JP4320381B2 - 抗cd80抗体を発現する細胞 - Google Patents
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Description
首尾よい免疫応答の精巧さは、T細胞と抗原提示細胞との間の一連の特異的な相互作用に依存する。このプロセスにおける最初の必須のステップはMHCクラスII分子との関連での抗原のT細胞受容体への結合に依存するが[非特許文献14]、この相互作用だけでは所定の抗原に対する継続した応答に必要なすべての事象を引き起こすのに充分ではない[非特許文献15;非特許文献16;非特許文献17;非特許文献18;非特許文献19;非特許文献9]。
B7/CD28相互作用の阻止は特異的な免疫抑制の可能性を与え、長期間持続する抗原特異的な治療効果が得られる可能性がある。この相互作用を一時的に妨害する抗体または薬剤は、長期間の抗原特異的な治療効果を生成する効力を有する有用で特異的で安全な臨床免疫抑制剤となり得る。
今日まで、B7.1およびB7.2の両者に交差反応するモノクローナル抗体は報告されていない。さらに、B7.1またはB7.2に特異的で受容体CD28結合を同時に活性化することに限定された抗原上の特定の部位を認識するモノクローナル抗体は報告されていない。または、B7.1またはB7.2に特異的でCTLA−4受容体結合に限定された抗原上の特定の部位を認識するモノクローナル抗体は報告されていない。記載したように、かかる抗体は免疫抑制剤として非常に望ましいものである。
組換え抗体を生成するための他の非常に効率的な手段がニューマン(Newman)によって開示されている[非特許文献51]。さらに詳しくは、この技術によりサル可変ドメインおよびヒト定常配列を含む霊長類化抗体を得ることができる。上記文献を参照のためその全体を本明細書中に引用する。さらに、この技術はまた、本願と同一の出願人である1995年1月25日に出願した米国特許出願第08/379,072号(これは1992年7月10日に出願した米国特許出願第07/912,292号(これは1992年3月23日に出願した米国特許出願第07/856,281号(これは1991年7月25日に出願した米国特許出願第07/735,064号の一部継続出願である)の一部継続出願である)の継続出願である)にも記載されている。米国特許出願第08/379,072号およびその親出願を参照のためその全体を本明細書中に引用する。
本発明を一層明確に理解できるように下記術語を定義する。
枯渇(Depleting)抗体 活性化B細胞または他の抗原提示細胞を殺す抗体。
非枯渇(Non−depleting)抗体 B7とT細胞活性化リガンドCD28およびCTLA−4とのコスティミュラトリー作用を阻止する抗体。それゆえ、この抗体は免疫性を減少させる(anergizes)が抗原提示細胞を排除はしない。
1.スキャッチャード分析は、B7−Igコーティングプレートへ結合するサル抗体のみかけの親和性定数(Kd)がおよそ以下のとおりであることを示した:
a:7C10: 6.2×10−9M
b:16C10: 8.1×10−9M
c:7B6: 10.7×10−9M
d:20C9: 10.8×10−9M
a:7B6: 5.0μg/M
b:16C10: <0.1μg/M
c:20C9: 2.0μg/M
d:7C10: 5.0μg/M
4.サル抗体16C10、7B6、7C10および20C9をFACS分析によりC1q結合について試験した。その結果は、B7.1 CHOトランスフェクション細胞とともにインキュベートした後に7C10サルIgが強いヒトC1q結合を有することを示した。16C10は陽性であったが、20C9および7B6サル抗体は陰性であった。
5.病理−毒性(path-tox)研究のための動物モデルを選択するため、異なる種からの動物血でサル抗体を試験した。サル抗B7.1抗体は、ヒト、チンパンジーと交差反応した。
本発明の抗体またはそのフラグメントは単独でも投与することが可能であるが、医薬製剤として投与することが好ましい。活性成分は、局所投与の場合、医薬製剤の0.001〜10%w/w、たとえば1重量%〜2重量%を構成してよいが、10%w/wを構成してもよく、好ましくは医薬製剤の5%w/wを越えない量、さらに好ましくは0.1〜1%w/wである。
カプセル剤の形態の本発明の医薬組成物は、標準的な2片(two-piece)ハードゼラチンカプセルに粉末形態の本発明の抗体またはそのフラグメント(50mg)、乳糖(100mg)、タルク(32mg)およびステアリン酸マグネシウム(8mg)を充填することにより調製する。
注射により投与するのに適した形態の本発明の医薬組成物は、本発明の抗体またはそのフラグメント(1.5重量%)を10容量%のプロピレングリコールおよび水の中で撹拌することにより調製する。この溶液を濾過滅菌する。
本発明の抗体またはそのフラグメントを1.0g
白色軟パラフィンを100.0gまで。
本発明の抗体またはそのフラグメントを少量のビヒクル中に分散させて滑らかな均一な生成物を得る。ついで、この分散液を折り畳み式金属チューブに充填する。
本発明の抗体またはそのフラグメントを1.0g
ポラワックスGP200を20.0g
無水ラノリンを2.0g
白色蜜蝋を2.5g
ヒドロキシ安息香酸メチルを0.1g
蒸留水を100.0gまで。
ポラワックス、蜜蝋およびラノリンをいっしょに60℃で加熱する。ヒドロキシ安息香酸メチルの溶液を加え、高速で撹拌して均一な溶液とする。ついで、温度を50℃まで下げる。ついで、本発明の抗体またはそのフラグメントを加え、充分に分散させ、ゆっくりとした速度で撹拌して組成物を冷却する。
本発明の抗体またはそのフラグメントを1.0g
ソルビタンモノラウレートを0.6g
ポリソルベート20を0.6g
セトステアリルアルコールを1.2g
グリセリンを6.0g
ヒドロキシ安息香酸メチルを0.2g
精製水B.P.を100−00ml(B.P.=英国薬局方)。
ヒドロキシ安息香酸メチルおよびグリセリンを75℃の水(70ml)中に溶解する。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート20およびセトステアリルアルコールをいっしょに75℃で溶融し、上記水溶液に加える。得られた乳濁液をホモジナイズし、連続攪拌しながら冷却させ、本発明の抗体またはそのフラグメントを残りの水中の懸濁液として加える。全懸濁液をホモジナイズされるまで攪拌する。
本発明の抗体またはそのフラグメントを0.5g
ヒドロキシ安息香酸メチルを0.01g
ヒドロキシ安息香酸プロピルを0.04g
精製水B.P.を100−00ml
ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルを70mlの精製水中に75℃にて溶解し、得られた溶液を冷却した。ついで、本発明の抗体またはそのフラグメントを加え、溶液をメンブランフィルター(0.022μmの孔径)で濾過して滅菌し、適当な滅菌容器中に滅菌充填する。
15〜20ml容のエアロゾル容器用:
10mgの本発明の抗体またはそのフラグメントを0.2〜0.5%の滑沢剤、たとえばポリソルベート85またはオレイン酸と混合し、ついで該混合物を好ましくは(1,2ジクロロテトラフルオロエタン)とジフルオロクロロメタンとの組み合わせ中でフレオン等のプロペラント中に分散させ、鼻内かまたは口内投与のいずれかに適合させた適当なエアロゾル容器中に入れる。
15〜20ml容のエアロゾル容器用:
本発明の抗体またはそのフラグメント(10mg)をエタノール(6〜8ml)中に溶解し、ポリソルベート85またはオレイン酸などの滑沢剤(0.1〜0.2%)を加え、このものをフレオン(好ましくは(1,2ジクロロテトラフルオロエタン)とジフルオロクロロメタンとの組み合わせ)などのプロペラント中に分散し、鼻内かまたは経口吸入投与に適合させた適当なエアロゾル容器中に入れる。
本発明者らは、サルの免疫、インビトロでの結合および機能アッセイの開発、ヘテロハイブリドーマのスクリーニングおよびファージライブラリーのえり分けの目的のために多くの試薬を作成した。表1には各試薬とその意図する目的を掲げてある。B7.1の場合には、RNAをSB細胞から抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAに変換した。第一鎖のcDNAをB7.1特異的プライマーを用いてPCR増幅し、IDECのNEOSPLA哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。このB7.1 NEOSPLA DNAでCHO細胞をトランスフェクションし、膜結合B7.1を発現するクローンを同定した。B7.1融合タンパク質も同様にして生成したが、ヒトCH2およびCH3免疫グロブリン遺伝子を含むNEOSPLAカセットベクター中にPCR増幅B7.1遺伝子をクローニングした。このB7.1/Ig NEOSPLA DNAでCHO細胞を形質転換し、B7.1/Ig融合タンパク質を分泌する安定なクローンを増幅した。一般に、B7.2およびCTLA−4試薬も同様にして生成したが、B7.2ではRNAを抗IgおよびIL−4で24時間刺激したヒト脾臓細胞から単離し、CTLA4構築物については遺伝子の採取源はPHA活性化したヒトT細胞であった。
試薬 目的 CHO発現
可溶性B7.1 免疫、イムノアッセイ 有
B7.1トランスフェクタント スクリーニング、ELISA 有
B7.1/Ig融合タンパク質 抑制試験、えり分け 有
B7.2トランスフェクタント スクリーニング、ELISA 有
B7.2/Ig融合タンパク質 抑制試験、えり分け 未完
CTLA4トランスフェクタント 抑制試験 未完
CTLA4/Ig 抑制試験 未完
組換えファージ提示ライブラリーをB7.1およびB7.2免疫サルから作成する。免疫の7〜12日後にリンパ節および骨髄生検を採取し、RNAに富むB細胞および形質細胞を回収する。チョンチンスキー(Chomczynski)により記載された方法[Anal.Biochem.、162(1)、156〜159(1987)]を用い、リンパ球からRNAを単離する。オリゴdTプライマーおよび逆転写酵素を用いてRNAをcDNAに変換する。第一鎖cDNAをアリコートに分け、以前に記載されたカッパ、ラムダ、および重鎖Fd領域のプライマーセット並びにPfuポリメラーゼ(ストラタジーン、サンジエゴ)かまたはTaqポリメラーゼ(プロメガ、マジソン)のいずれかを用い、PCR増幅する。重鎖PCR増幅生成物をプールし、Xho VSpeI制限酵素で切断し、ベクターpMS中にクローニングする。その後、軽鎖PCR生成物をクローニングし、SacI/XbaI制限酵素で切断し、クローニングして組換えライブラリーを作成する。XLI−Blue大腸菌を該ライブラリーDNAで形質転換し、VCSM13で重感染させて抗体を提示するファージを生成させる。このライブラリーを、B7.1抗原またはB7.2抗原をコーティングしたポリスチレンウエル上で4回えり分ける。各回のえり分けからの個々のファージクローンを分析する。pMSベクターDNAを単離し、遺伝子IIIを切り出す。可溶性のFabフラグメントが生成し、B7.1およびB7.2への結合についてELISAで試験する。
サルファージFabフラグメントを、その特異性、およびCTLA−4−IgまたはCTLA−4トランスフェクション細胞へのB7.1−IgおよびB7.2−Ig結合を阻止する能力について特徴付ける。ファージフラグメントはまた、高親和性のフラグメントを選択するため、免疫に使用したB7種上で4回行った最初のえり分け後の交差反応性について特徴付けを行う。B7.1抗原またはB7.2抗原のいずれかをコーティングした表面上で4回えり分けたものから同定したFabフラグメントを、大腸菌の24時間発酵培養液中での感染および増殖によりスケールアップする。フラグメントを、抗FLAGアフィニティーカラムへのコダックFLAG結合により精製する。精製したファージFabを、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗サルFab抗体または抗FLAG MAbを用いたELISAベースの直接結合改変スキャッチャード分析[カトー(Katoh)ら、J.Chem.BioEng.、76:451〜454(1993)]により親和性を試験する。抗サルFab試薬は、ヒト重鎖定常領域Igに対して吸着され、B7−Igへの交差反応性は除かれるであろう。B7.1−IgまたはB7.2−Igをコーティングしたプレートへの直接結合の測定の後、各フラグメントについてKd値を計算する。
最も低い濃度でB7−Igの結合を最も有効に阻止するFabフラグメントを先導候補として選択する。選択は、CTLA−4−IgまたはCTLA−4トランスフェクション細胞への125I−B7−Ig結合を競合し尽くすことにより行う。他の選択基準には、応答細胞での3H−チミジンの取り込みの抑制[アズマら、J.Exp.Med.、177:845〜850;アズマら、Nature、301:76〜79(1993)]およびIL−2アッセイキットを用いたIL−2産生の直接分析により測定されるように、混合リンパ球反応(MLR)の阻止が含まれる。MLRの抑制およびCTLA−4結合アッセイにおいて最も有効な3または4の候補が、CHO細胞へのトランスフェクションおよびキメラサル/ヒト抗体の発現のための上記哺乳動物発現ベクター中へクローニングするために選択される。
モノクローナル抗体を分泌するサルヘテロハイブリドーマを、その血清がB7.1および/またはB7.2に対して陽性と試験された生存(existing)免疫動物から作成する。いずれかまたは両方の抗原に対して陽性の動物からリンパ節生検を採取する。ハイブリドーマの産生方法は、サル抗CD4抗体の作成に使用する確立された方法[ニューマン、1992(上掲)]と同様である。高い血清力価を有するサルは、鼠蹊部のリンパ節の切片を麻酔下で取り除かれるであろう。組織からのリンパ球を洗浄し、ポリエチレングリコール(PEG)を用いてKH6/B5ヘテロハイブリドーマ細胞[キャロル(Carrol)ら、J.Immunol.Meth.、89:61〜72(1986)]と融合させる。ハイブリドーマをH.A.T.培地上で選択し、96ウエルプレート中で繰り返しサブクローニングすることにより安定化させる。
スキャッチャード分析は、B7−Igコーティングプレートへのサル抗体の結合の見かけの親和定数(Kd)がおよそ以下のとおりであることを示した:
a:7C10: 6.2×10−9M
b:16C10: 8.1×10−9M
c:7B6: 10.7×10−9M
d:20C9: 16.8×10−9M
a:7B6: 5.0μg/M1
b:16C10: 0.1μg/M1
c:20C9: 2.0μg/M1
d:7C10: 5.0μg/M1
サル抗体16C10、7B6、7C10および20C9をFACS分析によりC1q結合について試験した。その結果は、7C10サルIgがB7.1 CHOトランスフェクション細胞とともにインキュベートした後に強いヒトC1q結合を有することを示した。16C10もまた陽性であったが、20C9および7B6サル抗体は陰性であった。
ビオチン化CTLA−4Igを用いた競合結合アッセイにおいて(図6)、非標識霊長類化16C10(すなわち、P16C10)はB7.1トランスフェクションCHO細胞へのCTLA−4Ig結合を阻止することができなかった。非標識CTLA−4Igおよび非標識B7.1はこれら条件下で有効に競合することがわかる。
マウス抗体の結合部位がCTLA−4の結合部位と重複するか否かを決定するため、CTLA−4Igの存在下でのL307.4およびBB−1マウス抗体の結合を調べた。P16C10−ビオチン、L307.4−ビオチンおよびCTLA−4Ig−ビオチンを用いた競合アッセイ実験を行い、親和性の相違が競合結合の検出を妨害しないことを保証した。その結果を図8および図9に示す。
B7.1のP16C10結合がB7.1とCD28との相互作用を阻止し得るか否かを決定する実験を、B7.1Igを125Iで放射性標識し、ついでCD28陽性非活性化末梢血Tリンパ球への競合結合により行った。図10に示す結果は、非標識B7.1Igでの阻害により確認されるように、放射性標識B7.1IgがT細胞に特異的に結合することを示している。これら結果はまた、CTLA−4Ig、抗CD28およびP16C10がすべてこの相互作用を阻止し得ることをも示している。これら結果はさらに、P16C10がCD28/B7相互作用の結合を<1μg/mLのIC50にて阻止することを確認している。
同様の結果は、同実験でP16C10の代わりにP7C10を用いても得られた(データは示していない)。
Claims (17)
- ヒトCD80抗原に特異的に結合し、該CD80抗原のCD28への結合は阻害するが、該CD80抗原のCTLA−4への結合は阻害せず、下記よりなる群から選ばれるモノクローナル抗体を発現する細胞:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体7C10の軽鎖可変領域および配列番号4に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を有する抗体;
(b)配列番号10に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体16C10の軽鎖可変領域および配列番号12に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を有する抗体;および
(c)ヒトCD80抗原への結合に対して(a)または(b)の抗体と競合し、(a)または(b)の抗体によっても結合されるヒトCD80抗原のエピトープに結合する抗体。 - サルの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を発現する、請求項1に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体が、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体7C10の軽鎖可変領域および配列番号4に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体が、配列番号10に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体16C10の軽鎖可変領域および配列番号12に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体がヒト軽鎖定常領域および重鎖定常領域を含む、請求項1ないし4のいずれかに記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体が、ヒトガンマ1定常領域、ヒトガンマ4定常領域、およびヒトガンマ4PE定常領域よりなる群から選ばれるヒト重鎖定常領域を含む、請求項5に記載の細胞。
- ヒトCD80抗原に特異的に結合し、該CD80抗原のCD28への結合は阻害するが、該CD80抗原のCTLA−4への結合は阻害せず、下記よりなる群から選ばれるモノクローナル抗体のフラグメントを発現する細胞:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体7C10の軽鎖可変領域および配列番号4に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を有する抗体;
(b)配列番号10に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体16C10の軽鎖可変領域および配列番号12に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を有する抗体;および
(c)ヒトCD80抗原への結合に対して(a)または(b)の抗体と競合し、(a)または(b)の抗体によっても結合されるヒトCD80抗原のエピトープに結合する抗体。 - サルの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体のフラグメントを発現する、請求項7に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体が、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体7C10の軽鎖可変領域および配列番号4に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含む、請求項7に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体が、配列番号10に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体16C10の軽鎖可変領域および配列番号12に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含む、請求項7に記載の細胞。
- Fab、F(ab')2、およびFvよりなる群から選ばれるフラグメントを発現する、請求項7ないし10のいずれかに記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体またはフラグメントが、Tリンパ球によるIL−2の産生をインビトロで阻害する、請求項1ないし11のいずれかに記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体またはフラグメントが、少なくとも10μg/mlの濃度でTリンパ球によるIL−2産生を阻害する、請求項12に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体が、配列番号10に示すアミノ酸配列を有するサルモノクローナル抗体16C10の軽鎖可変領域および配列番号12に示すアミノ酸配列を有する該サルモノクローナル抗体の重鎖可変領域を有する抗体と同じCD80上のエピトープに結合する、請求項1に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体がヒト軽鎖定常領域および重鎖定常領域を含む、請求項14に記載の細胞。
- 該モノクローナル抗体がサルの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項15に記載の細胞。
- CHO細胞である、請求項1に記載の細胞。
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