JP2001504693A - ある種の抗体とヒトｂ７．１およびｂ７．２コスティミュラトリー抗原との間の独特の結合相互作用の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＢ７.１抗原（ＣＤ８０）に特異的であり、ＣＤ２８受容体へのＢ７.１の結合を阻害することができ、ＣＴＬＡ−４受容体へのＢ７.１の結合を阻害し得ない抗体の同定に関する。これら抗体のうちの２つの抗体、１６Ｃ１０および７Ｃ１０は、第二の活性化リガンドＢ７.２（ＣＤ８６）の存在にもかかわらず、ＩＬ−２の産生を有意に阻害する。ＣＴＬＡ−４とＢ７.１および／またはＢ７.２との相互作用が損なわれずまたは同時に進行しながら、これら抗体を用いてＣＤ２８とＢ７.１（ＣＤ８０）との間の第一活性化シグナルを阻止することは、正のコスティミュレーションに対するアンタゴニスト作用と負のシグナル伝達に対するアゴニスト作用との組み合わせを表す。これら抗体は、特異的な免疫抑制剤として、たとえば自己免疫疾患の治療のためおよび臓器移植拒絶を防ぐために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ある種の抗体とヒトＢ７.１およびＢ７.２コスティミュラトリー抗原との間の独 特の結合相互作用の同定 発明の技術分野 本発明は、ヒトＢ７.１抗原（ＣＤ８０）に特異的なモノクローナル抗体の同 定および使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトＢ７.１抗原のＣＤ２ ８受容体への結合は阻害し得るがＢ７.１のＣＴＬＡ−４受容体への結合は阻害 し得ないモノクローナル抗体またはその霊長類化（primatized）形態の同定およ び使用に関する。それゆえ、本発明は、ＣＴＬＡ−４受容体結合を排除するＢ７ .１抗原上の特定の部位を認識するモノクローナル抗体およびその霊長類化形態 の同定および使用に関する。 本発明はさらに、ヒトＢ７.１抗原上の特定の部位を認識し、ＩＬ−２産生を 阻害し得るモノクローナル抗体またはその霊長類化形態に関する。 本発明はまた、ヒトＢ７.１に特異的なモノクローナル抗体または霊長類化抗 体を含む医薬組成物並びにＢ７：ＣＤ２８経路を調節することによる、たとえば 自己免疫疾患の治療や臓器移植拒絶の防止のための免疫抑制剤としてのその使用 に関する。 発明の要約 免疫学、血液学および腫瘍学の間での臨床的相互領域が長らく認識されている 。血液学者または腫瘍学者によって処置される多くの状態は、その病理生理学に 自己免疫または免疫不全要因のいずれかを有し、それが血液学者による免疫抑制 剤療法の広範な採用となり、一方、腫瘍学者は腫瘍に対する内生の免疫を高める ための免疫アジュバントを探し求めていた。今日ではこれらの介入措置は、一般 に非特異的なモードの免疫抑制および免疫刺激からなる。これら介入措置の効能 が限られていることに加え、その非特異性による毒性もまた、その全的成功を制 限していた。それゆえ、別の戦略が探し求められている。 迅速にその数を増している細胞表面分子の機能的役割の解明は、免疫学と臨床 血液学および腫瘍学との統合に多大な貢献をしている。２００近い細胞表面抗原 が免疫系および造血系の細胞で同定されている［シュロスマン（Schlossman,SF ）、ブムセル（Boumsell,L.）、ジルクス（Gilks,JM）、ハーラン（Harlan,T.） 、キシモト（Kishimoto,C.）、モリモト（Morimoto,C.）、リッツ（Ritz,J.）、 ショー（Shaw,S.）、シルバースタイン（Silverstein,RL）、スプリンガー（Spr inger,TA）、テッダー（Tedder,TF）、トッド（Todd,RF）：CD antigens（ｌ９ ９３）、Blood ８３：８７９、１９９４］。これら抗原は、細胞認識、接着、増 殖の誘発および維持、サイトカイン分泌、エフェクター機能、および細胞死さえ も含む種々のプロセスに関与する、系統に限定された分子および広く分布する分 子の両方を提示する。これら分子の機能的貢献の認識は、免疫応答を操作する新 規な試みを呼び起こした。以前には細胞接着および抗原特異的な認識に関与する 分子が治療用免疫学的介入の標的とされたが、最近ではコスティミュラトリー（ co-stimulatory）分子と呼ばれる細胞表面分子のサブグループに関心が集まって いる［ブレッチャー（Bretcher,P.）：「２１年後のリンパ球活性化の２シグナ ルモデル」、Immunol.Today １３：７３（１９９２）；ジェンキンス（Jenkins, MK）、ジョンソン（Johnson,JG）：「Ｔ細胞コスティミュレーションに関与する 分子」、Curr.Opin.Immunol.５：３５１、１９９３；ゲッパート（Geppert,T.） 、デービス（Davis,L.）、ガー（Gur,H.)、ワコルツ（Wacholtz,M.）、リプスキ ー（Lipsky,P.）：「Ｔ細胞活性化に関与するアクセサリー細胞」、Immunol.Rev .１１７：５（１９９０；ウィーバー（Weaver,CT）、ウナウエ（Unaue,ER）：「 抗原提示細胞のコスティミュラトリー機能」、Immunol.Today １１：４９（１９ ９０）；ステナム（Stennam,RM）、ヤング（Young,JW）：「抗原提示細胞から生 じるシグナル」、Curr.Opin.Immunol.３：３６１（１９９１）］。コスティミュ ラトリー分子は、抗原特異的なＴ細胞応答およびエフェクター機能の生成および 増幅を開始はしないが、むしろ可能にする［ブレッチャー：「２１年後のリンパ 球活性化の２シグナルモデル」、Immunol.Today １３：７３（１９９２）；ジェ ンキンス、ジョンソン：「Ｔ細胞コスティミュレーションに関与する分子」、Cu rr.Opin.Immunol .５：３５１、１９９３；ゲッパート、デービス、ガー、ワコル ツ、リプスキー：「Ｔ細胞活性化に 関与するアクセサリー細胞」、Immunol.Rev.１１７：５（１９９０）；ウィーバ ー、ウナウエ：「抗原提示細胞のコスティミュラトリー機能」、Immunol.Today １１：４９（１９９０）；ステナム、ヤング：「抗原提示細胞から生じるシグナ ル」、Curr.Opin.Immnunol.３：３６１（１９９１）；ジュン（June,CH）、ブル ーストーン（Bluestone,JA）、リンスレイ（Linsley,PS）、トンプソン（Thomps on,CD）：「Ｔ細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Immunol.Today １ ５：３２１（１９９４）]。 最近、Ｂ７：ＣＤ２８と称する一つの特異的なコスティミュラトリー経路が、 Ｂ細胞およびＴ細胞活性化におけるその有意の役割のために、異なる研究グルー プにより研究された［ジュン、ブルーストーン、リンスレイ、トンプソン：「Ｔ 細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Immunol.Today １５：３２１（１ ９９４）；ジュン、レッドベター（Ledbetter,JA）：「Ｔ細胞の抗原への応答の 間のＣＤ２８受容体の役割」、Ann.Rev.Immunol．１１：１９１（１９９３）； シュワルツ（Schwartz,RH）：「Ｔリンパ球のコスティミュレーション：インタ ーロイキン２の産生および免疫療法におけるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＢ７ ／ＢＢ１の役割」、Cell ７１：１０６５（１９９２）；ジェンシキンス（Jenki ns MK）、テイラー（Taylor PS）、ノートン（Norton SD）、アーダール（Urdha l KB）：「ＣＤ２８はヒトＴ細胞による抗原特異的なＩＬ−２産生に関与するコ スティミュラトリーシグナルを放出する」Journal of Immunology １４７：２４ ６１−２４６６（１９９１）］。このリガンド：受容体経路は４年前に発見され たので、Ｂ７：ＣＤ２８相互作用が免疫応答性とアレルギーとを決定するうえで の重大な接点の一つを代表することを示唆する膨大な証拠が得られてきている［ ジュン、ブルーストーン、リンスレイ、トンプソン：「Ｔ細胞活性化におけるＣ Ｄ２８受容体の役割」、Immunol.Today １５：３２１（１９９４）；ジュン、レ ッドベター：「Ｔ細胞の抗原への応答の際のＣＤ２８受容体の役割」、Ann.Rev. Immunol ．１１：１９１（１９９３）；シュワルツ：「Ｔリンパ球のコスティミ ュレーション:インターロイキン２の産生および免疫療法におけるＣＤ２８、Ｃ ＴＬＡ−４およびＢ７／ＢＢ１の役割」、Cell ７１：１０６５（１９９２）； コーエン（Cohen,J.）：「望んでいない 免疫応答に対して開始される攻撃」（ニュースコメント）Science ２５７：７５ １（１９９２）；コーエン：「“コスティミュレーター”として注目を浴びる新 たなタンパク質」（ニュースコメント）Science ２６２：８４４（１９９３）］ 。 とりわけ、ヒトＢ７抗原、すなわちヒトＢ７.１およびＢ７.２は、Ｔ細胞活性 化においてコスティミュラトリーな役割を果たすことが報告されている［たとえ ば、ギミ（Gimmi CD）、フリーマン（Freeman GJ）、グリッベン（Gribben JG） 、スギタ（Sugita K）、フリードマン（Freedman AS）、モリモト（Morimoto C ）、ナドラー（Nadler LM）：「Ｂ細胞表面抗原Ｂ７はＴ細胞の増殖およびイン ターロイキン２分泌を誘発するコスティミュラトリーシグナルを提供する」Proc ．Natl．Acad．Sci.（ＵＳＡ） ８８：６５７５−６５７９（１９９１）を参照］ 。 １．Ｔ細胞活性化におけるＢ７.１およびＢ７.２のコスティミュラトリーな役 割 首尾よい免疫応答の精巧さは、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の一連の特異的な 相互作用に依存する。このプロセスにおける最初の必須のステップはＭＨＣクラ スII分子との関連での抗原のＴ細胞受容体への結合に依存するが［レイン（Lane ,P.J.L.）、.マッコネル（F.M.McConnell）、シーベン（G.L.Schieven）、クラ ーク（E.A.Clark）、およびレッドベター（１９９０）、「ヒトＢ細胞活性化に おけるクラスII分子の役割」、The ournal of Immunology、１４４：３６８４− ３６９２］、この相互作用だけでは所定の抗原に対する継続した応答に必要なす べての事象を引き起こすのに充分ではない［シュワルツ、「Ｔリンパ球クローナ ルアネルギーの細胞培養モデル」、Science ２４８：１３４９；ジェンキンス（ １９９２）「クローナルアネルギーの誘発における細胞分裂の役割」、Immunolo gy Today 、１３：６９；アズマ（Azuma,M.）、カタビアブ（M.Catabyab）、バッ ク（D.Buck）、フィリップス（J.H.Phillips）およびラニエ（L,L,Lanier）（１ ９９２）、「ヒトナチュラルキラー白血病細胞株により媒体されるＭＨＣ非制限 細胞毒性へのＣＤ２８の関与」、The Journal of Immunology、１４９：１５５ ６−１５６１；アズマ、 カタビアブ、バック、フィリップスおよびラニエ（１９９２）、「ＣＤ２８とＢ ７との相互作用は、小さな静止Ｔリンパ球によって媒体される一次同種増殖応答 および細胞毒性をコスティミュレートする」、J.Exp.Med.１７５：３５３−３６ ０；ノートン、ズッカーマン（L,Zuckerman）、アーダール、シェフナー（R.She fner）、ミラー（J.Mi11er）およびジェンキンス（１９９２）、「ＣＤ２８リガ ンドであるＢ７はＴ細胞にコスティミュラトリーシグナルを提供することにより ＩＬ−２産生を促進する」、The Journal of Immunology、２４９：１５５６− １５６１；シュワルツ（１９９２）、「Ｔリンパ球のコスティミュレーション： インターロイキン−２産生および免疫療法におけるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、お よびＢ７／ＢＢ１の役割」、Cell ７１：１０６５−１０６８］。 ある種の他のコスティミュラトリー分子の関与が必要である［ノートン（Ｎor ton,S.D.）、ズッカーマン、アーダール、シェフナー、ミラーおよびジェンキン ス（１９９２）「ＣＤ２８リガンドであるＢ７はＴ細胞にコスティミュラトリー シグナルを提供することによりＩＬ−２産生を促進する」、The Journal of Imm unology 、１４９：１５５６〜１５６１］。「Ｔ細胞上で発現されたホモダイマ ーＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４」［ジューン、レッドベター、リンスレイおよび トンプソン（１９９０）「Ｔ細胞活性化におけるＣＤ２８受容体の役割」、Immu nology Today 、１１：２１１〜２１６；リンスレイ、ブラディー、アーンズ、グ ロスメア（L.S.Grosmaire）、ダムル（N.K.Damle）およびレッドベター（１９９ １）、「ＣＴＬＡ−４はＢ細胞活性化抗原Ｂ７の第二の受容体である」、J.Exp. Med .１７４：５６１］が、抗原提示細胞上で発現されたＢ７.１（ＣＤ８０）お よびＢ７.２（ＣＤ８６）とともに、持続された免疫応答に必要なコスティミュ ラトリー分子の主要なペアである［アズマ、イッセル（H.Yssel）、フィリップ ス、スピッツ（H.Spits）およびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ球上で のＢ７／ＢＢ１の機能的発現」、J.Exp.Med.１７７：８４５〜８５０；フリーマ ン（Freeman,G.J.）、フリードマン（A.S.Freedman）、セジル（J.M.Segil）、 リー（G.Lee）、ホワイトマン（J.F.Whitman）およびナドラー（LM.Nadler）（ １９８９）、「活性化された 新生物Ｂ細胞上でのみ発現されるＩｇスーパーファミリーの新たな成員であるＢ ７」、The Journal of Immunology、１４３：２７１４〜２７２２；ハスコック （Hathcok,K.S.）、ラスロ（G.Laslo）、ディックラー（H.B.Dickler）、ブラッ ドショー（J.Bradshaw）、リンスレイおよびホーズ（R.J.Hodes）（１９９３） 、「Ｔ細胞活性化のコスティミュラトリーの他のＣＴＬＡ−４リガンドの同定」 、Science、２６２：９０５〜９１１；ハート（Hart,D.N.J.）、スターリング（ G.C.Starling）、カルダー（V.L.Calder）およびフェルナンド（N.S.Fernando） （１９９３）、「Ｂ７／ＢＢ１は、活性化により誘発されたヒト樹状細胞上の白 血球分化抗原である」、Immunology、７９：６１６〜６２０］。インビトロでは 、これらコスティミュラトリーシグナルの不在が未発達のＴ細胞活性化経路およ び特定の抗原に対する応答の欠如すなわちアネルギーを導くことを示すことがで きる［たとえば、ハーディング（Harding,F.A.）、マッカーサー（J.G.McArthur ）、グロス（J.A.Gross）、ラウレット（D.M.Raulet）およびアリソン（J.P.All ison）（１９９２）、「ＣＤ２８により媒体されたシグナル伝達は、マウスＴ細 胞をコスティミュレートし、Ｔ細胞クローンにおけるアネルギーの誘発を防ぐ」 、Nature、３５６：６０７〜６０９；ギミ、フリーマン、グリベン、グレイ（G. Gray）およびナドラー（１９９３）、「ヒトＴ細胞クローナルアネルギーは、Ｂ ７コスティミュレーションの不在下での抗原提示により誘発される」、Proc.Nat l.Acad.Sci .、９０：６５８６〜６５９０；タン（Tan,P.）、アナセフティ（C.A nasefti）、ハンセン（J.A.Hansen）、メルローズ（J.Melrose）、ブランバンド （M.Brunvand）、ブラッドショー、レッドベターおよびリンスレイ（１９９３） 、「ＣＤ２８とその天然リガンドであるＢ７／ＢＢ１との間の相互作用を阻止す ることによるヒトＴリンパ球でのアロ抗原特異的な低応答性の誘発」、J.Exp.Me d .１７７：１６５〜１７３］。インビボの寛容の達成は、免疫抑制のメカニズム および臓器移植拒絶や自己免疫疾患の治療のための実行可能な療法を構成する。 このことは、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ投与後の実験モデルでは達成されている［レン ショー（Lenshow,D.J.）、ゼング（Y.Zeng）、ジスルスウェイト（R.J.Thistlet hwaite）、モンタグ（A.Montag）、ブラディー、 ギブソン（M.G.Gibson）、リンスレイおよびブルーストーン（J.A.Bluestone） （１９９２）、「ＣＴＬＡ４−Ｉｇにより誘発された異種個体膵臓島移植の長期 生存］、Science、２５７：７８９〜７９５］。 Ｂ７.１分子およびＢ７.２分子はＣＤ２８かまたはＣＴＬＡ−４のいずれかに 結合することができるが、Ｂ７.１はＣＤ２８には２００ＮｍのＫｄで結合し、 ＣＴＬＡ−４には２０倍高い親和性で結合する［リンスレイ、クラークおよびレ ッドベター（１９９０）、「Ｔ細胞抗原ＣＤ２８は、活性化抗原Ｂ７／ＢＢ１と 相互作用することによりＢ細胞との接着を媒体する」、Proc.Natl.Acad.Sci.、 ８７：５０３１〜５０３５；リンスレイら（１９９３）、「抗原へのＴ細胞応答 の際のＣＤ２８受容体の役割」、Annu.Rev.Immunol.、１１：１９１〜１９２； リンスレイら（１９９３）、「Ｂ７／ＢＢ１とＣＤ２８との連動が、ＣＤ２８合 成の一過性のダウンレギュレーションおよびＣＤ２８シグナル伝達に対する長期 化した応答の欠如を誘発する」、The Journal of Immunology、１５０：３１５ １〜３１６９］。Ｂ７.１は活性化されたＢ細胞およびインターフェロン誘発さ れた単球上では発現されるが、静止状態のＢ細胞では発現されない［フリーマン 、グレイ、ギミ、ロマルド（D.B.Lomarrd）、ゾウ（L−J.Zhou）、ホワイト、フ ィンゲロス（J.D.Fingeroth）、グリベンおよびナドラー（１９９１）、「ヒト Ｂリンパ球活性化抗原Ｂ７のマウスホモログの構造、発現およびＴ細胞コスティ ミュラトリー活性」、J.Exp.Med.、１７４：６２５〜６３１］。一方、Ｂ７.２ は、静止状態の単球、樹状細胞およびＢ細胞上で非常に低レベルではあるが構成 的に発現され、その発現は活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢリンパ球では 促進される［アズマ、イトー（D.Ito）、ヤギタ（H.Yagita）、オクムラ（K.Oku mura）、フィリップス、ラニエおよびゾモザ（C.Zomoza）（１９９３）、「Ｂ７ ０抗原はＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の第二のリガンドである」、Nature、３６ ６：７６〜７９］。Ｂ７.１およびＢ７.２は同じ細胞型上で発現されうるが、Ｂ 細胞上での発現は異なる動力学で起こる［レンショー、ス（G.H.Su）、ズッカー マン、ナバビ（N.Nabavi）、ジェリス（C.L.Jellis）、グレイ、ミラーおよびブ ルーストーン（１９９３）、「ＣＴＬＡ-４の別のリガンドの発現および機能的 有意」、Proc.Natl.Acad.Sci .USA、９０：１１０５４〜１１０５８；ブショティス（Boussiotis,V.A.）、 フリーマン、グリベン、ダリー（J.Daley）、グレイおよびナドラー（１９９３ ）、「活性化されたヒトＢリンパ球は、Ｔ細胞活性化をコスティミュレートする ３つのＣＴＬＡ−４対応受容体を発現する」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９０： １１０５９〜１１０６３］。ＲＮＡレベルでさらに分析したところ、Ｂ７.２ｍ ＲＮＡが構成的に発現されるのに対して、Ｂ７.ＩＭＲＮＡは活性化の４時間後 に検出され、初期低レベルのＢ７.１タンパク質は刺激から２４時間後までは検 出できなかった［ブショティス、フリーマン、グリベン、ダリー、グレイおよび ナドラー（１９９３）、「活性化されたヒトＢリンパ球は、Ｔ細胞活性化をコス ティミュレートする３つのＣＴＬＡ-４副受容体を発現する」、Proc.Natl.Acad. Sci .USA、９０：１１０５９〜１１０６３］。それゆえ、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２ ８対応（counter）受容体は、Ｂ細胞活性化後の種々の時間に発現される。 さらに最近では、第二のＴ細胞関連副受容体ＣＴＬＡ−４が明らかにランナウ エイ（runaway）免疫系を無効にし妨害する負のモデュレーターとして機能する ことが示唆されている［クラメル（Krummel M）、アリソン（Allison J）：「Ｃ Ｄ２８とＣＴＬＡ−４とは刺激に対するＴ細胞の応答に対して反対の作用を有す る」、J.Exp.Med．１８２：４５９−４６６（１９９５）］。ＣＴＬＡ−４受容 体は、ＣＴＬＡ−４ノックアウトマウスで証明されるように、免疫応答をダウン レギュレートするうえで重要な役割を果たしている。ＣＴＬＡ−４遺伝子を発現 する能力をもたずに生まれてきたノックアウトマウスは、重篤なリンパ増殖性疾 患のために３〜４週間以内に死亡する［チボル（Tivol EA）、ボリエロ（Borrie llo G）、シュワイツァー（Schweitzer AN）、リンチ（Lynch WP）、ブルースト ーン（Bluestone JA）、シャープ（Sharpe AH）：「ＣＴＬＡ-４の喪失は広範囲 のリンパ増殖および致死的な多臓器組織破壊に導き、ＣＴＬＡ−４の重要な負の 制御的役割を明らかにする」、Immunity ３：５４１−５４７（１９９５）］。 ＣＴＬＡ−４は、アポトーシスの誘発と連動したシグナル伝達機構により機能す ると考えられており［グリッベン、フリーマン、ブシオチス（Boussiotis VA） 、レナート（Remmert P）、ジェリス（J ellis CL）、グリーンフィールド（Greenfield E）、バーバー（Barber M）、レ スティボ（Restivo Jr．VA）、ケ（Ke X）、グレイ（Gray GS）、ナドラー：「 ＣＴＬＡ−４はヒトＴ細胞の抗原特異的なアポトーシスを媒介する」、Proc ．Na tl.Acad．Sci．(ＵＳＡ) ９２：８１１−８２５（１９９５）］、該受容体上の特 定部位への未だ定かでないリガンド結合により誘起される。Ｂ７.１／Ｂ７.２依 存性コスティミュラトリーシグナルの種々の仕方での阻止は未発達の（aborted ）Ｔ細胞活性化経路および特定の抗原に対する非応答性の発達を導くことがイン ビトロで示されている［レダーマン（Lederman S）、チェス（Chess L）、イェ リン（Yellin MJ）：「Ｔリンパ球の表面上のヒト糖タンパク質を認識するマウ スモノクローナル抗体（５ｃ８）、それを含有する組成物」、米国特許第５,４ ７４,７７１（１９９５年１２月１２日）；リンズレイ（Linsley PS）、レッド ベター、ダムル（Damle NK）、ブラディー（Brady W）：「キメラＣＴＬＡ４受 容体およびその使用方法」、米国特許第５,４３４,１３１（１９９５年７月１８ 日）；ハーディング、１９９２；ギミ、フリーマン、ブリッベン、グレイ、ナド ラー：「ヒトＴ細胞クローナルアネルギーはＢ７コスティミュレーションの不在 下での抗原提示により誘発される」、Ｐroc．Natl．Acad．Sci．(ＵＳＡ)９０： ６５８６−６５９０（１９９３）；タン、アナセッティ、ハンセン、メルローズ 、ブランバンド、ブラッドショー、レッドベター、リンスレイ：「ＣＤ２８とそ の天然リガンドＢ７／ＢＢ１との相互作用を阻止することによるアロ抗原特異的 な過応答性の誘発」、J ．Exp．Med、１７７：１６５−１７３（１９９３）］。 インビボ免疫寛容、アネルギー、または抗原特異的なＴ細胞の枯渇は、免疫抑制 機構および臓器移植拒絶のための実行可能な療法または自己免疫疾患のもっとも らしい治療を構成する。 Ｂ７.１およびＢ７.２の差異的な時間をずらした（differential temporal） 発現は、これら２つの分子とＣＴＬＡ−４および／またはＣＤ２８との相互作用 がＴ細胞への別個だが関連したシグナルを送達することを示唆している［ラサル （LaSalle,J.M.）、トレンチーノ（P.J.Tolentino）、フリーマン、ナドラーお よびハフラー（D.A.Hafler）（１９９２）、「ＣＤ２８およびＴ細胞抗原受容体 シグナル伝達は、スーパー抗原刺激に応答したインターロイキン２遺 伝子発現を共同的に制御する」、J.Exp.Med.、１７６：１７７〜１８６；バンデ ンベルグ（Vandenberghe,P.）、フリーマン、ナドラー、フレッチャー（M.C.Fle tcher）、カモウン（M.Kamoun）、ツルカ（L.A.Turka）、レッドベター、トンプ ソンおよびジュン（１９９２）、「抗体およびＢ７／ＢＢ１媒体されたＣＤ２８ 受容体のライゲーションはヒトＴ細胞においてチロシンリン酸化を誘発する」、The Journal of Experimental Medicine 、１７５：９５１〜９６０］。Ｔ細胞に 対するＣＴＬＡ-４およびＣＤ２８の正確なシグナル伝達機能は、現在のところ 知られていない［ジェインウェイ（Janeway,C.A.,Jr.）およびボトムリー（K.Bo ttomly）（１９９４）、「リンパ球応答のシグナルおよび信号」、Cell、７６. ２７５２８５］。しかしながら、１セットの受容体がＴ細胞活性化の初期刺激お よび第二の持続されたシグナルを提供し、該経路のさらなる精巧さ（elaboratio n）およびクローン拡張が起こるのを可能にしうる可能性がある［リンスレイ、 グリーン（J.L.Greene）、タン、ブラッドショー、レッドベター、アナヤッティ （C.Anasetti）およびダムル（１９９２）、「活性化Ｔリンパ球上でのＣＴＬＡ −４およびＣＤ２８の同時発現および機能的協同」、J.Exp.Med.、１７６：１５ ９５〜１６０４］。現在のデータは、Ｔ細胞拡張、リンホカイン分泌およびエフ ェクター機能の完全な発達のためにＴＣＲとコスティミュラトリーシグナルの両 者が必要である［グリーナン（Greenan,V.）およびクレーマー（G.Kroemer）（ １９９３）、「細胞免疫寛容への複数の経路」、Immunology Today、１４：５７ ３］というジェンキンスおよびシュワルツにより提唱された２シグナル仮説［シ ュワルツ（１９９０）、「Ｔリンパ球クローナルアネルギーのための細胞培養モ デル」、Science、２４８：１３４９；ジェンキンス（１９９２）、「クローナ ルアネルギーの誘発における細胞分裂の役割」、Immunology Today、１３：６９ ］を支持している。第二のシグナルの送達ができないとＴ細胞がＩＬ−２を分泌 できず、細胞は抗原に対して非応答性となる。 構造的には、Ｂ７.１およびＢ７.２の両者ともに、細胞外免疫グロブリンスー パーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、疎水性膜貫通領域および細胞質テールを 含む［フリーマン、グリベン、ブショティス、ング（J.W.Ng）、レスティボ （V.Restivo,Jr.）、ロンバード（L.A.Lombard）、グレイおよびナドラー（１９ ９３）、「Ｂ７.２のクローニング：ヒトＴ細胞増殖をコスティミュレートする ＣＴＬＡ−４対応受容体」、Science、２６２：９０９］。Ｂ７.１およびＢ７. ２はともに高程度にグリコシル化されている。Ｂ７.１は、２２３アミノ酸の細 胞外ドメイン、２３アミノ酸の膜貫通ドメインおよび６１アミノ酸の細胞質テー ルからなる４４〜５４ｋＤの糖タンパク質である。Ｂ７.１は、３つの潜在的な プロテインキナーゼリン酸化部位を含む［アズマ、イッセル、フィリップス、ス ピッツおよびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ球上でのＢ７／ＢＢ１の機 能的発現」、J.Exp.Med.、１７７：８４５〜８５０］。Ｂ７.２は、３０６アミ ノ酸の膜糖タンパク質である。Ｂ７.２は、２２０アミノ酸の細胞外領域、２３ アミノ酸の疎水性膜貫通ドメインおよび６０アミノ酸の細胞質テールからなる［ フリーマン、フリードマン、セジル、リー、ホワイトマンおよびナドラー（１９ ８９）、「活性化された新生物Ｂ細胞上でのみ発現されるＩｇスーパーファミリ ーの新たな成員であるＢ７」、The Journal of Immunology、１４３：２７１４ 〜２７２２］。Ｂ７.１およびＢ７.２の両遺伝予は同じ染色体領域中に局在する が［フリーマン、ロンバード、ギミ、ブロッド（S.A.Brod）、リー、レイニング （J.C.Laning）、ハフラー、ドーフ（M.E.Dorf）、グレイ、レイサー（H.Reiser ）、ジュン、トンプソンおよびナドラー（１９９２）、「ＣＴＬＡ-４およびＣ Ｄ２８のＭＲＮＡは活性化後に大抵のＴ細胞で同時に発現される」、The Journa l of Immunology 、１４９：３７９５〜３８０１；シュワルツ（１９９２）、「 Ｔリンパ球のコスティミュレーション：ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＢ７／Ｂ Ｂ１の役割」、セルバクマール（Selvakumar,A.）、モハンラジュ（B.K.Mohanra j）、エディ（R.L.Eddy）、ショーズ（T.B．Shows）、ホワイト（P.C.White）、 ペリン（C.Perrin）およびデュポン（B.Dupont）（１９９２）、「Ｂリンパ球活 性化抗原Ｂ７をコードするヒト遺伝子のゲノム構成および染色体位置」、Immuno genetics 、３６：１７５〜１８１］、これら抗原は高レベルのホモロジーを共有 してはいない。Ｂ７.１とＢ７.２との間の全体のホモロジーは２６％であり、マ ウスＢ７.１とヒトＢ７.１との間の全体のホモロジーは２７％である［アズマ、 イッセル、フィリップス、スピ ッツおよびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリンパ球上でのＢ７／ＢＢ１の機能 的発現」、J.Exp.Med.、１７７：８４５〜８５０；フリーマン、フリードマン、 セジル、リー、ホワイトマンおよびナドラー（１９８９）、「活性化された新生 物Ｂ細胞上でのみ発現されるＩｇスーパーファミリーの新たな成員であるＢ７」 、The Journal of Immunology、１４３：２７１４〜２７２２］。ヒトＢ７.１、 ヒトＢ７.２およびマウスＢ.１配列のアラインメントは、長いホモロジーを示す 領域は殆どないことを示すが、これら３つの分子はすべてヒトＣＴＬＡ−４およ びＣＤ２８に結合することが知られている。従って、これら３つの分子に共通す る隣接しているかまたは立体配置的な共通した密接に関連した相同領域が存在す る可能性が高い。この領域は、Ｂ７.１分子およびＢ７.２分子の対応受容体への 結合部位を構成する。これらエピトープに対して産生された抗体は、Ｔ細胞上で のＢ７と対応受容体との相互作用を阻止する可能性がある。さらに、Ｂ７.１分 子とＢ７.２分子との両者の上の該領域と交差反応する抗体は、Ｂ７.１またはＢ ７.２に対して別々に向けられた抗体よりも実際的に有利である可能性がある。 ２．Ｂ７／ＣＤ２８相互作用の阻止 Ｂ７／ＣＤ２８相互作用の阻止は特異的な免疫抑制の可能性を与え、長期間持 続する抗原特異的な治療効果が得られる可能性がある。この相互作用を一時的に 妨害する抗体または薬剤は、長期間の抗原特異的な治療効果を生成する効力を有 する有用で特異的で安全な臨床免疫抑制剤となり得る。 Ｂ７.１かまたはＢ７.２のいずれかに対する抗体は、インビトロでのＩＬ−２ 産生の抑制により測定されるようにＴ細胞活性化を阻止することが示されている ［デュボア（DeBoer,M.）、パレン（P.Parren）、ドーブ（J.Dove）、オッセン ドープ（F.Ossendorp）、ファン・デア・ホルスト（van der Horst）およびリー ダー（J.Reeder）（１９９２）、「新規な抗Ｂ７モノクローナル抗体の機能的特 徴付け」、Eur.Journal of Immunology、２２：３０７１〜３０７５；アズマ、 イッセル、フィリップス、スピッツおよびラニエ（１９９３）、「活性化Ｔリン パ球上でのＢ７／ＢＢ１の機能的発現」、J.Exp.Med.、１７７：８４５〜８５０ ］。しかしながら、種々の抗体が免疫抑制能においてさ まざまであることが示されており、これは親和性かまたはエピトープ特異性のい ずれかを反映しているかもしれない。このことの一つの可能な説明として、アポ トーシスや活性化Ｔ細胞でのＣＴＬＡ−４受容体を介した幾つかの他の負のシグ ナル伝達は促進しながら、Ｂ７とＣＤ２８との結合のみを阻止する幾つかの抗体 の能力がある。Ｂ７.１またはＢ７.２に対する幾つかの抗体は、実際、ＣＴＬＡ −４結合ドメインと交差反応することによりＣＴＬＡ-４の活性を妨害する。Ｃ ＴＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質および抗ＣＤ２８Ｆａｂは、ＩＬ−２産生のダ ウンレギュレーションに対して同様の作用を有することが示された。 可溶性のＣＴＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質のインビボ投与は、マウスにおい てＴ細胞依存性の抗体応答を抑制することが示されており［リンスレイ、グリー ン、タン、ブラッドショー、レッドベター、アナセッティおよびダムル（１９９ ２）、「活性化Ｔリンパ球上でのＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の同時発現および 機能的協同」、J.Exp.Med.、１７６：１５９５〜１６０４；リン（Lin,H.）、ビ リング（S.F.Builing）、リンスレイ、ウェイ（R.O.Wei）、トンプソンおよびツ ルカ（L.A.Turka）（１９９３）、「ＣＴＬＡ-４−Ｉｇとドナー特異的な輸血に よって誘発された主要組織適合複合体の不適合な心臓同種移植の長期受容」、J. Exp.Med .、１７８：１８０１］、さらに大用量の投与は第二の免疫に対する応答 を抑制することができ、このアプローチが抗体に媒体された自己免疫疾患の治療 に対して実行可能であることが示されている。さらに、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、 Ｔ細胞とＢ７.１／Ｂ７.２抗原提示細胞との間の相互作用を直接抑制することに より、マウスにおいて膵臓島細胞の拒絶を防ぐことができた［レンショー、ス、 ズッカーマン、ナバビ、ジェリス、グレイ、ミラーおよびブルーストーン（１９ ９３）、「ＣＴＬＡ−４の別のリガンドの発現および機能的有意」、Proc.Natl. Acad.Sci .USA、９０：１１０５４〜１１０５８］。この場合、長期のドナー特異 的な寛容が達成された。 ３．抗体選択のための組換えファージ提示（Display）法 今日まで、Ｂ７.１およびＢ７.２の両者に交差反応するモノクローナル抗体は 報告されていない。さらに、Ｂ７.１またはＢ７.２に特異的で受容体ＣＤ２８結 合を同時に活性化することに限定された抗原上の特定の部位を認識するモノクロ ーナル抗体は報告されていない。または、Ｂ７.１またはＢ７.２に特異的でＣＴ ＬＡ−４受容体結合に限定された抗原上の特定の部位を認識するモノクローナル 抗体は報告されていない。記載したように、かかる抗体は免疫抑制剤として非常 に望ましいものである。 ファージ提示法は免疫応答の際に産生される抗体を単離するための従来法に置 き換わりつつある。なぜなら、従来法を用いた場合に比べてはるかに高いパーセ ントの免疫範囲（immune repertoire）を評価することが可能であるからである 。このことは、一部、ＰＥＧ融合の非効率性、染色体の不安定性、およびヘテロ ハイブリドーマ産生に伴う大量の組織培養およびスクリーニングによるものであ る。対照的にファージ提示法は、所定の抗原に応答した免疫グロブリン遺伝子の 全範囲を潜在的に捕捉するための分子技術に依存している。 この技術はバーバー（Barber）らのProc.Natl.Acad.Sci.USA、８８、７９７８ 〜７９８２（１９９１）に記載されている。本質的に、免疫グロブリンの重鎖遺 伝子をＰＣＲ増幅し、繊維状ファージＭ１３のマイナーコートタンパク質をコー ドする遺伝子を含むベクター中に重鎖融合タンパク質が生成されるような仕方で クローニングする。重鎖融合タンパク質は、それが組み立てられるときに軽鎖遺 伝子とともにＭ１３ファージ粒子中に取り込まれる。各組換えファージはそのゲ ノム内に異なる抗体Ｆａｂ分子の遺伝子を含み、これはファージの表面上に提示 される。これらライブラリー内に１０⁶を越える異なる抗体がクローニングされ 、提示されうる。ファージライブラリーを抗原をコーティングしたマイクロタイ ターウエル上でえり分け、非特異的なファージを洗い落とし、抗原結合したファ ージを溶出する。抗原特異的なクローンからのゲノムを単離し、さらに特徴付け るために可溶性のＦａｂ形態で抗体が発現できるように遺伝子IIIを切り出す。 潜在的な治療候補として単一のＦａｂが一旦選択されたら、これを容易に全抗体 に変換することができる。Ｆａｂ配列を全抗体に変換するために以前に記載され た発現系は、ＩＤＥＣの哺乳動物発現ベクターＮＥＯＳＰＬＡである。このベク ターは、ヒトガンマ１かまたはガンマ４のいずれかの定常領域遺伝子を含む。Ｃ ＨＯ細胞をＮＥＯＳＰＬＡベクターでトランスフェクションし、増幅後、このベ クター系は非常に高い発現レベル（＞３０ｐｇ／細胞／日）を達成できる ことが報告された。 ４．霊長類化抗体 組換え抗体を生成するための他の非常に効率的な手段がニューマン（Newman） によって開示されている［ニューマン（１９９２）、Biotechnology、１０、１ ４５５〜１４６０］。さらに詳しくは、この技術によりサル可変ドメインおよび ヒト定常配列を含む霊長類化抗体を得ることができる。上記文献を参照のためそ の全体を本明細書中に引用する。さらに、この技術はまた、本願と同一の出願人 である１９９５年１月２５日に出願した米国特許出願第０８／３７９，０７２号 （これは１９９２年７月１０日に出願した米国特許出願第０７／９１２，２９２ 号（これは１９９２年３月２３日に出願した米国特許出願第０７／８５６，２８ １号（これは１９９１年７月２５日に出願した米国特許出願第０７／７３５，０ ６４号の一部継続出願である）の一部継続出願である）の継続出願である）にも 記載されている。米国特許出願第０８／３７９，０７２号およびその親出願を参 照のためその全体を本明細書中に引用する。 この技術は、抗体をヒトに投与したときに抗原的に拒絶されないように修飾す るものである。この技術は、ヒト抗原または受容体でカニクイザルを免疫するこ とによっている。この技術は、ヒト細胞表面抗原に向けられた高親和性のモノク ローナル抗体を産生するために開発された。 ファージ提示ライブラリーまたはＢ７.１および／またはＢ７.２で免疫したサ ルからのＢリンパ球を用いて得られたサルヘテロハイブリドーマをスクリーニン グすることによるヒトＢ７.１およびＢ７.２に対するマカークザル抗体の同定は また、本願と同一出願人に係る米国特許出願第０８／４８７,５５０号（１９９ ５年６月７日出願；その全内容を参照のため本明細書中に引用する）に記載され ている。さらに詳しくは、米国特許出願第０８／４８７,５５０号は、Ｂ７：Ｃ Ｄ２８経路を阻害し、それゆえ有効な免疫抑制剤として機能する４つのモノクロ ーナル抗体７Ｂ６、１６Ｃ１０、７Ｃ１０および２０Ｃ９を提供している。 このようにしてこれら同一出願人に係る出願により記載された仕方で生成され た抗体は、ヒトエフェクター機能を示すこと、免疫原性が低減していること、お よび長期の血清半減期を有することが以前に報告されている。この技術は、カニ クイザルがヒトと系統発生的には類似しているという事実にもかかわらず、カニ クイザルが依然として多くのヒト抗原を異物として認識し、それゆえ免疫応答を 誘起するという事実によっている。さらに、カニクイザルがヒトに系統発生的に 近接しているため、これらサルで産生された抗体はヒトで産生された抗体に対し て高度のアミノ酸ホモロジーを有することが見出された。実際、マカークザルの 免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域遺伝子を配列決定したところ、各遺伝子 ファミリーはヒトにおけるその対応遺伝子と８５〜９８％相同であることがわか った［ニューマンら（１９９２）、上掲］。このようにして産生された最初の抗 体である抗ＣＤ４抗体は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域のコンセンサ ス配列に９１〜９２％相同であつた［ニューマンら、Biotechnology、１０、１ ４５８〜１４６０（１９９２）］。 ヒトＢ７抗原に特異的なモノクローナル抗体は、以前に文献に記載されている 。 たとえば、ワイル（Weyl）ら［Hum.Immunol.、３１（４）、２７１〜２７６（１ ９９１）］は、天然および変異抗原変異体を用いたＨＬＡ−Ｂ−２７に対するヒ トモノクローナル抗体のエピトープマッピングを記載している。また、トウバー ト（Toubert）ら［Clin.Exp.Immunol.、８２（１）、１６〜２０（１９９０）］ は、３５ＫＤの細菌外膜タンパク質とも反応するＨＬＡ−Ｂ−２７モノクローナ ル抗体のエピトープマッピングを記載している。また、バル（Valle）ら［Inmlu nol .、６９（４）、５３１〜５３５（１９９０）］は、活性化Ｂ細胞およびＨＴ ＬＶ−１形質転換Ｔ細胞で発現されたＢ７抗原を認識するＩｇＧ１サブクラスの モノクローナル抗体を記載している。さらに、トウバートら［J.Immunol.、１４ １（７）、２５０３〜９（１９８８）］は、ＨＬＡ−Ｂ−２７およびＨＬＡ−Ｂ −７抗原遺伝子の対立遺伝子間でのハイブリッド遺伝子を大腸菌で作成すること により構築したドメイン内組換え体を用いたこれら抗原のエピトープマッピング を記載している。 Ｂ７抗原の高発現が自己免疫疾患と相関関係を有することが何人かの研究者に よって示されている。たとえば、イオネスコ−チルゴビスト（Ionesco−Tirgovi ste）ら［Med.Interre、２４（１）、１１〜１７（１９８６）］は、１型インス リン依存性糖尿病での増大したＢ７抗原発現を報告している。また、乾 癬患者から得た皮膚樹状細胞上でのＢ７抗原の関与が報告されている［ネッスル （Nestle）ら、J.Clin.Invest.、９４（１）、２０２〜２０９（１９９４）］。 さらに、アフィニティー精製した可溶性ＨＬＡ-Ｂ７を用いた抗ＨＬＡ-Ｂ７同 種反応性ＣＴＬの抑制が文献で報告されている［ザバザバ（Zavazava）ら、Tran splantation 、５１（４）、８３８〜４２（１９９１）］。さらに、動物モデル においてＢ７活性を阻止するためのＢ７受容体可溶性リガンドＣＴＬＡ−４−Ｉ ｇの使用［たとえば、レンショーら、Science、２５７、７８９、７９５５（１ ９９２）を参照］およびＢ７を抑制しうるＢ７−１−Ｉｇ融合タンパク質が報告 されている。 この開示では、ＣＤ２８受容体結合に限定されたＢ７.１抗原上の特定の部位 を認識するモノクローナル抗体の同定のための証拠が提供される。さらに、本明 細書では、ＣＴＬＡ−４受容体結合を排除するＢ７.１抗原上の特定の部位を認 識するモノクローナル抗体の同定のための証拠が提供される。それゆえ、本明細 書では、ヒトＢ７.１（ＣＤ８０）コスティミュラトリー抗原上の独特の抗原結 合部位の存在を支持する証拠が提供される。これら主張に係る部位は、抗Ｂ７. １ PRIMATIZED^R抗体により認識され、同時活性化受容体ＣＤ２８との結合に限定 されたＢ７.１抗原上の相互作用部位への結合を確認する証拠が提供される。 発明の要約および目的 本発明の目的は、ヒトＢ７抗原に特異的な新規な抗体を同定することにある。 より詳しくは、ヒトＢ７.１抗原に特異的であり、ＣＤ２８受容体へのＢ７.１の 結合をも阻止し得る抗体を同定することが本発明の目的である。ヒトＢ７.１抗 原に特異的であり、ＣＴＬＡ−４へのＢ７.１の結合を阻害し得る抗体を同定す ることもまた本発明の目的である。それゆえ、本発明の目的は、Ｂ７.１抗原上 の特定の部位を認識する抗原を同定することであり、その際、認識される部位は 、ＣＤ２８受容体結合に限定されＣＴＬＡ−４受容体結合を排除するものである 。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７.１抗原に特異的であるがヒトＢ７.２抗原を認 識することはできない抗体を同定することである。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７.１抗原上の特定の部位を認識し、ＩＬ−２産 生およびＴ細胞増殖を阻害し、有効な免疫抑制剤として機能するモノクローナル 抗体およびその霊長類化形態を同定することである。さらに詳しくは、本発明の 目的は、Ｂ７.１に特異的であり、ＩＬ−２産生を阻害し得る抗体を同定するこ とである。 本発明の他の目的は、ドナー脾臓細胞培養中での抗原誘発応答、たとえば、抗 原特異的なＩｇＧ応答、ＩＬ−２産生および細胞増殖を阻害する、モノクローナ ル抗体およびその霊長類化形態を提供することにある。 本発明の他の特別の目的はまた、有利な特性、すなわち親和性、免疫抑制活性 を有する、治療剤として有用な、ヒトＢ７.１抗原に特異的な特定のサルモノク ローナル抗体およびその霊長類化形態を同定することにある。さらに詳しくは、 これら抗体およびその霊長類化形態は、たとえば免疫抑制剤として、すなわち抗 原誘発免疫応答を阻止するため、自己免疫疾患（乾癬、慢性関節リウマチ、全身 性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴ Ｐ）、アレルギー、炎症性胆汁疾患など）を治療するため、および臓器移植拒絶 を防ぐために用いることができる。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７.１抗原に特異的な１またはそれ以上のモノク ローナル抗体またはその霊長類化形態および薬理学的に許容しうる担体または賦 形剤を含む医薬組成物を提供することにある。これら組成物は、たとえば、自己 免疫疾患、たとえば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）や全身性エリテマト ーデス（ＳＬＥ）を治療するため、抗原誘発免疫応答を阻止するため、および移 植受容者における臓器移植拒絶を防ぐための免疫抑制剤として用いられるであろ う。 本発明の他の目的は、ヒトＢ７.１抗原に特異的に結合する１またはそれ以上 の霊長類化モノクローナル抗体の治療学的有効量を投与することによる新規な治 療方法を提供することにある。そのような治療方法は、Ｂ７：ＣＤ２８経路の阻 害により治療可能な疾患、たとえば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全 身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、乾癖、慢性関節リウマチ、多発 性硬化症、再生不能性貧血などの自己免疫疾患の治療、並びに移植患者において 移植拒絶を防ぐために有用である。 本発明のさらに他の目的は、ヒトＢ７.１抗原に特異的なモノクローナル抗体 の少なくとも可変重鎖および軽鎖ドメインを発現するトランスフェクタント、た とえばＣＨＯ細胞を提供することにある。 定義 本発明を一層明確に理解できるように下記術語を定義する。 枯渇（Depleting）抗体 − 活性化Ｂ細胞または他の抗原提示細胞を殺す抗 体。 非枯渇（Non-depleting）抗体 − Ｂ７とＴ細胞活性化リガンドＣＤ２８お よびＣＴＬＡ−４とのコスティミュラトリー作用を阻止する抗体。それゆえ、こ の抗体は免疫性を減少させる（anergizes）が抗原提示細胞を排除はしない。 霊長類化抗体 − サル抗体、とりわけカニクイザル抗体の可変重鎖および軽 鎖ドメインを含み、ヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒト免疫グロブリンガン マ１またはガンマ４定常ドメイン（またはＰＥ変異体）を含むように設計した組 換え抗体。かかる抗体の調製は、ニューマンら（１９９２）、「ヒト疾患の免疫 療法のための組換え抗体の霊長類化：ヒトＣＤＨに対するマカークザル／ヒトキ メラ抗体」、Biotechnology、１０：１４５８〜１４６０；および本願と同じ出 願人に係る米国特許出願第０８／３７９，０７２号（両文献を参照のため本明細 書中にその全体を引用する）に記載されている。これら抗体は、ヒト抗体と高程 度のホモロジー、すなわち８５〜９８％のホモロジーを示し、ヒトエフェクター 機能を示し、免疫原性が減少しており、ヒト抗原に対して高い親和性を示すこと が報告されている。 Ｂ７抗原 − 本願におけるＢ７抗原は、たとえばヒトＢ７.１抗原およびＢ ７.２抗原を含む。これら抗原はＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４に結合す る。これら抗原はＴ細胞活性化においてコスティミュラトリー機能を有する。ま た、これら抗原はすべて、細胞外免疫グロブリンスーパーファミリ−ＶおよびＣ 様ドメイン、疎水性膜貫通領域および細胞質テールを含み［フリーマンら、Scie nce 、２６２：９０９（１９９３）を参照］、高度にグリコシル化されている。 抗Ｂ７抗体 − ヒトＢ７抗原、たとえばヒトＢ７.１抗原および／またはＢ ７.２抗原に充分な親和性にて特異的に結合してＢ７：ＣＤ２８相互作用を阻止 し、それによって免疫抑制を誘発するサルモノクローナル抗体またはその霊長類 化形態。 図面の簡単な説明 図１は、マカークザル免疫グロブリン配列に基づくプライマーを含む、繊維状 ファージの表面に示されたＢ７に対して産生された組換え免疫グロブリンライブ ラリーをスクリーニングするのに用いるｐＭＳベクターを示す。 図２は、本願発明のヒトＢ７.１抗原に特異的な霊長類化抗体を発現させるの に用いるＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクターを示す。 図３ａは、７Ｃ１０の軽鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示 す。 図３ｂは、７Ｃ１０の重鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示 す。 図４ａは、７Ｂ６の軽鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図４ｂは、７Ｂ６の重鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列および核酸配列を示す 。 図５ａは、１６Ｃ１０の霊長類化軽鎖のアミノ酸配列および核酸配列を示す。 図５ｂは、１６Ｃ１０の霊長類化重鎖のアミノ酸配列および核酸配列を示す。 図６は、Ｐ１６Ｃ１０がＢ７.１トランスフェクションＣＨＯ細胞へのＣＴＬ Ａ−４Ｉｇ−ビオチン結合を阻止できないことを示す。 図７は、ＣＴＬＡ−４ＩｇがＢ７.１トランスフェクションＣＨＯ細胞へのＰ １６Ｃ１０−ビオチン結合を阻止できないことを示す。 図８は、ＢＢ−１がＢ７.１トランスフェクションＣＨＯ細胞へのＣＴＬＡ− ４Ｉｇ−ビオチンの結合を完全に阻止することを示しており、さらにＢＢ−１が Ｂ７.１トランスフェクションＣＨＯ細胞へのＰ１６Ｃ１０−ビオチン結合に有 意の影響を及ぼすことができないことを示している。 図９は、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ−ビオチンがＰ１６Ｃ１０以外のすべてのＢ７.１ 阻害剤により有効に阻止されることを示している。 図１０は、Ｐ１６Ｃ１０がＣＤ２８／Ｂ７−ＩＩｇ相互作用の結合を阻止する 能力を示す。示したデータは、４つの別個の実験から得られた値の平均である。 発明の詳細な説明 上記のように、本発明は、ヒトＢ７.１抗原に特異的であり、ＣＤ２８受容体 へのＢ７.１の結合を阻害することができ、ＣＴＬＡ−４受容体へのＢ７.１の結 合を阻害することができないモノクローナル抗体またはその霊長類化形態の同定 に関する。正のコスティミュレーションに対するアンタゴニスト作用と負のシグ ナル伝達に対するアゴニスト作用との組み合わせを可能としながら上記同定され た抗体を用いてＣＤ２８とＢ７.１（ＣＤ８０）との間の主要な活性化部位を阻 止することは、再発形態の自己免疫疾患に介入するための有用な治療学的アプロ ーチであろう。同定された抗体の機能的な活性は、Ｔ細胞刺激性サイトカインＩ Ｌ−２の産生の阻止により定められる。同定された抗体は、第二の作動リガンド Ｂ７.２の存在下にもかかわらず、ＩＬ−２の産生を５０％を超えて阻止する能 力を示し、他の文献において定められる他の抗Ｂ７.１抗体で観察される作用で は一般に認められない別の作用機構が存在することを示唆していた。 ヒトＢ７.１および／またはＢ７.２抗原に特異的に結合する新規なサルモノク ローナル抗体並びにそれから得られた霊長類化抗体の製造は、同時出願中の米国 特許出願第０８／４８７,５５０号に記載されており、本明細書にも記載してあ る。これら抗体はヒトＢ７.１および／またはＢ７.２に対する高い親和性を有し 、それゆえＢ７：ＣＤ８６経路を阻害する免疫抑制剤として用いることができる 。 サルモノクローナル抗体の調製は、ファージ提示ライブラリーのスクリーニン グにより、またはＢ７（たとえば、ヒトＢ７.１および／またはＢ７.２）で免疫 したサルから得たＢリンパ球を用いたサルヘテロハイブリドーマの調製により、 行うことができる。 記載のように、抗Ｂ７抗体の第一の製造方法は、組換えファージ提示技術を含 む。この技術は一般に上記文献に記載されている。 本質的に、この技術は、繊維状ファージの表面上に提示されたＢ７抗原に対す る組換え免疫グロブリンライブラリーを合成し、Ｂ７.１抗原および／またはＢ ７.２抗原に対する高い親和性を有する抗体を分泌するファージを選択すること を含むであろう。上記に記載したように、ヒトＢ７.１およびＢ７.２の両者に結 合する抗体を選択するのが好ましいであろう。かかる方法を行うため、本発明者 らは組換えの可能性を減少させ安定性を改善したサルライブラリーのための独特 のライブラリーを作成した。このベクターｐＭＳは以下に詳細に記載するが、図 １に示してある。 本質的に、マカークザルライブラリーに使用するファージ提示を採用するため 、このベクターはサル免疫グロブリン遺伝子をＰＣＲ増幅するための特定のプラ イマーを含んでいる。これらプライマーは、霊長類化技術を開発する際に得られ るマカークザル配列およびヒト配列を含むデータベースに基づく。 適当なプライマーは、本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９, ０７２号（参照のため本明細書中に引用する）に開示されている。 第二の方法は、ヒトＢ７抗原、好ましくはヒトＢ７.１抗原およびＢ７.２抗原 に対してサル、すなわちマカークザルを免疫することを含む。マカークザルをモ ノクローナル抗体の再生に使用することの本来的な利点は上記に記載してある。 とりわけ、かかるサル、すなわちカニクイザルはヒト抗原または受容体に対して 免疫することができる。さらに、得られた抗体は、ニューマンら、Biotechnology 、１０、１４５５〜１４６０（１９９２）およびニューマンらの 本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９，０７２号（１９９５年１ 月２５日出願）（その全体を参照のため本明細書中に引用する）に記載の方法に 従って霊長類化抗体を作成するのに用いることができる。 カニクイザルから得られる抗体の有意な利点は、これらサルが多くのヒトタン パク質を異物として認識し、それゆえ所望のヒト抗原、たとえばヒト表面タンパ ク質および細胞受容体に対して高い親和性を有する抗体を作成できることである 。さらに、カニクイザルはヒトと系統発生的に近接しているため、それから得ら れる抗体はヒトで産生される抗体と高度のアミノ酸ホモロジーを示す。上記に記 載したように、マカークザルの免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域遺伝子の 配列決定したところ、各遺伝子ファミリーの配列はヒトの対応配列と８５〜８８ ％相同であることがわかった（ニューマンら（１９９２）、上掲）。 本質的に、カニクイザルにヒトＢ７抗原、たとえばヒトＢ７.１抗原および／ またはヒトＢ７.２抗原を投与し、それからＢ細胞を単離し、たとえばリンパ節 生検を該動物から採取し、ついでポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＢ リンパ球をＫＨ６／Ｂ５（マウス×ヒト）と融合させる。ついで、ヒトＢ７抗 原、たとえばヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ７.２抗原に結合する抗体を 分泌するヘテロハイブリドーマを同定する。 Ｂ７.１およびＢ７.２の両者に結合する抗体が望ましい。なぜなら、そのよう な抗体は、Ｂ７と同様にＢ７.１およびＢ７.２とその対応受容体、すなわちヒト ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との相互作用を抑制するのに用いることができるか らである。これらエピトープに対する抗体は、ヒトＢ７.１およびヒトＢ７.２の 両者がＴ細胞上の対応受容体と相互作用するのを抑制する。このことは、相乗作 用を付与する可能性がある。 しかしながら、ヒトＢ７抗原、Ｂ７.１抗原またはＢ７.２抗原の一方のみに結 合する抗体もまた、これら分子がともにＴ細胞活性化、クローン拡張、リンホカ イン（ＩＬ−２）分泌、および抗原に対する応答性に関与することから非常に望 ましい。ヒトＢ７.１およびＢ７.２の両者がヒトＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に 結合するなら、おそらく、それに対してマカークザル抗体が潜在的に産生される 少なくとも一つの共通したまたは相同な領域（おそらく、共通する立体配置エピ トープ）が存在するに違いない。 開示した発明は、特定の抗体を産生するようにプライミングした動物の使用を 含む。かかる手順に有用な動物には、これらに限られるものではないが、以下の ものが挙げられる：マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、ヤ ギおよびウサギ。 ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を産生するための好ましい手段は、本願と同 一出願人に係る同時出願中の米国特許出願第０８／４８８，３７６号に開示され ている。 本発明者らは、マカークザルの免疫を、ＣＨＯ細胞中で産生されＬ３０７.４ −セファロースアフィニティーカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ ーにより精製した組換え可溶性Ｂ７.１抗原に対して行うことを選択した。しか しながら、特定の投与Ｂ７抗原および潜在的に他のＢ７抗原に対して特異的な抗 体応答となるに充分な純度を有する限りにおいて、ヒトＢ７抗原、ヒトＢ７.１ 抗原またはヒトＢ７.２抗原の特定の採取源は重要ではない。 ヒトＢ７抗原、ヒトＢ７.１抗原（ＣＤ８０とも称される）遺伝子およびヒト Ｂ７.２抗原（ＣＤ８６とも称される）遺伝子はクローニングおよび配列決定さ れており、それゆえ組換え法により容易に製造することができる。 好ましくは、投与するヒトＢ７抗原、ヒトＢ７.１抗原および／またはヒトＢ ７.２抗原は、たとえば膜貫通ドメインと細胞質ドメインを除去することによっ て細胞外部分、すなわち細胞外スーパーファミリーＶおよびＣ様ドメインのみを 有するＢ７、Ｂ７.１またはＢ７.２遺伝子を発現させることにより、可溶性の形 態で投与されるであろう［たとえば、グルメット（Grumet）ら、Hum.Immunol.、 ４０（３）、２２８〜２３４、１９９４（可溶性形態のＢ７の発現を教示する； 参照のためその全体を本明細書中に引用する）を参照］。 マカークザルをＢ７抗原、Ｂ７.１抗原および／またはＢ７.２抗原、好ましく はその可溶性形態で、これら抗原に対する抗体が産生される条件下にて免疫する であろう。好ましくは、可溶性のヒトＢ７抗原、Ｂ７.１抗原またはＢ７.２抗原 をアジュバント、たとえばフロントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、アルミニウ ム、サポニンまたは他の公知のアジュバント並びにそれらの組み合わせとともに 投与されるであろう。一般に、これには、たとえば繰り返し注射することにより 数カ月にわたって繰り返し免疫することが必要であろう。たとえば、可溶性のＢ ７.１抗原の投与をアジュバント中でブースター免疫とともに３〜４カ月間行い 、ヒトＢ７.１抗原に結合する抗体を含む血清を生成した。 免疫後、Ｂ細胞をたとえば免疫動物からリンパ節生検を採取することにより回 収し、ポリエチレングリコールを用いてＢ細胞をＫＨ６／Ｂ５（マウス×ヒト） ヘテロハイブリドーマと融合させる。かかるヘテロハイブリドーマの作成方法は 知られており、１９９５年１月２５日に出願されたニューマンらの米国特許出願 第０８／３７９,０７２号（参照のため本明細書中に引用する）に記載されてい る。 ついで、ヒトＢ７、Ｂ７.１および／またはＢ７.２に結合する抗体を分泌する ヘテロハイブリドーマを同定する。このことは公知技術により行うことができる 。 たとえば、このことは酵素または放射性核種で標識したヒトＢ７、Ｂ７.１およ び／またはＢ７.２を用いたＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイにより決定 することができる。 ついで、ヒトＢ７、Ｂ７.１および／またはＢ７.２抗原に対する所望の特異性 を有する抗体を分泌する細胞株をサブクローニングしてモノクローナル化する。 本発明においては、本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける可溶性Ｂ７. １抗原コーティングプレート、抗原陽性Ｂ７.１細胞、および細胞表面上にヒト Ｂ７.１抗原を発現するＣＨＯトランスフェクタントに結合する能力について精 製抗体をスクリーニングした。さらに、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＩ Ｌ−２産生およびトリチウム化チミジンの取り込みにより測定されるように（Ｂ ７結合は¹²⁵Ｉ放射性標識した可溶性Ｂ７.１（ＳＢ７.１）を用いて検出）、Ｂ 細胞／Ｔ細胞相互作用を阻止する能力について抗体をスクリーニングした。 また、マカークザルからのアフィニティー精製した抗体を、Ｂ７.１／Ｉｇ融 合タンパク質を発現するＣＨＯトランスフェクタントに対する反応性、およびヒ トＢ７.２抗原を産生するＣＨＯ細胞に対する反応性について試験した。これら 結果は、Ｂ７.１免疫血清がＢ７.２トランスフェクトーマに結合することを示し た。Ｂ７.２抗原への抗体の結合は、可溶性のＢ７.２−Ｉｇ試薬を用いて確認す ることができる。実施例に記載するように、このことは、Ｂ７.２−Ｉｇ−セフ ァロースアフィニティーカラムを調製するのに充分な量でＢ７.２−ＩｇをＣＨ Ｏトランスフェクトーマから調製および精製することにより行う。Ｂ７.２に交 差反応する抗体はＢ７.２−Ｉｇ−セファロースカラムに結合するであろう。 ついで、ヒトＢ７抗原、Ｂ７.１抗原および／またはＢ７.２抗原に特異的に結 合する抗体を発現する細胞株を用い、本質的にニューマンら（１９９２）、上掲 、および１９９５年１月２５日に出願されたニューマンらの米国特許出願第０８ ／３７９,０７２号（ともに参照のため本明細書中に引用する）に記載されたよ うにして霊長類化抗体を作成するために可変ドメイン配列をクローニングする。 本質的に、このことには、該細胞株からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、お よびＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅が含まれる。適当なプライ マーは、ニューマンら（１９９２）、上掲、および米国特許出願第０８／３７９ ，０７２号明細書（とりわけ、米国特許出願第０８／３７９，０７２号の図１を 参照）に記載されている。 ついで、クローニングしたサル可変遺伝子を、ヒト重鎖および軽鎖定常領域遺 伝子を含む発現ベクター中に挿入する。好ましくは、このことはIDEC,Inc.の特 許発現ベクターであるＮＥＯＳＰＬＡを用いて行う。このベクターは図２に示し てあり、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン 主要プロモーター、ＳＶ４０の複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列 、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ヒト免 疫グロブリンκまたはλ定常領域、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、ヒト免疫 グロブリンγ１またはγ４ＰＥ定常領域およびリーダー配列を含む。このベクタ ーは、サル可変領域遺伝子の導入、ＣＨＯ細胞中でのトランスフェクション、つ いでＧ４１８含有培地中での選択およびメトトレキセート増幅の後に非常に高レ ベルの霊長類化抗体が発現されることがわかった。 たとえば、この発現系は、これまでにＣＤ４その他のヒト細胞表面受容体に対 して高い結合活性（Ｋｄ≦１０^-10Ｍ）を有する霊長類化抗体が得られることが 開示されている。さらに、これら抗体は、もともとのサル抗体と同じ親和性、特 異性および機能的活性を示すことがわかっている。このベクター系は、本願と同 じ出願人に係る米国特許出願第３７９，０７２号（参照のため本明細書中に引用 する）、および１９９３年１１月３日に出願された米国特許出願第０８／１４９ ，０９９号（参照のためその全体を本明細書中に引用する）に実質的に開示され ている。この系は高発現レベル、すなわち＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。 以下に記載するように、本発明者らは、Ｂ７.１抗原に特異的に結合する４つ の先導（lead）候補サルモノクローナル抗体を選択した。これらサルモノクロー ナル抗体は、本明細書において７Ｂ６、１６Ｃ１０、７Ｃ１０および２０Ｃ９と 称する。 以下にさらに詳細に記載するように、これら抗体を、Ｔ細胞結合についてのＴ 細胞結合実験のための混合リンパ球反応中でのＩＬ−２産生およびトリチル化チ ミジンの取り込みによって測定されるように、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用を阻止す る能力について評価し、ヒト体コート（human body coat）末梢血リンパ球をＰ ＨＡ刺激物質の存在下で３〜６日間培養した。Ｂ７結合を¹²⁵Ｉ−放射性標識し た可溶性Ｂ７.１を用いてラジオアッセイした。観察した結果は、減少したＩＬ −２産生および混合リンパ球培養の減少した増殖により示されるように、これら す ベての抗体がＢ７.１抗原と高い親和性にて結合し、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用を 有効に阻止することを示す。 これら特定のサルモノクローナル抗体の特性は、まとめると以下のとおりであ る。 １．スキャッチャード分析は、Ｂ７−Ｉｇコーティングプレートヘ結合するサ ル抗体のみかけの親和性定数（Ｋｄ）がおよそ以下のとおりであることを示した ： ａ：７Ｃ１０： ６.２ × １０^-9Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ８.１ × １０^-9Ｍ ｃ：７Ｂ６： １０.７ × １０^-9Ｍ ｄ：２０Ｃ９： １０.８ × １０^-9Ｍ ２．抗体を混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）においてインビトロで試験し た。ＭＬＲは、４つのすべての抗Ｂ７.１抗体が下記ＩＣ₅₀値に示されように異 なる程度にＩＬ−２産生を阻害することを示した： ａ：７Ｂ６： ５.０μｇ／Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ＜０.１μｇ／Ｍ ｃ：２０Ｃ９： ２.０μｇ／Ｍ ｄ：７Ｃ１０： ５.０μｇ／Ｍ ３．サル抗Ｂ７.１抗体を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）上のＢ７に結合す る能力について試験した。ＦＡＣＳ分析は、４つのすべてのサル抗体が陽性であ ることを示した。 ４．サル抗体１６Ｃ１０、７Ｂ６、７Ｃ１０および２０Ｃ９をＦＡＣＳ分析に よりＣ１ｑ結合について試験した。その結果は、Ｂ７.１ ＣＨＯトランスフェク ション細胞とともにインキュベートした後に７Ｃ１０サルＩｇが強いヒトＣ１ｑ 結合を有することを示した。１６Ｃ１０は陽性であったが、２０Ｃ９および７Ｂ ６サル抗体は陰性であった。 ５．病理−毒性（path-tox）研究のための動物モデルを選択するため、異なる 種からの動物血でサル抗体を試験した。サル抗Ｂ７.１抗体は、ヒト、チンパン ジーと交差反応した。 これら特性に基づき、３つのサルモノクローナル抗体、１６Ｃ１０、７Ｃ１０ および２０Ｃ９が最も有利な特性を備えていると思われ、そのうちでも１６Ｃ１ ０および７Ｃ１０は２０Ｃ９に比べて若干優れていた。 上記技術および本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９，０７２ 号に開示された技術を用い、本発明者らは７Ｃ１０、７Ｂ６および１６Ｃ１０の 可変ドメインをクローニングし、７Ｃ１０軽鎖、７Ｃ１０重鎖、７Ｂ６軽鎖、７ Ｂ６重鎖、１６Ｃ１０軽鎖および１６Ｃ１０重鎖の霊長類化形態のアミノ酸配列 および核酸配列を提供する。これらアミノ酸配列および核酸配列は、図８ａおよ び８ｂ、９ａおよび９ｂ、および１０ａおよび１０ｂに示されている。ヒトガン マ１定常ドオインのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は米国特許出願第０８／３７ ９,０７２号に記載されている。 上記に記載したように、これら霊長類化抗体は図２に示したＮＥＯＳＰＬＡ発 現ベクター（実質的に、本願と同じ出願人に係る米国特許出願第０８／３７９， ０７２号および０８／１４９，０９９号（両出願を参照のため本明細書中に引用 する）に記載されている）を用いて発現させるのが好ましい。 上記で記載したように、本発明の霊長類化抗体はヒト免疫グロブリンガンマ１ またはガンマ４定常領域のいずれかを含むのが好ましく、ガンマ４は２つの位置 にて突然変異させてガンマ４ＰＥを作成するのが好ましいであろう。このガンマ ４ＰＥ変異体は２つの変異、すなわち残留ＦＣＲ結合を排除するために導入した ＣＨ２領域中のグルタミン酸、および重鎖ジスルフィド結合相互作用の安定性を 増大させることを意図したヒンジ領域におけるプロリン置換を含んでいる［アレ グル（Alegre）ら、J.Immunol.、１４８、３４６１〜３４６８（１９９２）；お よびエンジェル（Angel）ら、Mol.Immunol.、３０、１０５〜１５８（１９９３ ）；ともに参照のため本明細書中に引用する］。 本発明の霊長類化抗体がガンマ１、ガンマ４またはガンマ４ＰＥ定常領域のい ずれを含むかは、特定の疾患標的にほぼ依存する。好ましくは、枯渇および非枯 渇霊長類化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体を作成し、特定の疾患標的に対して試験 する。 本発明のサルモノクローナル抗体が上記結合特性および機能的特性を有すると するなら、これら抗Ｂ７.１モノクローナル抗体およびその霊長類化形態はＢ７ ：ＣＤ２８相互作用を阻止するための治療剤として充分に適しているに違いなく 、かくして免疫抑制剤が提供される。とりわけ、混合リンパ球培養におけるＩＬ −２産生およびトリチウム化チミジンの取り込みによって測定されるようなＢ７ .１抗原への高親和性およびＢ細胞／Ｔ細胞相互作用を阻止する能力、並びに減 少した抗原特異的ＩｇＧ応答、ＩＬ−２産生および細胞増殖によって示されるよ うなドナー牌臓細胞培養において抗原誘発応答を有効に抑制する能力を有すると するなら、これらサルモノクローナル抗体およびその霊長類化形態はＢ７：ＣＤ ２８経路を調節する有効な免疫抑制剤として機能するに違いない。このことは、 免疫抑制が治療学上望ましい多くの疾患、たとえば自己免疫疾患を治療するため 、望ましくない抗原特異的ＩｇＧ応答を抑制するため、および臓器移植拒絶およ び移植片対宿主病を防ぐために重要である。本質的に、本発明の抗体は、Ｂ７： ＣＤ２８経路の抑制が治療学上望ましいあらゆる疾患を治療するうえで有用であ ろう。 本発明の抗Ｂ７.１抗体の重要な治療適応症としては、例として、特発性血小 板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、 多発性硬化症、再生不能性貧血、乾癖、アレルギー、炎症性胆汁疾患および慢性 関節リウマチなどの自己免疫疾患が挙げられる。 本発明の抗Ｂ７.１抗体の他の治療適応症は、臓器移植および骨髄移植（ＢＭ Ｔ）の際の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防ぐことである。本発明の抗体は、ド ナー特異的な同種抗原に対する宿主寛容を誘発し、それによって移植を容易にし 、移植拒絶の発生を低減するのに用いることができる。同種抗原心臓移植のマウ スモデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの静脈内投与が免疫抑制あるいは同種抗原 に対する寛容の誘発とさえなりうることが示されている［リン（Lin）ら、J.Exp .Med .１７８］１８０１、１９９３；トルカ（Torka）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 、８９：１１１０２、１９９２］。本発明の霊長類化抗Ｂ７.１抗体は同様ま たはそれ以上の活性を示すであろうことが期待される。 上記方法によりまたは同等の技術により産生した抗体は、機能的生物学的アッ セイにおいて特徴付けるためにアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除 クロマトグラフィーとの組み合わせにより精製することができる。これらアッセ イには、特異性および結合親和性の決定並びに発現されたイソ型に伴うエフェク ター機能、たとえばＡＤＣＣ、または補体固定化が含まれる。かかる抗体は、多 くのヒト疾患、たとえば、Ｂ細胞リンパ腫、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどのウイルス性 疾患を含む感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植に対する受動およ び能動治療剤として用いることができる。これら抗体は、その天然型か、または 抗体／キレート複合体、抗体／薬剤複合体もしくは抗体／毒素複合体の一部とし て用いることができる。さらに、全抗体または抗体フラグメント（Ｆａｂ₂、Ｆ ａｂ、Ｆｖ）を造影試薬として、または抗イディオタイプ応答を生成するための 能動免疫療法における潜在的なワクチンまたは免疫原として用いることができる 。 治療効果を得るのに有用な抗体の量は、当業者によく知られた標準法により決 定することができる。これら抗体は一般に、標準法により薬理学的に許容しうる 緩衝液中にて提供され、所望の経路にて投与できる。本願の請求に係る抗体の有 効性およびヒトによる寛容のため、ヒトにおける種々の疾患または疾患状態を治 療するためにこれら抗体を繰り返し投与することが可能である。 本発明の抗Ｂ７.１抗体（またはそのフラグメント）は、免疫抑制を誘発する のに、すなわちヒトまたは動物の免疫系の抑制を誘発するのに有用である。それ ゆえ、本発明は、本発明の抗体の有効な非毒性量を免疫抑制を必要とするヒトそ の他の動物に投与することによる、かかるヒトその他の動物において免疫抑制を 予防的または治療的に誘発する方法に関する。 本発明の化合物が免疫抑制を誘発する能力は、この目的のために使用される標 準的な試験、たとえば、混合リンパ球反応試験またはチミジンの取り込みにより 測定されるＴ細胞増殖の抑制を測定する試験で示される。 本発明の抗体が免疫抑制を誘発するうえで有用性を有するという事実は、本発 明の抗体が移植臓器または組織（たとえば、腎臓、心臓、肺、骨髄、皮膚、角膜 など）に対する抵抗または拒絶の治療または予防；自己免疫疾患、炎症疾患、増 殖性および過増殖性疾患、および免疫学的に媒体された疾患の皮膚症状（たとえ ば、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、橋本甲状 腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖尿病、ぶどう膜炎、ネフローゼ症候 群、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、およびさらなる（further）湿疹性 皮膚炎、脂漏性皮膚炎、偏平苔せん、天疱瘡、水泡性天疱瘡、表皮水泡症、蕁麻 疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症など）の治療また は予防；可逆性閉塞性気道疾患（reversible obstructive airways disease）、 胃腸炎症およびアレルギー（たとえば、炎症性胆汁疾患、小児脂肪便症、直腸炎 、好酸球増加性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病および潰瘍性大腸炎）、食物関 連アレルギー（たとえば、偏頭痛、鼻炎および湿疹）および他のタイプのアレル ギーの治療に有用であるに違いないことを示している。 当業者であれば日常的な実験により、免疫抑制を誘発する目的のための抗体の 有効かつ非毒性の量を決定できるであろう。しかしながら、一般に、有効投与量 は１日当たり体重１ｋｇ当たり約０.０５〜１００ｍｇの範囲であろう。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）はまた、哺乳動物において腫瘍を治 療するうえでも有用であるに違いない。一層詳しくは、本発明の抗体は、腫瘍の サイズを小さくし、腫瘍の増殖を抑制し、および／または腫瘍を有する動物の生 存時間を延ばすのに有用であるに違いない。さらに、本発明はまた、ヒトその他 の動物に有効かつ非毒性量の抗体を投与することによるヒトその他の動物におけ る腫瘍の治療方法にも関する。当業者であれば日常的な実験により、発癌性腫瘍 を治療する目的のための抗Ｂ７抗体の有効かつ非毒性の量を決定できるであろう 。しかしながら、一般に、有効投与量は１日当たり体重１ｋｇ当たり約０.０５ 〜１００ｍｇの範囲であることが期待される。 本発明の抗体は、上記治療方法に従い、治療または予防効果が期待できる程度 に充分な量にてヒトその他の動物に投与することができる。かかる本発明の抗体 は、公知技術に従って本発明の抗体を通常の薬理学的に許容しうる担体または希 釈液と混合することにより調製した通常の剤型にて、かかるヒトその他の動物に 投与することができる。当業者であれば薬理学的に許容しる担体または希釈液の 形態および特性が、混合する活性成分の量、投与経路および他のよく知られた変 量によって決定されることが認識されるであろう。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）の投与経路は、経口、非経口、吸入 または局所投与であってよい。本明細書において用いる非経口なる術語は、静脈 内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内または膣内投与を含む。皮下および筋肉内形 態の非経口投与が一般に好ましい。 本発明の化合物を予防的または治療的に免疫抑制を誘発するためまたは発癌性 腫瘍を治療するために用いる際の毎日の非経口および経口投与計画は、一般に１ 日当たり体重１ｋｇ当たり約０.０５〜１００ｍｇの範囲だが、約０.５〜１０ｍ ｇの範囲であるのが好ましいであろう。 本発明の抗体はまた吸入によっても投与することができる。「吸入」とは鼻内 および経口吸入投与を意味する。かかる投与に適した剤型、たとえばエアロゾル 製剤や定量吸入器（metered dose inhaler）などは通常の技術により製造できる 。 本発明の化合物の好ましい投与量は、一般に約１０〜１００ｍｇの範囲である。 本発明の抗体はまた、局所投与することもできる。局所投与とは非全身投与を いい、本発明の抗体（またはそのフラグメント）化合物を表皮や頬面窩洞に外用 したり、かかる抗体を眼、耳および鼻や血流に実質的に浸入しない場所に点滴注 入することを含む。全身投与とは、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意 味する。治療または予防効果を得るのに必要な抗体の量は、もちろん、選択した 抗体、治療しようとする状態の性質および重篤度および治療を受ける動物により 変わるであろうが、最終的には医師の裁量による。本発明の抗体の局所投与の適 当な投与量は、一般に１日当たり体重１ｋｇ当たり約１〜１００ｍｇの範囲であ ろう。製剤 本発明の抗体またはそのフラグメントは単独でも投与することが可能であるが 、医薬製剤として投与することが好ましい。活性成分は、局所投与の場合、医薬 製剤の０.００１〜１０％ｗ／ｗ、たとえば１重量％〜２重量％を構成してよい が、１０％ｗ／ｗを構成してもよく、好ましくは医薬製剤の５％ｗ／ｗを越えな い量、さらに好ましくは０.１〜１％ｗ／ｗである。 本発明の局所製剤は、活性成分を１またはそれ以上の許容しうる担体および任 意の他の治療成分とともに含む。担体は、製剤の他の成分と適合し、適用者に有 害でないという意味で「許容しうる」ものでなければならない。 局所投与に適した製剤としては、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、 軟膏またはパスタ剤などの治療が必要な部位へ皮膚を通して浸透していくのに適 した液状または半液状の製剤、および眼、耳または鼻に投与するのに適した滴剤 が含まれる。 本発明による滴剤は滅菌した水性または油性の溶液または懸濁液を含み、殺菌 剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水溶液（好 ましくは表面活性剤を含む）中に活性成分を溶解することにより調製できる。つ いで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、ついでこれを密 封し、９０〜１００℃にて半時間オートクレーブまたは維持することにより滅菌 する。別法として、溶液を濾過により滅菌し、無菌技術により容器に移す。滴剤 中に含めるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢 酸フェニル水銀（０.００２％）、塩化ベンザルコニウム（０.０１％）および酢 酸クロルヘキシジン（０.０１％）である。油性溶液を調製するのに適した溶媒 には、グリセリン、希アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。 本発明によるローション剤には、皮膚または眼に適用するのに適したものが含 まれる。眼用ローション剤は、任意に殺菌剤を含む滅菌水溶液を含み、滴剤の調 製と同様の方法により調製できる。皮膚に適用するローション剤またはリニメン ト剤はまた、アルコールやアセトンなどの乾燥促進剤や皮膚冷却剤、および／ま たはグリセリンなどの加湿剤またはヒマシ油や落花生油などの油をも含む。 本発明によるクリーム剤、軟膏またはパスタ剤は、活性成分の外用のための半 固形製剤である。これら製剤は、微細に粉砕したまたは粉末形態の活性成分を単 独で、または水性もしくは非水性流体中の溶液または懸濁液中にて、適当な機械 の助けを借りて脂肪性（greasy）または非脂肪性（non−greasy）基剤を用いて 混合することにより調製できる。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィンまたは 流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属石鹸などの炭水化物；粘漿薬；扁桃油 、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然起源の油； 羊毛脂もしくはその誘導体、またはステアリン酸やオレイン酸などの脂肪酸をプ ロピレングリコールやマクロゴールなどのアルコールとともに含む。製剤は、陰 イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤などの適当な界面活性剤、た とえば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などを含んで い てよい。天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質（シリカ（silicaceous si licas）などの懸濁化剤、およびラノリンなどの他の成分も含まれていてよい。 本発明の抗Ｂ７.１抗体またはそのフラグメントはまた、Ｂ７：ＣＤ２８経路 を調節する他の分子（moieties）とともに投与することもできる。かかる分子と しては、その例として、ＩＬ−７やＩＬ−１０などのサイトカイン、ＣＴＬＡ４ −Ｉｇ、可溶性ＣＴＬＡ４および抗ＣＤ２８抗体およびそのフラグメントが挙げ られる。本発明の抗体はまた、他の免疫抑制剤と併用して投与することができる 。 かかる免疫抑制剤としては、サイクロスポリンＡ（ＣＳＡ）およびＦＫ５０６な どの小さな分子；抗腫瘍壊死因子ａ（抗ＴＮＦａ）、抗ＣＤ５４、抗ＣＤ１１、 抗ＣＤ１１ａ、および抗ＩＬ−１などのモノクローナル抗体；および ｒＴＮＦ ａおよびｒＩＬ−１などの他の可溶性受容体が挙げられる。 当業者には、本発明の抗体またはそのフラグメントの個々の投与量の最適量お よび期間（spacing）が治療しようとする状態の性質および程度、投与の形態、 経路および部位、および治療しようとする特定の動物により決定されるであろう こと、およびかかる最適量が通常の技術により決定されうることが認識されるで あろう。当業者にはまた、治療の最適コース、すなわち所定日数の間の１日当た りに投与する本発明の抗体またはそのフラグメントの投与の回数が治療決定試験 （treatment determination tests）の通常のコースを用いて当業者により評価 されうることも認識されるであろう。 さらに詳述するまでもなく、当業者であれば上記の記載を用いて本発明を最大 限に活用することができると思われる。それゆえ、以下に記載する製剤例は例示 的な態様を示すのであって、本発明の範囲をいかなる意味においても限定するこ とを意図するものではない。カプセル組成物 カプセル剤の形態の本発明の医薬組成物は、標準的な２片（two-piece）ハー ドゼラチンカプセルに粉末形態の本発明の抗体またはそのフラグメント（５０ｍ ｇ）、乳糖（１００ｍｇ）、タルク（３２ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウ ム（８ｍｇ）を充填することにより調製する。注射可能な非経口組成物 注射により投与するのに適した形態の本発明の医薬組成物は、本発明の抗体ま たはそのフラグメント（１.５重量％）を１０容量％のプロピレングリコールお よび水の中で撹拌することにより調製する。この溶液を濾過滅菌する。軟膏組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを１.０ｇ 白色軟パラフィンを１００.０ｇまで。 本発明の抗体またはそのフラグメントを少量のビヒクル中に分散させて滑らか な均一な生成物を得る。ついで、この分散液を折り畳み式金属チューブに充填す る。局所クリーム組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを１.０ｇ ポラワックスＧＰ２００を２０.０ｇ 無水ラノリンを２.０ｇ 白色蜜蝋を２.５ｇ ヒドロキシ安息香酸メチルを０.１ｇ 蒸留水を１００.０ｇまで。 ポラワックス、蜜蝋およびラノリンをいっしょに６０℃で加熱する。ヒドロキ シ安息香酸メチルの溶液を加え、高速で撹拌して均一な溶液とする。ついで、温 度を５０℃まで下げる。ついで、本発明の抗体またはそのフラグメントを加え、 充分に分散させ、ゆっくりとした速度で撹拌して組成物を冷却する。局所ローション組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを１.０ｇ ソルビタンモノラウレートを０.６ｇ ポリソルベート２０を０.６ｇ セトステアリルアルコールを１.２ｇ グリセリンを６.０ｇ ヒドロキシ安息香酸メチルを０.２ｇ 精製水Ｂ.Ｐ.を１００−００ｍｌ（Ｂ.Ｐ.＝英国薬局方）。 ヒドロキシ安息香酸メチルおよびグリセリンを７５℃の水（７０ｍｌ）中に溶 解する。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート２０およびセトステアリル アルコールをいっしょに７５℃で溶融し、上記水溶液に加える。得られた乳濁液 をホモジナイズし、連続撹拌しながら冷却させ、本発明の抗体またはそのフラグ メントを残りの水中の懸濁液として加える。全懸濁液をホモジナイズされるまで 攪拌する。点眼組成物 本発明の抗体またはそのフラグメントを０.５ｇ ヒドロキシ安息香酸メチルを０.０１ｇ ヒドロキシ安息香酸プロピルを０.０４ｇ 精製水Ｂ.Ｐ.を１００−００ｍｌ ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルを７０ｍｌの精 製水中に７５℃にて溶解し、得られた溶液を冷却した。っいで、本発明の抗体ま たはそのフラグメントを加え、溶液をメンブランフィルター（０.０２２μｍの 孔径）で濾過して滅菌し、適当な滅菌容器中に滅菌充填する。吸入投与のための組成物 １５〜２０ｍｌ容のエアロゾル容器用： １０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを０.２〜０.５％の滑沢剤、 たとえばポリソルベート８５またはオレイン酸と混合し、ついで該混合物を好ま しくは（１,２ジクロロテトラフルオロエタン）とジフルオロクロロメタンとの 組み合わせ中でフレオン等のプロペラント中に分散させ、鼻内かまたは口内投与 のいずれかに適合させた適当なエアロゾル容器中に入れる。吸入投与のための組成物 １５〜２０ｍｌ容のエアロゾル容器用： 本発明の抗体またはそのフラグメント（１０ｍｇ）をエタノール（６〜８ｍｌ ）中に溶解し、ポリソルベート８５またはオレイン酸などの滑沢剤（０.１−０. ２％）を加え、このものをフレオン（好ましくは（１，２ジクロロテトラフルオ ロエタン）とジフルオロクロロメタンとの組み合わせ）などのプロペラント中に 分散し、鼻内かまたは経口吸入投与に適合させた適当なエアロゾル容器中に入れ る。 本発明の抗体および医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内または 静脈内投与に特に有用である。非経口投与用の組成物は一般に、許容しうる担体 、好ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体またはそのフラグメントまたは その組み合わせの溶液を含むであろう。種々の水性担体、たとえば、水、緩衝水 溶液、０.４％食塩水、０.３％グリシンなどを用いることができる。これらの溶 液は滅菌してあり、一般に粒状物質を含まない。これら溶液は、通常のよく知ら れた滅菌法により滅菌することができる。本発明の組成物は、ｐＨ調節剤や緩衝 剤など、適当な生理条件に必要とされる薬理学的に許容可能な補助物質を含んで いてよい。かかる医薬組成物中の本発明の抗体またはフラグメントの濃度は広範 囲に変わりうる、すなわち約０.５重量％未満、通常少なくとも約１重量％から １５または２０重量％までであってよく、選択した特定の投与方法に従って主と して流体容量、粘度などに基づいて選択されるであろう。 それゆえ、本発明の筋肉内投与用医薬組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水溶液およ び５０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを含むように調製できる。同 様に、本発明の静脈内投与用医薬組成物は、２５０ｍｌまでの滅菌リンゲル溶液 および１５０ｍｇの本発明の抗体またはそのフラグメントを含むように調製でき る。非経口投与可能な組成物の実際の調製法は当業者によく知られているかまた は当業者には明らかであり、たとえば、レミントンズ・ファーマシューティカル ・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）、第１５版、マック・パ ブリシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン、ペンシル ベニア（参照のため本明細書中に引用する）に一層詳細に記載されている。 本発明の抗体（またはそのフラグメント）は貯蔵のために凍結乾燥し、使用前 に適当な担体中で再構成することができる。この技術は通常の免疫グロブリンに おいて有効であることが示されており、技術分野で公知の凍結乾燥および再構成 法を用いることができる。 本発明の医薬組成物は、意図する結果に依存して予防および／または治療のた めに投与することができる。治療の目的で適用する場合には、すでに疾患を患っ ている患者に該疾患およびその合併症を治癒もしくは少なくとも部分的に寛解さ せるに充分な量の組成物を投与する。予防の目的で適用する場合には、未だ疾患 状態にない患者に本発明の抗体またはその混合物を含む組成物を投与して患者の 耐性を高める。 本発明の医薬組成物の単回投与または多回投与を、治療にあたった医師により 選択された投与量レベルおよびパターンにて行うことができる。いずれの場合に おいても、本発明の医薬組成物は患者を有効に治療するのに充分な所定量の本発 明の改変抗体（またはそのフラグメント）を提供できなくてはならない。 本発明の抗体はまた、該抗体と同じ療法において有用なペプチド性かまたは非 ペプチド性の化合物（模倣物）の設計および合成に用いることができる［たとえ ば、サラゴビ（Saragovi）ら、Science、２５３、７９２〜７９５（１９９１） を参照］。 本発明をさらに説明するため、下記実施例を記載する。これら実施例は本発明 を限定することを意図するものではない。 実施例１ 繊維状ファージの表面上に提示された組換え免疫グロブリンライブラリーは、 マッカファーティー（McCafferty）ら、Nature、３４８：５５２〜５５４、１９ ９０およびバーバス（Barbas）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８：７９７８〜 ７９８２、１９９１に最初に記載された。この技術を用い、高親和性抗体を免疫 ヒト組換えライブラリーから単離した［バーバスら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ５８９：１０１６４〜１０１６８、１９９２］。本発明で使用したファージ提示 の概念はバーバス（１９９１、上掲）によって記載されたものと実質的に同じで あるが、組換えの可能性を低減し安定性を改善するため、サルライブラリーの独 特のベクターを代用することにより該技術を修飾した。このベクター、ｐＭＳ（ 図１）は、ポリシストロン性の重鎖および軽鎖サルＤＮＡの効率的な転写および 翻訳のための単一のｌａｃプロモーター／オペレーターを含む。このベクターは 、２つの異なるリーダー配列、すなわち、軽鎖のためのｏｍｐＡ［モッバ（Movv a）ら、J.Biol.Chem.、２５５：２７〜２９（１９８０）］および重鎖Ｆｄのた めのｐｅｌＢ［レイ（Lei）ら、J.Bact.、４３７９〜１０９：４３８３（１９８ ７）］を含む。両リーダー配列は、重鎖お よび軽鎖クローニング生成物の細胞周辺腔への分泌を指令する疎水性のシグナル ペプチドに翻訳される。ペリプラスムの酸化的環境中では、これら２つの鎖は折 り畳まれ、ジスルフィド結合を生成して安定なＦａｂフラグメントを形成する。 本発明者らは、このベクターの骨格をファージミドであるbluescript（ストラタ ジーン、ラジョラ、カリフォルニア）から得た。それは、ｐＭＳ ＤＮＡを含む 細菌にアンピシリン（カルベニシリン）耐性を付与する酵素β−ラクタマーゼの 遺伝子を含む。本発明者らはまた、マルチコピープラスミドＣｏｌＥ１の複製起 点および繊維状バクテリオファージｆ１の複製起点をbluescriptから得た。ファ ージｆ１の複製起点（いわゆる遺伝子内領域）は、一本鎖ｐＭＳ ＤＮＡの合成 の開始、カプシド形成の開始およびウイルス酵素によるＲＮＡ合成の終止を指令 する。ｐＭＳ ＤＮＡ鎖の複製およびファージ粒子への組み立てには、ヘルパー ファージによって提供されなければならないウイルスタンパク質を必要とする。 本発明者らはヘルパーファージＶＣＳＭ１３を用いたが、これはカナマイシン耐 性をコードする遺伝子をも含んでいるため特にこの目的に適している。ＶＣＳＭ １３およびｐＭＳが感染した細菌は、増殖培地にカナマイシンおよびカルベニシ リンの両者を加えることにより選択できる。これら細菌は、最終的にｐＭＳゲノ ムかまたはＶＣＳＭ１３ゲノムのいずれかを含有する繊維状ファージ粒子を生成 するであろう。ヘルパーファージのパッケージングはｐＭＳのパッケージングに 比べて効率が悪く、その結果、組換えｐＭＳファージを優勢に含む混合ファージ 集団が得られる。このファージの両末端は各末端に特異的なマイナーコートタン パク質を拾い上げる（pick up）。本発明において特に興味深いのは、該ファー ジの一端に５コピーのうち３コピー中に存在する遺伝子III生成物である。この 遺伝子III生成物は４０６アミノ酸残基からなり、Ｆ線毛を介した大腸菌のファ ージ感染に必要である。重鎖の最初の２つのドメイン、すなわち可変ドメインお よびＣＨ１ドメインは遺伝子IIIタンパク質のカルボキシ末端半分に融合してい る。この組換え線毛タンパク質（ｐｅｌＢリーダーにより指令される）はペリプ ラスムに分泌され、そこで蓄積し、ファージのコート中に組み込まれる前に軽鎖 とジスルフィド結合を生成する。また、他のベクターは遺伝子IIIの下流に組み 込んだＦＬＡＧ配列を含む。このＦＬＡＧは、Ｆｄタンパク質のカルボキシ末 端にて発現される８アミノ酸ペプチドである。本発明者らは、ファージＦａｂの 精製およびＥＬＩＳＡによる検出の両目的のために市販のモノクローナル抗ＦＬ ＡＧ Ｍ２を用いている［ブリザード（Brizzard）、Bio Technology、１６（４ ）：７３０−７３１（１９９４）］。 ベクターｐＭＳを構築した後、本発明者らは該ベクターがファージ結合Ｆａｂ を産生する能力について対照の抗体遺伝子を用いて試験した。本発明者らは抗破 傷風毒素抗体（カルロス・バーバス（Carlos Barbas）博士より入手）をｐＭＳ 中にクローニングし、ＸＬＩ−blueを形質転換した。本発明者らはＶＣＳＭ１３ および得られた抗破傷風毒素抗体を提示するファージで本発明者らの細胞を同時 感染させた。本発明者らは効率実験を行い、その際、抗破傷風毒素ファージを関 連のない抗体を結合した（beading）ファージと１：１００,０００にて組み合わ せた。本発明者らは、混合ファージ（５０μｌ）を抗原（破傷風毒素）コーティ ングポリスチレンウエルに適用することにより３回のえり分けを行った。接着し なかったファージは洗い落とし、接着したファージは酸で溶出した。溶出したフ ァージを用いてＸＬ１−Blue細菌の新たなアリコートを感染させ、ヘルパーファ ージを加えた。一夜増幅させた後、ファージを調製し、抗原をコーティングした プレート上で再びえり分けた。３回のえり分けの後、本発明者らは抗破傷風毒素 ファージに首尾よく富むことを示すことができた。この技術が首尾よくいくかど うかはまた、最終のえり分け生成物の特徴付けのために可溶性のＦａｂを調製す る能力にも依存する。このことは、制限酵素ＮｈｅＩを用いてｐＭＳ ＤＮＡか ら遺伝子IIIを切り出し、ついで再ライゲートすることにより行った。遺伝子III を切り出した後はＦａｂはもはやファージ表面上には提示されず、細胞周辺腔中 に蓄積した。可溶性のＦａｂを発現する細菌から溶解液を調製し、ＥＬＩＳＡを 用いて抗原特異性を試験した。高レベルの可溶性Ｆａｂが検出された。 ファージ提示法をマカークザルライブラリーに使用するため、本発明者らはサ ル免疫グロブリン遺伝子のＰＣＲ増幅のために特別のプライマーを開発した。こ れらプライマーは、霊長類化（PRIMATIZED^TM）抗体法（米国特許出願第０８／３ ７９,０７２号を参照；参照のため本明細書中に引用する）を開発する際に本発 明者らが得たマカークザル配列およびヒト配列を含むデータベース（カバット （Kabat）ら（１９９１）、「免疫学的に興味のあるタンパク質の配列」、U.S.D ept．of Health and Human Services、National Institute of Health）に基づ いていた。 本発明者らは、マカークザルの範囲（repertoire）の増幅をカバーするために ３セットのプライマーを開発した。本発明者らの第一のプライマーのセットは、 重鎖のＶＨおよびＣＨ１（Ｆｄ）ドメインの増幅のために設計したものであった 。 それは、３'ＣＨ１ドメインプライマーおよびフレームワーク１領域に結合する ６つの５'ＶＨファミリー特異的プライマーからなっていた。本発明者らの第二 のプライマーのセットは全ラムダ鎖を増幅するためのものであり、多くのラムダ 鎖サブグループをカバーしている。それは、３'プライマーおよびＶＬフレーム ワーク１領域に結合する３つの５'縮重プライマーからなっている。本発明者ら の第三のプライマーのセットは、カッパ鎖サブグループの増幅のために設計した ものであった。それは、３'プライマーおよび５つのＶＫフレームワーク１プラ イマーからなる。これら各セットのプライマーを用い、ライブラリーのクローニ ングに利用するのに充分な物質を利用できるように各プライマーセットから充分 に強いシグナルを得るべくＰＣＲパラメータを最適化した。本発明者らは最近、 これら最適化ＰＣＲ条件を用いて本発明者らのｐＭＳベクターにおいてマカーク ザル組み合わせ（combinatorial）ライブラリーを作成した。免疫グロブリンＲ ＮＡの採取源として骨髄生検をＣＤ４免疫サルから採取した。これらライブラリ ーは約１０⁶の成員を含んでおり、目下、抗原コーティングウエル上で特異的結 合についてえり分けている。 実施例２ Ｂ７／ＣＴＬＡ−４試薬の開発 本発明者らは、サルの免疫、インビトロでの結合および機能アッセイの開発、 ヘテロハイブリドーマのスクリーニングおよびファージライブラリーのえり分け の目的のために多くの試薬を作成した。表１には各試薬とその意図する目的を掲 げてある。Ｂ７.１の場合には、ＲＮＡをＳＢ細胞から抽出し、逆転写酵素を用 いてｃＤＮＡに変換した。第一鎖のｃＤＮＡをＢ７.１特異的プライマーを用い てＰＣＲ増幅し、ＩＤＥＣのＮＥＯＳＰＬＡ哺乳動物発現ベクター中にクローニ ングした。このＢ７.ＩＮＥＯＳＰＬＡ ＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクシ ョンし、膜結合Ｂ７.１を発現するクローンを同定した。Ｂ７.１融合タンパク質 も同様にして生成したが、ヒトＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン遺伝子を含む ＮＥＯＳＰＬＡカセットベクター中にＰＣＲ増幅Ｂ７.１遺伝子をクローニング した。このＢ７.１／ＩｇＮＥＯＳＰＬＡ ＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換し、Ｂ ７.１／Ｉｇ融合タンパク質を分泌する安定なクローンを増幅した。一般に、Ｂ ７.２およびＣＴＬＡ−４試薬も同様にして生成したが、Ｂ７.２ではＲＮＡを抗 ＩｇおよびＩＬ−４で２４時間刺激したヒト脾臓細胞から単離し、ＣＴＬＡ４構 築物については遺伝子の採取源はＰＨＡ活性化したヒトＴ細胞であった。 表１ 試薬 目的 ＣＨＯ発現 可溶性Ｂ７.１ 免疫、イムノアッセイ 有 Ｂ７.１トランスフェクタント スクリーニング、ＥＬＩＳＡ 有 Ｂ７.１／Ｉｇ融合タンパク質 抑制試験、えり分け 有 Ｂ７.２トランスフェクタント スクリーニング、ＥＬＩＳＡ 有 Ｂ７.２／Ｉｇ融合タンパク質 抑制試験、えり分け 未完 ＣＴＬＡ４トランスフェクタント 抑制試験 未完 ＣＴＬＡ４／Ｉｇ 抑制試験 未完 これら試薬が、Ｂ７.１に対するモノクローナル抗体（Ｌ３０７４）［ベクト ン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、１９９４］、Ｂ７.２に対するモノ クローナル抗体（Ｆｕｎ−１）［エンジェル（Engel）ら、Blood、８４、１４０ ２〜１４０７（１９９４）］およびサルＦａｂフラグメントを検出すべく特別に 開発した精製ヤギおよびウサギ血清とともに利用できることは、所望の特性を有 する抗体の同定を容易にする。 実施例３ ファージ提示ライブラリーの作成 組換えファージ提示ライブラリーをＢ７.１およびＢ７.２免疫サルから作成す る。免疫の７〜１２日後にリンパ節および骨髄生検を採取し、ＲＮＡに富むＢ細 胞および形質細胞を回収する。チョンチンスキー（Chomczynski）により記載さ れた方法［Anal.Biochem.、１６２（１）、１５６〜１５９（１９８７）］を用 い、リンパ球からＲＮＡを単離する。オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を 用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。第一鎖ｃＤＮＡをアリコートに分け、以前 に記載されたカッパ、ラムダ、および重鎖Ｆｄ領域のプライマーセット並びにＰ ｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン、サンジエゴ）かまたはＴａｑポリメラーゼ （プロメガ、マジソン）のいずれかを用い、ＰＣＲ増幅する。重鎖ＰＣＲ増幅生 成物をプールし、Ｘｈｏ ＶＳｐｅＩ制限酵素で切断し、ベクターｐＭＳ中にク ローニングする。その後、軽鎖ＰＣＲ生成物をクローニングし、ＳａｃＩ／Ｘｂ ａＩ制限酵素で切断し、クローニングして組換えライブラリーを作成する。ＸＬ Ｉ−Blue大腸菌を該ライブラリーＤＮＡで形質転換し、ＶＣＳＭ１３で重感染さ せて抗体を提示するファージを生成させる。このライブラリーを、Ｂ７.１抗原 またはＢ７.２抗原をコーティングしたポリスチレンウエル上で４回えり分ける 。各回のえり分けからの個々のファージクローンを分析する。ｐＭＳベクターＤ ＮＡを単離し、遺伝子IIIを切り出す。可溶性のＦａｂフラグメントが生成し、 Ｂ７.１およびＢ７.２への結合についてＥＬＩＳＡで試験する。実施例４ ファージＦａｂフラグメントの特徴付け サルファージＦａｂフラグメントを、その特異性、およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ またはＣＴＬＡ−４トランスフェクション細胞へのＢ７.１−ＩｇおよびＢ７.２ −Ｉｇ結合を阻止する能力について特徴付ける。ファージフラグメントはまた、 高親和性のフラグメントを選択するため、免疫に使用したＢ７種上で４回行った 最初のえり分け後の交差反応性について特徴付けを行う。Ｂ７.１抗原またはＢ ７.２抗原のいずれかをコーティングした表面上で４回えり分けたものから同定 したＦａｂフラグメントを、大腸菌の２４時間発酵培養液中での感染および増殖 によりスケールアップする。フラグメントを、抗ＦＬＡＧアフィニティーカラム へのコダックＦＬＡＧ結合により精製する。精製したファージＦａｂを、西洋ワ サビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗サルＦａｂ抗体または抗ＦＬ ＡＧ ＭＡｂを用いたＥＬＩＳＡベースの直接結合改変スキャッチャード分析 ［カトー（Katoh）ら、J.Chem.BioEng.、７６：４５１〜４５４（１９９３）］ により親和性を試験する。抗サルＦａｂ試薬は、ヒト重鎖定常領域Ｉｇに対して 吸着され、Ｂ７−Ｉｇへの交差反応性は除かれるであろう。Ｂ７.１−Ｉｇまた はＢ７.２−Ｉｇをコーティングしたプレートへの直接結合の測定の後、各フラ グメントについてＫｄ値を計算する。 実施例５ ファージＦａｂフラグメントによるＣＴＬＡ−４／Ｂ７結合の阻止 最も低い濃度でＢ７−Ｉｇの結合を最も有効に阻止するＦａｂフラグメントを 先導候補として選択する。選択は、ＣＴＬＡ−４−ＩｇまたはＣＴＬＡ−４トラ ンスフェクション細胞への¹²⁵Ｉ−Ｂ７−Ｉｇ結合を競合し尽くすことにより行 う。他の選択基準には、応答細胞での３Ｈ−チミジンの取り込みの抑制［アズマ ら、J.Exp.Med.、１７７：８４５〜８５０；アズマら、Nature、３０１：７６〜 ７９（１９９３）］およびＩＬ−２アッセイキットを用いたＩＬ−２産生の直接 分析により測定されるように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻止が含まれる。 ＭＬＲの抑制およびＣＴＬＡ−４結合アッセイにおいて最も有効な３または４の 候補が、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションおよびキメラサル／ヒト抗体の発 現のための上記哺乳動物発現ベクター中へクローニングするために選択される。 実施例６ サルヘテロハイブリドーマの生成 モノクローナル抗体を分泌するサルヘテロハイブリドーマを、その血清がＢ７ .１および／またはＢ７.２に対して陽性と試験された生存（existing）免疫動物 から作成する。いずれかまたは両方の抗原に対して陽性の動物からリンパ節生検 を採取する。ハイブリドーマの産生方法は、サル抗ＣＤ４抗体の作成に使用する 確立された方法［ニューマン、１９９２（上掲）］と同様である。高い血清力価 を有するサルは、鼠蹊部のリンパ節の切片を麻酔下で取り除かれるであろう。組 織からのリンパ球を洗浄し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＫＨ６ ／Ｂ５ヘテロハイブリドーマ細胞［キャロル（Carrol）ら、J.Immunol.Meth.、 ８９：６１〜７２（１９８６）］と融合させる。ハイブリド ーマをＨ.Ａ.Ｔ.培地上で選択し、９６ウエルプレート中で繰り返しサブクロー ニングすることにより安定化させる。 Ｂ７.１抗原に特異的なサルモノクローナル抗体をＢ７.２への交差反応性につ いてスクリーニングする。サル抗Ｂ７抗体は、¹²⁵Ｉ−Ｂ７−Ｉｇ結合アッセイ を用いてＢ７／ＣＴＬＡ−４結合の阻止について特徴付けられるであろう。３Ｈ −チミジンの取り込みおよびＩＬ−２産生の直接測定によるＭＬＲの抑制を用い 、３つの候補を選択する。２つの候補はフェーズIIの試験に持ち込まれ、すべて の機能的研究を繰り返しながらＣＨＯ細胞中に発現されるであろう。インビボ薬 理学のための動物モデルを開発する目的のため、抗Ｂ７抗体が幾つかの動物種の 細胞上で試験されるであろう。動物モデルの確立は、選択した臨床適応のために 前臨床研究を行うことを可能にするであろう。 実施例７ 上記のように上記ヘテロハイブリドーマ法を用いて４つの先導サル抗Ｂ７.１ 抗体：１６Ｃ１０、７Ｂ６、７Ｃ１０および２０Ｃ９が同定された。これら抗体 は以下のように特徴付けられた： スキャッチャード分析は、Ｂ７−Ｉｇコーティングプレートへのサル抗体の結 合の見かけの親和定数（Ｋｄ）がおよそ以下のとおりであることを示した： ａ：７Ｃ１０： ６.２×１０^-9Ｍ ｂ：１６Ｃ１０： ８.１×１０^-9Ｍ ｃ：７Ｂ６： １０.７×１０^-9Ｍ ｄ：２０Ｃ９： １６.８×１０^-9Ｍ 抗体を混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）においてインビトロで試験した。 ＭＬＲは、４つのすべての抗Ｂ７.１抗体が異なる程度にＩＬ−２産生を抑制す ることを示した： ａ：７Ｂ６： ５.０μｇ／Ｍ１ ｂ：１６Ｃ１０： ０.１μｇ／Ｍ１ ｃ：２０Ｃ９： ２.０μｇ／Ｍ１ ｄ：７Ｃ１０： ５.０μｇ／Ｍ１ サル抗Ｂ７.１抗体を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）上のＢ７に結合する能 力について試験した。ＦＡＣＳ分析は、４つのすべてのサル抗体が陽性であるこ とを示した。 サル抗体１６Ｃ１０、７Ｂ６、７Ｃ１０および２０Ｃ９をＦＡＣＳ分析により Ｃ１ｑ結合について試験した。その結果は、７Ｃ１０サルＩｇがＢ７.１ＣＨＯ トランスフェクション細胞とともにインキュベートした後に強いヒトＣ１ｑ結合 を有することを示した。１６Ｃ１０もまた陽性であったが、２０Ｃ９および７Ｂ ６サル抗体は陰性であった。 実施例８ 本明細書中に参照のために引用した米国特許出願第０８／３７９,０７２号の 霊長類化抗体法を用い、および図２に示すＮＥＯＳＰＬＡベクター系を用い、７ Ｃ１０、７Ｂ６および１６Ｃ１０の重鎖および軽鎖可変ドメンをクローニングし 、その霊長類化形態をＮＥＯＳＰＬＡベクター系を用いてＣＨＯ細胞中で合成し た。霊長類化７Ｃ１０の軽鎖および重鎖、７Ｂ６の軽鎖および重鎖、および１６ Ｃ１０の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列および核酸配列を、それぞれ、図３ａ、 図３ｂ、図４ａ、図４ｂ、図５ａおよび図５ｂに示す。 実施例９ ＣＴＬＡ−４とＢ７.１上のPRIMATIZED^R抗体結合部位との非交差反応性の確認実 験 ビオチン化ＣＴＬＡ−４Ｉｇを用いた競合結合アッセイにおいて（図６）、非 標識霊長類化１６Ｃ１０（すなわち、Ｐ１６Ｃ１０）はＢ７.１トランスフェク ションＣＨＯ細胞へのＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合を阻止することができなかった。非 標識ＣＴＬＡ−４Ｉｇおよび非標識Ｂ７.１はこれら条件下で有効に競合するこ とがわかる。 ビオチン化Ｐ１６Ｃ１０を用いた第二の実験において、同じ結論を得ることが できる。図７に示す実験において、Ｐ１６Ｃ１０−ビオチンの結合は非標識Ｐ１ ６Ｃ１０およびＢ７.１Ｉｇの両者により阻害されるが、ＣＴＬＡ−４Ｉｇによ っては阻害されない。ＣＴＬＡ−４Ｉｇは４〜１０倍も高い親和性を示すことが 報告されているが（Ｋｄ＝０.４ｎＭ；モートンら、J ．Immunol. １５６：１０ ４７〜１０５４（１９９６））、１００倍過剰もの高いＣＴＬＡ−４ Ｉｇ濃度でもＰ１６Ｃ１０結合の有意な阻害はみられない。 同様の結果は、同実験でＰ１６Ｃ１０の代わりに霊長類化抗体７Ｃ１０（Ｐ７ Ｃ１０）を用いても得られた（データは示していない）。 実施例１０ Ｌ３０７.４およびＢＢ−１マウス抗体がＣＴＬＡ−４Ｉｇの存在下でＢ７ＣＨ Ｏ細胞へ結合する能力の比較 マウス抗体の結合部位がＣＴＬＡ−４の結合部位と重複するか否かを決定する ため、ＣＴＬＡ−４Ｉｇの存在下でのＬ３０７.４およびＢＢ−１マウス抗体の 結合を調べた。Ｐ１６Ｃ１０−ビオチン、Ｌ３０７.４−ビオチンおよびＣＴＬ Ａ−４Ｉｇ−ビオチンを用いた競合アッセイ実験を行い、親和性の相違が競合結 合の検出を妨害しないことを保証した。その結果を図８および図９に示す。 図８の結果は、マウス抗体ＢＢ−１がＰ１６Ｃ１０と競合しないという以前の 研究を確認している。これら結果はまた、Ｌ３０７.４に対する約５０％の若干 の交差反応性が認められることを示している。図８の結果は、ＢＢ−１およびＬ ３０７.４がともに互いに競合すること、およびＢＢ−１がＢ７.１トランスフェ クションＣＨＯ細胞へのＣＴＬＡ−４Ｉｇ−ビオチンの結合を完全に阻止するこ とを確認している。ＢＢ−１はＢ７.１陽性ＣＨＯ細胞へのＰ１６Ｃ１０結合に 有意に影響を及ぼさない。 図９に示す結果は、結合実験においてＣＴＬＡ−４Ｉｇ−ビオチンを用いたと きに５０％よりも良好な競合を示している。図９は、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ−ビオチ ンがＰ１６Ｃ１０以外のすべてのＢ７.１インヒビターにより有効に阻害される ことを示しており、それゆえＰ１６Ｃ１０は負のシグナルの生成において正常な ＣＴＬＡ−４リガンド結合を可能にするＢ７.１上の独特の結合決定部位を認識 する。以前の機能的研究（データは示していない）は、同種ＭＬＲにおいてＩＬ −２産生を阻止するＬ３０７.４の弱められた能力を示唆しており、このことは Ｌ３０７.４がＣＴＬＡ−４の負のシグナル伝達に介入するという仮設と相関し ている。文献に報告された他のマウス抗体の多くがいかにしてＣＴＬＡ−４結合 の完全な阻害をもたらすのかは明らかではない；しかしながら、Ｂ７.１特異的 抗体およびＢ７.２特異的抗体の真の機能的メカニズムを定めるう えで重要な問題である。 これら結果は、Ｂ７.１トランスフェクションＣＨＯ細胞への結合に対してＰ １６Ｃ１０−ビオチンと競合するＢ７−Ｉｇを用いた以前の研究を確認している 。これら研究はまた、ＣＴＬＡ−４ＩｇによりＰ１６Ｃ１０が阻害されないとい う以前の観察をも確認するものである。これらの結果は、霊長類抗体が、ＣＤ２ ８と主として相互作用するＣＴＬＡ−４結合部位とは独立に独特のＢ７.１エピ トープに特異的であることを強く示唆している。このタイプの相互作用は、ＣＴ ＬＡ−４の負のシグナル伝達機能は依然として阻害されずに起こるようにしなが ら、ＣＤ２８へのＢ７.１の結合を阻止する能力を有するため、有益である。こ のように認められる相互作用は、Ｔｈ１かまたはＴｈ２のいずれかの表現型の優 勢のいかんにかかわらず、全体としてのＴ細胞活性化応答のダウンレギュレーシ ョンに導く。 同様の結果は、同実験でＰ１６Ｃ１０の代わりにＰ７Ｃ１０を用いても得られ た（データは示していない）。 実施例１１ Ｂ７.１に結合しＣＤ２８受容体とのＢ７.１の相互作用を阻止する能力を示す実 験 Ｂ７.１のＰ１６Ｃ１０結合がＢ７.１とＣＤ２８との相互作用を阻止し得るか 否かを決定する実験を、Ｂ７.１Ｉｇを¹²⁵Ｉで放射性標識し、ついでＣＤ２８陽 性非活性化末梢血Ｔリンパ球への競合結合により行った。図１０に示す結果は、 非標識Ｂ７.１Ｉｇでの阻害により確認されるように、放射性標識Ｂ７.１Ｉｇが Ｔ細胞に特異的に結合することを示している。これら結果はまた、ＣＴＬＡ−４ Ｉｇ、抗ＣＤ２８およびＰ１６Ｃ１０がすべてこの相互作用を阻止し得ることを も示している。これら結果はさらに、Ｐ１６Ｃ１０がＣＤ２８／Ｂ７相互作用の 結合を＜１μｇ／ｍＬのＩＣ₅₀にて阻止することを確認している。 上記結果は、膜結合ＣＴＬＡ−４が発現されない条件下で得られ（リンスレイ ら、J ．Exp．Med. １７３：７２１〜７３０（１９９１））、抗ＣＤ２８抗体で の阻止により確認された。 同様の結果は、同実験でＰ１６Ｃ１０の代わりにＰ７Ｃ１０を用いても得られ た（データは示していない）。 これら霊長類化抗体は、それがおそらく低い抗原性を有しヒトエフェクター機 能を有するために治療剤として極めて適していることが期待される。実際、霊長 類化１６Ｃ１０はヒトＣ１ｑ結合を示すことが最近示されている。 当業者であれば、本明細書に記載した本発明の特定の態様と等価な多くの等価 物を日常的な実験を越えない実験を使用して認識もしくは確認し得るであろう。 かかる等価物は以下の請求の範囲に包含されることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 19/02 19/02 25/00 25/00 27/14 27/14 29/00 29/00 １０１ １０１ 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハンナ，ナビル アメリカ合衆国92067カリフォルニア州 ランチョ・サンタ・フェ、カミノ・デリシ アダ 16016番 (72)発明者 ブラムズ，ピーター アメリカ合衆国92116カリフォルニア州 サンディエゴ、プロクター、プレイス4303 番 (72)発明者 ハード，シェリル アメリカ合衆国92024カリフォルニア州 エンシニタス、ビア・モントロ1225番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＢ７.１抗原（ＣＤ８０）および／またはＢ７.２抗原（ＣＤ８６）に 特異的に結合し、該Ｂ７.１抗原またはＢ７.２抗原のＣＤ２８への結合を阻害す るモノクローナル抗体。 ２．Ｂ７.１抗原（ＣＤ８０）に特異的に結合する、請求項１に記載のモノク ローナル抗体。 ３．Ｂ７.１抗原のＣＴＬＡ−４への結合は阻害しない、請求項２に記載のモ ノクローナル抗体。 ４．Ｂ７.２抗原（ＣＤ８６）に特異的に結合する、請求項１に記載のモノク ローナル抗体。 ５．Ｂ７.２抗原のＣＴＬＡ−４への結合は阻害しない、請求項４に記載のモ ノクローナル抗体。 ６．Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル 抗体。 ７．ＣＤ２８／Ｂ７.１経路を介してＢ細胞およびＴ細胞の相互作用を選択的 に阻害する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。 ８．ＣＤ２８／Ｂ７.２経路を介してＢ細胞およびＴ細胞の相互作用を選択的 に阻害する、請求項４に記載のモノクローナル抗体。 ９．Ｔリンパ球によるＩＬ−２の産生をインビトロで阻害し得る、請求項１に 記載のモノクローナル抗体。 １０．少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度でＴリンパ球含有培地に加えたときに ＩＬ−２産生を阻害し得る、請求項９に記載のモノクローナル抗体。 １１．１６Ｃ１０または７Ｃ１０と同じＢ７.１上のエピトープに結合するか 、または１６Ｃ１０または７Ｃ１０とＢ７.１との相互作用を阻害する、モノク ローナル抗体。 １２．霊長類化抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 １３．ヒト抗体、キメラマウス／ヒト抗体、またはヒト化抗体である、請求項 １に記載のモノクローナル抗体。 １４．該Ｂ７.１がヒトＢ７.１である、請求項１に記載のモノクローナル抗 体。 １５．該Ｂ７.２がヒトＢ７.２である、請求項１に記載のモノクローナル抗体 。 １６．Ｂ７.１／ＣＤ２８経路を介したＢ細胞およびＴ細胞の結合を阻害する のに充分な量の請求項２に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、Ｔ 細胞／Ｂ細胞相互作用が関与する疾患の治療方法。 １７．Ｂ７.２／ＣＤ２８経路を介したＢ細胞およびＴ細胞の結合を阻害する のに充分な量の請求項４に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、Ｔ 細胞／Ｂ細胞相互作用が関与する疾患の治療方法。 １８．該疾患が自己免疫疾患である、請求項１６に記載の方法。 １９．該疾患が自己免疫疾患である、請求項１７に記載の方法。 ２０．該疾患が、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、１型 糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、再生不能性貧血、炎症性胆汁疾患、アレルギ ーおよび多発性硬化症よりなる群から選ばれたものである、請求項１６に記載の 方法。 ２１．該疾患が、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、１型 糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、再生不能性貧血、炎症性胆汁疾患、アレルギ ーおよび多発性硬化症よりなる群から選ばれたものである、請求項１７に記載の 方法。 ２２．該疾患が移植片対宿主病である、請求項１６に記載の方法。 ２３．該疾患が移植片対宿主病である、請求項１７に記載の方法。 ２４．該疾患が、Ｂ細胞リンパ腫、感染性疾患、および炎症性疾患よりなる群 から選ばれたものである、請求項１６に記載の方法。 ２５．該疾患が、Ｂ細胞リンパ腫、感染性疾患、および炎症性疾患よりなる群 から選ばれたものである、請求項１７に記載の方法。 ２６．請求項１に記載の抗体を含む、Ｂ７：ＣＤ２８結合の阻害により治療し 得る疾患の治療に適した医薬組成物。 ２７．他の組換えタンパク質または小分子の免疫抑制剤と併用して投与する、 請求項１６に記載の方法。 ２８．他の組換えタンパク質または小分子の免疫抑制剤と併用して投与する、 請求項１７に記載の方法。