SI20626A - Postopki za zaviralno moduliranje imunskega odziva na terapevtske proteine - Google Patents

Abstract

Zagotovljeni so sestavki in postopki za zdravljenje hemostatične motnje z uporabo sredstev, ki pospešujejo hemostazo, in sredstev, ki inhibirajo kostimulatorni signal v celici T. Predloženi sestavki in postopki omogočajo zdravljenje hemostatičnih motenj z uporabo tujih terapevtskih proteinov med zaviralnim moduliranjem imunskih odzivov na terapevtske proteine.ŕ

Description

Genetics Institute, Inc. AMERICAN RED CROSS

Postopki za zaviralno moduliranje imunskega odziva na terapevtske proteine

Vladna fundacija

Predloženi izum je bil delno podprt z NIH-nagrado HL 36099, podeljeno ameriškemu Rdečemu križu. Vlada ima zato določene pravice pri tem izumu.

Ena od primarnih omejitev terapevtskega zdravljenja z uporabo bioloških proteinov je imunski odziv, ki ga proizvede telo pri odzivu na prisotnost tujih snovi v telesu. Ta imunski odziv je posebno problematičen, kadar je potrebno ponovljeno dajanje tujih snovi, da so optimalno učinkovite.

Primer takega stanja je ponovljeno dajanje sredstev za zdravljenje hemostatičnih motenj, kot npr. bolezni pomanjkanja faktorja VIII (npr. klasična hemofilija A in von Willebrandova bolezen), ali pomanjkanje faktorja IX, tudi znano kot hemofilija B. Klasična hemofilija, hemofilija A, je motnja, vezana na X, ki prizadane enega na 10000 moških. Von Willebrandova bolezen je najbolj navadna podedovana krvavitvena motnja, ki se zgodi pri enem od 800 do 1000 posameznikov. Hemofilija B, znana tudi kot božična bolezen, se zgodi pri približno enem od 100000 moških (Harrison's Principles of Internal Medicine, Isselbacher et al., izd., 13. izd. 1994, McGraw-Hill Ν.Υ., Ν.Υ.).

Faktor Vilije 265 kD enoverižni protein, ki kroži v kompleksu s von Willebrandovim faktorjem (VWF). Faktor VIII je pomembni regulatomi protein v krvni koagulacijski kaskadi. Po aktivaciji s trombinom pospeši hitrost aktivacije faktorja X z aktiviranim faktorjem IX (faktor IXa), kar po možnosti lahko vodi do tvorbe fibrinskega strdka. VWF molekula je adhezivni glikoprotein, ki ima osrednjo vlogo pri aglutinaciji krvnih ploščic. Deluje kot nosilec za faktor VIII v plazmi in pospešuje interakcije krvnih ploščic in žilnih sten. VWF je narejen iz številnih po možnosti identičnih podenot, ki ima vsaka približno 230 kD. VWF se sintetizira v endotelijskih celicah in megakariocitih. Faktor IX je enoverižni 55 kD proencim, ki se pretvori v aktivno proteazo (IXa) s faktorjem XIa ali s kompleksom tkivnega faktorja-Vila. Aktivirani faktor IX in aktivirani faktor VIII nato aktivirata faktor X.

Ponovljeno dajanje tujih proteinov lahko vodi do imunskega odziva na te proteine pri prejemniku. Pri T-celičnem odzivu na tuje proteine morata biti zagotovljena dva signala z antigen predstavljajočimi celicami (APC) za mirujoče limfocite T (Jenkins M. and Schwartz R. (1987), J. Exp. Med. 165. 302-319; Mueller D.L. et al. (1990), J. Immunol. 144, 3701-3709). Prvi signal, ki daje specifičnost imunskemu odzivu, je transduciran s T-celičnim receptorjem (TCR) po razpoznavi tujega antigenskega peptida, predstavljenega v kontekstu z glavnim histokompatibilnostnim kompleksom (MHC). Drugi signal, označen kot kostimulacija, inducira celice T, da se razmnožujejo in rastejo ter postanejo funkcionalne (Lenschow et al. 1996, Annu. Rev. Immunol. 14:233). Kostimulacija ni niti antigensko specifična niti omejena z MHC, in je mišljeno, da jo zagotavlja ena ali več različnih celičnih površinskih molekul, izraženih z APC (Jenkins M.K. et al. 1988, J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley P.S. et al. 1991, J. Exp. Med. 173. 721-730; Gimmi C.D. et al. 1991, Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 6575-6579; Young J.W. et al. 1992, J. Ciin. Invest. 90, 229-237; Koulova L. et al. 1991, J. exp. Med. 173. 759-762; Reiser H. et al. 1992, Proč. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 271-275; van-Seventer G.A. et al. (1990) J. Immunol. 144. 4579-4586; LaSalle J.M. et al. 1991, J. Immunol. 147. 774-80; Dustin M.I. et al. 1989, J. Exp. Med. 169. 503; Armitage R.J. et al. 1992, Nature 357. 80-82; Liu Y. et al. 1992, J. Exp. Med. 175. 437-445).

CD80 (B7-1) in CD86 (B7-2) proteina, izražena na APC, sta kritični kostimulatomi molekuli (Freeman et al. 1991, J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. 1989, J.

Immunol. 143:2714; Azuma et al. 1993, Nature 366:76; Freeman et al. 1993, Science 262:909).

Za B7-2 se zdi, da je bolj značilen med primarnimi imunskimi odzivi, medtem ko je B7-1, kije izboljševalno reguliran kasneje med imunskim odzivom, lahko pomemben pri podaljševanju primarnih T-celičnih odzivov ali kostimulaciji sekundarnih Tceličnih odzivov (Bluestone 1995, Immunity 2:555).

B7-1 in B7-2 sta protireceptorja za dva liganda, izražena na T-limfocitih. En ligand, na katerega se vežeta B7-1 in B7-2, CD28, je konstitutivno izražen na mirujočih celicah T in naraste pri ekspresiji po aktivaciji. Po signaliziranju skozi T-celični receptor ligacija CD28 in transdukcija kostimulatornega signala inducira celice T, da se razmnožijo in rastejo ter izločijo IL-2 (Linsley P.S. et al. 1991, J. Exp. Med. 173, 721730; Gimmi C.D. et al. 1991, Proč. Natl. Acad. Sci, USA 88, 6575-6579; June C.H. et al. 1990, Immunol. Today. ii, 211-6; Harding F.A. et al. 1992, Nature. 356, 607-609). Drugi ligand, označen CTLA4 (CD 152), je homolog za CD28, vendar ni izražen na mirujočih celicah T in se pojavi po T-celični aktivaciji (Brunet J.F. et al. 1987, Nature 328, 267-270). Za CTLA4 se zdi, da je kritičen pri negativni regulaciji T-celičnih odzivov (Waterhouse et al. 1995, Science 270:985). Za blokado CTLA4 so ugotovili, da odstrani inhibitorne signale, medtem ko so za agregacijo CTLA4 ugotovili, da zagotovi inhibitorne signale, ki zaviralno regulirajo T-celične odzive (Allison and Krummel, 1995, Science 270:932). B7 molekule imajo višjo afiniteto za CTLA4 kot za CD28 (Linsley P.S. et al. 1991, J. Exp. Med. 174, 561-569), za B7-1 ter B7-2 pa so ugotovili, da se vežeta na različne regije CTLA4 molekule in imata različne kinetike vezave na CTLA4 (Linsley et al. 1994, Immunity 1:793).

Med 10 in 25 % pacientov s hemofilijo razvije imunski odziv na faktor VIII. Ti pacienti razvijejo inhibitorje, navadno IgG protitelesa, ki nevtralizirajo aktivnost faktorja VIII in tako preprečijo učinkovito terapijo. Identificirana sta bila dva tipa inhibitorjev. Pacienti z visokim odzivom z inhibitorji tipa I imajo anamnestični odziv na faktor VIII, kar ima za posledico povečan titer protiteles za faktor VIII. Pacienti z nižjim odzivom z inhibitorjem tipa II imajo nižji protitelesni titer, ki se ne poveča z dajanjem faktorja VIII. Najnovejše strategije, da bi otopili protitelesni odziv pri teh pacientih, so bile le delno uspešne. Poleg tega je razvoj protiteles za nadomeščene proteine kritični problem, ki ga je treba rešiti, da bo genska terapija uspešna pri zdravljenju hemofilij in drugih nedohranjenostih (Connelly S. et al, Blood 88:3846, 1996; Kuna S-H et al, Blood 91:784, 1998).

Predloženi izum med drugim zagotavlja sestavke in postopke, ki dopuščajo dajanje terapevtskega proteina za zdravljenje motnje, medtem ko zmanšujejo razvoj in/ali napredovanje imunskega odziva na terapevtski protein.

Z enega vidika se predloženi izum nanaša na sestavke, ki obsegajo prvo sredstvo, ki pospešuje hemostazo, in drugo sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T.

V drugi izvedbi predmetni sestavki nadalje obsegajo farmacevtsko sprejemljivi nosilec.

V eni izvedbi je prvo sredstvo faktor VIII. V nadaljnji izvedbi je prvo sredstvo varianta faktorja VIII z izpuščeno domeno B. V eni izvedbi je prvo sredstvo faktor IX.

V nadaljnji izvedbi je prvo sredstvo von Willebrandov faktor.

V eni izvedbi je drugo sredstvo topna oblika kostimulatome molekule. V prednostni izvedbi je drugo sredstvo topna oblika CTLA4. V nadaljnji prednostni izvedbi je drugo sredstvo topna oblika B7-1, topna oblika B7-2 ali kombinacija topne oblike B71 in topne oblike B7-2. V bolj prednostni izvedbi je drugo sredstvo CTLA4Ig. V nadaljnji bolj prednostni izvedbi je drugo sredstvo B7-lIg ali B7-2Ig. Še v nadaljnji prednostni izvedbi je drugo sredstvo topna oblika CD40 ali CD40L.

V nadaljnji izvedbi je drugo sredstvo protitelo, ki se veže na kostimulatomo molekulo.

V prednostni izvedbi je drugo sredstvo izbrano iz skupine, ki jo sestavljajo anti-B7-l protitelo, anti-B7-2 protitelo in kombinacija anti-B7-l in anti-B7-2 protiteles. V eni izvedbi je protitelo neaktivirna oblika anti-CD28 protitelesa.

Predloženi izum se nadalje nanaša na postopke zdravljenja hemostatične motnje pri subjektu, ki obsegajo dajanje predloženih sestavkov le-temu, tako da se zdravi hemostatična motnja.

V eni izvedbi ima subjekt znaten titer protiteles, ki se vežejo na prvo sredstvo. V nadaljnji izvedbi subjekt nima znatnega titra protiteles, ki se vežejo na prvo sredstvo.

V eni izvedbi postopki obsegajo dajanje sestavka, ki obsega sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T.

V eni izvedbi je hemostatična motnja izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo hemofilija A, hemofilija B in von Willebrandova bolezen.

V nadaljnji izvedbi se izum nanaša na postopke zdravljenja hemostatične motnje pri subjektu, ki obsegajo dajanje le-temu prvega sredstva, ki pospešuje hemostazo, in drugega sredstva, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, tako da se zdravi hemostatična motnja.

Z nadaljnjega vidika se izum nanaša na postopke zdravljenja hemostatične motnje pri subjektu, ki obsegajo dajanje le-temu prvega sredstva, ki pospešuje hemostazo, in drugega sredstva, ki inhibira konstimulatomi signal v celici T, tako da pride do imunotolerance na drugo sredstvo, s tem pa se zdravi hemostatična motnja.

V eni izvedbi je prvo sredstvo faktor VIII. V nadaljnji izvedbi je prvo sredstvo varianta faktorja VIII z izpuščeno domeno B. V nadaljnji izvedbi je prvo sredstvo faktor IX. V nadaljnji izvedbi je prvo sredstvo von Willebrandov faktor.

V eni izvedbi je drugo sredstvo topna oblika sredstva, ki dovede kostimulatomi signal celici T. V prednostni izvedbi je sredstvo topna oblika CTLA4. V bolj prednostni izvedbi je sredstvo CTLA4Ig. V nadaljnji prednostni izvedbi je sredstvo topna oblika B7-1, topna oblika B7-2 ali kombinacija obeh B7-1 in B7-2. V nadaljnji bolj prednostni izvedbi je sredstvo B7-lIg, B7-2Ig ali kombinacija obeh B7-lIg in B7-2Ig.

V eni izvedbi je drugo sredstvo protitelo, ki se veže na kostimulatomo molekulo. V nadaljnji izvedbi je drugo sredstvo izbrano iz skupine, ki jo sestavljajo anti-B7-l protitelo, anti-B7-2 protitelo in kombinacija anti-B7-l in anti-B7-2 protiteles. V nadaljnji izvedbi je protitelo neaktivima oblika anti-CD28 protitelesa.

V eni izvedbi je hemostatična motnja izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo hemofilija A, hemofilija B in von Willebrandova bolezen.

V eni izvedbi ima subjekt znaten titer protiteles, ki se vežejo na prvo sredstvo.

Kratek opis risb

Fig. 1 ponazarja eksperimentalni model, uporabljen v Primeru 1 za preizkus inhibicije primarnih protitelesnih odzivov na faktor VIII.

Fig. 2 prikazuje, da so imele miši, ki niso prejele CTLA4Ig, visoke titre protiteles z zgodnim začetkom na dan 20 (G-l), medtem ko miši, ki so prejele CTLA4Ig, niso razvile protiteles do dneva 82 (G-2 in G-3).

Fig. 3 ponazarja eksperimentalni model, uporabljen v Primeru 2, za preizkus inhibicije sekudnarnih protitelesnih odzivov na faktor VIII.

Fig. 4 prikazuje, da so imele živali, ki niso prejele CTLA4Ig, visoke titre anti-faktor VIII protiteles (G-l), medtem ko miši, ki so prejele CTLA4Ig , (G-2), razen ene miši, niso razvile sekundarnega imunskega odziva na faktor VIII.

Fig. 5 prikazuje učinek mCTLA4-Ig na tvorbo anti-faktor VIII protitelesa.

Fig. 6 prikazuje učinek ponovljenega dajanja mCTLA4-Ig na tvorbo anti-faktor VIII protitelesa.

Fig. 7 prikazuje učinek simultanega dajanja mCTLA4-Ig in faktorja VIII.

Fig. 8 prikazuje učinek mCTLA4-Ig na sekundami imunski odziv na faktor VIII.

Fig. 9 prikazuje vlogo B7-1 in B7-2 pri anti-faktor VIII protitelesnem odzivu.

Fig. 10 prikazuje T-celični odziv na faktor VIII za miši s hemofilijo Α/Β7-Γ⁷ in hemofilijo A/B7-2'^z'.

Predloženi izum pomeni pomemben napredek pri zdravljenju hemostatičnih motenj z zagotavljanjem sestavkov in postopkov, ki dopuščajo dajanje terapevtskega proteina za zdravljenje motnje, medtem ko se zmanjšuje razvoj in/ali napredovanje imunskega odziva na terapevtski protein.

Pred nadaljnjim opisom izuma so tukaj zbrani nekateri izrazi, uporabljeni v specifikaciji, Primerih in priloženih zahtevkih zaradi prikladnosti.

I. Definicije

Kot uporabljamo tukaj, izraz hemostatična motnja vključuje motnje, ki imajo za posledico nenormalno krvavenje in/ali trombozo. Normalna hemostaza omejuje izgubo krvi z vrsto interakcij med komponentami žilnih sten, krvnimi ploščicami in plazemskimi proteini. Do hemostatičnih motenj pride npr. zaradi pomanjkanja agregacije krvnih ploščic in/ali tvorbe fibrinskega strdka, kar ima lahko za posledico neustrezne odzive na bolezen ali travmo, npr. nekontrolirano krvavenje. Take motnje lahko odkrijemo npr. z določevanjem časa krvavenja, delnega tromboplastinskega časa (PTT), protrombinskega časa (PT), trombinskega časa (TT) ali s kvantitativnim določevanjem fibrinogena s postopki, dobro znanimi v tehniki. Primeri za hemostatične motnje vključujejo hemofilijo A, hemofilijo B in von Willebrandovo bolezen.

Kot uporabljamo tukaj, izraz sredstvo, ki pospešuje hemostazo vključuje protein ali polipeptid, ki manjka ali je izpuščen v subjektu in ki takrat, kadar ga damo subjektu, izboljša ali zdravi hemostatično motnjo. Prednostna sredstva, ki izboljšujejo hemostazo, vključujejo koagulacijske faktorje, kot npr. faktor VIII, faktor IX, VWF in njihove analoge.

Izraz B7 družina ali B7 molekule, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje kostimulatorne molekule, ki delijo identiteto aminokislinske sekvence z B7 polipeptidi, npr. z B7-1, B7-2 ali B7-3 (razpoznano s protitelesom BB-1). Poleg tega B7 družina molekul deli navadno funkcijo, npr. sposobnost, da se veže na ligand B7 družine (npr. enega ali več od CD28, CTLA4 ali ICOS), in sposobnost, da kostimulira T-celično aktivacijo.

B7 polipeptidi so sposobni, da zagotovijo kostimulacijo za aktivirane celice T in tako inducirajo T-celično proliferacijo in/ali izločanje citokina ali inhibirajo kostimulacijo celic T, npr. kadar so prisotni v topni obliki. Člani B7 družine vključujejo B7-1, B7-2 in njihove topne fragmente ali derivate. V eni izvedbi se člani B7 družine vežejo na CTLA4, CD28, ICOS in/ali druge Ugande na imunskih celicah in imajo sposobnost, da inhibirajo ali inducirajo kostimulacijo imunskih celic.

Kot uporabljamo tukaj, izraz sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T vključuje sredstva, ki inhibirajo signal, proizveden z interakcijo kostimulatorne molekule na antigen predstavljajoči celici (APC), npr. molekula B7 družine in njen protireceptor na celici T. Kostimulatorne molekule na APC (npr. člani B7 družine) in njihove sorodne Ugande na celicah T (npr. CTLA4, CD28 in ICOS) tukaj skupno imenujemo kostimulatome molekule. Sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal, lahko deluje bodisi ekstracelularno, da inhibira interakcijo med kostimulatomimi molekulami in tako blokira produkcijo intracelularnih signalov, ali lahko deluje intracelulamo, da inhibira kostimulatome signale na signalni transdukcijski poti. Primeri za taka sredstva so opisani bolj podrobno v nadaljevanju in vključujejo npr. topne oblike kostimulatomih molekul in protiteles, ki se vežejo na kostimulatome molekule.

Kot uporabljamo tukaj, fraza zaviralno moduliranje imunskega odziva vključuje zmanjševanje imunskega odziva (npr. supresija, dušenje ali inhibicija) pri pacientu, ki nima obstoječega imunskega odziva, ali zmanjševanje dolžine in velikosti obstoječega imunskega odziva. Izraz imunski odziv vključuje katerikoli tip imunskega odziva, ki je iniciran ali odvisen od kostimulatomih signalov, npr. celularni ali humoralni odziv, do katerega lahko pride pri subjektu pri odzivu na tuj antigen. V eni izvedbi je imunski odziv protitelesni odziv na sredstvo, ki pospešuje hemostazo (npr. faktor VII, VWF ali faktor IX). Izraz imunotoleriranje vključuje indukcijo antigenske specifične tolerance, ki jo lahko izmerimo s postopki, znanimi v tehniki, npr. z merjenjem sekundarnih imunskih odzivov (npr. celularni ali humoralni odzivi) na antigen.

II. Sredstva, ki pospešujejo hemostazo

V eni izvedbi je sredstvo, ki pospešuje hemostazo, faktor VIII. Izraz faktor Vlil, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje proteine, ki kažejo lastnost prokoagulantne aktivnosti faktorja VIII. V eni izvedbi izuma so proteini faktorja VIII naravni proteini faktorja VIII. Taki proteini so lahko očiščeni iz krvi ali jih lahko damo kot krvni produkt ali obogaten krvni produkt. V eni izvedbi lahko proizvedemo visoko očiščeni faktor VIII z adsorbiranjem in eluiranjem faktorja iz krvnega produkta na monoklonalni protitelesni koloni. Alternativno lahko take naravne proteine naredimo rekombinantno z uporabo molekul nukleinske kisline, prednostno molekul naravne nukleinske kisline.

V eni izvedbi lahko proteine faktorja VIII naredimo z ekspresijo molekule nukleinske kisline, ki kodira faktor VIII v celici, s postopki, znanimi v tehniki, tako da

-1010 proizvedemo protein faktorja VIII. Nukleotidna sekvenca (in ustrezna aminokislinska sekvenca) humanega faktorja VIII je znana v tehniki (npr., Toole et al, Nature 1984 312-5992; ali GenBank pristopna št. Χ01179; KO 1740).

V drugi izvedbi je sredstvo, ki pospešuje hemostazo, nenaravni faktor VIII, npr. mutantna oblika faktorja VIII, ki ohrani terapevtsko delovanje, npr. aktivnost za pospeševanje hemostaze faktorja VIII. Da proizvedemo proteine faktorja VIII v smislu izuma, lahko npr. uporabimo sekvence DNA, sposobne hibridiziranja z DNA, ki kodira humani faktor VIII, pri pogojih, pri katerih se izognemo hibridizaciji z geni nefaktorja VIII (npr. pri pogojih, ekvivalentnih: 65 °C v 5 X SSC (1 X SSC =150 mM NaCl/0,15 M Na citrat)), ali sekvence homologne DNA, ki ohranijo sekvenčno identiteto preko regij molekule nukleinske kisline, ki kodira proteinske domene, ki so pomembne pri delovanju faktorja VIII. Kot primeri so tukaj z referencami vključene vsebine US-patentov št. 5,744,446; 5,663,060; 5,583,209; 5,661,008; 5,422,260 in 5,707,832.

V drugi izvedbi je sredstvo, ki pospešuje hemostazo, protein faktorja VIII, pri katerem je izpuščena vsaj ena domena (npr. nebistvena domena) proteina. V eni izvedbi je npr. protein faktorja VIII modificiran protein faktorja VIII, v katerem so izpuščene ena ali več amino kislin ali so substituirane med cepitvenima mestoma 90 kD in 69 kD, glede na naravni faktor VIII, kot je podrobno opisano v US-patentu 4,868,112, katerega vsebina je vključena tukaj z referenco.

V drugi izvedbi je sredstvo, ki pospešuje hemostazo, analog faktorja VIII, ki vsebuje delecije ene ali več amino kislin med cepitvenim mestom 50/40 in 73 kD cepitvenim mestom, ki ga lahko proizvedemo s postopki, analognimi tistim, opisanim v USpatentu 4,868,112, katerega vsebina je vključena tukaj z referenco. V prednostni izvedbi analog faktorja VIII ohrani del ali vso kislo aminokislinsko regijo med cepitvenima mestoma 80 kD in 73 kD. V drugi izvedbi je del te regije ali vsa nadomeščena z ustrezno kislo regijo takoj za cepitvenim mestom 50/40. Še v nadaljnjih izvedbah naredimo proteine faktorja VIII ali analoge (z delecijami ali brez,

-1111 kot je navedeno zgoraj), kot je npr. prikazano v mednarodni prijavi PCT/US 87/01299 (katere vsebina je vključena tukaj z referenco), kjer je bilo npr. eno ali več cepitvenih mest, ki obsegajo argeninske ostanke na mestih 226, 336, 562, 740, 776, 1313, 1648 ali 1721, narejenih odpornih za proteolitično cepitev, npr. z nadomestitvijo ene ali več amino kislin z drugačnimi amino kislinami z mutagenezo cDNA s postopki, znanimi v tehniki, npr. s standardno usmerjeno mutagenezo.

Sredstva, ki pospešujejo hemostazo, vključujejo tudi proteine hibridnega faktorja VIII, ki vključujejo del proteina humanega faktorja VIII in del proteina nehumanega faktorja VIII iz druge vrste (npr. prašičji faktor VIII). Take hibridne proteine lahko naredimo s postopki, dobro znanimi v tehniki, kot so npr. prikazani v US-patentih 5,744,446; 5,663,060 in 5,583,209.

Vsebine US-patentov 5,693,499; 5,681,746; 5,663,060; 5,583,209; 5,563,045; 5,460,951 in 5,455,031 so tudi izrecno vključene tukaj z referenco.

V drugi izvedbi je sredstvo, ki pospešuje hemostazo, faktor IX. Kot uporabljamo tukaj, izraz faktor IX vključuje, vendar neomejujoče, faktor IX, izoliran iz plazme, transformiranih celičnih linij in rekombinantno proizvedeni faktor IX, izoliran iz kulturnega medija gostiteljske celice. Faktor IX lahko očistimo iz krvi ali ga lahko damo kot krvni produkt ali obogaten krvni produkt. V eni izvedbi lahko visoko očiščeni faktor IX proizvedemo z adsorbiranjem in eluiranjem faktorja iz krvnega produkta na monoklonalni protitelesni koloni. Primeri za take postopke čiščenja so prikazani tudi v US-patentih 5,639,857; 5,457,181 in 5,286,849. Alternativno lahko take naravne proteine naredimo rekombinantno z uporabo molekul nukleinske kisline, prednostno molekul naravne nukleinske kisline. V določenih izvedbah lahko npr. naredimo proteine faktorje IX z ekspresijo molekule nukleinske kisline, ki kodira faktor IX, v celici s postopki, znanimi v tehniki, tako da proizvedemo protein faktorja IX. Primere za genetske konstrukte za ekspresijo faktorja IX, lahko najdemo v USpatentih 5,650,503 in 4,994,371.

-1212

Nukleotidna sekvenca in aminokislinska sekvenca faktorja IX je znana v tehniki (npr., Yoshitake et al. 1985, Biochemistry 24:3726 ali GenBank pristopna št. K02402; A07407; A01819 ali Χ54500).

V drugih izvedbah faktor IX vključuje npr. proteine, opisane v US-patentih 4,994,371; 5,171,569; 5,679,639; 5,621,039 in 5,714,583, katerih celotni opisi so vključeni tukaj z referenco.

Izraz faktor IX vključuje poleg naravnih oblik faktorja IX tudi nenaravne oblike, npr. mutantne oblike faktorja IX, ki ohranijo terapevtske lastnosti, npr. lastnosti pospeševanja hemostaze faktorja IX. Npr. sekvence DNA, sposobne hibridiziranja z DNA, ki kodira humani faktor IX, pri pogojih, pri katerih se izognemo hibridizaciji z geni ne-faktorja IX (npr. pri pogojih, ekvivalentnih: 65 °C v 5 X SSC (1 X SSC = 150 mM NaCl/0,15 M Na citrat)). Da proizvedemo proteine faktorja IX v smislu izuma, lahko uporabimo tudi sekvence DNA, ki ohranijo sekvenčno identiteto preko regij molekule nukleinske kisline, ki kodira proteinske domene, ki so pomembne za delovanje faktorja IX.

Proteine faktorja VIII ali faktorja IX lahko kupimo tudi na trgu. Dosegljive so npr. koncentrirane oblike faktorja VIII, npr.: Immunate® (Immuno), Beriate® (Behring); oblike faktorja VIII, očiščene monoklonskih protiteles, so tudi dosegljive, npr.: Octanativ-M® (Pharmacia), Hemofd M® (Baxter) in Monoclate-P® (Armour); in rekombinantne oblike faktorja VIII so tudi dosegljive, npr. Recombinate® (Baxter) in Kogenate® (Bayer). Rekombinantna oblika faktorja VIII z izpuščeno domeno B, rVIII SQ® (Pharmacia in Upjohn, Stockholm) je tudi dosegljiva. Faktor IX lahko kupimo, kot npr. Nanotiv® (Kabi Pharmacia) ali lmmunine® (Immuno); dosegljiv je tudi faktor IX, očiščen monoklonskih protiteles, kot Mononine® (Armour). Rekombinantni faktor IX je tudi dosegljiv, kot npr. BeneFIX® (Genetics Institute).

VWF je velik multimerni plazemski protein, sestavljen iz podenot enojnega glikoproteina. Podenote v VWF so vezene skupaj z disulfidnimi vezmi. V plazmi

-1313

VWF kroži kot multimeri, ki so v območju od dimerov do multimerov z več kot 50 podenotami. Dimeri so sestavljeni iz dveh podenot, združenih verjetno na njihovih Cterminalih s fleksibilnimi palično oblikovanimi domenami in so domnevno promotorji pri multimerizaciji. Protomeri so vezani preko velikih verjetno Nterminalnih globularnih domen, da tvorijo multimere. Za VWF se zdi, da je proizveden kot 260 kD glikoziliran prekurzor, ki je nato procesiran in sulfatiran. Po dimerizaciji in multimerizaciji ter proteolitični cepitvi ima zreli protein približno 225 kD. VWF je proizveden rekombinantno. Nukleotidna in aminokislinska sekvenca v VWF je znana v tehniki (npr. Sadler et al. 1986, Cold Spring Harbor Symposium in Qunatitative Biology 51:515 ali GenBank pristopna št. L15333 ali ΚΌ3028). Vsebina EP 0197592 BI je vključena tukaj z referenco.

Poleg naravnih oblik faktorja VWF vključuje izraz faktor VWF tudi nenaravne oblike, npr. mutantne oblike faktorja VWF, ki ohranijo terapevtske lastnosti, npr. lastnosti faktorja VWF za pospeševanje hemostaze. Npr. sekvence DNA, ki so sposobne hibridiziranja z DNA, ki kodira humani faktor VWF, pri pogojih, pri katerih se izognemo hibridizaciji z geni ne-faktorja VWF (npr. pri pogojih, ekvivalentnih: 65 °C v 5 X SSC (IX SSC =150 mM NaCl/0,15 M Na citrat)). Da proizvedemo proteine faktorja VWF v smislu izuma, lahko uporabimo tudi sekvence DNA, ki ohranijo sekvenčno identiteto preko regij molekule nukleinske kisline, ki kodira proteinske domene, ki so pomembne pri delovanju faktorja VWF.

V eni izvedbi izvirajo sredstva, ki pospešujejo hemostazo, iz sesalcev. V prednostni izvedbi so sredstva, ki pospešujejo hemostazo, po izvoru prašičja. Še v nadaljnji bolj prednostni izvedbi so sredstva, ki pospešujejo hemostazo, po izviru humana. V nadaljnji izvedbi so sredstva, ki pospešujejo hemostazo, hibridne molekule.

III. Imunomodulatorna sredstva

V eni izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, naravna oblika kostimulatorne molekule. Naravne oblike kostimulatornih molekul lahko očistimo iz

-1414 celic ali jih lahko rekombinantno proizvedemo z uporabo postopkov, dobro znanih v tehniki. Kostimulatome proteine lahko npr. naredimo z ekspresijo molekule nukleinske kisline, ki kodira kostimulatomo molekulo v celici, tako da proizvedemo kostimulatorno molekulo. Nukleotidne sekvence kostimulatornih molekul so znane v tehniki in jih lahko najdemo v literaturi ali v bazi podatkov, npr. GenBank. Npr. B7-2 (Freeman et al. 1993, Science 262:909 ali GenBank pristopna št. P42081 ali A48754); B7-1 (Freeman et al., J. Exp. Med. 1991, 174:625 ali GenBank pristopna št. P33681 ali A45803; CTLA4 (npr. Ginsberg et al. 1985, Science 228:1401; ali GenBank pristopna št. P16410 ali 291929); in CD28 (Aruffo in Seed, Proč. Natl. Acad. Sci. 84:8573 ali GenBank pristopna št. 180091), ICOS (Hutloff et al. 1999, Nature 397:263; WO 98/38216) in sorodne sekvence.

Poleg naravnih oblik kostimulatornih molekul vključuje izraz kostimulatoma molekula tudi nenaravne oblike, npr. mutantne oblike kostimulatornih molekul, ki ohranijo delovanje kostimulatome molekule, npr. sposobnost za vezanje na sorodne protireceptorje. Npr. sekvence DNA, ki so sposobne hibridiziranja z DNA, ki kodira B7 molekulo, CTLA4 molekulo, CD28 ali ICOS molekulo, pri pogojih, pri katerih se izognemo hibridizaciji z nekostimulatomimi molekulskimi geni (npr. pri pogojih, ekvivalentnih 65 °C v 5 X SSC (1 X SSC = 150 mM NaCl/0,15 M Na citrat)) so kostimulatome molekule v obsegu predloženega izuma. Alternativno lahko uporabimo sekvence DNA, ki ohranijo sekvenčno identiteto preko regij molekule nukleinske kisline, ki kodira proteinske domene, ki so pomembne pri kostimulatornem delovanju molekule, npr. vezava na druge kostimulatome molekule, da proizvedemo kostimulatome proteine, ki jih lahko uporabimo kot sredstva, ki inhibirajo kostimulatorni signal v celici T. Prednostno imajo nenaravne kostimulatome molekule znatno (npr. večjo od 70 %, prednostno večjo od 80 % in bolj prednostno večjo od 90 do 95 %) aminokislinsko identiteto z naravno aminokislinsko sekvenco ekstracelularne domene kostimulatome molekule.

Za določitev aminokislinskih ostankov kostimulatome molekule, ki so verjetno pomembni pri vezavi kostimulatome molekule na njen protireceptor, so lahko

-1515 aminokislinske sekvence, ki obsegajo ekstracelulame domene kostimulatomih molekul različnih vrst, npr. miši in človeka, poravnani in konzervirani (npr. identično) zaznamovani ostanki. To lahko naredimo npr. s katerimkoli standardnim programom za poravnavo, kot je npr. MegAlign (DNA STAR). Taki konzervirani ali identični ostanki so verjetno potrebni za pravilno vezavo kostimulatomih molekul na njihove receptorje in tako verjetno niso na voljo za spremembo.

Specifični ostanki kostimulatomih molekul, ki so pomembni pri vezavi, so bili prav tako določeni. Npr., del CD28, ki je kritičen za interakcijo z B7-1 in B7-2, je bil določen z uporabo usmerjene mutageneze, mapiranja CD28 monoklonskega protitelesnega epitopa, adhezijskih preizkusov na osnovi receptorja in direktne vezave Ig-fuzijskih proteinov na celične površine receptorjev. Za raztezek sekvence, bogate s prolinom, pri CD28, ΜΥΡΡΡΥ, je ugotovljeno, da je kritično za delovanje tega proteina (Truneh et al. 1996, Mol. Immunol. 33:321). Podobno so z mutacijo identificirane regije B7-1 molekule, ki so pomembne pri posredovanju funkcionalnih interakcij s CD28 in CTLA4. Ugotovljeno je, da sta kritična dva hidrofobna ostanka v domeni B7-1, podobni V, vključno ostanek Υ87, kije konzerviran v vseh B7-1 in B72 molekulah, kloniranih iz različnih vrst (Fargeas et al. 1995, J. Exp. Med. 182:667). Z uporabo teh ali podobnih tehnik je možno določiti aminokislinske ostanke ekstracelulamih domen kostimulatomih molekul, ki so kritični in zato niso voljni za spremembo.

Kostimulatome molekule so lahko izražene v topni obliki ali uporabljene kot imunogeni za izdelavo protiteles. Take topne kostimulatome molekule ali protitelesa so koristna kot sredstva, ki inhibirajo kostimulatorni signal v celici T, kot je nadalje podrobno opisano.

A. Sredstva, ki delujejo ekstracelularno, da inhibirajo kostimulatorni signal v celici T

1. Topne oblike kostimulatomih molekul

-1616

V eni izvedbi je sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T, topna oblika Tcelične kostimulatorne molekule (npr. CTLA4, CD28 in/ali ICOS), ki je sposobna blokiranja transdukcije kostimulatomega signala v celici T.

V eni izvedbi je sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T, topna oblika CTLA4. DNA sekvence, ki kodirajo humani in murini CTLA4 protein, so znane v tehniki, npr. Dariavich, et al. (1988), Eur. J. Immunol. 18 (12), 1901-1905; Brunet J.F. et al. (1987) zgoraj; Brunet J.F. et al. (1988), Immunol. Rev. JJ)3.:21-36; in Freeman G.J. et al. (1992), J. Immunol. 149. 3795-3801. V določenih izvedbah topni CTLA4 protein obsega celotni CTLA4 protein. V prednostnih izvedbah topni CTLA4 protein obsega ekstracelularno domeno CTLA4 proteina. Npr., topna rekombinantna oblika ekstracelularne domene CTLA4 je bila izražena v kvasovkah (Gerstmayer et al. 1997, FEBS Lett. 407-63). V nadaljnji izvedbi obsegajo topni CTLA4 proteini vsaj del ekstracelularne domene CTLA4 proteina, ki ohrani sposobnost, da se veže na B7-1 in/ali B7-2.

V eni izvedbi je topni CTLA4 protein ali njegov del fuzijski protein, ki obsega vsaj del CTLA4, ki se veže na B7-1 in/ali B7-2, in vsaj del drugega ne-CTLA4 proteina. V prednostnih izvedbah CTLA4 fuzijski protein obsega CTLA4 ekstracelularno domeno, kije fuzionirana na amino terminalu s signalnim peptidom, npr. iz onkostatina M (npr. W093/00431).

V posebno prednostni izvedbi je topna oblika CTLA4 fuzijski protein, ki obsega ekstracelularno domeno CTLA4, fuzionirano z delom imunoglobulinske molekule. Tak fuzijski protein CTLA4Ig lahko naredimo s postopki, znanimi v tehniki (npr., Linsley 1994, Perspectives in Drug Discovery and Design 2:221; Linsley WO 93/00431 in US-patent 5,770,197).

V eni izvedbi je sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T topna oblika antigen predstavljajoče celične kostimulatorne molekule, npr. molekula B7-družine, kot npr. B7-1, B7-2 in/ali ICOS ligand. Npr., v eni izvedbi topna oblika

-1717 kostimulatome molekule vključuje topno obliko B7-1 ali topno obliko B7-2 ali kombinacijo topne oblike B7-1 in topne oblike B7-2. Sekvence DNA, ki kodirajo B7 proteine so znane v tehniki, npr. B7-2 (Freeman et al. 1993 Science, 262:909 ali GenBank pristopna št. P42081 ali A48754); B7-1 (Freeman et al. J.Exp. Med. 1991, 174:625 ali GenBank pristopna št. P33681 ali A45803). V določenih izvedbah topni B7 protein obsega celotni B7 protein. V prednostnih izvedbah topni B7 protein obsega ekstracelulamo domeno B7 proteina. Npr., topna rekombinantna oblika ekstracelulame domene CTLA4 je izražena v kvasovkah (Gerstmayer et al. 1997, FEBS Lett. 407:63). V drugih izvedbah topni B7 proteini obsegajo vsaj del ekstracelulame domene B7 proteina, ki ohrani sposobnost, da se veže na CTLA4 in/ali CD28.

V eni izvedbi je topni B7 protein ali njegov del fuzijski protein, ki obsega vsaj del B7, ki se veže na CD28 in/ali CTLA4, in vsaj del drugega ne-B7 proteina. V prednostnih izvedbah B7 fuzijski protein obsega B7 ekstracelulamo domeno, ki je fuzionirana na amino terminalu s signalnim peptidom, npr. iz onkostatina M (npr., WO 93/00431).

V posebno bolj prednostni izvedbi je topna oblika B7 fuzijski protein, ki obsega ekstracelulamo domeno B7, fuzionirano z delom imunoglobulinske molekule. Tak fuzijski protein B7Ig lahko izdelamo s postopki, znanimi v tehniki (npr., Linsley 1994, Perspecitves in Drug Discovery and Design 2:221; Linsley WO 93/00431, US- patent 5,770,197 in US-patent 5,580,756).

2. Protitelesa, ki se vežejo na kostimulatome molekule

N določenih izvedbah je sredstvo, ki blokira kostimulatomi signal v celici T, protitelo, ki se veže na kostimulatomo molekulo. Pri izdelavi protiteles, ki se vežejo na kostimulatome molekule, lahko uporabimo kostimulatomi protein, del kostimulatornega proteina (npr. peptid, izveden iz kostimulatornega proteina) ali fuzijski protein, ki vključuje vso ali del aminokislinske sekvence kostimulatome molekule, da proizvedemo antiproteinske in/ali antipeptidne poliklonalne antiserume

-1818 ali monoklonalna protitelesa s standardnimi postopki. Za izraz protitelo, kot ga uporabljamo tukaj, je mišljeno, da vključuje celotna protitelesa kot tudi njihove fragmente. Fragmente protiteles (npr. Fab' fragmente, F(ab')₂ fragmente ali enoverižna protitelesa) lahko izdelamo s postopki, dobro znanimi v tehniki. Izraz protitelo vključuje tudi kimerna in humanizirana protitelesa.

Sesalca (npr. miš, hrčka ali zajca) lahko npr. imuniziramo z imunogeno obliko kostimulatomega proteina ali peptida, ki izzove protitelesni odziv pri sesalcu. Imunogen je lahko npr. rekombinantni kostimulatorni molekulski protein ali njegov fragment, sintetični peptidni fragment, ali celica, ki izraža kostimulatorno molekulo na svoji površini. Celica je lahko npr. antigen predstavljajoča celica, ali celica T, ali celica, transferktirana z nukleinsko kislino, ki kodira kostimulatorno molekulo, tako da je kostimulatorna molekula izražena na celični površini. Gostiteljske celice, transfektirane za izražanje peptidov, so lahko katerekoli prokariotske ali evkariotske celice. Peptid s kostimulatorno molekulsko aktivnostjo lahko npr. izrazimo v bakterijskih celicah, kot npr. E.coli, insektnih celicah (bakulovirus), kvasovkah ali sesalskih celicah, kot npr. ovarijskih celicah kitajskega hrčka (CHO) in celicah NSO. Druge prikladne gostitelj ske celice in ekspresij ske vektorje lahko najdemo v: Goeddel (1990), zgoraj ali so znane strokovnjakom. Primeri za vektorje za ekspresijo v kvasovki S. cerivisae vključujejo pYepSecl (Baldari et al. (1987), Embo J. 6:229234), pMFa (Kurjan in Herskowitz (1982), Celi 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54:113-123) in pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Bakulovirusni vektorji, dosegljivi za ekspresijo proteinov v kultiviranih insektnih celicah (celicah SF 9), vključujejo pAc vrsto (Smith et al. (1983), Mol. Celi. Biol. 3:2156-2165) in pVL vrsto (Lucklow V.A. in Summers M.D. (1989) Virology 170:3139). Na splošno so celice COS (Gluzman Y. (1981), Celi 23:175-182) uporabljene skupaj s takimi vektorji, kot je pCDM8 (Seed B., (1987) Nature 329:840) za prehodno pomnoževanje/ekspresijo v sesalskih celicah, medtem ko so celice CHO (dhfr)( ovarijske celice kitajskega hrčka) uporabljene z vektorji, kot npr. pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195) za stabilno pomnoževanje/ekspresijo v sesalskih celicah. Prednostna celična linija za produkcijo rekombinantnega proteina je NSO

-1919 mielomska celična linija, dosegljiva pri ECACC (kataloška št. 85110503) in jo opisujeta: Galfre G. in Milstein C. ((1981), Methods in Enzymology 73(13):3-46; in Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, Ν.Υ., Ν.Υ.). Vektorsko DNA lahko uvedemo v sesalske celice s konvencionalnimi tehnikami, kot so npr.: soprecipitacija s kalcijevim sulfatom ali kalcijevim kloridom, transfekcija, posredovana z DEAE-dekstranom, lipofektin ali elektroporacija. Prikladni postopki za transformiranje gostiteljske celice so opisani v: Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) in drugih laboratorijskih knjigah. Kadar jih uporabimo v sesalskih celicah, so kontrolne funkcije ekspresijskih vektorjev navadno zagotovljene z virusnim materialom. Npr., navadno uporabljeni promotorji so izvedeni iz polioma, adenovirusa 2, citomegalovirusa in najbolj pogosto Simian virusa 40.

Peptide, ki imajo aktivnost kostimulatorne molekule, izraženo v sesalskih celicah ali drugače, lahko očistimo s standardnimi postopki v tehniki, ki vključujejo precipitacijo z amonijevim sulfatom, frakcionirno kolonsko kromatografijo (npr. ionska izmenjava, gelska filtracija, elektroforeza, afinitetna kromatografija itd.) in končno kristalizacijo (na splošno, Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22:233-577 (1971)).

Strokovnjaki bodo upoštevali, da jim je proizvajanje protiteles za humane kostimulatorne molekule z naslednjimi standardnimi tehnikami znano. Protitelesa so lahko bodisi poliklonalna ali monoklonalna ali fragmenti takih protiteles, ki vežejo antigen. Posebno pomembna za uporabo pri terapevtskih aplikacijah so protitelesa, ki inhibirajo vezavo kostimulatorne molekule z njenim naravnim ligandom (ligandi) na površini imunskih celic, in s tem inhibirajo kostimulacijo imunske celice. Prednostna antikostimulatorna molekulska protitelesa so tista, ki so sposobna inhibiranja ali zaviralnega reguliranja T-celično posredovanih imunskih odzivov z vezanjem B7-2 ali B7-1 na površini B-limfocitov in preprečevanja interakcije s CTLA4 in/ali CD28. Druga prednostna antikostimulatorna molekulska protitelesa so tista, ki imajo v kombinaciji z drugim protitelesom, ki se veže na drugo kostimulatorno molekulo, za

-2020 posledico povečano inhibicijo kostimulacije celice T, kadar primerjamo s prvim protitelesom samim, npr. kombinacija anti-B7-l in anti-B7-2 protiteles.

A. Imunogen. Izraz imunogen je tukaj uporabljen za opis sestavka, ki vsebuje peptid z aktivnostjo kostimulatorne molekule kot aktivno sestavino, uporabljeno za pripravo protiteles proti kostimulatomi molekuli. Kadar uporabimo peptid z aktivnostjo kostimulatorne molekule, da induciramo protitelesa, je razumljivo, da lahko uporabimo peptid sam ali vezanega na nosilec kot konjugat ali peptidni polimer.

Za izdelavo prikladnih antikostimulatomih molekulskih protiteles naj bi imunogen vseboval učinkovito imunogeno količino peptida z aktivnostjo kostimulatorne molekule, značilno vezanega kot konjugat na nosilec. Učinkovita količina peptida na enotno dozo je odvisna med drugim tudi od vrste inokulirane živali, telesne mase živali in izbranega imunizacij skega režima, kot je dobro znano v tehniki. Imunogeni pripravek značilno vsebuje peptidne koncentracije od pribl. 10 pg do pribl. 500 mg na imunizacij sko dozo, prednostno pribl. 50 pg do pribl. 50 mg na dozo. Imunizacij ski pripravek lahko vključuje tudi adjuvans kot del razredčila. Adjuvansi, kot npr. popolni Freundov adjuvans (CFA), nepopolni Freundov adjuvans (IFA) in alum, so materiali, dobro znani v tehniki in komercialno dosegljivi pri različnih virih.

Strokovnjaki bodo upoštevali, da lahko namesto naravne oblike kostimulatorne molekule za imunizacijo alternativno uporabimo tudi sintetične petpide, proti katerim vzgojimo protitelesa za uporabo v predloženemu izumu. Tako topne kot tudi membransko vezane kostimulatorne molekule ali peptidni fragmenti so prikladni za uporabo kot imunogeni in jih prav tako lahko izoliramo z imunoafinitetnim čiščenjem. Očiščeno obliko kostimulatomega molekulskega proteina, ki jo lahko izoliramo, kot je opisano zgoraj ali znano v tehniki, lahko samo direktno uporabimo kot imunogen ali jo alternativno lahko vežemo na prikladen nosilni protein s konvencionalnimi tehnikami, ki vključujejo kemijska pripojitvena sredstva kot tudi z genetskim inženirstvom z uporabo kloniranega gena kostimulatorne molekule.

-2121

Izbrani peptid za protein za imunizacijo lahko modificiramo, da povečamo njegovo imunogenost. Tehnike za podeljevanje imunogenosti peptidu vključujejo npr. konjugacijo z nosilci ali druge tehnike, dobro znane na tem področju. Sintetiziramo lahko tudi katerikoli peptid, izbran za imunizacijo. V določenih izvedbah lahko take peptide sintetiziramo kot razvejene polipeptide, da povečamo imunske odzive, kot je znano v tehniki (npr. Peptides, izd. Bemd Gutte Academic Press 1995, str. 456-493).

Očiščeni kostimulatomi molekulski protein je lahko tudi kovalentno ali nekovalentno modificiran z neproteinskimi materiali, kot npr. lipidi ali ogljikovimi hidrati, da se poveča imunogenost ali topnost. Alternativno je očiščeni kostimulatomi molekulski protein lahko pripojen ali vgrajen v virusni delec, replikacijski virus ali drug mikroorganizem, da se poveča imunogenost. Kostimulatomi molekulski protein je lahko npr. kemijsko vezan na virusni delec ali mikroorganizem ali njegov imunogenski del.

V ilustrativni izvedbi je očiščeni kostimulatomi molekulski protein ali peptidni fragment, ki ima kostimulatorno molekulsko aktivnost (npr. izdelan z omejeno proteolizo ali rekombinantnimi DNA tehnikami), konjugiran z nosilcem, ki je imunogen pri živalih. Prednostni nosilci vključujejo proteine, kot npr. albumin, serumske proteine (npr. globuline in lipoproteine) in poliamino kisline. Primeri za uporabne proteine vključujejo goveji serumski albumin, zajčji serumski albumin, tiroglobulin, hemocianin morske školjke, jajčni ovalbumin in goveje gama globuline. Sintetične poliamino kisline, kot npr. polilizin ali poliarganin, so tudi uporabni nosilci. Za kovalentno vezavo kostimulatornega molekulskega proteina ali peptidnih fragmentov na prikladni imunogeni nosilec obstajajo številna kemična premreževalna sredstva, znana strokovnjakom. Prednostna premreževalna sredstva so hcterobifonkcionalna premreževalna sredstva, ki jih lahko uporabimo za vezavo proteinov na stopenjski način. V tehniki so znana številna hcterobifonkcionalna premreževalna sredstva, vključno: sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-lkarboksilat (SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroskisukcinimidini ester (MBS); Nsukcinimidil (4-jodoacetil)-aminobenzoat (SLAB), sukcinimidil 4-(p-2222 maleimidofenil)butirat (SMPB), 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorid (EDC); 4-sukcinimidiloksikarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-toluen (SMPT), N-sukcinimidil-3-(2-piridildito)propionat (SPDP), sukcinimidil 6-[3-(2piridilditio)propionat]heksanoat (LC-SPDP).

Prikladno je lahko tudi enostavno imuniziranje s celotnimi celicami, ki izražajo kostimulatomi molekulski protein na svoji površini. Različne celične linije lahko uporabimo kot imunogene, da proizvedemo monoklonalna protitelesa za kostimulatomi molekulski antigen, vključno, vendar neomejujoče aktivirane celice B. Vranične celice B lahko npr. dobimo iz subjekta in aktiviramo z antiimunoglobulinom. Alternativno lahko uporabimo B-celično linijo, če je kostimulatoma molekula izražena na celični površini, npr. celično linijo Raji (Bcelični Burketovi limfomi, npr. Freeman G.J. et al. (1993), Science 262:909-911) ali JY B limfoblastoidno celično linijo (npr., Ažurna M. et al. (1993), Nature 366:76-79). Celotne celice, kijih lahko uporabimo kot imunogene, da proizvedemo kostimulatoma molekulska specifična protitelesa, vključujejo tudi rekombinantne transfektante. Npr. celice COS in CHO lahko rekonstituiramo s transfekcijo s kostimulatomo molekulo cDNA, kot opisujejo: Knudson et al. (1993, PNAS 90:4003-4007); Travemor et al. (1993, Immunogenitics 37:474-477); Dougherty et al. (1991, J. Exp Med 174:1-5) in Aruffo et al. (1990, Celi 61:1303-1313), da proizvedemo intaktno kostimulatomo molekulo na celični površini. Te transfektantne celice lahko nato uporabimo kot imunogen, da proizvedemo antikostimulatoma molekulska protitelesa s predhodno izbrano specifičnostjo. Drugi primeri transfektantnih celic so znani, posebno evkariotske celice, ki so sposobne, da glikozilirajo kostimulatomi molekulski protein, seveda pa bi lahko uporabili katerikoli postopek, s katerim bi dosegli izražanje tansfektiranih kostimulatomih molekulskih genov na celični površini za produkcijo celotnega celičnega imunogcna.

B. Poliklonalna antikostimulatoma molekulska protitelesa

-2323

Poliklonalna protitelesa za očiščeni kostimulatomi molekulski protein ali peptid z kostimulatorno molekulsko aktivnostjo lahko na splošno dobimo pri živalih z multiplimi subkutanimi (sc) ali intraperitonealnimi (ip) injekcijami kostimulatomega molekulskega imunogena, kot npr. ekstracelularno domeno kostimulatomega molekulskega proteina in adjuvansa. Kot je npr. opisano zgoraj, je lahko koristno, da konjugiramo kostimulatorno molekulo (vključno fragmente, ki vsebujejo poseben epitop (epitope), ki nas zanima) na protein, ki je imunogen v vrsti, ki jo je treba imunizirati, npr. hemocianin morske školjke, serumski albumin.

Za način in urnik dajanja za gostiteljsko žival ali kultivirane protitelesa proizvajajoče celice iz le-te lahko na splošno uporabimo ustaljene in konvencionalne tehnike za protitelesno stimulacijo in produkcijo. V ilustrativni izvedbi živali značilno imuniziramo proti imunogenim kostimulatomim molekulskim konjugatom ali derivatom s kombiniranjem pribl. 1 pg do 1 mg konjugata s Freundovim popolnim adjuvansom in injiciranjem raztopine intradermalno na več mestih. En mesec kasneje živali poživimo z 1/5 do 1/10 originalne količine konjugata v Freudovem popolnem adjuvansu (ali drugem prikladnem adjuvansu) s subkutano injekcijo na več mestih. 7 do 14 dni kasneje živalim vzamemo kri in serum preizkusimo za antikostimulatomi molekulski titer. Živali poživljamo do titrskega platoja. Prednostno žival poživimo s konjugatom istega kostimulatomega molekulskega proteina, vendar konjugiranega na drugačen protein in/ali z različnimi premreževalnimi sredstvi. Konjugate lahko naredimo tudi v rekombinantni celični kulturi kot proteinske fuzije. Prav tako lahko uporabimo tudi agregacijska sredstva, kot npr. alum, da povečamo imunski odziv.

Take sesalsko proizvedene populacije protitelesnih molekul imenujemo poliklonalne, ker populacija obsega protitelesa z različnimi imunospecifičnostmi in afinitetami za kostimulatorno molekulo. Protitelesne molekule nato zberemo od sesalcev in izoliramo z dobro znanimi tehnikami, kot npr. z uporabo DEAE Sephadexa, da dobimo IgG frakcijo. Da povečamo specifičnost protitelesa, lahko protitelesa očistimo z imunoafinitetno kromatografijo z imunogenom s pritrjeno trdno fazo. Protitelo spravimo v stik z imunogenom s pritrjeno trdno fazo, in sicer za

-2424 zadosten čas, da imunogen imunoreagira s protitelesnimi molekulami, da se tvori imunokompleks s pritrjeno trdno fazo. Vezana protitelesa ločimo od kompleksa s standardnimi tehnikami.

C. Monoklonalna anti-ko stimulator na molekulska protitelesa

Izraz monoklonalno protitelo ali monoklonalni protitelesni sestavek, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na populacijo protitelesnih molekul, ki vsebujejo le eno vrsto antigen vezavnega mesta, sposobnega imunoreagiranja s posebnim epitopom kostimulatorne molekule. Monoklonalni protitelesni sestavek tako značilno prikazuje eno vezavno afiniteto za posebni kostimulatorni molekulski protein, s katerim imunoreagira. Prednostno je monoklonalno protitelo, uporabljeno v postopku v smislu izuma, nadalje označeno kot tako, ki imunoreagira s kostimulatorno molekulo, izvedeno iz ljudi.

Monoklonalna protitelesa, uporabna v sestavkih in postopkih v smislu izuma, so usmerjena na epitop kostimulatomega molekulskega antigena, tako da tvorba kompleksa med protitelesom in kostimulatomim molekulskim antigenom inhibira interakcijo kostimulatorne molekule z njenim naravnim liganom (Ugandi) na površini imunskih celic in s tem inhibira kostimulacijo celice T z interakcijo kostimulatoma molekula-ligand. Monoklonalno protitelo za epitop kostimulatorne molekule lahko pripravimo s postopkom, ki zagotavlja produkcijo protitelesnih molekul s kontinuirnimi celičnimi linijami v kulturi. To vključuje, vendar neomejujoče, hibridomske postopke, ki so jih originalno opisali: Kohler in Milstein (1975, Nature 256:495-497), in novejšo humane B-celične hibridomske postopke (Kozbor et al. (1983) immunol Today 4:72), EBV-hibridomski postopek (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96) in triomske postopke. Drugi postopki, pri katerih lahko učinkovito dobimo monoklonalna protitelesa, uporabna v predloženem izumu, vključujejo postopke za prikazovanje fagov (Marks et al. (1992), J. Biol Chem 16007-16010).

-2525

V eni izvedbi je protitelesni pripravek, uporabljen v predloženem postopku, monoklonsko protitelo, proizvedeno s hibridomsko celično linijo. Hibridomski fuzijski postopki so bili najprej uvedeni: Kohler in Milstein (Kohler et al., Nature (1975) 256:495-97; Brown et al. (1981), J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976), PNAS 76:2927-31; in Yeh et al. (1982), Int. J. Cancer 29:269-75). Tako lahko monoklonske protitelesne sestavke v smislu izuma proizvedemo z naslednjim postopkom, ki obsega stopnje:

(a) Imuniziranje živali s kostimulatorno molekulo. Imunizacijo značilno izvedemo z dajanjem kostimulatornega molekulskega imuno gena imunološko kompetentnemu sesalcu v imunološko učinkoviti količini, tj. količini, ki zadostuje, da proizvede imunski odziv. Prednostno je sesalec glodalec, kot je zajec, podgana ali miš. Sesalca nato vzdržujemo v časovni periodi, ki zadostuje, da sesalec proizvede celice, ki izločajo protitelesne molekule, ki imunoreagirajo s kostimulatornim molekulskim imunogenom. Tako imunoreakcijo detektiramo s pregledovanjem tako proizvedenih protitelesnih molekul za imunoreaktivnost s pripravkom imunogenega proteina. Po izbiri lahko pregledamo protitelesne molekule s pripravkom proteina v obliki, ki jo je treba detektirati s protitelesnimi molekulami pri preizkusu, npr. z membrano združena oblika kostimulatorne molekule. Ti postopki za pregledovanje so dobro znani strokovnjakom.

(b) Nato pripravimo suspenzijo celic, ki proizvajajo protitelesa, odstranjenih iz vsakega imuniziranega sesalca, ki izloča želeno protitelo. Po zadostnem času miši usmrtimo in dobimo somatske limfocite, ki proizvajajo protitelesa. Celice, ki proizvajajo protitelesa, lahko izvedemo iz limfnih žlez, vranice in periferne krvi živali, obdelanih s primerjem. Vranične celice so prednostne in jih lahko mehanično ločimo v individualne celice v fiziološko prikladnem mediju z dobro znanimi postopki. Mišji limfociti dajo višji odstotek stabilnih fuzij z mišjimi mielomi, opisanimi spodaj. Prav tako lahko uporabimo podganje, zajčje in žabje somatske celice. Kromosome vraničnih celic, ki kodirajo želene imunoglobuline, ovekovečimo s fuzioniranjem vraničnih celic z mielomskimi celicami, na splošno v navzočnosti fuzionimega sredstva, kot je npr. polietilenglikol (PEG). Katerokoli od številnih mielomskih

-2626 celičnih linij lahko uporabimo kot fuzijski partner v skladu s standardnimi tehnikami; npr. P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653 ali Sp2/O-Agl mielomske linije. Te mielomske linije so dosegljive pri American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md.

Dobljene celice, ki vključujejo želene hibridome, nato gojimo v selektivnem mediju, kot je npr. HAT-medij, v katerem nefuzionirane parentalne mielomske ali limfocitne celice po možnosti umrejo. Preživijo le hibridomske celice in jih lahko gojimo pri pogojih omejujočega razredčevanja, da dobimo izolirane klone. Supematante hibridomov pregledamo za prisotnost protitelesa želene specifičnosti, npr. s tehnikami imuno preizkusov z uporabo antigena, ki smo ga uporabili za imunizacijo. Pozitivne klone lahko nato subkloniramo pri pogojih omejujočega razredčenja, proizvedeno monoklonsko protitelo pa lahko izoliramo. Obstajajo različni konvencionalni postopki za izolacijo in čiščenje monoklonskih protiteles, tako da jih osvobodimo proteinov in drugih kontaminantov. Navadno uporabljeni postopki za čiščenje monoklonskih protiteles vključujejo precipitacijo z amonijevim sulfatom, ionsko izmenjevalno kromatografijo in afinitetno kromatografijo (npr., Zola et al. Monoclonal Hvbridoma Antibodies: Technigues And Applications, Hurell (izd.) str. 51-52 (CRC Press 1982)). Hibridome, proizvedene po teh postopkih, lahko razmnožimo in vitro ali in vivo (v ascitesni tekočini) s postopki, znanimi v tehniki.

Na splošno lahko individualno celično linijo razmnožimo in vitro v laboratorijskih posodah za kulture, kulturni medij, ki vsebuje visoke koncentracije posameznih specifičnih monoklonskih protiteles, pa lahko zberemo z dekantiranjem, filtracijo ali centrifugiranjem. Alternativno lahko dobitek monoklonskih protiteles povečamo z injiciranjem vzorca hibridomov v histokompatibilno žival tipa, uporabljenega, da zagotovimo somatske in mielomske celice za originalno fuzijo. Tumorji, ki izločajo specifična monoklonska protitelesa, proizvedena s fuzioniranim celičnim hibridom, se razvijejo v injicirani živali. Telesne tekočine živali, kot je npr. ascitesna tekočina ali serum, zagotovijo monoklonska protitelesa v visokih koncentracijah. Kadar uporabimo humane hibridome ali EV-hibridome je nujno, da se izognemo zavrnitvi

-2727 tujega vcepka, injiciranega v živali, kot npr. miši. Uporabimo lahko ali imunodificientne ali gole miši ali pa lahko hibridome najprej spustimo v obsevane gole miši kot trdni subkutani tumor, kultiviran in vitro, in nato injiciramo intraperitonealno v obsevane gole miši, obdelane s primerjem pristanom, ki razvijejo ascitesne tumorje, ki izločajo velike količine specifičnih humanih monoklonalnih protiteles.

Mediji in živali, uporabni za pripravo teh sestavkov, so tako dobro znani v tehniki kot tudi komercialno dosegljivi in vključujejo sintetične kulturne medije, miši z dednimi lastnostmi ipd. Primer za sintetični medij je Dulbeccov minimalno esencialni medij (DMEM; Dulbecco et al. (1959), Virol 8:396), dopolnjen s 4,5 g/1 glukoze, 20 mM glutamina in 20 % fetalnega telečjega seruma. Primer za sev miši s dednimi lastnostmi je Balb/c.

D. Humanizirana anti-kostimulatorna molekulska protitelesa

Kadar se protitelesa, proizvedena v nehumanih subjektih, uporabljajo terapevtsko pri ljudeh, so prepoznana do različnih stopenj kot tuja in v pacientu lahko nastane imunski odziv. Način za minimiziranje ali eliminiranje tega problema, ki je prednosten za splošno imunosupresijo, je, da proizvedemo kimerne protitelesne derivate, tj. protitelesne molekule, ki združujejo nehumano živalsko variabilno regijo in humano konstantno regijo. Taka protitelesa so ekvivalenti monoklonalnih in poliklonalnih protiteles, opisanih zgoraj, vendar pa so lahko manj imunogena, kadar jih damo ljudem in jih pacienti za to verjetno bolje tolerirajo.

Kimerna mišja-humana monoklonalna protitelesa (tj. kimema protitelesa), reaktivna s kostimulatomo molekulo, lahko npr. proizvedemo s postopki, ki so jih nedavno razvili za proizvodnjo kimernih protiteles. Humanizirana protitelesa lahko npr. proizvedemo z nadomestitvijo imunogenega dela protitelesa z ustreznim, vendar neimunogenim delom. V skladu s tem so geni, ki kodirajo konstantne regije glodalske (ali drugih vrst) anti-kostimulatorne molekulske protitelesne molekule, substituirani z geni, ki kodirajo

-2828 humane konstantne regije. (Robinson et al., mednarodna patentna objava PCT/US86/02269; Akira, et al., evropska patentna prijava 184,187; Taniguchi, M., evropska patentna prijava 171,496; Morrison et al., evropska patentna prijava 173,494; Neuberger et al., PCT prijava WO 86/01533; Cabilly et al., evropska patentna prijava 125,023; Better et al. (1988), Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987), PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987), J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987), PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987), Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985), Nature 314:446-449 in Shaw et al. (1988), J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559). Splošni pregled humaniziranih kimemih protiteles zagotavljajo: Morrison S.L. (1985), Science 229:1202-1207 in Oi et al. (1986), Bio Techniques 4:214. Ti postopki vključujejo izoliranje, manipuliranje in ekspresijo sekvenc nukleinskih kislin, ki kodirajo vso ali del monoglobulinske variabilne regije iz vsaj ene od težke ali lahke verige. Izviri takih nukleinskih kislin so dobro znani strokovnjakom in jih npr. lahko dobimo iz hibridomov, ki proizvajajo antikostimulatorna molekulska protitelesa. Kimerno cDNA lahko nato kloniramo v ustrezen ekspresij ski vektor.

Prikladna humanizirana protitelesa lahko alternativno proizvedemo s CDR ali CEA substitucijo (The Winter, US-patent 5,225,539; Jones et al. (1986), Nature 321:552525; Verhoeyan et al. (1988), Science 239:1534 in Beidler et al. (1988), J. Immunol. 141:4053.4060).

E. Kombinatorna anti-ko stimulator na molekulska protitelesa

Tako monoklonalne kot tudi poliklonalne protitelesne sestavke v smislu izuma lahko proizvedemo tudi z drugimi postopki, dobro znanimi strokovnjakom na področju rekombinantne DNA tehnologije. Alternativni postopek, imenovan kot postopek kombinatorne protitelesne predstavitve, so razvili za identificiranje in izoliranje protitelesnih fragmentov, ki imajo posebno antigensko specifičnost, in ga lahko uporabimo, da proizvedemo monoklonalna antikostimulatorna molekulska protitelesa kot tudi poliklonalno antikostimulatomo molekulsko populacijo (Sastry et al. (1989), PNAS 86:5728; Huse et al. (1989), Science 246:1275 in Orlandi et al. (1989), PNAS

-2929

86:3833). Po imuniziranju živali s kostimulatomim molekulskim imunogenom, kot je opisano zgoraj, se protitelesni repertoar dobljenega B-celičnega poola klonira. Postopki so na splošno znani za direktno pridobivanje sekvence DNA variabilnih regij različne populacije imunoglobulinskih molekul z uporabo zmesi oligomemih primerjev in PCR. Npr., mešane oligonukleotidne primerje, ki ustrezajo 5' vodilnim (signalni peptid) sekvencam in/ali sekvencam okvira 1 (FR1), kot tudi primer za primer s konzervirano 3' konstantno regijo, lahko uporabimo za PCR-pomnoževanje težkih in lahkih verižnih variabilnih regij iz številnih glodalskih protiteles (Larrick et al. (1991), Biotechniques 11: 152-156). Podobno strategijo lahko uporabimo tudi za pomnoževanje humanih težkih in lahkih verižnih variabilnih regij iz humanih protiteles (Larrick et al. (1991), Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-110). Sposobnost za kloniranje humanih imunoglobulinskih V-genov je posebno pomembna v luči napredkov pri oblikovanju humanih protitelesnih repertoarjev pri transgenskih živalih (npr., Bruggeman et al. (1993), Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. (1993), PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. (1991), Eur J Immunol 21:1323-1326; in Wood et al. PCT-objava WO 91/00906).

V ilustrativni izvedbi izoliramo RNA iz aktiviranih celic B, npr. perifernih krvnih celic, kostnega mozga ali vraničnih pripravkov po standardnih predpisih (npr. USpatent št. 4,683,202; Orlandi et al. PNAS (1989) 86:3833-3837; Sastry et al. PNAS (1989) 86:5728-5732; in Huse et al. (1989), Science 246:1275-1281). Prvo-verižno cDNA sintetiziramo s primerji, specifičnimi za konstantne regije težke verige (verig) in vsako od lahkih verig κ in λ kot tudi s primerji za signalno sekvenco. Z uporabo variabilnih regijskih PCR-primerjev pomnožimo variabilne regije tako za težke kot tudi za lahke verige, vsako samo ali v kombinaciji, in ligiramo v ustrezne vektorje za nadaljnjo manipulacijo in proizvajanje predstavitvenih paketov. Oligonukleotidni primerji, uporabni pri pomnoževalnih protokolih, so lahko posebni ali degenerirani ali vključujejo inozin na degeneriranih mestih. Restrikcijske endonukleazne razpoznavne sekvence lahko tudi vključimo v primerje, da dopustimo kloniranje pomnoženega fragmenta v vektor v predhodno določenem bralnem okvirju za ekspresijo.

-3030

V-gensko knjižnico, klonirano iz imunizacijsko izvedenega protitelesnega repertoarja, lahko izrazimo s populacijo predstavitvenih paketov, prednostno izvedenih iz filamentnega faga, da tvorimo protitelesno predstavitveno knjižnico. Idealno obsega predstavitveni paket sistem, ki dopušča vzorčenje zelo velikih popestrenih protitelesnih predstavitvenih knjižnic, hitro sortiranje po vsakem afinitetnem ločevalnem krogu in enostavno izoliranje protitelesnega gena iz očiščenih predstavitvenih paketov. Poleg komercialno dosegljivih kompletov za proizvajanje fagnih predstavitvenih knjižnic (npr. Pharmacia, Recombinant Phage Antibody System, katalog št. 27-9400-01; in Stragagene SurfZAP™ phage display kit, katalog št. 240612) so primeri za postopke in reagente, ki so posebno prikladni za uporabo pri proizvajanju popestrenih antikostimulatornih molekulskih protitelesnih predstavitvenih knjižnic, opisani npr. v: Ladner et al., US-patent št. 5,223,409; Kang et al., mednarodna objava št. WO 92/18619; Dower et al., mednarodna objava št. WO 91/17271; Winter et al., mednarodna objava WO 92/20791; in Markland et al., mednarodna objava št. WOP 92/15679; Breitling et al., mednarodna objava WO 93/01288; McCafferty et al., mednarodna objava št. WO 92/01047; Garrard et al., mednarodna objava št. WO 92/09690; Ladner et al., mednarodna objava št. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991), Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992), Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989), Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993), EMBO J 12:725-734; Havvkins et al. (1992), J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991), Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991), Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991), Nuc Acid Res 19:4133-4137; in Barbas et al. (1991), PNAS 88:7978-7982.

V določenih izvedbah lahko domene V-regije težkih in lahkih verig izrazimo na istem polipeptidu, povezanem s fleksibilnim linkerjem, da tvorimo enoverižni Fv fragment, scFV gen pa nato kloniramo v želeni ekspresij ski vektor ali fagni genom. Kot na splošno opisujejo McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554, lahko kompletne V_n in V_L domene protitelesa, povezanega s fleksibilnim (Gly₄-Ser)₃ linkerjem, uporabimo, da proizvedemo enoverižno protitelo, ki lahko naredi predstavitveni paket ločljiv na osnovi antigenske afinitete. Izolirana scFV protitelesa, imunoreaktivna s

-3131 kostimulatomo molekulo, lahko nato formuliramo v farmacevtski pripravek za uporabo v predloženem postopku.

F. Hibridomi in postopki priprave

Hibridomi, uporabni v predloženem izumu, so tisti, ki so označeni, da imajo zmogljivost, da proizvedejo monoklonsko protitelo, ki bo specifično imunoreagiralo s kostimulatomo molekulo. Kot je opisano spodaj, lahko antikostimulatomo molekulsko protitelo, ki proizvaja hibridomne celice, direktno implantiramo v recipientno žival, zato da zagotovimo konstantni vir protiteles. Uporaba imunoizolatomih naprav za inkapsuliranje hibridomne kulture lahko prepreči imunogeni odziv proti implantiranim celicam kot tudi nepreverjeno proliferacijo hibridomne celice v imunokompromintiranem gostitelju. Prednostni hibridom v smislu predloženega izuma je označen s proizvajanjem protitelesnih molekul, ki specifično imunoreagirajo s kostimulatomo molekulo, izraženo na celičnih površinah aktiviranih humanih celic B.

Postopki za proizvajanje hibridomov, ki proizvajajo, npr. izločajo, protitelesne molekule, ki imajo želeno imunospecifičnost, tj. imajo sposobnost, da se vežejo na posebno kostimulatomo molekulo in/ali epitop kostimulatorne molekule, ki ga je možno identificirati, so v tehniki dobro znani. Posebno uporabna je hibridomna tehnologija, ki jo opisujejo: Niman et al. (1983), PNAS 80:4949-4953; in Galfre et al. (1981), Meth. Enzymol. 73:3-46.

V drugem zglednem postopku lahko transgenske miši, ki nosijo humani protitelesni repertoar, imuniziramo s humano kostimulatomo molekulo. Splenocite iz teh imuniziranih transgenskih miši lahko nato uporabimo, da oblikujemo hibridome, ki izločajo humana monoklonalna protitelesa, specifično reaktivna s humano kostimulatomo molekulo (npr., Wood et al., PCT-objava WO 91/00906, Kucherlapati et al., PCT-objava WO 91/10741; Lonberg et al., PCT-objava WO 92/03918; Kay et al., PCT-objava 92/03917; Lonberg N. et al. (1994), Nature 368:856-859; Green L.L.

-3232 et al. (1994), Nature Genet. 7:13-21; Morrison S.L. et al. (1994), Proč. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. (1993), Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. (1993), PNAS 90:3720-3724; in Bruggeman et al. (1991), Eur J Immunol 21:13231326).

Izraz protitelo, kot ga uporabljamo tukaj, je namenjen, da vključuje njegove fragmente, ki so tudi specifično reaktivni s kostimulatomo molekulo, kot je opisana tukaj. Protitelesa lahko fragmentiramo s konvencionalnimi tehnikami in fragmente pregledamo za uporabo na enak način, kot je opisano zgoraj za celotna protitelesa. Npr., F(ab')₂ fragmente lahko proizvedemo z obdelovanjem protiteles s pepsinom. Dobljeni F(ab')₂ fragment lahko obdelamo, da reduciramo disulfidne mostove, da proizvedemo Fab' fragmente.

Protitelesa, izdelana s temi ali drugimi postopki, lahko preizkusimo, da določimo, ali inhibirajo kostimulatomi signal v celici T, s postopki, opisanimi spodaj.

V eni izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, protitelo, ki se veže tako na B7-1 kot tudi na B7-2. Pri izdelavi takega protitelesa lahko npr. dele ekstracelulame domene, ki so konzervirani med obe kostimulatomi molekuli, uporabimo kot imunogen. Npr., Metzler et al. 1997, Nat Struct. Biol. 4:527.

V eni izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, protitelo, ki se veže na B7-1. Taka protitelesa so znana v tehniki ali jih lahko izdelamo, kot je navedeno zgoraj, z uporabo B7-l-molekule ali njenega dela kot imunogena, in pregledamo s postopki, navedenimi zgoraj, ali drugimi standardnimi postopki. Primeri za B7-1 protitelesa vključujejo tiste, navedene v: US- patentu 5,747,034 in McHugh et al. 1998, Ciin. Immunol. Immunopathol. 87:50 ali Rugtveit et al. 1997, Ciin Exp. Immunol. 110:104.

V drugi izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, protitelo, ki se veže na B7-2. Taka protitelesa so znana v tehniki ali jih lahko izdelamo, kot je

-3333 navedeno zgoraj, z uporabo B7-2 molekule ali njenega dela kot imunogena, in pregledamo s postopki, navedenimi zgoraj, ali drugimi standardnimi postopki. Primeri za B7-2-protitelesa vključujejo tista, navedena v: Rugtveit et al. 1997, Ciin Exp. Immunol. 110:104.

V eni izvedbi je sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T, kombinacija protitelesa, ki se veže na B7-1, in protitelesa, ki se veže na B7-2.

Še v drugi izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, protitelo, ki se veže na CD28, vendar ne transducira kostimulatomega signala za celico T (npr. Fab fragment anti-CD28 protitelesa). Taka protitelesa so znana v tehniki ali jih lahko izdelamo, kot je navedeno zgoraj, z uporabo CD28 molekule ali njenega dela kot imunogena, in pregledamo s postopki, navedenimi zgoraj, ali drugimi standardnimi postopki. Primeri za znana anti-CD28 protitelesa vključujejo tista, navedena v: Darling et al. 1997, Gene Ther. 4:1350.

V prednostnih izvedbah lahko uporabimo Fab fragmente protitelesa, ki veže na CD28. Za take protitelesne fragmente, ki niso sposobni, da premrežijo CD28 na površini celice T, so ugotovili, da blokirajo T-celično kostimulacijo (Walunas et al. 1994, Immunity 1:405).

Še v drugih izvedbah je sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, protitelo, ki se veže na CTLA4, ki blokira kostimulatorni signal v celici T z dovajanjem negativnega signala za celico T (tj., ki je CTLA4 agonist). Npr. za premreženje CTLA4 na površini celici T je bilo prikazano, da inhibira proliferacijo in IL-2 produkcijo (Krummel in Allison, 1996, J. Exp. Med. 183:2533). Taka protitelesa lahko izdelamo, kot je navedeno zgoraj, z uporabo CTLA4 molekule ali njenega dela kot imunega, in pregledamo s postopki, navedenimi zgoraj, ali drugimi standardnimi postopki. Primeri za taka protitelesa so prav tako prikazani, npr. v: Vandenborre et al., 1998, Am. J. Pathol. 152:963.

-3434

Še v drugi izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, protitelo, ki se veže na ICOS, ki blokira kostimulatorni signal v celici T. Taka protitelesa lahko izdelamo, kot je navedeno zgoraj, z uporabo ICOS molekule ali njenega dela kot imunogena, in pregledamo s postopki, navedenimi zgoraj, ali drugimi standardnimi postopki.

IV. Sredstva, ki regulirajo ekspresijo kostimulatornih molekul

V drugi izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, sredstvo, kije v interferenci z ekspresijo kostimulatorne molekule. Npr. za interakcije med CD40 na antigen predstavljajočih celicah in CD40 ligandom (CD40L) na celicah T so ugotovili, da so pomembne pri vzdrževanju, povečevanju ali podaljševanju ekspresije B7-1 ali B7-2 na antigen predstavljajočih celicah, kar ima za posledico povečano kostimulacijo (Van Gool et al. 1996, Immunol. Rev. 153:47; Klaus et al. 1994, J. Immunol. 152:5643).

V eni izvedbi je sredstvo, ki blokira ekspresijo kostimulatorne molekule, in tako blokira kostimulatorni signal v celici T, topna oblika CD40 ali CD40L. Sekvence DNA, ki kodirajo te CD40 in CD40L, so znane v tehniki, npr.: GenBank pristopna št.. Υ10507 ali Stamenlovic et al. 1988, EMBO J. 7:1053-1059 za CD40 ali Gauchat et al. 1993, FEBS 315(3):259-266; Graf et al. 1992, Eur. J. Immunol. 22:3191-3194; Seyama 1996, Hum. Genet. 97:180-185 ali GenBank pristopne št. L07414, Χ67878, Χ96710 za CD40L.

V eni izvedbi je sredstvo, ki blokira ekspresijo kostimulatorne molekule, in tako blokira kostimulatorni signal v celici T, topna oblika CD40 ali CD40L. V eni izvedbi topni CD40 ali CD40L protein obsega celotni protein. V prednostnih izvedbah topni CD40 ali CD40L protein obsega ekstracelularno domeno proteina. Npr. topno rekombinantno obliko ekstracelulame domene CD40 ali CD40L proteina ali njegovega dela lahko izdelamo kot fuzijski protein, ki obsega vsaj del CD40 ali CD40L, tako daje interakcija med CD40 na APC in CD40L na celici T prekinjena in

-3535 je dovajanje kostimulatomega signala celici T inhibirano. Taka topna rekombinantna oblika CD40 ali CD40L proteina obsega vsaj del molekule, ki zadostuje, da se veže na njen protireceptor in vsaj del drugega ne-CD40 ali CD40L proteina. V prednostnih izvedbah CD40 ali CD40L fuzijski protein obsega CD40 ali CD40 ekstracelulamo domeno, ki je fuzionirana na amino terminalu s signalnim peptidom, npr. iz onkostatina M (npr. WO 93/00431).

V posebno prednostni izvedbi je topna oblika CD40 ali CD40L fuzijski protein, ki obsega ekstracelulamo domeno CD40 ali CD40L, fuzionirano z delom imunoglobulinske molekule (npr. Chen et al. 1995, J. Immunol. 155:2833). Tak fuzijski protein CD40Ig ali CD40LIg lahko izdelamo s postopki, znanimi v tehniki (npr., Linsley 1994, Perspectives in Drug Discovery and Design 2:221; Linsley, WO 93/00431, US-patent 5,770,197 in US-patent 5,580,756).

Poleg tega so za protitelesa za CD40 ligand ugotovili, da so v sinergiji s sredstvi, ki inhibirajo kostimulatorni signal v celici T, da pospešijo toleranco za implant (Kirk et al. 1997, Proč. Natl. Acad. Sci. USA 94:8789; Larsen et al. 1996, Nature 381:434).

Tako lahko v eni izvedbi uporabimo protitelesa za CD40 ali CD40L, ki se vežejo na te molekule, vendar pa ne inducirajo ekspresije kostimulatornih molekul, kot sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T.

V. Sredstva, ki delujejo intracelularno, da inhibirajo kostimulatorni signal

N eni izvedbi je sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, takšno, ki deluje intracelularno, da inhibira tak signal. Stimulacija celice T skozi CD28 površinski receptor (tj. kostimulatorni signal) vodi do produkcije D-3 fosfoinozitidov v celici T. Zato lahko v eni izvedbi produkcijo D-3 fosfoinozitidov inhibiramo v celici T, da inhibiramo kostimulatorni signal in na ta način inhibiramo T-celični odziv, kot izmerimo npr. s T-celično proliferacijo in/ali citokinsko produkcijo. Izraz D-3 fosfoinozitidi je namenjen, da vključuje derivate fosfatidilinozitola, ki so fosforilirani

-3636 v položaju D-3 inozitolnega obroča in vključujejo spojine fosfatidilinozitol(3)monofosfat (PtdIns(3)P), fosfatidilinositol(3,4)-bisfosfat (PtdIns(3,4)P₂) in fosfatidilinositol(3,4,5 )-trifosfat (Ptdlns(3,4,5 )P₃).

D-3 fosfoinozitidi so proizvedeni intracelularno z aktivnostjo fosfatidil-inozitol 3kinaze (PI3K). PI3K je heterodimer, sestavljen iz 85 kDa podenote, ki se veže na tirozilno fosforilirane proteine preko svojih SH2 domen, in 110 kDa katalitične podenote. PI3K so najprej identificirali kot lipidno kinazo, ki fosforilira D-3 položaj inozitolnega obroča fosfatidilinozitola, Ptdlns (4)P in PtdIns(4,5)P2. Dve nedavni študiji pa sta pokazali, da je PI3K dejansko kinaza z dvojno specifičnostjo, ki ima tako aktivnosti lipida kot tudi serin kinaze (Dhand R. et al. (1994), EMBO J. 13:522 in Carpenter C.L. et al. (1993), Mol. Celi Biol. 13:1657).

V skladu s tem jev eni izvedbi sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, takšno, ki inhibira aktivnost PI3K. Prednostno sredstvo, ki inhibira aktivnost PI3K v celici T, je glivni metabolit wortmanin ali njegovi derivati ali analogi. Wortmanin je močan PI3K inhibitor, izveden iz T. Wortmannii (Kyowa Hakko Kohyo Co. Ltd.) ali iz P. fumiculosum (Sigma). Wortmaninski derivati ali analogi vključujejo spojine, ki so strukturno sorodne wortmaninu, ki ohranijo sposobnost, da inhibirajo PI3K in Tcelične odzive. Primeri za wortmaninske derivate in analoge so prikazani v: Wiesinger D. et al. (1974), Experientia 30:135-136; Closse A. et al. (1981), J. Med. Chem. 24:1465-1471; in Baggiolini M. et al. (1987), Exp. Celi Res. 169:408-418. Drugi inhibitor PI3K aktivnosti, ki ga lahko uporabimo, je bioflavenoidni kvercetin ali njegovi derivati ali analogi. Kvercetinski derivati ali analogi vključujejo spojine, ki so strukturno sorodne kvercetinu, ki ohranijo sposobnost, da inhibirajo PI3K in inhibirajo T-celične odzive. Primeri za kvercetinske derivate in analoge so opisani v: Vlahos C.J. et al. (1994), J. Biol. Chem. 269:541-5284. Prednostni kvercetinski derivat, ki inhibira PI3K aktivnosti je LY294002 (2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-l-benzopiran-4-on, Lilly Indianapolis, IN) (opisano v: Vlahos et al., citirano zgoraj).

-3737

Za CD28 stimulacijo je tudi prikazano, da ima za posledico fosforilacijo proteina tirozina v celici T (npr., Vandenberghe P. et al. (1992), J. Exp. Med. 125:951-960; Lu Y. et al. (1992), J. Immunol. 149:24-29). V skladu s tem v eni izvedbi sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, inhibira tirozinsko fosforilacijo v celici T. Prednostni inhibitor proteinske tirozin kinaze je tisti, ki inhibira src proteinske tirozin kinaze. V eni izvedbi je inhibitor src proteinske tirozin kinaze herbimicin A ali njegov derivat ali analog. Derivati in analogi herbimicina A vključujejo spojine, ki so strukturno sorodne herbimicinu A in ohranijo sposobnost, da inhibirajo aktivnost proteinskih tirozin kinaz. V drugi izvedbi je sredstvo, ki inhibira fosforilacijo proteinskega tirozina, proteinska tirozin fosfataza ali aktivator proteinske tirozin fosfataze. S povečevanjem aktivnosti tirozin fosfataze v celici T se poveča čista količina fosforilacije proteinskega tirozina. Proteinska tirozin fosfataza je lahko celularna proteinska tirozin fosfataza v celici T, kot npr. CD45 ali Hcph. Aktivnost celične površinske tirozin fosfataze na celici T lahko aktiviramo s kontaktiranjem celice T z molekulo, ki se veže na fosfatazo in stimulira njeno aktivnost. Npr. protitelo, usmerjeno proti CD45, lahko uporabimo, da stimuliramo aktivnost tirozin fosfataze v celici T, ki izraža CD45 na svoji površini. V skladu s tem je v eni izvedbi sredstvo, ki inhibira fosforilizacijo proteinskega tirozina v celici T, proti-CD45 protitelo ali njegov fragment, ki ohrani sposobnost, da stimulira aktivnost CD45. Primeri za protitelesne fragmente vključujejo Fab in F(ab')₂ fragmente. Protitelesa ali njihove fragmente lahko zagotovimo v stimulatorni obliki, npr. multimerizirane ali imobilizirane itd.

Poleg tega je CD28 ligacija povezana s povečano aktivnostjo fosfolipaze C (npr., Nunes J. et al. (1993), Biochem. J. 293:835-842) in povečanimi intracelulamimi nivoji kalcija (npr., Ledbetter J.A. et al. (1990), Blood 75:1531-1539 in Primeri). V skladu s tem sredstvo, ki deluje intracelularno, da inhibira kostimulatorni signal v celici T, lahko deluje z inhibiranjem aktivnosti fosfolipaze C in/ali inhibiranjem rasti nivojev intracelulamega kalcija. Npr. inhibitor tirozin kinaze herbimicin A inhibira tudi pretok kalcija, induciranega s CD28, v celicah T.

-3838

Za proteinske serin in serin-treonin kinaze je prav tako prikazano, da so vključene v signalne transdukcijske poti, povezane s CD28 (Siegel J.N. et al. (1993), J. Immunol. 151:4116-4127; Pai S.V. et al. (1994), J. Immunol. 24:2364; Parry et al. 1997, Eur. J. Immunol. 27:2495). Tako v drugi izvedbi izuma sredstvo, ki deluje intracelulamo, da inhibira kostimulatomi signal v celici T, inhibira aktivnost serin ali serin-treonin kinaze.

VI. Druga sredstva, ki blokirajo kostimulacijo celic T

Druga sredstva, ki blokirajo kostimulatomi signal v celici T, lahko identificiramo s standardnimi tehnikami. Taka sredstva lahko npr. identificiramo glede njihove sposobnosti, da inhibirajo T-celično proliferacijo in/ali citokinsko produkcijo. Uporabimo lahko npr. sistem za preizkus kostimulacije. V takem sistemu humane CD28⁺ T celice izoliramo, npr. z osiromašenjem z imunomagnetnim biserom z uporabo monoklonalnih protiteles, usmerjenih proti celicam B, naravnim celicam ubijalkam in makrofagom, kot je bilo predhodno opisano (Gimmi C.D. et al. (1993), Proč. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6586-6590). Antigen predstavljajoče celice, npr. celotne vranične celice, ali očiščene celice B, ali celice COS, transfektirane z B7-1 ali B7-2, lahko obsevamo ali obdelujemo z mitomicinom-C (npr., pri 25 pg/ml) 1 uro in nato temeljito speremo, da inhibiramo proliferacijo. 10⁵ celic CD28⁺T lahko inkubiramo, npr. z 10⁵-10⁴ APC (npr., celice COS, transfektirane z B7 molekulo). V tem zglednem preizkusu ena populacija celic T prejme samo primarni aktivacijski signal (npr., T-celični receptorski signal); druga populacija celic T prejme samo kostimulatomi signal; še druga populacija celic T prejme tako primarni aktivacijski signal kot tudi kostimulatomi signal in še druga populacija celic T prejme tako primarni aktivacijski signal kot tudi kostimulatomi signal v prisotnosti sredstva, ki ga je treba preizkusiti za njegovo sposobnost, da blokira kostimulatomi signal v celici T. Primarni aktivacijski signal lahko dovedemo npr. s submitogeno dozo PMA (npr. 1 ng/ml), submitogeno dozo mitogena, suboptimalno dozo antigena ali submitogeno dozo anti-T-celičnega receptorskega protitelesa. Signal 2 dovedemo z antigen predstavljajočimi celicami, ki nosijo B7 molekulo. Potencialna blokima sredstva lahko

-3939 preizkusimo v območju koncentracij. Potencialna blokirna protitelesa lahko npr. uporabimo kot hibridomne supematante ali kot očiščena protitelesa (npr. pri pribl. 10 pg/ml). Proliferacijo celic T lahko izmerimo z vključitvijo ³H-timidina (1 pCi) vsaj za 12-18 ur za 72-urno inkubacijo. Dovajanje primarnega aktivacijskega signala naj bi imelo za posledico manjšo proliferacijo, vendar pa naj bi bila maksimalna proliferacija signalov pri celicah T, ki so prejele tako primarni aktivacijski signal kot tudi kostimulatomi signal 2. Blokirna sredstva so identificirana glede njihove sposobnosti, da znižajo maksimalno s kostimulatornim signalom inducirano proliferacijo.

Poleg tega ali kot alternativa merjenja T-celične proliferacije, lahko T-celično citokinsko produkcijo izmerimo s postopki, ki so dobro znani v tehniki. IL-2 in IL-4, proizvedena v T celičnih kulturah, lahko npr. preizkusimo v kulturnih supernatantih, zbranih 24-72 ur po iniciaciji kulture, pri čemer uporabimo komercialno dosegljivo ELISO (R&D Systems, Minneapolis, MN in BioSource, Camarillo, CA). Kot je navedeno zgoraj, lahko blokirna sredstva identificiramo glede njihove sposobnosti, da znižajo maksimalno citokinsko produkcijo, inducirano s kostimulatornim signalom.

V primeru protiteles lahko katerakoli blokirna protitelesa, identificirana s tem ali drugim preizkusom, nadalje preizkusimo, da določimo kostimulatorno molekulo, na katero se oni vežejo, s postopki, znanimi v tehniki. Sposobnost blokimega protitelesa, da zmanjša vezavo označenega protitelesa na znani ligand, lahko npr. izmerimo.

VIL Dodatna sredstva za zaviralno moduliranje imunskih odzivov

V določenih izvedbah lahko sestavki in postopki v smislu izuma obsegajo dodatna sredstva ali uporabo dodatnih sredstev za povečanje imunotolerance na sredstvo, ki pospešuje hemostazo. V eni izvedbi lahko sredstvo, ki pospešuje imunotoleranco, vendar ne deluje z inhibiranjem kostimulatornega signala v celici T, dodamo predloženim sestavkom ali ga damo v predloženih postopkih. Npr. anti-CD40 ligand (npr. monoklonsko protitelo za humani CD40 ligand, 5C8 (Kirk et al. 1997, Proč. Natl. Acad. Sci. USA 94:8789)) je lahko vključen v sestavek. CD40 in njegov ligand

-4040 na osnovi celic T, CD40L (CD 154) ima pomembno vlogo pri izbolj sevalnem reguliranju B7 in določevanju B-celične aktivnosti (US-patent 5,683,693, Yang et al. 1996, Science 273:1862; Grewal et al. 1996. Science 273:1864; Leterman et al. 1992, J. Exp. Med. 175:1091; Lederman et al. 1992, J. Immunol. 149:3817). Za protitelesa za CD40 ligand so ugotovili, da so v sinergiji s sredstvi, ki inhibirajo kostimulatomi signal v celici T, da izboljšajo toleranco za implant (Kirk et al. 1997, Proč. Natl. Acad. Sci. USA 94:8789; Larsen et al. 1996, Nature 381:434). V drugi izvedbi lahko uporabimo v predloženih sestavkih sredstvo, ki deluje intracelulamo, da izboljša imunotoleranco, vendar ne inhibira kostimulatomi signal v celici T. V eni izvedbi lahko vključimo v predložene sestavke ali damo kot del predloženih postopkov tudi npr. ciklosporin A (CSA), FK506, rapamicin ali drugo sredstvo, ki inhibira imunske odzive. (Npr., Sigal et al. 1992, Annv. Rev. Immunol. 10:519, Ruhlmann et al. 1997 ali Immunobiology 198:192; Shaw et al. 1996, Ciin. Chem. 42:1316).

VIII. Postopki uporabe sestavkov, ki obsegajo terapevtski protein in imunotolerirno sredstvo

V eni izvedbi predložene sestavke in/ali sredstva, opisana tukaj, damo subjektom, ki imajo hemostatično motnjo in ki so bili predhodno obdelani s sredstvom, ki pospešuje hemostazo. V drugi izvedbi damo predložene sestavke in/ali sredstva, opisana tukaj, subjektom, ki še niso bila obdelana s sredstvom, ki pospešuje hemostazo.

Še v drugi izvedbi damo predložene sestavke in/ali sredstva, opisana tukaj, subjektu, ki še ni razvil imunskega odziva na sredstvo, ki pospešuje hemostazo. V drugih izvedbah damo predložene sestavke in/ali sredstva subjektom, ki imajo predobstoječi imunski odziv na sredstvo, ki pospešuje hemostazo. Ali ima subjekt predobstoječi imunski odziv, lahko ugotovimo z merjenjem titra protiteles pri subjektu, ki reagira s sredstvom, ki pospešuje hemostazo, s postopki, dobro znanimi v tehniki. Če ima tak subjekt merljiv titer takih protiteles (npr. statistično znaten titer), kadar ga primerjamo s titri kontrolnih posameznikov, lahko rečemo za subjekt, da ima predobstoječi imunski odziv na sredstvo, ki pospešuje hemostazo. Alternativno lahko izmerimo

-4141 celularni imunski odziv na sredstvo, ki pospešuje hemostazo, da ugotovimo, ali ima subjekt trajen imunski odziv na sredstvo, ki pospešuje hemostazo. Taki postopki so dobro znani v tehniki.

V eni izvedbi uporabimo prvo sredstvo, ki pospešuje hemostazo, in drugo sredstvo, ki inhibira ali blokira kostimulatomi signal v celici T, za zdravljenje hemostatične motnje. V drugi izvedbi lahko uporabimo sestavke, ki obsegajo kombinacijo prvega sredstva, ki pospešuje hemostazo, in drugega sredstva, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, za zdravljenje hemostatične motnje.

Dajanje sestavkov in/ali sredstev, opisanih tukaj, je lahko v katerikoli farmakološki obliki, ki vključuje terapevtsko učinkovito količino sredstva in farmacevtsko sprejemljivi nosilec. Dajanje terapevtsko aktivne količine predloženih sredstev in/ali sestavkov je definirano kot količina, učinkovita v dozah in v časovnih periodah, potrebnih, da dosežemo zdravljenje hemostatične motnje, v primem sredstva, ki pospešuje hemostazo, in da dosežemo imunotoleranco za sredstvo, ki pospešujejo hemostazo, v primem sredstva, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T. Terapevtsko aktivna količina sredstva ali sestavka se lahko spreminja v skladu s faktorji, kot so stanje bolezni, starost, spol in masa posameznika, in glede na to, ali je posameznik že razvil imunski odziv ali ne na sredstvo, ki pospešuje hemostazo. Tako količino lahko strokovnjak s tega področja z lahkoto določi.

Optimalni potek dajanja sredstev in/ali sestavkov se lahko spreminja tudi odvisno od subjekta, ki gaje treba zdraviti. V določenih izvedbah subjekt potrebuje zdravljenje z obema sredstvoma istočasno. V tem primeru bo prikladno, da damo sredstvo, ki pospešuje hemostazo, in sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, simultano, npr. v obliki sestavka, ki obsega obe sredstvi.

V drugih izvedbah bo prikladno, da damo sredstva ločeno, npr. zato da povečamo stabilnost sredstva ali olajšamo stopenjsko dajanje sredstev. V eni izvedbi je lahko stopenjsko dajanje prikladno, da dosežemo optimalni terapevtski učinek sredstva, ki pospešuje hemostazo, medtem ko optimalno inhibiramo imunski odziv, prednostno

-4242 protitelesih odziv na sredstvo. Sredstvo, ki inhibira kostimulatorni signal, lahko npr. damo samo pred dajanjem sredstva, ki pospešuje hemostazo, ali ga lahko dajemo samega več dni po dajanju sredstva, ki pospešuje hemostazo.

V eni izvedbi lahko sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T, dajemo kronično, npr. vsakokrat damo sredstvo, ki pospešuje hemostazo. V drugi izvedbi dajemo sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T, sporadično. Npr. subjekt lahko potrebuje zdravljenje s sredstvom, ki pospešuje hemostazo, na regularni osnovi, vendar pa lahko potrebuje zdravljenje s sredstvom, ki inhibira kostimulatorni signal v celici T, le periodično. Npr., zdravljenje s sredstvom, ki pospešuje hemostazo, je lahko trajno, medtem ko lahko zadostuje samo eno ali dva zdravljenje subjekta s sredstvom, ki blokira kostimulatorni signal v celici T; nadaljnje dajanje sredstva, ki blokira kostimulatorni signal, lahko ni več potrebno. V prednostni izvedbi dajemo sredstvo, ki blokira kostimulatorni signal v celici T, v ustreznih intervalih za vsaj pribl. 6 mesecev.

V eni izvedbi dajemo predložena sredstva ali sestavke pacientom, pri katerih ugotovimo, da imajo predobstoječa protitelesa. V nadaljnji izvedbi dajemo predložena sredstva ali sestavke predhodno neobdelanim pacientom, tj. pacientom brez predobstoječih protiteles. Še v nadaljnji izvedbi dajemo predložena sredstva ali sestavke pacientom, ki so bili predhodno zdravljeni, vendar pa nimajo protitelesnih titrov proti sredstvu, ki pospešuje hemostazo.

Dozirni režim je možno prilagoditi, da zagotovimo optimalni terapevtski odziv pri vsakem subjektu, brez nepotrebnega eksperimentiranja. Protitelesne titre za sredstvo, ki pospešuje hemostazo, lahko npr. izmerimo, da določimo ali subjekt razvije imunski odziv na sredstvo ali ne, in glede nato lahko prilagodimo dozirni režim. Če npr. protitelesni titri sredstva, ki pospešuje hemostazo, narastejo, lahko damo več doz sredstva, ki blokira kostimulatorni signal v celici T.

-4343

Za dajanje predloženih sredstev ali sestavkov na drugačen način, kot je parenteralni, je lahko treba, da le-te prevlečemo z materialom, da preprečimo njihovo inaktivacijo, ali da jih damo istočasno s takim materialom. Sredstvo ali sestavek v smislu izuma lahko dajemo posamezniku v ustreznem nosilcu ali razredčilu, lahko ga dajemo istočasno z encimskimi inhibitorji ali v ustreznem nosilcu, kot so npr. liposomi.

Farmacevtsko sprejemljiva razredčila vključujejo fiziološko raztopino soli in vodne puferne raztopine. Encimski inhibitorji vključujejo pankreatični tripsinski inhibitor, diizopropil fluorofosfat (DEP) in trazilol. Liposomi vključujejo emulzije voda v olju v vodi kot tudi konvencionalne liposome (Strejan et al. (1984), J. Neuroimmunol 7:27).

Aktivno sredstvo ali sestavek lahko dajemo tudi parenteralno ali intraperitonealno. Disperzije lahko pripravimo tudi v glicerolu, tekočih polietilenglikolih in njihovih zmeseh in v oljih. Pri normalnih razmerah shranjevanja in uporabe lahko ti pripravki vsebujejo varovalna sredstva za preprečitev rasti mikroorganizmov.

Farmacevtski sestavki, prikladni za injektabilno uporabo, vključujejo sterilne vodne raztopine (kadar so topni v vodi) ali disperzije in sterilne praške za improvizirano pripravo sterilnih in injektabilnih raztopin ali disperzij. V vseh primerih mora biti sredstvo ali sestavek sterilen in tekoč do take mere, da je sposoben za enostavno vbrizgavanje. Biti mora stabilen pri razmerah izdelave in shranjevanja kot tudi zaščiten pred kontaminantnim delovanjem mikroorganizmov, kot so npr. bakterije in glive. Nosilec je lahko topilo ali disperzijski medij, ki vsebuje npr. vodo, etanol, poliol (npr. glicerol, propilenglikol in tekoči polietilenglikol ipd.) in njihove prikladne zmesi. Prikladno tekočnost lahko vzdržujemo npr. s prevleko, kot npr. lecitinsko, z vzdrževanjem potrebne velikosti delcev v primeru disperzije in s surfaktanti. Preprečevanje delovanja mikroorganizmov lahko dosežemo z različnimi protibakterijskimi in protiglivnimi sredstvi, npr. parabeni, klorobutanolom, fenolom, askorbinsko kislino, timerosalom ipd. V mnogih primerih je prednostno, da vključimo v sestavek izotonično sredstvo, npr. sladkorje, polialkohole, kot npr. manitol, sorbitol, natrijev klorid. Podaljšano absorpcijo injektabilnih sestavkov lahko dosežemo tako, da

-4444 vanje vključimo sredstvo, ki zakasni absorpcijo, npr. aluminijev monostearat in želatino.

Sterilne injektabilne raztopine lahko pripravimo z vključitvijo aktivnega sestavka ali sredstva v potrebni količini v ustrezno topilo z eno sestavino ali kombinacijo sestavin, naštetih zgoraj, kot je potrebno, nato pa izvedemo sterilizacijo s filtriranjem. Na splošno pripravimo disperzije z vključitvijo aktivne sestavine v sterilni nosilec, ki vsebuje bazični disperzij ski medij in potrebne druge sestavine izmed tistih, naštetih zgoraj. V primeru sterilnih praškov za pripravo sterilnih injektabilnih raztopin sta prednostna pripravljalna postopka vakuumsko sušenje in liofilizacija, kjer dobimo prašek aktivne sestavine (npr. sredstvo ali sestavek) skupaj s katerokoli dodatno prikladno sestavino iz njene predhodno sterilno filtrirane raztopine.

Kadar je aktivno sredstvo ali sestavek prikladno zaščiten, kot je opisano zgoraj, lahko dajemo protein oralno, npr. z inertnim razredčilom ali prilagodljivim užitnim nosilcem. Izraz farmacevtsko sprejemljivi nosilec, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje katerokoli in vsa topila, disperzijske medije, prevleke, protibakterijska in protiglivna sredstva, izotonična sredstva in sredstva za zavlačevanje absorpcije ipd. Uporaba takih medijev in sredstev za farmacevtsko aktivne snovi je dobro znana v tehniki. Njihova uporaba v terapevtskih sestavkih je potrjena, razen če katerikoli konvencionalni medij ali sredstvo ni kompatibilno z aktivno spojino. Dodatne aktivne spojine prav tako lahko vgradimo v sestavke.

Posebno prednostno je, da formuliramo parenteralne sestavke v dozirni enotni obliki zaradi enostavnosti dajanja in enakomernosti doziranja. Dozirna enotna oblika, kot jo uporabljamo tukaj, se nanaša na fizikalno diskretne enote, prikladne kot enotne doze za subjekte sesalce, ki jih je treba zdraviti; vsaka enota vsebuje predhodno določeno količino aktivne spojine, preračunano, da proizvede želeni terapevtski učinek, skupaj s potrebnim farmacevtskim nosilcem. Specifikacija za dozirne enotne oblike v smislu izuma je določena in direktno odvisna od: (a) posameznih značilnosti aktivne spojine in posebnega terapevtskega učinka, ki ga je treba doseči, in (b) omejitev, zajetih v

-4545 tehniki pripravljanja takega aktivnega sredstva ali sestavka za zdravljenje posameznikov.

Izraz farmacevtsko sprejemljiv nosilec, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje katerokoli in vsa topila, disperzijske medije, prevleke, antibakterijska in antifungicidna sredstva, izotonična sredstva in sredstva za zavlačevanje absorpcije ipd. Uporaba takih medijev in sredstev za farmacevtsko aktivne snovi je dobro znana v tehniki. Vključimo lahko tudi dodatna sredstva.

Za izvajanje predloženega izuma se bodo uporabljale, če ni drugače navedeno, konvencionalne tehnike celične biologije, celičnih kultur, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNA in imunologije, ki so vse v obsegu spretnosti s tega področja. Take tehnike so popolnoma obrazložene v literaturi. Npr.: Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. izd., izd. Sambrook J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Bilogy 3.izd., izd. Ausubel F. et al. (Wiley, NY (1995)); DNA Cloning, vol. I in II (D.N. Glover izd., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait izd. (1984)); Mullis et al. US-patent št. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins izd. (1984)); znanstveni sestavki, Methods in Enzymology (Aademic Press, Inc., Ν.Υ.); Immunochemical Methods in Celi and Molecular Biology (Mayer in Walker, izd. Academic Press, London (1987)); Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV (D.M. Weir in C.C. Blackwell, izd. (1986)); in Miller J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, Ν.Υ. (1972)).

Vsebine vseh referenc, patentnih prijav, ki so v postopku, in objavljenih patentov, citiranih v tej prijavi, so tukaj izrecno vključene z referenco.

Predloženi izum je nadalje ponazorjen s spodnjimi Primeri, ki niso grajeni kot nadaljnje omejevanje.

PRIMERI

-4646

V Primerih smo uporabili mišji model hemofilije A za oceno novih postopkov za preprečevanje in zdravljenje tvorbe inhibitorja. Miši s hemofilijo A, dobljene s ciljano prekinitvijo eksona 16 gena faktorja VIII, nimajo detektibilne aktivnosti faktorja VIII v njihovi plazmi (Bi L., Nature Genetics 10:119, 1995) in so tako podobne pacientom z resno hemofilijo A. Kot pričakovano imajo miši s hemofilijo A znake in vivo za defekt koagulacijske poti s fatalnim krvavenjem, kadar so repi odrezani brez uporabe hemostatičnih meril, in razvijejo subkutano in intramuskularno krvavenje po obdelovanju ali začasni imobilizaciji (Qian J, Borovok M, Bi L, Kazzazian HH, Hoyer L. Thromb Haemost 81:940, 1999; Evans GL et al, Proč Natl Acad Sci USA 95:5734, 1998).

Intravenozne infuzije 0,2 pg humanega faktorja VIII, doza ekvivalentna na osnovi mase tisti, ki jo dobijo pacienti s hemofilijo A, imajo za posledico minimalni protitelesni odziv ali nobenega pri teh miših s hemofilijo A po eni injekciji, vendar pa ponovljene infuzije vodijo do visokega titra inhibitomega anti-faktorja VIII (Quian J et al. Thromb Haemost 81:940, 1999). Poleg tega je bil detektiran T-celični proliferativni odziv, specifičen za faktor VIII, tri dni po prvi izpostavitvi humanemu faktorju VIII, preden so bila detektirana protitelesa.

Primer 1

Inhibicija primarnega imunskega odziva na faktor VIII

Eksperimentalni model za ta Primer je prikazan na Fig. 1. Trem skupinam miši smo injicirali faktor VIII intravenozno na dan 0. Eni skupini miši smo injicirali tudi CTLA4-Ig en dan pred in en dan po injekciji faktorja VIII. Druga skupina miši je prejela enako obdelavo s CTLA4-Ig (intraperitonealno), nato pa vsak dan injekcije faktorja VIII od dneva 2 do 12. Tretja skupina ni prejela nič CTLA4-Ig. Vse miši so nato prejele dve dodatni injekciji faktorja VIII na dneva 23 in 44. Živalim smo vzeli kri na dneve 20, 37, 58 in 82. Medtem ko so imele miši, ki niso prejele CTLA4-Ig

-4747 visoke titre protiteles s pričetkom na dan 20, pa miši, ki so prejele CTLA4-Ig, niso razvile protiteles do dneva 82 (Fig. 2).

Primer 2

Inhibicija sekundarnega odziva na faktor VIII

Eksperimentalni model za ta Primer je prikazan na Fig. 3. V tem Primeru so miši dobile večkratne intravenozne injekcije faktorja VIII v dvotedenskih intervalih in so bile nato razdeljene v dve skupini. Mišim smo ponovno injicirali faktor VIII na dneve 1, 20 in 37. Eni skupini miši smo injicirali CTLA4-Ig na dan -1 in na dan +1 glede na injekcije faktorja VIII na dneve 1, 20 in 37. Živali, ki niso prejele CTLA4-Ig, so imele visoke titre protiteles antifaktorja VIII, medtem ko miši, ki so prejele CTLA4-Ig (z izjemo ene miši), niso razvile sekundarnega imunskega odziva na faktor VIII (Fig. 4).

V Primerih 3 do 6 smo uporabili naslednje postopke in materiale:

Živali. Lastnosti za ekson-16 (E-16) sev hemofdnih miši navajajo: Bi L. et al., Nature Genetics 10:119, 1995; Bi L. et al., Blood 88:3446, 1996. Odrasle samce in homozigotne E-16 samice miši s starostjo 10 do 20 tednov smo uporabili za te študije. Vzorce krvi smo dobili z jemanjem krvi iz orbitalnega venusnega pleksusa, serum pa smo ločili s centrifugiranjem pri 600 g 3 minute. Serumske vzorce smo shranili pri -20 °C do preizkusov. Da bi se izognili resnemu krvavenju in poginu živali, nismo uporabili ušesnih oznak za identifikacijo miši pri nekaterih eksperimentih. Zaradi tega Fig. 5 ne označuje zaporednih podatkov za individualne miši.

Miši z dvema izključenima genoma, E-16/B7-1 in B7-2, smo dobili s križanjem E-16 miši z mišmi z izključenima B7-1 in B7-2 (Borriello F, et al. 1997. Immunity 6:303). Homozigotne miši z dvema izključenima genoma, E-16/B7-1 in E-16/B7-2, smo identificirali z genotipskim določevanjem (Bi L et al, Nature Genetics 10:119, 1995; Borriello F, et al. Immunity 6:303, 1997. Zmanjšano aktivnost faktorja VIII smo potrdili s kromogenskim biopreizkusom Coatest (Chromogenix, Molndal, Švedska)

-4848 (Bi L et al, Blood 88:3446, 1996). Aktivnost faktorja VIII je bila manjša od 1 % tako pri E-16/B7-1 kot pri E-16/B7-2 deficientnih miši.

Antigeni. Rekombinantni humani faktor VIII smo dobili pri Hyland Division of Baxter Healthcare Corp. (Glendale, CA).

mCTLA-4Ig. Murini CTLA4-Ig cDNA ekspresijski plazmid smo pripravili z ligacijo vodilnih in ekstracelularnih domen murinih CTLA4 na zglob CH2 in CH3 domen IgHg2a, kije bil mutiran za odstranitev efektorskih funkcij, kot opisujejo Streurer et al (Streurer J. Immunol. 155:1165, 1995). Vključek smo kolonirali v ekspresijski vektor pED in stabilno transfektirali v celice CHO, kot je bilo predhodno opisano (Lollar P. et al, J. Ciin. Invest. 93:2497, 1994). S koncentriranimi kondicioniranimi mediji smo napolnili hitropretočno kromatografsko kolono rProtein A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Kolono smo sprali s PBS, pH 7,1 in mCTLA4-Ig eluirali z 20 mM citratom, pH 3,0. Najvišji pool smo nevtralizirali z IM Trisa, pH 8,0, do končnega pH 7,5 in formulirali v PBS, pH 7,1, z uporabo mešane celice Amicon z membrano ΥΜ30. mCTLA4-Ig smo depirogenirali z uporabo Poros Pl (Perceptive Biosystems) kromatografij ske kolone in produkt eluirali iz kolone z linearnim NaCI gradientom od 0 do 1 M NaCI v 25 mM Trisa, pH 7,5. mCTLA4-Ig smo nato formulirali v PBS, pH 7,1, z uporabo mešane celice Amicon z membrano ΥΜ30.

Meritve protiteles.. Titer antifaktorja VIII smo določili z ELISO (Qian J, et al. Inhibitor antibody development and celi response to human factor VIII in murine hemophilia A, Thromb Haemost 81:940, 1999). Preizkuse ELISA smo izvedli z uporabo mikrotitrskih vdolbin, prevlečenih z rekombinantnim humanim faktorjem VIII, 0,8 pg/ml v 0,05 mol/ml karbonata-bikarbonata, pH 9. Vzorce mišje plazme smo inkubirali v vdolbinah pri 4 °C preko noči, jih nato sprali in potem dodali kozji antimišji IgG, konjugiran z alkalno fosfatazo (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) za 2 uri pri sobni temperaturi. Po izpiranju smo dodali P-nitrofenil fosfat (Sigma, St. Louis, MO) 2 mg/ml v 100 mmol/1 glicina, 1 mmol/1 MgCl₂, 2 mmol/L ZnCl₂, pH 10,4, in odčitali absorbanco pri 410 nm z avtomatskim čitalnikom

-4949

ELISA z mikrotitersko ploščico. Koncentracijo antifaktor VHI-protitelesa smo določili iz standardne krivulje, ki smo jo dobili z uporabo monoklonalnega murinega IgG antihumani faktor VHI-protitelesa, ki se veže na A2 domeno (Mab 413) (Lollar P. et al, J Ciin Invest 93:9497, 1994). Titer smo izračunali iz točk, ki so padle na linearni del preizkusne standardne krivulje.

Titre anti-faktor VIII inhibitorja v Bethesda enotah (BE) smo izmerili z Bethesda preizkusom (Kasper CK. Thromb et Diath Haem 30:263, 1973).

T-celični proliferacijski preizkusi. Vranico smo uporabili kot vir celic T za proliferacijske preizkuse. Vranične celice smo nato kultivirali (5xl0⁵/vdolbino) na ploščah z ravnim dnom s 96 vdolbinami. Spremenljive količine rekombinatnega faktorja VIII smo dodali kulturnemu mediju, sestavljenemu iz popolnega RPMI-1640, vsebujočega 0,5 % seruma hemofilnih miši. 37 kBp H-timidina/vdolbino (6,7 Ci/mmol, ICN Pharmaceuticals Irvine, CA) smo dodali po 72 urah kultiviranja pri 37 °C. Kulture smo zbrali 16 ur kasneje z uporabo matriksa Matrix 9600 (Packard, Meriden, CT). Podatki so izraženi kot povprečje trojnikov vdolbin za cpm, vključene v netopno DNA.

Primer 3 mCTLA4-Ig blokira indukcijo odziva anti-faktorja VIII

Anti-faktor VIII inhibitorna protitelesa induciramo pri kontrolnih miših s ponovljenimi intravenoznimi injekcijami 1 pg rekombinatnega humanega faktorja VIII v tritedenskih intervalih. V tem Primeru smo štirim skupinam miši s hemofilijo A injicirali rekombinatni humani faktor VIII na dneve 0, 23, 44 in 66 (1 pg i.v. na začetku in nato 0,2 pg za drugo, tretjo in četrto injekcijo). Mišim v skupinah G-3 in G4 smo prav tako injicirali intraperitonealno 0,2 pg faktorja VIII na dneve 2-12. Vzorce krvi za preizkus anti-faktorja VIII smo dobili na dneve 20, 37, 58 in 82. Kontrolnim skupinam G-l in G-3, prazni krogci, smo injicirali le faktor VIII. Skupinam G-2 in G4, polni krogci, smo injicirali tudi mCTLA4-Ig (250 pg, i.p.) na dan pred prvo

-5050 injekcijo in na dan po prvi injekciji faktorja VIII. Koncentracijo anti-faktor VIIIprotitelesa smo določili z ELISA. Točke preizkusnih podatkov anti-faktorja VIII, navedene kot <0,16 pg/ml, so bile podobne tistim za plazemske vzorce, dobljene pri neimuniziranih miših s hemofilijo A. Rezultati za ta eksperiment so prikazani na Fig. 5 (Opomba: na Fig. 5 so ponovljeni nekateri podatki, prikazani na Fig. 2, vendar so dodani dodatni podatki).

Anti-faktor VIII smo detektirali pri štirih od petih miši 20 dni po prvi injekciji in vse kontrolne miši so razvile visok titer anti-faktorja VIII, potem ko so prejele od dve do štiri injekcije. Povprečni inhibitorski nivo po štirih injekcijah je bil 1860 Bethesda enot (BE). Tvorbo anti-faktor VIII protitelesa smo izrazito zatrli pri miših, injiciranih intraperitonealno z 250 pg murinega CTLA4-Ig na dan pred prvo injekcijo in dan po prvi injekciji faktorja VIII (skupina G-2, Fig. 5), čeprav s tremi kasnejšimi injekcijami faktorja VIII na dneve 23, 44 in 66 nismo dali nadaljnjega mCTLA4-Ig. Anti-faktorja VIII ni bilo možno zaznati v katerikoli skupini G-2 miši po prvi ali drugi injekciji faktorja VIII. Tri tedne po tretji injekciji faktorja VIII smo detektirali slab imunski odziv pri dveh od šestih miši v skupini G-2.

Zato da bi raziskali, ali je omejeno trajanje neodzivnosti posledica kratkega razpolovnega časa humanega faktorja VIII pri teh miših (4-5 ur pri murini hemofiliji A (Evans GL et al, Proč Natl Acad Sci ZDA 95:5734, 1998), smo injicirali kontrolnim mišim in tistim, obdelanim z mCTLA4-Ig (skupini G-3 in G-4, Fig. 5), 1 pg faktorja VIII intravenozno na dan 0, nato pa smo dali dnevno intraperitonealne injekcije 1 pg faktorja VIII na dneve 2-12. Visok titer anti-faktorja VIII je bil na dan 20 pri kontrolnih miših (skupina G-3); v primerjavi s 350 pg/ml z ELISO in povprečnim inhibitorskim titrom 694 BE. V nasprotju s tem skupina miši G-4, kateri smo injicirali mCTLA4-Ig en dan pred izpostavitvijo faktorju VIII in en dan po tem, ni imela detektibilnega anti-faktorja VIII na dan 20. Zakasnjeni odziv anti-faktor VIII protitelesa po treh dodatnih injekcijah faktorja VIII je bil enak pri teh miših kot pri živalih iz skupine G-2. Tako omejena persistenca faktorja VIII v plazmi po injekciji

-5151

CTLA4-Ig ni bila razlog za omejeno trajanje neodzivnosti pri miših, obdelanih s CTLA4-Ig.

Primer 4

Učinki ponovljenega dajanja CTLA4-Ig

Ker smo zakasnjeni odziv anti-faktorja VIII detektirali po ponovljenih infuzijah faktorja VIII, kadar smo mCTLA4-Ig dali le v času prve izpostavitve prvemu faktorju VIII, smo ugotavljali, ali mCTLA4-Ig lahko prepreči razvoj anti-faktorja VIII, če ga damo z vsako infuzijo faktorja VIII. Pri tem preizkusu (Fig. 6) smo pri miših s hemofilijo A izvedli simultano infuzijo tako faktorja VIII kot mCTLA4-Ig šestkrat v tritedenskih intervalih. Mišim s hemofilijo A smo injicirali intravenozno tako oba 1 pg faktorja VIII in 250 pg mCTLA4-Ig v tritedenskih intervalih (polni krogci) kot tudi sam faktor VIII po prvi injekciji, kije vsebovala tako faktor VIII kot tudi mCTLA4-Ig (prazni krogci). Serumske vzorce za preizkus anti-faktorja VIII smo dobili štiri tedne po šesti injekciji faktorja VIII. V nobeni od desetih miši, obdelanih na ta način, ni bilo možno detektirati anti-faktorja VIII, ko smo jih preizkusili štiri tedne po šesti injekciji faktorja VIII. V nasprotju s tem pa je bil visok titer anti-faktorja VIII v serumu miši, ki so prejele le eno injekcijo mCTLA4-Ig (v času prve izpostavitve faktorju VIII) in nato pet injekcij samo faktorja VIII.

Te miši, obdelane z mCTLA4-Ig, smo nato preizkusili, da smo ugotovili, ali bi imele imunski odziv po dodatnih injekcijah faktorja VIII v odsotnosti mCTLA4-Ig. Po dveh intravenoznih injekcijah v tritedenskih intervalih nobena od petih miši ni razvila antifaktorja VIII, medtem ko smo nizki nivo anti-faktorja VIII detektirali pri dveh od štirih kontrolnih miši, ki niso bile predhodno izpostavljene bodisi faktorju VIII ali mCTLA4-Ig (Fig. 7). Pri tem eksperimentu smo mišim s hemofilijo A, obdelanim, kot je opisano pri Fig. 6 s šestimi injekcijami tako faktorja VIII kot tudi mCTLA4-Ig, kasneje dali šest intravenoznih injekcij po 0,2 μg faktorja VIII v tridenskih intervalih brez dodatnega mCTLA4-Ig (polni krogci). Kontrolne miši smo brez predhodne izpostatitve faktorju VIII vzporedno imunizirali (prazni krogci). Serumske vzorce za

-5252 preizkus anti-faktorja VIII smo dobili tri tedne po drugi in šesti injekciji. Po šestih injekcijah samo faktorja VIII je bil povprečni titer faktorja VIII 93 pg/ml pri miših, ki so predhodno prejele tako faktor VIII kot tudi mCTLA4-Ig, medtem ko je bil povprečni titer pri kontrolnih miših 155 pg/ml. Ti podatki prikazujejo meje antigensko specifične imunske supresije, do katere pride pri ponovljenem sodajanju mCTLA4-Ig s faktorjem VIII.

Primer 5 mCTLA4-Ig zatira drugi imunski odziv na faktor VIII

Da bi ugotovili, ali mCTLA4-Ig modificira drugi imunski odziv na faktor VIII, smo mCTLA4-Ig injicirali v istem času, kot smo dali faktor VIII mišim s hemofilijo A, ki so že razvile anti-faktor VIII. Na začetku smo vsem mišim s hemofilijo A injicirali 3krat 0,2 pg faktorja VIII, nivo anti-faktorja VIII pa smo določili z ELISO. Kontrolne miši so nato prejele tri dodatne injekcije faktorja VIII, medtem ko smo preostalim mišim dali mCTLA4-Ig v istem času, kot so prejele prvo od treh dodatnih injekcij faktorja VIII. Ker je mnogo miši med tem preizkusom poginilo zaradi krvavitvenih zapletov, zaradi ponovljenih injekcij in zbiranja vzorcev krvi, so rezultati jasno različni za obe skupini.

V tem Primeru so vse miši na začetku prejele tri intravenozne injekcije po 0,2 pg FVIII v dvotedenskih intervalih. Kontrolnim mišim (prazni krogci) smo nato injicirali faktor VIII še trikrat in dobili vzorce krvi za preizkus (zgornji diagram). Drugim mišim (polni krogci) smo dali mCTLA4-Ig (250 pg intraperitonealno) en dan pred četrto injekcijo faktorja VIII in en dan kasneje (kot je označeno s puščico), nato pa še dve injekciji samo faktorja VIII v tritedenskih intervalih. Število injekcij faktorja VIII pred preizkusom vzorca krvi za antifaktor VIII je prikazano na horizontalni osi.

Povečanje titra anti-faktorja VIII smo ugotovili po četrti injekciji faktorja VIII pri kontrolnih miših s povprečnim titrom od 16 do 230 pg/ml (Fig. 8A). Po peti injekciji faktorja VIII so bili vsi titri anti-faktorja VIII nad 350 pg/ml pri štirih preostalih

-5353 kontrolnih miših. V nasprotju s tem so imele miši, obdelane z mCTLA4-Ig, pri četrti injekciji faktorja VIII minimalno povečanje anti-faktorja VIII ali sploh ne (Fig. 8B in C). Dajanje mCTLA4-Ig je inhibiralo ta drugi imunski odziv na faktor VIII pri miših, ki so že razvile relativno visoke nivoje anti-faktorja VIII, kar ustreza inhibitorskim titrom 5-90 BE (Quian J. et al., Thromb Haemost 81:940, 1999) (Fig. 8C) kot tudi pri miših z minimalnim anti-faktorjem VIII po treh začetnih injekcijah, manj od 5 BE (Fig. 8B).

Primer 6

Določevanje vloge B7-1 in B7-2 pri primarnem imunskem odzivu na faktor VIII

Nato smo ocenili vloge B7-1 in B7-2 kostimulatornih ligandov na antigen predstavljajoče celice, zaradi njihove interakcije s CD28, za katero smo domnevali, da jo treba preprečti pri eksperimentih z uporabo mCTLA4-Ig. Za to izvedbo smo križali miši s hemofilijo A z B7-1’^Z’ in B7-2’^z' mišmi (Borriello F. et al., B. Immunity 6:303, 1997; Freeman GJ et al, Science 262:907, 1993) in z genotipsko analizo izbrali miši, ki so bile deficientne tako glede faktorja VIII kot tudi B7-1 ali B7-2. Mišim s hemofilijo A/B7-l’^/’ in hemofilijo A/B7-2 ^Z smo nato injicirali intravenozno 0,2 pg humanega faktorja VIII v dvotedenskih intervalih. Serumske vzorce za preizkus antifaktorja VIII smo dobili 12 dni po drugi in šesti injekciji faktorja VIII. Po štirih injekcijah je vseh devet miši s hemofilijo A/B7-l'^z' (prazni krogci) razvilo anti-faktor VIII s titri nad 350 pg/ml in povprečnimi inhibitorskim nivojem 712 BE (Fig. 9), vrednosti, podobne tistim za miši s sicer normalno hemofilijo A, injicirane s faktorjem VIII (Quian J. et al. Thromb Haemost 81:940, 1999). V nasprotju s tem nobena od osmih miši s hemofilijo A/B7-2’^z' (polni krogci) ni imela detektibilnega anti-faktorja Vlil. Podobne rezultate smo dobili pri miših s hemofilijo A, obdelanih z anti-B7-l in anti-B7-2 protitelesi.

Za oceno T-celičnega odziva teh B7-1 in B7-2 deficientnih miši s hemofilijo A smo dobili vranične celice tri dni po tem, ko smo dali peto intravenozno injekcijo faktorja VIII. Zbrane vranične celice treh miši smo uporabili za ugotovitev proliferacijskih podatkov. Prazni in polni kvadratki na Fig. 10 so za celice neobdelanih miši s

-5454 hemofilijo A/B7-1’⁷ oz. B7-2’⁷’. Prazni krogci so za celice miši s hemofilijo A/B7-1’⁷’, ki so prejele pet intravenoznih injekcij FVIII, polni krogci pa so za miši s hemofilijo A/B7-2'⁷, ki so prejele pet intravenoznih injekcij faktorja VIII. Koncentracija faktorja VIII v kulturah je označena na horizontalni osi. T-celična proliferativna aktivnost, določena z vključitvijo 3H-timidina, kaže odziv, odvisen od doze faktorja VIII, za celice miši s hemofilijo A/B7-1’⁷’ (Fig. 10). V nasprotju s tem nismo detektirali nobenega T-celičnega odziva pri kateremkoli nivoju faktorja VIII pri vraničnih celicah miši s hemofilijo A/B7-2'^/. Tako ima B7-2 glavno vlogo pri podpiranju imunskega odziva na faktor VIII, injiciran intravenozno, tvorba anti-faktorja VIII pa je preprečena, če le-ta manjka.

Ekvivalenti

Strokovnjaki bodo prepoznali, ali bodo sposobni določiti z uporabo le rutinskega eksperimentiranja, številne ekvivalente specifičnih sestavkov in postopkov, opisanih tukaj. Za te ekvivalente menimo, da so v obsegu predloženega izuma in so pokriti s priloženimi zahtevki.

-5555

SEKVENČNA LISTA <110> Qian, Jiahua <12O> Postopki za zaviralno moduliranje imunskega odziva na terapevtske proteine <130> GIN-013 <140> 09/158,178 <141> 1998-09-21 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Komo sapiens <400> 1

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 1 5

Za

Genetics Institute, Inc. AMERICAN RED CROSS:

N/ '4 1.4 «C il

Claims (36)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Sestavek, označen s tem, da obsega prvo sredstvo, ki pospešuje hemostazo, in drugo sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T.
2. 2. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da nadalje obsega farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
3. 3. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, daje prvo sredstvo faktor VIII.
4. 4. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, daje prvo sredstvo varianta faktorja VIII z izpuščeno domeno B.
5. 5. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, daje prvo sredstvo faktor IX.
6. 6. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je prvo sredstvo von Willebrandov faktor.
7. 7. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je drugo sredstvo topna oblika kostimulatorne molekule.
8. 8. Sestavek po zahtevku 7, označen s tem, daje drugo sredstvo topna oblika CTLA4.
9. 9. Sestavek po zahtevku 7, označen s tem, da je drugo sredstvo topna oblika B7-1, topna oblika B7-2 ali kombinacija topne oblike B7-1 in topne oblike B7-2.
10. 10. Sestavek po zahtevku 8, označen s tem, daje drugo sredstvo CTLA4Ig.
11. 11. Sestavek po zahtevku 9, označen s tem, daje drugo sredstvo B7-lIg ali B7-2Ig.

    -5757
12. 12. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, daje drugo sredstvo topna oblika CD40 ali CD40L.
13. 13. Sestavek po zahtevku 1, označena s tem, daje drugo sredstvo protitelo, ki se veže na kostimulatomo molekulo.
14. 14. Sestavek po zahtevku 13, označen s tem, daje drugo sredstvo izbrano iz skupine, ki jo sestavljajo anti-B7-l protitelo, anti-B7-2 protitelo in kombinacija anti-B7protitelesa in anti-B7-2 protitelesa.
15. 15. Sestavek po zahtevku 13, označen s tem, da je protitelo neaktivima oblika antiCD28 protitelesa.
16. 16. Uporaba sestavka po kateremkoli zahtevku 1-15 za pripravo zdravila za zdravljenje hemostatične motnje pri subjektu.
17. 17. Uporaba po zahtevku 16, označena s tem, da ima subjekt predobstoječi imunski odziv na prvo sredstvo.
18. 18. Uporaba po zahtevku 16, označena s tem, da subjekt nima predobstoječega imunskega odziva na prvo sredstvo.
19. 19. Uporaba po zahtevku 16, označena s tem, da sestavek obsega dodatno imunosupresivno sredstvo.
20. 20. Uporaba po zahtevku 16, označena s tem, da je hemostatična motnja izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo hemofilija A, hemofilija B in von Willebrandova bolezen.
21. 21. Uporaba sestavka za pripravo zdravila za zdravljenje hemostatične motnje pri subjektu, označena s tem, da sestavek obsega prvo sredstvo, ki pospešuje hemostazo,

    -5858 in drugo sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, tako da se zdravi hemostatična motnja.
22. 22. Uporaba sestavka za pripravo zdravila za zdravljenje hemostatične motnje pri subjektu, označena s tem, da sestavek obsega prvo sredstvo, ki pospešuje hemostazo in drugo sredstvo, ki inhibira kostimulatomi signal v celici T, tako daje imunski odziv na prvo sredstvo zaviralno moduliran in se s tem zdravi hemostatična motnja.
23. 23. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, daje prvo sredstvo faktor VIII.
24. 24. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, da je prvo sredstvo varianta faktorja VIII z izpuščeno domeno B.
25. 25. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, daje prvo sredstvo faktor IX.
26. 26. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, da je prvo sredstvo von Willebrandov faktor.
27. 27. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, daje drugo sredstvo topna oblika sredstva, ki dovaja kostimulatomi signal celici T.
28. 28. Uporaba po zahtevku 27, označena s tem, daje sredstvo topna oblika CTLA4.
29. 29. Uporaba po zahtevku 28, označena s tem, daje sredstvo CTLA4Ig.
30. 30. Uporaba po zahtevku 27, označena s tem, daje sredstvo topna oblika B7-1, topna oblika B7-2 ali kombinacija topne oblike B7-1 in topne oblike B7-2.
31. 31. Uporaba po zahtevku 30, označena s tem, da je sredstvo B7-lIg, B7-2Ig ali kombinacija obeh B7-lIg in B7-2Ig.

    -5959
32. 32. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, daje drugo sredstvo protitelo, ki se veže na kostimulatomo molekulo.
33. 33. Uporaba po zahtevku 32, označena s tem, daje drugo sredstvo izbrano iz skupine, ki jo sestavljajo anti-B7-l protitelo, anti-B7-2 protitelo in kombinacija anti-B7-l in anti-B7-2 protitelesa.
34. 34. Uporaba po zahtevku 32, označena s tem, da je protitelo neaktivima oblika antiCD28 protitelesa.
35. 35. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, daje hemostatična motnja izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo hemofilija A, hemofilija B in Von Willebrandova bolezen.
36. 36. Uporaba po zahtevku 21 ali 22, označena s tem, da ima subjekt znaten titer protiteles, ki se vežejo na prvo sredstvo.