KR20010085830A - 치료 단백질에 대한 면역 반응을 하향조절하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지혈을 촉진시키는 제제와 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제제를 사용하여 혈액응고 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 외래 치료 단백질을 사용하여 혈액응고 질환을 치료하는 동안 치료 단백질에 대한 면역 반응을 하향조절할 수 있게 해준다.

Description

치료 단백질에 대한 면역 반응을 하향조절하는 방법 {METHODS OF DOWNMODULATING THE IMMUNE RESPONSE TO THERAPEUTIC PROTEINS}

생물학적 단백질을 이용하는 치료법의 주요 한계 중의 하나는 체내 외래 물질의 존재에 반응하여 신체가 일으키는 면역 반응이다. 이러한 면역 반응은 최적 효과를 얻기 위해 외래 물질을 반복 투여해야 하는 경우 특히 문제가 된다.

이러한 경우의 한 가지 예는 인자 VII 결핍 질환(예를 들어, 전형적인 A형 혈우병 및 폰 빌레브란드병) 또는 인자 XI 결핍증(또한 B형 혈우병으로서 알려져 있음)과 같은 혈액응고 질환을 치료하기 위한 제제의 반복 투여이다. 전형적인 혈우병인 A형 혈우병은 남성 10,000명 중 1명에게 작용하는 X-연관성 질환이다. 폰 빌레브란드병은 800 내지 1000명 중 1명꼴로 발생하는 가장 보편적인 유전성 출혈 질환이다. 크리스마스병으로도 알려져 있는 B형 혈우병은 남성 100,000명 중 약 1명에게서 발생한다 (Harrison's Principles of Internal Medicine. Isselbacher et al., eds. 13th Edition. 1994. McGraw-Hill N.Y., N.Y.).

인자 VIII은 폰 빌레브란드 인자(VWF)와의 복합체 형태로 순환하는 265kD의 단일 사슬 단백질이다. 인자 VIII는 혈액 응고 연쇄증폭반응(cascade)에서 중요한 조절 단백질이다. 트롬빈에 의해 활성화된 후, 이것은 활성화된 IX(인자 IXa)에 의한 인자 X 활성화 속도를 가속시켜서, 결국 섬유소 응괴를 형성시킨다. VWF 분자는 혈소판 응집에서 중심 역할을 하는 부착성 당단백질이다. 이것은 혈장에서 인자 VIII에 대한 운반체로서 작용하고, 혈소판-혈관벽 상호작용을 촉진시킨다. VWF는 각각 230kD인 다수의(아마도 동일한) 서브유닛으로 이루어져 있다. VWF는 내피세포와 거대핵세포에서 합성된다. 인자 IX는 인자 XIa 또는 조직 인자-VIIa 복합체에 의해 활성 프로테아제(IXa)로 전환되는 55kD의 단일 사슬 효소전구체(proenzyme)이다. 그 후, 활성화된 인자 IX와 활성화된 인자 VIII는 인자 X를 활성화시킨다.

외래 단백질의 반복 투여는 수용자에게서 이러한 단백질에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 외래 단백질에 대한 T 세포 반응의 경우, 2개의 신호가 항원 제공 세포(APC)에 의해 휴지 T 림프구에 제공되어야 한다 (Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987)J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D.L., et al. (1990)J. Immunol.144, 3701-3709). 면역 반응에 특이성을 부여하는 첫 번째 신호는 주요 조직적합성 복합체(MHC)를 배경으로 제공되는 외래 항원성 펩티드의 인식 후 T 세포 수용체(TCR)에 의해 전달된다. 보조자극(costimulation)으로 명명되는 두 번째 신호는 T 세포를 증식시켜서 작용성이 되도록 유도시킨다 (Lenschow et al. 1996.Annu. Rev. Immunol.14:233). 보조자극은 항원 특이적인 것도 아니고, MHC 제한적인 것도 아니며, APC에 의해 발현된 하나 이상의 독특한 세포 표면 분자에 의해 제공되는 것으로 생각된다 (Jenkins, M.K., et al. 1988 J.Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S., et al. 1991J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al., 1991Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; Young, J.W., et al.1992J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L., et al. 1991J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H., et al. 1992Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 271-275; van-Seventer, G.A., et al. (1990)J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M., et al., 1991J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M.I., et al., 1989J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J., et al. 1992Nature 357, 80-82; Liu, Y., et al. 1992J. Exp. Med. 175, 437-445).

APC 상에서 발현되는 CD80(B7-1)과 CD86(B7-2)는 중요한 보조자극 분자이다 (Freeman et al. 1991.J. Exp. Med.174:625; Freeman et al. 1989J. Immunol.143:2714; Azuma et al. 1993Nature366:76; Freeman et al. 1993.Science262-909).

B7-2는 1차 면역 반응 동안 더욱 현저한 것으로 여겨지며, 면역 반응 과정에서 후기에 상향조절되는 B7-1은 1차 T 세포 반응 또는 보조자극성 2차 T 세포 반응을 연장시키는 데에 중요할 수 있다 (Bluestone. 1995.Immunity.2:555).

B7-1과 B7-2는 T 림프구 상에서 발현되는 2개의 리간드에 대한 반대 수용체이다. B7-1과 B7-2가 결합하는 하나의 리간드인 CD28은 휴지 T 세포 상에서 구성적으로 발현되고, 활성화 후 발현이 증가한다. T 세포 수용체를 통해 신호전달된 후, CD28의 연결과 보조자극 신호의 전달은 T 세포를 증식시켜서 IL-2를 분비시키게 한다 (Linsley, P.S., et al. 1991J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D., et al. 1991Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; June, C.H., et al. 1990Immunol. Today. 11, 211-6; Harding, F.A., et al. 1992Nature.356, 607-609) CTLA4(CD152)로 명명되는 두 번째 리간드는 CD28에 대해 상동성이지만, 휴지 T 세포 상에서 발현되지 않으며, T 세포 활성화 후에 나타난다 (Brunet, J.F., et al., 1987Nature 328, 267-270). CTLA4는 T 세포 반응의 네거티브 조절에서 중요한 것으로 여겨진다 (Waterhouse et al. 1995.Science270:985). CTLA4의 차단은 억제 신호를 제거하는 것으로 밝혀졌으며, CTLA4의 응집은 T 세포 반응을 하향조절하는 억제 신호를 제공하는 것으로 밝혀졌다 (Allison and Krummel. 1995.Science270:932). B7 분자는 CD28 보다 CTLA4에 대해 보다 높은 친화력을 지니며(Linsley, P.S., et al., 1991J. Exp. Med. 174, 561-569), B7-1과 B7-2는 CTLA4 분자의 별개의 영역에 결합하고, CTLA4에 대한 결합에 있어서 상이한 동력학을 지니는 것으로 밝혀졌다 (Linsley et al. 1994. Immunity. 1:793).

혈우병에 걸린 환자 중 10 내지 25%는 인자 VIII에 대한 면역 반응을 발생시킨다. 이러한 환자들은 인자 VIII 활성을 중화시키는 억제제(일반적으로 IgG 항체)를 발생시킴으로써, 효과적인 치료를 억제한다. 두 가지 타입의 억제제가 동정되었다. 타입 I 억제제를 지닌 고반응자 환자는 인자 VIII에 대한 면역기억 반응을 나타내어, 인자 VIII에 대한 항체의 역가를 증가시킨다. 타입 II 억제제를 지닌 저반응자 환자는 인자 VIII의 투여에 의해 증가하지 않는 낮은 항체 역가를 나타낸다. 이러한 환자들에서의 항체 반응을 무디게 하기 위한 현재의 방법들은 최저로 성공적일 뿐이었다. 더욱이, 대체된 단백질에 대한 항체의 개발은, 유전자 요법이 혈우병 및 그 밖의 결핍 질병의 치료에서 성공적인 경우, 해결할 필요가 있는 중요한 문제이다 (Connelly S et al, Blood 88:3846, 1996; Kuna S-H et al,Blood 91:784, 1998).

발명의 요약

본 발명은 특히 치료 단백질을 투여하여 질환을 치료하면서 치료 단백질에 대한 면역 반응의 발생 및/또는 진행을 감소시킬 수 있게 해주는 조성물 및 방법을 제공한다.

한 가지 일면에 있어서, 본 발명은 지혈을 촉진시키는 제 1 제제와 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제 2 제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한 가지 양태에 있어서, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 캐리어를 추가로 포함한다.

한 가지 양태에 있어서, 제 1 제제는 인자 VIII 이다. 또 다른 양태에 있어서, 제 1 제제는 인자 VIII의 B-도메인 결실 변이체이다. 한 가지 양태에 있어서, 제 1 제제는 인자 IX 이다. 또 다른 양태에 있어서, 제 1 제제는 폰 빌레브란드 인자이다.

한 가지 양태에 있어서, 제 2 제제는 가용성 형태의 보조자극성 분자이다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 제 2 제제는 가용성 형태의 CTLA4 이다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 제 2 제제는 가용성 형태의 B7-1, 가용성 형태의 B7-2 또는 가용성 형태의 B7-1과 가용성 형태의 B7-2의 조합물이다. 한 가지 더욱 바람직한 양태에 있어서, 제 2 제제는 CTLA4Ig 이다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 제 2 제제는 가용성 형태의 CD40 또는 CD40L 이다.

또 다른 양태에 있어서, 제 2 제제는 보조자극성 분자에 결합하는 항체이다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 제 2 제제는 안티-B7-1 항체, 안티-B7-2 항체 및 안티-B7-1과 안티-B7-2 항체의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 가지 양태에 있어서, 항체는 비활성 형태의 안티-CD28 항체이다.

또한, 본 발명은 혈액응고 질환이 치료되도록 환자에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하여 환자의 혈액응고 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

한 가지 양태에 있어서, 환자는 제 1 제제에 결합하는 항체를 유의수준의 역가로 지닌다. 또 다른 양태에 있어서, 환자는 제 1 제제에 결합하는 항체의 현저한 역가를 지니지 않는다.

한 가지 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

한 가지 양태에 있어서, 혈액응고 질환은 A형 혈우병, B형 혈우병 및 폰 빌레브란드병으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 혈액응고 질환이 치료되도록 환자에게 지혈을 촉진시키는 제 1 제제 및 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제 2 제제를 투여하는 것을 포함하여 환자의 혈액응고 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 제 1 제제에 대한 면역내성을 일으켜서 혈액응고 질환이 치료되도록 환자에게 지혈을 촉진시키는 제 1 제제 및 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제 2 제제를 투여하는 것을 포함하여 환자의 혈액응고 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

한 가지 양태에 있어서, 제 1 제제는 인자 VIII 이다. 또 다른 양태에 있어서, 제 1 제제는 인자 VIII의 B-도메인 결실 변이체이다. 또 다른 양태에 있어서, 제 1 제제는 인자 IX이다. 또 다른 양태에 있어서, 제 1 제제는 폰 빌레브란드 인자이다.

한 가지 양태에 있어서, 제 2 제제는 보조자극성 신호를 T 세포에 전달하는 가용성 형태의 제제이다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 제제는 가용성 형태의 CTLA4 이다. 한 가지 더욱 바람직한 양태에 있어서, 제제는 CTLA4Ig이다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 제제는 가용성 형태의 B7-1, 가용성 형태의 B7-2 및 B7-1과 B7-2 둘의 조합물이다. 또 다른 더욱 바람직한 양태에 있어서, 제제는 B7-1Ig, B7-2Ig 또는 B7-1Ig과 B7-2Ig 둘의 조합물이다.

한 가지 양태에 있어서, 제 2 제제는 보조자극성 분자에 결합하는 항체이다. 또 다른 양태에 있어서, 제 2 제제는 안티-B7-1 항체, 안티-B7-2 항체 및 안티-B7-1과 안티-B7-2 항체의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에 있어서, 항체는 비활성 형태의 안티-CD28 항체이다.

한 가지 양태에 있어서, 혈액응고 질환은 A형 혈우병, B형 혈우병 및 폰 빌레브란드병으로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 가지 양태에 있어서, 환자는 제 1 제제에 결합하는 항체의 현저한 역가를 지닌다.

도면의 간단한 설명

도 1은 인자 VIII에 대한 1차 항체 반응의 억제를 시험하기 위한 실시예 1에 대해 사용된 실험 설계를 도시한다.

도 2는 CTLA4Ig가 투여되지 않은 마우스는 이미 20일째(G-1)부터 시작하여 항체의 높은 역가를 지니는 반면, CTLA4Ig가 투여된 마우스는 82일째(G-2 및 G-3)까지 항체를 발생시키지 않았음을 도시한다.

도 3은 인자 VIII에 대한 2차 항체 반응의 억제를 시험하기 위한 실시예 2에 대해 사용된 실험 설계를 도시한다.

도 4는 CTLA4Ig가 투여되지 않은 마우스는 안티-인자 VIII 항체의 높은 역가를 지니는(G-1) 반면, CTLA4Ig가 투여된 마우스(G-2)는 1마리를 제외하고는 인자 VIII에 대한 2차 면역 반응을 발생시키지 않았음을 도시한다.

도 5는 안티-인자 VIII 항체 형성에 대한 mCTLA4-Ig의 효과를 도시한다.

도 6은 안티-인자 VIII 항체 형성에 대한 mCTLA4-Ig의 반복 투여의 효과를 도시한다.

도 7은 mCTLA4-Ig와 인자 VIII의 동시 투여의 효과를 도시한다.

도 8은 인자 VIII에 대한 2차 면역 반응에 대한 mCTLA4-Ig의 효과를 도시한다.

도 9는 안티-인자 VIII 항체 반응에서의 B7-1과 B7-2의 역할을 도시한다.

도 10은 A형 혈우병/B7-1^-/-및 A형 혈우병/B7-2^-/-마우스에서의 인자 VIII에 대한 T 세포 반응을 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 치료 단백질을 투여하여 질환을 치료하면서 치료 단백질에 대한 면역 반응의 발생 및/또는 진행을 감소시킬 수 있게 해주는 조성물 및 방법을 제공함으로써 혈액응고 질환을 치료하는 데에 있어서의 중요한 진보를 나타낸다.

본 발명을 추가로 설명하기 전에, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 몇몇 용어를 편의상 여기에 정리해 둔다.

I. 정의

본원에 사용된 용어 "혈액응고 질환"은 비정상적 출혈 및/또는 혈전증을 일으키는 질환을 포함한다. 정상적 혈액응고는 혈관벽의 성분들, 혈소판 및 혈장 단백질 사이의 일련의 상호작용에 의해 혈액 손실을 제한시킨다. 혈액응고 질환은 예를 들어, 질병 또는 외상에 대해 부적당한 반응, 예를 들어 조절되지 않는 출혈을 일으킬 수 있는 혈소판 응집 및/또는 섬유소 응괴 형성의 장애로 인해 일어난다. 이러한 질환은 예를 들어 출혈 시간, 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT), 프로트롬빈 시간(PT), 트롬빈 시간(TT)을 결정하거나, 당 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 피브리노겐을 정량적으로 측정함으로써 검출될 수 있다. 예시적인 혈액응고 질환으로는 A형 혈우병, B형 혈우병 및 폰 빌레브란드병이 있다.

본원에 사용된 용어 "지혈을 촉진시키는 제제"는 환자에게는 결핍되어 있거나 결실되어 있고, 환자에게 투여되는 경우 혈액응고 질환을 완화시키거나 치료하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 지혈을 촉진시키는 바람직한 제제로는 응고 인자, 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX, VWF 및 이들의 유사체가 있다.

본원에 사용된 용어 "B7 패밀리" 또는 "B7 분자"는 B7 폴리펩티드, 예를 들어 B7-1, B7-2 또는 B7-3 (항체 BB-1에 의해 인식됨)와 아미노산 서열 동일성을 공유하는 보조자극성 분자를 포함한다. 또한, 분자의 B7 패밀리는 공통적인 기능, 예를 들어 B7 패밀리 리간드(예를 들어, CD28, CTLA4 또는 ICOS 중 하나 이상)에 결합할 수 있는 능력 및 T 세포 활성화를 보조자극할 수 있는 능력을 공유한다.

B7 폴리펩티드는 활성화된 T 세포에 보조자극을 제공하여 T 세포 증식 및/또는 시토킨 분비를 유도시킬 수 있거나, 예를 들어 가용성 형태로 존재하는 경우, T 세포의 보조자극을 억제시킬 수 있다. B7 패밀리 일원으로는 B7-1, B7-2 및 이들의 가용성 단편 또는 유도체가 있다. 한 가지 양태에 있어서, B7 패밀리 일원들은 CTLA4, CD28, ICOS 및/또는 면역 세포 상의 기타 리간드에 결합하며, 면역 세포의 보조자극을 억제시키거나 유도시킬 수 있는 능력을 지닌다.

본원에 사용된 용어 "T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제제"는 항원 제공 세포(APC) 상의 보조자극성 분자(예를 들어, B7 패밀리 분자)와 T 세포 상의 이의 반대 수용체의 상호작용에 의해 생성된 신호를 억제시키는 제제를 포함한다. APC 상의 보조자극성 분자(예를 들어, B7 패밀리 일원) 및 T 세포 상의 이들의 동족 리간드(예를 들어, CTLA4, CD28 및 ICOS)는 본원에서 보조자극성 분자로서 집합적으로 언급된다. 보조자극성 신호를 억제시키는 제제는 세포외적으로 작용하여 보조자극성 분자 간의 상호작용을 억제시킴으로써 세포내 신호의 생성을 차단하거나, 세포내적으로 작용하여 신호 전달 경로에서 보조자극성 신호를 억제시킬 수 있다. 예시적 제제는 본원에 더욱 상세히 설명되며, 예를 들어 가용성 형태의 보조자극성 분자 및 보조자극성 분자에 결합하는 항체가 있다.

본원에 사용된 표현 "면역반응의 하향조절"은 기존의 면역 반응을 가지지 않거나 기존의 면역 반응의 기간과 강도가 감소된 환자에서의 면역 반응의 감소(예를 들어, 서프레션(suppression), 댐페닝(dampening), 또는 억제)를 포함한다. 용어 "면역 반응"은 외래 항원에 반응하여 일어날 수 있는, 보조자극성 신호에 의해 개시되거나 이에 의존하는 임의의 타입의 면역 반응, 예를 들어 세포성 반응 또는 체액성 반응을 포함한다. 한 가지 양태에 있어서, 면역 반응은 지혈을 촉진시키는 제제(예를 들어, 인자 VII, VWF 또는 인자 IX)에 대한 항체 반응이다. 용어 "면역내성화"는 당 분야에 공지된 기법을 사용하여, 예를 들어 항원에 대한 2차 면역 반응(예를 들어, 세포성 반응 또는 체액성 반응)을 측정함으로써 측정될 수 있는 항원 특이적 내성의 유도를 포함한다.

II. 지혈을 촉진시키는 제제

한 가지 양태에 있어서, 지혈을 촉진시키는 제제는 인자 VIII 이다. 본원에 사용된 용어 "인자 VIII"는 인자 VIII의 특징인 전응고(procoagulant) 활성을 나타내는 단백질을 포함한다. 본 발명의 한 가지 양태에 있어서, 인자 VIII 단백질은 천연 인자 VIII 단백질이다. 이러한 단백질은 혈액으로부터 정제되거나, 혈액 제제 또는 농축된 혈액 제제로서 투여될 수 있다. 한 가지 양태에 있어서, 고도로 정제된 인자 VIII는 혈액 제제로부터의 인자를 모노클로날 항체 컬럼 상에 흡착시키고 용리시킴으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 천연 단백질은 핵산 분자, 바람직하게는 천연 핵산 분자를 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를들어, 한 가지 양태에 있어서, 인자 VIII 단백질은 당 분야에 공지된 기법을 사용하여 인자 IX 단백질이 생성되도록 인자 VIII를 암호화하는 핵산 분자를 세포에서 발현시킴으로써 제조된다. 인간 인자 VIII의 누클레오티드 서열(및 상응하는 아미노산 서열)은 당 분야에 공지되어 있다 (참조: Toole et al. Nature 1984. 312:5992; or GenBank Accession Nos. X01179; K01740).

또 다른 양태에 있어서, 지혈을 촉진시키는 제제는 비천연 인자 VIII, 예를 들어 인자 VIII의 치료적 기능, 예를 들어 지혈 촉진 활성을 보유하는 인자 VIII의 돌연변이 형태이다. 예를 들어, 인자 VIII 이외의 유전자에 대한 하이브리드화를 방지하는 조건(예를 들어, 5 X SSC (1 X SSC = 150mM NaCl/0.15M Na 시트레이트)에서의 65℃에 상당하는 조건) 하에서 인간 인자 VIII를 암호화하는 DNA에 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 또는 인자 VIII 기능에서 중요한 단백질 도메인을 암호화하는 핵산 분자의 영역에 대해 서열 동일성을 보유하는 상동성 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에서 인자 VIII 단백질을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 예로서, 미국 특허 제 5,744,446호; 제 5,663,060호; 제 5,583,209호; 제 5,661,008호; 제 5,422,260호; 및 제 5,707,832호의 내용은 본원에 참고문헌으로 명백히 편입되어 있다.

또 다른 양태에 있어서, 지혈을 촉진시키는 제제는 단백질의 하나 이상의 도메인(예를 들어, 비필수 도메인)이 결실되어 있는 인자 VIII 단백질이다. 예를 들어, 한 가지 양태에 있어서, 인자 VIII 단백질은, 본원에 참고문헌으로 편입되어 있는 미국 특허 제 4,868,112호에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 천연 인자VIII에 비해 하나 이상의 아미노산이 90Kd 내지 69Kd 절단 부위 사이에서 결실되거나 치환되어 있는 개질된 인자 VIII 단백질이다.

또 다른 양태에 있어서, 지혈을 촉진시키는 제제는, 본원에 참고문헌으로 편입되어 있는 미국 특허 제 4,868,112호에 기재되어 있는 방법과 유사한 방법에 의해 생성될 수 있는, 50/40 절단 부위와 73kD 절단 부위 사이의 하나 이상의 아미노산의 결실(들)을 함유하는 인자 VIII 유사체이다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 인자 VIII 유사체는 80kD와 73kD 절단 부위 사이의 산성 아미노산 영역의 일부 또는 전부를 보유한다. 그 밖의 양태에 있어서, 이러한 영역의 일부 또는 전부는 50/40 절단 부위 바로 근처에 있는 상응하는 산성 영역으로 치환된다. 그 밖의 양태에 있어서, 인자 VIII 단백질은 국제 출원 PCT/US87/01299(이의 내용은 본원에 참고문헌으로 편입되어 있음)에 기재되어 있는 유사체(상기 언급된 결실을 지니거나 지니지 않음)이며, 예를 들어, 위치 226,336, 562, 740, 776, 1313, 1648 또는 1721에 있는 아르기닌 잔기들을 스패닝하는 하나 이상의 절단 부위가 예를 들어, 당 분야에 공지된 기법에 의한 돌연변이법, 예를 들어 표준 부위 유도 돌연변이법에 의해 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산으로 치환시킴으로써 단백가수분해성 절단에 대해 내성이 되도록 하였다.

지혈을 촉진시키는 제제는 인간 인자 VIII 단백질의 일부와 또 다른 종으로부터의 인간 이외의 인자 VIII 단백질(예를 들어, 돼지 인자 VIII)의 일부를 포함하는 하이브리드 인자 VIII 단백질을 또한 포함한다. 이러한 하이브리드 단백질은, 예를 들어 미국 특허 제 5,744,446호; 제 5,663,060호; 및 제 5,583,209호에기재되어 있는 당 분야에 공지된 기법을 사용하여 제조될 수 있다.

미국 특허 제 5,693,499호; 제 5,681,746호; 제 5,663,060호; 제 5,583,209호; 제 5,563,045호; 제 5,460,951호; 및 제 5,455,031호의 내용은 본원에 참고문헌으로 명백히 편입되어 있다.

또 다른 양태에 있어서, 지혈을 촉진시키는 제제는 인자 IX이다. 본원에 사용된 용어 "인자 IX"는 혈장, 형질전환된 세포주로부터 단리된 인자 IX, 및 숙주 세포 배양 배지로부터 단리된 재조합적으로 생성된 인자 IX를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인자 IX는 혈액으로부터 정제되거나 혈액 제제 또는 농축된 혈액 제제로서 투여될 수 있다. 한 가지 양태에 있어서, 고도로 정제된 인자 IX는 혈액 제제로부터의 인자를 모노클로날 항체 컬럼 상에 흡착시키고 용리시킴으로써 생성될 수 있다. 또한, 예시적인 정제 방법은 미국 특허 제 5,639,857호; 제 5,457,181호 및 제 5,286,849호에 기재되어 있다. 대안적으로, 이러한 천연 단백질은 핵산 분자, 바람직하게는 천연 핵산 분자를 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에 있어서, 인자 IX 단백질은 당 분야에 공지된 기법을 사용하여 인자 IX 단백질이 생성되도록 인자 IX를 암호화하는 핵산 분자를 세포에서 발현시킴으로써 제조된다. 인자 IX를 발현시키기 위한 예시적 유전자 구성물은 미국 특허 제 5,650,503호 및 제 4,994,371호에서 발견할 수 있다.

인자 IX의 누클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 당 분야에 공지되어 있다 (참조: Yoshitake et al. 1985. Biochemistry 24:3726 or GenBank Accession Nos. K02402; A07407; A01819; or X54500).

다른 양태에서, 예를 들어, 인자 IX에는 미국 특허 제 4,994,371호; 제 5,171,569호; 제 5,679,639호; 제 5,621,039호; 및 제 5,714,583호에 기술되어 있는 단백질이 포함되며, 이의 전체 내용을 각각 참조로서 본 명세서에 인용하였다.

인자 IX의 천연 발생 형태에 추가적으로, 용어 인자 IX에는 비-천연 발생 형태, 예컨대, 인자 IX의 치료적 특성, 예컨대, 지혈작용을 촉진시키는 특성을 지닌 인자 IX의 돌연변이 형태도 포함된다. 예를 들어, 비-인자 IX 유전자와의 하이브리드화가 회피되는 조건(예컨대, 5X SSC(1X SSC = 150 mM NaCl/0.15 M Na 시트레이트)에서의 65℃에 상당하는 조건)하에서 인간 인자 IX를 암호화하는 DNA와 하이브리드화될 수 있는 DNA 서열. 또한, 인자 IX 기능상에 중요한 단백질 도메인들을 암호화하는 핵산 분자의 영역에 걸쳐 서열 동일성을 지닌 DNA 서열들은 본 발명의 범위내에서 인자 IX 단백질을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

또한 인자 VIII 또는 인자 IX 단백질들을 상용으로 구입할 수 있다. 예를 들어, 농축된 형태의 인자 VIII가 이용가능하고(예컨대, Immunate(Immuno), Beriate(Behring)); 모노클로날 항체 정제된 형태의 인자 VIII가 이용가능하고(예컨대, Octanativ-M(Pharmacia), Hemofil M(Baxter) 및 Monoclate-P(Armour)); 및 재조합 형태의 인자 VIII도 이용가능하다(예컨대, Recombinate(Baxter) 및 Kogenate(Bayer)). 재조합 B-도메인-결실된 형태의 인자 VIII인 r-VIII SQ(Pharmacia 및 Upjohn, Stockholm)도 이용가능하다. 인자 IX를 예컨대, Nanotiv(Kabi Pharmacia) 또는 Immunine(Immuno)로서 구입할 수 있으며; 또한 모노클로날 항체 정제된 인자 IX는 Mononine(Armour)로서 이용가능하다. 또한 재조합 인자 IX는 예컨대, BeneFIX(Genetics Institute)로서 이용가능하다.

VWF는 단일 당단백질 서브유닛으로 구성되어 있는 거대한 다량체성 혈장 단백질이다. VWF의 서브유닛들은 디설피드 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 혈장에서 VWF는 이량체 내지 50개 이상의 서브유닛의 다량체로서 환형화된다. 이량체는 유동성 "막대-모양" 도메인에 의해, 바람직하게는 C-말단에, 연결된 두 개의 서브유닛으로 구성되어 있으며 다량체화에 있어서 기본단위체가 된다고 생각된다. 기본단위체들은 거대한, 아마도 N-말단의, 구형의 도메인을 통해 연결되어 다량체를 형성한다. VWF는 260 kD의 글리코실레이션된 전구체로서 생성된 다음에 프로세싱되고 설페이션되는 것 같다. 이량체화와 다량체화 및 단백질가수분해적 절단 후에, 성숙 단백질은 약 225kD이다. VWF는 재조합적으로 생성되어 왔다. VWF의 누클레오티드 및 아미노산 서열은 당분야에 공지되어 있다(참조 : 예컨대, Sadler et al. 1986. Cold Spring Harbor Symposium in Qunatitative Biology 51:515 또는 GenBank 수탁 번호 제 L15333호 또는 제 K03028호). EP 0197592 B1호의 내용을 참조로서 본 명세서에 인용하였다.

인자 VWF의 천연 발생 형태에 추가적으로, 용어 "인자 VWF"에는 비-천연 발생 형태, 예컨대, 인자 VWF의 치료적 특성, 예컨대, 지혈작용을 촉진시키는 특성을 지닌 인자 VWF의 돌연변이 형태도 포함된다. 예를 들어, 비-인자 VWF 유전자와의 하이브리드화가 회피되는 조건(예컨대, 5X SSC(1X SSC = 150 mM NaCl/0.15 M Na 시트레이트)중에서의 65℃에 상당하는 조건)하에서 인간 인자 VWF를 암호화하는 DNA와 하이브리드화될 수 있는 DNA 서열. 또한, 인자 VWF 기능에 중요한 단백질 도메인을 암호화하는 핵산 분자의 영역에 걸쳐 서열 동일성을 지닌 DNA 서열은 본 발명의 범위내에서 인자 VWF 단백질을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 지혈작용을 촉진시키는 제제는 공급원에 있어서 포유동물이다. 바람직한 양태에서, 지혈작용을 촉진시키는 제제는 공급원에 있어서 돼지이다. 또 다른 더욱 바람직한 양태에서, 지혈작용을 촉진시키는 제제는 공급원에 있어서 인간이다. 또 다른 양태에서, 지혈작용을 촉진시키는 제제는 하이브리드 분자이다.

III. 면역조절제

하나의 양태에서, T 세포에서의 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 보조자극성 부자의 천연 발생 형태이다. 보조자극성 분자의 천연 발생 형태는 세포로부터 정제될 수 있거나 당분야에 공지되어 있는 기술을 사용하여 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 보조자극성 단백질들은 보조자극성 분자가 생성되는 세포내에서 보조자극성 분자를 암호화하는 핵산 분자를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 보조자극성 분자의 누클레오티드 서열은 당분야에 공지되어 있으며 문헌 또는 GenBank와 같은 데이터베이스상에서 발견할 수 있다. 예를 들어, B7-2(참조 : Freeman et al. 1993 Science. 262:909 or GenBank Accession numbers P42081 or A48754); B7-1(참조 : Freeman et al. J. Exp. Med. 1991. 174:625 or GenBank Accession numbers P33681 or A45803); CTLA4(참조 : Ginsberg et al. 1985. Science. 228:1401; or GenBank Accession numbers P16410 or 291929); 및 CD28(참조 : Aruffo and Seed. Proc Natl. Acad. Sci. 84:8573 or GenBank Accessionnumber 180091), ICOS(참조 : Hutloff et al. 1999. Nature. 397:263; WO 98/38216), 및 관련된 서열들을 참조하라.

보조자극성 분자의 천연 발생 형태에 추가적으로, 용어 "보조자극성 분자"에는 비-천연 발생 형태, 예컨대, 보조자극성 분자의 기능, 예컨대, 동족의 반대 수용체에 결합하는 능력을 지닌 보조자극성 분자의 돌연변이 형태도 포함된다. 예를 들어, 비-보조자극성 분자 유전자와의 하이브리드화가 회피되는 조건(예컨대, 5X SSC(1X SSC = 150 mM NaCl/0.15 M Na 시트레이트)에서의 65℃에 상당하는 조건)하에서 B7 분자, CTLA4 분자, CD28 또는 ICOS 분자를 암호화하는 DNA와 하이브리드화될 수 있는 DNA 서열들은 본 발명의 범위내에 속하는 보조자극성 분자들이다. 또한, 보조자극성 분자의 기능, 예컨대, 다른 보조자극성 분자에 결합하는 데 중요한 단백질 도메인을 암호화하는 핵산 분자의 영역에 걸쳐 서열 동일성을 지닌 DNA 서열은 T 세포에서의 보조자극성 신호를 억제하는 제제로서 사용될 수 있는 보조자극성 단백질을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비천연 발생 보조자극성 분자들은 보조자극성 분자의 세포외 도메인의 천연 발생 아미노산 서열과 상당한(예컨대, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90-95% 이상) 아미노산 동일성을 가지고 있다.

보조자극성 분자의 반대 수용체에 보조자극성 분자가 결합하는 데 중요할 것 같은 보조자극성 분자의 아미노산 잔기를 결정하기 위해, 다른 종, 예컨대, 마우스 및 인간의 보조자극성 분자의 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 정렬시키고 주목되는 (예컨대, 동일한) 잔기들을 보존할 수 있다. 예를 들어, 이것은MegAlign(DNA STAR)과 같은 임의의 표준 정렬 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 보존되거나 동일한 잔기들은 보조자극성 분자들이 이들의 수용체에 적합하게 결합하기 위해 필요한 것 같으며, 따라서 변화에 따르지 않는 것 같다.

또한 결합에 중요한 보조자극성 분자의 특정 잔기들이 결정되었다. 예를 들어, B7-1과 B7-2의 상호작용을 위해 중요한 CD28의 부분은 특정부위 돌연변이유발, CD28 모노클로날 항체 에피토프 맵핑, 수용체 기재 부착 검정 및 세포 표면 수용체에 Ig-융합 단백질의 직접적인 결합을 사용하여 결정되었다. CD28의 프롤린이 풍부한 서열의 스트레치(MYPPPY)는 상기 단백질의 기능에 중요한 것으로 밝혀졌다(참조 : Truneh et al. 1996. Mol. Immunol. 33:321). 마찬가지로, CD28과 CTLA4의 기능적인 상호작용을 중재하는 데 중요한 B7-1 분자의 영역은 돌연변이에 의해 동정되었다. Y87 잔기(이들은 다양한 종으로부터 클로닝된 B7-1 및 B7-2 분자내에 보존되어 있다)를 포함하여, B7-1의 V-유사 도메인내의 2개지 소수성 잔기들은 중요한 것으로 밝혀졌다(참조 : Fargeas et al. 1995. J. Exp. Med. 182:667). 이들 또는 유사한 기술을 사용하여, 중요한, 따라서, 변화에 따르지 않는 보조자극성 분자의 세포외 도메인의 아미노산 잔기들을 결정할 수 있다.

보조자극성 분자들은 가용성 형태로 발현되거나 항체를 만들어 내는 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 가용성 보조자극성 분자 또는 항체들은 본 명세서에 추가로 상세히 기술되어 있는 바와 같이 T 세포에서의 보조자극성 신호를 억제시키는 제제로서 유용하다.

A. T 세포에서의 보조자극성 신호를 억제시키기 위해 세포외적으로 작용하는제제

1. 보조자극성 분자의 가용성 형태

하나의 양태에서, T 세포에서의 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 T 세포에서의 보조자극성 신호의 전달을 차단할 수 있는 T 세포 보조자극성 분자(예컨대, CTLA4, CD28 및/또는 ICOS)의 가용성 형태이다.

하나의 양태에서, T 세포에서의 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 CTLA4의 가용성 형태이다. 인간 및 쥐과동물 CTLA4 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 당분야에 공지되어 있다[참조 : Dariavich, et al. (1988) Eur. J. Immunol.18(12), 1901-1905; Brunet, J.F., et al. (1987) supra; Brunet, J.F. et al. (1988) Immunol. Rev.103:21-36; and Freeman, G.J., et al. (1992) J. Immunol.149, 3795-3801]. 특정 양태에서, 가용성 CTLA4 단백질은 전체 CTLA4 단백질을 포함한다. 바람직한 양태에서, 가용성 CTLA4 단백질은 CTLA4 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, CTLA4의 세포외 도메인의 가용성 재조합 형태는 효모내에서 발현된다(참조 : Gerstmayer et al. 1997. FEBS Lett. 407:63). 다른 양태에서, 가용성 CTLA4 단백질은 적어도 B7-1 및/또는 B7-2에 결합하는 능력을 지닌 CTLA4 단백질의 세포외 도메인의 일부분을 포함한다.

하나의 양태에서, 가용성 CTLA4 단백질 또는 이의 일부분은 적어도 B7-1 및/또는 B7-2에 결합하는 CTLA4의 일부분 및 제 2의 비-CTLA4 단백질의 일부분을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직한 양태에서, CTLA4 융합 단백질은 아미노 말단에서 예컨대, 온코스타틴(oncostatin) M으로부터의 신호 펩티드와 융합된 CTLA 세포외도메인을 포함한다(참조 : WO93/00431).

특히 바람직한 양태에서, CTLA4의 가용성 형태는 면역글로블린 분자의 일부분과 융합된 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질인, CTLA4Ig는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참조 : Perspectives in Drug Discovery and Design 2:221; Linsley WO 93/00431 and U.S. Patent 5,770,197).

하나의 양태에서, T 세포에서의 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 세포 보조자극성 분자(예컨대, B7-1, B7-2 및/또는 ICOS 리간드와 같은 B7 패밀리 분자)를 제공하는 가용성 형태의 항원이다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 보조자극성 분자의 가용성 형태는 B7-1의 가용성 형태 또는 B7-2의 가용성 형태 또는 B7-1의 가용성 형태와 B7-2의 가용성 형태의 조합체를 포함한다. B7 단백질들을 암호화하는 DNA 서열들은 당분야에 공지되어 있다[참조 : B7-2(Freeman et al. 1993 Science. 262:909 or GenBank Accession mumbers P42081 or A48754); B7-1(Freeman et al. J. Exp. Med. 1991. 174:625 or GenBank Accession numbers P33681 or A45803)]. 특정 양태에서, 가용성 B7 단백질은 전체 B7 단백질을 포함한다. 바람직한 양태에서, 가용성 B7 단백질은 B7 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, CTLA4의 세포외 도메인의 가용성 재조합 형태는 효모내에서 발현된다(참조 : Gerstmayer et al. 1997. FEBS Lett. 407:63). 다른 양태에서, 가용성 B7 단백질들은 적어도 CTLA4 및/또는 CD28에 결합하는 능력을 지닌 B7 단백질의 세포외 도메인의 일부분을 포함한다.

하나의 양태에서, 가용성 B7 단백질 또는 이의 일부분은 적어도 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 B7의 일부분 및 제 2의 비-B7 단백질의 일부분을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직한 양태에서, B7 융합 단백질은 아미노 말단에서 예컨대, 온코스타틴 M으로부터의 신호 펩티드와 융합된 B7 세포외 도메인을 포함한다(참조 : WO93/00431).

특히 바람직한 양태에서, B7의 가용성 형태는 면역글로불린 분자의 일부에 융합된 B7의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질, B7Ig는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참조: Linsley 1994.Perspectives in Drug Discovery and Design2:221; Linsley WO 93/00431, U.S.Patent 5,770,197, 및 U.S.Patent 5,580,756).

2. 보조자극성 분자에 결합하는 항체

일정 양태에서, T 세포내의 보조자극성 신호를 블로킹하는 제는 보조자극성 분자에 결합하는 항체이다. 보조자극성 분자에 결합하는 항체를 제조하는 데에 있어서, 보조자극성 단백질, 보조자극성 단백질의 일부(예컨대 보조자극성 단백질로부터 유도된 펩티드), 또는 보조자극성 분자의 아미노산 서열의 일부 또는 모두를 포함하는 융합 단백질은 표준 방법을 사용하여 항단백질 및/또는 항펩티드 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 항체 전체 뿐만 아니라 이의 단편도 포함하는 것을 의미한다. 항체의 단편(예컨대 Fab' 단편, F(ab')₂단편, 또는 신호 연쇄 항체)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 또한 용어 항체는 키메라의 인간화된 항체를 포함한다.

예를들면, 포유동물(예컨대 마우스, 햄스터, 또는 토끼)은 포유동물내의 항체 반응을 끌어내는 보조자극성 단백질 또는 펩티드의 면역원 형태를 이용하여 면역될 수 있다. 예컨대, 면역원은 재조합 보조자극성 분자 단백질 또는 이의 단편; 합성 펩티드 단편 또는 이의 표면에서 보조자극성 분자를 발현시키는 세포가 될 수 있다. 세포는 예컨대, 항원 존재 세포, T 세포 또는 보조자극성 분자가 세포 표면에서 발현될 수 있도록 보조자극성 분자를 암호화하는 핵산으로 트랜스펙션된 세포일 수 있다. 펩티드를 발현시키도록 트랜스펙션된 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예컨대, 보조자극성 분자 활성을 갖는 펩티드는 E.콜리와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(바쿨로바이러스(baculovirus)), 이스트 또는 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 및 NS0 세포와 같은 포유 동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포 및 발현 벡터는 문헌(Goeddel, (1990) supra)에서 발견되거나, 당업자에게 공지되어 있다. 이스트 S. 세리비사(cerivisae)에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1(Baldari.et al., (1987)Embo J.6:229-234), pMFa(Kurjan and Herskowitz,(1982) Cell30:933-943), pJRY88(Schultzet al.,(1987) Gene54:113-123), 및 pYES2(Invitrogen Corporatioin, San Diego, CA)를 포함한다. 배양된 곤충 세포(SF 9 세포)에서의 단백질 발현에 이용되는 바쿨로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(Smithet al., (1983) Mol. Cell Biol.3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology170:31-39)를 포함한다. 일반적으로, COS 세포(Gluzman, Y., (1981) Cell23: 175-182)는 포유동물 세포에서의 일시적인 중폭/발현을 위해 pCDM8(Seed, B.,(1987) Nature329:840)와 같은 벡터들와 함께 사용되는 반면, CHO(dhfr^- ChineseHamsterOvary) 세포는 포유동물 세포에서의 안정한 증폭/ 발현을 위해 pMT2PC(Kaufmanet al.(1987),EMBO J.6:187-195)와 같은 벡터와 사용된다. 재조합 단백질의 제조를 위한 바람직한 세포주는 ECACC(catalog #85110503)로부터 판매하며 문헌(Galfre, G. and Milstein, C.((1981)Methods in Enzymology 73(13):3-46; 및 Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y))에서 설명된 NS0 미엘로마 세포주이다. 벡터 DNA는 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 보조 침전, DEAE-덱스트란 중개 트랜스펙션, 리포펙션 또는 일렉트로포레이션(electroporation)과 같은 통상의 기술에 의해 포유동물 세포로 도입될 수 있다. 숙주 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))] 및 다른 실험 교재에서 알 수 있다. 포유동물 세포에 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예컨대, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 가장 일반적으로 시미안 바이러스 40으로부터 유도된다.

포유동물 세포 또는 이외의 세포에서 발현되는 보조자극성 분자의 활성을 갖는 펩티드는 황산 암모늄 침전, 분획 컬럼 크로마토그래피(예컨대 이온 교환, 겔여과, 전기영동, 친화도 크로마토그래피등), 및 결정화(참조: "Enzyme Purification and Related Techniques",Methods in Enzymology, 22:233-577(1971))를 포함하는 당업계의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다.

하기 표준 기술에 의해 인간 보조자극성 분자에 대한 항체를 발생시키는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이거나, 이러한 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 면역 세포의 표면에서 보조자극성 분자와 이의 천연 리간드(들)의 결합을 억제하여 면역 세포의 보조자극을 억제하는 항체는 치료용으로 사용하는데 특히 중요하다. 바람직한 안티-보조자극성 분자 항체는 B 림프구의 표면에서 B7-2 또는 B7-1을 결합시켜 T 세포 중개 면역 반응을 억제하거나 하향조절하고 CTLA4 및/또는 CD28과의 상호작용을 금지시킬 수 있는 항체이다. 다른 바람직한 안티-보조자극성 분자 항체는 제 1 항체 단독, 예컨대 항 B7-1 및 항 B7-2 항체의 조합과 비교하여 다른 보조자극성 분자에 결합하는 제 2 항체와 함께 T 세포의 보조자극의 억제를 증가시키는 항체이다.

A. 면역원. 용어 "면역원"은 본원에서 보조자극성 분자에 대한 항체의 제조를 위해 사용되는 활성 성분으로서 보조자극성 분자의 활성을 갖는 펩티드를 함유하는 조성물을 설명하는 것으로 사용된다. 보조자극성 분자 활성을 갖는 펩티드가 항체를 유도하기 위해 사용되는 경우, 펩티드는 펩티드 중합체로서 또는 배합체로서 캐리어에 결합되거나 또는 단독으로 사용될 수 있다.

적합한 항보조자극성 분자 항체를 발생시키기 위해, 면역원은 전형적으로 캐리어에 결합된 배합체로서 보조자극성 분자 활성을 갖는 펩티드를 면역원성 유효량으로 포함해야 한다. 단위 투여량당 펩티드의 유효량은 예방접종 시킨 동물의 종류, 동물의 몸무게, 및 당업계에 널리 공지된 선택된 면역 섭생법에 의존한다. 면역원 제조방법은 전형적으로 면역 투여량당 약 10마이크로그램 내지 약 500밀리그램, 바람직하게는 투여량당 약 50마이크로그램 내지 약 50밀리그램의 펩티드 농도를 함유할 것이다. 또한 면역 제조방법은 희석제의 일부로서 보조제를 포함할 수 있다. 완전 프로인트 보조제(CFA), 불완전 프로인트 보조제(IFA) 및 백반(alum)과 같은 보조제는 당업계에 널리 알려진 물질이며 여러 가지 공급원으로 상업적으로 사용된다.

당업자는 면역을 위한 보조자극성 분자의 형태를 천연적으로 발생시키는 대신, 본 발명을 사용하기 위해 항체를 성장시킬 수 있는 합성 펩티드를 사용할 수 있다는 점을 이해할 것이다. 가용성이며 막 결합된 보조자극성 분자 또는 펩티드 단편 모두는 면역원으로 사용하기에 적합할 뿐 아니라 면역친화도 정제에 의해 분리될 수 있다. 공지된 바와 같이 또는 앞서 설명된 바와 같이 분리될 수 있는 정제된 형태의 보조자극성 분자 단백질은 자체적으로 직접 면역원으로서 사용하거나 보조자극성 분자의 클로닝된 유전자를 사용하는 유전자 엔지니어링뿐 아니라 화학 커플링 수단을 포함하는 통상의 기술에 의해 적합한 캐리어 단백질에 결합시킬 수 있다.

면역을 위해 선택된 펩티드 또는 단백질은 이의 면역원성을 증가시키도록 개질될 수 있다. 예를들면, 펩티드에 면역원성을 공급하는 기술은 당업게에 널리 공지된 캐리어로의 결합 또는 다른 기술을 포함한다. 또한, 면역을 위해 선택된 임의의 펩티드는 합성될 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 펩티드는 분지된 폴리펩티드와 같이 합성될 수 있어 공지된 바와 같이 면역 반응을 향상시킬 수 있다[참조; 예를들면 Peptides. Edited by Bernd Gutte Academic Press 1995. pp. 456-493].

또한 정제된 보조자극성 분자 단백질은 지질 또는 당질과 같은 비단백성 물질을 이용하여 공유로 또는 비공유로 개질화되어 면역원성 또는 가용성을 향상시킬 수 있다. 또한, 정제된 보조자극성 분자 단백질은 면역원성을 증가시키도록 바이러스 입자, 복제 바이러스, 또는 다른 미생물과 결합되거나 내부에 혼입될 수 있다. 예를들면, 보조자극성 분자 단백질은 바이러스 입자, 미생물 또는 이의 면역원 일부에 화학적으로 부착될 수 있다.

예시한 양태에서, 정제된 보조자극성 분자 단백질 또는 보조자극성 분자 활성을 갖는 펩티드 단편(예를들면, 한정된 단백분해 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성됨)은 동물에서 면역원성인 캐리어에 컨쥬게이팅된다. 바람직한 캐리어는 알부민, 혈청 단백질(예를들면, 글루불린 및 지단백질)과 같은 단백질, 및 폴리아미노산을 포함한다. 유용한 단백질의 예는 소 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민, 타이로글로불린, 키홀 리펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 란 난알부민, 및 소 감마글루불린을 포함한다. 또한 폴리리신 또는 폴리아르기닌과 같은 합성 폴리아미노산은 유용한 캐리어이다. 적합한 면역원성 캐리어에 대한 보조자극성 분자 단백질 또는 펩티드 단편의 공유 부착에 대해, 당업자에게 공지된 다수의 화학적인 가교제가 있다. 바람직한 가교제는 헤테로이작용성 가교제이며, 단계별로 단백질을 결합하기 위해 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 헤테로이작용성 가교제는 다양하며, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS); N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트(SMPB), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC); 4-숙신이미딜옥시카르보닐-a-메틸-a-(2-피리미딜디티오)-톨루엔(SMPT), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트]헥사노에이트(LC-SPDP)를 포함한다.

또한, 보조자극성 분자 단백질을 표면에서 발현하는 전체 세포들을 이용하여 단순하게 면역화시키는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 세포주가 활성화 B 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 보조자극성 분자 항원에 대해 모노클로날 항체를 발생시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 예를들면, 비장의 B 세포는 개체로부터 수득되어 안티-면역글로불린으로 활성화될 수 있다. 또한, 단 보조자극성 분자가 라지(Raji) 세포주(B 세포 버키트림프종, 참조 Freeman, G.J. et al. (1993) Science262:909-911) 또는 JY B 림프블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주[참조: Azuma, M. et al. (1993) Nature366:76-79)와 같은 세포 표면에서 발현된다면, 비장의 B 세포주가 사용될 수 있다. 보조자극성 분자 특정 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있는 전체 세포는 재조합 트랜스펙턴트(transfectant)를 포함한다. 예를들면 COS 및 CHO 세포는 문헌[Knudson et al. (1993,PNAS90:4003-4007); Travernor et al.(1993, Immunogenitics 37:474-477); Dougherty et al. (1991),J Exp Med174:1-5); 및 Aruffo et al.(1990,Cell61:1303-1313)]과 같이보조자극성 분자 cDNA로 트랜스펙션시켜 재구성되어 세포 표면에 완전한 보조자극성 분자를 생성시킬 수 있다. 이후 이러한 트랜스펙턴트 세포는 미리 선택된 특정한 안티-보조자극성 분자를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 트랜스펙턴트 세포중 다른 예는 보조자극성 분자 단백질을 포도당화시킬 수 있는 진핵 세포가 특히 공지되어 있지만, 세포 표면에 트랜스펙션된 보조자극성 분자 유전자를 발현시키는 임의의 작업이 전체 세포 면역원을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

B. 폴리클로날 안티-보조자극성 분자 항체. 보조자극성 분자 활성을 갖는 정제된 보조자극성 분자 단백질 또는 펩티드에 대한 폴리클로날 항체는 보조자극성 분자 단백질의 세포외 도메인과 같은 보조자극성 분자 면역원과 보조제의 다수의 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주입에 의해 동물에게서 일반적으로 유도될 수 있다. 예를 들어, 상술된 바와 같이, 보조자극성 분자(중요한 특별한 에피토프(들)를 함유하는 단편을 포함한다)를 면역된 종에서 면역성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민에 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다.

숙주 동물 또는 이로부터의 배양된 항체 생성 세포의 경로 및 일정은 일반적으로 항체 자극 및 생성을 위해 확립된 통상의 기술을 사용할 수 있다. 예시적 양태로서, 프로인트 완전면역보강제와 약 1㎍ 내지 1mg의 컨쥬케이트를 조합시키고 상기 액제를 다중 부위에 피내로 주입시킴으로써 면역원성 보조자극성 분자 컨쥬케이트 또는 유도체에 대하여 동물을 면역시킨다. 한달 후, 상기 동물을 다중 부위에의 피하 주사에 의해 프로인트 완전면역보강제(또는 그 밖의 적합한 보강제)를 컨쥬케이트 본래량의 1/5 내지 1/10을 추가로 주사한다. 7일 내지 14일 후, 동물의 혈액을 채취하고 이의 혈청을 안티-보조자극성 분자 역가에 대하여 검정한다. 역가 정점에 이를 때까지 상기 동물에게 추가로 주사한다. 상기 동물에게 동일한 보조자극성 분자 단백질의 컨쥬게이트지만 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교제를 통해 컨쥬게이션된 컨쥬게이트를 추가로 주입시키는 것이 바람직하다. 컨쥬케이트는 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양액에서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제도 면역 반응을 증대시키는데 사용될 수 있다.

이러한 포유동물로부터 생성된 항체 분자의 집단은 "폴리클로날"로서 언급되는데, 그 이유는 상기 집단이 보조자극성 분자에 대하여 다양한 면역특이성 및 친화성을 지닌 항체를 포함하기 때문이다. 그런 다음, 상기 항체 분자를 포유동물로부터 수집하고 널리 공지된 기술, 예를 들어 DEAE 세파덱스를 이용한 기술을 사용하여 단리시켜 IgG 분획을 수득한다. 항체의 특이성을 증대시키기 위해, 고체상 부착된 면역원을 사용하는 면역친화도 크로마토그래피에 의해 항제를 정제할 수 있다. 면역원이 항체 분자와 면역반응하여 고체상 부착된 면역복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안에 상기 항체를 고체상 부착된 면역원과 접촉시킨다. 결합된 항체는 표준 기술에 의해 상기 복합체로부터 분리한다.

C. 모노클로날 안티-보조자극성 분자 항체. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 보조자극성 분자의 특정 에피토프와 면역반응을 일으킬 수 있는 항원 결합 부위의 유일한 단일종을 함유하는 항체 분자의 집단을 언급한다. 이와 같이, 모노클로날 항체 조성물은 전형적으로 면역반응을 일으키는 특정의 보조자극성 분자 단백질에 대한 단일 결합 친화도를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용된 모노클로날 항체의 또 다른 특징은 인간으로부터 유도된 보조자극성 분자와 면역반응을 일으킨다는 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 모노클로날 항체는 보조자극성 분자 항원의 에피토프로 지향되어, 항체와 보조자극성 분자 항원간의 복합체 형성이 면역 세포의 표면상에서의 천연 리간드(들)과 보조자극성 분자의 상호작용을 억제함으로써, 보조자극성 분자-리간드 상호작용을 통해 T 세포의 보조자극을 억제한다. 보조자극성 분자의 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 배양액내의 연속적인 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키기 위해 제공되는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이들 기술로는 문헌[Kohler and Milstein 1975,Nature256:495-497]에 처음으로 기술되어 있는 하이브리도마 기술, 및 보다 최근의 인간 B 세포 하이브리도마 기술[참고문헌: Kozbor et al. (1983)Immunol Today4:72], EBV-하이브리도마 기술[참고문헌: Cole et al. (1985),Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 및 트리오마(trioma) 기술이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 유용한 모노클로날 항체를 효과적으로 수득할 수 있는 다른 방법은 파아지 디스플레이 기술[참고문헌: Marks et al., (1992)J Biol Chem16007-16010]을 포함한다.

하나의 양태로서, 본 발명에서 적용된 항체 제조물은 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체이다. 하이브리도마 융합 기술은 콜러(Kohler) 및 밀슈테인(Milstein)[참고문헌: Kohler et al.Nature(1975) 256:495-97; Brown et al. (1981)J. Immunol127:539-46; Brown et al. (1980)J Biol Chem255:4980-83; Yeh et al. (1976)PNAS76:2927-31; and Yeh et al. (1982)Int. J. Cancer29:269-75]에 의해 처음으로 도입되었다.

(a) 보조자극성 분자에 의한 동물의 면역. 면역반응은 면역학적으로 수용능력이 있는 포유동물에게 면역학적 유효량, 즉, 면역반응을 생성시키기에 충분한 양의 보조자극성 분자 면역원을 투여함으로써 전형적으로 달성된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 토끼, 래트 또는 마우스와 같은 설치류이다. 그런 다음, 상기 포유동물은 포유동물이 보조자극성 분자 면역원과 면역반응을 일으키는 항체 분자를 분비하는 세포를 생성시키기에 충분한 시간 동안 유지된다. 이러한 면역반응은 면역원 단백질의 제조물과의 면역반응성을 위해 생성된 항체 분자를 선별함으로써 검출된다. 임의로는, 검정시 항체 분자에 의해 검출하고자 하는 형태, 예를 들어 예를 들어 보조자극성 분자의 막 결합형의 단백질의 제조물로 항체 분자를 선별하는 것이 요망될 수도 있다. 이들 선별 방법은 당업자에게는 널리 공지되어 있다.

(b) 그런 다음, 요망되는 항체를 분비하는 각각의 면역된 포유동물로부터 제거된 항체 생성 세포의 현탁액이 제조된다. 충분한 시간이 경과된 후에, 마우스가 절명되고 체성 항체 생성 림프구가 수득된다. 항체 생성 세포는 초회감작된 동물의 림프 마디, 비장 및 말초 혈액으로부터 유도될 수도 있다. 비장 세포가 바람직하며, 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생리학적으로 허용되는 배지에서 개개의 세포로 기계적으로 분리될 수 있다. 마우스 림프구는 하기된 마우스 골수종과의 고율의 안정한 융합물을 제공한다. 래트, 토끼 및 개구리 체세포도 또한 사용될 수 있다. 요망되는 면역글로불린을 암호화하는 비장 세포 염색체는 골수종 세포와 비장 세포를 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 융합제의 존재하에 융합시킴으로써 불멸화된다. 다수의 골수종 세포주 중의 어느 세포주도 표준 기술에 따라 융합 파트너로서 사용될 수 있다; 예를 들어 P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주. 이들 골수종 세포주는 메릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)로부터 입수할 수 있다.

이후, 요망되는 하이브리도마를 포함하는 생성된 세포는 비융합된 모골수종 또는 림프구 세포가 궁극적으로는 사멸되는 HAT 배지와 같은 선택 배지에서 성장된다. 하이브리도마 세포만이 살아남고 한정 희석 조건하에서 성장되어 단리된 클론을 수득할 수 있다. 하이브리도마의 상층액은 요망되는 특이성을 지닌 항체의 존재에 대하여 예를 들어 면역을 위해 사용된 항원을 사용하는 면역검정 기술에 의해 선별된다. 이후, 포지티브 클론은 한정 희석 조건하에서 서브클로닝될 수 있으며 생성된 모노클로날 항체는 단리될 수 있다. 그 밖의 단백질 및 그 밖의 오염물질로부터 이들을 유리시키기 위해 모노클로날 항체의 단리 및 정제를 위한 다양한 통상의 방법이 존재한다. 모노클로날 항체를 정제시키기 위해 공통적으로 사용된 방법으로는 황산암모늄 침전법, 이온교환 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피가 포함된다[참조예: Zola et al. inMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (ed.) pp. 51-52 (CRC Press 1982)]. 이들 방법에 따라 생성된 하이브리도마는 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 시험관내 또는 생체내(복수액)에서 증식될 수 있다.

일반적으로, 개개의 세포주는 시험관내, 예를 들어 실험실의 배양 용기에서증식될 수 있으며, 고농도의 단일한 특이적 모노클로날 항체를 함유하는 배양 배지가 상층용액 붓기, 여과 또는 원심분리에 의해 수확될 수 있다. 대안적으로, 모노클로날 항체의 수율은 하이브리도마의 샘플을 본래의 융합을 위해 사용된 체세포 및 골수종 세포를 제공하는데 사용된 유형의 조직 적합성 동물내로 주입시킴으로써 증대될 수 있다. 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양은 주사된 동물에게서 발생한다. 복수액 또는 혈청과 같은 동물의 체액은 모노클로날 항체를 고농도로 제공한다. 인간 하이브도마 또는 EBV-하이브리도마가 사용될 때, 마우스와 같은 동물내로 주입된 외종 이식편의 거부반응을 피하는 것이 필요하다. 면역결핍성 또는 누드 마우스가 사용될 수 있거나 하이브리도마가 고형의 피하 종양으로서 조사된(irradiated) 누드 마우스로 계대배양되고, 시험관내에서 배양된 후, 다량의 특정의 인간 모노클로날 항체를 분비하는 복수 종양을 전개시키는 조사된(irradiated) 누드 마우스인 초회 감작된 프리스탄(pristane)의 복강내로 주입될 수 있다.

이들 조성물의 제조에 유용한 배지 및 동물 둘 모두 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 입수할 수 있으며, 합성 배양 배지, 근교배 마우스 등을 포함한다. 하나의 예시적 합성 배지는 4.5gm/ℓ의 글루코오스, 20mM의 글루타민 및 20%의 우태아 혈청이 보충된 둘베코즈 미니멈 에센셜 배지(DMEM; Dulbecco et al. (1959)Virol8:396)이다. 예시적인 근교배 마우스 균주는 Balb/C이다.

D. 인간화된 안티-보조자극성 분자 항체. 인간이 아닌 피검체에서 생성된 항체가 인간에게 치료적으로 사용될 때, 이들 항체는 외부물질로서 다양한 정도로인지되며 면역 반응이 환자에게서 발생될 수 있다. 이러한 문제를 최소화시키거나 제거하기 위한 하나의 접근법(일반적인 면역억제에 바람직한)은 키메라(chimeric) 항체 유도체, 즉, 인간이 아닌 동물의 가변 영역과 인간의 불변 영역을 조합시키는 항체 분자를 생성시키는 것이다. 이러한 항체는 상기된 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 균등물이지만, 인간에게 투여될 때 보다 덜 면역원성일 수 있어 환자에 의해 보다 용이하게 허용될 것으로 여겨진다.

보조자극성 분자와 반응성이 있는 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체(즉, 키메라 항체)는 예를 들어 키메라 항체를 생성시키기 위해 최근에 개발된 기술에 의해 생성될 수 있다. 인간화된 항체는 예를 들어 항체의 면역원성 부분을 상응하는, 그렇지만 비면역원성인 부분과 대체시킴으로써 생성될 수 있다. 따라서, 뮤린(또는 그 밖의 종) 안티-보조자극성 분자 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 유전자는 인간의 불변 영역을 암호화하는 유전자로 대체된다[참고문헌: 로빈손(Robinson) 등의 국제특허공보 PCT/US86/02269호; 아키라(Akira) 등의 유럽특허출원 제 184,187호; 타니구치, 엠.(Taniguchi, M.)의 유럽특허출원 제 171,496호; 모리손 등의 유럽특허출원 제 173,494호; 네우베르게르(Neuberger) 등의 PCT 출원 WO96/01533호; 카빌리(Cabilly) 등의 유럽특허출원 제 125,023호; Better et al. (1988Science240:1041-1043); Liu et al. (1987)PNAS84:3439-3443; Liu et al. (1987)J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al.(1987PNAS84:214-218; Nishimura et al.(1987)Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al.(1985)Nature314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559]. "인간화된" 키메라 항체의 일반적인 검토사항은 문헌[Morrison, S.L. (1985)Science229:1202-1207 and by Oi et al(1986)BioTechniques4:214]에 제시되어 있다. 이들 방법은 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄로부터 면역글로불린 가변 영역의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 단리시키고, 조작하고 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산원은 당업자에게는 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 하이브리도마를 생성시키는 안티-보조자극성 분자 항체로부터 얻을 수도 있다. 이후, 키메라 cDNA는 적합한 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다.

적합한 "인간화된" 항체는 CDR 또는 CEA 치환에 의해 교호적으로 생성될 수 있다[참고문헌: 더 윈터(The Winter)의 U.S. 특허 제 5,225,539호; Jones et al.(1986)Nature321:552-525; Verhoeyan et al. (1988)Science239:1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060].

E. 조합 안티-보조자극성 분자 항체. 본 발명의 단일클론성 및 다클론성 항체 조성물 둘 모두는 또한 재조합 DNA 기술의 당업자들에게 널리 공지된 그 밖의 방법에 의해 제조될 수 있다. "조합 항체 디스플레이" 방법으로 언급되는 또 다른 방법이 특정 항원 특이성을 갖는 항체 단편을 동정하고 단리시키기 위해 개발되었으며, 단일클론성 안티-보조자극성 분자 항체뿐만 아니라 다클론성 안티-보조자극성 분자집단을 생성하는데 사용될 수 있다[참조: Sastry et al.(1989)PNAS86:5728; Huse et al. (1989)Science246: 1275; and Orlandi et al. (1989)PNAS86:3833]. 상기 기재된 바와 같이 동물을 보조자극성 분자 면역원으로 면역화시킨 후, 형성된 B-세포 푸울(pool)의 항체 레퍼토리를 클로닝한다. 올리고머 프라이머와 PCR의 혼합물을 사용하여 면역글로불린 분자의 다양한 집단의 가변 영역의 DNA 서열을 직접 얻기 위한 방법은 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 5' 리더(신호 펩티드) 서열 및/또는 프레임워크 1(FR1) 서열에 상응하는 혼합된 올리고누클레오티드 프라이머뿐만 아니라 보존된 3' 불변 영역 프라이머에 대한 프라이머가 다수의 쥐과동물 항체로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 PCT 증폭시키는데 사용될 수 있다[참조: Larrick et al.(1991) Biotechniques 11: 152-156]. 유사한 기술이 인간 항체로부터의 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭시키는데 사용될 수 있다[참조: Larrick et al. (1991)Methods: Companion to Methods in Enzymology2: 106-110]. 인간 면역글로불린 V-유전자를 클로닝시키는 능력은 유전자 이식된 동물의 인간 항체 레퍼토리를 생성시키는데 있어서의 진보에 특히 중요하다[참조예: Bruggeman et al. (1993)Year Immunol7:33-40; Tuaillon et al. (1993)PNAS90:3720-3724; Bruggeman et al. (1991)Eur J Immunol21:1323-1326; and Wood et al. PCT publication WO 91/00906].

예시적 양태에서, RNA는 예를 들어, 말초혈 세포, 골수 또는 비장 제제의 활성화된 B 세포로부터 표준 프로토콜을 사용하여 단리된다[참조예: 미국 특허 제 4,683,202호; Orlandi, et al.PNAS(1989) 86:3833-3837; Sastry et al.,PNAS(1989) 86:5728-5732; and Huse et al., (1989)Science246:1275-1281]. 제 1 가닥 cDNA는 중쇄 및 각각의 κ및 λ경쇄의 불변 영역에 특이적인 프라이머뿐만 아니라 신호 서열을 위한 프라이머를 사용하여 합성된다. 가변 영역 PCR 프라이머를 사용하여, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역이 각각 단독으로 또는 조합하여증폭되고, 디스플레이 패키지를 생성시키는데 있어 추가의 조작을 위한 적합한 벡터로 결찰된다. 증폭 프로토콜에 유용한 올리고누클레오티드 프라이머는 변질 위치에서 있는 특이적 또는 변질 또는 도입 이노신(inosine)일 수 있다. 제한 엔도누클레아제 인식 서열 또한 프라이머에 도입되어 발현을 위한 예정된 판독 프레임에 있는 벡터로 증폭된 단편을 클로닝하도록 할 수 있다.

면역화 유도된 항체 레퍼토리로부터 클로닝된 V-유전자 라이브러리는 바람직하게는 필라멘트상 파아지로부터 유도된 디스플레이 패키지의 집단에 의해 발현되어 항체 디스플레이 라이브러리를 형성할 수 있다. 이상적으로, 디스플레이 패키지는, 매우 큰 다양한 항체 디스플레이 라이브러리의 샘플링, 각각의 친화성 분리 단계 후의 신속한 분류 및 정제된 디스플레이 패키지로부터의 항체 유전자의 용이한 분리를 가능하게 하는 시스템을 포함한다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성시키기 위한 시판되는 키트(예를 들어, PharmaciaRecombinant Phage Antibody System, 카달로그 번호 27-9400-1; 및 StratageneSurf ZAP™ 파아지 디스플레이 키트, 카달로그 번호 240612) 이외, 다양한 안티-보조자극성 분자 항체 디스플레이 라이브러리를 생성시키는데 사용하기 위해 특히 적용될 수 있는 방법 및 시약의 예를 문헌으로부터 알 수 있다[참조예: Ladner et al. U.S. Patent No. 5,223,409; Kang et al. International Publication No. WO 92/18619; Dower et al. International Publication No. WO 91/17271; Winter et al. International Publication No. WO 92/20791; Markland et al. International Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. International Publication No. WO 93/01288;McCafferty et al. International Publication No. WO 92/01047; Garrard et al. International Publication No. WO 92/09690; Ladner et al. International Publication No. Wo 90/02089; Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372; Hay et al. (1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85; Huse et al.(1989)Science246:1275-1281; Griffths et al.(1993)EMBO J12:725-734; Hawkins et al. (1992)J Mol Biol226:889-896; Clackson et al.(1991)Nature352:624-628; Gram et al.(1992)PNAS89:3576-3580; Garrad et al. (1991)Bio/Technology9:1373-1377; Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137; and Barbas et al. (1991)PNAS88:7978-7982].

특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 도메인은 동일한 폴리펩티드 상에서 발현되고, 가요성 링커에 의해 결합되어 단일쇄 Fv 단편을 형성하며, scFV 유전자가 이후 목적하는 발현 벡터 또는 파아지 게놈으로 클로닝된다. 일반적으로 문헌(MaCafferty et al.,Nature(1990) 348: 552-554)에 기재된 바와 같이, 가요성 (Gly₄-Ser)₃링커에 결합된 완전한 V_H및 V_L도메인이 항원 친화성을 기초로 디스플레이 패키지를 분리가능하게 하는 단일 쇄 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이후, 보조자극성 분자에 면역활성인 단리된 scFV 항체는 상기 방법에 사용하기 위한 약제학적 제제로 제형될 수 있다.

F. 하이브리도마 및 제조 방법. 본 발명에 유용한 하이브리도마는 보조자극성 분자와 특이적으로 면역반응하게 되는 단일클론성 항체를 생성시킬 수 있는 능력을 갖는 것으로 특징되는 것들이다. 하기 기재되는 바와 같이, 하이브리도마 세포 생성 안티-보조자극성 분자 항체가 수용체 동물에 직접 이식되어 항체의 불변 공급원을 제공할 수 있다. 하이브리도마 배양물을 캡슐화시키기 위한 면역-분리 장치의 사용은 이식된 세포에 대한 면역원성 반응을 억제할뿐만 아니라, 면역손상된 숙주의 하이브리도마 세포의 억제되지 않은 증식을 억제할 수 있다. 본 발명의 바람직한 하이브리도마는 활성화된 인간 B 세포의 세포 표면 상에서 발현된 보조자극성 분자와 특이적으로 면역반응하는 항체 분자를 생성시키는 것으로 특징된다.

목적하는 면역특이성을 갖는, 즉, 특정 보조자극성 분자 및/또는 보조자극성 분자의 확인가능한 에피토우프로의 결합능을 갖는 항체 분자를 생성, 예를 들어 분비하는 하이브리도마를 생성시키는 방법은 당해 널리 공지되어 있다. 문헌(Niman et al.(1983)PNAS80:4949-4953; and Galfre et al. (1981)Meth. Enzymol.73:3-46)에 기재된 하이브리도마 기술이 특히 적용될 수 있다.

또 다른 예시적 방법에서, 인간 항체 레퍼토리를 갖는 유전자 이식된 마우스가 인간 보조자극성 분자로 면역화될 수 있다. 이러한 면역화된 유전자 이식된 마우스로부터의 비세포가 인간 보조자극성 분자와 특이적 반응성을 갖는 인간 단일클론성 항체를 분리하는 하이브리도마를 생성시키는데 사용될 수 있다[참조예: Wood et al. PCT publication WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT publication WO 91/10741; Lonberg et al. PCT publication WO 92/03918; Kay et al. PCT publication 92/03917; Lonberg, N. et al. (1994)Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. (1994)Nature Genet.7:13-21; Morrison, S.L. et al.(1994)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman et al.(1993)Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. (1993)PNAS90:3720-3724; and Bruggeman et al. (1991)Eur J Immunol 21:1323-1326].

본원에서 사용된 용어 "항체"는 본원 기재된 바와 같은 보조자극성 분자와 특이적 반응성이 있는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 종래 기술을 사용하여 단편화될 수 있으며, 이러한 단편은 전체 항체에 대해 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 사용하기 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')₂단편은 항체를 펩신으로 처리하므로써 생성될 수 있다. 형성된 F(ab')₂단편은 디술파이드 브릿지를 환원시키도록 처리되어 Fab' 단편을 생성시킬 수 있다.

이러한 방법 또는 이외의 방법을 사용하여 생성된 항체는 이들 항체가 하기 기재된 방법을 사용하여 T 세포내의 보조자극성 신호를 억제하는지의 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다.

한 가지 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 B7-1 및 B7-2 둘 모두와 결합하는 항체이다. 이러한 항체를 생성시키기 위해, 예를 들어, 두개의 보조자극성 분자 사이에 보존되는 세포외 도메인의 일부가 면역원으로서 사용될 수 있다[참조예: Metzler et al. 1997Nat Struct. Biol.4:527].

한 가지 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 B7-1과 결합하는 항체이다. 이러한 항체는 당해 공지되어 있거나, 면역원으로서 B7-1 또는 이의 일부를 사용하여 상기 언급된 바와 같이 생성되고, 상기 언급된 방법 또는 이외의 표준 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. B7-1 항체의 예는 문헌(U.S. Patent 5,747,034 and McHugh et al. 1998.Clin. Immunol. Immunopathol.87:50 or Rugtveit et al. 1997.Clin Exp. Immunol. 110:104)에 설명된 것들이 포함된다.

또 다른 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 B7-2과 결합하는 항체이다. 이러한 항체는 당해 공지되어 있거나, 면역원으로서 B7-2 또는 이의 일부를 사용하여 상기 언급된 바와 같이 생성되고, 상기 언급된 방법 또는 이외의 표준 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. B7-2 항체의 예는 문헌(Rugtveit et al. 1997.Clin Exp. Immunol. 110:104)에 설명된 것들이 포함된다.

한 가지 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 B7-1과 결합하는 항체와 B7-2와 결합하는 항체의 조합물이다.

또 다른 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 CD28과 결합하는 항체이나, T 세포로 보조자극성 신호를 유도하지 않는다(예를 들어, CD28 항체의 Fab 단편). 이러한 항체는 당해 공지되어 있거나, 면역원으로서 CD28 분자 또는 이의 일부를 사용하여 상기 언급된 바와 같이 생성되고, 상기 언급된 방법 또는 이외의 표준 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 공지된 안티-CD28의 예는 문헌(Darling et al. 1997.Gene Ther. 4:1350)에 설명된 것들이 포함된다.

바람직한 양태에서, CD28에 결합하는 항체의 Fab 단편이 사용될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 CD28을 가교시킬 수 없는 이러한 항체 단편은 T 세포 보조자극을 차단하는 것으로 밝혀졌다[참조: Walunas et al. 1994.Immunity1:405].

또 다른 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 네가티브 신호를 T 세포에 전달하므로써 T 세포내 보조자극성 신호를 차단하는 CTLA4에 결합하는 항체이다(즉, CTLA4 작용제임). 예를 들어, T 세포의 표면 상에서의 CTLA 4 가교는 증식 및 IL-2 생성을 억제하는 것으로 나타났다[참조: Krummel and Allison. 1996.J. Exp. Med.183:2533]. 이러한 항체는 면역원으로서 CTLA4 분자 또는 이의 일부를 사용하여 상기 언급된 바와 같이 생성되고, 상기 언급된 방법 또는 이외의 표준 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 항체의 예는 문헌(Vandenborre et al. 1998.Am. J. Pathol. 152:963)에 설명된 것들이 포함된다.

또 다른 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 ICOS와 결합하는 항체이며, 이는 T 세포로 보조자극성 신호를 차단한다. 이러한 항체는 면역원으로서 ICOS 분자 또는 이의 일부를 사용하여 상기 언급된 바와 같이 생성되고, 상기 언급된 방법 또는 이외의 표준 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다.

IV. 보조자극성 분자의 발현을 조절하는 제제

또 다른 양태에서, T 세포내 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 보조자극성 분자의 발현을 방해하는 제이다. 예를 들어, 항원 제공 세포상의 CD40와 T 세포상의 CD40 리간드(CD40L) 간의 상호작용은 항원 제공 세포상에서 B7-1 또는 B7-2의 발현을 유지하거나, 증진시키거나, 연장시키는데 중요하며, 증진된 보조자극을 유도하는 것으로 밝혀졌다[참조: Van Gool, et al. 1996.Immunol. Rev. 153:47; Klaus et al. 1994.J. Immunol. 152:5643].

한 가지 양태에서, 보조자극성 분자의 발현을 차단하여 T 세포에서의 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 CD40 또는 CD40L의 가용성 형태이다. 이들 CD40 또는 CD40L을 암호화하는 DNA 서열은 공지이다(참고문헌: CD40에 대해 GenBank Accession Nos. Y10507 또는 Stamenlovic et al. 1988.EMBO J.7:1053-1059, 또는 CD40L에 대해 Gauchat et al. 1993. FEBS315(3):259-266; Graf et al.1992.Eur. J. Immunol.22:3191-3194; Seyama 1996.Hum. Genet.97:180-185 또는 GenBank Acession Nos. L07414, X67878, X96710).

한 가지 양태에서, 보조자극성 분자의 발현을 차단하여 T 세포에서의 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 CD40 또는 CD40L의 가용성 형태이다. 한 가지 양태에서, 가용성 CD40 또는 CD40L은 전체 단백질을 포함한다. 바람직한 양태에서, 가용성 CD40 또는 CD40L 단백질은 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, CD40 또는 CD40L 단백질 또는 이것의 부분의 세포외 도메인의 가용성 재조합 형태가 CD40 또는 CD40L의 일부 이상을 포함하는 융합 단백질로서 제조될 수 있으며, 그 결과 APC상의 CD40와 T 세포상의 CD40L과의 상호작용이 방해되고 T 세포로의 보조자극성 신호의 전달이 저해된다. 이러한 CD40 또는 CD40L 단백질의 가용성, 재조합 형태는 그것의 대응하는 수용체와 결합하기에 충분한 분자의 일부 이상을 포함하고, 제 2의 비-CD40 또는 CD40L 단백질의 일부 이상을 포함한다. 바람직한 구체에에서, CD40 또는 CD40L 융합 단백질은 아미노 말단에서 예를 들어, 온코스타틴 M(WO93/00431)으로부터의 신호 펩티드와 융합되는 CD40 또는 CD40L 세포외 도메인을 포함한다.

특히 바람직한 양태에서, CD40 또는 CD40L의 가용성 형태는 면역글로불린 분자(예를 들어, Chen et al. 1995. J. Immunol. 155:2833)의 부분과 융합된 CD40 또는 CD40L의 세포외 도메인을 포함하는 융합단백질이다. 이러한 융합단백질 즉, CD40Ig 또는 CD40LIg은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참고문헌: Linsley 1994. Perspectives in Drug Discovery and Design 2:221; Linsley WO93/00431, 미국특허 제 5,770,197호 및 미국특허 제 5,580,756호).

또한, CD40 리간드에 대한 항체가 T 세포에서 보조자극성 신호를 저해하는 제제와 상승작용하여 이식편 내성을 증진시킴이 밝혀졌다(Kirt et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8279; Larsen et al. 1996. Nature 381:434).

따라서, 한 가지 양태에서, 이들 분자와 결합하나 보조자극성 분자의 발현을 유도하지 아니하는 CD40 또는 CD40L에 대한 항체가 T 세포에서 보조자극성 신호를 차단하는 제제로서 사용될 수 있다.

V. 보조자극성 신호를 저해하기 위해 세포내에서 작용하는 제제

한 가지 양태에서, T 세포내에서 보조자극성 신호를 저해하는 제제는 세포내에서 작용하여 이러한 신호를 저해하는 제제이다. CD28 표면 수용체(즉, 보조자극성 신호)를 통한 T 세포의 자극은 T 세포에서 D-3 포스포이노시티드의 생성을 유도한다. 따라서, 한 가지 양태에서, D-3 포스포이노시티드의 생성이 저해되어 보조자극성 신호가 저해되고, 그 결과 예를 들어, T 세포증식 및/또는 사이토카인 생성에 의해 측정되는 것과 같이 T 세포반응이 저해된다. 용어 "D-3 포스포이노시티드"는 이노시톨 고리의 D-3 위치에서 포스포릴화된 포스파티딜이오시톨의 유도체를포함하고, 포스파티딜이노시톨(3)-모노포스페이트(PtdIns(3)P), 및 포스파티딜이노시톨(3,4)-비스포스페이트(PtdIns(3)P₂), 및 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리포스페이트(PtdIns (3,4,5)P₃)를 포함할 수 있다.

D-3 포스포이노시티드는 포스파티딜-이노시톨 3-키나제(PI3K)에 의해 세포내에서 생성된다. PI3K는 85kDa 서브유닛으로 구성된 헤테로다이머이며, 이것은 SH2 도메인 및 110kDa의 촉매 서브유닛을 통해 티로실-포스포릴화된 단백질과 결합한다 (Dhand, R. et al. (1994) EMBO J. 13:522 및 Carpenter, C.L. et al.(1993) Mol. Cell Biol. 13:1657).

따라서, 한 가지 양태에서, T 세포내의 보조자극성 신호를 저해하는 제제는 PI3K의 활성을 저해하는 제제이다. T 세포내에서 PI3K의 활성을 저해하는 바람직한 제제는 진균성 대사물 오르트만닌(wortmannin), 또는 이것의 유도체 또는 유사체이다. 오르트만닌은T.wortmannii(Kyowa Hakko Kohyo Co. Ltd) 또는P. fumiculosum(Sigma)로부터 유도된다. 오르트만 유도체 또는 유사체는 PI3K 및 T 세포 반응을 저해할 수 있는 능력을 지닌 오르트만닌과 구조적으로 관련된 화합물을 포함한다. 오르트만닌 유도체 및 유사체의 예는 참고문헌(Wiesinger, D. et al.(1974)Experientia 30:135-136; Close, A et al. (1981)J. Med. Chem. 24: 1465-1471; 및 Baggiolini, M. et al. (1987)Exp. Cell Res. 169:408-418)에 기술된다. 다른 PI3K 저해제는 바이오플라베노이드 퀘르세틴, 또는 이것의 유도체 또는 유사체이다. 퀘르세틴 유도체 또는 유사체는 PI3K 및 T 세포 반응에 대한 저해활성을 지닌 퀘르세틴과 구조적으로 관련된 화합물을 포함한다. 퀘르세틴 유도체 및 유사체의 예는 참고문헌(Valahos, C.J. et al.(1994) J. Biol. Chem.269:5241-5284). PI3K 활성을 저해하는 바람직한 퀘르세틴 유도체는 LY294002(2-(4-모르폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-원, Lily Indianopolis, IN)에 기술된다.

CD28 자극이 또한 T 세포에서 단백질 티로신 포스포릴화를 가져오는 것이 관찰되었다(참고문헌: Vanenberghe, P et al. (1992) J. Exp. Med. 175:951-960; Lu, Y. et al.(1992) J. Immunol. 149:24-29). 따라서, 일 구체에서, T 세포내의 보조자극성 신호를 저해하는 제제는 T 세포에서 티로신 포스포릴화를 저해한다. 바람직한 단백질 티로신 키나제 저해제는src단백질 티로신 키나제를 저해하는 것이다. 한 가지 양태에서,src단백질 티로신 키나제 저해제는 헤르비마이신 (herbimycin) A와 구조적으로 관련되고, 단백질 티로신 키나제의 활성을 저해한다. T 세포에서의 티로신 포스페이트 활성의 증가에 의해, 단백질 티로신 포스포릴화의 순수 함량은 감소한다. 단백질 티로신 포스파타제는 T 세포내의 세포 단백질 티로신 포스파타제 예컨대, CD45 또는 Hcph일 수 있다. T 세포상의 세포 표면 티로신 포스파타제의 활성은 T 세포를 포스파타제와 결합하여 그의 활성을 증가시키는 분자와 접촉시킴에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들어, CD45에 대한 항체가 그의 표면에서 CD45를 발현시키는 T 세포에서의 티로신 포스파타제 활성을 자극하는데 사용될 수 있다. 따라서, 한 가지 양태에서, T 세포내의 단백질 티로신 포스포릴화를 저해하는 제제는 안티-CD45 항체이거나, CD45의 활성을 자극할 수 있는 능력을 지닌 이것의 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab 및 F(ab')2단편을 포함한다. 항체,또는 이것의 단편은 자극성 형태 예를 들어, 중합체화 또는 고정화 등으로 제공될 수 있다.

또한, CD28 결합은 증가된 포스포리파제 C 활성(참고문헌: Nunes, J. et al. (1993)Biochem. J. 293:835-842) 및 증가된 세포내 칼슘 수준(참고문헌: Ledbetter, J.A. et al.(1990) Blood75:1531-1539 및 실시예)과 관련된다. 따라서, 내세포성으로 작용하여 T 세포에서 보조자극성 신호를 저해하는 제제는, 포스포리파제 C 활성의 저해 및/또는 세포내 칼슘 수준의 증가의 저해에 의해 작용할 수 있다.

단백질 세린 및 세린-트레오닌 키나제가 또한 CD28과 관련된 신호전달경로에 포함되는 것이 밝혀졌다(Siegel, J.N. et al. (1993) J. Immunol. 151:4116-4127; Pai, S. V. et al.(1994) J. Immunol. 24:2364; Parry et al. 1997. Eur. J. Immunol. 27:2495). 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 세포내에서 작용하여 T 세포내의 보조자극성 신호를 저해하는 제제는 세린 또는 세린-트레오닌 키나제 활성을 저해한다.

Ⅵ. T 세포의 보조자극을 차단하는 다른 제제

T 세포에서 보조자극성 신호를 차단하는 다른 제제가 표준 기법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 이러한 제제는 T 세포 증식 및/또는 사이토카인 생성을 저해하는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 보조자극 분석 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 인간 CD28⁺T 세포가 예를 들어, 상기한바와 같은 B 세포, 천연 킬러 세포 및 대식세포에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 이뮤노마그네틱 비드 디플리션에 의해 단리된다(참고문헌: Gimmi, C.D., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6586-6590). 항원 제공 세포 예를 들어, 전 비장 세포, 또는 정제된 B 세포, 또는 B7-1 또는 B7-2 트랜스펙션된 COS 세포가 증식이 저해되도록 방사선조사되거나 미토마이신-C(예를 들어, 25㎍/ml)으로 1시간동안 처리된 후, 광범위하게 세척되었다. 10⁵CD28⁺가 예를 들어, 10⁵-10⁴APCs(예를 들어, B7 분자로 트랜스펙션된 COS 세포)와 함께 배양될 수 있다. 이러한 예시적인 분석에서, 하나의 T 세포 집단은 1차 활성화 신호(예를 들어, T 세포 수용체 신호)만을 수용하며; 다른 T 세포 집단은 보조자극성 신호만을 수용하고; 다른 T 세포 집단은 1차 활성화 신호 및 보조자극성 신호를 수용했으며; 다른 T 세포 집단은 T 세포에서의 보조자극성 신호를 차단하는 능력에 대해 시험하고자 하는 제제의 존재하에 1차 활성화 신호 및 보조자극성 신호를 수용했다. 1차 활성화 신호는 예를 들어, PMA의 서브미토게닉(submitogenic) 용량(예를 들어, 1ng/ml), 미토겐의 서브미토게닉 용량, 항원의 서브옵티멀 용량, 또는 안티-T 세포 수용체 항체의 서브미토게닉 용량에 의해 전달된다. 신호 2는 B7 분자를 함유하는 항원 제공 세포에 의해 전달된다. 잠재적(potent) 차단 제제가 일정 농도에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 항체가 하이브리도마 상청액 또는 정제된 항체(예를 들어, 약 10㎍/ml)로서 사용될 수 있다. T 세포의 증식은 72시간 배양중 후기 12-18시간 동안의³H-티미딘(1μCi) 통합에 의해 측정될 수 있다. 1차 활성화 신호의 전달은 다소의 증식을 초래할 것이나, 1차 활성화 신호 및 보조자극성 신호 2 신호를 수용한 T 세포는 최대로 증식될 것이다. 차단 제제는 이것이 최대의 보조자극성 신호 유도 증식을 감소시키는 능력에 의해 확인되었다.

또한, T 세포 증식을 측정하는 대안으로서, T 세포 사이토카인 생성물은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, T 세포 배양에서 생성된 IL-2 및 IL-4은 시판중인 ELISA(R&D System, Minneapolis, MN 및 BioSource, Camarillo, CA)를 사용하여, 배양의 개시 후 24-72시간에 수집된 배양 상청액에서 분석할 수 있다. 상기한 바와 같이, 차단제는 이들이 최대의 보조자극성 신호 유도의 사이토카인 생성을 감소시키는 능력에 의해 확인될 수있다.

항체의 경우, 이러한 또는 다른 분석법에 의해 확인된 임의의 "차단 항체"가 당업계에 알려진 기술을 사용하여 이들이 결합하는 보조자극성 분자를 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공지의 리간드에 대해 표지된 항체의 결합을 감소시키는 항체의 능력이 측정될 수 있다.

Ⅶ. 면역 반응을 하향조절하기 위한 추가의 제제

특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 지혈을 촉진시키는 제제에 대한 면역내성을 증강시키기 위한 추가의 제제 또는 추가의 제제의 용도를 포함할 수 있다. 한 가지 양태에서, 면역내성을 증진시키나 T 세포에서 보조자극성 신호를 저해함에 의해 활성이 없는 제제가, 본 조성물에 부가되거나 본 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 안티-CD40 리간드(예를 들어, 인간 CD40 리간드에 대한 모노클로날 항체, 5C8(Kirk et al.1997.Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:8789))가 조성물중에 포함될 수 있다. CD40 및 T 세포에 기초한 리간드, CD40L(CD154)는 B7을 상향조절하고 B 세포 활성을 생성하는데 중요한 역할을 한다[U.S. Patent 5,683,693, Yang et al. 1996. Science 273:1862; Grewal et al. 1996. Science 273:1864; Lterman et al. 1992. J. Exp. Med. 175:1091; Lederman et al. 1992. J. Immunol. 149:3817]. CD40 리간드에 대한 항체는 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제하여 이식 관용을 촉진하는 는 제제와 함께 상승작용을 하는 것으로 밝혀졌다[Kirk et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8789; Larsen et al. 1996. Nature 381:434]. 다른 양태에서, 면역내성화를 촉진하기 위하여 세포내에서 작용하지만, T 세포에서 보조자극성 신호를 억제하지 않는 제제가 표제 조성물에서 사용될 수 있다. 예컨대, 한 가지 양태에서, 사이클로스포린 A(CSA), FK506, 라파마이신, 또는 면역 반응을 억제할 수 있는 기타 제제가 본 조성물에 포함될 수 있거나 본 방법의 일부로서 투여될 수 있다[참조: Sigal et al. 1992. Ann. Rev. Immunol. 10:519, Ruhlmann et al. 1997 or Immunobiology. 198:192; Shaw et al. 1996. Clin. Chem. 42:1316].

VIII. 치료 단백질 및 면역내성화제를 포함하는 조성물을 사용하는 방법

한 가지 양태에서, 본원에서 기술된 표제 조성물 및/또는 제제가 혈액응고 질환을 가지고 있고, 이전에 지혈을 촉진하는 제제로 치료받은 적이 있는 환자에게 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 제제는 지혈을 촉진하는 제제에 대해 선재하는 면역 반응을 가진 환자에게 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 제제가 지혈을 촉진시키는 제제에 대한 면역 반응을 아직 발생시키지 않은 환자에게 투여된다. 그 밖의 양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 제제는 지혈을 촉진시키는 제제에 대한 선재하는 면역 반응을 갖는 환자에게 투여된다. 환자가 "선재하는 면역 반응"을 가지는지 여부는 환자에서 당해 분야에서 잘 공지된 기술을 사용하여 지혈을 촉진하는 제제와 반응하는 항체의 역가를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 환자가 대조 개체에서의 역가와 비교하여 측정가능한 역가의 항체를 가진 경우(예컨대, 통계적으로 유의한 역가), 환자는 지혈을 촉진하는 제제에 대해 선재하는 면역 반응을 가진 것이라고 할 수 있다. 대안적으로, 지혈을 촉진하는 제제에 대한 세포성 면역 반응을 측정하여 환자가 지혈을 촉진하는 제제에 대해 진행중인 면역 반응을 가지고 있는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 기법들은 당 분야에 널리 공지되어 있다.

한 가지 양태에서, 지혈을 촉진하는 제 1 제제, 및 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제 또는 차단하는 제 2 제제가 혈액응고 질환을 치료하는데 사용된다. 다른 양태에서, 지혈을 촉진하는 제 1 제제 및 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제하는 제 2 제제의 복합제를 포함하는 조성물이 혈액응고 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 조성물 및/또는 제제는 치료적 유효량의 제제 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 임의의 제형으로 투여될 수 있다. 치료적 유효량의 표제 제제 및/또는 조성물의 투여는 지혈을 촉진하는 제제의 경우에는 혈액응고 질환의 치료를 달성하고, T 세포에서 보조자극성 신호를 억제하는 제제의 경우에는 지혈을 촉진하는 제제에 대한 면역내성을 달성하는데 필요한 투여량 및 기간 동안에서의 유효량으로 정의된다. 제제 또는 조성물의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 개체가 지혈을 촉진하는 제제에 대한 면역 반응을 이미 일으킨 적이 있었는지 여부에 따라 변화할 수 있다. 이러한 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

제제 및/또는 조성물의 최적의 투여 과정은 치료되는 환자에 따라 변화할 수 있다. 특정 양태에서, 환자는 동시에 두 제제 모두로 치료할 필요가 있을 것이다. 이러한 경우에, 지혈을 촉진하는 제제 및 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제하는 제제를 동시에, 예컨대 두 제제 모두를 포함하는 조성물의 형태로 투여하는 것이 바람직할 것이다.

다른 양태에서는, 제제의 안정성을 촉진시키기 위해서, 또는 제제의 시차 투여를 촉진하기 위하여 제제를 따로 투여하는 것이 바람직할 것이다. 한 가지 양태에서, 시차 투여는 지혈을 촉진하는 제제의 최적 치료 효과를 달성하면서 상기 제제에 대한 면역 반응, 바람직하게는 항체 반응을 최적으로 억제하는데 바람직할 수 있다. 예컨대, 보조자극성 신호를 억제하는 제제는 지혈을 촉진하는 제제의 투여 전에 단독으로 투여될 수 있거나, 지혈을 촉진하는 제제를 투여한 후 수일간 단독으로 투여될 수 있다.

한 가지 양태에서, T 세포에서 보조자극을 억제하는 제제는 장기간에 걸쳐, 예컨대 지혈을 촉진하는 제제가 투여될 때마다 투여될 수 있다. 다른 양태에서, T 세포에서 보조자극성 신호를 차단하는 제제는 산발적으로 투여될 수 있다. 예컨대, 환자가 지혈을 촉진하는 제제를 사용한 치료를 규칙적으로 필요로 할 수 있지만, T 세포에서 보조자극성 신호를 억제하는 제제를 사용한 치료는 단지 주기적으로 필요로 할 수 있다. 예컨대, 지혈을 촉진하는 제제를 사용한 치료는 계속될 수 있는 반면, T 세포에서 보조자극을 차단하는 제제를 사용한 환자의 치료는 1회 또는 2회로 충분할 수 있고, 보조자극을 차단하는 제제의 추가 투여는 필요치 않을 수 있다. 바람직한 양태에서, T 세포에서 보조자극을 차단하는 제제는 약 6개월 이상 동안 적당한 간격으로 투여된다.

한 가지 양태에서, 환자가 선재하는 항체를 가진 것으로 밝혀진 경우 표제 제제 또는 조성물이 환자에게 투여된다. 다른 양태에서, 표제 제제 또는 조성물은 이전에 치료받은 적이 없는 환자, 즉 선재하는 항체가 없는 환자에게 투여된다. 또다른 양태에서, 표제 제제 또는 조성물은 이전에 치료받은 적은 없으나, 지혈을 촉진하는 제제에 대한 항체 역가를 갖지 않은 환자에게 투여된다.

투여 계획은 과도한 실험없이 각 환자에게 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예컨대, 지혈을 촉진하는 제제에 대한 항체 역가를 측정하여 환자가 제제에 대한 면역 반응을 일으키는지 여부를 결정할 수 있고, 이에 따라 투여 계획이 조정될 수 있다. 예컨대, 지혈을 촉진하는 제제에 대한 항체 역가가 증가하는 경우, T 세포에서 보조자극성 신호를 차단하는 제제가 보다 다량으로 투여될 수 있다.

비경구 이외의 투여방법으로 표제 제제 또는 조성물을 투여하기 위해서는, 상기 제제를 상기 제제의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 이와 함께 공동투여하는 것이 필요할 수 있다. 본 발명의 제제 또는 조성물은 적당한 캐리어 또는 희석제중에서 개체에 투여될 수 있고, 효소 억제제와 함께 공동투여될 수 있으며, 리포좀과 같은 적당한 캐리어중에서 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤(trasylol)을 포함한다. 리포좀은 통상적인 리포좀 뿐만 아니라 수중유중수(w/o/w) 에멀션을 포함한다[Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol 7:27].

활성 제제 또는 조성물은 비경구 또는 복강내로 투여될 수도 있다. 또한 분산액이 글리세롤, 지질 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물중에서 및 오일중에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 증식을 방지하기 위하여 보존제를 함유할 수 있다.

주사용으로 적당한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 주사액 및 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 제제 또는 조성물은 멸균되어야 하며, 용이하게 주사가능할 정도의 유동성이 있어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 캐리어는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 및 지질 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적당한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성이, 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용은 다양한 항균 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살등에 의해 방지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예컨대 당, 예컨대 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 염화 나트륨을 조성물중에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 지연은 조성물중에 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

멸균 주사 용액은 적당한 용매중에 필요하 양의 활성 조성물 또는 제제를 필요에 따라 상기 열거된 성분들중 하나 또는 조합물와 함께 혼입한 다음 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들중 필요한 기타 성분을 함유한 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분(예컨대, 제제 또는 조성물) 및 임의의 추가 목적 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결건조이다.

활성 제제 또는 조성물이 상기한 바와 같이 적당히 보호되는 경우, 단백질이 예컨대 불활성 희석제 또는 흡수가능한 식용 캐리어와 함께 경구 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 캐리어"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 매질 및 약제학적으로 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 배합부적인 경우를 제외하고는, 치료 조성물중에서 이들의 사용이 고려된다. 또한 보충적인 활성 성분들도 조성물중에 혼입될 수 있다.

비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여의 균일성을 위한 단위 제형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 단위 제형은 치료받는 포유동물 환자에 대해 다일 투여로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한며; 각 단위는 목적하는 치료 효과를 내기 위하여 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 필요한 약제학적 캐리어와 함께 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 상세한 사항은 a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 b) 개체의 치료를 위한 이러한 활성 제제 또는 조성물을 하는 컴파운딩하는 분야에 내재하는 한계에 의해 나타나며, 이것들에 직접적으로 좌우된다.

본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 캐리어"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 매질 및 약제학적으로 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 또한 보충적인 활성 성분들도 조성물중에 혼입될 수 있다.

본 발명의 실시에는, 별다른 언급이 없는 한, 당 분야의 기술수준에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법이 사용될 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 상세히 설명되어 있다. [참조:Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., ed. by Ausubel, F. et al. (Willey, NY (1995));DNA Cloning,Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985);Oligonucleotides Synthesis(M. J. Gait ed. (1984)); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195;Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); thetreatise,Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987));Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds. (1986)); and Miller, J.Experiments in Molecular Genetics(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972))]

본원에 전반적으로 인용된 모든 참고자료, 출원 중인 특허출원 및 공개된 특허의 내용은 참고내용으로서 본원에 명백하게 포함되어 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명될 것이며, 이것은 추가적인 제한으로 해석되어서는 안된다.

이 실시예에서, A형 혈우병의 마우스 모델이 억제제 형성의 예방 및 처치를 위한 새로운 방법을 평가하기 위하여 사용되었다. 인자 Ⅷ의 엑손(exon) 16의 표적화된 파열에 의해 발생된 A형 혈우병 마우스는 혈장 내에서 검출 가능한 인자 Ⅷ의 활동이 없었고(참조: Bi L, Nature Genetics 10:119, 1995), 중증의 A형 혈우병을 가진 환자에 있어서 이러한 점에서 유사하다. 예상된 바와 같이, A형 혈우병 마우스는 지혈 수단을 사용하지 않고 꼬리가 잘려진 경우 치명적인 출혈을 갖는 응고 경로 결함의 생체내 신호를 갖고, 처리 또는 일시적 고정 이후에 피하 또는 근육내 출혈이 진행된다(참조: Qian J, Borovok M, Bi L, Kazazian HH, Hoyer L. Thromb Haemost 81:940, 1999; Evans GL et al, Proc Natl Acad Sci USA 95:5734,1998).

A형 혈우병 환자에게 주어진 것과 중량에 기초하여 등가 투여량인 0.2㎍ 인간 인자 Ⅷ의 정맥내 주입은 단일 주사 이후에 이러한 A형 혈우병 마우스 내에서 최소한 또는 전혀 항체 반응이 일어나지 않았으나, 반복적인 주사는 높은 역가의 억제 항인자 Ⅷ를 초래하였다(Qian J et al. Thromb Haemost 81:940, 1999). 또한, 항체가 검출되기 전에, 인간 인자 Ⅷ에 최초 노출된 후 3일만에 인자 Ⅷ-특정의 T 세포의 증식된 반응이 검출되었다.

실시예 1.인자 Ⅷ에 대한 제 1 면역 반응의 억제

이 실시예에 대한 실험 설계는 도 1에 도시되어 있다. 3개 그룹의 마우스에 제 0일째에 인자 Ⅷ을 정맥내 주사하였다. 또한, 제 1 그룹의 마우스에는 CTLA4-Ig를 인자 Ⅷ을 주사하기 하루 전 및 하루 후에 주사하였다. 제 2 그룹의 마우스에는 동일한 CTLA4-Ig 처치(복막내로)를 하고 나서, 인자 Ⅷ이 제 2일째 및 제 12일째까지 매일 주사하였다. 제 3 그룹에는 어떠한 CTLA4-Ig도 처치하지 않았다. 그 후, 모든 마우스에게 제 23일째 및 제 24일째에 인자 Ⅷ을 추가로 두 번 주사하였다. 동물에게서 제 20, 37, 58 및 82일째에 채혈하였다. CTLA4-Ig를 처치하지 않은 마우스는 제 20일째의 초기부터 시작하여 높은 항체 역가를 가졌지만, CTLA4-Ig를 처치한 마우스는 제 82일째까지 항체가 발생하지 않았다(도 2).

실시예 2.인자 Ⅷ에 대한 제 2 반응 억제

이 실시예를 위한 실험 설계는 도 3에 도시되어 있다. 이 실시예에서, 마우스에게 인자 Ⅷ의 정맥내 주사를 2주 동안 여러차례 처치하고 나서 2개의 그룹으로나누었다. 마우스에게 제 1, 20 및 37일째에 인자 Ⅷ을 다시 주사하였다. 제 1 그룹의 마우스에게 제 1, 20 및 37일째의 인자 Ⅷ의 주사와 관련하여 그 -1 및 +1일째에 CTLA4-Ig를 주사하였다. CTLA4-Ig로 처치하지 않은 마우스는 높은 역가의 항인자 Ⅷ 항체를 가지는 반면, CTLA4-Ig로 처치한 마우스(1마리의 마우스는 예외)는 인자 Ⅷ에 대해 제 2 반응이 발생하지 않았다(도 4).

하기 방법 및 재료는 실시예 3 - 6에 사용된다.

동물. 혈우병 마우스의 엑손-16(E-16)주의 특징이 참고문헌에 보고되어 있다(참고: Bi L, et al. Nature Genetics 10:119, 1995; Bi L, et al. Blood 88:3446, 1996). 10 - 20주 연령의 성인 수컷 및 동형접합의 E-16 암컷 마우스가 이러한 연구를 위해 사용되었다. 혈액 샘플을 안와정맥총채혈에 의해 수득하고, 600g을 3분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 샘플을 평가될 때까지 -20℃에 저장하였다. 동물의 심각한 출혈 및 사망을 회피하고자, 몇몇 실험에서 귀 꼬리표를 사용하지 않았다. 이러한 이유로, 도 5는 개개의 마우스에 대한 순차적 데이타를 나타내지 않는다.

E-16을 B7-1 및 B7-2 녹아웃(knockout) 마우스로 교차 교배시켜서 E-16/B7-1 및 B7-2 이중 녹아웃 마우스의 발생을 수행하였다(참조: Borriello F, et al. 1997. Immunity 6:303). 동형접합의 E-16/B7-1 및 E-16/B7-2 이중 녹아웃 마우스를 유전자형 결정법으로 식별하였다(참조: Bi L et al, Nature Genetics 10:119, 1995; Borriello F, et al. Immunity 6:303, 1997). 감소된 인자 Ⅷ의 활동도가 코아테스트(Coatest) 이색발생 생물학적 검정법(Chromogenix, MoIndal, Sweden)에의해 검증되었다(Bi L et al, Blood 88:3446, 1996). 인자 Ⅷ의 활동도는 E-16/B7-1 및 E-16/B7-2 결함된 마우스 양자 모두에게서 1% 미만이었다.

항원. 재조합 인간 인자 Ⅷ을 회사(Hyland Division of Baxter Healthcare Corp.: Glendale, CA)로부터 입수하였다.

mCTLA-4Ig. 마우스의 CTLA4-Ig cDNA 발현 플라스미드를 리더 및 CTLA4의 세포외 분역, 즉 참조(참조: Streurer, J Immunol 155:1165, 1995)에 설명된 바와 같이 작동체 기능을 제거하기 위하여 변종처리된 IgHg2a의 CH2 및 CH3 분역을 힌지에 결찰함으로써 제조하였다. 삽입물은 발현 벡터 pED로 복제되고, 전술(참조: Lollar P et al, J Clin Invest 93:2497, 1994)한 바와 같이 CHO 세포로 안정적으로 핵산감염이 되었다. 농축된 상태의 매질을 r단백질 A 세파로스 고속 크로마토그래피 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 장입하였다. 칼럼을 PBS pH 7.1로 세척하고, mCTLA4-Ig를 20 mM 시트레이트 pH 3.0으로 용리하였다. 피크 풀(peak pool)을 1M 트리스 pH 8.0으로 중화하여 최종 pH 7.5로 하였고, YM3O 격막을 구비한 아미콘(Amicon) 교반된 세포를 이용하여 PBS pH 7.1을 제조하였다. 포로스(Poros) PI(지각있는 생물시스템: Perceptive Biosystems) 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 mCTLA4-Ig을 탈발열원성(depyrogenate)하고, 생성물을 칼럼으로부터 25 mM 트리스 pH 7.5 내의 0에서 1M NaCl까지의 선형 NaCl 경도로 용리시킨다. 그 후, mCTLA4-Ig를 YM30 격막을 이용한 아미콘 교반된 세포를 이용하여 PBS pH 7.1로 제조하였다.

항체 측정. 항인자 Ⅷ 역가를 ELISA(참조: Qian J, et al. Inhibitorantibody development and cell response to human factor Ⅷ in murine hemophilia A. Thromb Haemost 81:940, 1999)에 의해 결정하였다. ELISA 평가는 pH 9, 0.05 mol/ml 탄산염-중탄산염 내의 0.8 ㎍/ml 재조합 인간 인자 Ⅷ로 피복된 미소역가 웰(well)을 사용하여 수행하였다. 마우스 혈장 샘플을 웰 내에서 4℃로 밤새 배양하고 나서 세척하였고, 알칼리-포스파타아제 접합된 염소 안티-마우스 IgG(Southern Biotechnology Aoosciates Inc., Birmingham, AL)를 2시간 동안 실온에서 첨가하였다. 세척 후에, P-니트로페닐 포스페이트(Sigma, St. Louis, MO), pH 10.4인 100mmol/L 글리신, 1mmol/L MgCl₂, 2mmol/L ZnCl₂내의 2mg/ml를 첨가하였고, 자동화된 마이크로 역가 플레이트 ELISA 판독기를 사용하여 410nm에서의 흡광도를 판독하였다. 안티-인자 Ⅷ 항체의 농도를 A2 분역(Mab 413)에 결합된 마우스의 IgG 안티-인간 인자 Ⅷ 단일 클론 항체를 이용하여 수득된 표준 곡선으로부터 추정하였다(참조: Lollar P et al, J Clin Invest 93:9497, 1994). 역가는 검정 표준 곡선의 선형부분 상의 점들로부터 계산하였다.

베테스다 유니트(Bethesda Units: BU) 내의 안티-인자 Ⅷ 억제제 역가는 베테스다 검정법으로 측정하였다(참조: Kasper CK. Thromb et Diath Haem 30:263, 1973).

T 세포 증식 검정. 비장을 증식 검정용 T 세포원으로 사용하였다. 그 후, 비장 세포를 96개의 웰의 평탄한 바닥 플레이트 내에서 배양하였다(5×10⁵/웰). 다양한 양의 재조합 인자 Ⅷ을 0.5% 혈우병 마우스 혈청을 함유한 완전한 RPMI-1640으로 구성된 배양 매질에 첨가하였다. 37kBp 3H-티미딘/웰(6.7 Ci/mmol, ICN Pharmaceutical Irvine, CA)을 37℃에서 72시간 동안 배양한 후에 첨가하였다. 16시간 이후에 매트릭스 9600(Packard, Meriden, CT)을 사용하여 배양하였다. 데이타는 불용성 DNA 내에 포함된 cpm의 3중 웰의 평균으로 나타내었다.

실시예 3.안티-인자 Ⅷ 반응의 유도를 차단하는 mCTLA4-Ig

안티-인자 Ⅷ 억제 항체를 3주간의 간격으로 1㎍의 재조합 인간 인자 Ⅷ을 반복적으로 정맥내 주사하여 조절 마우스내에 유도하였다. 이 실시예에서 A형 혈우병 마우스의 4개 그룹에 재조합 인간 인자 Ⅷ을 제 0, 23, 44 및 66일째에 주사하였다(처음에 1㎍을 정맥주사, 다음에 제 2차, 3차 및 4차 주사에는 0.2㎍). 행-인자 Ⅷ 검정용 혈액 샘플을 제 20, 37, 58 및 82일째에 수득하였다. 개방 서클인 조절 그룹 G-1 및 G-3에는 단지 인자 Ⅷ만 주입하였다. 실선 서클인 그룹 G-2 및 G-4에는 최초 인자 Ⅷ의 주사 하루 전 및 하루 후에 mCTLA4-Ig(250㎍, 복강내 주사)을 주사하였다. 안티-인자 Ⅷ 항체 농도는 ELISA로 결정하였다. 0.16㎍/ml보다 작게 지시된 안티-인자 Ⅷ 검정 데이타 점들은 면역되지 않은 A형 혈우병 마우스로부터 수득한 혈장 샘플에 대한 것과 유사하였다. 이 실험의 결과는 도 5에 나타나 있다(도 5가 도 2에 나타난 일부 데이타를 반복하고 추가적인 데이타를 첨부하고 있는 것을 주목하라).

안티-인자 Ⅷ은 최초 주사로부터 20일 이후에 5마리의 마우스 중 4마리에서 검출되었고, 모든 조절 마우스는 2 내지 4번의 주사 후에 고역가의 안티-인자 Ⅷ이 발생하였다. 4번의 주사 후에 평균 억제제 수준은 1860 베테스다 유니트(BU)였다.후속하는 세 번의 제 23, 44 및 66일째의 인자 Ⅷ의 주사와 함께 mCTLA4-Ig를 주사하지 않았음에 불구하고, 안티-인자 Ⅷ 항체 형성은 최초 인자 Ⅷ 주사 하루 전 및 하루 후에 마우스의 CTLA4-Ig를 250㎍ 복강내 주사한 마우스(그룹 G-2, 도 5)에서 현저하게 억제되었다. 안티-인자 Ⅷ은 제 1 및 제 2차 인자 Ⅷ의 주사 이후에 그룹 G-2의 어떠한 마우스에게서도 검출되지 않았다. 인자 Ⅷ의 세 번째 주사로부터 3주 후, G-2 그룹의 6마리의 마우스 중 2마리에서 약한 면역 반응이 검출되었다.

비반응의 제한된 지속(마우스의 A형 혈우병에서 4-5 시간)이 이러한 마우스 내에서의 인간 인자 Ⅷ의 짧은 반감기의 결과인지를 조사하기 위하여(참조: Evans GL et al, Proc Natl Acad Sci USA 95:5734, 1998), 조절 및 mCTLA4-Ig 처치된 마우스(그룹 G-3 및 G-4, 도 5)에게 제 0일째에 1㎍의 인자 Ⅷ을 정맥주사 하고 나서 제 2 내지 12일째에 매일 1㎍의 인자 Ⅷ을 복강내 주사하였다. 고역가의 안티-인자 Ⅷ이 조절 마우스(그룹 G-3)내에 제 20일째에 존재하였다: ELISA에 의해 350㎍/ml 초과 및 평균 억제제 역가가 694 BU. 대조적으로, 최초 인자 Ⅷ에 노출되기 하루 전 및 하루 후에 mCTLA4-Ig를 주사한 그룹 G-4 마우스는 제 20일째에 안티-인자 Ⅷ이 검출되지 않았다. 세 번의 추가적인 인자 Ⅷ의 주사 후로 지연된 안티-인자 Ⅷ 항체 반응은 그룹 G-2 동물에서와 같이 이러한 마우스에서도 동일하였다. 따라서, CTLA4-Ig 주사 후에 혈장 내에서의 인자 Ⅷ의 제한된 지속은 CTLA4-Ig 처치된 마우스 내의 비반응의 제한된 지속에 대한 이유는 아니었다.

실시예 4.CTLA4-Ig의 반복 투여의 효과

지연된 안티-인자 VIII 반응이 mCTLA4-Ig가 최초의 인자 VIII 노출시에만 주어진 경우 반복된 인자 VIII 주입 후에 검출되었기 때문에, mCTLA4-Ig가 각각의 인자 VIII 주입과 함께 주어진 경우 안티-인자 VIII 발생을 억제시킬 수 있는 지가 결정되었다. 상기 실험(도 6)에 있어서, A형 혈우병 마우스에게 인자 VIII와 mCTLA4-Ig 둘 모두를 3주 간격으로 6회에 걸쳐 동시 주입하였다. A형 혈우병 마우스에게 1㎍의 인자 VIII와 250㎍의 mCTLA4-Ig 둘 모두를 3주 간격으로 정맥 주사하거나(흑색 원), 인자 VIII와 mCTLA4-Ig 둘 모두가 함유된 제 1 주사 후 인자 VIII를 단독 정맥 주사하였다 (빈 원). 안티-인자 VIII 검정을 위한 혈청 샘플을 6회째 인자 VIII 주사한 지 4주 후에 수득하였다. 6회째 인자 VIII 주사한지 4주 후에 시험된 경우, 이러한 방식으로 처리된 10마리의 마우스 중 어느 것에도 검출가능한 안티-인자 VIII가 없었다. 대조적으로, 단지 1회의 mCTLA4-Ig 주사(인자 VIII에 최초 노출시에) 후 인자 VIII 단독으로 5회 주사된 마우스로부터의 혈청에는 높은 역가의 안티-인자 VIII가 존재하였다.

그 후, 이러한 mCTLA-Ig 처리된 마우스를 시험하여 이들이 mCTLA4-Ig의 부재 하에서 추가의 인자 VIII 주사 후에 면역 반응을 지니는 지를 결정하였다. 3주 간격으로 2회 정맥 주사한 후, 5마리 마우스 중 어느 것도 안티-인자 VIII를 발생시키지 못한 반면, 인자 VIII 또는 mCTLA4-Ig에 사전 노출되지 않은 4마리의 대조 마우스 중 2마리에서 낮은 수준의 안티-인자 VIII가 검출되었다 (도 7). 이러한 실험에 있어서, 인자 VIII와 mCTLA4-Ig 둘 모두로 6회 주사된 도 6에 대해 설명된 바와 같이 처리된 A형 혈우병 마우스에게 후속하여 0.2㎍의 인자 VIII를 추가의 mCTLA4-Ig 없이 3주 간격으로 6회 주사하였다 (흑색 원). 인자 VIII에 사전 노출되지 않은 대조 마우스를 대등하게 면역시켰다 (빈 원). 안티-인자 VIII 검정을 위한 혈청 샘플을 2회째 및 6회째 주사한 지 3주 후에 수득하였다. 인자 VIII 단독을 6회 주사한 후, 평균 인자 VIII 역가는 인자 VIII와 mCTLA4-Ig 둘 모두가 사전 투여된 마우스의 경우 93㎍/㎖인 반면, 평균 역가는 대조 마우스의 경우 155㎍/㎖ 이었다. 이러한 데이터는 mCTLA4-Ig와 인자 VIII의 반복 동시-투여로부터 수반되는 항원-특이적 면역 억제의 한계를 입증한다.

실시예 5.인자 VIII에 대한 2차 면역 반응을 억제시키는 mCTLA4-Ig

mCTLA4-Ig가 인자 VIII에 대한 2차 면역 반응을 조절하는 지를 결정하기 위해, 안티-인자 VIII가 이미 발생된 A형 혈우병 마우스에게 인자 VIII를 투여하면서 mCTLA4-Ig를 동시에 주사하였다. 초기에는, 모든 A형 혈우병 마우스에게 0.2㎍의 인자 VIII를 3회 주사하고, 안티-인자 VIII의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 그 후, 대조 마우스에게 인자 VIII를 3회 추가 주사하면서, 남아있는 마우스에게 3회의 추가 인자 VIII 주사 중 첫 번째 주사와 동시에 mCTLA4-Ig를 투여하였다. 다수의 마우스가 반복 주사 및 혈액 샘플 수집으로 인해 이러한 실험 동안 출혈 합병증으로 치사하였지만, 결과는 두 그룹에 대해 명백하게 상이하였다.

이 실시예에 있어서, 모든 마우스에게 초기에 0.2㎍의 FVIII를 2주 간격으로 3회 정맥 주사하였다. 그 후, 대조 마우스(빈 원)에게 인자 VIII를 3회 더 주사하고, 혈액 샘플을 검정을 위한 수득하였다 (상부 패널). 그 밖의 마우스(흑색 원)에게 4회째 인자 VIII 주사 전날 및 다음날(화살표로 표시되어 있음) mCTL4-Ig(250㎍, 복강내)을 투여한 후, 인자 VIII 단독을 3주 간격으로 2회 더 주사하였다. 안티-인자 VIII에 대해 혈액 샘플을 시험하기 전의 인자 VIII 주사 횟수를 수평축 상에 표시하였다.

안티-인자 VIII 역가의 증가는 대조 마우스의 경우 인자 VIII의 4회째 주사 후에 주목되었으며, 평균 역가는 16 내지 230㎍/㎖ 이었다 (도 8A). 5회째 인자 VIII 주사 후, 안티-인자 VIII 역가는 4마리의 남아있는 대조 마우스에서 모두 350㎍/㎖ 보다 높았다. 대조적으로, 4회째 인자 VIII 주사에서 mCTLA4-Ig로 처리된 마우스는 안티-인자 VIII의 증가가 최소이거나 없었다 (도 8B 및 C). mCTLA4-Ig의 투여는 비교적 높은 안티-인자 VIII 수준을 이미 발생시킨 마우스에 대해 인자 VIII에 대한 이러한 2차 면역 반응을 억제시켰으며, 이는 5 내지 90BU의 억제제 역가에 상응하며(Qian J, et al. Thromb Haemost 81:940, 1999)(도 8C), 3회의 초기 주사 후 최소의 안티-인자 VIII가 투여된 마우스의 경우, 5BU 미만이었다 (도 8B).

실시예 6.인자 VIII에 대한 1차 면역 반응에서의 B7-1 및 B7-2의 역할의 측정.

항원 제공 세포 상의 B7-1 및 B7-2 보조자극성 리간드의 역할을 평가하였는데, 이는 이것이 mCTLA4-Ig를 사용하는 실험에서 억제되는 것으로 추정되는 이들과 CD28의 상호작용이기 때문이었다. 이를 위해, 본 발명자들은 A형 혈우병 마우스와 B7-1^-/-및 B7-2^-/-마우스(Borriello F, et al. B Immunity 6:303, 1997; Freeman GJ et al, Science 262:907, 1993)와 교배시키고, 인자 VIII와 B7-1 또는 B7-2 둘 모두가 결핍된 마우스를 유전자형 분석에 의해 선택하였다. 그 후, A형 혈우병/B7-1^-/-및 A형 혈우병/B7-2^-/-마우스에게 0.2㎍의 인간 인자 VIII를 2주 간격으로 정맥 주사하였다. 안티-인자 VIII 검정을 위한 혈청 샘플을 2회째 및 6회째 인자 VIII 주사한 지 12일 후에 수득하였다. 4회 주사 후, 모든 9마리 A형 혈우병/B7-1^-/-마우스(빈 원)는 안티-인자 VIII를 발생시켰고, 역가는 350㎍/㎖ 보다 높았고 평균 억제제 수준은 712BU였고(도 9), 수치는 인자 VII가 주사된 정상적 A형 혈우병 마우스에 대한 수치와 유사하였다 (Qian J, et al. Thromb Haemost 81:940, 1999). 대조적으로, 8마리의 A형 혈우병/B7-2^-/-마우스(흑색 원) 중 어느 것도 검출가능한 안티-인자 VIII를 지니지 않았다. 유사한 결과가 안티-B7-1과 안티-B7-2 항체로 처리된 A형 혈우병 마우스에서 수득되었다.

이러한 B7-1 및 B7-2 결핍성 A형 혈우병 마우스의 T 세포 반응을 평가하기 위해, 비장 세포를 인자 VIII의 5회째 정맥 주사한 지 3일 후에 수득하였다. 3마리의 마우스로부터의 풀링된 비장 세포를 증식 데이터를 확립하기 위해 사용하였다. 도 10에 있는 빈 사각형 및 흑색 사각형은 각각 처리되지 않은 A형 혈우병/B7-1^-/-및 A형 혈우병/B7-2^-/-마우스로부터의 세포에 대한 것이다. 빈 원은 FVIII가 5회 정맥 주사된 A형 혈우병/B7-1^-/-로부터의 세포에 대한 것이고, 흑색 원은 인자 VIII가 5회 정맥 주사된 A형 혈우병/B7-2^-/-마우스에 대한 것이다. 배양액 중의 인자 VIII의 농도를 수평축 상에 표시하였다. 3H-티미딘 혼입에 의해 측정된T 세포 증식 활성은 A형 혈우병/B7-1^-/-마우스로부터의 세포에 대한 인자 VIII 용량 의존성 반응을 나타내었다 (도 10). 대조적으로, T 세포 반응은 A형 혈우병/B7-2^-/-마우스로부터의 비장 세포에 대해 임의의 인자 VIII 수준에서도 검출되지 않았다. 따라서, B7-2는 정맥 주사된 인자 VIII에 대한 면역 반응을 지지하는 데에 있어서 주역할을 하며, 이것이 없는 경우 안티-인자 VIII 형성은 억제된다.

균등물

당업자는 본원에 기재된 특정 조성물 및 방법에 대한 다수의 균등물을 단지 일상적인 실험을 이용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되며, 하기 청구의 범위에 의해 보호된다.

Claims (36)

1. 지혈을 촉진시키는 제 1 제제와 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제 2 제제를 포함하는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 캐리어를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 제 1 제제가 인자 VIII임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 제 1 제제가 인자 VIII의 B-도메인 결실 변이체임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 제 1 제제가 인자 IX임을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 제 1 제제가 폰 빌레브란드 인자임을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 제 2 제제가 가용성 형태의 보조자극성 분자임을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 제 2 제제가 가용성 형태의 CTLA4임을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 제 2 제제가 가용성 형태의 B7-1, 가용성 형태의 B7-2, 또는 가용성 형태의 B7-1과 가용성 형태의 B7-2의 조합물임을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 8항에 있어서, 제 2 제제가 CTLA4Ig임을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 9항에 있어서, 제 2 제제가 B7-1Ig 또는 B72Ig임을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 1항에 있어서, 제 2 제제가 가용성 형태의 CD40 또는 CD40L임을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1항에 있어서, 제 2 제제가 보조자극성 분자에 결합하는 항체임을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 제 2 제제가 안티-B7-1 항체, 안티-B7-2 항체, 및 안티-B7 항체와 안티-B7-2 항체의 조합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는조성물.
15. 제 13항에 있어서, 항체가 비활성 형태의 안티-CD28 항체임을 특징으로 하는 조성물.
16. 혈액응고 질환이 치료되도록 환자에게 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여 환자의 혈액응고 질환을 치료하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 환자가 제 1 제제에 대한 기존의 면역 반응을 지님을 특징으로 하는 방법.
18. 제 16항에 있어서, 환자가 제 1 제제에 대한 기존의 면역 반응을 지니지 않음을 특징으로 하는 방법.
19. 제 16항에 있어서, 추가의 면역억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
20. 제 16항에 있어서, 혈액응고 질환이 A형 혈우병, B형 혈우병, 및 폰 빌레브란드병으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
21. 혈액응고 질환이 치료되도록 환자에게 지혈을 촉진시키는 제 1 제제와 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제 2 제제를 투여하는 것을 포함하여 환자의혈액응고 질환을 치료하는 방법.
22. 제 1 제제에 대한 면역 반응이 하향조절되어 혈액응고 질환이 치료되도록 환자에게 지혈을 촉진시키는 제 1 제제와 T 세포에서 보조자극성 신호를 억제시키는 제 2 제제를 투여하는 것을 포함하여 환자의 혈액응고 질환을 치료하는 방법.
23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 제 1 제제가 인자 VIII임을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 제 1 제제가 인자 VIII의 B-도메인 결실 변이체임을 특징으로 하는 방법.
25. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 제 1 제제가 인자 IX임을 특징으로 하는 방법.
26. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 제 1 제제가 폰 빌레브란드 인자임을 특징으로 하는 방법.
27. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 제 2 제제가 보조자극성 신호를 T 세포에 전달시키는 가용성 형태의 제제임을 특징으로 하는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 제제가 가용성 형태의 CTLA4임을 특징으로 하는 방법.
29. 제 28항에 있어서, 제제가 CTLA4Ig임을 특징으로 하는 방법.
30. 제 27항에 있어서, 제제가 가용성 형태의 B7-1, 가용성 형태의 B7-2, 또는 가용성 형태의 B7-1과 가용성 형태의 B7-2의 조합물임을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 제제가 B7-1Ig, B7-2Ig, 또는 B7-1Ig와 B7-2Ig의 조합물임을 특징으로 하는 방법.
32. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 제 2 제제가 보조자극성 분자에 결합하는 항체임을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32항에 있어서, 제 2 제제가 안티-B7-1 항체, 안티-B7-2 항체, 및 안티-B7-1 항체와 안티-B7-2 항체의 조합물임을 특징으로 하는 방법.
34. 제 32항에 있어서, 항체가 비활성 형태의 안티-CD28 항체임을 특징으로 하는방법.
35. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 혈액응고 질환이 A형 혈우병, B형 혈우병 및 폰 빌레브란드병으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
36. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 환자가 제 1 제제에 결합하는 항체를 유의수준의 역가로 지님을 특징으로 하는 방법.