために活性化され、それによって保護免疫において主要な役割を果たす。骨髄細胞療法は、当技術分野で既知であり、がん、感染症、又は疾患の治療に有用であり得る。例えば、骨髄細胞は、腫瘍間質に豊富であることが知られており、これらの細胞の存在は、多くのがん型において患者の転帰に影響を及ぼし得る。簡潔に述べると、骨髄細胞は、患者から単離されてもよく、疾患特異的抗原、例えば、がん特異的抗原に曝露されてもよく、又はＣＡＲ若しくは疾患特異的抗原を発現するように遺伝子改変されてもよく、次いで、患者に戻して注入されて、エフェクター免疫細胞、例えば、Ｔ細胞をプライミング、活性化、及び拡大する。

マクロファージ
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、マクロファージである。マクロファージは、組織マクロファージ、抗原提示樹状細胞、及び骨再吸収破骨細胞に分化する骨髄由来の単球前駆細胞から生じる骨髄系細胞である。マクロファージ細胞療法は、当技術分野で既知であり、がん、感染症、又は疾患の治療に有用であり得る。簡潔に述べると、マクロファージは、患者から単離されてもよく、疾患特異的抗原、例えば、がん特異的抗原に曝露されてもよく、又はＣＡＲ若しくは疾患特異的抗原を発現するように遺伝子改変されてもよく、次いで、患者に戻して注入されて、エフェクター免疫細胞、例えば、Ｔ細胞をプライミング、活性化、及び拡大する。

キメラ抗原受容体
「キメラ抗原受容体」又は代替的に「ＣＡＲ」という用語は、ポリペプチド又はポリペプチドのセットを指し、これは、免疫細胞内にあるとき、標的Ｔ細胞、例えば、がん細胞に対する特異性、及び細胞内シグナル生成を、細胞に提供する。

ＣＡＲを使用して、選択された標的に特異的なＴ細胞、樹状細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞を生成することができる。ＣＡＲを生成するための好適な構築物は、ＵＳ５，８４３，７２８、ＵＳ５，８５１，８２８、ＵＳ５，９１２，１７０、ＵＳ６，００４，８１１、ＵＳ６，２８４，２４０、ＵＳ６，３９２，０１３、ＵＳ６，４１０，０１４、ＵＳ６，７５３，１６２、ＵＳ８，２１１，４２２、及びＷＯ９２１５３２２に記載されている。代替的なＣＡＲ構築物は、連続した世代に属するものとして特徴付けることができる。第一世代ＣＡＲは、典型的には、抗原に特異的な抗体の一本鎖可変断片からなり、例えば、柔軟なリンカー、例えば、ＣＤ８ａヒンジドメイン及びＣＤ８ａ膜貫通ドメインによって、ＣＤ３Ｃ又はＦｃＲｙ又はｓｃＦｖ－ＦｃＲｙのいずれかの膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結された、特定の抗体のＶＨに連結されたＶＬを含む（例えば、ＵＳ７，７４１，４６５、ＵＳ５，９１２，１７２、及びＵＳ５，９０６，９３６を参照されたい）。第二世代ＣＡＲは、エンドドメイン内のＣＤ２８、ＣＤ２８ｚ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの１つ以上の共刺激分子の細胞内ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８／ＯＸ４０／４ＢＢ－ＣＤ３（例えば、ＵＳ８，９１１，９９３、ＵＳ８，９１６，３８１、ＵＳ８，９７５，０７１、ＵＳ９，１０１，５８４、ＵＳ９，１０２，７６０、ＵＳ９，１０２，７６１を参照されたい）を組み込む。第三世代ＣＡＲは、ＣＤ３Ｃ鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩ ｌａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、又はＣＤ２８シグナル伝達ドメインなどの共刺激エンドドメイン、例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４ＢＢ－ＣＤ３Ｃ又はｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３Ｑの組み合わせを含む（例えば、ＵＳ８，９０６，６８２、ＵＳ８，３９９，６４５、ＵＳ５，６８６，２８１、ＷＯ２０１４／１３４１６５、及びＷＯ２０１２／０７９０００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、共刺激は、共刺激とともに、例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞上の抗原との相互作用に続いて、活性化及び拡大されるように選択される抗原特異的Ｔ細胞においてＣＡＲを発現することによって調整されることができる。例えば、Ｔ細胞攻撃の標的化を改善し、かつ／又は副作用を最小限に抑えるために、追加の操作された受容体を免疫細胞に提供することができる。

ＣＡＲ発現細胞を調製する方法
細胞の供給源
拡大、及び可能な遺伝子改変又は他の修飾の前に、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はそれらの組み合わせなどの免疫細胞を含むか、又はそれらからなる細胞集団を、対象から得ることができる。免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍などのいくつかの供給源から得ることができる。

本開示のある特定の実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技法を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。好ましい一実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、樹状細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって回収された細胞は、血漿画分を除去するために、かつ任意選択的に、後続の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液又は培地に配置するために、洗浄され得る。一実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないが多くの二価カチオンを欠き得る。

カルシウムの非存在下での最初の活性化ステップは、増幅された活性化につながる可能性がある。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄ステップは、製造元の指示に従い、半自動「フロースルー」遠心分離器（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することによるなど、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、例えば、無Ｃａ、無Ｍｇ ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、又は緩衝液の有無にかかわらず他の生理食塩溶液などの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁され得る。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁し得る。

本出願の方法は、５％以下、例えば２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用することができ、公知の培養培地条件及び組成物、例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）に記載されるものを採用することができることが認識される。

一実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離又は対向流遠心溶出法によって、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。

本明細書に記載の方法は、例えば、Ｔ調節細胞枯渇集団である免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の特定の亜集団の選択を含むことができる。例えば、ＣＤ２５＋の枯渇した細胞集団は、例えば、本明細書に記載の負の選択技術を使用して得ることができる。好ましくは、Ｔ調節枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。しかしながら、本明細書で考察されるように、本発明の方法で使用されるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤のみで、培養中にＴ_ＲＥＧ細胞を低減させることができる。

一実施形態では、Ｔ調節（Ｔ_ＲＥＧ）細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体若しくはその断片、又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ－２を使用して集団から除去される。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体若しくはその断片、又はＣＤ２５結合リガンドは、基質、例えばビーズにコンジュゲートされるか、又はそれ以外の場合、基質、例えばビーズ上にコーティングされる。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体又はその断片は、本明細書に記載の基質にコンジュゲートされる。

特定の理論に拘束されることを望むものではないが、アフェレーシスの前に、又はＣＡＲ発現細胞産物の製造中に、対象における免疫細胞の負の調節因子のレベルを低下させること（例えば、望ましくない免疫細胞、例えば、Ｔ_ＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、対象の再発のリスクを低減させることができる。例えば、Ｔ_ＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当技術分野で知られている。Ｔ_ＲＥＧ細胞を減少させる方法には、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書に記載される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５－枯渇、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞の製造前にＴ_ＲＥＧ細胞の数を低減させる（例えば、枯渇させる）ことを含む。例えば、製造方法は、試料、例えば、アフェレーシス試料を、抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（又はその断片、若しくはＣＤ２５結合リガンド）と接触させて、例えば、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物を製造する前に、Ｔ_ＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。

ある実施形態では、本発明の方法は、培養細胞を選別して、ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＣＲ７－ ＣＤ６２Ｌ－ Ｔメモリー細胞を単離することを含まない。

刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄ステップの後に凍結することもできる。理論に拘束されないことを望むと、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団内の顆粒球及びある程度の単球を除去することによって、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞は、凍結溶液に懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメータが、当該技術分野で知られており、この文脈では有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、又は１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、若しくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、並びに７．５％のＤＭＳＯを含む培養培地、又は例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを伴い、次いで、細胞を、１分間当たり１°の速度で－８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保管する。制御凍結の他の方法も、－２０℃間近での又は液体窒素中での未制御凍結とともに使用され得る。

ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を本明細書に記載されるように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用して活性化する前に室温で１時間休ませる。

本発明の文脈において、本明細書に記載の拡大された細胞が必要とされ得る前の期間の、対象からの血液試料又はアフェレーシス産物の収集も企図される。したがって、拡大される細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、本明細書に記載のものなど、免疫細胞療法から利益を得るであろう任意の数の疾患又は状態のための免疫細胞療法において後で使用するために、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離及び凍結することができる。一実施形態では、血液試料又はアフェレーシスは、概して健康な対象から採取される。ある特定の実施形態では、血液試料又はアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるがまだ疾患を発症していない概して健康な対象から採取され、目的の細胞は、単離され、後で使用するために凍結される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、拡大され、凍結され、後で使用され得る。ある特定の実施形態では、試料は、本明細書に記載される特定の疾患の診断直後に、任意の治療の前に患者から収集される。更なる実施形態では、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線などの薬剤、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、又はＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線などの他の免疫除去剤による治療を含むが、それに限定されない、任意の数の関連する治療様式の前に、対象からの血液試料又はアフェレーシスから単離される。

ＣＡＲ発現細胞を作製する方法
ある実施形態では、本発明の方法は、ＣＡＲをコードするベクター又は核酸を細胞に導入することによって、ＣＡＲ発現細胞を作製することを含む。遺伝子を細胞に導入及び発現させる方法は、当該技術分野で知られている。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって、宿主Ｔ細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫Ｔ細胞に容易に導入されることができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主Ｔ細胞に移入されることができる。

宿主Ｔ細胞中にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ポリヌクレオチドを宿主Ｔ細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。

目的のポリヌクレオチドを宿主Ｔ細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る（例えば、ＵＳ５，３５０，６７４及びＵＳ５，５８５，３６２を参照されたい）。

ポリヌクレオチドを宿主Ｔ細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子又は他の好適なサブミクロンサイズの送達系によるポリヌクレオチドの送達などの、核酸の最先端の標的化送達の他の方法が利用可能である。

例示的な非ウイルス送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤の使用は、核酸の宿主Ｔ細胞への導入（インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）のために企図される。別の実施形態では、核酸は、脂質と関連し得る。脂質に関連する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在されてもよく、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方に関連している連結分子を介してリポソームに結合されてもよく、リポソームに捕捉されてもよく、リポソームと複合体化されてもよく、脂質を含有する溶液に分散されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質中に懸濁液として含有されてもよく、ミセルに含有されるか、若しくはそれと複合体化されてもよく、又はそうでなければ脂質と関連していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ、又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造に、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液中に散在されてもよく、場合によっては、サイズ又は形状が均一ではない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質か、又は合成脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質としては、細胞質内に天然に存在する脂肪液滴、並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物のクラスが挙げられる。使用に好適な脂質を、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができ、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保管することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される様々な単層及び多層脂質ビヒクルを包含する一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。

多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が、過剰な水溶液に懸濁されるときに自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再構成され、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を捕捉する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を想定するか、又は単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。リポフェクタミン核酸複合体も企図される。宿主Ｔ細胞に外因性核酸を導入するために使用される方法にかかわらず、又はそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主Ｔ細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを行い得る。かかるアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって、又は本明細書に記載されるアッセイによって、特定のペプチドの存在又は非存在を検出して、本発明の範囲に入る薬剤を同定することなどの「生化学的」アッセイが挙げられる。

免疫細胞を培養及び拡大させる方法
Ｔ細胞などの免疫細胞は、一般に、例えば、ＵＳ６，３５２，６９４、ＵＳ６，５３４，０５５、ＵＳ６，９０５，６８０、ＵＳ６，６９２，９６４、ＵＳ５，８５８，３５８、ＵＳ６，８８７，４６６、ＵＳ６，９０５，６８１、ＵＳ７，１４４，５７５、ＵＳ７，０６７，３１８、ＵＳ７，１７２，８６９、ＵＳ７，２３２，５６６、ＵＳ７，１７５，８４３、ＵＳ５，８８３，２２３、ＵＳ６，９０５，８７４、ＵＳ６，７９７，５１４、ＵＳ６，８６７，０４１、及びＵＳ２００６／０１２１００５に記載の方法を使用して活性化及び拡大され得る。

本明細書に開示される方法によってＴ細胞を拡大することは、細胞を約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍又はそれ以上、及びそれらの間の全ての整数又は部分整数増殖させることができる。一実施形態では、Ｔ細胞は、約２０倍～約５０倍の範囲で拡大する。

ある実施形態では、細胞を、約７日～約１４日間、又は約７日～約１０日間培養する。

一般に、免疫細胞の集団、例えば、Ｔ調節細胞枯渇細胞は、それに結合された表面と、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接触させることによって拡大され得る。具体的には、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片又は表面上に固定された抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、又はカルシウムイオノフォアと併用してタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることなどにより、本明細書に記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子の共刺激のために、アクセサリ分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野において一般的に知られている他の方法（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）と同様に使用され得る。

免疫細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦ、及びＴＮＦ－ａ、又は当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地若しくはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０、又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラズマネート、並びにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清であるか、又は適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは定義されたホルモンのセット、並びに／又はＴ細胞の成長及び拡大に十分な量のサイトカインが補充された、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的Ｔ細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気プラス５％ＣＯ２）下で維持される。

ＣＡＲ発現細胞療法
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法の一種である。注入された細胞は、レシピエントにおけるＣＡＲの標的を発現する疾患細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ修飾免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、インビボで複製することができ、持続した腫瘍制御をもたらすことができる長期持続性をもたらす。様々な実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者に投与され、ＣＡＲ－Ｔ細胞の患者への投与後、少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、又は５年間、患者においてＣＡＲ－Ｔ細胞又はその子孫が持続する。

本発明はまた、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が、例えば、インビボ転写ＲＮＡによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように修飾され、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、細胞療法の一種を含む。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺傷することができる。したがって、様々な実施形態では、患者に投与される免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を患者に投与した後、１ヶ月未満、例えば、３週間、２週間、１週間存在する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答又は受動免疫応答であってもよく、又は代替的に、直接的な対間接的な免疫応答に起因してもよい。

上述のように、エクスビボ手順は、当該技術分野で周知であり、上記で説明されている。簡潔に述べると、細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、ＣＡＲを発現するベクターを用いて遺伝子改変される（すなわち、インビトロで形質導入又はトランスフェクトされる）。ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、治療効果を提供するために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであってもよく、ＣＡＲ発現細胞は、レシピエントに関して自己であり得る。代替的に、細胞は、レシピエントに関して、同種、同系、又は異種であり得る。

造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ拡大のための手順は、ＵＳ５，１９９，９４２に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法は、当該技術分野で既知であり、したがって、本発明は、細胞のエクスビボ拡大の任意の特定の方法に限定されない。簡潔に述べると、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）のエクスビボ培養及び拡大は、（１）末梢採血又は骨髄外植体からの哺乳動物からのＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を収集することと、（２）そのような細胞をエクスビボで拡大させることと、を含む。ＵＳ５，１９９，９４２に記載の細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、及びｃ－キットリガンドなどの他の因子を、細胞の培養及び拡大に使用することができる。

本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、単独で、又は希釈剤と組み合わせた、及び／又はＩＬ－２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで、投与され得る。免疫細胞は、単独で、又は希釈剤と組み合わせた、及び／又はＩＬ－２、ＩＬ－１５若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで、投与され得る。簡潔に述べると、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される免疫細胞を含み得る。かかる組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。開示される方法で使用するための組成物は、いくつかの実施形態では、静脈内投与のために製剤化される。

本明細書に記載される細胞を含む医薬組成物は、１０^５～１０^６個の細胞／ｋｇ体重などの１０^４～１０^９個の細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得る。細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技法を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい）。特定の患者に最適な投薬量及び治療レジメンは、患者を疾患の徴候について監視し、適宜に治療を調整することによって、医療分野の当業者によって容易に決定されることができる。

ある特定の実施形態では、活性化された免疫細胞を対象に投与し、次いで、その後再採血し（又はアフェレーシスを行い）、その血液から免疫細胞を活性化及び拡大し、これらの活性化及び拡大した細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行されることができる。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１００ｃｃの採血から活性化される。この複数回採血／複数回再注入プロトコルを使用することは、ある特定の免疫細胞の集団を選出するように機能し得る。

併用療法
本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞などの、又は本発明の方法によって産生される免疫細胞は、ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体又はＰＲＬＲの小分子阻害剤）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブ又はパニツムマブ］又はＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブ又はエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、又はＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２［例えば、トラスツズマブ又はＴ－ＤＭ１］、抗ＥｒｂＢ３、若しくは抗ＥｒｂＢ４抗体、又はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、若しくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ－ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）、ＰＤＧＦＲ－アルファ阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－アルファ抗体）、ＰＤＧＦＲ－ベータ阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－ベータ抗体、又はイマチニブメシレート若しくはスニチニニブマレートなどの小分子キナーゼ阻害剤）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、又は－Ｄ抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１を参照されたい（本明細書では「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、又はパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１などのＵＳ２０００９／０１４２３５４に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５ＰなどのＵＳ２０１１／００２７２８６に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１又はＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体又は抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価のＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブなどの一価抗ＣＤ２０抗体）、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＤ３抗体、ＣＴＬＡ－４抗体などからなる群から選択される１つ以上の追加の治療活性成分と共製剤化、及び／又はそれらと組み合わせて投与され得る。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤には、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、又はそれらのそれぞれの受容体に結合する低分子サイトカイン阻害剤及び抗体を含む、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、及びサイトカイン阻害剤が含まれる。

本発明の方法によって任意選択的に産生される本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞などの免疫細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。別の実施例では、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤は、チェックポイント阻害剤とともに投与されることができる。２つの既知の阻害性チェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）及びプログラム死１（ＰＤ－１）受容体を通るシグナル伝達を伴う。これらのタンパク質は、Ｔ細胞機能の全ての段階にわたって重要な役割を果たす共シグナリング分子のＣＤ２８－Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１受容体（ＣＤ２７９としても知られる）は、活性化されたＴ細胞の表面に発現される。そのリガンド、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１；ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ；ＣＤ２７３）は、樹状細胞又はマクロファージなどのＡＰＣの表面上に発現される。ＰＤ－Ｌ１が優勢なリガンドである一方、ＰＤ－Ｌ２は、はるかに制限された発現パターンを有する。リガンドがＰＤ－１に結合すると、阻害シグナルがＴ細胞に伝達され、サイトカイン産生が低減し、Ｔ細胞増殖が抑制される。チェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－Ｌ１（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨｌｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）をブロックする抗体が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）又はＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）などの、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤は、ランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、又はＭＥＤｌ４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）などの、ＰＤ１に特異的に結合する抗体を含む。ＰＤ－１に対するヒトモノクローナル抗体、及び抗ＰＤ－１抗体を単独で又は他の免疫療法剤と組み合わせて使用してがんを治療するための方法は、米国特許第８，００８，４４９号に開示されており、これらの抗体については参照により組み込まれる。したがって、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用は、米国特許第８，５５２，１５４号に記載されており、これらの抗体については参照により組み込まれる。抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗がん剤は、米国特許第８，６１７，５４６号に記載されており、これらの抗体については参照により組み込まれる。

本発明は、本明細書に記載されるＣＡＲ－Ｔ細胞などの免疫細胞のいずれかを、１つ以上の化学療法剤と組み合わせて含む、組成物及び治療製剤を含む。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボクオン、メトレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンホスホルアミド、及びトリメチロメラミンを含む、エチレンイシンイミン及びメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、オキシド塩酸化メクロレタミン、メルファラン、ノベミチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトーシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５－フルオラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’‘－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン剤；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤などの腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。

開示される治療剤のいずれかの投与は、注射、輸血、又は移植を含む、任意の都合のよい様式で実行され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、又は腹腔内で患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、開示される組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射され得る。

当業者であれば理解するであろうが、上記の細胞は、治療有効量で対象に投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、治療される疾患又は状態の症状のうちの１つ以上をある程度緩和するか、又は悪化を防止する、投与される十分な量の治療剤を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、又は原因の低減若しくは進行の防止、又は生体系の他の任意の所望の変化であり得る。例えば、治療上の使用のための「有効量」は、過度の有害な副作用なしに疾患症状の臨床的に有意な減少をもたらすために必要な治療剤の量である。

「治療有効量」という用語は、例えば、予防有効量を含む。治療剤の「有効量」は、過度の有害な副作用なしに所望の薬理学的効果又は治療改善を達成するのに有効な量である。「有効量」又は「治療有効量」は、対象の年齢、体重、全身状態、治療される状態、治療される状態の重症度、及び処方医師の判断のいずれかの化合物の代謝の変動に起因して、対象によって異なる場合があることが理解される。

定期的な実験（用量漸増臨床試験を含むが、これらに限定されない）によってそのような治療有効量を決定することは、当技術分野の技術の範囲内であると考えられる。任意の個々の症例における適切な「有効量」は、用量漸増研究などの技術を使用して決定され得る。

１つ以上の治療剤が、組み合わせて使用される場合、各治療剤の「治療有効量」は、それ自体が使用されるときに治療有効であるであろう治療剤の量を指すことができ、又は１つ以上の追加の治療剤との組み合わせによって治療有効である低減した量を指すことができる。

治療の方法
本発明の、又は本発明を使用して産生される免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、とりわけ、疾患又は障害の治療、予防、及び／又は改善に有用である。例えば、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、がん、感染症、又は炎症性疾患の治療に有用である。別の例として、本発明の方法によって産生される樹状細胞は、例えば、がん、感染症（細菌又はウイルス感染症など）、又は自己免疫疾患（糖尿病など）を治療するための樹状細胞ワクチン（例えば、Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４を参照されたい）として使用することができる。更なる例として、ＮＫ－ＣＡＲ細胞などのＮＫ細胞を使用して、がんを治療することができる（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１を参照されたい）。

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、消化管、男性及び女性の生殖管、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、並びに眼などの特殊感覚器官に発生する原発性及び／又は転移性腫瘍を治療するために使用され得る。特定の実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、腎細胞がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、大腸がん、胃がん（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、乳がん、黒色腫、白血病、又はリンパ腫のうちの１つ以上を治療するために使用される。

ある実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、又は慢性リンパ性白血病を治療するために使用される。ある実施形態では、白血病は、低ＣＤ３３＋芽球が優勢である急性骨髄性白血病である。

別の実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫を治療するために使用される。非ホジキンリンパ腫の種類としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、又は末梢Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。ある実施形態では、リンパ腫は、低レベルのＣＤ１９及び／又はＣＤ２０を有するびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。

本明細書に記載される治療の方法の文脈では、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの免疫細胞は、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、又は１つ以上の追加の治療剤（その例は本明細書の他の場所に記載される）と組み合わせて（併用療法）投与され得る。

一実施形態では、対象は、がん（例えば、がん）を発症するリスクにある。対象者が、対照集団よりもがんを発症するリスクが高い場合、対象者は、リスクにある。対照集団は、がんに罹患していないか、又はがんの家族歴を有する一般集団から無作為に選択された（例えば、年齢、性別、人種、及び／又は民族によってマッチングされた）１つ以上の対象を含み得る。がんに関連する「リスク因子」が、その対象に関連することが判明した場合、対象は、がんのリスクにあるとみなされることができる。リスク因子には、例えば、対象の集団に関する統計学的又は疫学的研究を通じて、所与の障害に関連する任意の活動、形質、事象、又は特性が含まれ得る。したがって、基礎となるリスク因子を同定する研究に、対象が具体的に含まれていなくても、対象は、がんのリスクにあると分類されることができる。

一実施形態では、対象は、がんを発症するリスクにあり、細胞又は組成物は、がんの症状の発現前又は発現後に投与される。一実施形態では、細胞又は組成物は、がんの症状の発現前に投与される。一実施形態では、細胞又は組成物は、がんの症状の発現後に投与される。一実施形態では、本発明の細胞又は組成物は、リスクにある対象におけるがんの症状のうちの１つ以上を緩和又は軽減する用量で投与される。

ある実施形態では、対象は、がん、感染症、又は炎症性疾患などの疾患又は障害を有すると診断されているか、又は有する疑いがある。ある実施形態では、対象は、結腸がん又は乳がんを有すると診断されているか、又は有する疑いがある。ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象を、がん、感染症、又は炎症性疾患、好ましくは結腸がん又は乳がんなどの疾患又は障害を有するか、又は有する疑いがあると診断するステップを含む。

本明細書で使用される診断は、対象又は患者が、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞並びに／又はＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤による治療を必要とするという決定を指す。本明細書に記載の方法に従って診断される疾患又は障害の種類は、当該技術分野で既知の又は本明細書に記載の任意の種類であり得る。

ある実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞並びに／又はＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤による治療を必要とする対象を特定又は診断するステップは、対象が、がんを有するという決定を含み、
－血液プロファイリング；
－細胞生検吸引物；
－コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、超音波及びＸ線などのイメージング；
－身体検査のうちの１つ以上又は全ての評価を含み得る。

ＮＫ細胞で治療することができる疾患の例としては、がん（例えば、黒色腫、前立腺がん、乳がん、及び肝臓がん）、並びにウイルス感染症（例えば、ＨＳＶ、肝炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、及びＨＩＶ－１による感染症）、細菌感染症（例えば、マイコバクテリア、リステリア、及びブドウ球菌による感染症）、及び原虫感染症（例えば、マラリア原虫による感染症）、及び真菌感染症（例えば、アスペルギルスによる感染症）が挙げられるが、それらに限定されない。

当業者には明らかであるように、対象におけるがんの症状の「軽減」は、同じくがんに罹患しているが、本明細書に記載の方法による治療を受けていない別の対象と比較されるであろう。これは、必ずしも２人の対象の対照比較を必要としない。むしろ、集団データを信頼することができる。例えば、本明細書に記載の方法で治療を受けていないがんに罹患している対象の集団（任意選択的に、治療された対象と同様の対象の集団、例えば、年齢、体重、人種）が評価され、平均値が、本明細書に記載の方法で治療された対象又は対象の集団の結果と比較される。

一実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞及び方法は、がん、感染症、又は炎症性疾患などの疾患又は障害に罹患している対象の生存を改善するために使用される。生存が企図される場合、生存分析は、カプラン・マイヤー法を使用して行うことができる（図２６Ｃに示すように）。カプラン・マイヤー法は、生存期間データから生存関数を推定し、治療後一定期間生存する患者の割合を測定するために使用することができる。生存関数のカプラン・マイヤー法のプロットは、十分な大きさの試料が採取されたときに、その集団の真の生存関数に近づく、大きさが減少する一連の水平ステップである。連続した別個のサンプリングされた観察（「クリック」）間の生存関数の値は、一定であると仮定される。

カプラン・マイヤー曲線の重要な利点は、方法が、最終的な結果が観察される前に（例えば、患者が研究から離脱した場合）、試料からの「打ち切り」データ損失を考慮に入れることができることである。プロットでは、小さな垂直のチェックマークは、患者データが打ち切られた損失を示す。切り捨てや打ち切りが発生しない場合、カプラン・マイヤー曲線は、経験分布と同等である。

統計学では、ログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定としても知られている）は、２つのグループの患者の生存分布を比較する仮説検定である。それは、ノンパラメトリック検定であり、データが正しく打ち切られる場合に使用するのに適している。それは、測定が事象までの時間である場合に、対照群と比較して新薬の有効性を確立するために、臨床試験で広く使用されている。ログランク検定統計量は、観察された各事象時間における２つのグループのハザード関数の推定値を比較する。それは、各観察された事象時間におけるグループのうちの１つにおける観察された事象及び予想される事象の数を計算し、次いでこれらを加算して、事象が存在する全ての時点にわたる全体的な概要を得ることによって構築される。ログランク統計量は、２つのグループを比較するＣｏｘ比例ハザードモデルのスコア検定として導出することができる。したがって、そのモデルに基づく尤度比検定統計量と漸近的に同等である。

実施例１－材料及び方法
マウスＣＡＲ－Ｔ製造プロトコル
ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を使用してマウス脾細胞を活性化し、ＣＡＲ－Ｔベクターによる形質導入の前に、組換えＩＬ－２及びＩＬ－７の存在下で２４時間培養した。形質導入の直後にＴＣＮ（トリシリビン）又はＴＣＮ－Ｐ（トリシリビンホスフェート）を添加し、次いでＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＣＮ／ＴＣＮ－Ｐに２４、４８、又は７２のいずれかの時間曝露した。

ヒトＰＢＭＣをバフィーパック（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ）から抽出した。それらは、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を使用して、全てＩＬ－２の存在下で、４８時間形質導入の前に２日間活性化された。ＩＬ－２において最大３日間培養されたこれらのＣＡＲ－Ｔ細胞に、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐを直ちに添加した。

腫瘍殺傷アッセイ
１００，０００Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。２時間後、マウスＣＡＲ－Ｔ細胞を、２：１、１：１、及び０．５：１）のエフェクター対標的Ｔ細胞比で同じウェルに播種し、最大１６時間インキュベートした。培養上清を収集し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のレベルを測定した。

フローサイトメトリー表現型決定
マウスＣＡＲ－Ｔ細胞を製造後に表現型決定するために、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌに対する蛍光色素標識抗体を使用して細胞を染色した。ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＰＤ－１、及びＣＤ６９に対する蛍光色素コンジュゲート抗体を使用して表現型決定された。生細胞又は死細胞を区別するために、固定可能な生／死染料を使用した。

質量分析
ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐのいずれかで２４又は３日間処置した後に収集した。各時点で、細胞を、収集し、グローバルなプロテオーム解析のために、細胞溶解の前に、冷たいＤＰＢＳで３回洗浄した。具体的には、リン酸化プロテオーム解析のために、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を未処置として放置するか、又はＤＰＢＳで洗浄した後、細胞溶解する前に、０、５、及び１５分間、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐで処置した。

細胞プロテオーム及びリン酸化プロテオームの質量分析
ＬｙｓＣ（酵素：基質１：１００、Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）トリプシン（酵素：基質１：５０）によるＳｅｒａ－Ｍａｇ Ｓｐｅｅｄ Ｂｅａｄベースのタンパク質消化の前に、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＨＡＬＴ）を含有する細胞を、チッププローブ超音波処理によって均質化／可溶化し、定量化、正規化、及び還元し（ジチオスレイトール、ＤＴＴ）、アルキル化（ヨードアセトアミド）した。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）多重化を、正規化されたペプチド混合物（９－プレックスＴＭＴ、参照１３１Ｃ等圧標識）に対して行った。ペプチドを脱塩し（ＳＤＢ－ＲＰＳステージチップ）、グローバルな細胞プロテオームについて分析した。リン酸化プロテオーム解析のために、高選択二酸化チタン（ＴｉＯ２）ビーズ捕捉を使用して、各ＴＭＴセットからホスホペプチドを濃縮した。

Ｅａｓｙ－ｎＬＣ１２００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）ポンプに結合されたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計でのデータ依存性取得で取得したスペクトル。ペプチドを、勾配５～１００％緩衝液Ｂ（８０％ＡＣＮ、０．１％ＦＡ）を用いて、２４０分間にわたって、３００ｎＬ／分の流速で、５５℃で直接注入して、分離した（１．９μｍ粒径Ｃ１８、０．０７５×２５０ｍｍ、Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ）。スキャン配列には、ＭＳ１スペクトル（分解能６０，０００；質量範囲３００～１６５０ｍ／ｚ；自動ゲイン制御（ＡＧＣ）標的３ｅ６、最大注射時間１２８ｍｓ、分離ウィンドウ０．８Ｔｈ）が含まれた。最も強力なＭＳ１イオンを、ＭＳ２分析のために選択し、３３の正規化された衝突エネルギーで高エネルギーの衝突解離によって断片化した。前駆体は、電荷状態≧２に従って濾過し、ＭＳ／ＭＳについてはＡＧＣが１ｅ５に設定され、単一同位体ピークが使用された。

データ処理及びバイオインフォマティクスパイプライン
質量スペクトルは、ＭａｘＱｕａｎｔ（１．６．１４）を使用して前処理及び処理された。スペクトルは、Ａｎｄｒｏｍｅｄａを使用して、ＵｎｉＰｒｏｔ（配列データベースＪａｎ－２０２１）に注釈付けされたヒトタンパク質配列の全セットに対して検索した。データを、固定修飾、システインカルバミドメチル化及び可変修飾、Ｎ－アセチル化及びメチオニン酸化（並びにリン酸化（ＳＴＹ））で検索した。検索を、総タンパク質／リンタンパク質レベル分析のための２０ｐｐｍ前駆体イオン耐性、及びバッチ効果を正規化するための内部参照標識チャネルを使用して行った。更なる修飾としては、静的修飾として設定されたペプチドＮ末端／リジン残基（＋２２９．１６２９３Ｄａ）上のＴＭＴタグが挙げられた。厳格な１％の偽発見率を適用して、ペプチド及びタンパク質レベルで不十分な同定をフィルタリングした。得られたｐ値は、多数の比較のためにＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定補正法によって補正した。

更なるデータ分析のために、正規化された強度を、各試料群にわたって測定された各タンパク質の中央値強度にわたる強度のｌｏｇ２比に変換し、スチューデントのＴ検定又はＡＮＯＶＡを使用して統計解析を行った（ｐ値＜０．０５を有意とみなした）。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ、Ｒ（ｇｇＰｌｏｔ２）、及びＰｅｒｓｅｕｓ（Ｍａｘ－Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、Ｍｕｎｉｃｈ）ソフトウェアを使用したデータ分析。Ｇｐｒｏｆｉｌｅｒ／Ｒｅａｃｔｏｍｅバイオインフォマティクスを使用して、遺伝子濃縮機能アノテーションクラスタリング分析を行った。全てのデータは、内部基準ＴＭＴチャネルに対して正規化され、ＤＭＳＯ及び未処置対照（プロテオーム解析）、並びに時間０におけるＤＭＳＯ対照（リン酸化プロテオーム解析）のいずれかに対して比較が行われた。ＰＨ含有ドメインは、ＳＭＡＲＴオンラインソフトウェアツール（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）から取得した。

実施例２－結果
形質導入のプロセス中又はその後のいずれかに５０μＭのＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐを添加すると、少なくとも８０％のＣＡＲ－Ｔ細胞死をもたらした（図１）。しかしながら、低濃度のＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐ（最大１０μＭ、５０μＭ未満）は、３日間の処置まででさえ、高レベルの生存ＣＡＲ－Ｔ細胞（約６０％）を維持した。ＴＣＮで前処置したマウスＣＡＲ－Ｔでは、増殖率が低い（図２）一方、セントラルメモリー表現型（ＣＤ４４^ｈｉＣＤ６２Ｌ^ｈｉ）を保持しながら（図３）、わずかに低減したレベルのＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生したが細胞傷害能力を保持していた（図４Ａ～Ｂ）。

マウスＣＡＲ－Ｔ細胞において活性化マーカーを測定した場合、本発明者らは、ＴＣＮの前処置が古典的な初期の活性化マーカーであるＰＤ－１及びＣＤ６９の発現を増加させることを観察した（図５Ａ～Ｂ）。腫瘍抗原指向性細胞傷害は、鈍化しているにもかかわらず、ＴＣＮ前処置後に保持される（図６Ａ）。対照的に、マウスＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存は、ＴＣＮ前処置でわずかに改善された（図６Ｂ）。

マウスＣＡＲ－Ｔ細胞におけるこれらの転帰に基づいて、同じプロトコルを使用して、ヒトＰＢＭＣからＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。３人のドナーからのバフィーコートを処理して、ＰＢＭＣを単離し、５０００万個のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、１．５μｇ／ｍＬ）及び組換えＩＬ－２（６００Ｕ／ｍＬ）を含有する培地の存在下で２日間培養した。次いで、活性化されたＴ細胞を、５μＭのＴＣＮ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）で、６００Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ－２の存在下で治療する前に、Ｈｅｒ２標的化ＣＡＲ構築物を用いた２日間のレトロウイルス形質導入プロトコルに供した。試料を２４時間後又は７２時間後のいずれかに収集した。ここで、ＴＣＮ処置がＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の形質導入効率に影響を与えなかったことが観察された（図７）。

興味深いことに、ＴＣＮ処置は、３人全てのドナーにわたって一貫してセントラルメモリーＴ（Ｔ_ＣＭ）細胞の割合を増加させた（図８）。３人のＰＢＭＣドナーにわたって定量化すると、このＴ_ＣＭの増加は、エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）の低減（８％対５％）を伴った（図９、１１％対１７％）ことに留意されたい。図９Ａは、データが、各生物学的ドナー（すなわち、個々のＰＢＭＣドナー）の代表を指し示す定量化データを示し、図９Ｂは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＴＣＮ、又はＴＣＮ－Ｐに応答した、Ｔ_ＣＭＣＡＲ－Ｔ細胞への変化を示す。また、ＴＣＮ又はＴＣＮ－ＰへのＣＡＲ－Ｔ細胞のこの短い曝露は、エフェクターＴ（Ｔ_Ｅ）細胞の低減（３５％対２３％）を伴って、少なくとも３日間、Ｔ_ＣＭ細胞へのこの移行を持続させる（図１０～１１、９％対１６％）ことに留意されたい。表面マーカー現象を回避するために、Ｔ_ＣＭ細胞の追加のマーカー（すなわち、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＣＲ７）を含め、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐによる前処置後に、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－ＴにおけるＴ_ＣＭの増加とともに同様のパターンが観察された（図１２）。興味深いことに、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐによる前処置は、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴ_ＣＭ又はＴ_Ｅ表現型にいかなる効果も有さなかった（図１３～１６）。これは、Ｔ_ＣＭＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞（４５～６０％のＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞、図１４Ａ）の比較的高い出発存在量に起因していた可能性がある。

腫瘍微小環境の免疫耐性における調節Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞の役割を考えると、形質導入されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ_ＲＥＧ細胞の相対的な割合もまた評価された。ここで、ＴＣＮ前処置が、ＣＤ４＋形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ_ＲＥＧ割合を低減させたことが観察された（図１７）。ＰＢＭＣのＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐ治療は、インターフェロンシグナル伝達及び抗ウイルス活性に関連するタンパク質の濃縮を増加させた。これらのタンパク質には、ＭＸ１－インターフェロン誘導ＧＴＰ結合タンパク質Ｍｘ１、グアニル酸結合タンパク質－１及び－２、並びにＤｎａＪ相同性サブファミリーＢメンバー１が含まれた。抗ウイルス活性はまた、核酸感知及びＴＬＲ－３、８、及び－９シグナル伝達に不可欠であるＬＲＲＣ５９の上方調節によっても示唆される。代謝及びＲＮＡプロセシングに関連するタンパク質が濃縮されたＰＢＭＣのＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐ治療。

ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐがそれらの上流で働く可能性が高い、複数のＰＨドメイン含有タンパク質及び非ＰＨドメイン含有タンパク質の有意な脱リン酸化。セリン／トレオニン－タンパク質キナーゼＰＲＰ４ホモログ、スペクトリンベータ鎖、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害を介した調節Ｔ細胞機能に重要である非赤血球１。データは、以下のタンパク質、オキシステロール結合タンパク質１、オキシステロール結合タンパク質２、スペクトリンベータ鎖、非赤血球１、及びＲｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質２７が、ＴＣＮ投与後に有意に阻害されることを示した。

結論
ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐによる前処置は、インビボで持続し、かつＣＡＲ－Ｔ療法後の臨床応答に対応することが示されているＴ細胞表現型における濃縮を可能にした。ＡＫＴ阻害剤として使用される場合のＴ細胞に対する毒性の以前の報告を考慮すると（例えば、Ｍｏｕｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８を参照されたい）、現在の研究の知見は、驚くべきものであった。非常に低濃度のＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐは両方とも、形質導入されたＴ細胞によって十分に耐容され、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を含むＴ_ＣＭ表現型を有するＴ細胞の濃縮に有効であった。更に、低濃度のＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐによる前処置は、形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ_ＲＥＧ細胞を低減させた。

まとめると、これらの知見は、ＴＣＮ又はＴＣＮ－Ｐ前処置が、インビボで持続することが知られており、かつ部分的又は完全な臨床応答に関連するＴ細胞表現型を濃縮することによって、ＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を増強するための有効な方法であることを実証する。ＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐ前処置は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞に大きな影響を及ぼし、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞にほとんど又は全く影響を及ぼさないようである。データは更に、阻害剤を使用して、樹状細胞数、及びＮＫ細胞の細胞傷害活性を増加させることができることを示した。

実施例３－インビボでの前処置又はネオアジュバントとしてのＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐの有効性を試験するための材料及び方法
本発明者らは次に、治療上関連のあるがんモデルにおけるインビボでのＴ_ＣＭ及びＣＡＲ－Ｔ_ＳＣＭ表現型の増強に対するＡＫＴ阻害剤の効果を決定しようとした。第１のアプローチは、図１８に例示される概略図に従って、内因性ＣＡＲ－Ｔ又は養子移入されたＣＡＲ－ＴのいずれかにおいてＣＡＲ－Ｔ_ＣＭ及びＣＡＲ－Ｔ_ＳＣＭ表現型を濃縮するための製造試薬として使用される場合のＡＫＴ阻害剤の効果を試験することであった。第２のアプローチは、図２４に例示される概略図に従って、内因性ＣＡＲ－Ｔ又は養子移入されたＣＡＲ－ＴのいずれかにおいてＣＡＲ－Ｔ_ＣＭ及びＣＡＲ－Ｔ_ＳＣＭ表現型を濃縮するためのアジュバントとして使用される場合のＡＫＴ阻害剤の効果を試験することであった。

細胞株及びマウス
マウス結腸腺がんＭＣ－３８－ｈＨｅｒ２及び乳がんＥ０７７１－ｈＨｅｒ２がん細胞株を、インビトロ及びインビボ実験で使用した。レトロウイルスベクターを産生するために使用されるＧＰ＋ｅ８６細胞株は、ＡＴＣＣ（ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。全ての腫瘍及びパッケージング細胞株を、１０％熱不活性ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、及び１００ｕｇ ｍＬ^－１ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中の５％ＣＯ_２で３７℃に維持した。全ての細胞株は、マイコプラズマ陰性であることが検査された。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ＷＴ）及びヒトＨｅｒ２（ｈＨｅｒ２）トランスジェニックマウス株は全て、Ｐｅｔｅｒ ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で飼育及び維持された。６～１６週齢のマウスを、性別をマッチングさせ、異なる処置群に無作為化した。全ての動物実験は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅ６７８）によって承認された。

マウスＣＡＲ－Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入
Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスからの脾細胞を、１μｇ ｍＬ^－１抗ＣＤ３、１μｇ ｍＬ－１抗ＣＤ２８で、ＩＬ－２及び２００ｐｇ ｍＬ－１ ＩＬ－７の存在下で１日間活性化した後、フィコール勾配処置した。細胞を、ＧＰ＋８６ ＬＸＳＮ－抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲパッケージング細胞株から産生された上清を使用して、１ｕｇ ｍＬのレトロネクチンでコーティングされたプレートに形質導入した。その後、形質導入された細胞を、５μＭのＰＴＸ－２００の有無にかかわらず、同じ濃度のＩＬ－２及びＩＬ－７を有する完全なＲＰＭＩで拡大させた。完全培地中の新鮮なＩＬ－２及びＩＬ－７を、形質導入の２日後に全てのＣＡＲ－Ｔ細胞に添加した。

ヒトＨｅｒ２＋同系マウス腫瘍モデル。
Ｈｅｒ２トランスジェニックレシピエントに、２．５×１０^５のＭＣ３８－ｈＨｅｒ２又は２．５×１０^５のＥ０７７１－ｈＨｅｒ２のいずれかを乳房脂肪パッドに皮下注射した。腫瘍が触知可能になり、手動のカリパスを使用して測定し、腫瘍面積を平方ミリメートル（ｍｍ^２、長さ×幅）で計算した。腫瘍接種後６～７日目に、腫瘍保有Ｈｅｒ２＋マウスを２０ｍｍ^２の平均腫瘍サイズを有するように無作為化し、２０×１０^６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をこれらのレシピエントに養子移入した。５０，０００ＵのＩＬ－２を、次の２日間にわたって５回腹腔内注射することによって投与した。腫瘍サイズを測定し、腫瘍サイズが、１２０ｍｍ^２を超えるまで、又は腫瘍保有マウスが、指定された実験時点に達するまで、２～３日ごとに監視した。

ＰＴＸ－２００の腹腔内注射
ＤＰＢＳで希釈したＰＴＸ－２００を、腹腔内注射を介して３～４日ごとにマウス１匹当たり５、２５、又は５０ｍｇ／Ｋｇで投与した。

マウスの腫瘍部位、流入領域リンパ節、脾臓、及び血液における免疫サブセットの分析
マウスの血液を、処置後８～９日目に顎下出血を介してＥＤＴＡ含有チューブに直接収集した。実験的エンドポイントでは、安楽死の直後に、腫瘍、流入領域リンパ節（ｄＬＮ）、及び脾臓を含む様々な臓器を収集した。ｄＬＮ及び脾臓からの単一細胞懸濁液は、これらの臓器を７０μｍのフィルタを通して処理することによって達成した。脾細胞については、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解した。固形腫瘍を手動でスライスし、１ｍｇ ｍＬ^－１ＩＶ型コラゲナーゼ及び０．０２ｍｇ ｍＬ^－１ＤＮＡｓｅを含有するＤＭＥＭで、３７℃で３０分間、１２０ｒ．ｐ．ｍでのロッキングインキュベーションで消化した。消化をＤＭＥＭで中和し、７０μｍのフィルタを通して処理し、ＦＡＣＳ緩衝液又は完全なＲＰＭＩ培地のいずれかで再懸濁した。エクスビボで細胞を再刺激するために、これらの異なる組織からの単一細胞懸濁液を、補充されたＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、フローサイトメトリー分析の分析の前に、３７℃で４時間、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＳＴＯＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したフォルボール１２－ミリスチン酸１２－酢酸塩（ＰＭＡ；１０ｎｇ ｍＬ^－１）、カルシウムイオノフォア（１μｇ ｍＬ^－１）で活性化した。

インビトロ慢性腫瘍再刺激
ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＬ－７（２００ｐｇｍＬ^－１）及びＩＬ－１５（１０ｎｇｍＬ^－１）の存在下で、示されたエフェクター：標的比で、ＭＣ－３８がん細胞又はＥ０７７１－ｈＨｅｒ２がん細胞のいずれかと共培養した。１日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞懸濁液を収集し、がん細胞の新鮮な層と共培養した。これをＩＬ－７及びＩＬ－１５で３回繰り返した。上清を毎日収集し、サイトカインビーズアレイで分析し、３回目の腫瘍再刺激後の細胞をフローサイトメトリー分析に供した。

経時的な生がん細胞の分析
未処置又はＰＴＸ－２００前処置のＣＡＲ－Ｔ細胞を、３８４ウェルプレート中で、示されたエフェクター：標的比でＭＣ－３８又はＥ０７７１－ｈＨｅｒ２のいずれかと共培養した。カスパーゼ３／７染料を細胞懸濁液に分配した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ＳＸ５を使用して、４時間ごとに画像を撮影した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍソフトウェアを使用して、細胞数及び関連するカスパーゼ３／７活性を定量化した。

フローサイトメトリー
Ｆｃ受容体ブロック（ＦＡＣＳ緩衝液で１：５０希釈したハイブリドーマ上清のクローン２．４Ｇ２）を用いて、細胞を室温で１５分間ブロックした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで氷上で３０分間蛍光色素コンジュゲート抗体で染色した。染色された細胞を、２０，０００個のカウントビーズを有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる前に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞内又は核内染色について、染色された細胞を、次いで、それぞれ製造元の指示に従って、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅキットのいずれかで固定及び透過化した。固定及び透過化された細胞を、室温で３０分間、蛍光色素コンジュゲート抗体で染色した後、パーマ／洗浄緩衝液で２回洗浄し、カウントビーズを用いてＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、染色した試料を取得した。標的Ｔ細胞集団の数は、標的化集団の試料／ビーズ事象×事象における入力ビーズの数を使用して計算した。

統計分析
ＦＡＣＳ分析は、Ｆｌｏｗｊｏ ｖｓ．１０を使用して行った。図及び統計分析は、バージョン９のＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して生成した。データは、平均±標準誤差として表され、統計分析は、一元配置分散分析／二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して行われ、ログランク（両側Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して、生存分析における統計的有意性を決定した。

実施例４－インビボでの前処置としてのＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐの有効性の結果
本発明者らはまず、図１８に例示される概略図に従って、内因性ＣＡＲ－Ｔ又は養子移入されたＣＡＲ－ＴのいずれかにおいてＣＡＲ－Ｔ_ＣＭ及びＣＡＲ－Ｔ_ＳＣＭ表現型を濃縮するための製造試薬として使用される場合のＡＫＴ阻害剤の効果を決定しようとした。

免疫応答性同系ｈＨｅｒ２マウスにおける腫瘍モデルの代表的な例を図１９Ａに示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前に、フローサイトメトリーを採用して、ＣＤ４：ＣＤ８ Ｔ細胞の比を決定し、これは、ＣＡＲ－Ｔ製造中のＴＣＮ－Ｐ条件付けによって変化しないことが観察された（図１９Ｂ、上部パネル、及び図１９Ｃ）。しかしながら、ＴＣＮ－Ｐ事前条件付けは、セントラルメモリーＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞に有意な濃縮を付与した（図１９Ｂ、下部パネル）。ＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＴＣＮ－Ｐ事前条件付けの影響は、インビボでの腫瘍制御の改善につながった。非制御のままに放置した場合、Ｅ０７７１乳がん腫瘍モデルは、１４日目までに実験的エンドポイントに達した（すなわち、腫瘍＞１２０ｍｍ^２）。ＣＡＲ－Ｔ投与は、これを１６日目まで延長することができ、事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞は、これを２４日目まで延長することができ（図１９Ｄ）、生存の確率の有意な改善（図１９Ｅ、ｐ＝０．００１２）。

同じ同系ｈＨｅｒ２乳がんモデルを使用して、動物の別のコホートを、処置後８日までの腫瘍成長について評価した（図２０Ａ）。循環Ｔ細胞の分析は、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、未処置のＣＡＲ－Ｔ細胞を受けたものと比較して、ＴＣＮ－Ｐ事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物においてより多く見られるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞の事前条件付けが、インビボでのＣＤ４：ＣＤ８比の歪みをもたらしたことを示した（図２０Ｂ、上部パネル）。また、事前条件付けにより、インビボでのＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の減少がもたらされたことも指摘された（図２０Ｂ、中央パネル）。これらの観察は、セントラルメモリーＴ細胞がほぼ２倍になったこと一致した（図２０Ｂ、下パネル）。

フローサイトメトリー分析は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の事前条件付けが、腫瘍内のＣＤ４＋又はＣＤ８＋組成物に有意な影響を及ぼさなかった（図２０Ｃ）が、二次リンパ器官である脾臓内のＣＤ４＋細胞を増加させるように見えた（図２０Ｄ）ことを更に明らかにした。興味深いことに、事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍殺傷効率の改善は、サイトカイン、ＴＮＦ－アルファ、又はＩＦＮ－ガンマの産生の任意の有意な変化と一致しなかった（図２０Ｅ）。

宿主ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の循環数は、群間で有意ではなかった（図２１Ａ～Ｂ）。ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、群間でも同様であったが、循環ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物において、平均３倍増加した（図２１Ｄ、ｐ＝０．０００９）。循環ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型決定は、製造ステップ中の事前条件付けが、ＣＡＲ－Ｔ細胞がインビボでセントラルメモリー表現型を保持することを可能にしたことを示唆した。セントラルメモリー表現型を有するＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは、事前条件付けされた群でほぼ２倍であった（図２１Ｅ、ｐ＜０．０００１）。セントラルメモリー表現型を有するＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは、事前条件付けされた群で約２０％高かった（図２１Ｆ、ｐ＜０．０００１）。これらの知見は、エフェクターメモリー表現型を有するＣＤ８＋及びＣＤ４＋ ＣＡＲ Ｔ細胞の半減と一致した（それぞれ、図２１Ｇ～Ｈ、ｐ＜０．００１及びｐ＝０．００２９）。

腫瘍及び脾臓の免疫細胞を分析したとき、事前条件付けが、セントラルメモリー表現型を保有するＣＤ８＋又はＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して有意な効果を有さないことを観察した（図２２Ａ及びＣ）。腫瘍中のＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞における早期枯渇マーカーの発現において有意差は観察されなかったが（図２２Ｂ）、事前条件付けは、脾臓に動員されたときにＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞を枯渇から保護するように見えた（図２２Ｄ）。

次いで、発明者らは、ＰＤ－１チェックポイント阻害薬と組み合わせてＴＣＮ－Ｐで前処置されたＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を決定して、この治療が固形腫瘍に対する抗腫瘍有効性を改善するかどうかを決定しようとした。図２３Ａ～Ｂに示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＤ－１チェックポイント阻害薬と組み合わせてＴＣＮ－Ｐで前処置した場合、腫瘍面積の相乗的な低減が観察された。

実施例５－インビボでのネオアジュバントとしてのＴＣＮ及びＴＣＮ－Ｐの有効性の結果
第２のアプローチでは、図２４に例示される概略図に従って、内因性ＣＡＲ－Ｔ又は養子移入されたＣＡＲ－ＴのいずれかにおいてＣＡＲ－Ｔ_ＣＭ及びＣＡＲ－Ｔ_ＳＣＭ表現型を濃縮するためのアジュバントとして使用される場合のＡＫＴ阻害剤の効果を試験した。

図２５に示すように、Ｈｅｒ２＋トランスジェニックマウスに、２．５^ｅ５ＭＣ－３８－ｈＨｅｒ２を接種し、その後３～４日ごとに、５、２５、又は５０ｍｇ／ＫｇのＤＭＳＯ（ビヒクル対照）又はＴＣＮ－Ｐのいずれかを腹腔内注射した場合、ＴＣＮ－Ｐは、インビボで腫瘍成長に効果を発揮する能力を実証する強力な抗腫瘍効果を誘導した。次いで、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と併用して、ＴＮＣ－ｐの効果を試験した。図２６Ａ～Ｂに示されるように、２０×１０^６個の抗ヒトＨｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及び２５ｍｇ／ＫｇのＴＣＮ－Ｐによる静脈内注射の併用処置を受けたマウスは、単回処置単独と比較して有意に腫瘍サイズが低減したことを実証した。一貫して、２０×１０^６個の抗ヒトＨｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞及び２５ｍｇ／ＫｇのＴＣＮ－Ｐによる静脈内注射の併用処置を受けたマウスも、単回処置単独と比較して生存率の増加を実証した（図２６Ｃ）。特に、対照群の生存期間の中央値は、２５ｍｇ／ＫｇのＴＮＣ－ｐで処置したマウスについて、１５日及び２０日であった。ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在下では、生存期間は、２６日に増加したが、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＮ－Ｐの両方の存在下では、生存期間は、３２．５日に増加した。

最後に、ＣＡＲ－Ｔ療法のためのアジュバントとしてのＴＣＮ－Ｐの有用性もまた、マウスが、ビヒクル、未処置のＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ投与後３日ごとに２５ｍｇ／ｋｇのＴＣＮ－Ｐアジュバントと組み合わせてＣＡＲ－Ｔ細胞、又は前処置のＣＡＲ－Ｔ細胞とＴＣＮ－Ｐアジュバントとの組み合わせのいずれかを投与された結腸がんのＭＣ－３８ ｈＨｅｒ２モデルを使用して評価した（図２７Ａ）。１４日目までの腫瘍サイズを評価した。ここで、発明者らは、アジュバントとしてのＴＣＮ－Ｐの投与が、Ｈｅｒ２標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍制御を有意に改善したことを観察し（図２７Ｂ、＊ｐ＜０．０５）、ここで、事前条件付けされたＣＡＲ－Ｔ細胞とＴＣＮ－Ｐアジュバントとの組み合わせは、インビボで最も有意な腫瘍殺傷をもたらした（ｐ＜０．０１）。予想外に、脾臓が、ＴＣＮ－Ｐ前処置とＴＣＮ－Ｐアジュバント療法との組み合わせに応答して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞の有意な蓄積及び／又は拡大を含有した（ｐ＜０．０００１）と判定された（図２８Ａ）。更に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在下でのアジュバントとしてのＴＣＮ－Ｐの投与は、腫瘍内Ｔｒｅｇの５０％の低減をもたらした（図２８Ｂ）。

この研究からの知見は、ＴＣＮ－Ｐ事前条件付けが、インビボで持続することが知られており、かつ部分的又は完全な臨床応答に関連するＴ細胞表現型を濃縮することによって、従来のＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を高めることができることを実証する。腫瘍学的適応におけるＴＣＮ－Ｐの使用に関する臨床安全性データを考慮すると、ＴＣＮ－Ｐ及び同様の化合物を、ＣＡＲ－Ｔ療法と併用して、セントラルメモリーＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ持続性を高め、そうすることで、臨床的耐久性及び応答を改善することができることはもっともらしい。

当業者は、広く説明されているような本発明の主旨又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されているように、本発明に対して多数の変形及び／又は変更を行うことができることを理解されよう。したがって、本実施形態は、全ての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。

本明細書で説明及び／又は参照される全ての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などの任意の考察は、単に本発明の文脈を提供する目的のためである。これらの事項のいずれか又は全てが、先行技術の基礎の一部を形成していることか、又は本出願の各請求項の優先日前に存在した本発明に関連する分野における共通一般的知識であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。

参照文献
Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０：３９７５－３９７７．
Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ８７：４９１－５１８．
Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７：５３－６３．
Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－５１０．
Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１３１９－１３２８．
Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｊ Ｈｅｍａｔ Ｏｎｃｏｌ １４：７．
ＭｃＬｅｌｌａｎ ａｎｄ Ａｌｉ Ｈｏｓｓｅｉｎｉ Ｒａｄ（２０１９）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９７：６６４－６７４．
Ｍｏｕｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７：ｅ１４８８５６５．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ ３１９：１６７６．
Ｓａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２７：７４－９５．
Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１５）４：ｅ３１．

Claims (68)

1. 対象における免疫応答を修飾する方法であって、前記対象に免疫細胞の集団を投与することを含み、前記免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生され、好ましくは、前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである、方法。
2. 対象におけるＴ細胞応答を修飾する方法であって、前記対象に、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の集団を投与することを含み、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中でＣＡＲ－Ｔ細胞を培養することを含む方法を使用して産生される、方法。
3. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾する方法であって、
   ａ）前記対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することと、
   ｂ）ステップａ）の少なくとも約１８時間後に、前記対象に、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団を投与することと、を含む、方法。
4. 対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾する方法であって、
   ａ）前記対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することと、
   ｂ）前記対象に、樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む免疫細胞の集団を投与することと、を含む、方法。
5. 前記免疫細胞の集団が、前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の約１８時間後～約７２時間後に投与される、請求項３又は４に記載の方法。
6. ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を低減させる方法であって、前記対象に、ＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤並びに／又はＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することを含み、前記対象に投与される前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が、前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で培養されている、方法。
7. 前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ２８ｚ共刺激ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
8. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、前記対象が、前記薬品の少なくとも１８時間後に、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団とともに投与される、使用。
9. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団の使用であって、前記対象が、前記薬品の少なくとも１８時間前に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されるか、又は投与されている、使用。
10. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用であって、前記薬品が、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、使用。
11. 対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の使用。
12. 対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための薬品の製造のための、樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む、免疫細胞の集団の使用であって、前記対象が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されているか、又は投与される、使用。
13. 対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団の産生に使用するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤。
14. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答の修飾に使用するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤であって、前記対象が、前記薬品の少なくとも１８時間後に、好ましくはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団とともに投与される、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤。
15. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞応答の修飾に使用するための、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む、免疫細胞の集団であって、前記対象が、前記薬品の少なくとも１８時間前に、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されるか、又は投与されている、免疫細胞の集団。
16. 対象における免疫応答を修飾するための方法であって、前記対象に、免疫細胞の集団及びチェックポイント阻害剤を投与することを含み、前記免疫細胞が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生され、好ましくは、前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである、方法。
17. 前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）であり、前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、請求項１６に記載の方法。
18. 治療が、いずれかの治療単独の効果と比較して相乗的である、請求項１７に記載の方法。
19. 対象における免疫応答、好ましくはＴ細胞免疫応答を修飾するための方法であって、前記対象に、
    （ｉ）好ましくは、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含む方法を使用して産生される、免疫細胞の集団であって、前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、又はそれらの組み合わせであり、最も好ましくは、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）である、免疫細胞の集団と、
    （ｉｉ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤と、を投与することを含む、方法。
20. 前記免疫応答又はＴ細胞免疫応答の修飾が、前記対象の生存期間を、ＣＡＲ－Ｔ細胞並びに／又はＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤を受けていない対象と比較して増加させる、請求項１～７若しくは１６～１９のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５に記載の免疫細胞の集団。
21. 生存期間が、３、６、９、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６ヶ月又はそれ以上増加する、請求項２０に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
22. 前記対象が、免疫枯渇されている、請求項１～７若しくは１６～２１のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２若しくは２０若しくは２１のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４若しくは２０若しくは２１のいずれか一項に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５若しくは２０若しくは２１のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
23. 前記対象が、リンパ枯渇化学療法又は放射線療法を使用してリンパ枯渇されている、請求項２２に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
24. 前記対象が、がん、感染症、又は炎症性疾患を有する、請求項１～７若しくは１６～２３のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２若しくは２０～２３のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４若しくは２０～２３のいずれか一項に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５若しくは２０～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
25. 前記感染症が、ウイルス感染症である、請求項２４に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
26. 前記対象が、結腸がん及び乳がんから選択されるがんを有する、請求項２４に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
27. 前記対象が、低抗原存在量に関連するがんを有する、請求項２４に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
28. 前記対象が、
    ｉ）低ＣＤ３３＋芽球が優性である急性骨髄性白血病、又は
    ｉｉ）低レベルのＣＤ１９及び／若しくはＣＤ２０を有するびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫を有する、請求項２７に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
29. 前記対象が、ヒトである、請求項１～７若しくは１６～２８のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２若しくは２０～２８のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４若しくは２０～２８のいずれか一項に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５若しくは２０～２８のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
30. 対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤。
31. 対象における樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞応答を修飾するための、樹状細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む、細胞の集団の使用であって、前記対象が、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤とともに投与されているか、又は投与される、使用。
32. 前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤が、トリシリビン（ＴＣＮ）、トリシリビン５’－モノホスフェート（ＴＣＮ－Ｐ）、ＡＫＴ阻害剤ＶＩＩＩ、ＭＫ－２２０６、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ－００６８、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＧＳＫ２１１０１８３塩酸塩から選択される、請求項１～７若しくは１６～２９のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２若しくは２０～２９若しくは３１のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４若しくは２０～３０のいずれか一項に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５若しくは２０～２９のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
33. 前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質阻害剤の阻害剤が、トリシリビン（ＴＣＮ）又はトリシリビン５’－モノホスフェート（ＴＣＮ－Ｐ）である、請求項１～７若しくは１６～２９若しくは３２のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２若しくは２０～２９若しくは３１のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４若しくは２０～３０のいずれか一項に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５若しくは２０～２９若しくは３２のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
34. 前記対象に投与されるＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の用量が、約２ｍｇ／ｋｇである、請求項１～７若しくは１６～２９若しくは３２若しくは３３のいずれか一項に記載の方法、請求項８～１２若しくは２０～２９若しくは３１～３３のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは１４若しくは２０～３０若しくは３２若しくは３３のいずれか一項に記載の使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は請求項１５若しくは２０～２９若しくは３２若しくは３３のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団。
35. 前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤が、前記対象に毎週２回静脈内に投与される、請求項３４に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
36. ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の第１の用量が、前記免疫細胞及び／又はチェックポイント阻害薬の投与と同時に投与される、請求項３５に記載の方法、使用、使用のためのＡＫＴ阻害剤及び／若しくはＰＨドメインタンパク質の阻害剤、又は免疫細胞の集団。
37. 対象における免疫応答、好ましくは対象におけるＴ細胞応答を修飾するための方法であって、前記対象に、チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体並びにＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を投与することを含み、治療の効果が、各治療の個々の効果と比較して相乗的である、方法。
38. 免疫細胞を含む細胞集団を産生する方法であって、ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で免疫細胞を培養することを含み、好ましくは、前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、骨髄細胞、又はそれらの組み合わせである、方法。
39. 前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）である、請求項３８に記載の方法。
40. ａ）対象から単離された免疫細胞の集団から、Ｔ細胞濃縮細胞集団を産生することと、
    ｂ）前記Ｔ細胞濃縮細胞集団を、キメラＴ細胞受容体をコードするベクターで形質転換することと、
    ｃ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で、ステップｂ）で得られた前記細胞を培養することと、を含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記方法を使用して産生される前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を含む、請求項３９又は４０に記載の方法。
42. 前記セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞が、前記方法を使用して産生される前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも約１０％を含む、請求項４１に記載の方法。
43. 前記セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞が、前記方法を使用して産生される前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の約１０％～約３０％を含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞が、前記方法を使用して産生されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の少なくとも約０．８％を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞が、前記方法を使用して産生される前記ＣＤ８＋ Ｔ細胞の約０．８％～約５％を含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞が、前記方法を使用して産生される総リンパ球の少なくとも約０．３７％を含む、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞が、前記方法を使用して産生される前記総リンパ球の約０．３７％～約５％を含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記Ｔ_ＣＭ細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ Ｔ細胞を含む、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記ＴＳ_ＣＭ細胞が、ＣＤ２７^＋ＣＤ９５^＋Ｔ細胞を含む、請求項４１～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞について前記培養された細胞を濃縮することを更に含む、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記方法が、前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも高いパーセンテージのセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を産生する、請求項３８～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記方法が、前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約２５％多いセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）及び／又は幹細胞（Ｔ_ＳＣＭ）Ｔ細胞を産生する、請求項５１に記載の方法。
53. 前記方法が、前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少ないパーセンテージの調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記方法が、前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＴ細胞よりも少なくとも約５％少ない調節（Ｔ_ＲＥＧ）Ｔ細胞を産生する、請求項５３に記載の方法。
55. 前記Ｔ_ＲＥＧ細胞が、ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞である、請求項５３又は５４に記載の方法。
56. 前記キメラ抗原受容体が、ウイルス抗原に結合する、請求項３９～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＣＡＲ－Ｔ細胞の集団よりも高い抗ウイルス活性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を産生する、請求項５６に記載の方法。
58. ａ）対象から単離された免疫細胞の集団から、樹状細胞濃縮細胞集団を産生することと、
    ｂ）ステップａ）からの前記細胞を抗原に曝露することと、
    ｃ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で前記細胞を培養することと、を含む、請求項３８に記載の方法。
59. 前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養される樹状細胞よりも多くの樹状細胞を産生する、請求項３８又は５８に記載の方法。
60. ａ）対象から単離された免疫細胞の集団から、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）濃縮細胞集団を産生することと、
    ｂ）ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤を含む培地中で、ステップａ）からの前記細胞を培養することと、を含む、請求項３８に記載の方法。
61. 前記ＡＫＴ阻害剤及び／又はＰＨドメインタンパク質の阻害剤の非存在下で同一の条件下で培養されるＮＫ細胞の集団よりも高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞の集団を産生する、請求項３８又は６０に記載の方法。
62. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３８～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記培養された細胞、又は前記免疫細胞を含むその亜集団が、前記対象に投与される、請求項３８～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 請求項４０～６３のいずれか一項に記載の方法を使用して産生される、免疫細胞の集団。
65. 前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも１０％が、ＣＤ８＋ Ｔ_ＣＭ及び／又はＴ_ＳＣＭ細胞である、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞集団。
66. 選別されていない、請求項６５に記載の細胞集団。
67. 前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の２５％未満が、Ｔ_ＲＥＧである、請求項６５又は６６に記載の細胞集団。
68. 請求項６４～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞の集団を含む、医薬組成物。