JP2023543163A - 造血細胞移植後の血液新生物再発の処置または予防で使用するためのｍｄｍ２阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、患者における造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤に関する。複数の実施形態では、血液新生物は、白血病、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。好ましくは、患者は、ＨＣＴと同時および／またはＨＣＴ後に、例えばＭＤＭ２投与の時点等において同種異系Ｔ細胞移植を受けた。さらに、本発明は、先行する主張のいずれかに基づき、患者において、造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのＭＤＭ２阻害剤およびエキスポーチン１（ＸＰＯ－１）阻害剤を含む医薬組成物に関する。

Description

本発明は、患者における造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤に関する。複数の実施形態では、血液新生物は、白血病、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。好ましくは、患者は、ＨＣＴと同時および／またはＨＣＴ後に、例えばＭＤＭ２投与の時点等において同種異系Ｔ細胞移植を受けた。さらに、本発明は、先行する主張のいずれかに基づき、患者において、造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのＭＤＭ２阻害剤およびエキスポーチン１（ＸＰＯ－１）阻害剤を含む医薬組成物に関する。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）再発は、同種異系造血細胞移植（アロＨＣＴ）を行った後、移植後１００日経過以降に生ずる死亡の主要原因である（１）。再発を促進する主要機構には、とりわけＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）の下方制御（２、３）、ミスマッチＨＬＡ４の喪失、免疫チェックポイントリガンドの上方制御（３）、およびＩＬ－１５産生低下（５）、および白血病由来の乳酸放出（６）が含まれる（７においてレビューされている）。ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体１および２を含むアポトーシス促進遺伝子の下方制御は、療法耐性およびＡＭＬにおける再発に関連することが明らかにされた（８）。このようなデータより、ＭＨＣ－ＩＩまたはＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現を増加させるアプローチがアロＨＣＴ後のＡＭＬ再発を処置するのに奏功的であり得ることが示唆される。

ＡＭＬ再発に対する現行の薬理学的アプローチには、その他のＦＬＴ３キナーゼ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、脱メチル化剤、ｂｃｌ－２阻害剤等がさらに含まれる（９においてレビューされている）。マウス二重微小染色体－２（ＭＤＭ２）阻害剤（１０、１１）は、ＡＭＬにおいてｐ５３依存性アポトーシスを誘発することができるが、しかしながらアロＨＣＴ後の状況におけるその役割についてこれまで評価されたことはなかった。

先行技術に鑑み、白血病またはリンパ腫の再発、特にＨＣＴ後のＡＭＬの再発を処置するための追加の手段および／または改善した手段を提供するという、当技術分野において重大な必要性が存続する。特に、そのような処置は、白血病細胞内でＭＨＣ－ＩＩまたはＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２の発現を増加させる化合物を包含し得る。しかしながら、そのような化合物は今日まで入手可能ではなく、そのような化合物の提供に対する必要性が存続する。

先行技術に鑑み、本発明に潜在する技術的問題は、白血病またはリンパ腫の再発、特にＨＣＴ後のＡＭＬ再発を処置するための代替的手段および／または改善した手段を提供することである。そのような手段は、白血病細胞内ＭＨＣ－ＩＩまたはＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現において、その発現の上方制御または維持を媒介するのに適する化合物、分子、および／または組成物を含むべきである。

この問題は、独立請求項の特徴により解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属項により提供される。

したがって、本発明は、患者における造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤に関する。ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＣＴの投与前、および／またはそれと同時、および／またはその後（好ましくはＨＣＴの後）に投与され得る。

本発明は、ＨＣＴ後の、血液新生物に罹患した患者におけるがん細胞の再発は、ＭＤＭ２阻害剤の投与により特異的に処置または予防可能であるというまったく驚くべき知見に基づく。本発明は、ＭＤＭ２を阻害すると、がん細胞、例えば白血病細胞またはＡＭＬ細胞等内のＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ分子、ならびにＴＲＡＩＬ－受容体の上方制御を引き起こすという予期せぬ発見まで遡る。これは、ＨＣＴと共に、および／または同種異系Ｔ細胞の分離移植（同種異系のドナーリンパ球輸注；ＤＬＩ）と共に患者に導入された同種異系Ｔ細胞による患者がん細胞の認識の大規模な強化を引き起こす。換言すれば、ＭＤＭ２阻害剤に曝露することで、がん細胞が患者にとって免疫学的に「目視可能」となり、または移植された同種異系Ｔ細胞が、がん細胞をたちどころに認識および攻撃することができるように、免疫学的「可視性」が強く強化される。

ＭＤＭ２タンパク質は、ｐ５３のＮ末端トランス活性化ドメインを認識するユビキチンリガーゼとして、およびｐ５３転写活性化の阻害剤として機能する。Ｍｄｍ２の過剰発現は、発癌性Ｒａｓと連携して、齧歯類一次線維芽細胞の変換を促進するが、またＭＤＭ２阻害はｐ５３活性を増加させることができる（１１）。ＭＤＭ２効果はｐ５３タンパク質レベルの低下を経由するが、そのような低下は腫瘍細胞における新規突然変異の蓄積を促進し、これによりその悪性度を増強する。その抗発癌作用に加えて、ｐ５３は、ある特定の免疫関連遺伝子の発現を増加させることができる。本発明の文脈において、類似した機構が、血液新生物のがん細胞内、特にＡＭＬ細胞内で作動可能であること、すなわちＨＬＡクラスＩＩ分子およびＴＲＡＩＬ受容体を上方制御することで、アロＨＣＴ後のアロ反応性ドナーＴ細胞応答に対するそのような細胞の感受性をより高めることが驚くべきことに見出された。

ＭＤＭ２阻害が、白血病およびリンパ腫細胞、例えば一次ヒトＡＭＬ細胞およびＡＭＬ細胞系等内でＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現を引き起こすことはまったく予期されなかった。ＴＲＡＩＬがライゲートすると、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体は、その細胞内細胞死ドメイン（ＤＤ）において、ＦＡＳ関連タンパク質から構成される細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を細胞死ドメイン（ＦＡＤＤ）およびプロカスパーゼ８／１０と会合させる（１７）。ＴＲＡＩＬ－Ｒの活性化は、抗腫瘍活性を有することが明らかにされた（１８）。

さらに、ＭＤＭ２阻害は、一次白血病およびリンパ腫細胞、特にヒトＡＭＬ細胞上でのＭＨＣ－ＩＩ発現も増加させ、アロＨＣＴ後のＡＭＬ再発において観察されるＭＨＣ－ＩＩ減少を逆転させるための薬理学的介入を提供し得ることがここで発見された（２、３）。

複数の実施形態では、血液新生物は、白血病、リンパ腫、および骨髄異形成症候群を含む群から選択される。複数の実施形態では、血液新生物は、白血病、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

複数の実施形態では、血液新生物は、新生細胞内でのＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４発現を誘発する１つまたは複数の突然変異、例えば発癌突然変異等を含む。

驚くべきことに、ある特定の突然変異は、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４を誘発し、ＭＤＭ２阻害剤を用いた処置に対するそのような新生物的がん細胞の感受性を特に高める。好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４誘発性突然変異を含む血液新生物はＡＭＬである。ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４誘発性突然変異は、例えば点突然変異または融合遺伝子であり得る（染色体転座を通じて形成され得る）。

ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４誘発性突然変異は、非限定的に、ｃＫｉｔ－Ｄ８１６Ｖ、ＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－α、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、およびＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆを含む群から選択され得る。さらなるＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４誘発性突然変異は、例えば本明細書に記載される技術を使用することにより同定され得る。

ｃＫｉｔ－Ｄ８１６Ｖは、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における悪性細胞増殖だけでなく、全身性肥満細胞症および胚細胞腫瘍にも関わっているＫｉｔ遺伝子のコドン８１６の活性化突然変異であるが、それは、アスパラギン酸とバリンとの置換（Ｄ８１６Ｖ）により特徴づけられ、ならびに活性化およびシグナル伝達について受容体をリガンド非依存性にする。

ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲα融合遺伝子が、造血器悪性腫瘍、特にＡＭＬに関係する好酸球、好中球、マスト細胞、単球、Ｔリンパ球、およびＢリンパ球において検出された。ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲ－α関連のチロシンキナーゼ活性を保持するものの、ＰＤＧＦＲ－αとは異なり、そのチロシンキナーゼは構成的であり、すなわち常に活性である：融合タンパク質はＰＤＧＦＲ－α本来の膜近傍ドメイン（ＰＤＧＦＲ－αがその活性化リガンドである血小板由来増殖因子に結合する場合を除き、チロシンキナーゼ活性を通常ブロックする）を欠いている。ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲ－αの正常な分解経路、すなわちプロテアソーム依存性ユビキチン化に対して耐性でもある。したがって、該タンパク質は、非常に安定、長寿命、非制御性であり、ＰＤＧＦＲＡチロシンキナーゼコンポーネントの刺激作用を連続的に発現する。

ＭＤＭ２阻害剤を用いてＨＣＴを行った後の造血新生物再発、例えばＡＭＬ再発等を、好ましくは同種異系Ｔ細胞移植と組み合わせて処置することは、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４誘発性突然変異を有する新生物を有する患者において特に有効である。したがって、好ましい実施形態では、患者は、そのような突然変異、例えばＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ｃＫｉｔ－Ｄ８１６Ｖ、またはＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－α等を有する造血新生物に侵されていることが既知である。

複数の実施形態では、ＨＣＴは同種異系ＨＣＴである。ＨＬＡ分子に関する差異に起因して、移植によって含まれた同種異系Ｔ細胞は、ＨＣＴ後に再発するがん細胞を標的とする移植片対白血病または移植片対がん細胞応答を生成することができるので、造血細胞移植は同種異系であるのが好ましい（Ｔ細胞非枯渇性であるのが最も好ましい）。したがって、ＭＤＭ２阻害剤の投与は、がん細胞に対する移植Ｔ細胞のより強い抗がん効果を引き起こす可能性があり、ＨＣＴ後のがんの再発を予防することができるか、または再発が生じた後のがん細胞の制御もしくは根絶を実現することができる。

複数の実施形態では、ＨＣＴはＴ細胞を含む。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＣＴ後かつ再発発生前に患者に投与される。本発明の文脈において、ＭＤＭ２阻害剤は、様々な時点において患者に投与可能である。例えば、阻害剤は、ＨＣＴの時点において（造血細胞移植の時点）、例えば同一日等に投与され得る。複数の実施形態では、残存するがん細胞が造血細胞移植に含まれるＴ細胞にとって速やかに視認可能となるように、ＨＣＴの前に、例えばＨＣＴより１、２、３、４、５、６、または７日等前に阻害剤がすでに投与されているのが有用であり得る。ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＣＴ後、例えばＨＣＴから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日後等、またはそれより後においても投与可能である。いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＣＴの投与前、それに先立ち、およびその後に投与される。好ましくは、ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＣＴ投与後に（のみ）投与される。

ＭＤＭ２阻害剤の投与は複数回生じる可能性があり、また定期的にさえ、例えば毎日、２日に１回、４日に１回、毎週、毎月、（反復式の）２８日スケジュールの１～５日目、または（反復式の）２８日スケジュールの１～７日目等反復され得る。

ＭＤＭ２阻害剤の投与は、例えば、患者において、移植片対がん効果を強化し、がん再発の発生を予防するために、予防手段としてＨＣＴを受けた、および／または受けている、および／または将来受ける、血液新生物を有する患者においてルーチン的に生じ得る。

複数の実施形態では、阻害剤は、ＨＣＴ後に再発が発生した後の白血病患者に投与される。ＭＤＭ２阻害剤投与は、血液新生物を有する患者において、ＨＣＴ後に再発が発生した後の治療手段であり得る（おそらくはさらなる同種異系Ｔ細胞移植（好ましくは、造血幹細胞を含有しないドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ））と組み合わせて）。

一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＣＴ後、およびａ）同種異系Ｔ細胞移植の前、および／またはｂ）同種異系Ｔ細胞移植と同一日、および／またはｃ）同種異系Ｔ細胞移植後に投与される。

この文脈において、ＭＤＭ２阻害剤のコンビナトリアル投与および同種異系Ｔ細胞移植は、阻害剤および細胞の協働的投与と関連し得るものと理解される。２つの生成物は、単一組成物において投与される必要はなく、個別の組成物として、また異なる時点において投与可能である。例えば、患者は、例えばＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、およびＨＬＡクラスＩＩ分子の上方制御を誘発するために、第１のＭＤＭ２阻害剤の投与を受けることができ、後ほど、例えば同一日の遅い時期、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日後等にＴ細胞移植を受けることができる。しかしながら、２つの生成物は、ほぼ同時に、すなわちおよそ８時間以内に投与することも可能であり、またはＭＤＭ２阻害剤は、Ｔ細胞移植が投与された後に投与することが可能である。この文脈において、生成物の一方または両方（ＭＤＭ２阻害剤またはＴ細胞移植）は、協働した方式で患者に対して１回超投与可能である。

本発明の文脈において、さらなる生成物、例えばＨＣＴ、同種異系Ｔ細胞移植、および／またはＰＯ－１阻害剤等とのＭＤＭ２の協働投与は、阻害剤の治療効果または予防効果を強化するための、ＭＤＭ２阻害剤とその他の生成物との投与に関係するものと理解される。当業者は、ＭＤＭ２阻害剤の投与を受ける患者の具体的症例に応じて適する投与法を選択し、阻害剤およびその他の化合物／生成物の各投与を調整することができる。さらに、例えば、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６ＶおよびＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－αはＭＤＭ２およびＭＤＭ４を誘発することが観察されたように、ＭＤＭ２の発現を誘発するある特定の突然変異を有する白血病は極めて良好に応答する可能性が高い。これに整合して、アロＨＣＴ（骨髄移植）後のアロＴ細胞／ＭＤＭ２阻害剤の併用は、ＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－α突然変異体およびｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ突然変異体ＡＭＬを有するマウスにおいて極めて有効であることを明らかにすることができた。

複数の実施形態では、本発明の処置は、ＨＣＴと同時および／またはＨＣＴ後に同種異系Ｔ細胞移植の投与をさらに含む。複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞移植は、リンパ球を含むが、しかし造血幹細胞を含まないドナーリンパ球輸注である。複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞移植のドナーは、ＨＣＴのドナーでもあった。

本発明の文脈において、ＭＤＭ２阻害剤は、好ましくはＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８）、ＡＭＧ－２３２（ＫＲＴ－２３２）、ＡＰＧ－１１５、ＢＩ－９０７８２８、ＣＧＭ０９７、シレマドリン（ＨＤＭ－２０１）、およびミラデメタン（ＤＳ－３０３２ｂ）、ならびに薬学的に許容されるその塩を含む群から選択される。一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、シレマドリン（ＨＤＭ－２０１）、またはその薬学的に許容される塩もしくは共結晶（例えば、コハク酸共結晶またはコハク酸塩）である。

様々なＭＤＭ２阻害剤が、当技術分野において公知であり、またＭＤＭ２阻害剤を同定するための複数の確立されたアッセイ法が記載されおり、様々な状態を処置するために調査中である（Marina Konopleva et al. leukemia. 2020 Jul 10. doi: 10.1038/s41375-020-0949-z）。しかしながら、血液新生物を有する患者において、ＨＣＴ後のがんの再発を特異的に処置または予防するためのＭＤＭ２阻害剤の使用については、当技術分野において記載されておらずまた示唆もされていない。そのような処置の利点はこれまでに記載されたことがなく、また血液新生物のがん細胞、例えば白血病細胞等は、同種異系Ｔ細胞によるがん細胞の認識を強化する分子を上方制御するというまったく驚くべき知見に基づく。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤を投与すると、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子のうちの１つまたは複数について上方制御を引き起こす。したがって、複数の実施形態では、ＭＤＭ２の阻害は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子のうちの１つまたは複数について上方制御を引き起こす。複数の実施形態では、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子のうちの１つまたは複数の上方制御、特にＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２の上方制御は、ｐ５３依存性である。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤を投与すると、がん細胞に対するＣＤ８＋アロＴ細胞の細胞傷害性が増加し、その場合、好ましくは、ＣＤ８＋アロＴ細胞の細胞傷害性は、がん細胞のＴＲＡＩＬ－ＲとＣＤ８＋アロＴ細胞のＴＲＡＩＬ－リガンド（ＴＲＡＩＬ－Ｌ）との相互作用に少なくとも部分的に依存する。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤を投与すると、移植片対白血病（ＧＶＬ）または移植片対リンパ腫反応が増加し、その場合、好ましくは、移植片対白血病反応または移植片対リンパ腫反応はＣＤ８＋アロＴ細胞により媒介される。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤を投与すると、ＣＤ８＋アロＴ細胞による、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＣＤ６９のうちの１つまたは複数の発現が増加する。したがって、本発明の１つの態様によれば、ＣＤ８＋アロＴ細胞による、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＣＤ６９のうちの１つまたは複数の発現を増加させる方法であって、ＨＣＴ（例えばＴ細胞を含む、例えば同種異系間ＨＣＴ）と組み合わせてＭＤＭ２阻害剤（例えば、ＨＤＭ２０１または薬学的に許容されるその塩）を投与することを含む方法が本明細書により提供される。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤を投与すると、Ｔ細胞において、特にＣＤ８＋Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋アロＴ細胞等において寿命の特性を誘発する（（１３）に記載されるように）。例えば、複数の実施形態では、移植されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＤＭ２阻害の文脈において、Ｂｃｌ－２および／またはＩＬ－７Ｒ（ＣＤ１２７）について高発現性を示す。さらに、複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤を投与すると、高抗原リコール応答を有するＣＤ８＋Ｔ細胞、例えばＣＤ２７を欠いているＣＤ８＋Ｔ細胞等を誘発する（例えば、（１２）において定義される）。複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤処置は、ＣＤ８＋ＣＤ２７＋ＴＩＭ３＋ドナーＴ細胞の減少を誘発する。

本発明のまったく予期されないさらなる知見として、ＭＤＭ２阻害剤を投与することで、本明細書に記載されるようながん細胞上の受容体および表面分子の上方制御がもたらされるだけでなく、患者内の同種異系Ｔ細胞において有利な表現型が誘発され、がん細胞に対するＴ細胞のより強い細胞傷害効果ももたらされることが挙げられる。概言すれば、ＭＤＭ２阻害剤は、ＣＤ８＋アロＴ細胞内でより細胞傷害性の表現型を誘発し、再発性のがん細胞に対してＣＤ８＋アロＴ細胞をより「攻撃性」にすることができる。したがって、本発明の１つの態様によれば、ＣＤ８＋アロＴ細胞においてより有効な細胞傷害性表現型を誘発する方法であって、ＨＣＴ（例えばＴ細胞を含む、例えば同種異系間のＨＣＴ）と組み合わせて、ＭＤＭ２阻害剤（例えば、ＨＤＭ２０１または薬学的に許容されるその塩）を投与することを含む方法が本明細書により提供される。

複数の実施形態では、本発明に従い、対象にＭＤＭ２阻害剤を投与すると、移植片対白血病反応期間中に、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞の糖分解活性が強化される。したがって、複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害は、対象においてＴ細胞の糖分解活性増加を引き起こす。したがって、本発明の１つの態様によれば、ＣＤ８＋アロＴ細胞内の糖分解活性を増強する方法であって、ＨＣＴ（例えばＴ細胞を含む、例えば同種異系間のＨＣＴ）と組み合わせてＭＤＭ２阻害剤（例えば、ＨＤＭ２０１または薬学的に許容されるその塩）を投与することを含む方法が本明細書により提供される。

本明細書に示す通り、ＭＤＭ２阻害は、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞内の糖分解活性の増加（より強いＴ細胞活性化およびＧＶＬ活性の増加を示唆する）を引き起こす。複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤処置は、対象において、Ｔ細胞の活性化を増加させ、および／またはＴ細胞のＧＶＬ活性を増加させる。Ｔ細胞は、内因性のまたは投与されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋アロＴ細胞であり得る。下記の例に示す通り、対象のＭＤＭ阻害は、前記対象におけるＴ細胞の糖分解活性増加を誘発する。

本発明の文脈におけるＭＤＭ２阻害剤を投与することで、糖分解活性が強化され／増加したＴ細胞表現型が誘発され、ＣＤ８＋アロＴ細胞の細胞傷害活性がさらに改善することはまったく予期されなかった。

複数の実施形態では、患者は、エキスポーチン１（ＸＰＯ－１）阻害剤の投与をさらに受けてもよい。したがって、複数の実施形態では、本発明は、本発明に従い使用されるＭＤＭ２阻害剤に関し、その場合、処置はエキスポーチン－１（ＸＰＯ－１）阻害剤の投与をさらに含む。

下記の例に示す通り、ＡＭＬ細胞におけるＭＤＭ２阻害はＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現増加を引き起こし、ＡＭＬ細胞に対するＧＶＬを強化するが、それは、ＨＣＴ後に再発した場合の患者の処置の文脈において、またはＨＣＴ後の再発を防止するのに非常に大きな長所であり得る。ＸＰＯ－１分子は、核からのｐ５３の排出に関与し、またある特定のがん性細胞において、ＭＤＭ２阻害時に、ＸＰＯ－１はｐ５３誘発性のＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２／ＭＨＣ－ＩＩ生成を低下させることが驚くべきことに見出された。したがって、ＭＤＭ２阻害の効果を最大化するために、本発明の文脈においてＸＰＯ－１をさらに阻害することが有利である。ＭＤＭ２阻害剤およびＸＰＯ－１阻害剤は、ＭＤＭ２阻害剤と造血細胞移植または同種異系Ｔ細胞移植との複合投与について上記したように、協働した方式で投与可能である。２つの阻害剤の投与は個別に、または両阻害剤を含む医薬製品または組成物の形態で生じ得る。

したがって、本発明は、先行する主張のいずれかに基づき、患者において、造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのＭＤＭ２阻害剤およびエキスポーチン１（ＸＰＯ－１）阻害剤を含む医薬組成物とも関連する。そのような医薬組成物は、本明細書に記載されるすべての実施形態の文脈において使用可能である。

さらに、本発明の１つの態様によれば、患者内の血液新生物の処置および／または予防において使用するためのＸＰＯ－１阻害剤であって、該処置が造血細胞移植（例えばＴ細胞を含む、例えば同種異系間の）およびＭＤＭ２阻害剤の投与をさらに含む、ＸＰＯ－１阻害剤が本明細書により提供される。

特許および特許文献の全引用文書は、本明細書により参照によりそのまま組み込まれる。

したがって、本発明は、患者において、造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤に関する。

本明細書で使用される場合、血液新生物再発の「予防」は、血液新生物再発が生じないことの保証と関連する任意の方法、プロセス、または行為に関係することとして理解される。予防は、再発の状況を回避するように意図された予防的処置に関する。「予防的」処置は、病理学を発症するリスク、本ケースではＨＣＴ後の再発の発生を減少させるために、疾患の兆候を示さない、または初期の兆候のみを呈する対象に対して投与される処置である。

用語「処置」とは、疾患の兆候もしくは症状、または病理学的状態（ここでは、ＨＣＴ後の血液新生物の再発）を、その発症開始後に良化させる治療介入を指す。本明細書で使用される場合、用語「～を良化させること」とは、疾患または病理学的状態と紐づけられるとき、処置のあらゆる観測可能な有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、易罹患性の対象における疾患の臨床症状の発現遅延、疾患の臨床症状の一部または全部における重症度の低下、疾患進行の低速化、対象の全体的な健康もしくは健全性における改善により、または特定の疾患に固有の、当技術分野において周知されているその他のパラメーターにより証明され得る。

本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」には、ヒトおよび獣医学対象の両方、特に哺乳動物およびその他の生物が含まれる。用語「レシピエント」は、ＨＣＴおよび本発明のＭＤＭ２阻害剤の投与を受ける患者または対象に関する。

用語「新生物」は、組織の新たな異常増殖に関するものと理解されよう。悪性新生物は、良性新生物と比較してより重度の退形成を示し、また浸潤および転移の特性を有する。本明細書で使用される場合、用語「血液新生物」は、血液および造血組織（骨髄やリンパ組織）に位置する新生物に関する。最も一般的な形態は、様々な種類の白血病、リンパ腫、および骨髄異形成症候群、特に進行性の生命を脅かす骨髄異形成症候群の形態である。

血液新生物という用語は、血液、骨髄、リンパ液、およびリンパ系に影響を及ぼす腫瘍およびがんに関係する、造血およびリンパ系組織の腫瘍およびがんを含む。造血およびリンパ系組織は、循環系および免疫系の両方を通じてすべて緊密に結びついているので、一方に影響を及ぼす疾患は、多くの場合他方にもやはり影響を及ぼし、骨髄増殖とリンパ球増殖（したがって、白血病およびリンパ腫）を密接に関連付け、多くの場合重複した問題となる。

本発明の主題である造血器悪性腫瘍は悪性新生物（「がん」）であり、それは、内科の下位専門領域として、血液学および／または腫瘍学の専門医により一般的に処置されるが、外科的および放射線腫瘍学者もそのような状態に関係する。造血器悪性腫瘍は、２つの主要な血液細胞系統、すなわち骨髄細胞系およびリンパ系細胞系に由来し得る。骨髄細胞系は、果粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、およびマスト細胞を通常生成する；リンパ系細胞系は、Ｂ、Ｔ、ＮＫ、および血漿細胞を生成する。リンパ腫、リンパ球性白血病、およびミエローマはリンパ球系に由来する一方、急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および骨髄増殖性疾患は骨髄起源である。

本発明の文脈において、白血病として、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球白血病、幹細胞白血病、急性単球白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（lymphatic leukemia）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病（lymphogenous leukemia）、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞白血病が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

本発明によれば、リンパ腫には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ; mucosa-associated lymphoid tissue）リンパ腫としても知られている）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、および脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンシュトレームマクログロブリン血症）、有毛状細胞性白血病原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚のＴ細胞リンパ腫（菌状息肉腫、セザリー症候群等）、くすぶり型、慢性、急性、およびリンパ腫サブタイプを含む成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、鼻腔タイプ、腸疾患関連の腸管Ｔ細胞性リンパ腫（ＥＡＴＬ; enteropathy-associated intestinal T-cell lymphoma）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ; anaplastic large cell lymphoma）、および不特定の末梢性Ｔ細胞リンパ腫を含む、ただしこれらに限定されないホジキンおよび非ホジキンリンパ腫（Ｂ細胞およびＴ細胞リンパ腫）が含まれる。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄内の未成熟の血球が成熟せず、したがって健康な血球とならないがんの群である。症状として、疲労感、息切れ、容易な出血、または高頻度の感染症を挙げることができる。一部のタイプは、急性骨髄性白血病に発展するおそれがある。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄および血液中に蓄積する異常細胞の急速な増殖により特徴づけられ、正常な血球細胞の生成を妨害する血球の骨髄細胞系のがんである。症状として、疲労感、息切れ、容易な紫斑および出血、ならびに感染症に対するリスクの増加を挙げることができる。時に、脳、皮膚、または歯肉にまで拡散する場合もある。急性白血病、ＡＭＬは急速に進行するので、未処置のまま放置される場合には、一般的に数週間または数カ月以内に死に至る。ＡＭＬは、一般的には、寛解の誘発を目的として化学療法によりまず処置される。病人は、次に追加の化学療法、放射線療法、または幹細胞移植を継続して受ける可能性がある。がん細胞内に存在する特定の遺伝子突然変異は療法の指針となり、ならびに病人が後どのくらい生き延びるか明確にし得る。

血液新生物および造血器悪性腫瘍の侵襲的形態は、化学療法、放射線療法、免疫療法、および骨髄移植（造血細胞移植（ＨＣＴ）の形態である）を用いた処置を必要とする。

造血細胞移植（ＨＣＴ）（造血幹細胞移植（ＨＳＣＴとも呼ばれる））は、通常骨髄、末梢血液、または臍帯血に由来する多分化能造血幹細胞の移植である。ＨＣＴは、自系（患者自身の幹細胞が使用される）、同種異系（幹細胞はドナーに由来する）、またはシンジェニック（一卵性双生児由来）であり得る。ＨＣＴは、血液もしくは骨髄、またはリンパ系のある種のがん、例えば多発性骨髄腫または白血病等を有する患者に対して実施される。この場合、レシピエントの免疫系は、通常、造血幹細胞移植片の移植前に、放射線および／または化学療法、あるいは当技術分野において公知のその他の方法を用いて完全に（またはいくつかのケースでは部分的にのみ）破壊される（骨髄破壊または部分的な骨髄破壊）。感染症および移植片対宿主病は、同種異系ＨＣＴの主要な合併症である。ＨＣＴは多くの合併症の可能性を有する危険な手技であり、したがって生命を脅かす疾患を有する患者にほぼ限定して実施される。

本発明の文脈において、ＨＣＴは同種異系であるのが好ましい。自系ＨＣＴとの比較において、がんの再発生／再発リスクは低下する。同種異系ＨＣＴには、ドナー（健常者）およびレシピエント（患者）が関係する。同種異系ＨＣＴドナーは、レシピエントのものと一致する組織型（ヒト白血球抗原、ＨＬＡ）を有さなければならない。一致させる工程は、ＨＬＡ遺伝子の３つ以上の遺伝子座における相違性に基づき通常実施され、これらの遺伝子座における完全一致が好ましい。これらの重要な対立遺伝子において良好な一致性が存在したとしても、レシピエントは、移植片対宿主病を緩和するために免疫抑制薬を必要とする。同種異系移植ドナーは、親族（通常ＨＬＡが密接に一致した兄弟）であってもよく、また非親族（親族ではないが、非常に近いＨＬＡ一致性を有することが判明したドナー）であってもよい。同種異系移植は、幹細胞の起源として臍帯血を使用しても実施される。一般的に、健康な幹細胞をレシピエントの血流に輸注して健康な免疫系を再形成することにより、同種異系ＨＣＴは、直近の移植関連の合併症が消散してしまえば、治癒または長期寛解の機会を改善すると思われる。

潜在的なドナーの血液から追加のＨＬＡテストを行うことにより、適合性を有するドナーが見出される。ＨＬＡ遺伝子は２つの分類（Ｉ型およびＩＩ型）に該当する。一般的に、Ｉ型遺伝子（すなわち、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ）のミスマッチは移植片拒絶のリスクを増加させる。ＨＬＡ ＩＩ型遺伝子（すなわち、ＨＬＡ－ＤＲまたはＨＬＡ－ＤＱＢ１）のミスマッチは移植片対宿主病のリスクを増加させる。

ドナー細胞の考え得る供給源には、非限定的に骨髄、末梢血幹細胞、羊水、および臍帯血が含まれる。

移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、同種異系移植に固有の炎症性疾患であり、またレシピエント組織に対する「新しい」骨髄の免疫細胞による攻撃により媒介される。免疫系はその組織間のその他の差異をなおも認識する可能性があるので、ドナーおよびレシピエントがＨＬＡ同一であったとしてもＧＶＨＤが生じ得る。急性移植片対宿主病は移植後の最初の３カ月内に一般的に生じ、また皮膚、腸、または肝臓と関係し得る。高用量コルチコステロイド、例えばプレドニゾン等が標準処置法である；しかしながら、この免疫抑制処置は致命的な感染症を多くの場合引き起こす。死に至る頻度はそれほど多くはないものの、慢性移植片対宿主病も同種異系移植後に発症する場合があり、遅発性の処置関連合併症の主要な起源である。

本発明の複数の実施形態では、移植されたアロＴ細胞は、本明細書に記載されるようなＭＤＭ２阻害により強化される移植片対腫瘍効果（ＧｖＴ）に関与する。ＧｖＴ効果は同種異系ＨＣＴ後に現れる。移植片は、残存する悪性細胞を除去することによってレシピエントにとって有益となり得るドナーＴ細胞（Ｔリンパ球）を含有することが可能であり、また本発明の文脈において、患者が１つまたは複数回の追加的な同種異系Ｔ細胞移植を受けることも可能である。

ＧｖＴは、腫瘍特異的またはレシピエント特異的アロ抗原を認識した後に発現する。ＧｖＴは、血液悪性腫瘍の寛解または免疫制御をもたらすことができ、したがってＨＣＴ後の血液新生物再発の予防または処置の文脈において利用可能である。この効果は、ミエローマおよびリンパ性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、およびおそらくは乳がんにも当て嵌まり、また本発明の文脈において、移植片対白血病効果、または移植片対リンパ腫効果、または移植片対多発性骨髄腫効果と呼ばれ得る。同種免疫の基礎原理は同一であるので、この効果は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と密接に関連している。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、有益なＧｖＴ効果を失うことなくＧｖＨＤを抑制するのに使用可能であり、また当業者は、ＧｖＴ効果を微調整するために、本発明の特定の実施形態に手を加えることができる。ＧｖＴは、造血細胞上で特異的に、またはいくつかの組織細胞上ではより幅広く発現している多形性マイナー組織適合抗原または腫瘍関連抗原との反応と関係している可能性が極めて高い。ＧｖＴは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により主に媒介されるが、しかし別のエフェクターとしてナチュラルキラー（ＮＫ細胞）がそれを利用する可能性がある。

移植片対白血病（ＧｖＬ）は特別な種類のＧｖＴ効果であり、またＨＣＴ前の骨髄機能廃絶処置後に存続および増殖して患者の再発を引き起こす可能性のある、宿主の白血病細胞に対する反応である。該効果は同種免疫原理に依存し、また宿主に対する移植片反応の一部分であるので、ＧｖＬは遺伝的不均衡を必要とする。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は宿主に対して悪影響を有する一方、ＧｖＬは造血器悪性腫瘍を有する患者にとって有益である。ＨＣＴ後にＧｖＬおよびＧｖＨＤの両方が発現し得る。ＨＣＴ後の白血病再発をＧｖＨＤの発現と比較することにより、これら２つ効果の相互関連性を認めることができる。慢性または急性のＧｖＨＤを発現する患者は、白血病を再発する機会がより低い。Ｔ細胞枯渇幹細胞移植を行うとき、ＧｖＨＤは部分的に妨害され得るが、しかし同時に、Ｔ細胞はこれらの効果の両方において重要な役割を演じているのでＧｖＬ効果も低下する。したがって、Ｔ細胞枯渇は、本発明の文脈において好ましくない。造血器悪性腫瘍の処置におけるＧｖＬ効果の可能性は、ＧｖＨＤにより制限される。ＨＣＴ後にＧｖＬを誘発するがＧｖＨを誘発しない能力は、このような患者にとって非常に有益となろう。移植後のＧｖＨＤを抑制するかまたはＧｖＬを強化するいくつかの戦略が存在するが、しかしそのいずれもこの問題に対する理想的な解決策を提供しない。しかしながら、本明細書に記載されるようなＭＤＭ２阻害剤の使用は、ＧｖＬおよびＧｖＴ反応の促進を可能にする新たな戦略を代表する。

造血器悪性腫瘍のいくつかの形態、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において、ＨＣＴ期間中に必須の細胞は、ドナーのＴ細胞の他に、ＫＩＲ受容体と相互作用するＮＫ細胞である。ＮＫ細胞は初期細胞の中に存在し宿主の骨髄を蘇生させる（それが移植生着において重要な役割を演じていることを意味する）。ＧｖＬ効果におけるその役割に対して、そのアロ反応性が必要とされる。ＫＩＲおよびＨＬＡ遺伝子は独立に遺伝するので、理想的なドナーは、適合性を有するＨＬＡ遺伝子およびＮＫ細胞のアロ反応を同時に誘発するＫＩＲ受容体を有し得る。これは非血縁ドナーのほとんどに生ずる。

非枯渇Ｔ細胞移植を使用するとき、ＧｖＨＤまたは移植拒絶反応を防止するために、シクロホスファミドが移植後に使用される。ＧｖＨＤを抑制し、かつＧｖＬを増強するために現在臨床的に使用されるその他の戦略は、例えば移植条件の最適化、または移植後のドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）である。可能性の１つはサイトカインの使用である。果粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が、移植期間中にＨＳＣを動員し、Ｔ細胞忍容性に関与するのに使用される。Ｇ－ＣＳＦは、ＬＰＳおよびＴＮＦ－αのレベルを低下させることにより、ＧｖＬ効果を強化し、かつＧｖＨＤを抑制するのに役立ち得る。Ｇ－ＣＳＦの使用もＴｒｅｇのレベルを増加させ、ＧｖＨＤの予防にも役立ち得る。その他のサイトカイン、例えばＫＧＦ、ＩＬ－１１、ＩＬ－１８、およびＩＬ－３５も、ＧｖＬを排除することなく、ＧｖＨＤを防止または低下させるのに使用可能である。

同種異系ＨＣＴは、高リスク悪性腫瘍に対する集中治療処置を代表するので、再発防止が不奏功であっても、奏功的な救済処置に対するいくつかの選択肢が残されている。多くの患者では再発からの初期死亡率が高い一方、一部の患者は応答し、持続的寛解を有するが、またごく少数は、適する療法を用いた第２の治癒の機会を有する。ＭＤＭ２阻害はアロＴ細胞に対する残存性または再発性がん細胞の可視性を増加させるので、本発明はＨＣＴ後の再発を処置および予防するための新規戦略を代表する。ＨＣＴ後の造血器悪性腫瘍再発の予後は、４つの因子：ＳＣＴから再発までの経過時間（６カ月以内に生ずる再発は最悪の予後を有する）、疾患タイプ（慢性白血病および一部のリンパ腫はさらなる処置により治癒する第２の可能性を有する）、疾病負荷および再発の部位（疾患が早期に処置された場合には、処置成功率はより良好となる）、ならび第１回移植の状態（アロ免疫効果、標的薬剤による抗白血病効果の特異性、または第２回移植におけるコンディショニングの強度のいずれかを増加させる機会が存在する患者について優れた転帰がもたらされる）に主に依存する。これらの特徴は、改変された第２回移植、化学療法、目標を定めた抗白血病療法、免疫療法、または緩和ケアのいずれかに処置を方向づける。ＨＣＴ後の再発は腫瘍学における重要な問題であり、また当業者は、例えばＢａｒｒｅｔｔら（Expert Rev Hematol. 2010 Aug; 3(4): 429-441.doi: 10.1586/ehm.10.32）によりレビューされるような再発を引き起こす病理機構、最新の処置選択肢、およびＨＣＴ後に再発した場合の患者の管理法について最新の理解を認識している。

マウス二重微小染色体２同族体（ＭＤＭ２）は、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２としても知られており、またヒトにおいてＭＤＭ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＭＤＭ２は、ｐ５３腫瘍抑制因子の重要な負の制御因子であり、またｐ５３腫瘍抑制因子のＮ末端トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）を認識するＥ３ユビキチンリガーゼとして、およびｐ５３転写活性化の阻害剤として、両様に機能する。

非対立性のｐ５３活性化は、ポドプトーシス（podoptosis）と呼ばれるｐ５３過剰活性化依存性の細胞死を引き起こすので、ＭＤＭ２は臓器の発達および組織ホメオスタシスにも必要とされる。ポドプトーシスはカスパーゼ非依存性であり、したがってアポトーシスとは異なる。ＭＤＭ２の分裂促進因子的役割は組織傷害時における創傷治癒にも必要とされる一方、ＭＤＭ２の阻害は上皮損傷時における再上皮化を損なう。それに加えて、ＭＤＭ２は、核内因子－カッパベータ（ＮＦκＢ）活性化においてｐ５３非依存性の転写因子様効果を有する。したがって、ＭＤＭ２は組織炎症を促進し、またＭＤＭ２の阻害は、組織傷害において強力な抗炎症効果を有する。ゆえに、ＭＤＭ２の遮断は、ほぼ抗炎症性および抗細胞分裂性の効果（炎症性および過剰増殖性疾患、例えばある特定のがん等、またはリンパ増殖性の自己免疫、例えば全身性エリテマトーデスまたは半月体形成性糸球体腎炎等における付加的な治療効果に該当し得る）を有した。Ｍｄｍ２の重要な標的はｐ５３腫瘍抑制因子である。Ｍｄｍ２は、ｐ５３転写活性を抑制するｐ５３相互作用タンパク質として識別されてきた。Ｍｄｍ２は、ｐ５３のＮ末端トランス活性化ドメインに結合し、それをブロックすることによりこの抑制を実現する。Ｍｄｍ２はｐ５３応答遺伝子である－すなわちその転写はｐ５３により活性化され得る。したがって、ｐ５３が安定化すると、Ｍｄｍ２の転写もやはり誘発され、その結果Ｍｄｍ２タンパク質レベルが上昇する。がんにおけるＭＤＭ２の機能およびその役割は、広範囲わたる研究の対象であり、また当技術分野において、例えばＬｉら（Front. Pharmacol., 07 May 2020, volume 11, article 631, “Targeting Mouse Double Minute 2: Current Concepts in DNA Damage Repair and Therapeutic Approaches in Cancer”）によりレビューされている。同文献は、様々ながんを処置するために現在臨床試験中のＭＤＭ２阻害剤についてもレビューする。ＨＣＴ後の血液新生物の再発を処置および／または予防するための、この公開資料で議論されている阻害剤の使用は、本発明に含まれる。

ＭＤＭ２の機能により、ＭＤＭ２は、抗がん薬として使用される阻害剤を設計するための有望な目標として目されている。長期的な治療効果維持において単一の標的薬が有する欠陥、ならびに薬物耐性に役立つ代替的シグナリング経路を活性化させやすいことを考慮し、デュアルまたはマルチ標的型ＭＤＭ２阻害剤が登場した。当業者が用語「ＭＤＭ２阻害剤」の意味合いについて熟知し、当技術分野において公知のそのような阻害剤の複数例を容易に特定することができるように、多くの異なるＭＤＭ２阻害剤が、臨床試験用としてその開発にすでに成功している。これには、例えば、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８）、ＡＭＧ－２３２（ＫＲＴ－２３２）、ＡＰＧ－１１５、ＢＩ－９０７８２８、ＣＧＭ０９７、シレマドリン（ＨＤＭ－２０１）、およびミラデメタン（ＤＳ－３０３２ｂ）が含まれる。

ヌトリンは、ｐ５３結合ポケット内でＭＤＭ２に結合し、がん細胞において細胞周期停止およびアポトーシス、ならびにヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖阻害を引き起こすことが特定された一連のシス－イミダゾリンアナログである。ＭＤＭ２－ｐ５３を標的とするいくつかの阻害剤、例えばＲＧ７１１２、ＲＧ７３８８、ＲＧ７７７５、ＳＡＲ４０５８３８、ＨＤＭ２０１、ＡＰＧ－１１５、ＡＭＧ－２３２、およびＭＫ－８２４２等が、臨床試験でヒトがんを処置するために近年開発された。

ＲＧ７１１２

は、ヒト臨床試験に登録され、およびヌトリン－３ａの構造的改変に由来した最初の小分子ＭＤＭ２阻害剤であった。ＲＧ７１１２は、ｐ５３結合ポケット内でＭＤＭ２を標的とするように設計され、ｐ５３野生型神経膠芽腫細胞において強固なｐ２１発現およびアポトーシスを誘発するｐ５３活性を修復した。これまでに、ＲＧ７１１２に関する７つの臨床試験が完了した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ／；ＮＣＴ０１６７７７８０、ＮＣＴ０１６０５５２６、ＮＣＴ０１１４３７４０、ＮＣＴ０１１６４０３３、ＮＣＴ００５５９５３３、ＮＣＴ００６２３８７０、ＮＣＴ０１６７７７８０）。ＮＰ２５２９９（ＮＣＴ０１１６４０３３）の試験は、固形腫瘍を有する患者を対象とする非盲検、ランダム化、クロスオーバー試験であった。同試験は、ＲＧ７１１２の経口単回用量の薬物動態に対する食物の効果について評価した。この試験には２つの部分が含まれ：第１の部分は初回単回投与を含む一方、他方は用量を増加させながら４つの異なる処置スケジュールを含んだ。結果より、ＲＧ７１１２は、最も一般的なＡＥであり、鎮吐薬を用いて処置可能なＧＩ毒性につき一般的に良好な忍容性を示すことが示唆された（Patnaik et al, 2015）。

第２世代ヌトリンのＲＧ７３８８、

が、初期ヌトリンの効力および毒性プロファイルを改善するために開発された。ＲＧ７３８８は、３つの細胞系ＭＣＦ－７、Ｕ－２ＯＳ、およびＳＪＳＡ－１において、ｐ２１発現および効果的な細胞周期停止を誘発し、ｐ５３の強い活性化を証明した。ＲＧ７３８８について、ＭＤＭ２阻害剤の第ＩＩＩ相臨床試験のみ（ＭＩＲＲＯＳ／ＮＣＴ０２５４５２８３）を含むいくつかの臨床審査が現在進行している。第Ｉ相臨床試験の結果より、ＲＧ７３８８は、高レベルのＭＤＭ２発現を有するＡＭＬ患者において、ｐ５３活性を調節することにより臨床転帰を改善することが明らかとなった。ＭＩＲＲＯＳは、再発性および難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置において、シタラビンと組み合わせてＲＧ７３８８の有効性を評価するランダム化第ＩＩＩ相臨床試験である。２０１９年４月現在、試験には患者母集団のおよそ９０％が応募し、なおも継続中である。この試験のｐ５３－ＷＴ集団において８０％の死亡が観察された場合には、中間有効性分析が２０２０年までに取得可能である。ＭＩＲＲＯＳは、ＭＤＭ２阻害剤について最初の第ＩＩＩ相臨床試験データを取得し、ＡＭＬを有する患者について新たな処置選択肢を提供する可能性がある。

ＲＧ７７７５は、ＡＰ（イダサヌトリン）の不活性ペグ化プロドラッグであり、血中エステラーゼのペグ化された尾部を切断する。ＡＰは、ｐ５３経路を活性化させるｐ５３－ＭＤＭ２相互作用の強力かつ選択的阻害剤であり、また細胞周期停止および／またはアポトーシスと関連する。前臨床試験において、静脈内（ＩＶ）ＲＧ７７７５（ＲＯ６８３９９２１）は、免疫不全マウスモデルの骨肉腫およびＡＭＬにおいて抗腫瘍効果を示した。第Ｉ相試験（ＮＣＴ０２０９８９６７）において、ＲＧ７７７５が、進行した悪性腫瘍を有する患者を対象に、その安全性、忍容性、および薬物動態について調査された。結果は、ＲＧ７７７５は経口イダサヌトリンに匹敵する安全性プロファイルを有することを明らかにした。

ＳＡＲ４０５８３８

は、ＭＤＭ２の経口選択的スピロオキシインドール小分子誘導体アンタゴニストであり、ＭＤＭ２－ｐ５３相互作用を標的とする。脱分化した脂肪肉腫細胞の処置において、ＳＡＲ４０５８３８は、ｐ５３を効果的に安定化し、ｐ５３経路を活性化し、細胞増殖をブロックし、細胞周期停止を促進し、アポトーシスを誘発した。ＳＡＲ４０５８３８は、がん患者を対象とする２つの臨床試験において使用された（ＮＣＴ０１６３６４７９、ＮＣＴ０１９８５１９１）。ＴＥＤ１２３１８（ＮＣＴ０１６３６４７９）の試験は、進行した固形腫瘍を有する成人患者を対象に経口投与された第Ｉ相、非盲検、用量設定、用量漸増、安全性試験であった。このトライアルにおいて、患者７４例がＳＡＲ４０５８３８を用いて処置され、５６％の患者において最良の応答が明らかとなり、３カ月無増悪率は３２％であった。この試験は、ＳＡＲ４０５８３８は、進行した固形腫瘍を有する患者において許容される安全性プロファイルを有することを示唆した。ＳＡＲ４０５８３８に関する別の臨床試験は、ＴＣＤ１３３８８（ＮＣＴ０１９８５１９１）の試験であり、がん患者を対象にピマセルチブと組み合わせてＳＡＲ４０５８３８の安全性および有効性を分析した。この試験では、局所的に進行性または転移性の固形腫瘍を有し、野生型ｐ５３、およびＲＡＳまたはＲＡＦ突然変異を有することが文書化された患者２６例がこの試験に登録された。この試験の目的は、最大忍容量（ＭＴＤ）を探索することであった。ＳＡＲ４０５８３８（２００または３００ｍｇ ＱＤ）＋ピマセルチブ（６０ｍｇ ＱＤまたは４５ｍｇ ＢＩＤ）について、患者応答が観察された。観測された最も頻繁に生ずる有害事象は、下痢（８１％）、血中クレアチンホスホキナーゼ（７７％）、悪心（６２％）、および嘔吐（６２％）であった。この試験は、ピマセルチブと組み合わせたＳＡＲ４０５８３８の安全性プロファイルは、両薬物の安全性プロファイルと整合することを示唆した。

ＨＤＭ２０１

は、シレマドリンまたはＮＶＰ－ＨＤＭ２０１とも呼ばれ、低用量および高用量レジメンのいずれを用いても、ＭＤＭ２とｐ５３との間の相互作用を阻害し、前臨床モデルにおいて腫瘍退縮をもたらす強力かつ選択的小分子である。該化合物および類似した活性の関連化合物が、国際公開第２０１３／１１１１０５Ａ１号パンフレットならびに国際公開第２０１９／０７３４３５Ａ１号パンフレットに広範に記載されている。ＨＤＭ２０１は、ミドタリン（midotaline）と組み合わせて使用したとき、ＩＴＤ陽性のｐ５３野生型細胞に対して特異的かつ有効な殺傷効果を有した。ＨＤＭ２０１は、臨床試験（ＮＣＴ０２１４３６３５）に使用された。ＮＣＴ０２１４３６３５では、野生型ｐ５３を有し腫瘍が進行した患者を対象に、ＨＤＭ２０１の安全性および忍容量が決定され、評価された。データカットオフ時点（２０１６年４月１日）で、患者７４例がＨＤＭ２０１の投与を受けた（患者３８例を含むＲｅｇ１およびなおも処置を受けている患者３６例を含むＲｅｇ２）。結果より、両レジメン（Ｒｅｇ１およびＲｅｇ２）における一般的なグレード３／４有害事象（ＡＥ）は、貧血（８％；１７％）、好中球減少症（２６％；１４％）、および血小板減少症（２４％；２８％）であることが明らかとなった。予備的なデータは、血液学的毒性は遅発性であり、またレジメンに依存すること、およびＲｅｇ１レジメンはより高い累積用量を許容することを示唆した。

ＡＰＧ－１１５

は、新規の経口的に活性な小分子ＭＤＭ２阻害剤である。ＡＰＧ－１１５は、ＭＤＭ２と結合した後にｐ５３発現を修復し、また野生型ｐ５３を有する腫瘍細胞においてｐ５３媒介式のアポトーシスを活性化させる。ＡＰＧ－１１５は、固形腫瘍（ＮＣＴ０２９３５９０７）、転移性メラノーマ（ＮＣＴ０３６１１８６８）、および唾液腺癌（ＮＣＴ０３７８１９８６）の処置を目的とする臨床試験で使用された。試験ＮＣＴ０２９３５９０７は、進行した固形腫瘍またはリンパ腫を有する患者を対象とした、経口投与されるＡＰＧ－１１５の安全性、薬物動態学的および薬力学的特性に関する第Ｉ相試験であった。異なる用量レベル（１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、および３００ｍｇを含む）がこの試験でテストされた。結果より、ＡＰＧ－１１５の最適用量は１００ｍｇであり、用量制限毒性は認められないことが明らかにされた。最近の試験において、ＡＰＧ－１１５は腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の抗腫瘍免疫に関与した。ＡＰＧ－１１５は、骨髄由来マクロファージにおいてｐ５３およびｐ２１をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し、またｃ－Ｍｙｃおよびｃ－Ｍａｆを下方制御することにより免疫抑制的Ｍ２マクロファージの数を低下させた。それに加えて、ＡＰＧ－１１５は、Ｔ細胞において共刺激活性を示し、また腫瘍細胞においてＰＤ－Ｌ１の発現を増加させた。このエビデンスは、ＡＰＧと免疫療法との組合せは新たな抗腫瘍レジメンであり得ることを示唆する。

ＡＭＧ２３２

は、ＭＤＭ２－ｐ５３相互作用をブロックすることによりｐ５３の腫瘍抑制作用を修復する治験用経口選択的ＭＤＭ２阻害剤である。ＡＭＧ２３２の活性およびそのｐ５３シグナルに対する効果が、いくつかの前臨床腫瘍モデルにおいて特徴づけられた。ＡＭＧ２３２はＭＤＭ２に結合し、ｐ５３活性を強く誘発し（細胞周期停止をもたらす）、および腫瘍細胞増殖を阻害する。ＡＭＧ２３２のいくつかの臨床試験、例えばＮＣＴ０１７２３０２０、ＮＣＴ０２０１６７２９、ＮＣＴ０２１１０３５５、ＮＣＴ０３０３１７３０、ＮＣＴ０３０４１６８８、ＮＣＴ０３１０７７８０、およびＮＣＴ０３２１７２６６等が、ヒトがんの処置を目的として進行中である。ＮＣＴ０２０１６７２９は、ＡＭＧ２３２の安全性、薬物動態、およびＭＴＤを評価する非盲検第Ｉ相試験であった。この試験では、ＡＭＧ２３２が２つのレジメン（治療群１および治療群２）において投与された。患者は、治療群１において、６０、１２０、２４０、３６０、４８０、または９６０ｍｇのＡＭＧ２３２を用いて、２週間毎に７日間、１日１回の単一療法として、または治療群２においては２ｍｇのトラメチニブと組み合わせて６０ｍｇで処置された。結果より、一般的な処置関連のＡＥには、悪心（５８％）、下痢（５６％）、嘔吐（３３％）、および食欲減退（２５％）が含まれたことが明らかとなった。しかしながら、ＡＭＧ２３２のＭＴＤには到達しなかった。用量漸増は、より高用量における許容されないその胃腸ＡＥのために中止された。

ＭＫ－８２４２

は、ＭＤＭ２－ｐ５３相互作用を標的とする強力な小分子阻害剤である。ＭＫ－８２４２は、様々な固形腫瘍型の腫瘍退縮、およびほとんどの急性リンパ芽球性白血病異種移植において完全または部分的応答を誘発した。ＭＫ－８２４２は、２つの第Ｉ相臨床試験（ＮＣＴ０１４５１４３７およびＮＣＴ０１４６３６９６）において使用された。ＮＣＴ０１４５１４３７の試験は、難治性または再発性のＡＭＬを有する成人参加者を対象とした、ＭＫ－８２４２単独試験およびシタラビン併用試験であった。この試験では、ＭＫ－８２４２は、２８日サイクルで７日間投薬／７日間休薬しながら、３０～２５０ｍｇ（ｐ．ｏ；ＱＤ）、または１２０～２５０ｍｇ（ｐ．ｏ；１日２回（ＢＩＤ））で投与され、最適化レジメンは、２１日サイクルで７日間投薬／１４日間休薬しながら２１０または３００ｍｇ（ｐ．ｏ；１日２回（ＢＩＤ））で投与された。患者２６例がこの試験に登録され、そのうち５例がＡＥを理由に中止し、７例の患者が死亡した。この試験では、７日間投薬／１４日間休薬レジメンが、７日間投薬／７日間休薬レジメンよりも好ましい安全性プロファイルを有することが明らかにされた。ＮＣＴ０１４６３６９６は、進行した固形腫瘍を有する患者におけるＭＫ－８２４２の安全性および薬物動態プロフィルを評価することを目的とした。この試験では、パート１においてＭＴＤを決定するために投薬量が漸増され、パート２においてＭＴＤが確認され、また推奨される第ＩＩ相用量（ＲＰＴＤ）が規定された。最終的に、患者４７例がこの試験に登録され、ＭＫ－８２４２を用いて８レベルの用量（６０～５００ｍｇの範囲）で処置された。結果より、ＭＫ－８２４２はｐ５３経路を活性化し、４００ｍｇ（ＢＩＤ）において許容される忍容性プロファイルを有することが明らかとなった。

ＭＤＭ２阻害剤ＢＩ９０７８２８は、潜在的抗新生物活性を有するマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）の経口利用可能な阻害剤である。経口投与すると、ＢＩ９０７８２８はＭＤＭ２タンパク質と結合し、同タンパク質が腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３の転写活性化ドメインと結合するのを妨げる。ＭＤＭ２－ｐ５３相互作用を妨げることにより、ｐ５３の転写活性が修復される。これはｐ５３が媒介する腫瘍細胞アポトーシスの誘発を引き起こす。現在利用可能なＭＤＭ２阻害剤と比較して、ＢＩ９０７８２８の薬物動態特性は、このクラスの阻害剤について、骨髄抑制、オンターゲット、用量規制毒性を低下させ得るより最適な投与および投与スケジュールを可能にする。

ＮＶＰ－ＣＧＭ０９７

は、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ法で分析したとき、ｈＭＤＭ２に対して１．３ｎＭのＫｉ値を有する、極めて強力かつ選択的ＭＤＭ２阻害剤である。これは、Ｍｄｍ２タンパク質のｐ５３結合部位に結合し、両タンパク質間の相互作用を破壊し、ｐ５３経路の活性化を引き起こす。

ミラデメタン

は、潜在的抗新生物活性を有する経口利用可能なＭＤＭ２（マウス二重微小染色体２）アンタゴニストである。経口投与すると、ミラデメタンはＭＤＭ２タンパク質に結合し、同タンパク質が腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３の転写活性化ドメインに結合するのを妨げる。このＭＤＭ２－ｐ５３相互作用を妨げることにより、ｐ５３のプロテアソーム媒介式の酵素的分解が阻害され、ｐ５３の転写活性が修復される。これはｐ５３シグナル伝達の修復を引き起こし、ｐ５３が媒介する腫瘍細胞アポトーシスの誘発をもたらす。ジンクフィンガータンパク質であり、またｐ５３経路の負の制御因子でもあるＭＤＭ２は、がん細胞において過剰発現している；それはがん細胞増殖および生存率に関係している。

上記化合物のいずれの塩も本発明の範囲内にある。

本明細書で使用される場合、ＭＤＭ２阻害剤は、そのそれぞれが本明細書において参照により組み込まれている、米国特許出願公開第２００８／００１５１９４号明細書として公開された米国特許出願番号第１１／６２６，３２４号明細書；米国非仮出願番号第１２／９８６，１４６号明細書；国際公開第２０１１／０８５１２６号パンフレットとして公開された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ第１１／２０４１４号；または国際公開第２０１１／０８５１２９号パンフレットとして公開された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ第１１／２０４１８号に開示されるような化合物であり得る。

ＭＤＭ２阻害剤は、Vassilev 2006 Trends in Molecular Medicine 13(1), 23-31に開示されるような化合物であり得る。例えば、ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン（例えば、シス－イミダゾール化合物、例えばヌトリン－３ａ等）； Grasberger et al. 2005 J Med Chem 48, 909-912に開示されるようなベンゾジアゼピン； Issaeva et al. 2004 Nat Med 10, 1321-1328に開示されるようなＲＩＴＡ化合物；Ding et al. 2005 J Am Chem Soc 127, 10130-10131、およびDing et al. 2006 J Med Chem 49, 3432-3435に開示されるようなスピロオキシインドール化合物；またはLu et al. 2006 J Med Chem 49, 3759-3762に開示されるようなキニノール（quininol）化合物であり得る。さらなる例として、ＭＤＭ２阻害剤は、Chene 2003 Nat. Rev. Cancer 3, 102-109; Fotouhi and Graves 2005 Curr Top Med Chem 5, 159-165;またはVassilev 2005 J Med Chem 48, 4491-4499に開示されるような化合物であり得る。

ＭＤＭ２阻害がドナーＴ細胞の細胞傷害性および寿命を促進するということは、本発明のＭＤＭ２阻害剤の重要な利点である。

複数の実施形態では、ＭＤＭ２阻害は、患者内のアロＴ細胞の表現型に影響を及ぼすことができ、細胞傷害性および寿命の増加をもたらす。例えば、ＭＤＭ２阻害は、アロＴ細胞が、Ｂｃｌ－２－受容体およびＩＬ７－受容体（ＤＥ１２７）（寿命と関連するマーカーである）の発現を上方制御する原因となり得る。さらに、細胞傷害性マーカー発現の上方制御、例えばＣＤ８＋アロＴ細胞によるパーフォリン、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＣＤ６９の発現増加等が、本発明の文脈内のＭＤＭ２阻害剤によりＭＤＭ２が阻害された際に観察可能である。

細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔ－キラー細胞、細胞溶解Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞としても知られている）は、がん細胞、感染した細胞（特にウイルスに）、またはその他の方式で損傷を受けた細胞を殺傷するＴリンパ球（白血球の種類）である。ほとんどの細胞傷害性Ｔ細胞は、特異抗原を認識することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。抗原は、免疫応答を刺激する能力を有する分子であり、また多くの場合、がん細胞またはウイルスにより産生される。細胞内部の抗原はクラスＩ ＭＨＣ分子に結合し、クラスＩ ＭＨＣ分子により細胞の表面に運ばれ、そこでそれはＴ細胞により認識され得る。ＴＣＲが当該抗原に対して特異的であれば、ＴＣＲは、クラスＩ ＭＨＣ分子と抗原からなる複合体と結合し、Ｔ細胞が細胞を破壊する。ＴＣＲがクラスＩ ＭＨＣ分子と結合するためには、ＴＣＲにはＣＤ８と呼ばれる糖タンパク質（クラスＩ ＭＨＣ分子の定常部分と結合する）が随伴しなければならない。したがって、このようなＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＤ８とＭＨＣ分子との間の親和性は、抗原特異的活性化の期間中、ＴＣ細胞と標的細胞とが共に緊密に結合した状態に保つ。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それが活性化するとＴＣ細胞として認識され、免疫系内で事前に定義された細胞傷害性の役割を有するものとして一般的に分類される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、いくつかのサイトカインも生成することができる。

ＭＤＭ２阻害剤の投与は、患者のがん細胞上で、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、およびＨＬＡクラスＩＩ分子の上方制御および発現増加を誘発することができる。ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、アポトーシスと呼ばれる細胞死のプロセスを誘発するリガンドとして機能するタンパク質である。ＴＲＡＩＬは、ほとんどの正常組織細胞により生成および分泌されるサイトカインである。ＴＲＡＩＬは、ある特定の細胞死受容体（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２）に結合することにより主に腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす。ＴＲＡＩＬは、ＣＤ２５３（表面抗原分類２５３）およびＴＮＦＳＦ１０（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１０）としても命名されている。

ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）およびその５つの細胞受容体は、免疫系において細胞間アポトーシス応答を制御することが明らかにされている３つの細胞死受容体／リガンド系のうちの１つを構成する。抗原投与または腫瘍誘発の異なる系において、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ受容体系は、免疫抑制性、免疫調節性、プロウイルスまたは抗ウイルス性、および腫瘍免疫監視機能を有することが明らかにされた。ＴＲＡＩＬは、２つのアポトーシス誘発性受容体－ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）－ならびにアポトーシスシグナルを伝達することができない２つの追加の細胞結合型受容体－ＴＲＡＩＬ－Ｒ３（ＬＩＴ、ＤｃＲ１）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ４（ＴＲＵＮＤＤ、ＤｃＲ２）（時にデコイ受容体と呼ばれる）と結合することができる。ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘発の最初のステップは、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２に対するリガンドの結合である。これにより、受容体は三量体化し、細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）が形成される。アダプター分子であるＦａｓ関連細胞死ドメイン（ＦＡＤＤ）はＤＩＳＣに移動し、そこで受容体の細胞内細胞死ドメイン（ＤＤ）と相互作用する。その第２の機能的ドメインである細胞死エフェクタードメイン（ＤＥＤ）を介して、ＦＡＤＤはプロカスパーゼ８および１０をＤＩＳＣに導入し、そこで該プロカスパーゼは自己触媒的に活性化する。この活性化は、カスパーゼ依存性シグナルカスケードの開始を表す。エフェクターカスパーゼの完全な活性化は、標的タンパク質の切断、ＤＮＡの断片化、および最終的に細胞死を引き起こす。ＴＲＡＩＬ、ならびにＴＲＡＩＬ－Ｒ１およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２の機能は、当技術分野において、例えばＦａｌｓｃｈｌｅｈｎｅｒら(Immunology. 2009 Jun; 127(2): 145-154)により記載されている。

本発明の文脈において、ＭＤＭ２阻害の投与は、がん細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２発現を強化することが驚くべきことに見出された（Ｔ細胞上にＴＲＡＩＬが存在しなければ、その結果殺傷力が大きく低下したことから、ＭＤＭ２阻害は、本発明の文脈において、アロＴ細胞の細胞傷害効果に関与するのに少なくとも部分的に必要とされた）。

さらに、ＭＤＭ２阻害は、がん細胞、例えば白血病細胞等、特にＡＭＬ細胞上でＭＨＣタンパク質の上方制御を可能にし、これによりＨＣＴおよびアロＴ細胞移植後の同種異系Ｔ細胞に対するそれらの脆弱性が高まることはまったく予期されなかった。

主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は脊椎動物ＤＮＡ上の大きな遺伝子座であり、密接に関連した多形性遺伝子のセット（適応性免疫系にとって必須の細胞表面タンパク質をコードする）を含む。この遺伝子座の名称は、それが移植時の組織適合性試験において発見されたことに因む。後の試験より、非適合に起因する組織拒絶反応は、ＭＨＣ分子の真の機能－自己タンパク質または病原体に由来する抗原への結合、および該当するＴ細胞による認識を目的とする細胞表面上での抗原提示－を不顕化させる実験的アーチファクトであることが判明した。ＭＨＣ分子は、白血球とその他の白血球または体細胞との相互作用に関与する。ＭＨＣは、臓器移植に対するドナーの適合性、ならびにある者が交差反応性免疫を介して自己免疫疾患に罹患するしやすさを明確にする。

ＭＨＣクラスＩ分子は、すべての有核細胞において、また血小板においても－本質的に赤血球を除くすべての細胞において発現している。同分子はエピトープをキラーＴ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とも呼ばれる）に提示する。ＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に付加してＣＤ８受容体を発現する。ＣＴＬのＣＤ８受容体がＭＨＣクラスＩ分子とドッキングすると、ＣＴＬのＴＣＲがＭＨＣクラスＩ分子内のエピトープに適合する場合、ＣＴＬは、細胞がアポトーシスによるプログラム細胞死に至るきっかけを作る。したがって、ＭＨＣクラスＩは、細胞内病原体、例えばウイルスおよび一部の細菌（Ｌ型菌、細菌属マイコプラズマ（Mycoplasma）、および細菌属リケッチア属（Rickettsia）を含む）等に対処するための主要手段である細胞性免疫への関与に役立つ。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ分子を含む。

ＭＨＣクラスＩＩは条件に応じてすべての細胞型により発現され得るが、しかし通常、「プロフェッショナルな」抗原提示細胞（ＡＰＣ）：マクロファージ、Ｂ細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）上でのみ生ずる。ＡＰＣは抗原性タンパク質を取り込み、抗原処理を実施し、その分子断片を差し戻し－エピトープと呼ばれる断片－ＭＨＣクラスＩＩ分子内部に連結したＡＰＣの表面上にそれを提示する（抗原提示）。細胞の表面上で、エピトープは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のような免疫学的構造により認識され得る。エピトープに結合する分子領域はパラトープである。ヘルパーＴ細胞の表面上には、ＣＤ４受容体ならびにＴＣＲがある。ナイーブなヘルパーＴ細胞のＣＤ４分子がＡＰＣのＭＨＣクラスＩＩ分子とドッキングすると、そのＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩＩ内部に連結したエピトープと遭遇し、それに結合することができる。この事象はナイーブＴ細胞を刺激する。局所環境に基づき、すなわち微環境においてＡＰＣにより分泌されるサイトカインのバランスに従い、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）は、メモリーＴｈ細胞、またはこれまで同定されたような１型（Ｔｈ１）、２型（Ｔｈ２）、１７型（Ｔｈ１７）、または制御／サプレッサー（Ｔｒｅｇ）のうちのいずれかの表現型のエフェクターＴｈ細胞に分極化する（Ｔｈ細胞の最終分化）。したがって、ＭＨＣクラスＩＩは、抗原に対する免疫化－またはＡＰＣがＴｈ０細胞を主にＴｒｅｇ細胞に分極化させる場合、抗原の免疫寛容に関与する。抗原に対する一次曝露期間中の分極化は、類似した抗原に対して二次曝露された際にそのメモリリコールが惹起されたときに、メモリーＴｈ細胞が調整する免疫応答を歪めることによるいくつかの慢性疾患、例えば炎症性腸疾患および喘息等を確認する際に重要である。Ｂ細胞はＭＨＣクラスＩＩを発現してＴｈ０に対して抗原を提示するが、しかしそのＢ細胞受容体が対応するエピトープに結合するとき（ＭＨＣが関与しない相互作用）、このような活性化したＢ細胞は可溶性免疫グロブリン：体液性免疫に関与する抗体分子を分泌する。クラスＩＩＭＨＣ分子もヘテロ二量体であり、αおよびβサブユニットの両方に対する遺伝子は多形性であり、ＭＨＣクラスＩＩサブ領域内に位置する。同一の鎖からなる２つのドメインが関係するＭＨＣ－Ｉ分子とは異なり、ＭＨＣ－ＩＩ分子のペプチド結合グルーブは、ヘテロ二量体α１およびβ１の両サブユニットのＮ末端ドメインにより形成される。それに加えて、ＭＨＣ－ＩＩの両サブユニットは、膜貫通ヘリックス、およびＣＤ４共受容体によって認識され得る免疫グロブリンドメンα２またはβ２を含有する。このように、リンパ球が異なれば、その発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）共受容体も異なることから、ＭＨＣ分子は、どの種類のリンパ球が所定の抗原と高い親和性を有して結合し得るかシャペロンする。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体は、ヒトにおいて主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子複合体によりコードされる関連タンパク質の群である。ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、およびＣ）に対応するＨＬＡ（いずれもＨＬＡクラス１の群である）は、細胞内部からペプチドを提示する。例えば、細胞がウイルスに感染した場合、ＨＬＡ系は、細胞が免疫系により破壊され得るように、ウイルスの断片を細胞の表面に運ぶ。このペプチドは、プロテアソームにおいて分解される消化されたタンパク質から生成される。一般的に、このような特別なペプチドは、長さがアミノ酸約８～１０個の低分子ポリマーである。ＭＨＣクラスＩにより提示された外来抗原は、細胞を破壊するキラーＴ細胞と呼ばれる（ＣＤ８陽性または細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる）Ｔリンパ球を引き付ける。アミノ酸１０個よりも長い抗原（アミノ酸１１～１４個）がＭＨＣＩ上に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し得る［３］ことが、いくつかの新規研究により提案されている。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡタンパク質とは異なり、第１５染色体上の遺伝子によりコードされるβ２－ミクログロブリンと会合する。

ＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯ、ＤＱ、およびＤＲ）に対応するＨＬＡは、細胞の外部からＴリンパ球に抗原を提示する。これらの特別な抗原は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞とも呼ばれる）の増殖を刺激し、ひいては抗体産生Ｂ細胞を刺激して当該特異抗原に対する抗体を産生させる。自己抗原は調節性Ｔ細胞により抑制されている。

エキスポーチン１（ＸＰＯ１）は染色体維持因子１（ＣＲＭ１）としても知られており、タンパク質、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、および一部のｍＲＮＡの核外輸送に関与する真核生物タンパク質である。エキスポーチン１は、ロイシンに富んだ核外輸送シグナル（ＮＥＳ）依存性タンパク質輸送に関与し、またＲｅｖおよびＵ ｓｎＲＮＡの核外輸送に特異的に関与する。エキスポーチン１は、サイクリンＢ、ＭＡＰＫ、およびＭＡＰＫＡＰキナーゼ２の局在化を制御することによりいくつかの細胞プロセスの制御に関わっており、またＮＦＡＴおよびＡＰ－１も制御する。さらに、ｐ５３と相互作用し、核からのその排出に関与し、これによりｐ５３の制御下にある遺伝子、例えばＴＲＡＩＬ－Ｒ１および－Ｒ２ならびにＭＨＣ－ＩＩをコードする遺伝子等の発現を低下させることが明らかにされている。

ＸＰＯ１も、多くの悪性腫瘍において上方制御されており、また予後不良と関連する。その阻害が治療の目標であり、したがって核輸送の選択的阻害剤（ＳＩＮＥ）である化合物が、新規クラスの抗がん剤として開発された。最もよく知られているＳＩＮＥ剤はセリネクソール（ＫＰＴ－３３０）であり、また固形腫瘍および血液悪性腫瘍の両方において、第ＩおよびＩＩ相臨床試験で幅広くテストされている。

核外輸送の選択的阻害剤（ＳＩＮＥまたはＳＩＮＥ化合物）は、細胞核から細胞質への輸送に関わるタンパク質であるエキスポーチン１（ＸＰＯ１またはＣＲＭ１）をブロックする薬物である。これは細胞周期停止およびアポトーシスによる細胞死を引き起こす。したがって、ＳＩＮＥ化合物は抗がん剤として興味深い；いくつかが開発中であり、また１つ（セリネクソール）は、多発性骨髄腫を処置するために最終治療薬として承認された。プロトタイプ核外輸送阻害剤は、レプトマイシンＢ（天然物でありストレプトミセス属（Streptomyces）細菌の二次代謝物）である。ＳＩＮＥには、ＫＰＴ－３３０の他に、例えばＫＰＴ－８６０２、ＫＰＴ－１８５、ＫＰＴ－２７６、ＫＰＴ－１２７、ＫＰＴ－２０５、およびＫＰＴ－２２７も含まれる。治療を目的とするＸＰＯ－１阻害が、例えば、Ｐａｒｉｋｈら（J Hematol Oncol. 2014; 7: 78）による文献においてレビューされている。

本明細書で使用される場合、対象に投与するための医薬組成物は、好適な分子に付加して少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される添加剤、例えば担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、防腐剤、界面活性剤等を含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数の追加の有効成分、例えば抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬等も含むことができる。これらの製剤に有用な薬学的に許容される担体は常套的である。Remington's pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)は、本明細書に開示される化合物の医薬送達に適する組成物および製剤について記載する。

一般的に、担体の性質は、採用される具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、媒体として薬学的および生理学的に許容される液体、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等を含む注射可能な液体を通常含有する。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の無毒性固体担体として、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に付加して、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。

本開示の様々な処置方法に基づき、化合物は、障害（処置法または予防法が追及される対象となる）の管理と関連する従来法と整合する方式で対象に送達され得る。本明細書の開示に基づき、予防上または治療上有効な量の化合物および／またはその他の生物学的に活性な薬剤が、選択された疾患もしくは状態、またはその１つもしくは複数の症状（複数可）を予防、阻害し、および／または良化させるのに十分な時間および条件下で、そのような処置を必要としている対象に投与される。

化合物または生成物「の投与」およびそれ「を投与すること」とは、本明細書に記載されるような化合物、化合物のプロドラッグ、または医薬組成物を提供することを意味するものと理解すべきである。化合物または組成物は、別の人により対象に対して（例えば、静脈内に）投与可能であり、または対象により自己投与可能である（例えば、錠剤）。

医学的状態の処置において医薬として使用される化合物を本明細書で引用する場合、そのいずれも、化合物または前記化合物を含む組成物を、それを必要としている対象に投与すること、または前記医学的状態の処置において化合物、前記化合物を含む組成物を使用することを含む、前記医学的状態を処置する方法と関連する。

投薬量は、標的部位（例えば、肺、骨髄、または体循環）において所望の濃度を維持するために、担当臨床医によって変更され得る。より高いまたはより低い濃度が、送達方式、例えば、経－皮膚、直腸、経口、肺、または鼻腔内送達や静脈内または皮下送達に基づき選択され得る。また、投薬量は、投与される製剤、例えば、肺内スプレーや粉末、持続放出型経口送達や注射用の粒状物質、または経皮送達製剤等の放出速度に基づき、やはり調整され得る。

本発明は、本明細書に開示されるような対象を処置する方法とも関連する。処置の方法は、好ましくは、本明細書で開示される、治療有効量の化合物およびおそらくはさらなる化合物または生成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。

本発明の文脈において、用語「医薬」とは、薬物、薬学的薬物、または疾患の診断、治癒、処置、または予防において使用される医薬製品を指す。それは、疾患を処置または予防するための特性を有するものとして提示された任意の物質または物質の組合せを指す。該用語は、薬理学的、免疫学的、もしくは代謝的作用を発揮することにより、生理機能を修復、是正、もしくは修正するために、または医学的診断を下すために使用または投与され得る任意の物質または物質の組合せを含む。医薬という用語は、生物学的薬物、小分子薬物、または生理学的プロセスに影響を及ぼすその他の物理的材料を含む。

本明細書に記載されるような、本発明に基づくＭＤＭ２阻害剤およびおそらくはさらなる化合物は、それが、固体、液体、またはエアゾール形態で投与されるか、およびそれが、例えば注射として投与されるような経路のために滅菌される必要があるかに応じて、異なる種類の担体を含み得る。本発明は、静脈内、皮膚内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局部、腫瘍内、筋肉内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜的、心膜内、臍帯内、眼内、口腔内、局部、局所的、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、輸液、連続輸液、標的細胞を直接浸漬する局所的潅流、カテーテル経由、ラバージュ経由、クリーム内、脂質組成物内（例えば、リポソーム）、またはその他の方法、もしくは当業者にとって公知であるような上記の任意の組合せにより投与可能である（例えば、本明細書において参照により組み込まれているRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照）。

本発明の文脈において、用語「がん療法」とは、非限定的に、手術、化学療法、放射線療法、放射線照射療法、ホルモン療法、標的療法、細胞療法、がん免疫療法、モノクロナール抗体療法を含む任意の種類のがんの処置を指す。本明細書に記載されるようなＭＤＭ２阻害剤の投与は、より広いがん療法戦略に包含され得る。

ＭＤＭ２阻害剤の投与は、１つまたは複数のその他のがん療法と組み合わせることができる。本発明の文脈において、用語「～と組み合わせて」とは、本発明に基づく化合物の投与を受ける個人が、その他のがん療法（必ずしも同時に生じない）も、単一の薬理学的組成物内に組み込んで、または同一の投与経路を経由してやはり受けることを表す。「～と組み合わせて」とは、したがってがんに罹患した個人を２つ以上のがん療法を用いて処置することを意味する。組合せ投与は、同時処置、共存処置、または合併処置を包含し、それによって処置は、相互に数分以内、別の処置と同一時間、同一日、同一週、または同一月に生じ得る。

本発明の趣旨に含まれるがん療法は、非限定的に放射線照射療法および化学療法を含み、またＤＮＡ損傷を修復する細胞の能力を凌駕することによって細胞死を引き起こすように働く。

この文脈において、化学療法とは、標準化された化学療法レジメンの一環として１つまたは複数の抗がん薬（化学療法剤）を使用するがん処置のカテゴリーを指す。化学療法は、治癒目的（複数の薬物の組合せとほぼ常時関係する）で実施され得るか、または同療法は寿命の延長または症状の低下を目的とする（緩和的化学療法）。化学療法は、腫瘍内科学の主要な分類の１つである（がんに対する薬物療法に特化した医学専門分野）。化学療法剤はがんを処置するのに使用され、また１つまたは複数のサイクルからなるレジメンにおいて、数日～数週間の期間にわたり２つ以上の薬剤を組み合わせながら投与される。そのような薬剤は、増殖速度が速い細胞－例えば、がんそのものに対してのみならず、ＧＩ管（悪心および嘔吐を引き起こす）、骨髄（様々な血球減少を引き起こす）、および毛髪（脱毛症を引き起こす）に対しても有毒である。

化学療法剤は、非限定的に、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンを含む。

本発明の文脈における放射線照射療法（irradiation therapy）もしくは放射線療法（radiation therapy）、または放射療法（radiotherapy）は、一般的には、悪性細胞、例えばがん細胞または腫瘍細胞等を制御または殺傷するためのがん処置の一環として、電離照射または紫外線～可視光（ＵＶ／Ｖｉｓ）照射を使用する治療アプローチに関する。放射線療法は、いくつかの種類のがんにおいて、それが身体の１つのエリアに限局している場合には、根治的であり得る。同療法は、原発性悪性腫瘍（例えば、初期段階の乳がん）を取り除くために行われた手術後の腫瘍再発を防止するための補助療法の一環としても使用され得る。放射線療法は化学療法と相乗的であり、また感受性のがんにおいて化学療法の前、期間中、およびその後に使用され得る。放射線療法は、細胞増殖を制御するその能力ゆえに、がん性腫瘍に一般的に適用される。電離照射は、がん性組織のＤＮＡに損傷を与え、細胞死を引き起こすことにより機能する。放射線療法は、全身的または局所的に使用可能である。

放射線療法は、がん性細胞のＤＮＡに損傷を与えることにより機能する。このＤＮＡ損傷は、２種類のエネルギー（光子または荷電粒子）のうちの１つにより引き起こされる。この損傷は、ＤＮＡ鎖を構成する原子の直接的または間接的イオン化である。間接的イオン化は、水のイオン化（ヒドロキシルラジカルを含むフリーラジカルの形成を引き起こし、次にそれはＤＮＡに損傷を与える）の結果として生じる。光子療法では、照射効果の大半はフリーラジカルを通じて媒介される。細胞は、一本鎖ＤＮＡ損傷および二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための機構を有する。しかしながら、二本鎖ＤＮＡの切断は、修復するのがかなり困難であり、劇的な染色体異常および遺伝子欠損を引き起こすおそれがある。目標を定めた二本鎖切断は細胞が細胞死に至る確率を増加させる。

光子放射線療法で使用される照射量は、グレー（Ｇｙ）として測定され、処置されるがんのタイプおよび病期に応じて変化する。根治的なケースでは、固体上皮腫瘍に対する代表的な線量は６０～８０Ｇｙの範囲である一方、リンパ腫は２０～４０Ｇｙで処置される。予防的（アジュバント）線量は、一般的に１．８～２Ｇｙの区分量で約４５～６０Ｇｙである（乳がん、頭部および頸部のがん）。

異なる種類の放射線療法、例えば体外ビーム放射線療法等が公知であり、これには、従来の体外ビーム放射線療法、定位放射線療法（ラジオサージェリー）、仮想シミュレーション法、３次元原体放射線療法、および強度変調放射線療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、強度変調回転放射線療法（ＶＭＡＴ：volumetric modulated arc therapy）、粒子線療法、オージェ療法、近接照射療法、術中放射線療法、放射性同位元素療法、および深吸気息止め法が含まれる。

体外ビーム放射線療法は、Ｘ線、ガンマ線、および荷電粒子を含み、また全体的な治療アプローチに応じて低線量率または高線量率として適用され得る。

体内放射線療法では、放射性物質を１つまたは複数のモノクロナール抗体に結合させる場合がある。例えば、放射性ヨウ素は、甲状腺悪性腫瘍に使用可能である。高用量レジーム（ＨＤＲ）または低用量レジーム（ＬＤＲ）の近接照射療法を、前立腺がんにおいてＩＲと組み合わせることができる。

本発明によれば、ＤＮＡ損傷誘発式化学療法は、アントラサイクリン、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン等；トポイソメラーゼＩの阻害剤、例えばイリノテカン（ＣＰＴ－１１）およびトポテカン等；トポイソメラーゼＩＩの阻害剤（エトポシド、テニポシド、およびタフルポシドが含まれる）；白金ベースの薬剤、例えばカルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン等；ならびにその他の化学療法薬、例えばブレオマイシン等を含む、ただしこれらに限定されない化学療法剤の投与を含む。

本開示には、本明細書に記載の医薬組成物、有効成分を含有するキット、パッケージ、およびマルチコンテナユニット、ならびに／または哺乳動物対象において疾患およびその他の状態を予防および処置する際に使用することを目的としてそれを投与するための手段も含まれる。

本発明は、下記の図面によりさらに説明される。これらは、本発明の範囲を制限するようには意図されず、むしろ本明細書に記載される本発明をより深く例証するために提供される、本発明の態様の好ましい実施形態を代表する。

ＭＤＭ２阻害は複数のＧＶＬマウスモデルにおいてＡＭＬ生存率を改善することを示す図である。（ａ）ＡＭＬ ＷＥＨＩ－３Ｂ細胞（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）および同種異系Ｃ５７ＢＬ／６ ＢＭを移入した後のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの生存率（％）を示す。表示の通り、マウスに追加の同種異系Ｔ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６）を注射し、および／または媒体もしくはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。１群当たりｎ＝９～１０の独立した動物を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｂ）ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）および同種異系ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを移入した後のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスの生存率（％）を示す。表示の通り、マウスに追加の同種異系Ｔ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を注射し、および／または媒体もしくはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。２つの実験に由来する生物学的に独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｃ）ヒトＯＣＩ－ＡＭＬ－３細胞を移入した後のＲａｇ２^－／－ＩI２ｒγ^－／－レシピエントマウスの生存率（％）を示す。表示の通り、マウスに追加のヒトＴ細胞（健常ドナーの末梢血液から単離した）を注射し、および／または媒体もしくはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。３つの実験に由来する生物学的に独立した動物（ｎ＝１２）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｄ）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と接触させながら、ＣＤ３／２８およびＩＬ－２増殖させた後に単離したヒトＴ細胞の特異的溶解の割合（％）を示す。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞をＤＭＳＯまたはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて事前処置し、表示の通り、Ｅ：Ｔ（標的（ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞）に対するエフェクター（Ｔ細胞）の比）を１０：１～１：１の間で変化させた。３つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験を示す。（ｅ）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるカスパーゼ３およびローディング対照（βアクチン）の活性化を表す代表的なウェスタンブロット。ＤＭＳＯまたはＲＧ－７１１２（１μＭ）に曝露したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、活性化Ｔ細胞と共に、１０：１のＥ：Ｔ比で４時間同時培養した。（ｆ）棒グラフは、プロカスパーゼ３に対する切断型カスパーゼ３の比（βアクチンに対して標準化した）を表す。数値を、Ｔ細胞のみの群（「１」として設定される）に対して標準化した。（ｇ）ＤＭＳＯ、ＲＧ－７１１２（１μＭ）、またはＨＤＭ－２０１（２００ｎＭ）を用いて２４時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１０ＡおよびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂの発現レベルについてマイクロアレイに基づく分析を行い、それを、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）シグナル値からのタイル式表示として表す（１群当たりｎ＝６の生物学的に独立したサンプル）。（ｈ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝５の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。（ｉ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝５の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。（ｊ，ｋ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３（ｐ５３^＋／＋）またはｐ５３ノックアウト（ｐ５３^－／－）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１発現（ｊ）またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現（ｋ）に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝４の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。（ｌ，ｍ）ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）（ｌ）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）（ｍ）のプロモーターに対するｐ５３の結合を検出するために、ＤＭＳＯまたは２μＭのＲＧ－７１１２用いて１２時間処置したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ分析。データはインプット率（％）として表し、３つの実験を代表する；エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．は３回の技術的反復実験に由来する。Ｎ．Ｄ．は未検出を表す。 （同上） ＭＤＭ２阻害はｐ５３に依存する様式でＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現を強化することを示す図である。（ａ）ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）および同種異系ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを移入した後のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスの生存率（％）を示す。マウスに追加の同種異系Ｔ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を注射し、表示の通り、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２および抗ＴＲＡＩＬ－抗体またはＩｇＧ－アイソタイプを用いて処置した。２つの実験に由来する独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｂ）ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）および同種異系ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを移入した後のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスの生存率（％）を示す。マウスに追加の同種異系Ｔ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）、ＷＴ Ｔ細胞、またはＴＲＡＩＬ^－／－Ｔ細胞を注射した。２つの実験に由来する独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｃ）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるカスパーゼ３、カスパーゼ９、およびローディング対照（βアクチン）の活性化を表すウェスタンブロット。活性化Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＲＡＩＬ、中和抗体、またはＩｇＧ対照で１時間事前処置し、ＤＭＳＯまたはＲＧ－７１１２（１μＭ）に曝露したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と共に、１０：１のＥ：Ｔ比で４時間同時培養した。（ｄ）アイソタイプ対照に対して標準化した切断型カスパーゼ３／全カスパーゼ３の比の定量化。各データポイントは独立した生物学的反復を表す。（ｅ）アイソタイプ対照に対して標準化した切断型カスパーゼ９／全カスパーゼ９の比の定量化。各データポイントは独立した生物学的反復を表す。（ｆ）ＷＴ ＯＣＩ－ＡＭＬ細胞またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓノックアウトＯＣＩ－ＡＭＬ細胞の移植を受けたＲａｇ２^－／－ＩI２ｒγ^－／－マウスの生存率。マウスに健常ドナーから単離した一次ヒトＴ細胞をさらに注射し、媒体またはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。２つの独立した実験に由来する動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｇ）棒グラフは、１μＭのＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７１１２と共にインキュベートした（記載がある場合）ＷＴまたはＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓノックアウトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２^－／－）の生存率を示す。４８時間後に、限定濃度のｈＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）を２４時間添加した（記載がある場合）。ＡＭＬ細胞の生存率をフローサイトメトリーにより測定した。三重測定の平均±ＳＥＭを示す。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。（ｈ）Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭ＋同種異系Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞を用いてアロＨＣＴを受けたＷＥＨＩ－３Ｂ白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスのアロＨＣＴ後１２日目に脾臓から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）。レシピエントマウスを、表示の通り、媒体またはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。測定を繰り返す毎に、ＥＣＡＲベースライン値に対する標準化を実施した。平均値±ＳＥＭはｎ＝４の生物学的に独立した反復試料に由来し、各反復試料は、マウス２匹から得た脾臓をプールすることにより生成した。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。（ｉ）パネルｈに記載するように、ＢＭＴレシピエントから単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞の糖分解（グルコース注射後のＥＣＡＲと基底ＥＣＡＲとの間の差異として計算した）および糖分解能力（オリゴマイシン注射後のＥＣＡＲと基底ＥＣＡＲとの間の差異として計算した）。平均値±ＳＥＭはｎ＝４の生物学的に独立した反復試料に由来し、各反復試料は、マウス２匹から得た脾臓をプールすることにより生成した。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。（ｊ）パネルｈに記載するように、ＢＭＴレシピエントから単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏラベリングした後の糖分解中間体に対するＵ－^１３Ｃ－グルコースの部分的な寄与。各ドットは一匹のマウスを表す。スチューデントの対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。ｎｓ：有意ではない。経路の概略図はＢｉｏｒｅｎｄｅｒ．ｃｏｍを用いて作成した。 （同上） （同上） ＭＤＭ２阻害はドナーＴ細胞の細胞傷害性および寿命を促進することを示す図である。（ａ～ｈ）散布図および代表的なヒストグラムは、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭ＋同種異系Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞を移植し、媒体またはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置したＷＥＨＩ－３Ｂ白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの、アロＨＣＴ後１２日目に脾臓から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーフォリン（ａ，ｂ）、ＣＤ１０７ａ（ｃ，ｄ）、ＩＦＮ－γ（ｅ，ｆ）、ＴＮＦ－α（ｇ，ｈ）の発現を示す。２つの実験に由来する１群当たりｎ＝１４～１９の生物学的に独立した動物から得られた平均値±ＳＥＭを示し、また両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した。（ｉ）ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を移入し、および同種異系ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを使用してＢＭＴを行った後のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスの生存率（％）を示す。マウスに追加の同種異系Ｔ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を、ＢＭＴ後の２日目に注射した。適応があれば、ＣＤ８ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を枯渇させた。２つの実験に由来する独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｊ）ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）および同種異系ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを移入した後のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスの生存率（％）を示す。マウスに、これまでに誘発操作および処置を受けた（ＭＤＭ２阻害剤または媒体）マウスに由来する追加の同種異系Ｔ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を注射した。２つの実験に由来する独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｋ）アロ移植された白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた脾臓ＣＤ４５＋生存細胞に関するＦｌｏｗＳＯＭガイド式のマニュアルメタクラスタリングを示すＵＭＡＰ（Ａ、上段）、およびメジアンマーカー発現を示すヒートマップ（下段）。（ｌ）アロ移植された白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを表示のようにＲＧ－７１１２または媒体を用いて処置し、それから得られたドナー由来の（Ｈ－２ｋｂ＋）ＴＣＲｂ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に関するＦｌｏｗＳＯＭガイド式のマニュアルメタクラスタリングを示すＵＭＡＰ（Ａ、上段）、およびメジアンマーカー発現を示すヒートマップ（下段）。（ｍ）アロ移植された白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを表示のようにＲＧ－７１１２または媒体を用いて処置し、それから得られたドナー由来の（Ｈ－２ｋｂ＋）ＴＣＲｂ＋ＣＤ８＋ＣＤ２７＋ＴＩＭ３＋Ｔ細胞の定量。 （同上） （同上） 一次ヒトＡＭＬ細胞におけるＭＤＭ２阻害はＴＲＡＩＬ－１／２発現を引き起こすことを示す図である。（ａ）グラフは、ｑＰＣＲを通じて決定したときの、ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで１２時間処置する前またはその後の一次ヒトＡＭＬ細胞におけるｈＴＲＡＩＬ－Ｒ１ ｍＲＮＡ発現レベル（ｈＧａｐｄｈに対して標準化した）を示す。各データポイントは、１人の独立した患者の個々のサンプルを表す。実験を独立に実施し、結果（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）をプールした。（ｂ）グラフは、異なる濃度のＲＧ－７１１２（０．５、１、および２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで１２時間処置した後の、患者由来ＰＢＭＣから得られた一次ＡＭＬ芽球のｈＴＲＡＩＬ－Ｒ１ ｍＲＮＡレベルの代表的な定量を示す。（ｃ）グラフは、ｑＰＣＲを通じて決定したときの、ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで１２時間処置する前またはその後の一次ヒトＡＭＬ細胞におけるｈＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ｍＲＮＡ発現レベル（ｈＧａｐｄｈに対して標準化した）を示す。各データポイントは、１人の独立した患者の個々のサンプルを表す。実験を独立に実施し、結果（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）をプールした。（ｄ）グラフは、異なる濃度のＲＧ－７１１２（０．５、１、および２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで１２時間処置した後の、患者由来ＰＢＭＣから得られた一次ＡＭＬ芽球のｈＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ｍＲＮＡレベルの代表的な定量を示す。（ｅ）一次ヒトＡＭＬ細胞を移入した後のＲａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－レシピエントマウスの生存率（％）を示す（患者番号５６）。表示の通り、マウスに追加のヒトＴ細胞（ＨＬＡ不一致の健常ドナーの末梢血液から単離した）を注射し、および／または媒体もしくはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｆ）ヒトＷＴまたはｐ５３ノックダウン（ｐ５３^－／－）ＯＣＩ－ＡＭＬ－３細胞を移入した後のＲａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－レシピエントマウスの生存率（％）を示す。表示の通り、マウスに追加のヒトＴ細胞（ＨＬＡ不一致の健常ドナーの末梢血液から単離した）を注射し、および／または媒体もしくはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置した。２つの実験に由来する生物学的に独立した動物（ｎ＝１０）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。（ｇ）ヒトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞内のカスパーゼ８、カスパーゼ３、ＰＡＲＰ、およびローディング対照（βアクチン）を示す代表的なウェスタンブロット。ＤＭＳＯまたはＲＧ－７１１２（１μＭ）に曝露したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、活性化Ｔ細胞と共に、１０：１のＥ：Ｔ比で４時間同時培養した。数値をβアクチンに対して標準化した。（ｈ，ｉ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラム（ｈ）および倍率変化の棒グラフ（ｉ）は、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＨＬＡ－Ｃ発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。棒グラフは、ｎ＝５～６の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭを示す。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｊ，ｋ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラム（ｊ）および倍率変化の棒グラフ（ｋ）は、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＨＬＡ－ＤＲ発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。棒グラフは、ｎ＝５～６の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭを示す。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｌ，ｍ）グラフは、ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３（ｐ５３^＋／＋）またはｐ５３ノックダウン（ｐ５３^－／－）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＨＬＡ－Ｃ発現（ｌ）、ＨＬＡ－ＤＲ発現（ｍ）に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝４の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｎ）ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４８時間処置した後の一次ＡＭＬ患者芽球の累積的ＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣ－ＩＩ）レベルをフローサイトメトリーにより決定し、生物学的に独立した患者（ｎ＝１１）のＭＦＩとして示す。対照で処置した細胞から得られたＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣ－ＩＩ）のＭＦＩを１．０として設定した。両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定を使用してｐ値を計算し、グラフ内に表示する。（ｏ）代表的なヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４８時間処置した後の、患者の一次ＡＭＬ芽球上でのＨＬＡ－ＤＲ発現に関するＭＦＩを、三重で実施した１つの実験に由来する平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞から得られたＭＦＩを１．０として設定し、またスチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 （同上） ＧＶＨＤ組織病理スコアリングを示す図である。（ａ～ｃ）散布図は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢＡＬＢ／ｃ ＢＭおよびＴ細胞を移植し、媒体またはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置し、アロＨＣＴ後１２日目にそのマウスから単離した（ａ）肝臓、（ｂ）結腸、（ｃ）小腸から得られた組織病理スコアを示す。両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した（有意でない（ｎ．ｓ．））。 ＲＧ７１１２またはＨＤＭ２０１によりＭＤＭ２阻害した時のヒトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を示す図である。（ａ）表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。５回の独立した生物学的反復の１つを示す。（ｂ）表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。５回の独立した生物学的反復の１つを示す。（ｃ～ｆ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて６時間（ｃ，ｄ）または１２時間（ｅ，ｆ）処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞内のヒトＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ｈＴＲＡＩＬＲ１）ＲＮＡおよびｈＴＲＡＩＬＲ２ ＲＮＡに関する倍率変化を、ｎ＝３の独立した実験（各２回の技術的反復測定を含む）から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞から得られたＲＮＡを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｇ，ｉ）表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ－２０１を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのｈＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ｇ）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ｉ）発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。（ｈ，ｊ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ｈ）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ｊ）発現のＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝５の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 （同上） マウスＷＥＨＩ－３Ｂ細胞におけるＴＲＡＩＬ－Ｒ ｍＲＮＡおよび／タンパク質の発現を示す図である。（ａ，ｂ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて６時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞におけるマウスＴＲＡＩＬ－Ｒ（ｍＴＲＡＩＬ－Ｒ）ＲＮＡおよびｍＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＲＮＡの倍率変化を、ｎ＝４の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。ＤＭＳＯで処置した細胞のＲＮＡを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｃ，ｄ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて１２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞におけるマウスＴＲＡＩＬ－Ｒ（ｍＴＲＡＩＬ－Ｒ）ＲＮＡおよびｍＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＲＮＡの倍率変化を、ｎ＝４の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。ＤＭＳＯで処置した細胞のＲＮＡを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｅ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。（ｆ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝５の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０に設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｇ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。（ｈ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝５の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０に設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 （同上） ＸＩ－００６（ＭＤＭＸ阻害剤）処置は、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２発現増加を引き起こすことを示す図である。（ａ）グラフは、表示濃度のＭＤＭＸ阻害剤ＸＩ－００６を用いて７２時間処置したＯＣＩ－ＡＭＬ３生存細胞（固定可能な細胞生死判定色素陰性）の割合（％）を、ｎ＝７の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｂ，ｃ）グラフは、表示濃度のＭＤＭＸ阻害剤ＸＩ－００６を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ｂ）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ｃ）発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝７の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。ＤＭＳＯで処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 ＨＤＭ２０１（ＭＤＭ２阻害剤）処置は、ヒトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２発現をｐ５３に依存する方式で増加させることを示す図である。（ａ）適応があれば、１ｍｇ／ｍｌのドキソルビシンに４時間曝露したＷＴ ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞またはｐ５３ノックダウンＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＭＤＭ２、ｐ５３、およびローディング対照（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す代表的なウェスタンブロット（左パネル）。右パネル：群毎のタンパク質バンドの相対強度の定量。（ｂ）１μＭのＲＧ－７１１２に４時間曝露したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＭＤＭ２、ｐ５３、およびローディング対照（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す代表的なウェスタンブロット（左パネル）。（ｃ，ｄ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後の野生型（ＷＴ）ＯＣＩ－ＡＭＬ３またはｐ５３ノックダウン（ｐ５３^－／－）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１発現（ｃ）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現（ｄ）に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝４の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｅ）グラフは生存細胞の割合（％）を示す。記載がある場合、野生型ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＷＴ）またはｐ５３ノックアウト（ｐ５３^－／－）ＯＣＩ－ＡＭＬ３を、１μＭのＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７１１２と共にインキュベートした。４８時間後に、記載がある場合は、限定濃度のｈＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）を２４時間添加した。細胞の生存率をフローサイトメトリーにより測定した。三重測定の平均±ＳＥＭを示す。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＴＲＡＩＬ－Ｒ２ノックダウン効果およびＭＤＭ２阻害の影響を示す図である。（ａ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、ＷＴ ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを使用するｈＴＲＡＩＬ－Ｒ２ノックアウト上でのｈＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｈＴＲＡＩＬ－Ｒ１、およびｐ５３発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７１１２を用いて７２時間処置。（ｂ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７１１２を用いて７２時間処置した後のＷＴまたはＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓノックアウトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝２の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｃ）最適濃度のｈＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）を用いて２４時間処置した後のＷＴ細胞またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓノックアウトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の生存率をフローサイトメトリーにより測定した。三重測定の平均±ＳＥＭを示す。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 （同上） （同上） ＭＤＭ２阻害はアロ反応性Ｔ細胞の代謝活性を増加させることを示す図である。（ａ～ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＭＤＭ２阻害剤を用いて処置したアロＨＣＴレシピエントマウスの脾臓から濃縮した。媒体を用いて処置したマウス（ｎ＝８）およびＭＤＭ２阻害剤を用いて処置したマウス（ｎ＝７）から、補足的方法（Supplementary Methods）に記載されるように極性代謝物を抽出し、ＬＣ－ＭＳにより測定した。（ａ）目標を定めたアプローチにより分析した代謝物１００例のＶｏｌｃａｎｏプロット。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｂ）「ＭＤＭ２阻害剤」および「媒体」間で有意に制御を受けた代謝物２７例のヒートマップ（ｐ＜０．０５）。カラースケールは、各サンプル内の標準化された濃度を表す。（ｃ）ピリミジン生合成経路由来の代謝物の絶対存在量。経路スキームはＢｉｏｒｅｎｄｅｒ．ｃｏｍを用いて作成した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 （同上） 脾臓Ｈ－２ｋｂ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するゲーティング戦略、および白血病を有するマウスにおいてＭＤＭ２阻害した際のＣＤ８Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現を示す図である。（ａ）マウス脾臓からドナー由来の（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を特定するためのゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロット。ゲートされた細胞は、シングレット、生存性（固定可能な細胞生死判定色素陰性）、Ｈ－２ｋｂ^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^＋、およびＣＤ８^＋であった。ＴＢＩが施され、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭおよびＷＥＨＩ－３Ｂ細胞を注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を採取した（ｄ０）。マウスに、同種異系のドナーＴ細胞（ｄ２）を輸注し、ＲＧ－７１１２の５回投与（３日目に開始し、一日置き）による処置を施した。 （同上） アロＨＣＴが施されたＭＤＭ２阻害剤処置マウスから単離したＴ細胞の表現型を示す図である。（ａ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表し、また散布図は、アロＨＣＴが施され、媒体を用いて処置される白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた全生存ドナー（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣＤ６９に関するＭＦＩの倍率変化を示す。２つの実験に由来する、１群当たりｎ＝１４／１５の生物学的に独立したマウスから得られた平均値±ＳＥＭを示す。媒体で処置した白血病を有するマウスのＭＦＩを１．０として設定した。両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した。（ｂ）アロ移植が施され、表示の通りＲＧ－７１１２または媒体を用いて処置された白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた全生存ドナー（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＣＤ３^＋Ｔ細胞に占めるＣＤ８^＋細胞の割合（％）を示す散布図。３つの実験に由来する、１群当たりｎ＝１４／１９の生物学的に独立したマウスから得られた平均値±ＳＥＭを示す。媒体で処置した白血病を有するマウスのＭＦＩを１．０として設定した。両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した。ＣＤ８Ｔ細胞／全ＣＤ３Ｔ細胞に差異は検出されなかった。 ＭＤＭ２阻害はナイーブマウスにおいてＴ細胞傷害性を促進することを示す図である。（ａ～ｄ）ＲＧ－７１１２または媒体の５回投与（一日置き）により処置したナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから得られた脾臓細胞のフローサイトメトリー分析。分析の時点は最後の処置から１日後であった。（ａ）表示の通り、ＲＧ－７１１２または媒体を用いて未処置ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを処置し、それから得られた全生存ドナー（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＣＤ３^＋Ｔ細胞に占めるＣＤ８^＋細胞の割合（％）を示す散布図。２つの実験に由来する１群当たりｎ＝５／１０の生物学的に独立したマウスから得られた平均値±ＳＥＭを示す。媒体で処置した白血病を有するマウスのＭＦＩを１．０として設定した。両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した。（ｂ～ｄ）媒体を用いて未処置ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを処置し、それから得られた全生存ドナー（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＣＤ８^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ（ｂ）、ＴＮＦα（ｃ）、およびＣＤ６９（ｄ）に関するＭＦＩの倍率変化を示す散布図。２つの実験に由来する１群当たりｎ＝５／１０の生物学的に独立したマウスから得られた平均値±ＳＥＭを示す。媒体で処置した白血病を有するマウスのＭＦＩを１．０として設定した。両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＮＫ１．１^＋細胞の枯渇前後におけるＢＭ移植片の純度を示す図である。（ａ）蛍光活性化セルソーティングによるＣＤ８^＋Ｔ細胞の枯渇前後のＢＭ純度を表す代表的なフローサイトメトリープロット。ＢＭ ＣＤ８^＋枯渇後の生存実験に、表示するソート後の細胞を使用した。２つの独立した実験において類似した結果が得られた。（ｂ）蛍光活性化セルソーティングによるＮＫ１．１^＋細胞の枯渇前後のＢＭ純度を表す代表的なフローサイトメトリープロット。ＢＭ ＮＫ細胞枯渇後の生存実験に、表示するソート後の細胞を使用した。２つの独立した実験において類似した結果が得られた。 二次レシピエントに移植するためのＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｈ－２ｋｄ^＋Ｔ細胞の純度を示す図である。（ａ）ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを移植したＣ５７ＢＬ／６マウスから再単離した脾臓ＣＤ３^＋Ｈ－２ｋｄ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、マウスＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ／ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞（ｄ０）、および同種異系ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞（ｄ２）の純度（全生存細胞の）を示す代表的なフローサイトメトリープロット。マウスは、ｄ３以降、一日置きに、ＲＧ－７１１２または媒体の５回投与を受けた。脾臓細胞をアロＨＣＴ後のｄ１２に採取した。ソート後の細胞をリコール免疫生存実験に使用した。３つの独立した実験において類似した結果が得られた。 （同上） ＣＤ４５^＋およびドナー由来の（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのマーカー発現を表すＵｍａｐを示す図である。（ａ，ｂ）アロＨＣＴが施された白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた、ランダムに選択された生存ＣＤ４５^＋細胞（ａ）およびドナー由来の（Ｈ－２ｋｂ^＋）ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ｂ）上でのマーカー発現を示すＵｍａｐダイアグラム。 （同上） ＭＤＭ２阻害はＣＤ８Ｔ細胞においてＣＤ１２７およびＢｃｌ－２のレベル増加を引き起こすことを示す図である。（ａ～ｄ）散布図および代表的なヒストグラムは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＢＭ＋同種異系Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞が移植され、および媒体またはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置されたＷＥＨＩ－３Ｂ白血病を有するＢＡＬＢ／ｃマウスのアロＨＣＴ後１２日目に脾臓から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣＤ１２７の発現（ｋ，ｌ）、Ｂｃｌ－２の発現（ｍ，ｎ）を示す。２つの実験に由来する１群当たりｎ＝１４～１９の生物学的に独立した動物から得られた平均値±ＳＥＭを示し、両側マンホイットニーＵ検定を使用してｐ値を計算した。 ＰＢＭＣにおいて一次ＡＭＬ芽球を特定するためのゲーティング戦略、およびＭＤＭ２阻害は一次ＡＭＬ患者芽球においてｐ５３を増加させることを示す図である。（ａ）患者由来ＰＢＭＣにおいて一次ＡＭＬ芽球を特定するためのゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロット。ゲート後の細胞は、シングレット、生存性（固定可能な細胞生死判定色素陰性）、およびマーカーＣＤ３４^＋またはＣＤ１１７（ｃＫＩＴ）^＋について陽性であった（ここではＣＤ３４陽性細胞に関するゲーティングを示す）。一次診断時のＡＭＬ細胞上での有益なマーカー発現に基づきマーカーを選択した。（ｂ）ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４８時間処置した後の一次ＡＭＬ患者芽球の累積的ｐ５３レベルをフローサイトメトリーにより決定し、生物学的に独立した患者（ｎ＝２３）のＭＦＩを示す。対照で処置した細胞から得られたｐ５３のＭＦＩを１．０として設定した。両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定を使用してｐ値を計算し、グラフ内に表示する。（ｃ，ｄ）ヒストグラム（ｃ）およびグラフ（ｄ）は、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて４８時間処置した後の代表的な患者の一次ＡＭＬ芽球上でのｐ５３発現に関するＭＦＩの倍率変化を、三重で実施した１つの実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞から得られたＭＦＩを１．０として設定し、またスチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 （同上） ＭＤＭ２阻害は一次ＡＭＬ患者芽球においてＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２タンパク質の上方制御を引き起こすことを示す図である。（ａ）ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４８時間処置した後の一次ＡＭＬ患者芽球の累積的ＴＲＡＩＬ－Ｒ１レベルをフローサイトメトリーにより決定し、独立した患者（ｎ＝２３）のＭＦＩとして示す。対照で処置した細胞から得られたＴＲＡＩＬ－Ｒ１のＭＦＩを１．０として設定した。両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定を使用してｐ値を計算し、グラフに表示する。（ｂ，ｃ）ヒストグラム（ｂ）およびグラフ（ｃ）は、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて４８時間処置した後の、代表的な患者の一次ＡＭＬ芽球上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ１発現に関するＭＦＩの倍率変化を、三重で実施した１つの実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞から得られたＭＦＩを１．０として設定し、またスチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｄ）ＲＧ－７１１２（２μＭ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４８時間処置した後の一次ＡＭＬ患者芽球の累積的ＴＲＡＩＬ－Ｒ２レベルをフローサイトメトリーにより決定し、生物学的に独立した患者（ｎ＝２２）のＭＦＩとして示す。対照で処置した細胞から得られたＴＲＡＩＬ－Ｒ１のＭＦＩを１．０として設定した。両側ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定を使用してｐ値を計算し、グラフに表示する。（ｅ）ヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて４８時間処置した後の代表的な患者の一次ＡＭＬ芽球上でのＴＲＡＩＬ－Ｒ２発現に関するＭＦＩの倍率変化を、三重で実施した１つの実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞から得られたＭＦＩを１．０として設定し、またスチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 ＭＤＭ２阻害は患者番号５６の一次ＡＭＬ芽球においてＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２ ｍＲＮＡの上方制御を引き起こすことを示す図である。患者番号５６の一次ＡＭＬ芽球を使用するＡＭＬ異種移植マウスモデルの純度対照。（ａ）棒グラフは、患者番号５６の一次ＡＭＬ芽球をＭＤＭ２阻害（ＲＧ）に曝露したときのＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２タンパク質レベル（ＭＦＩ）を示す。ヒト白血病細胞（事前のＭＤＭ２阻害無し）を異種移植実験における生存試験に使用した（図４に示す）。（ｂ）免疫不全マウス中に移入する前のＡＭＬ細胞の富化を示す代表的なフローサイトメトリープロット。ゲート後の細胞は、シングレット、生存性（固定可能な細胞生死判定色素陰性）、およびヒトＣＤ４５^＋であった。 （同上） （同上） ＭＤＭ２阻害は患者番号５７の一次ＡＭＬ芽球においてＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２ ｍＲＮＡの上方制御を引き起こすことを示す図である。移入前のＡＭＬ細胞の純度および生存試験．（ａ）棒グラフは、患者番号５７の一次ＡＭＬ芽球をＭＤＭ２阻害（ＲＧ）に曝露したときのＴＲＡＩＬ－Ｒ１／Ｒ２タンパク質レベル（ＭＦＩ）を示す。ヒト白血病細胞（事前のＭＤＭ２阻害無し）を、異種移植実験における生存試験に使用した。（ｂ）代表的なフローサイトメトリープロットは、免疫不全Ｒａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－マウス中に移入する前のＡＭＬ細胞の富化を示す。ゲート後の細胞は、シングレット、生存性（固定可能な細胞生死判定色素陰性）、およびヒトＣＤ４５^＋であった。（ｃ）一次ヒトＡＭＬ細胞移入後のＲａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－レシピエントマウスの生存率（％）を示す（患者番号５７）。表示の通り、マウスに追加のヒトＴ細胞（健常ドナーの末梢血液から単離した）を注射し、および／または媒体もしくはＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて処置を施した。３つの実験に由来する独立した動物（ｎ＝８）を表し、また両側マンテル・コックス検定を使用してｐ値を計算した。 （同上） （同上） 移植前ｐ５３^－／－ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＰ５３ノックダウン効果を示す図である。（ａ）移植前ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるｐ５３ノックダウン効果を示す代表的なフローサイトメトリープロット。細胞を、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含有する２０％のＦＣＳ ＲＰＭＩ培地内で最低７日間培養した。ゲート後の細胞は、シングレットおよび生存性（固定可能な細胞生死判定色素陰性）であった。安定なノックダウン効果を有する細胞をＧＦＰ^＋ＲＦＰ^＋集団として表す。２つ独立した実験において類似した結果が得られた。 骨髄ＢＭ細胞においてＭＤＭ２を増加させる発癌突然変異ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－αおよびｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖは、ＡＭＬをＭＤＭ２阻害剤／Ｔ細胞効果に対して感受性にさせることを示す図である。（ａ）ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、またはＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－αが導入された３３，０００個の一次マウスＢＭ細胞、および５^＊１０^６個のＢＡＬＢ／ｃ ＢＭ細胞を移入してから２６日後のマウスの脾臓。（ｂ）棒グラフは（ａ）に示す異なる群の脾臓の重量を示す。（ｃ）フローサイトメトリーにより定量した、（ａ）に由来するマウスのＢＭ内の全ＣＤ４５^＋細胞に占める発癌遺伝子導入（ＧＦＰ^＋）細胞の割合（％）。（ｄ）表示のような、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはｃ－ｍｙｃが導入された一次マウスＢＭ細胞内のＭＤＭ２タンパク質（ＭＦＩ）。（ｅ）表示のような、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはｃ－ｍｙｃが導入された一次ＢＭ細胞内のＭＤＭ４タンパク質（ＭＦＩ）。（ｆ）表示のような、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはｃ－ｍｙｃが導入された一次マウスＢＭ細胞内のＭＤＭ２およびローディング対照（βアクチン）の量を示すウェスタンブロット。（ｇ）棒グラフは、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはｃ－ｍｙｃが導入された一次マウスＢＭ細胞内のＭＤＭ２／βアクチンの比を示す。比はＥＶ（空ベクター）に対して標準化されている。生物学的反復試料（異なるマウス由来のＢＭ）を使用しながら実験を２回実施し、データをプールした。（ｈ）ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α－ｔｇ導入ＢＭ細胞（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）、および３０日後に同種異系Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭを移入した後のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの生存率（％）を示す。マウスには、ＢＭ移入後２日目に同種異系Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ３^＋Ｔ細胞の移植を施し、媒体またはＭＤＭ２阻害剤を用いて処置を施した。（ｉ）ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ－ｔｇ導入ＢＭ細胞（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）、および３０日後に同種異系Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭを移入した後のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの生存率（％）を示す。マウスには、ＢＭ移入後２日目に同種異系Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ３^＋Ｔ細胞の移植を施し、媒体またはＭＤＭ２阻害剤を用いて処置を施した。 （同上） ＭＤＭ２およびＭＤＭＸ阻害はＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を上方制御することを示す図である。（ａ）ＤＭＳＯ、ＲＧ－７１１２（１μＭ）、またはＨＤＭ－２０１（２００ｎＭ）を用いて２４時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＨＬＡクラスＩおよびＩＩの発現レベルについてマイクロアレイに基づく分析を行い、それを、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）シグナル値からのタイル式表示として表す（１群当たりｎ＝６の生物学的に独立したサンプル）。（ｂ，ｃ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで７２時間処置した後の野生型ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ｐ５３＋／＋）またはｐ５３ノックアウト（ｐ５３－／－）ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＨＬＡ－Ｃ発現（ｂ）、ＨＬＡ－ＤＲ発現（ｃ）に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝４の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｄ，ｅ）グラフは、表示濃度のＭＤＭＸ－阻害剤ＸＩ－００６を用いて７２時間処置した後のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上でのＨＬＡ－Ｃ発現（ｄ）およびＨＬＡ－ＤＲ発現（ｅ）に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝７の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。 ＭＤＭ２阻害は悪性ＷＥＨＩ－３Ｂ内でｐ５３およびＭＨＣクラスＩＩ発現を増加させるが、非悪性の３２Ｄ細胞においてはそうでないことを示す図である。（ａ）ウェスタンブロットは、ＤＭＳＯ、ＲＧ－７１１２（０．５μＭ、１μＭ）、または１０００ｎｇ／ｍｌのドキソルビシンに４時間曝露したＷＥＨＩ－３Ｂ細胞内のＭＤＭ２、ｐ５３、およびローディング対照（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す。（ｂ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝６の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｃ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。（ｄ）ウェスタンブロットは、ＤＭＳＯ、ＨＤＭ２０１（１００ｎＭ、２００ｎＭ）、または１０００ｎｇ／ｍｌのドキソルビシンに４時間曝露したＷＥＨＩ－３Ｂ細胞内のＭＤＭ２、ｐ５３、およびローディング対照（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す。（ｅ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ発現に関するＭＦＩの倍率変化をｎ＝４～６の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｆ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後のＷＥＨＩ－３Ｂ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。（ｇ）ウェスタンブロットは、ＤＭＳＯ、ＨＤＭ２０１（１００ｎＭ、２００ｎＭ）、または１０００ｎｇ／ｍｌのドキソルビシンに４時間曝露した３２Ｄ細胞内のＭＤＭ２、ｐ５３、およびローディング対照（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す。（ｈ）グラフは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後の３２Ｄ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ発現に関するＭＦＩの倍率変化を、ｎ＝４～６の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。対照で処置した細胞のＭＦＩを１．０として設定した。スチューデントの対応のない両側t検定を使用してｐ値を計算した。（ｉ）代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、表示濃度のＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１を用いて７２時間処置した後の３２Ｄ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。 （同上） 図式的要約を示す図である。単純化されたスケッチは、Ｔ細胞に対するＡＭＬ細胞のＭＤＭ２誘発型免疫感受性の作用機序（案）を示す。ＭＤＭ２阻害はｐ５３レベルを増加させる。Ｐ５３は核に移行し、そこでＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、ならびにＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２の転写を活性化させる。ＭＨＣＩＩ発現増加はＴ細胞のプライミングを引き起こし、これによりサイトカインを連続的に産生しながらその寿命および活性化を促進する。ＡＭＬ細胞上でＴＲＡＩＬ－Ｒが上方制御されると、Ｔ細胞によるＴＲＡＩＬ媒介式のアポトーシス誘発に対するＡＭＬ細胞の感受性が増加し、ＡＭＬ細胞内でＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２下流経路（カスパーゼ８、カスパーゼ３、ＰＡＲＰ）の活性化が引き起こされる。

本発明は、下記の実施例によりさらに記載される。これは、本発明の範囲を制限するようには意図されず、むしろ本明細書に記載される本発明をより深く例証するために提供される本発明の態様の好ましい実施形態を代表する。

実施例において採用された方法
患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離および培養
ヒトサンプルの収集および分析は、Ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙの倫理委員会より承認された（プロトコール番号１００／２０）。同意書を各患者から得た。ヒトデータのすべての分析は、関連する倫理規定を順守して実施した。患者の特徴を表１にリスト化する。

ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
ヒト末梢血液を、滅菌ＥＤＴＡコーティングＳ－Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、ドイツ）内に収集した。ＰＢＳを用いて血液を１：１希釈し、１容のＰａｎｃｏｌｌ Ｈｕｍａｎ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ドイツ）に積層した。勾配遠心分離を、ブレーキをかけずに３００×ｇ、室温で３０分間実施して（加速９、減速１）、ＰＢＭＣを分離した。分離後のＰＢＭＣを含有する中間相をアスピレーター吸引し、ＰＢＳを用いて３回洗浄した；１０分間、３００×ｇで１回、次に２００×ｇで２回。

ヒトＰＢＭＣからのＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞の単離
ＰＢＭＣ単離を上記のように実施した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ細胞分離システムを使用しながら、製造業者の指示に従い濃縮した（注文番号１３０－０４５－１０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、米国）。ポジティブ選択では、抗ヒトＣＤ４^＋ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、米国）を使用した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の純度は、フローサイトメトリーにより評価した場合、少なくとも９０％であった。

一次健常ドナーＰＢＭＣおよび一次ＡＭＬ芽球
一次細胞を、２０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ培地内で維持した。

ＭＤＭ２阻害に対する一次ＡＭＬ芽球の曝露
ＰＢＭＣを、製造業者（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）のプロトコールに従い、フィコール密度勾配遠心分離法によりＡＭＬ患者の血液から単離し、１ウェル当たり細胞５００，０００個の密度で２４ウェルプレートに播種し、個々の実験において表示する濃度のＲＧ－７１１２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｌｃ社、米国）またはＨＤＭ－２０１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）の存在下または非存在下で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ）内で４８時間培養した。

Ｔ細胞の活性化および細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイで使用される細胞傷害性Ｔ細胞を、フィコール密度勾配遠心分離法によりドナー血液を単離した後の健常志願者ドナーの末梢血液Ｔ細胞から生成し、製造業者の指示に従い、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）およびＭＡＣＳ細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用するネガティブ選択により富化した。取得されたＴ細胞の純度は、フローサイトメトリーにより評価した場合、少なくとも９０％であった。単離したＣＤ３^＋Ｔ細胞を、単離後の１日目に、Ｔ細胞１百万個当たり２５μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ社、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、２日目に３０Ｕ／ｍｌのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を用いて刺激し、合計７日間培養した。

ヒトＡＭＬサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ
単離した患者ＰＢＭＣの全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙキットを使用しながら、製造業者の指示に基づき単離した。ＰＢＭＣを、６ウェルプレート内に１ウェル当たり細胞１０００万個の密度で播種し、１０％のウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内で培養し、ＲＧ－７１１２（０．５μＭ、１μＭ、および２μＭ）を用いて１２時間処置した。ｃＤＮＡ合成では、１μｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマー（Ｈｉｇｈｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット、ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して逆転写した。定量的ＲＴ－ＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ）および表２に提示するようなプライマーを使用して実施した。すべての反応を、５０ｎｇのｃＤＮＡを用いて三重で、補正および再現性測定を二重で実施し、すべてのｍＲＮＡレベルを参照遺伝子ｈＧＡＰＤＨに対して標準化しながら、相対的発現量をＰｆａｆｆｌ ΔＣｔ方法を使用して計算した。プライマー配列を表２に提示する。

マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２Ｋｂ）およびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２Ｋｄ）マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ社（フランス）から購入し、またはＦｒｅｉｂｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの動物施設にあるローカルストックから取得した。Ｒａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－マウスを、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの動物施設にあるローカルストックから取得した。６～１４週齢の間でマウスを使用し、またメスまたはオスのみのドナー／レシピエントの対を使用した。動物プロトコールは、動物倫理委員会Regierungsprasidium Freiburg、Freiburg、ドイツ（プロトコール番号：Ｇ１７－０９３、Ｇ－２０／９６）より承認された。

移植片対白血病（ＧｖＬ）マウスモデル
ＧｖＬ実験をこれまでに記載されたように実施した（５）。要するに、^１３７Ｃｓ源を使用して（亜）致死照射した後に、レシピエントに白血病細胞＋／－ドナーＢＭ細胞を静脈内に（ｉ．ｖ．）注射した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、ドナー脾臓または健常ドナーの末梢血液から単離し、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国）およびＭＡＣＳ細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用するネガティブ選択により、製造業者の指示に従い富化した。取得したＴ細胞の純度は、フローサイトメトリーにより評価した場合、少なくとも９０％であった。ＣＤ３^＋Ｔ細胞は、ＢＭ移植後の２日目に付与した。

ＡＭＬ ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ} 白血病モデル
ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}白血病モデルでは、１２Ｇｙ（４時間の間隔を置いて実施した２等分割された線量）による致死照射後に、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントに、ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞、５，０００個、およびＢＡＬＢ／ｃ ＢＭ細胞、５百万個をｉ．ｖ．移植した。これまでに報告されたように（１９、２０）、初回移植後の２日目に、ＢＡＬＢ／ｃ（同種異系モデル）脾臓ＣＤ３^＋Ｔ細胞、合計３００，０００個をｉ．ｖ．で導入した。

ＷＥＨＩ－３Ｂ白血病モデル
ＷＥＨＩ－３Ｂ白血病モデルでは、１０Ｇｙ（４時間の間隔を置いて実施した２等分割された線量）による致死照射後に、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、ＡＭＬ（ＷＥＨＩ－３Ｂ）細胞、５，０００個、およびＣ５７／ＢＬ６ ＢＭ細胞、５百万個をｉ．ｖ．で移植した。初回移植後の２日目に、Ｃ５７／ＢＬ６（同種異系モデル）脾臓ＣＤ３^＋Ｔ細胞、合計２００，０００個をｉ．ｖ．で導入した。

ＯＣＩ－ＡＭＬ３異種移植モデル
ＯＣＩ－ＡＭＬ３異種移植モデルでは^４、５Ｇｙによる致死照射後に、表示の通り、Ｒａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－レシピエントに、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（野生型またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２ノックアウト）細胞、２００，０００個、またはＯＣＩ－ＡＭＬ３（野生型またはｐ５３欠損）細胞、１百万個をｉ．ｖ．で移植した。初回移植後の２日目に、健常ドナーの末梢血液から単離したヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞、合計５００，０００個をｉ．ｖ．で導入した。

一次ヒトＡＭＬ異種移植モデル
一次ヒトＡＭＬ異種移植モデル（２１）では、Ｒａｇ２^－／－ＩＩ２ｒγ^－／－レシピエントを使用した。一次ヒトＡＭＬ細胞をフィコール密度遠心分離により単離し、磁気分離によりＣＤ３^＋細胞を枯渇させた。５Ｇｙによる亜致死照射後に、ＣＤ３^＋枯渇一次ヒトＡＭＬ細胞、１０００万個をｉ．ｖ．で移植した。初回移植後の２日目に、健常ドナーの末梢血液から単離したヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞、合計５０，０００個をｉ．ｖ．で導入した。

ＢＭに導入された発癌突然変異に基づく白血病モデル：
ある特定の発癌突然変異に基づき白血病を誘発するために、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６ＶまたはＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－αが導入されたＢＡＬＢ／ｃ由来のＢＭ細胞、３０，０００個を移植した。ＧＶＬ効果を誘発するために、１０Ｇｙ（４時間の間隔を置いて実施した２等分割された線量）による照射をマウスに施した。次に、レシピエントマウスに、Ｃ５７／ＢＬ６ ＢＭ細胞、５百万個をｉ．ｖ．で注射し；同種異系ＢＭ移入後の２日目に、Ｃ５７／ＢＬ６脾臓Ｔ細胞、２００，０００個を、ｉ．ｖ．で導入した。脾臓由来のＴ細胞を、ＭＡＣＳによってＣＤ３陽性細胞以外のすべての細胞を枯渇させることにより濃縮した。

マウスモデルにおける薬物処置
移植後の３～１１日において、ＲＧ－７１１２（１００ｍｇ／ｋｇ）または媒体（コーンオイル＋５％のＤＭＳＯ）を用いて、経口胃管栄養を介して、一日置きに（５回投与）マウスを処置した。移植後４および８日目に、各実験において適応があれば、精製した抗マウスＣＤ２５３（ＴＲＡＩＬ）抗体またはアイソタイプ対照抗体を、１２．５μｇ／ｇ（体重）の用量でｉ．ｐ．注射した。

ＧｖＬマウスモデルにおけるＴ細胞表現型の決定
Ｔ細胞の表現型を決定する実験を、ＷＥＨＩ－３Ｂ白血病モデルを使用して実施した。ＷＥＨＩ－３Ｂをｉ．ｖ．注射した後の１２日目に、脾臓のＦＡＣＳ分析を実施した。

白血病細胞系
下記の白血病細胞系：ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}（２２）（マウス）、ＷＥＨＩ－３Ｂ（２３）（マウス）、およびＯＣＩ－ＡＭＬ３（ヒト）を使用した。ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}白血病細胞は、Ｄｒ．Ｂ．Ｒ．Ｂｌａｚａｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）より提供された。Iｎ ｖｉｖｏ実験で使用されたすべての細胞系は、ＤＳＭＺまたはＭｕｌｔｉｐｌｅｘｉｏｎ、ドイツにおいて認証を受けた。すべての細胞系をマイコプラズマ汚染について反復テストし、陰性であることが判明した。

ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるｐ５３のノックダウン
Ｐ５３ノックダウン細胞はすでに記載されている（２４）。ｐ５３ｓｈＲＮＡ（ｐ５３．１２２４）は、赤色蛍光タンパク質を同時発現し、ドキシサイクリンにより誘発され得るレトロウイルスベクター中にクローン化された（２４）。トランスフェクトされた細胞を、安定したノックダウン効率を得るために、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含有する２０％のＦＣＳ ＲＰＭＩ培地内で培養した。ｐ５３のノックダウンはウェスタンブロッティングにより確認した。

ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞におけるＴＲＡＩＬ Ｒ１／Ｒ２のノックダウン
ＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ）内で培養した。クロラムフェニコール耐性レンチウイルスベクターである、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉヒトＴＲＡＩＬ－Ｒ１標的ｓｈＲＮＡ（クローンＩＤ：ＴＬ３０８７４１Ａ ５’－ＴＴＣＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＣＡ－３’（配列番号１３））、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉヒトＴＲＡＩＬ－Ｒ２標的ｓｈＲＮＡ（クローンＩＤ：ＴＬ３００９１５Ｂ ５’－ＡＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＧＧＡＣ－３’（配列番号１４））、およびｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ非発現停止ｓｈＲＮＡ対照（クローンＩＤ：ＴＲ３００２１［ＡＭ１］５’－ＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＴ－３’（配列番号１５））を、ＯｒｉＧｅｎｅ社、米国から購入した。リポフェクタミン２０００を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによりレンチウイルス粒子を生成した。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞、３００，０００個に、４μｇ／μｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｍｅｒｃｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の存在下で、レンチウイルス粒子を導入した。ＴＲＡＩＬ－Ｒ１およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２のノックダウンをＦＡＣＳ分析により確認した。

ＴＲＡＩＬ－Ｒ２ノックアウトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の生成
Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、およびピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＭＩＤ：２５０７５９０３）を発現するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを送達するのに使用した。ＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ｇＲＮＡの設計（５’－ＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＣＡＡ－３’（配列番号１６））、およびｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号５２９６１）中へのクローニングを、Ｚｈａｎｇ ｌａｂプロトコールに従い、これまでに記載されたように実施した（ＰＭＩＤ：３１１１４５８６）。ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２－ＴＲＡＩＬ－Ｒ２プラスミドを送達するために、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞、２００，０００個を、２μｇのプラスミドの存在下、再懸濁バッファーＲ（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内で再懸濁した。細胞を、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用しながら、１０μｌのＮｅｏｎチップ内、１３５０Ｖ、３５ｍｓ、単一パルスで電気穿孔し、抗生物質フリーのリカバリー培地に速やかに移した。ＴＲＡＩＬ－Ｒ２陰性細胞をセルソーティング（ＢＤ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ）により単離し、フローサイトメトリー分析により検証した。

マウス脾臓の細胞の単離およびＰＭＡ／イオノマイシン刺激
７０ｍｍセルストレーナーを通じて脾臓をすり潰すことにより、単一細胞浮遊液を得た。赤血球を、１ｍＬの１×ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて氷上で２分間溶解し、サンプルをＰＢＳで洗浄し、４００ｇで７分間遠心分離した。細胞を、Ｇｏｌｇｉ－ＳｔｏｐおよびＧｏｌｇｉ－Ｐｌｕｇ（１：１０００、ＢＤ）、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（５０ｎｇ／ｍｌ、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ社）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が補充されたＲＰＭＩ（２ｍｌ）内、３７℃で５時間再刺激した。

マイクロアレイ分析
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞由来の全ＲＮＡを、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ－７１１２（２μＭ）またはＨＤＭ－２０１（５００ｎＭ）による処置後２４時間の時点で、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、オランダ）およびＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を使用しながら、製造業者の指示に従い抽出した。ＲＮＡの完全性を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．社、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を使用しながら、キャピラリー電気泳動により分析した。ＲＮＡサンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｐｉｃｏ ｋｉｔを用いてさらに処理し、製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、米国）の記載に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓ ａｒｒａｙにハイブリダイズさせた。Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒオリゴパッケージ内で実施されるようなロバストなマルチチップ平均化を介してアレイを標準化した。遺伝子セットの富化率を、遺伝子セットとしてＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｔｈＤＢ４９を経由する経路、および有意カットオフｐ＜０．０５を使用するＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ「ゲージ」４８を使用して計算した。

マイクロアレイ分析をこれまでに記載されたように実施した（２６）。マイクロアレイデータを、データベースＧＥＯレポジトリ内にＧＥＯ受託番号ＧＳＥ１５８１０３として預託する。

ウェスタンブロッティング
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、１ｍｇ／ｍｌのドキソルビシン（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ薬学部）または１μＭのＲＧ－７１１２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｃ社）の存在下または非存在下において４時間培養し、総タンパク質抽出物をこれまでの記載に従い調製した（２７）。カスパーゼの活性化を検出するために、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を１μＭのＲＧ－７１１２で７２時間処置し、活性化Ｔ細胞と共に、１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間同時培養した。いくつかの実験では、同時培養前に、Ｔ細胞を、ＴＲＡＩＬに対する中和抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＭＡＢ３７５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、またはマウスＩｇＧ１（＃４０１４０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）と共に１時間インキュベートした。Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩを使用してＴ細胞を除去した後、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞について分析を行った。

ＥＶ（空ベクター）、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲ－α、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはｃ－ｍｙｃが導入された一次マウス骨髄細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツ）を使用しながらＧＦＰ発現細胞についてソーティングし、分析に付した。

細胞を、ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）が補充された放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）内で溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してタンパク質濃度を決定した。ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーおよびＮｕＰＡＧＥ（商標）サンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、細胞ライセートをＳＤＳ―ＰＡＧＥ用に調製した。ＳＤＳおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するサンプルバッファーを使用して、無細胞上清由来の上清サンプルを調製した。ｐ５３（＃２５２７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＭＤＭ２（＃８６９３４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、カスパーゼ３（＃９６６２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に対して一次抗体を使用した。抗ＧＡＰＤＨ（＃ＧＡＰＤＨ－７１．１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）および抗βアクチン（＃４９７０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を内部ローディング対照として使用した。二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にリンクした抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧを使用した（＃７０７４、＃７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。ブロットシグナルを、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ Ｑｕａｎｔｕｍ、またはＳｉｒｉｕｓ ＨＲＰ基質（Ａｄｖａｎｓｔａ社）を使用して検出し、ＣｈｅｍｏＣａｍ Ｉｍａｇｅｒ３．２．０（Ｉｎｔａｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ社）を使用して画像化し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用して数値化した。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析で使用されるすべての抗体を表３にリスト化する。死細胞を除去する場合、Ｔｒｕｅ Ｓｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）と共に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）、またはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を製造業者の指示に従い使用した。すべての蛍光色素コンジュゲート抗体について、力価測定実験を使用して最適濃度を決定した。表面抗原染色するために、細胞を、ＦＡＣＳバッファー内で希釈した各抗体と共に、４℃で２０分間インキュベートした。次に、細胞を、製造業者の指示に従い、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。マウスＢｃｌ－２分析では、細胞を、事前加温した３．７％のホルマリン（１容）およびＦＡＣＳバッファー（１容）を用いて固定し、次にＢｃｌ－２抗体を添加する前に９０％メタノール内で３０分間インキュベートした。細胞内サイトカイン染色を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ドイツ）またはＦｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して、製造業者の指示に従い実施した。マウスＩＦＮ－γの細胞内サイトカイン染色では、染色前に、ＰＭＡおよびイオノマイシンを含有するＣｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツ）の希釈物を用いて、製造業者の指示に従い、細胞を４時間再刺激した。データを、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ドイツ）上で取得し、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェア、バージョン１０．４（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社、米国）を使用して分析した。高次元分析の場合、データを、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ（Ｃｙｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で取得し、シングレットおよび死細胞を除外し、およびＣＤ４５陽性細胞を選択するために、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェア、バージョン１０．４（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社、米国）を使用して事前処理した。

スペクトル型フローサイトメトリーデータのアルゴリズムガイド式高次元分析
Ｒ環境において高次元分析を実施した。ｕｍａｐパッケージを使用して２次元ＵＭＡＰ（一様多様体の近似と投影（Uniform Manifold Approximation and Projections））を生成し、ＦｌｏｗＳＯＭに基づくメタクラスタリングをＢｒｕｍｅｌｍａｎらの記載に従い実施した（２５）。

殺傷アッセイ法
ＯＣＩ－ＡＭＬ３標的細胞を、２０％のＦＣＳ補充ＲＭＰＩ培地内、１μＭのＲＧ－７１１２の存在下または不存在下で７２時間培養し、０．５ｍＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ＢＶ４２１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ドイツ）を用いて製造業者の指示に従い標識し、１０：１、５：１、２：１、および１：１のエフェクター対標的比において９６ウェルプレート内でエフェクターＴ細胞と共に１６時間同時培養した。エフェクターＴ細胞の細胞傷害性を、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を使用して測定した。

組換えｈＴＲＡＩＬ（（ＴＮＦＳＦ１０、Ａｐｏ－２Ｌ、ＣＤ２５３；）ＳＵＰＥＲＫＩＬＬＥＲＴＲＡＩＬ（登録商標）；ＥＮＺＯ）を使用する殺傷アッセイでは、リガンドを、ＯＣＩ－ＡＭＬ３標的細胞に対して、最適殺傷条件の場合０．５μｇ／ｍｌ（１：１０００）、および限定的殺傷条件の場合０．２５μｇ／ｍｌ（１：２０００）で２４時間添加した。細胞の生存率を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により評価した。データをＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で取得し、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェア、バージョン１０．４（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を使用して分析した。

クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰアッセイ法）
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を２μＭのＲＧ－７１１２を用いて１２時間処置し、１％のホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間架橋し、最終濃度１２５ｍＭまでグリシンを添加することによりホルムアルデヒドを不活性化した。溶解バッファー（１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス－Ｃｌ、ｐＨ８．０、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて細胞を再懸濁し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒにおいて高出力での３０秒オン／オフプログラムを使用しながら１５分間超音波処理した。１６，０００ｇで５分間遠心分離した後、上清を収集し、希釈バッファー（２０ｍＭのトリス－Ｃｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて１０倍希釈した。調製済みのクロマチン抽出物を、マウスＩｇＧ（ｓｃ－２０２５、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）または抗ｐ５３抗体（ｓｃ－１２６、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と共に、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ビーズを使用しながら、免疫複合体を、ローテーター上、４℃で２時間収集し、洗浄バッファー（２０ｍＭのトリス－Ｃｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のＮＰ－４０、０．５ＭのＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて５回、ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス－Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて４回洗浄した。ＤＮＡを、溶出バッファー（１００ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１％のＳＤＳ）内、６５℃で６時間溶出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した。定量的ＰＣＲを、結合したＤＮＡの富化を測定するのに使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、スイス）を使用しながら、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ社、スイス）内で実施した。プライマー配列を表２に提示する。

各プライマー対に対するＣｈＩＰ－ｑＰＣＲデータを、免疫沈降物内の各特異的ＤＮＡ断片の分量を、インプットＤＮＡ内の当該断片の数量と比較して計算することにより、インプット率（％）として表す。

腫瘍細胞系統
ヒト白血病細胞系ＯＣＩ－ＡＭＬ３、ＭＯＬＭ－１３、マウス白血病細胞系ＷＥＨＩ－３Ｂ、および非悪性３２Ｄ細胞を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア、米国）から購入し、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ培地内で培養した。

リコール免疫実験
ＧｖＬリコール免疫実験では、アロＨＣＴ後の１２日目に、脾臓細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭＴレシピエントから採取した（ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭ、５百万個、およびＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ／ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞、５，０００個（ｄ０）、同種異系Ｔ細胞、３００，０００個（ｄ２））。ドナーＨ－２ｋｂ^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＦＡＣＳソーティングを次に実施した。細胞純度は、フローサイトメトリーにより評価した場合、少なくとも９０％であった。ＢＡＬＢ／ｃ ＢＭ、５百万個、およびＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ／ ＦＬＴ３－ＩＴＤ}細胞、５，０００個を注射した（ｄ０）後の２日目に、ソート済みの細胞、１００，０００個をｉ．ｖ．で二次レシピエントに移植した。

マウス骨髄内ＮＫ細胞の枯渇
ＮＫ細胞を枯渇させるために、ナイーブＢＡＬＢ／ｃ ＢＭを単離し、ＣＤ３およびＮＫ１．１表面について染色した。ＦＡＣＳソーティングを通じて、ＢＭからＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－細胞を除去し、ＢＭ内ＮＫ細胞の枯渇を引き起こした。

マウス骨髄内ＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の枯渇
ＣＤ８^＋Ｔ細胞を枯渇させるために、抽出されたＢＭをＣＤ３およびＣＤ８表面マーカーについて染色した。この場合、ＦＡＣＳソーティングを通じてＢＭからＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞が除去され、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が枯渇したＢＭが生成する。

ＧＶＨＤ組織学スコアリング
ＧＶＨＤスコアリングをこれまでに記載されたように実施した（２８）。小腸、大腸、および肝臓の各臓器を単離し、組織切片をＨ＆Ｅ染色し、処置群に対して盲検化された病理学者により評価した。

細胞外フラックスアッセイ
細胞外フラックスアッセイを、Ｓｅａｈｏｒｓｅアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）上で、製造業者の勧告に従い実施した。要するに、Ｔ細胞、２００，０００個を、２ｍＭのグルタミンが補充されたＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉｕｍを含む９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅの各ウェルに播種した。細胞培養物プレートを、次に３７℃非ＣＯ_２インキュベーター内で４５分間インキュベートした。センサーカートリッジポートに、グルコース、オリゴマイシン、および２－デオキシグルコース（２－ＤＧ）を負荷した。糖分解ストレステストを、基底細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の測定と、それに後続するグルコース（最終濃度１０ｍＭ）、オリゴマイシン（最終濃度１μＭ）、および２－ＤＧ（最終濃度５０ｍＭ）の連続注射により実施した。

一般的発癌突然変異または遺伝子融合を有する一次マウスＢＭ細胞のトランスフェクション
ＥＶ－ｔｇ、ＦＬＴ３－ＩＴＤ－ｔｇ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ－ｔｇ、ｃＫＩＴＤ８１６Ｖ－ｔｇ、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ－ｔｇ、ＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲα－ｔｇ、ＢＣＲａｂｌ－ｔｇ、ｃＭＹＣ－ｔｇ ＢＭ細胞を生成するために、骨髄採取の４日前に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００ｍｇ／ｋｇの５－フルオロウラシル（Ｍｅｄａｃ ＧｍｂＨ社）を注射した。マウス骨髄を収集し、本発明者らのこれまでの記載に従い（５、２９）、増殖因子（１０ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ－３、１０ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ－６、および１４．３ｎｇ／ｍＬのｍＳＣＦ）を用いてオーバーナイトで事前刺激した。増殖因子および４μｇ／ｍＬのポリブレンが補充されたレトロウイルス上清（２ｍＬ）を添加することによる、１２時間毎の３ラウンドのスピン感染（２４００ｒｐｍ、９０分、３２℃）によって、細胞に形質導入した。

マススペクトロメトリーのためのサンプル調製
アロＨＣＴ後の１２日目に、レシピエントマウスの脾臓からＣＤ８^＋Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、細胞２，０００，０００個／ｍｌの細胞密度で、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ社）、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ－２、および５５μＭのβ－メルカプトエタノールが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地内、３７℃で９０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を、上記のように補充され、１０ｍＭのＵ－^１３Ｃ－グルコースが添加された、グルコースを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。Ｕ－^１３Ｃ－グルコースによる標識を５０分実施した。１サンプル当たり細胞１百万個を採取し、５００ｇで５分間の遠心分離により細胞培養培地から分離した。４℃において、細胞を５００μｌのＰＢＳで洗浄し、それに４℃、５００ｇでの別の遠心分離ステップが５分間後続した。上清を完全に除去した後、ドライアイス上で３０分間事前冷却した５０μｌのメタノール：アセトニトリル：水（５０：３０：２０）バッファー内で細胞ペレットを再懸濁することによって代謝物を抽出した。サンプルを短時間ボルッテックス処理し、－８０℃で保管した。

液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ）
ＬＣ－ＭＳは、陰イオンモードで作動するＢｒｕｋｅｒ Ｉｍｐａｃｔ ＩＩ ＱＴＯＦ－ＭＳと直列で配置するＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣを使用して実施した。スキャン範囲は２０～１０５０Ｄａであった。質量校正を各測定の冒頭で実施した。ＬＣ分離は、９５％バッファーＢ（９０：１０ アセトニトリル：バッファーＡ）～２０％バッファーＡ（２０ｍＭの炭酸アンモニウム＋５μＭのメドロン酸水溶液）からなる溶媒グラジエントを使用しながら、Ｈｉｌｉｃｏｎ ｉＨＩＬＩＣ（Ｐ）クラシックカラム（１００×２．１ｍｍ、５μｍ粒子）上で行った。流速は１５０μＬ／分であった。オートサンプラー温度は５度であり、また注射容積は２μＬであった。代謝物の絶対存在量について目標を定めた分析を行うためのデータ処理を、ＴＡＳＱソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用して実施した。各代謝物に対応するピーク面積をマニュアルピーク積分により決定した。８０％超のサンプルで検出された代謝物ピークのみをさらに分析した。該当する代謝物について全サンプルにおいて検出された最低値を設定し、その５０％として欠損値を計算した。統計比較をスチューデントの対応のない両側t検定を使用して実施した。ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ５．０（３０）を使用して以下のようにヒートマップを生成した：ピーク面積値に対数変換およびオートスケーリングを施した；ユークリッド距離上でＷａｒｄ凝集法と共に階層的クラスタリングを使用して代謝物をクラスター化した。天然同位体存在量に関する補正を含む、^１３Ｃ－グルコース追跡のためのデータ処理をこれまでに記載されたように実施した（３１、３２）。

統計分析
マウスＧＶＬ生存実験における標本サイズでは、検出力分析を実施した。０．０５の統計的有意性に到達し、少なくとも１．０６の効果量が検出される８０％の検出力によって、標本サイズを１群当たり少なくともｎ＝１０と決定した。動物生存率（カプラン・マイヤー生存曲線）における差異を、マンテル・コックス検定により分析した。実験を非盲検化方式で実施した。統計分析では対応のないｔ検定（両側）を適用した。データを平均およびＳＥＭとして提示する。（エラーバー）。ｐ値が０．０１未満であったときに、差異を有意とみなした。

実施例の表

実施例の結果
ＭＤＭ２阻害は同種異系Ｔ細胞媒介式の細胞傷害性に対してマウスおよびヒトＡＭＬ細胞の脆弱性を増加させる
ＭＤＭ２阻害が同種異系免疫応答と相乗的であるという仮説をテストするために、骨髄（ＢＭ）単独またはＴ細胞と組み合わせて使用するアロＨＣＴでマウスを処置した。骨髄単球性白血病細胞（ＷＥＨＩ－３Ｂ）を有するマウスにおいて、同種異系ＢＭ移植片にＴ細胞を加えることで生存率が改善した（図１ａ）。ドナーＴ細胞非存在下、ＭＤＭ２阻害剤を用いて白血病を有するマウスを処置した場合、生存率が改善したが、しかし長期的保護をもたらさなかった（図１ａ）。Ｔ細胞をＭＤＭ２阻害と組み合わせたときにのみ、マウスの大部分（＞８０％）が長期にわたり保護された（図１ａ）。匹敵する生存パターンが、ＡＭＬ^{ＭＬＬ－ＰＴＤ／ＦＬＴ３－ＩＴＤ}モデル（図１ｂ）、およびＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を使用するヒト化マウスモデル（図１ｃ）において認められた。Ｔ細胞／ＭＤＭ２阻害剤を組み合わせても、Ｔ細胞／媒体と比較して、急性ＧＶＨＤ重症度を増加させることはなかった（図５ａ～ｃ）。

同種異系Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞をＭＤＭ２阻害に曝露したとき、より高かった（図１ｄ）。一貫して、Ｔ細胞をＭＤＭ２阻害と組み合わせたとき、切断型カスパーゼ３は最も高かった（図１ｅ～ｆ）。

観察されたｉｎ ｖｉｖｏ相乗効果に関係する機構を理解するために、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞をＭＤＭ２阻害に曝露した。偏りのない遺伝子発現分析より、ＭＤＭ２阻害時の白血病細胞によるＴＲＡＩＬ－Ｒ１およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２の上方制御が明らかとなった（図１ｇ）。一貫して、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／ＴＲＡＩＬ－Ｒ２－タンパク質およびＴＲＡＩＬ－Ｒ１／ＴＲＡＩＬ－Ｒ２－ＲＮＡは、ヒトＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞をＭＤＭ２阻害したとき（図１ｈ～ｉ、図６ａ～ｊ）、およびマウスＷＥＨＩ－３Ｂ細胞をＭＤＭ２阻害したとき（ＲＧ７１１２、ＨＤＭ２０１）（図７ａ～ｈ）、またはＯＣＩ－ＡＭＬ細胞においてＭＤＭＸ阻害したとき（ＸＩ－００６）（図８ａ～ｃ）増加した。ＲＧ７１１２およびＨＤＭ２０１のいずれも、ＨＤＭ２結合を妨害することによりｐ５３分解を阻害する。ＭＤＭ２阻害後のＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現増加がｐ５３に依存するかテストするのにｐ５３－ノックダウンＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を使用したが、ｐ５３のドキソルビシン誘発はｐ５３－ノックダウン細胞において低下している（図９ａ）一方、ＭＤＭ２阻害はｐ５３野生型細胞においてｐ５３を誘発する（図９ｂ）ことが判明した。ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現は、天然ｐ５３を有する細胞においてＭＤＭ２阻害（ＲＧ７１１２またはＨＤＭ２０１）により増加したが、ｐ５３－ノックダウン細胞ではそうならなかった（図１ｊ～ｋ、図９ｃ～ｄ）。一貫して、ＴＲＡＩＬにより誘発されたアポトーシスは、ｐ５３^－／－ＡＭＬ細胞においてより低かった（図９ｅ）。クロマチン免疫沈降法より、ｐ５３はＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２プロモーターに結合することが明らかとなった（図１ｌ～ｍ）。

ＭＤＭ２阻害時のＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現増加はＧＶＬ効果に寄与する
ＡＭＬ細胞におけるＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現が、ＭＤＭ２阻害時のＧＶＬ効果増強にどの程度寄与するか判定するために、抗ＴＲＡＩＬ－リガンド遮断抗体を用いてマウスを処置した。これはアロＴ細胞／ＭＤＭ２阻害の保護効果を低下させる（図２ａ）。興味深いことに、ＴＲＡＩＬリガンド欠損Ｔ細胞（Ｔｎｆｓｆ１０^{ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉ}／ＭｂｐＭｍｕｃｄ）を移入した場合でも、ＭＤＭ２阻害の保護効果を低下させた（図２ｂ）。さらに、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２をｉｎ ｖｉｔｒｏで遮断すると、ＭＤＭ２阻害に曝露した白血病細胞に対する同種異系Ｔ細胞の細胞傷害性が低下した（図２ｃ～ｅ）。ＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－ノックアウトＡＭＬ細胞（図１０ａ～ｃ）は、アロＴ細胞／ＭＤＭ２阻害効果に対してそれほど感受性ではなかった（図２ｆ）。ＴＲＡＩＬ＋ＭＤＭ２阻害の治療的相乗効果がＷＴ－ＡＭＬに認められたが、しかしＴＲＡＩＬ－Ｒ２^－／－ＡＭＬ細胞には認められなかった（図２ｇ）。ＭＤＭ２阻害剤処置マウスから単離したＴ細胞は、細胞外フラックスアッセイ法により測定される糖分解活性についてより高い活性を示した（図２ｈ－ｉ）。糖分解フラックスの増加は、Ｕ－^１３Ｃ－グルコースのいくつかの糖分解中間体への取り込み上昇により確認された（図２ｊ）。それに加えて、特にピリミジン生合成経路のヌクレオチドおよびその前駆体が、ＭＤＭ２阻害剤処置マウスから単離されたＴ細胞内で濃縮していた（図１１ａ～ｃ）。糖分解フラックスおよびヌクレオチド生合成の増加はＴ細胞のより強い活性化を示唆し、より高いＧＶＬ活性に対応する（６）。

ＭＤＭ２阻害はドナーＴ細胞の細胞傷害性および寿命を促進する
媒体単独投与を受けたレシピエントと比較して、ＭＤＭ２阻害剤の投与を受けたアロＨＣＴレシピエントにおいて、抗腫瘍細胞傷害性マーカーであるパーフォリンおよびＣＤ１０７ａ、ならびにＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＣＤ６９について、ドナーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の全体的な増加を引き起こすことなくより高い発現を示した（図３ａ～ｈ、図１２ａ、図１３ａ～ｂ）。ナイーブマウスＣＤ１０７ａにおいて、ＭＤＭ２阻害時にＴＮＦおよびＣＤ６９が増加した（図１４ａ～ｄ）。ＮＫ細胞ではなくＣＤ８^＋Ｔ細胞が枯渇すると（図１５ａ～ｂ）、保護性のＭＤＭ２阻害効果の喪失が引き起こされ（図３ｉ）、抗白血病効果にはＣＤ８^＋Ｔ細胞が関与していることが示唆される。リコール免疫がＭＤＭ２阻害剤処置の下で発現するか理解するために、媒体またはＭＤＭ２阻害剤を用いて処置した白血病を有するマウスからドナータイプのＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離した（図１６ａ）。ＭＤＭ２阻害剤処置された白血病を有するマウスに由来するＴ細胞は、二次白血病を有するマウスにおいて白血病の対照改善を引き起こし（図３ｊ）、抗白血病リコール応答が示唆された。ＣＤ２７を欠くエフェクターＴ細胞は高い抗原リコール応答を示し（１２）、またＭＤＭ２阻害剤処置レシピエントにおいてＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋ＴＩＭ３^＋ドナーＴ細胞の頻度低下が観測された（図３ｋ～ｍ、図１７）。ＭＤＭ２阻害剤処置マウス内のＴ細胞は、高Ｂｃｌ－２およびＩＬ－７Ｒ（ＣＤ１２７）を含む寿命の特徴（１３）を示した（図１８ａ～ｄ）。

一次ヒトＡＭＬ細胞におけるＭＤＭ２阻害はＴＲＡＩＬ－１／２発現を引き起こす
マウスモデルから得られた本発明者らの知見をヒト細胞において妥当性確認するために、一次ヒトＡＭＬ細胞に対するＭＤＭ２阻害の効果について試験した。ＭＤＭ２阻害はｐ５３のレベルを増加させ（図１９ａ～ｄ）、オンターゲット活性を示唆した。ＭＤＭ２阻害はＴＲＡＩＬ－Ｒ１およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２のＲＮＡ（図４ａ～ｄ）およびタンパク質のレベルも増加させた（図２０ａ～ｅ）。ＭＤＭ２阻害と同種異系Ｔ細胞とを組み合わせることで、免疫不全マウスにおいて一次ヒトＡＭＬ細胞の除去が強化された（図４ｅ）。ＡＭＬ細胞は、ＭＤＭ２阻害時にＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現増加を示した（図２１ａ、図２２ａ～ｃ）。ヒトｐ５３^－／－ＡＭＬ細胞は、ＭＤＭ２阻害剤／アロＴ細胞の組合せに対して耐性であったことから、相乗効果は天然ｐ５３に依存した（図４ｆ、図２３ａ）。ＭＤＭ２阻害剤／アロＴ細胞の組合せは、ヒトＡＭＬ細胞において、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２下流経路（カスパーゼ８、カスパーゼ３、ＰＡＲＰ）の活性化を引き起こした（図４ｇ）。

ＭＤＭ２発現を活性化させる発癌突然変異はＴ細胞／ＭＤＭ２阻害剤の組合せに対する感受性増加をもたらす
Ｔ細胞／ＭＤＭ２阻害剤の組合せに対して特に感受性であり得るＡＭＬサブタイプを特定するために、複数の一般的な発癌突然変異または遺伝子融合（ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｄ、ｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ、ＪＡＫ２－Ｖ６１７Ｆ、ＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－α、ＢＣＲ－ＡＢＬ、およびｃ－ｍｙｃ）を、そのＭＤＭ２に対する影響について試験した。表示の発癌ベクターが導入されたシンジェニックＢＭの移植を受けたマウスは、脾腫およびＧＦＰ^＋トランスジェニック細胞を含むＢＭ浸潤を発症した（図２４ａ～ｃ）。ｃＫＩＴ－Ｄ８１６ＶおよびＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－αは、ＭＤＭ２およびＭＤＭ４を誘発した（図２４ｄ～ｇ）。興味深いことに、アロＢＭＴ後のアロＴ細胞／ＭＤＭ２阻害剤の組合せは、ＦＩＰ１Ｌ－ＰＤＧＦＲ－α突然変異体およびｃＫＩＴ－Ｄ８１６Ｖ突然変異体ＡＭＬを有するマウスにおいて極めて有効であった（図２４ｈ～ｉ）。

ＭＤＭ２阻害は、ＡＭＬ細胞上でのＭＨＣクラスＩ／ＩＩ発現をｐ５３に依存する方式で増加させる
ＭＨＣ遺伝子の下方制御およびミスマッチＨＬＡの喪失は、アロＨＣＴ後のＡＭＬ再発を引き起こすことが明らかにさているので（２、４）、ＭＤＭ２阻害がＡＭＬ細胞上のＭＨＣ分子を上方制御し、これにより同種異系Ｔ細胞によるその認識を強化し得るかテストした。

遺伝子発現分析より、ＭＤＭ２阻害時のＨＬＡクラスＩおよびＩＩの上方制御が明らかとなった（図２５ａ）。タンパク質レベルにおいて、ＭＤＭ２阻害は、白血病細胞上でのＨＬＡ－ＣおよびＨＬＡ－ＤＲ発現を増加させた（図４ｈ～ｋ、図２５ｂ～ｃ）。ＨＬＡ－ＤＲ下方制御はアロＨＣＴ後のＡＭＬ再発と関連することが明らかにされたので、ＨＬＡ－ＤＲを選択した（２）。ｐ５３依存性の制御と整合して、ｐ５３－ノックダウンＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞においてＭＤＭ２阻害を行っても、ＨＬＡ－ＣおよびＨＬＡ－ＤＲは増加しなかった（図４ｌ～ｍ）。ｐ５３活性を増加させるアプローチとして、ＭＤＭＸ阻害（ＸＩ－００６）（１４）もＨＬＡ－ＣおよびＨＬＡ－ＤＲを増加させた（図２５ｄ，ｅ）。ＭＤＭ２阻害は、一次ヒトＡＭＬ細胞上（図４ｎ～ｏ）およびＡＭＬ細胞系においてＭＨＣ－ＩＩ発現増加を引き起こしたが、しかし非悪性細胞には当て嵌まらない（図２６ａ～ｌ）。これらの知見は、ＭＤＭ２誘発型のｐ５３下方制御を標的とすることで、マウスおよびヒトにおいて、ＭＨＣ－ＩＩおよびＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２上方制御を介してアロＨＣＴ後の抗白血病免疫が強化されることを示唆する（図２７）。

実施例の考察
ＡＭＬ再発は免疫逃避機構により引き起こされる（９）。本発明者らの最近の研究では、ＡＭＬ細胞は免疫逃避機構として乳酸を生成し、これによりＴ細胞の代謝およびエフェクター機能を妨げることを明らかにした（６）。再発をもたらす第２の機構は、ＩＬ－１５産生をブロックするＦＬＴ３－ＩＴＤ発癌シグナル伝達を経由し、ＡＭＬの免疫原性低下を引き起こす（５）。この試験では、ドナーＴ細胞のアロ反応性を、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２およびＭＨＣ－ＩＩの下方制御を逆転させる薬理学的アプローチと組み合わせるという再発処置の新規概念についてテストした。

本発明者らは、ＭＤＭ２阻害は一次ヒトＡＭＬ細胞およびＡＭＬ細胞系においてＴＲＡＩＬ－Ｒ１／２発現を誘発することを見出した。ＴＲＡＩＬがライゲートすると、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体は、その細胞内細胞死ドメインにおいて、ＦＡＳ関連タンパク質から構成される細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を細胞死ドメイン（ＦＡＤＤ）およびプロカスパーゼ８／１０と会合させる（１５）。ＴＲＡＩＬ－Ｒの活性化は抗腫瘍活性を有することが明らかにされた（１６）。さらに、ＭＤＭ２阻害は一次ヒトＡＭＬ細胞おいてＭＨＣ－ＩＩ発現も増加させた（アロＨＣＴ後のヒトＡＭＬ再発において観察されたＭＨＣ－ＩＩ減少を逆転させる薬理学的介入のための介入点を提供し得る）（２、３）。

白血病再発は、アロＨＣＴを施された患者死亡の５７％を占めるので、本発明者らの観察は臨床的に極めて重要である（１、１７）。この観察の背後にある免疫学的機構についても明確にし、これによりＭＤＭ２阻害およびＴ細胞を使用してＡＭＬ再発を処置するための科学的根拠（第Ｉ／ＩＩ相臨床試験をもたらす）を提供する。

参照

Claims (19)

1. 患者における造血細胞移植（ＨＣＴ）後の血液新生物再発の処置および／または予防で使用するためのマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤。
2. 前記血液新生物が、白血病、リンパ腫、および骨髄異形成症候群を含む群から選択される、請求項１に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
3. 前記血液新生物が、白血病、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１または２に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
4. 前記ＨＣＴが同種異系ＨＣＴである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
5. 前記ＨＣＴがＴ細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
6. ＨＣＴの後かつ再発発生の前に患者に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
7. ＨＣＴ後の再発発生後に白血病患者に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
8. ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８）、ＡＭＧ－２３２（ＫＲＴ－２３２）、ＡＰＧ－１１５、ＢＩ－９０７８２８、ＣＧＭ０９７、シレマドリン（ＨＤＭ－２０１）、およびミラデメタン（ＤＳ－３０３２ｂ）、ならびに薬学的に許容されるその塩を含む群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
9. シレマドリン（ＨＤＭ－２０１）または薬学的に許容されるその塩である、請求項８に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
10. 前記ＭＤＭ２阻害剤の投与が、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、およびＨＬＡクラスＩＩ分子のうちの１つまたは複数の上方制御を引き起こす、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
11. 前記処置が、ＨＣＴと同時および／またはＨＣＴ後に同種異系Ｔ細胞移植の投与をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
12. 前記同種異系Ｔ細胞移植が、リンパ球を含むが、しかし造血幹細胞を含まないドナーリンパ球輸注である、請求項１１に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
13. 前記同種異系Ｔ細胞移植のドナーが、前記ＨＣＴのドナーでもあった、請求項１１または請求項１２に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
14. 前記ＨＣＴの後、かつ前記同種異系Ｔ細胞移植の投与前、および／またはそれと同一日、および／またはその後に投与される、請求項１１から１３に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
15. 前記ＭＤＭ２阻害剤の投与が、がん細胞に対するＣＤ８＋アロＴ細胞の細胞傷害性を増加させ、好ましくはＣＤ８＋アロＴ細胞の細胞傷害性が、前記がん細胞のＴＲＡＩＬ－Ｒと前記ＣＤ８＋アロＴ細胞のＴＲＡＩＬリガンド（ＴＲＡＩＬ－Ｌ）との相互作用に少なくとも部分的に依存する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
16. 前記ＭＤＭ２阻害剤の投与が、移植片対白血病または移植片対リンパ腫反応を増加させ、好ましくは前記移植片対白血病反応または前記移植片対リンパ腫反応が、ＣＤ８＋アロＴ細胞により媒介される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
17. 前記ＭＤＭ２阻害剤の投与が、ＣＤ８＋アロＴ細胞によるパーフォリン、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＣＤ６９のうちの１つまたは複数の発現を増加させる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
18. 前記処置がエキスポーチン－１（ＸＰＯ－１）阻害剤の投与をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用するためのＭＤＭ２阻害剤。
19. 患者における血液新生物の処置および／または予防で使用するためのＸＰＯ－１阻害剤であって、前記処置が造血細胞移植およびＭＤＭ２阻害剤の投与をさらに含む、ＸＰＯ－１阻害剤。