JP2000509370A - Ｉｇｆ―ｉｒの活性生存ドメイン及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脊椎動物細胞中で生存シグナルを伝達するために必要とされるインスリン様成長因子レセプタ−Ｉ（ＩＧＦ−ＩＲ）内の活性生存ドメインを同定した。野生型ＩＧＦ−ＩレセプターによりトランスフェクションされたＦＬ５．１２細胞中において、ＩＧＦ−Ｉは、Ｂｃｌ−２の発現による場合のように、ＩＬ−３離脱を防止するものであった。同じ条件下でＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉレセプターを発現するＦＬ５．１２細胞に有意なミトゲンの効果を与えることはなかった。ＡＴＰ結合部位において変異したＩＧＦ−Ｉレセプターはアポトーシスを防ぐことはなかった。しかしながら、９５０位のチロシン残基又はキナーゼドメインのチロシン集団部位（１１３１、１１３５及び１１３６位）における変異は、結果として、活性機能を保持したレセプターを生じた。ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端において、１２５１位のチロシン、１２９３位のヒスチジン及び１２９４位のリジンにおける変異はアポトーシスの機能を失わせたが、１２８０位〜１２８３位の４個のセリンにおける変異は生存に影響を及ぼさなかった。驚くべきことに、Ｃ末端で切断されたレセプターは高められた抗アポトーシス機能を有した。本発明の組成物及び方法は、脊椎動物細胞中のアポトーシスの調整に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＧＦ−ＩＲの活性生存ドメイン及びその使用方法 技術分野 本発明は、一般的に細胞生理学の分野、特にプログラム細胞死即ちアポトーシ スに関する。本発明の新規なペプチド、組成物及び本発明の方法は、細胞中での アポトーシスを調整するのに有用である。 背景技術 プログラム細胞死即ち「アポトーシス」は、免疫及び神経システム成熟を含む 、広範な発達過程の正常なコースに含まれるとともに重要である。アポトーシス はまた、高い細胞代謝回転速度を有する成体細胞中でもその役割を果たす(Ellis ,R.E.,et al.,Ann.Rev.Cell.Biol.7:663-698(1991):Oppenheim,R.W.,Ann.Rev.Ne urosci.14:453-501(1991);Cohen,J.J.,et al.,Ann.Rev.Immunol.10:267-293(199 2):Raff,M.C.,Nature 356:397-400(1992))。発達過程での役割に加えて、アポト ーシスは腫瘍形成に対する重要な細胞の保護手段として関連づけられてきた(Wil liams.G.T.,Cell 65:1097-1098(1991);Lane,D.P.,Nature 362:786-787(1993))。 ある条件下では、細胞は、高水準又は調整のとれない腫瘍遺伝子の発現に応答し て、アポトーシスにより死滅する(Askew,D.,et al.,Oncogene 6:1915-1922(1991 ):Evan,G.L,et al.,Cell 69:119-128(1992):Rao,L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci .USA 89:7742-7746(1992);Smeyne,R.J.,et al.,Nature 363:166-169(1993);Tana ka,S.,et al.,Cell 77:829-839(1994);Wu,X.,et al.,Proc Nutl.Acad.Sci.USA 9 1:3602-3606(1994))。様々な遺伝的損傷によるアポトーシスプログラムの抑制は 、悪性疾患の発達と進行に寄与するかもしれない。この事は、人の腫瘍中でのｐ ５３腫瘍抑制遺伝子の頻繁な変異により、十分に説明される(Levine,A.J.,et al .,Nature 351:453-456(1991))。 アポトーシスを調整する役割を果たすとみられる他の因子が同定された。その １つである、インスリン様成長因子Ｉリセプター（ＩＧＦ−ＩＲ）はシグナル形 質導入性分子のチロシンキナーゼファミリーの１員である。ＩＧＦ−ＩＲは、超 生理学的濃度におけるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II及びインスリンリガンドにより活 性化され、正常な細胞の発達、成長及び生存に重要な役割を果たす(LeRoith,D., et al.,Endocrine Revs．16：143-163(1995);Lowe,W.L.,Jr．“Biological acti ons of the Insulin-like growth factor receptors,”in LeRoith,D.,Ed.,Insu lin-like Growth Factors:Molecular and Cellular Aspects,CRCPress,Boca Rat on,Pub.(1991);Baserga,R.,et al.,CellProlif.27:63-71(1994))。ＩＧＦ−ＩＲ の過発現は線維芽細胞の形質転換を引き起こし、逆にＩＲＦ−ＩＲ不存在線維芽 細胞は多数の腫瘍遺伝子による制御不能な形質転換となる(Sell,C.,et al.,Mol. Cell Biol.14:3604-3612(1994))。 生体内及び生体外における腫瘍細胞の維持に関してＩＧＦ−ＩＲの果たす役割 について顕著な証拠がある。肺(Kalser,U.,et al.,J.Cancer Res.Clin Oncol.11 9:665-668(1993);Moody,T.W.and Cutitta,F.,Life Sciences 52:1161-1173(l993 ))、乳房(Pollak,M.N.,et al.,Cancer Lett.38:223-230(1987);Fockens,J.A.,et al.,Cancer Res.49:7002-7009(1989)Cullen,K.I.,et al.,Cancer Res.49:7002- 7009(1990)及び結腸(Remaole-Bennet,M.M.,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.75 :609-616(1992);Guo,Y.S.,et al.,Gastroenterol.102:1101-1108(1992)の腫瘍中 のＩＧＦ−ＩＲレベルは上昇している。ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−II発現レ ベルの増加は人の腫瘍と関係づけられている(McCauley,V.M.,et al.,Cancer Res .50:2511-2517(1990);Bhatavdekar,J.M.,et al.,Neoplasma41:101-103(1994))。 これらの腫瘍細胞の多くは培養中に増殖シグナルを伴って応答し(Nakanishi,Y., et al.,J.Clin.Invest.82:354-359(1988);Freed,K.A.and Herrington,A.C.,J.Mo l.Endocrinol.3:509-514(1989))、そして生体中での増殖に対するオートクライ ン又はパラクリンループが仮定されている(LeRoith,D.,et al.,Endocrine Revs. 16:143-163(1995);Yec,D.,et al.,Mol.Endocrinol.3:509-514(1989))。 ＩＧＦ−Ｉは、ＩＬ−３依存性の造血細胞中のサイトカイン離脱により引き起 こされるアポトーシスを防ぎ(Rodriguez-Tarduchy,G.,et al.,J.Immunol.149:53 5-540(1992))、またＲａｔ−１／ｍｙｃＥＲ細胞中の血清離脱を防ぐ(Harringto n,E.,et al.,EMBO J．13:3286-3295(1994))。マイトジェンＥＧＦ及びＰＤＧＦ を含む牛胎児血清中に存在するサイトカインの中で、ＩＧＦ−ＩがＲａｔ−１細 胞中でのｍｙｃ−誘発死を阻止するのに最も有効であることが証明された。ＩＧ Ｆ−Ｉの抗アポトーシス機能は細胞サイクルのポスト−コミットメントステージ 中及びエトポシド又はチミジンにより細胞サイクル進行中でブロックされた細胞 中で明白である。ｃ−ｍｙｃで誘発された繊維芽細胞の生存はＩＧＩ−Ｉに依存 するという証明は、特にアポトーシスを阻止することにより腫瘍遺伝子で誘発さ れた腫瘍細胞の維持におけるＩＧＦ−ＩＲの重要な役割、増殖効果としてよりよ く特徴づけられるものとは別の役割が存在することを示唆する。これは腫瘍生存 の促進におけるｂｃｌ−２のような他の抗アポトーシス遺伝子により果たされる と考えられる役割に類似したものであろう(McDonnell,T.J.,et al.,Cell 57:79- 88(1989);Hockenberry,D.M.,et al.,Nature 348:334-336(1990))。ＩＧＦ−Ｉの 防御効果は、リガンドの入手可能性よりもレセプターレベルに依存する(Resnico ff,M.,et al.,Cancer Res.55:3739-3741(1995a))。腫瘍細胞の維持におけるＩＧ Ｆ−ＩＲの抗アポトーシス効果は、ＩＧＦ−ＩＲに対するアンチセンスオリゴヌ クレオチドを使用し、ＩＧＦ−ＩＲレベルとラット同系腫瘍のアポトーシスの程 度及び腫瘍形成ポテンシャルとの定量的関係を同定した研究によっても支持され た(Rescinoff,M.,et al.,Cancer Res.55:3739-3741(1995b))。ＩＧＦ−ＩＲ不存 在(null)マウスからの繊維芽細胞が形質転換におけるＩＧＦ−ＩＲの必要性を証 明し、またＩＧＦ−ＩＲの増殖及び形質転換機能について重要なレセプター中の ドメインをマップするのに使用された。特に、IGＦ−ＩＲのＣ末端領域は形質転 換機能に必要である。１２２９位のアミノ酸で切断されたレセプターは、ＩＧＦ −ＩＲ不存在マウス由来の繊維芽細胞を形質転換することができないが、増殖活 性は完全に維持している(Surmacz,E.,et al.,Exp.Cell Res.218:370-380(1995)) 。Ｃ末端領域内で、形質転換活性はさらに１２４５〜１２９４位のアミノ酸間に 位置づけられた。１２５１位の１個のチロシンをフェニルアラニンで置換すると 形質転換機能が減少し(Miura,M.,et al.,J.Biol.Chem.270:22639-22644(1995b)) 、４個のセリン（1２８０〜１２８３）を置換すると形質転換は完全に消滅し（L i et al.提出）、１２９３位のヒスチジン及び１２９４位のリジンを置換すると 形質転換活性が減少する（Hongo et al.提出）。形質転換機能を欠失し、切断さ れまた位置変異したレセプターは全て増殖能力を維持していた。これらの研 究は、増殖と形質転換というレセプターの２つの異なる機能は、レセプター内で 空間的に区別されるものであり、また形質転換は増殖に必要とされるものに追加 のシグナルを必要とすることを示す。キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位、キナ ーゼドメインのチロシン集団部位、又は９５０位のチロシン部位（ＩＧＦ−ＩＲ 、ＩＲＳ−１及びＳＨＣの確立された基質に対する主な結合部位）における変異 は、増殖及び形質転換の両方を失わせる(Miura,M.,et al.,Cancer Res.55:663-6 67(1995a);Li,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:32558-32564(1994);Gronberg,M.,et al.,J.Biol.Chem.268:23435-23440(1993))。 これらの先行する議論が示すように、最近の研究は脊椎動物細胞におけるＩＧ Ｆ−ＩＲの形質転換及び増殖機能についての一般的な理解を進めたが、ＩＧＦ− ＩＲの明白な抗アポトーシス機能はよく判明しないままである。レセプターの抗 アポトーシス機能に含まれるＩＧＦ−ＩＲドメインの解明は、ガン細胞のような ある種の細胞の生存を調整する組成物の開発に大きな価値をもつであろう。また 、ＩＧＦ−ＩＲの抗アポトーシス活性を調整することができれば、ＩＧＦ−ＩＲ の抗アポトーシス機能の活性が有用であると思われる、神経変性病のような病気 や、発作のような急性低酸素症傷害により影響を受けた細胞を処置するための組 成物やストラテジーの開発を可能とするであろう。逆に、腫瘍細胞中のＩＧＦ− ＩＲの抗アポトーシス機能の不活性化は、有用で特異的な処置ストラテジーとな るであろう。したがって、抗アポトーシス機能の原因となるＩＧＦ−ＩＲにおけ る活性部位を同定する必要性が存在する。 発明の開示 広義には、本発明はリガンド結合に対するレセプターの生存又は抗アポトーシ ス機能を調整するＩＧＦ−ＩＲのドメインを含む新規な組成物を指向する。これ らの新規組成物は、以下集合的に「活性生存ドメイン」と称するＩＧＦ−ＩＲの ペプチド領域を含み、その調整はレセプター活性化に対する抗アポトーシス応答 を高め又は消失させる。 一態様として、本発明はＩＧＦ−ＩＲのＣ末端削除変異株を指向する。本発明 のＣ末端削除変異株を含む脊椎動物細胞はレセプターに対するリガンド結合にお ける高められた抗アポトーシス応答を示す。本発明のこの側面によるＣ末端削除 変異株は、削除変異株１２２９ｄ、１２４５ｄ及び１２９３ｄ（すなわち、それ ぞれＦ１２２９位、Ｒ１２４５位及びＨ１２９３位のアミノ酸で切断されたＩＧ Ｆ−ＩＲペプチド変異株）ならびにそれらの機能等価物には限定されない。 他の側面では、本発明は単離され精製された、別法として合成的に生産しても よい、ＩＧＦ−ＩＲの最後の１０８、９２又は４４アミノ酸を含み、好ましくは ＭｙＣＦ、ＣＦ、ＭｙＣＦ−Ｎ、ＭｙＣＦ−ｍｉｄ、ＭｙＣＦ−ＣＮＭｙＣＦ− ２９、ＭｙＣＦ−６２、ＣＦ−Ｎ、ＣＦ−ｍｉｄ及びＣＦ−Ｃと称されるＩＧＦ −ＩＲ細胞質ドメイン構造、又はＭｙＣＦ、ＣＦ及びＹ１２５０Ｆ／Ｙ１２５１ Ｆ、Ｈ１２９３Ｆ／Ｋ１２９４Ｒ又はＳ１２８０−１２８３Ａにおける変異を有 するＭｙＣＦ−Ｎ構造を指向し、さらに細胞のアポトーシス状態を誘発又は調整 するのに有用なそれらの構造及び／又は機能を模倣し又は妨害する分子を指向す る。活性生存ドメインの機能を中断する化合物は、アポトーシス調整剤として有 用である。したがって、さらに他の側面として、本発明は活性生存機能の中断剤 を指向する。そのような中断剤は、限定するわけではないが、活性生存ドメイン に結合する分子、活性生存ドメインと細胞蛋白由来の他のペプチド配列との相互 作用を妨害する分子（１０８、９２及び４４アミノ酸Ｃ末端ペプチド又はＩＧＦ −ＩＲ自体の他のペプチド配列を含むが、これらには限定されない）、及び何ら かの態様で変化した活性生存ドメインを含む分子を含む。 本発明はさらに、例えば本発明の追加の態様ともなる、ＩＧＦ−ＩＲとの分子 内相互作用による活性生存ドメインの機能中断によりアポトーシスを調整する分 子を同定するスクリーニング法を提供する。一側面として、該スクリーニング法 は競合結合アッセイを含み、そこでは推定調整分子のＩＧＦ−ＩＲの切断１２２ ９ｄ、１２５４ｄ又は１２９３ｄ削除変異株に対する結合能力が適当な標識Ｃ末 端ペプチドの存在下に測定される。 他の態様として、本発明はＩＧＦ−ＩＲの単一又は複数点変異株を指向する。 本発明の点変異ＩＧＦ−ＩＲを含む脊椎動物細胞はレセプターに結合するリガン ドに対して変化した抗アポトーシス応答を示す。本発明のこの側面による点変異 ＩＧＦ−ＩＲ組成物は、限定するものではないが、変異株Ｙ１２５１Ｆ及び二重 変異株Ｙ１２５０Ｆ／Ｙ１２５１Ｆ及びＨ１２９３Ｆ／Ｋ１２９４Ｒ、ならびに これらの機能等価物を含む。本発明の点変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物のリン酸化段階 は、該段階の調整と同様に、本発明の他の側面を構成し、それは本発明によれば 、例えば各蛋白チロシンキナーゼ又はホスホチロシンホスファターゼの阻害によ って達成されるかもしれず、それにより本発明の点変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物の抗 アポトーシスシグナルは影響を受けるかもしれない。 さらに本発明の他の態様は、本発明の点変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物をアポトーシ スを調整する分子のスクリーニング用マーカーとして使用することを含む。この 態様は、限定するものではないが、細胞のアポトーシス状態を調整するために、 本発明の点変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物に特異的に結合するものとして同定された、 他のペプチドや蛋白（限定するものではないが、ＩＧＦ−ＩＲ自体の他のペプチ ド配列を含む）と競合する推定アポトーシス調整分子の能力を測定するアッセイ 法を含む。特に意図された典型的な態様では、推定アポトーシス調整分子の点変 異レセプターへの結合能力が、野生型（即ち、非変異）レセプターに対する同じ 分子の親和性に対して測定されたときに、減少し又は失われ又は獲得されるアッ セイ法が提供される。 本発明のスクリーニングアッセイ法により同定された分子は、標的細胞を単独 で又は適当な担体と組み合わせて生体内で、生体外で又は試験管内で処置するた めの有用な治療薬の候補となるであろう。 他の側面では、本発明は、本発明によるＣ末端変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物及び点 変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物（集合的に、「変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物」）のクローニ ング、調製及び発現に含まれる製品及びプロセス；これらの変異ＩＧＦ−ＩＲ組 成物に特異的な抗体；これらの変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物又はその蛋白をコードす るヌクレオチド配列に関する。本発明の変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物を含有するペプ チドは、それに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を産生するのに有 用である。これらの抗体、その断片は、例えば心臓細胞、肺細胞、腫瘍細胞、脳 細胞、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓及びすい臓を含む全ての人組織由来の細胞を含 む生物学的検体中の変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物を含む蛋白を検出し単離するのに有 用であり、同様に該生物学的検体中又はそこから得たＣ末端断片のような、変異 ＩＧＦ−ＩＲ組成物を含む蛋白のアポトーシス活性を調整するのに有用であり、 本発明の他の側面をなすものである。 さらに他の側面として、本発明は遺伝子配列を含む発現ベクター、該発現ベク ターにより形質転換されたホスト及び本発明の組換え変異ＩＧＦ−ＩＲ組成物を 生産する方法を提供する。 本発明はまた、不適切な細胞増殖又は生存により、もしくは不適切な細胞死に より、それぞれ特徴づけられる疾患にかかっている人の細胞及び／又は組織中の アポトーシスを誘発又は抑制する方法を指向する。不適切な細胞増殖及び／又は 生存により特徴づけられる疾患は、例えば炎症状態、リンパ腫及び遺伝子型腫瘍 を含むガン等を包含する。不適切な細胞死により特徴づけられる疾患は、例えば 自己免疫病、後天性免疫不全症（エイズ）、放射療法又は化学療法による細胞死 、急性低酸素傷害等を含む。 本発明はまた、ＩＧＦ−ＩＲ抗アポトーシスドメインの存在を検出する方法、 及び正常な細胞母集団中で期待される蛋白発現レベルに比較して、ＩＧＦ−ＩＲ 抗アポトーシスドメインを含む蛋白の増加又は減少した発現レベルを伴う疾患の 診断方法に関する。 本発明はまた、ＩＧＦ−ＩＲ抗アポトーシスドメインを含むペプチドの治療上 の使用に関する。 本発明はまた、それぞれ不適切な細胞増殖（即ち、アポトーシス誘発）を安定 させ、又は不適切な細胞死（即ち、アポトーシス抑制）を安定させ、及び／又は いずれのケースにおいても正常な細胞活動を回復するために、活性生存ドメイン 配列を含むペプチド又は不適切な細胞増殖又は不適切な細胞死により特徴づけら れる疾患にかかっている人に対する活性生存ドメインの活性を調整する化合物を 管理することによって、細胞のアポトーシス状態を調整する方法に関する。 他の側面として、本発明は、Ｃ末端１０８アミノ酸ペプチドを含むＩＧＦ−Ｉ Ｒ由来のＣ末端アミノ酸ペプチドが腫瘍細胞に対して細胞毒性があるという驚く べき発見に向けられる。これらのペプチドは、ＩＧＦ−ＩＲ Ｃ末端依存性であ る細胞、即ち不着独立性成長及び／又は試験管内でのトランスフェクションによ りもたらされるアポトーシス刺激又は生体内の生核酸チャンバー中での成長を示 す 細胞を、特異的に阻止し及び／又は殺す。本発明の細胞毒性Ｃ末端アミノ酸ペプ チド（及びその機能類似体）は治療剤及びＩＧＦ−ＩＲの抗アポトーシス機能を 調整する他の剤のスクリーニングアッセイに有用である。 さらに他の側面として、ＩＬ−３依存性細胞でのＩＧＦ−ＩＲ抗アポトーシス 機能のアッセイ方法を指向し、該方法はレセプター構造中でのミトゲンの及び形 質転換機能からの生存機能の分離を証明することを可能とする。 本発明のこれらのそして他の目的及び側面は、以下の記載から当業者には明ら かとなるであろう。 図面の説明 図１ FL5.12/Bcl-2細胞と比較した、IGF-IRで安定的にトランスフェクトしたFL5.12 細胞の生存度。５％FBS、５％FBS＋IGF-1、または５％FBS+IL-3を含有する培地 中で細胞を５×106／mlで培養し、生存度をトリパンブルー排除によって示され た時点で監視した。図１ＡはFL5.12/neo細胞を示すものであり、図１ＢはFL5.12 /IGF-IR-I細胞を示すものである。図１Ｃにおいては、FL5.12細胞／BCL-2細胞の ５％FBSにおける生存度を、FL5.12/neoと比較している。データの点は、三系(tr iplicate)培養から誘導された細胞生存度の平均および標準偏差を示すものであ る。ヒトIGF-IRに特異的なAb-1 mAbで染色する間接免疫蛍光法によって測定され たFL5.12細胞におけるwt IGF-IRの発現をパネルＤに示しており；細い線は陰性 対照（一次抗体を含まない）について得られた染色を表すものであり、太い線は Ab-1mAbについての染色を表すものである。 図２ IL-3またはIGF-1の存在下におけるFL5.12/IGF-IRの増殖。細胞を、５％FBS、 ５％FBS+IGF-I、または５％FBS＋IL-3中に１×105／mlで接種した。図に示した ような時点でアリコートを取り出し、細胞数を測定した。 図３Ａ IGF-IRのヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列。前受容体(proreceptor)のア ミノ酸には、Glu１から始めて番号を付して、30残基シグナル配列の前に置いて お り；ヌクレオチドには右の方まで番号を付している。実験的に決定されたペプチ ド配列には下線を引いて、番号を付しており；N-結合グリコシル化の可能性のあ る部位に上線を引いており；システイン残基には陰を施しており；膜貫通ドメイ ンには太い下線を引いている。ＡＴＰ結合の可能性のある部位は、Gly 976、978 および981上にはアステリスクを付して、Lys 1003上には矢印を付すことによっ て示している。推定前駆体プロセシング部位は枠で囲っている。Ullrich，Aら， EMBO J．5(10):2503-2512(1986)を参照されたい。 図３Ｂ 鎖のシステイン富化領域および二量体のＢ鎖のキナーゼドメインを示すIGF-IR のｃＤＮＡ構造の概略図。上記の欠失突然変異体の相対位置を示す。Ullrich，A ら，EMBO J．5(10):2503-2512(1986)を参照されたい。 図４Ａ FL5.12細胞における安定なトランスフェクション後のIGF-IR突然変異体の発現 レベル。細胞を、ヒトIGF-IRに特異的なAb-1モノクローナル抗体の結合について 、間接免疫蛍光法によってアッセイした。細い線は、陰性対照（一次抗体を含ま ない）について得られた染色を表すものであり、太い線はAb-1結合を表すもので ある。発現した各突然変異体の名称は、枠の上に示す。 図４Ｂ K1003R突然変異体IGF-IR、Y950F突然変異体、Y1131、1135、1136F突然変異体 、Y1250F/1251F突然変異体、S1280-1283A突然変異体、およびH1293/F/K1294R突 然変異体を発現するFL5.12細胞の生存曲線。細胞を、IL-3を含有する培地中で24 時間インキュベートし、大規模に洗浄し、５％FBS、５％FBS＋IGF、または５％F BS＋IL-3を含有する培地中で５×10⁵／mlで培養した。細胞生存度を、再プレー ティングの24、48および72時間後、トリパンブルー排除によって監視した。その データを、横軸を時間、縦軸を総細胞の％生存度としてプロットしたものとして 示す。 図５ トランケート(truncated)IGF-IRを発現するFL5.12細胞中に取りこまれたIL-3 によって誘導されたアポトーシスからのIGF-Iの保護。細胞を、IL-3を含有する 培地中で24時間インキュベートし、大規模に洗浄し、５％FBS、５％FBS＋IGF、 または ５％FBS＋IL-3を含有する培地中で５×10⁵／mlで培養した。細胞生存度を、24、 48および72時間において、トリパンブルー排除によって監視した。そのデータを 、横軸を時間、縦軸を総細胞の％生存度としてプロットしたものとして示す。各 点は、三系培養の平均および標準偏差を示すものである。パネルＡ：1229d IGF- IR突然変異体を発現するFL5.12細胞；パネルＢ：1245d IGF-IR突然変異体；およ びパネルＣ：1293d IGF-IR突然変異体。 図６ IGF-IR細胞質ドメイン構築物。IGF-IR断片のヌクレオチド配列をコードする構 築物は、全長IGF-IR配列からＰＣＲ増幅によって作製された。各配列を、3'末端 で、7-アミノ酸フラッグ(flag)抗原タグ（Ｆ）と融合させた。第２バージョンは 、ＳＲＣの最初の16アミノ酸を5'末端にミリスチル化（My）および膜固定のシグ ナルとして融合することによって修飾された各構築物から作られる（上記のとお りである）。MyBFは、アミノ酸930からアミノ酸1337までの、5'末端にMyが融合 し、3'末端にＦが融合した全IGF-IR細胞質ドメインをコードする。MyKCFは、IGF -IRキナーゼドメインと、アミノ酸972からアミノ酸1337までの、5'末端にMyが融 合し、3'末端にＦが融合した全Ｃ末端とをコードする構築物である。MyCFは、ア ミノ酸1225(キナーゼドメイン中）からアミノ酸1337までの、5'末端にMyが融合 し、3'末端にＦが融合したIGF-IRの全Ｃ末端をコードする。CFは、アミノ酸1223 (キナーゼドメイン中）から始まり、3'末端にＦが融合したIGF-IRの全Ｃ末端を コードする。MyKC20は、アミノ酸1210からアミノ酸1229までの、5'末端にMyが融 合し、3'末端にＦが融合したIGF-IRキナーゼドメイン由来の20アミノ酸をコード する。MyCF-Nは、アミノ酸1225〜1269の、5'末端にMyが融合し、3'末端にＦが融 合したIGF-IRＣ末端のＮ末端部分をコードする。MyCF-midは、アミノ酸1260〜13 07の、5'末端にMyが融合し、3'末端にＦが融合したIGF−IRＣ末端の中央領域を コードする。MyCF-Cは、アミノ酸1301〜1337の、5'末端にMyが融合し、3'末端に Ｆが融合したIGF−IRＣ末端のＣ末端をコードする。MyCF-29は、アミノ酸1231〜 1259の、5'末端にMyが融合し、3'末端にＦが融合したIGF−IRＣ末端断片をコー ドする。MyCF-62は、アミノ酸1246〜1307の、5'末端にMyが融合し、3'末端にＦ が融合したIGF−IRＣ末端断片をコードする。また、CF-N、CF-midおよびCF-Cの 構築物、な らびにY1250F/Y1251F、H1293F/K1294Rおよび／またはS1280-1283Aにおける突然 変異に特徴付けられるMyCF、CFおよびMyCF-Nの構築物も作製した。 図７ IGF-IRＣ末端断片MyCFのMCF-7への一過性発現により細胞毒性が生じる。MCF-7 細胞を、β−ガラクトシダーゼをコードするマーカープラスミド、pcDNA3対照ベ クター、またはCFもしくはMyCFの配列を含むpcDNA3プラスミドでリポフェクタミ ン(lipofectamine)法によって一過性トランスフェクトし、IGF-Iの存在下で48時 間インキュベートした。細胞を、48時間後にXgalで染色し、生死ブルー細胞を顕 微鏡分析によって計数した。パネルＡ：トランスフェクトした各プラスミドにつ いての合計生死ブルー細胞数。データは、三系トランスフェクションから得られ た生死細胞数の平均および標準偏差を示すものである。一過性トランスフェクシ ョンによるMCF-7細胞におけるCFおよびMyCFタンパク質の発現は、パネルＢに、 免疫沈降タンパク質のウェスタンブロット分析によって示される。免疫沈降およ びウェスタンブロットには抗フラッグモノクローナル抗体を使用し、検出はＥＣ Ｌプロトコルによって行った。 図８ CF、MyCFおよびMyKCFの一過性トランスフェクションはＲ＋細胞に対して毒性 になる。細胞を、β−ガラクトシダーゼをコードするマーカープラスミドで、CF 、MyCFまたはMyKCFを含むＲ＋プラスミドとともにリポフェクタミン法によって トランスフェクトし、10％FBSまたはIGF-I（50ng/ml）とともに24時間インキュ ベートし、Xgalで染色した。生死ブルー細胞を顕微鏡分析によって計数した。パ ネルＡは10％FBS中でインキュベートしたＲ＋細胞を示すものであり、パネルＢ はIGF-I中でインキュベートしたＲ＋細胞を示すものである。データは、三系ト ランスフェクションから得られた生死細胞数の平均および標準偏差を示すもので ある。 図９ Ｒ＋細胞におけるMyCF、MyKC20、MyCF-N、MyCF-N(50/51)、MyCF-midおよびMyC F-Cの一過性発現。細胞を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするマーカー プラスミドで、種々のIGF-IR構築物をコードするプラスミドとともにリポフェク タミンによってトランスフェクトし、IGF-I（50ng/ml）を含有する血清を含まな い 培地中で24時間インキュベートし、Xgalで染色した。生死ブルー細胞を顕微鏡分 析によって計数した。データは、三系トランスフェクションから得られた生死細 胞数の平均および標準偏差を示すものである。 図１０ GSTおよびアンテナペディア配列に融合したMyCFをコードする修飾pGEX-2TK鋳 型ベクター。P-GEX-2TKベクターのクローニング領域を、Nco-I制限部位にクロー ニングされたMy（SRC由来の最初の16アミノ酸）配列、Sac-Iにクローニングされ たフラッグタグ（Ｆ）およびXba I制限部位にクローニングされたアンテナペデ ィア配列(Ap)を含むようにそのクローニング領域中で修飾した。アミノ酸1223〜 1337を含むIGF-IRＣ末端配列を、KpN-IおよびSac−I制限部位の間にクローニン グした。このプラスミドは、Ｎ末端にGSTが融合し、Ｃ末端にApが融合しているM yCFを産生する。GSTとMyCFとの間のリンカー領域は、トロンビン切断部位および タンパク質の32Ｐ標識のためのタンパク質キナーゼＡ部位を含む。GST、フラッ グタグおよびApへの融合のためにあらゆるＤＮＡを子のベクターに挿入すること ができる。 図１１ 酵母ツーハイブリッドシステムスクリーニングにおいて使用するためのIGF-IR おとり(bait)構築物。IGF-IR構築物を、酵母ツーハイブリッドシステムおとりプ ラスミドpAS-2にクローニングして、GAL-4ＤＮＡ結合ドメインおよび赤血球凝集 素（ＨＡ）エピトープタグに融合するタンパク質を産生させた。Y2Hwtは、アミ ノ酸931〜1337を含む全IGF-IR細胞質ドメイン配列をコードするpAS-2プラスミド である。Y2H 950は、Y950F突然変異を含む以外は同一の構築物である。Y2H CFは 、アミノ酸1225〜1337の、IGF-IRＣ末端をコードするpAS-2プラスミドである。Y 2H-CF 50/51はY1250F/Y1251F突然変異を含むCFであり、Y2H CF93/94はH1293F/K1 294R突然変異を含むCFであり、Y2H CF 1280-83はS1280-1280A突然変異を含むCF である。 発明の詳細な説明 ここで使用される技術用語及び学術用語は、特に限定がない場合は、本発明の 属する技術分野における通常の知識を有するものが通常理解する意味を有するも のとする。また、当該技術分野において公知である多くの方法論を参照するもの とする。ここで、参照される上記公知の方法論が記載された刊行物その他の資料 は、全体として参照するものとする。ＤＮＡ組換技術の原理一般を示すものとし て通常参照するものには、J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Planview,New York(1989);Kaufm an,P.B.,et al.,Eds.,Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biolog y and Medicine ,CRC Press,Boca Raton(1995);McPherson,M.J.,Ed.,Directed Mu tagenesis:A Practical Approach ,IRL Press Oxford(1991);Jones,J.,Amino Aci d and Peptide Synthesis ,Oxford Sciece Publications,Oxford(1992);Aust en, B.M.and Westwood,O.M.R.,Protein Targeting and Secretion,IRL Press,Oxford (1991)が含まれる。本発明を実施するに当たっては、通常用いられる材料及び／ 又は方法はいずれも使用することができるが、好適な材料及び／又は方法は以下 に述べる通りである。以下の詳細な説明及び実施例で参照する材料、試薬等は、 特に示さない場合は、商業過程で入手することができる。 本発明では、ＩＧＦ−ＩＲの抗アポトーシス機能に関する、ＩＧＦ−ＩＲのタ ンパク質ドメイン（ここで「活性生存ドメイン」と定義する）を同定する。キナ ーゼドメインの、及びＣ末端のＹ９５０において変異したものを含むＩＧＦ−Ｉ ＲはＩＬ−３依存性のネズミＢ細胞株ＦＬ５．１２において発現された。これら の細胞はＩＬ−３の離脱において急激にアポトーシスを受けるため、細胞死の研 究のためのモデルとして広範に使用されてきた。ｂｃｌ−２のような抗アポトー シス遺伝子によりトランスフェクションされた場合は、ＩＬ−３により誘発され るアポトーシスは妨げられる。(Hockenberry et al.,1990)また、ｂａｋのよう なアポトーシス誘発遺伝子によりトランスフェクションされた場合は、ＩＬ−３ 剥奪によるアポトーシスの開始が加速される。ｂａｋの単離、同定は、１９９４ 年１０月１１日に出願された、継続中の米国特許出願シリアル番号０８／３２１ ，０７１に記載されている。該出願は、１９９４年８月９日出願の米国特許出願 シリアル番号０８／２８７，４２７（ここではｂａｋはｂｃｌ−ｙとして言及） の一部継続出願であり、本出願において参照するものとする。 ＩＬ−３依存性の細胞株ＦＬ５．１２はＩＧＦ−ＩＲの抗アポトーシス機能を 研究する上で、明快な機構を提供し、この目的に好適に用いられるものである。 繊維芽細胞のような細胞とは対照的に、ＦＬ５．１２細胞株はきわめて少数の内 因性ＩＧＦ−ＩＲしか発現しないため（＜１０００／ｃｅｌｌ）、内因性レセプ ターと細胞内にトランスフェクションされたレセプターの混乱を起こすことが少 ない。ＩＧＦ−Ｉは、野生型“ｗｔ”ＩＧＦ−ＩＲによりトランスフェクション された細胞のアポトーシスを防ぎ、これは該細胞中でＢｃｌ−２が過発現された 場合にアポトーシスが妨げられるのと類似するものである。ＩＧＦ−ＩＲの抗ア ポトーシス機能は、ＦＬ５．１２細胞中で有意のミトゲンのシグナルを伴わなか ったが、これはＩＧＦ−Ｉの存在下ではＦＬ５．１２細胞が増殖しなかったから である。 これまでＩＧＦ−ＩＲ不存在細胞内での増殖の、及び形質転換の機能が分析さ れていたＩＧＦ−ＩＲの一連の変異について、ＦＬ５．１２細胞内でのＩＬ−３ の離脱により誘起されるアポトーシスを防ぐはたらきについて分析がなされた。 Ｋ１００３Ｒにおけるキナーゼ不活性化変異は、増殖及び形質転換の欠失に従っ て、抗アポトーシス効果を有しないレセプターを与える。(Kato et al.,1993)２ −ハイブリッド機構分析(two-haybrid system analysis)によって、ＩＧＦ−Ｉ Ｒにおける９５０位のチロシンがＩＲＳ−１と相互作用することが証明され(O'N eill et al.,1994,Gustafson et al.,1995)、この相互作用を最大化するために はキナーゼドメインにおけるチロシン集合部位（１１３１、１１３５、１１３６ ）が必要とされる。(Gustafson et al.,1995)変異株Ｙ９５０Ｆ、及びＹ１１３ １、１１３５、１１３６ＦはいずれもＲ細胞内においてミトゲンの、又は形質転 換の機能を有しないが、これらの変異株はいずれもアポトーシスを防ぐはたらき を保持している。この結果は、ＩＧＦ−ＩＲにおける増殖の、及び形質転換のは たらきに必要とされるドメインと、抗アポトーシス機能（ここでは“活性生存ド メイン”という）に必要とされるドメインは分離したものであることが示し、更 には、抗アポトーシス機能はＩＲＳ−１によって媒介されるものではないことを 示す。 ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端における、Ｙ１２５１ＦとＨ１２９３Ｆ／Ｋ１２９４Ｒ の２つの変異は、ＩＧＦ−Ｉによって媒介されるＩＬ−３の離脱からの保護を失 わせ、またこれらの変異は予想されるここでいうところの活性生存ドメインを含 む。興味深いことに、これらの変異株はともにＲ−細胞における増殖を保持する が、これら２つの部位は形質転換の機能に必要とされるものでもある。(Miura e t al.,l995b,Hongo et al.,1996)４個のセリン（１２８０〜１２８３）において 変異したＩＧＦ−ＩＲは増殖機能を有するが、形質転換を起こすことはできない 。(Li et al.,submitted)この変異株は、Ｆ１５．１２細胞において抗アポトー シス機能を保持する。この結果は、Ｃ末端において必要とされる一定の残存部位 に関し、ＩＧＦ−IＲにおける形質転換の及びアポトーシスの機能にはこれまで 認められていなかった程度のオーバーラップがあることを示す。このようにアポ トーシスの阻害は細胞の形質転換の一部をなし得るものであるが、追加のシグナ ルもまた必要とされる。これらの変異株における抗アポトーシス及び形質転換機 能に関するデータの比較によって（ＴａｂｅｌＩ）、アポトーシスの阻害は形質 転換に不可欠であることがわかる。アポトーシスを防ぐことのない変異株では、 形質転換はなかった。 本発明者らにより、Ｃ末端で切断されたＩＧＦ−ＩＲは、削除された部位での 点変異株がレセプターの全体にわたって抗アポトーシス機能を失ってもアポトー シス機能を保持するという、予想外かつ驚くべき発見がなされた。レセプターの 発現が低レベルの状態であって、また外部からＩＧＦ−Ｉを付加しない５％ＦＢ Ｓ中で、有意のＩＬ−３の離脱防止が明らかであったことから、該切断されたレ セプターは、向上した抗アポトーシス効果を有するようである。該切断されたレ セプターはなおＩＧＦ−Ｉに対する応答性を有し、またホスホチロシン容量のウ エスタンブロット（Western blot）分析より、構造上のリン酸化はないように 思われた。これらの切断されたレセプターは形質転換機能を有さない。これらは 増殖機能を有し、この機能は高められてはいないようである。(Surmacz,et al., 1995)特定の定理に制限するものではないが、このことはＩＧＦ−ＩＲの抗アポ トーシス機能におけるＣ末端の役割について２つの可能性を示す。第１の可能性 は、Ｃ末端はレセプターの他の部分に対して規制的な役割を果たし、この規制が ない状態では、レセプターの抗アポトーシス活性は増加するというものである。 第２の可能性は、Ｃ末端は自身に、細胞の生存にとって潜在的にネガティブなシ グナ ル、若しくは前駆アポトーシスシグナル（pro-apoptotic signal）をもっており 、このシグナルはレセプターの他の部分によって抑制されているとするものであ る。このようなネガティブなシグナルは、抗アポトーシス機能を与えない、リガ ンドスティミュレーションを有しない不活性ＩＧＦ−１Ｒに類似するものである 。Ｙ１２５１又はＨ１２９３／Ｋ１２９４において変異がある場合は、このネガ ティブなシグナルはＩＧＦ−１の存在のもとでも明白である。Ｃ末端部分の短期 トランスフェクションによって検出された細胞毒生は、ＩＧＦ−ＩＲのこの部位 における、生存に対する制限的な役割に対する更なる証明を与える。安定に発現 された卵巣ガン細胞中のＣ末端部分の研究によって、これらのＣ末端部分は、固 定され独立した成長、若しくは生体内での生拡散小室における成長のためにＩＧ Ｆ−ＩＲのＣ末端の機能が必要とされる条件下に細胞がおかれた場合に、特に制 限的であることが示唆される。 抗アポトーシスシグナルを与えるに当たって、ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端が規制的 な役割を果たすことの支持として、切断されたレセプター又はＣ末端変異株はＩ ＲＳ−１及びＳＨＣリン酸化を有することが、形質転換の研究過程で示されてい る。また、Ｃ末端切断ＩＧＦ−ＩＲ及びＣ末端変異ＩＧＦ−ＩＲは、ＳＨＣ及び ＩＲＳ−１のいずれに対しても高められた相互作用を有することが、酵母におけ るタンパク質の相互作用の研究で示されている。(Tartare-Deckert et al.,1995 ) 本発明者らは、ＩＲＳ−１とは相互作用することはできないと予想された変異 株Ｙ９５０Ｆは、アポトーシスを防ぐことはなかったことを観察した。これらの データは、切断されたレセプターの高められた活性は、ＩＲＳ−１又はＳＨＣを 通じて増加したシグナルによるものではなさそうであることを示唆する。それゆ え、レセプターの抗アポトーシス機能にとって不可欠なものとして、キナーゼド メイン又は近傍膜(juxta-membrane)部位におけるレセプター上の選択的なサイト が提案されるべきである。このような部位はＩＧＦ−ＩＲのＣ末端による規制を 受けやすいはずであり、本発明における生存活性ドメインを含む。一方、前駆ア ポトーシスシグナル（pro-apototic signals）の阻害による、このような生存ド メイン機能がＣ末端に存在することも考えられる。 これに限られるものではないが、本発明者らは、Ｃ末端基がＩＧＦ−ＩＲの抗 アポトーシス機能を規制する方法について限定的ではない過程を導くことができ た。全長を有するＩＧＦ−ＩＲにおいて、Ｃ末端はレセプターの機能を減衰すべ く、直接的に又は他の阻害タンパク質との相互作用を通じて間接的にレセプター と相互作用し得る。このような相互作用は、レセプターが活性ではない場合に起 こり得る。リガンドＩＧＦ−Ｉの結合の結果、キナーゼドメインの活性化が起こ り、キナーゼドメイン又はレセプターのＣ末端における、主要な残基のリン酸化 によって、阻害的な相互作用は開放され得る。このようなモデルは細胞にトラン スフェクトされた場合のＣ末端部分の細胞毒生効果とも合致する。これらの分子 が細胞毒生を示すにのには、２つの機構が考えられる。これらの分子は上記のよ うに、内因性のレセプターと相互作用し、その抗アポトーシス機能を阻害するか もしれない。若しくは、Ｃ末端部分は、通常内因性ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端と相互 作用するタンパク質と競合することによりアポトーシスを誘発し、アポトーシス 機能を阻害するかもしれない。卵巣ガン細胞中のこれらの分子の安定した発現か ら得られたデータは、仮定した機構と合致する。Ｙ１２５１Ｆ又はＨ１２９３Ｆ ／Ｋ１２９４Ｒ変異株による効果に似た効果を有する試薬、若しくはＩＧＦ−Ｉ ＲのＣ末端部分のような挙動を示す試薬もまた、本発明の腫瘍細胞における治療 介入に使用することができる。 ＩＧＦ−ＩＲの抗アポトーシス機能は、該レセプターのミトゲン性又は形質転 換機能に対して要求されるものとは同じでないドメインを必要とする。この事は 、明らかに該レセプターのＣ末端による規制を受け易い、ここで「活性生存ドメ イン」と表現する、抗アポトーシスシグナルに対して必要とされる１種又はそれ 以上の特異的ドメインの存在を示唆する。そのようなレセプターレベルでの規制 相互作用は腫瘍細胞中での治療介入に対する特異的な標的を提供する。 ここで使用する「アポトーシス誘発剤」は、標的細胞中での完全な又は部分的 なアポトーシス応答を誘発するどのような生物学的、化学的、生化学的又は物理 的手段をも包含する。標的細胞は正常な細胞、又は腫瘍細胞のように異常な成長 性又は増殖性を有する細胞であり得る。テストした大部分の有核真核細胞は、鳥 類及び線虫のような非ほ乳類細胞を含む適当な刺激に応答してアポトーシスを受 ける能力を示した。 アポトーシス誘発剤の例としては、ＵＶ光、高体温又は熱ショック、カルシウ ム、ＡＴＰ、アクチ／マイシンＤ、Ａ２３１８７Ｃａ²⁺−Ｍｇ²⁺イオノフォア、 サイトカラシンＢ、シクロヘキシミド、抗−ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター抗体、エ ピポドフィロトキシン、グリトキシン、グルココルチコイド、リンフォトキシン 、ＲＵ４８６、ＴＣＤＤ、ＴＧＦ−β１、酸化性ストレス、ウイルス感染、化学 療法剤、冷ショック、ガンマ放射線、シスプラチン、エトポシド、テニポシド、 ＤＮＡアルキル化剤、巨大分子合成阻害剤、ナチュラルキラー細胞のような免疫 性剤、エフェクター細胞、リンフォトキシン、Ｋ細胞等及びその他、例えばGree n,D.R.et al.,Apoptosis and Cancer,in Principles and Practice of Oncology Updates Volume 8,J.B.Lippincott Companany,January 1994 Number 1,and Ger schenson,L.E.,et al.,FASEBJ.6:2450-2455(1992)に記載されているものが挙げ られる。 本発明の活性生存ドメイン組成物は、例えばＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧ Ｆ−II及びインスリンを含むそのリガンドならびに細胞中に見出されるレセプタ ー相互作用蛋白を使用したアッセイ中で、既知の及び推定アポトーシス誘発剤を 同定するのに使用される。本発明における好ましい薬剤は、ペプチド及び蛋白を 含む分子であり、活性生存ドメインと結合するか又は他の方法で相互作用し、そ れによって活性生存ドメインの機能に影響を与えまたは与えないが、ここでは「 生存ドメイン相互作用剤」と称する。ここで使用するように、「生存ドメイン相 互作用剤」は特別な蛋白によって認識される分子を意味し、特別な蛋白としては 好ましくはレセプター蛋白、そして最も好ましくはＩＧＦ−ＩＲが挙げられる。 該蛋白により結合され又は反応する薬剤は、「生存ドメイン相互作用剤」と称さ れるが、この用語はそのカウンターパート蛋白に関してのみ定義上の意味を有す る。用語「生存相互作用剤」は、問題となる物質が蛋白と結合又は他の方法で相 互作用することができるという以外の、特別な分子サイズや他の構造上又は組成 物としての性状を示唆するものではない。また、「生存ドメイン相互作用剤」は 蛋白が結合又は相互作用する天然のリガンドとして、又はアゴニスト又はアンタ ゴニストとして作用し得る機能類似体として役立つかもしれない。 ここに記載されているように、トランスフェクトされた細胞は、アポトーシス を研究するためのモデルとして使えるかもしれない。対照研究用として、ＩＧＦ −ＩＲを欠如するほ乳類細胞が、本発明のＩＧＦ−ＩＲをコードする発現構造物 でトランスフェクトされ得る。生産された細胞は、しばしば野生型蛋白と機能的 に等価である蛋白をコードする。したがって、天然に生じ又は合成上の生存ドメ イン相互作用剤を含めて、相互作用蛋白の結合特性が分析され得る。トランスフ ェクトされた細胞は、医薬効能を有する薬剤を同定するために特に有用である。 トランスフェクトされた細胞は、推定医薬と接触され、推定医薬の不存在下で対 照細胞と対比することによって、アポトーシス調整の量が測定される。本発明に よって同定された薬剤は、アポトーシスの調整剤、神経変性疾患、腫瘍、ウイル ス性疾患の阻害剤、及び腫瘍プロモーターの同定を含む様々な用途を有する。 本発明はまた、本発明のポリペプチド断片及び実質的にその同族体ペプチドを 含む他のポリペプチドを提供する。本発明の蛋白ペプチドは、一般に天然に生じ るＩＧＦ−ＩＲの配列と少なくとも約８０％の相同性、典型的には少なくとも約 ８５％の相同性、そしてより通常的には少なくとも約９７％の相同性を示すであ ろう。比較配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なく とも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約 ２８残基、そして好ましくは約３５残基より多いものとなるであろう。 本発明はまた、切断されていてもよいＩＧＦ−ＩＲと他の蛋白の融合ポリペプ チドを含む。例えば、相同性のポリペプチドは、他の蛋白又は他のアポトーシス 調整蛋白と融合することができ、得られる融合蛋白は混合した機能を有する。適 当な蛋白の例としては、蛋白のＢｃｌ−２ファミリーのメンバー、Ｂａｋ、Ｂａ ｘ等が挙げられる。同様に、融合は異質の蛋白、例えばＳＲＣの最初の１６アミ ノ酸と行うこともできる。そのようなポリペプチドは、この分野で既知の方法を 使用して、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、又は他の部分の付加により化学 的に変性されたアミノ酸残基を有してもよい。ある態様として、修飾は試薬のラ ベリングに有用となるであろうし、又は精製標的例えば親和リガンドとして役立 つであろう。本発明による好ましいものとしては、ＭｙＣＦ、ＣＦ、ＭｙＣＦ− Ｎ、ＭｙＣＦ−ｍｉｄ、ＭｙＣＦ−Ｃ、ＭｙＣＦ−２９、ＭｙＣＦ−６２、ＣＦ −Ｎ、ＣＦ−ｍｉｄ及びＣＦ−Ｃとして示されるＩＧＦ−ＩＲ細胞質ドメイン構 造物、ＭｙＣＦ、ＣＦ及びＹ１２５０Ｆ／Ｙ１２５１Ｆ、Ｈ１２９３Ｆ／Ｋ１２ ９４Ｒ又はＳ１２８０−１２８３Ａ位で変異したＭｙＣＦ−Ｎからなる構造物、 ならびにそれらの構造及び／又は機能を模倣し及び／又は妨害する分子が挙げら れる。 融合ポリペプチドは典型的には組換え核酸法又は合成ポリペプチド法のいずれ かにより作製され、これらの方法は一般的にSambrookら、上記：Merrifield,J.A mer.Chem.Soc.85:2149-2156(1963)Merrifield,Sclence 232:341-347(1986);and Atherton,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis;A Practical Approach，IRL Press.Oxford(1989)に記載されている。 本発明の核酸組成物は、一般にＲＮＡ又はＤＮＡの形態、混合ポリマー形態、 又は核酸の相補成分に塩基特異的に結合することのできるあらゆる合成ヌクレオ チド構造となるであろう。適切な合成ヌクレオチド構造の１例が、Nielson,P.E. ,et al.,Science 254:1497-1500(1991)に記載されている。記載された核酸の態 様は、典型的にはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに由来する、合成により調製された 、又はそれらの組合せにより得られたものである。ＤＮＡ組成物は、一般にはＩ ＧＦ−IR又はその断片、例えば少なくとも８コドン、通常は少なくとも１２コド ン、又は通常は少なくとも約１５コドン、典型的には少なくとも約２０コドン、 より典型的には少なくとも約３０コドン及び好ましくはそれ以上、をコードする 完全なコード領域を含む。１つ又はそれ以上のイントロンが存在し得る。 ＩＧＦ−ＩＲ又はＣ末端断片のようなその断片をコードする核酸は、ＩＧＦ− ＩＲに対する発現構造物の調製に使用することができる。発現構造物は、通常は 操作可能に結合し天然又は他のプロモーターの翻訳コントロール下にあるＩＧＦ −ＩＲをコードする１つ又はそれ以上のＤＮＡ配列を含む。通常は、プロモータ ーはほ乳類細胞中の真核発現プロモーターとなるであろう。翻訳制御配列は、典 型的には異質のプロモーター又はホスト細胞により認識されるエンハンサーを含 むであろう。適切なプロモーターの選択はホスト細胞に依存するであろう。便利 な発現ベクターは商業的に入手可能である。 本発明の組成物は、アポトーシスプロセスを通じて細胞の成長と分化を調整す るのに有用である。アポトーシスプロセスの調整は、細胞母集団中のアポトーシ ス速度の減速、又はアポトーシス誘発剤に対する細胞のアポトーシス応答の除去 を含む。アポトーシスプロセスの調整はまた、細胞死の速度を増加させるか又は 細胞の母集団を特異的に標的とすることが望まれるところで、アポトーシスを誘 発又は加速することを含む。例えば、腫瘍細胞又は増加した増殖と成長を示す他 の細胞中でのアポトーシスの誘発は、これら細胞の成長を減少又は中断させる効 果的な治療法を提供する。本発明の化合物はまた、現行のガン治療で共通の課題 である薬剤耐性を除去するのに有用である。薬剤耐性は、一般にはアポトーシス に対する耐性であり得るので、本発明の蛋白は薬剤耐性を減少させるのに使用す ることができる。この態様では、本発明の組成物は他の抗ガン剤と組み合わせて 使用することができる。薬剤耐性のメカニズムは、例えばRemington's Pharmace ntical Sclences,18th Edition,Supraに記載されている。或る態様では、本発明 の組成物は、組織の障害又は変性をアッセイするのに使用することができる。組 織の障害をアッセイする好適なモデル系はデキサメタゾン処理ラットの胸腺であ り、Schwartzman,R.,et al.,Endocrinol.128(29:1190-1197(1991)に記載されて いる。 したがって、本発明の組成物は、抗ウイルス、抗微生物、又は抗寄生虫剤、肺 、乳房、すい臓及び肝臓の腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍処置用の抗ガ ン剤として、同様に急性のリンパ芽球性又は骨髄性白血病、慢性骨髄性、骨髄形 成性、顆粒状の、又はリンパ白血病、後天性免疫不全症（エイズ）、神経変性疾 患、脊髄形成異常症、ホドキンスリンパ腫、非ホドキンスリンパ腫等の悪性リン パ腫、又はバーキットリンパ腫、新生物等を含む種々の治療適用に有用である。 効果的治療に必要な活性成分の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状 態及び他の投与された医薬を含む数多くの異なる要素に依存するであろう。した がって、処置用量は安全性と効能を最大とするように決定されるべきである。典 型的には、試験管内で使用される用量が活性成分の現場投与での有効量の有用な 指標となるであろう。特別な症状の処置用の動物実験での有効量は、人間の用量 に対するさらに予知的な指標となるであろう。様々な考察が、例えばGoodman an d Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics ,7th Ed.,MacMillan P ublishing Co,,New York(1985),and Remington's Pharmaceutical Sciences 18t h Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Penn(1990)に記載されている。そこで議論 されている投与方法は、経口、静脈内、腹腔内、筋内、経皮、鼻、イオン導入投 与等を含むものである。 「機能的等価物」は実質的に本発明の組成物のものと同様の生物学的活性又は 免疫学的性状を有するペプチドを意味し、そのような活性又は性状を有する「断 片」、「変異体」、「類似体」、「同族体」又は「化学的誘導体」を含むことを 意図するものである。したがって、活性生存ドメインを含むペプチドの機能的等 価物は、同じアミノ酸配列を共有しないかもしれず、定型的又は非定型的アミノ 酸の保存的又は非保存的アミノ酸置換は可能である。 ここでの参照する「保存的」アミノ酸置換とは、同様な側鎖を有するアミノ酸 残基の交換可能性を意味することを意図している。例えば、グリシン、アラニン 、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群を構成 し;セリン及びトレオニンは脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸であり；アスパ ラギンとグルタミンはアミド基含有側鎖を有するアミノ酸であり；フェニルアラ ニン、チロシン及びトリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；リジ ン、アルギニン及びヒスチジンは塩基側鎖を有するアミノ酸であり；システイン とメチオニンはイオウ含有側鎖を有するアミノ酸である。ある群の１アミノ酸と 同じ群の他のアミノ酸で交換することは保存的置換と考えられるであろう。好ま しい保存的置換群は、アスパラギン−グルタミン、アラニン−バリン、リジン− アルギニン、フェニルアラニン−チロシン及びバリン−ロイシン−イソロイシン を含む。 活性生存ドメイン及びその機能的等価物の生物学的活性は、これらの組成物の 非細胞局在によって影響され得る。したがって、本発明のもう１つの好ましい態 様として、本発明の活性生存ドメインペプチドは、好ましくは細胞膜を標的とす るミリスチル化（Ｍｙ）のためのＳＲＣ配列であり得る、それらのＮ末端の適切 な配列に融合するであろう。適当な疎水性テイルの選択を含む、非細胞局在を生 じる他の適当な手段は、公知の方法を使用して当業者により採用されるであろう 。 活性生存ドメイン機能を調整することのできる薬剤は、活性生存ドメインを含 む蛋白、ならびに活性生存ドメイン又は活性生存ドメインを含む蛋白の変異株を 含み得る。ここで使用する「変異株」とは、天然に生じるペプチド又は蛋白のも のとは少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するペプチドを意味 する。変異株は、天然に生じる活性生存ドメイン又は天然に生じる蛋白と同じ生 物学的及び免疫学的活性を有し得る。しかし、変異株の生物学的又は免疫学的活 性は異なるか欠失しているかもしれない。例えば、活性生存ドメイン変異株は、 天然に生じる活性生存ドメインペプチドを特徴づける生物学的活性を欠失してい るが、活性生存ドメインペプチドに対する抗体を生じるか、又は活性生存ドメイ ンに対する抗体の測定又は精製用、又は（競合的又は非競合的）アゴニスト、ア ンタゴニスト、又は天然に生じる活性生存ドメインペプチド機能の部分アゴニス トとして有用であり得る。本発明による好ましい変異株は、ここで定義する「変 異ＩＧＦ−ＩＲ組成物」を含む。 活性生存ドメインが仲介する機能の調整は、活性生存ドメインペプチドのアゴ ニスト又はアンタゴニストによっても行われ得る。活性生存ドメインペプチドを 含む蛋白機能のアゴニスト又はアンタゴニストを同定するためのペプチドライブ ラリー、化合物ライブラリー及び他の情報バンクのスクリーニングは、活性生存 ドメイン結合を妨害又は増強するアゴニスト又はアンタゴニストの潜在能力を測 定するアッセイ法により行われる。 例えば、ＩＧＦ−ＩＲ Ｃ末端又はその断片のＧＳＴ融合蛋白は、ＩＧＦ−Ｉ Ｒ相互作用蛋白の阻害剤のスクリーニングに使用される。そのようなアッセイ法 では、ＧＳＨ−アガロースがＧＳＴ融合蛋白の固定に使用される。放射性標識相 互作用蛋白（³⁵Ｓ−Ｍｅｔ−標識試験管内翻訳蛋白又は³²Ｐ−標識−経由蛋白キ ナーゼＡ−ＧＳＴ融合蛋白、トロンビンで解裂し、ＧＳＴから精製）の結合は、 シンチレーション計数により検定及び／又は測定され得る。大規模、迅速スルー プットスクリーニングには、精製蛋白が９６−ウェル プレート フォーマット 中で使用される。ビオチン化蛋白は、当業者に公知の方法によってピンポイント ベクター（プロメガ）を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で生産される。対象とする蛋白 は、ビオチンリガーゼ、ｂｉｒＡの遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ株中でビオチ ン化された、ビオチンカルボキシラーゼ担体蛋白のセグメントに融合される。該 アッ セイ法は、精製ビオチン化蛋白が結合する中性アビジン被覆プレートを使用する 。ＧＳＴ融合相互作用蛋白の結合は、ＧＳＴ ＭＡｂを使用するＥＬＩＳＡによ り検出される。逆に、ＧＳＴ融合蛋白は、９６−ウェルプレート上に固定される 。この態様のビオチン化相互作用蛋白は、蛍光色素標識ストレプトアビジン（ピ アース）を使用して検定される。両方のアッセイ法に対して、相互作用の阻害剤 が減少したシグナル（ＥＬＩＳＡ又は蛍光）として記録する。 本発明のスクリーニングアッセイ法に使用される適当な標識としては、酵素、 放射活性アイソトープ、蛍光性化合物、ケミルミネッセント化合物又はバイオル ミネッセント化合物のような検出可能な標識が含まれる。当業者は他の適当な標 識を知るか又は日常的な実験によりそれらを確認することができるであろう。さ らに、これらの標識のペプチドへの結合は、当技術分野で公知の標準的技術を使 用して行われる。 活性生存ドメインに直接結合する薬剤の高速スクリーンは、固定された又は「 標識された」結合ライブラリーを採用し得る。そのようなライブラリーに特異的 に結合する薬剤は、それらの活性生存ドメイン機能を変性させる能力を試験され る候補である。変性の性状に依存して、そのような薬剤は、変性疾患又はそれに 続く虚血性障害での異常アポトーシスの抑制や、ガンのような異常生存又は増殖 疾患でのアポトーシスカスケードを開始又は高めるのに有用となろう。 例えば、ＩＧＦ−ＩＲＣ末端断片への精製ＧＳＴの融合は、Ｃ末端の特異的領 域と相互作用する細胞蛋白の検出に有用である。１つの典型的な態様として、こ れらの蛋白はλ−ＺＡＰ（ストラタゲン）発現ライブラリーのスクリーンに使用 される(Skolnik,E.Y.,et al.,Cell 65:83-90(1991))。λ−ＺＡＰライブラリー はＥ．ｃｏｌｉ上に置かれ、得られたプラックは蛋白発現を誘発するためにイソ プロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（ＩＰＴＧ）含浸ニトロセルロースフィルタ ーへと移される。発現した蛋白は、³²ｐ−放射標識ＧＳＴ融合蛋白又はＧＳＴに 対するＭＡｂにより検出可能な非標識ＧＳＴ融合蛋白を使用して、ＩＧＦ−ＩＲ Ｃ末端相互作用についてプローブされる。別法として、細胞溶解産物から相互作 用蛋白を捕捉するために、ＧＳＴ融合物はグルタチオン（ＧＳＨ）−アガロース カラムに固定される。ＩＧＦ−１による刺激を受け又は受けずに、安定にＩＧＦ − ＩＲを発現するＦＬ５．１２細胞の細胞溶解産物は、カラムに通され、続いて洗 浄される。カラムに結合し残留している相互作用蛋白は、遊離のＧＳＨを使用し てＧＳＴ融合蛋白とともに、又はＧＳＴ融合蛋白なしで塩、ｐＨ、グアニジンＨ Ｃｌ又は界面活性剤グラジエントを使用して、共溶出することができる。相互作 用蛋白は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により、又はヨウ素化、ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって、分析される。相互作用蛋白の同定 は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、バンドの切除及びＮ末端のマイクロシーケンシン グによって行われる。必要ならば、対象とする蛋白をコードする遺伝子は、Ｎ末 端配列に対応する放射標識ＤＮＡプローブによって、ｃＤＮＡライブラリーのス クリーニングによってクローン化される。 本発明の相互作用蛋白を同定する他の典型的な方法は、ＩＧＦ−ＩＲの機能に 伴う及び／又は必要とされる、キナーゼ、ホスファターゼ又はプロテアーゼ活性 のような、酵素活性を測定することである。そのような蛋白はレセプターとは直 接結合しないか又は強固には結合せず、上記のスクリーンでは見逃されるかもし れない。もしホスファターゼ又はキナーゼがＩＧＦ−ＩＲ Ｃ末端の変異種又は ｗｔバージョンに対して導かれるなら、この活性は、例えばＦＬ５．１２／ＩＧ Ｆ−ＩＲ細胞からの溶解産物、及びキナーゼ又はホスファターゼ活性の基質であ るＩＧＦ−ＩＲの断片によって、試験管内で検出され得る。本発明のこの側面に よれば、試験管内でのキナーゼアッセイは、１０ｍＭのＭｎＣｌ₂及び１μＭの 冷ＡＴＰを含む１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液中で、³²ｐ−標識ＡＴＰの存在下に、Ｃ Ｆ蛋白又はその断片によってＦＬ５．１２／ＩＧＦ−IR細胞溶解産物をインキュ ベートすることによって行われる。ホスファターゼ活性は、細胞から免疫沈澱さ れたリン酸化ＩＧＦ−ＩＲ又はその断片を用いて、分画したＦＬ５．１２／ＩＧ Ｆ−ＩＲ細胞溶解産物をインキュベートし、脱リン酸化ＩＧＦ−ＩＲに対する細 胞溶解産物の能力を追跡することによって検出される。ＩＧＦ−ＩＲの領域に特 異的な細胞溶解産物中の酵素活性同定は、例えば“Protein purification:Princ iples and Practice,”by Robert Scopes(Ed:C.Cantor,Springer Verlag,Heidel berg,1982)に記載されているような、標準的な生化学的方法によって、この活性 の原因となる蛋白の更なる単離、精製及びシーケンシングを可能とする。 本発明の活性生存ドメイン蛋白に対する抗体は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを スクリーンし、蛋白の活性生存ドメインファミリーのメンバーであり得る、構造 的に関連し免疫交差反応性の蛋白をコードするｃＤＮＡインサートを含むクロー ンの同定するのに使用し得る。ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ発現ライブラリーのスクリ ーニングは、この分野で公知である。同様に、活性生存ドメインペプチドに対す る抗体は、このドメインに関連する免疫交差反応性の蛋白を同定又は精製し、も しくは細胞又は細胞母集団中、例えば患者から得られた腫瘍細胞又はリンパ球の ような組織又は細胞中の、活性生存ドメインを含む蛋白の量を検出又は測定する のに使用される。そのような測定のための公知の方法は、細胞抽出物の免疫沈澱 と引続くＰＡＧＥ、免疫組織化学法によるインシチュー検出及びＥＬＩＳＡ法を 含み、これらはすべてこの分野で周知である。 本発明によるアポトーシスの調整は、ここに開示されているように活性生存ド メイン機能を調整する薬剤をコードするヌクレオチド配列の全部又は一部に対し て相補的な特異的アンチセンスポリヌクレオチドを採用する方法を含む。そのよ うな相補アンチセンスポリヌクレオチドは、標的配列に対する特異的なハイブリ ダイゼーションが維持されるという条件下に、ヌクレオチドの付加、欠失、置換 及び転移を含んでもよい。本発明による薬剤をコードするｍＲＮＡ種に対して特 異的にハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡ種の転写及び／又はコードされ たポリペプチドの翻訳を阻止する、可溶性アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴ ヌクレオチドは、本発明による相補アンチセンスポリヌクレオチドであると意図 されている。ここで意図された蛋白薬剤の生産は、本発明のアンチセンスポリヌ クレオチドにより阻害され、そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、アポ トーシス、老化等を阻害し、及び／又は細胞の形質転換された表現型を逆転させ 得る。異質の発現カセットが、トランスフェクト化物又はトランスジェニック細 胞中でアンセヤンスポリヌクレオチドを生産するのに使用され得る。アンチセン スポリヌクレオチドはまた、試験管内の細胞培養液や生体内の介在性液体（例、 循環系経由）のような、標的細胞の外部環境に対して可溶性オリゴヌクレオチド として投与され得る。アンチセンスポリヌクレオチドとその使用は、当業者には 公知であり、例えばMelton,D.A.,Ed.,Antisense RNA and DNA,Cold Spring Har bor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1988)に記載されている。 活性生存ドメイン擬症薬剤は、ガン及びウイルス性疾患の治療処置に有用であ る。活性生存ドメインペプチドのペプチド擬症体(peptidomimetics)もまた本発 明によって提供され、例えば個々の活性生存ドメインを含む蛋白、好ましくはＩ ＧＦ−ＩＲの機能をブロックすることによって、アポトーシスを調整する薬剤と して利用できる。ペプチド擬症体は、製薬産業では、模倣されたペプチドの性状 と類似した性状を有する非ペプチド薬剤を含むものと一般に理解されている。ペ プチド擬症体デザインの原理と実行はこの分野で公知であり、例えばFauchere J .,Adv.Drug Res.15:29(1986);and Evans,et al.,J.Med.Chem.30:1229(1987)に記 載されている。治療的に有用なペプチドと構造上類似したペプチド擬症体は、等 しい治療上又は予防上の効果を奏するものとして使用され得る。典型的には、そ のようなペプチド擬症体は、生体内での化学的損傷に対する耐性のような望まし い性状を変化させる結合によって任意に置換される１種又はそれ以上のペプチド 結合を有する。そのような結合は、−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂−Ｃ Ｈ₂−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−及び−ＣＨ₂Ｓ Ｏ−を含み得る。ペプチド擬症体は、その治療上の使用を特に望ましいものとす る、高められた薬理学的性状（生理学的半減期、吸収速度等）、異なる特異性、 増加した安定性、生産経済性、減少した抗原性等を示し得る。 本発明を、例えば、その抗原性状を考慮して免疫化学的又は他の技術手段によ って、組織／器官の切除から得た分画中で、活性生存ドメインを含む蛋白（又は それに対して特異的な抗体）の検出又は測定に採用することは可能である。これ は、例えば組織バイオプシーや、限定されるものではないが免疫組織化学でのパ ラフィン包埋を含む、当業者に公知の他の組織化学処置の遂行に有用である。活 性生存ドメインを単独で、又は公知の方法でアジュバントと結合して含有するペ プチドによる動物の免疫化により、活性生存ドメインペプチドに特異的な抗体を 生産することができる。通常の方法により得られた抗血清はこの目的に使用し得 る。例えばウサギのようなほ乳動物は、活性生存ドメインを含むペプチドによっ て免疫化され、それによってそれに対するポリクローナル抗体の形成を誘発する 。モノクローナル抗体もまた公知の方法を使用して生産できる。これらの抗体は 、 本発明により活性生存ドメインを含むペプチドの存在及び量を測定するのに使用 できる。 活性生存ドメインを含むペプチドの正確な化学構造は多数の要素に依存して変 化するであろうことは、当業者には理解されるであろう。例えば、或る蛋白は、 分子中にイオン化可能なカルボキシル及びアミノ基を有するので、酸性又は塩基 性の塩、もしくは中性の形で得られるであろう。したがって、本発明の目的に対 しては、天然に生じるペプチドの治療又は診断上の活性を維持する活性生存ドメ インを含むペプチドのあらゆる形態が本発明の範囲に入るものと意図されている 。 本発明の活性生存ドメインペプチド及び他の組成物は、この技術分野で公知の 組換えＤＮＡ技術により生産できる。例えば、本発明の活性生存ドメインペプチ ドをコードするヌクレオチド配列は、プラスミドのような適当なベクター中に挿 入され、該ベクターが適当なホストを形質転換するのに使用される。組換え活性 生存ドメインペプチドは、該ホスト中で発現することによって生産される。形質 転換されたホストは、原核生物又は真核生物の細胞であり得る。活性生存ドメイ ンをコードするこの目的に好適なヌクレチオド配列は、図３に示されているよう に１２２９−１３３７、Ｙ１２５１及びＨ１２９３／Ｋ１２９４である。 活性生存ドメインを含むペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ハイブリ ダイゼーションスクリーニング法を含む通常の方法によって、クローンライブラ リーから単離されたゲノムの又はｃＤＮＡであり得る。別法として、オリゴヌク レチオドの合成法として公知の化学合成法によって、合成ポリヌクレオチド配列 を構築してもよい。そのような合成法は、例えばBlackburn,G.M.and Gait,M.J., Eds.,Nucleic,Acids in Chemistry and Biology,IRL Press Oxford,England(199 0)に記載されている。また、製造業者の指示に従って、商業的に入手可能なオリ ゴヌクレオチド合成機を使用できることも明らかであろう。製造業者の１つとし てアプライド バイオシステムズがある。 ここで開示されたヌクレオチド配列データに基づいたプライマーを使用するポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ｍＲＮＡのプール、ｃＤＮＡクローンライブ ラリー又はゲノムＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅するのに使用できる。ＰＣＲヌク レチオド増幅法はこの分野で公知であり、例えば、Erlich,H.A.,Ed.,PCR Techn- ology:Principles and APPlications for DNA Amplification ， Stockton ress， New York,New York(1989):米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８ ００，１５９号；及び米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。種々 の欠失、付加及び置換は、当業者に認識されるように本発明のポリヌクレオチド 中に導入することができる。また当業者は、活性生存ドメインペプチドをコード するヌクレオチド配列中には、例えば対立遺伝子多型、マイナーな配列エラー等 の結果として、変化が起こり得ることを認識するだろう。本発明の活性生存ドメ インペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーション プローブ及びＰＣＲプライマーとして有用である短いオリゴヌクレオチドを含み 得る。本発明のポリヌクレオチド配列はまた、より大きなポリヌクレオチドの部 分を含むことができ、それらはポリヌクレオチド結合を通じて、異なる蛋白をコ ードする１種又はそれ以上のポリヌクレオチド配列と構造中に融合され得る。こ の点で、発現蛋白は融合蛋白を含み得る。勿論、本発明のポリヌクレオチド配列 は、病気の診断や法医学分析で、活性生存ドメインペプチドをコードするｍＲＮ Ａの存在を検出するために、ＰＣＲ法に使用できる。 活性生存ドメイン（又はそのようなドメインを含む蛋白）と相互作用する蛋白 をコードするｃＤＮＡは、公知の方法を使用する、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの スクリーニングにより同定することができる。そのような方法の例としては、イ ースト２−ハイブリッド系(Chien,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci 88:9578(1991)). 及びE.coli/BCCP相互作用スクリーニング系(Germino,et al.,Proc.Natl.Acad.Sc i.90:1639(1993))が挙げられる。適当なｃＤＮＡライブラリーは、人、マウス又 はラットのようなほ乳動物のｃＤＮＡライブラリーを含み、それらは、この分野 で公知の通り、ＲＮＡ及び単独の細胞、組織又は器官型又は発達段階から生産さ れるｃＤＮＡを含み得る。 活性生存ドメインを含む蛋白又はペプチドをコードするヌクレオチド配列は、 結合用の平滑末端又は付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、付 着末端の充足による適切化、望ましくない接合を防止するためのアルカリホスフ ァターゼ処理及び適切なリガーゼによる結合を含む、通常の技術にしたがってＤ ＮＡベクター中に挿入される。これらの操作技術は、例えば上記Sambrookらによ り開示されており、この分野では周知である。 活性生存ドメインを含む蛋白又はペプチド中のアミノ酸残基の配列は、一般に 採用されている三文字表記又は一文字表記によってここに示されている。これら の三文字又は一文字表記は、Lehninger,A.,Biochemistry,2d Ed,Worth Publishe r s,New York,New York(1975)のような教科書に記載されている。アミノ酸配列 を水平方向に記載した場合には、アミノ末端は左側末端を意味し、一方カルボキ シ末端は右側末端を意味する。ペプチド中のアミノ酸残基は、ハイフォンで分離 してもよい。これらのハイフォンは単に配列の表記を容易にするためのものであ る。 モデル化した（又は実験的に決定した）ペプチド構造に基づいた、活性生存ド メイン擬症体又は結合分子の理論的デザインは、公知の理論的医薬デザイン法を 使用して、当業者が実施できるであろう。自己免疫疾患、神経変性疾患、ガン等 の病的状態を処置する治療又は予防法は、活性生存ドメイン機能を特異的に変化 させ、それによって患者の蛋白を含む活性生存ドメインの生物学的活性とアポト ーシス状態を調整することができる治療薬の有効量を投与することによって行わ れる。 ここに開示された、活性生存ドメインを含む切断ＩＧＦ−ＩＲ分子及び「最小 の」活性生存ドメインを構成する他の小さいペプチド誘導体は、野生型ＩＧＦ− ＩＲにより示されるアポトーシス調整機能を維持することが証明された。これら の分子やペプチド擬症誘導体は、ＩＧＦ−ＩＲにより生じるのと同じ生物学的シ グナルを与えることによって、細胞中のアポトーシスを予防し得る。それらの薬 剤は、標的細胞のアポトーシス状態に影響を与えることができる治療薬の新規な クラスを含む。 細胞膜を通過し標的細胞中へ治療薬を送達する結果となるどのような投与形態 も、本発明の範囲内にあるものと意図されている。投与部位と細胞は、処置され る個々の変性疾患についての理解に基づいて、当業者によって選択されるであろ う。さらに、用量、投与頻度及び処置期間は、処置される個々の変性疾患に依存 して、当業者によって決定され最適化され得る。個別の投与形態は当業者によっ て容易に選択することができ、そして治療薬が細胞膜を通過するという要求を満 たすように、例えば、経口、静脈内、皮下、筋内等を含むものである。医薬用量 と医薬送達の原理は公知であり、例えば、Ansel,H.C.and Popovich,N.G.,Pharma ceutical Dosae Forms and Drug Deliver Sstems, 5th Ed,Lea & Febiger,Pub.,P hiladelphia,PA(1990)に記載されている。例えば、本発明の薬剤を特異的に送達 するためにリポソームを使用することは可能である。該リポソームは、標的部位 で作用するであろう医薬、ラジオアイソトープ、レクチン及びトキシンのような 追加の生物活性化合物等を含むように、生産することができる。 本発明による使用に好適な薬剤は、活性生存ドメインペプチド及び擬症体、断 片、機能的等価物及び／又はハイブリッド又はその変異体、並びに変異体及び前 記のもののいずれかをコードするｃＤＮＡを含むベクターを包含する。薬剤は単 独で、又は組合わせて、及び／又は同時に他の適当な医薬及び／又は治療処置と ともに投与することができる。 本発明の薬剤は、不適切な細胞増殖又は不適切な細胞死、もしくはある場合に はその両者により特徴づけられる疾患を含む、変性疾患の処置用に好適である。 不適切な細胞増殖は、正常な母集団における当該細胞型の増殖に比較して、統計 的に有意な細胞数の増加を含むだろう。また、例えば急性肺障害後の肺組織中で の線維芽細胞の存在のように、細胞が不適切な位置に存在及び／又は持続する疾 患も含まれる。例えば、それらの細胞は、侵入及び転移性を示し高度に退生であ るガン細胞を含む。それらの細胞は限定するわけではないが、例えば腫瘍細胞を 含むガン細胞を包含する。不適切な細胞死は、正常な母集団における当該細胞型 の存在に比較して、統計的に有意な細胞数の減少を含むだろう。そのような存在 不足は、例えば不適切なＴ−細胞の死をもたらすエイズ（ＨＩＶ）及び不適切な 細胞死により特徴づけられる自己免疫疾患を含む個々の変性疾患によるものであ り得る。自己免疫疾患は、自己抗原に対して向けられた免疫応答により引起こさ れる疾患である。それらの疾患は、循環する自己抗体の存在、又は自己抗原を含 む組織中の免疫学的反応性細胞又は免疫複合体により引起こされる炎症障害に関 連した自己抗原に対する細胞仲介免疫によって特徴づけられる。該疾患は全身性 エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎を含む。 免疫学の一般的原理を記載した標準的参照刊行物としては、Stites,D.P.,and Terr,A.I.,Basic and Clinical Immunology,7th Ed.,Appleton & Lange,Publ.,N orwalk,CT(1991);及びAbbas,A.K.,et al.,Cellular and Molecular Immunology, W.B.Saunders Co.,Publ.,Philadelphia,PA(1991)．が挙げられる。 ここで記載された活性生存ドメインペプチド、擬症体、薬剤等、ならびにそれ ら又はそれらの対応するアンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列を含む ベクター及び該ベクターを含むホストは、疾病の処置用医薬の製造に使用できる であろう。 活性生存ドメインを含む蛋白をコードする、１種又はそれ以上の機能的に損な われた対立遺伝子を有する細胞及び非ヒトトランスジェニック動物は、活性生存 ドメインを含むプロテインのゲノムのクローンから得られた同族体標的構造物を 使用して創生することができる。同族体標的構造物の生産方法は公知であり、例 えばBradley,et al.,Bio/Technology 10:534(1992);及びKoh,et al.,Science256 :1210(1992)に記載されている。例えば、「ノック−アウト」マウスはＩＧＦ− ＩＲ又は活性生存ドメインを含む他の蛋白の不活性化対立遺伝子に対してホモジ ガス又はヘテロジガスであり同族体標的法を使用して創生される。該マウスは疾 病の研究用又は他の用途の研究対象として有用である。キメラ標的マウスの生産 方法は公知であり、例えばRobertson,E,J.,Ed.,Teratocarcinomas and Embryoni c Stem Cells:A Practical Approach ,IRL Press,Washington,D.C.(1987)に記載 されており、それには胚幹細胞の操作法も記載されている。さらに、活性生存ド メインを含むポリペプチドを高レベル又は選択された転写制御配列の制御下に発 現するための導入遺伝子は、該ｃＤＮＡ又は活性生存ドメインを含む蛋白のゲノ ム遺伝子を使用して構築し得る。構築された導入遺伝子は、公知の方法で細胞及 びトランスジェニック非ヒト動物中に導入できる。これらのトランスジェニック 細胞及びトランスジェニック非ヒト動物は、アポトーシスを調整する薬剤のスク リーンに使用し得る。 本発明は、限定ではなく説明のために提供された、以下の実施例を参照するこ とのよって、さらに理解されるであろう。 実施例 発現プラスミド： この研究において使われている野生型ＩＧＦ−ＩＲと全ての変異型を含むＰＢ ＶＩＧＦ−ＩＲの創生は既に発表されている(Kato et al.,1993,Miura et al.,1 995,Li et al.,1994.Miura et al.,1995b,Li et al.,submitted,Hongo et al.,s ubmitted,Surmacz,et al.,1995)。これらのＩＧＦ−ＩＲｃＤＮＡ構造はあるシ ャトルベクターＳＫ−ＩＧＦ−ＩＲ(pBluescriptSK中にクローンされたＩＧＦ− ＩＲｃＤＮＡ)(Stratagene,La Jolla,CA)からＳａｌＩとＸｂａＩで消化される ことで放出され、pcＤＮＡ３(Invitrogen,San Diego,CA)のＸｈｏＩとＸｂａＩ 部位でサブクローニングされた。そのＩＧＦ−ＩＲのアミノ酸の番号付はUllric hらにより提案されたものである。 ＩＧＦ−ＩＲを含むプラスミドのＦＬ５．１２細胞へのトランスフェクション ＦＬ５．１２細胞は１ｍＭのＬ−グルタミン、１０％牛胎児血清とＩＬ−３産 生するセルラインのＷＥＨＩ−３Ｂから１０％に条件設定された培地で補われた イスコブの調整培地（ＩＭＤＭ）中で維持された。細胞（５×１０⁶）は電気穿 孔法（２００Ｖ、９６０μＦ）又は４００ｎｇのＤＮＡを用いて、３．５時間で リポフェクトアミン(Gibco/BRL.Technologies.Inc.,Grand Island,NY)により、 ２０μｇのＤＮＡでトランスフェクトされた。細胞は、２４穴プレート中の１０ ％ＷＥＨＩＣＭで補われたＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ中に１×１０⁵／ｍＬ・（２ ｍＬ／穴）になるようにまかれた。最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＧ４１ ８(geneticin,Gibco/BRL Lifc Technologies Inc.)が４８時間後に加えられた。 培地は３〜４日毎に取りかえられ、そして出現した薬物耐性細胞は間接的免疫蛍 光法によりＩＧＦ−ＩＲ発現をスクリーンした。いくつかのセルラインは９６穴 プレートにおいて、限界希釈法でサブクローニングされた。ＦＬ５．１２／Ｂｃ １−２セルラインは継続中の、１９９４年８月９に出願された米国特許出願第０ ８／２８７，４２７号の一部継続出願である。１９９４年１０月１１日に出願さ れた米国特許出願第０８／３２１，０７１号に既に記載されており、これらの記 載内容は参照として本出願に包含される。 間接的免疫蛍光法 細胞（２×１０⁵）は９６穴丸底プレート中で、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓと１０ ％ヒト貯蓄ＡＢ血清を含むＩＭＤＭ中にけんだくされた。抗ＩＧＦ−ＩＲｍＡｂ （Ab-1,Oncogene Sciences,Cambridge,MA）は、最終用量１００μｌ中で最終濃 度が１ｕｇ／ｍＬになるように加えられ、２０℃で１時間培養された。細胞は３ 回洗浄され、マウスＩｇＧに対するヤギＩｇの蛍光標識された(Fab')₂フラグメ ントに４℃で３０分間さらされた。細胞はさらに２回洗浄され、細胞に結合した 蛍光はFACSCANフローサイトメーターを用いて計測された。 細胞周期解析 細胞ＤＮＡ含量はプロピシジウムイオダイドを使用し細胞ＤＮＡフロー血球計 算分析試薬セット（ベーリンガーマンハイム、インジアナポリス、ＩＬ）で染色 することにより測定した。ＩＧＦ−ＩＲ、ネオ、又はＢｃｌ−２でトランスフェ クトされたＦＬ５．１２セルラインはＩＭＤＭ５％ＦＢＳ中でＩＧＦ−Ｉ又はＷ ＥＨＩ ＣＭの存在又は非存在下に定められた時間培養された。ＤＮＡを染色し ている間、１０⁶細胞は除かれ、ＰＢＳで一度洗浄され、１０分間氷冷７０％エ タノール中に固定された。細胞はＰＢＳで２回洗浄され、１ｍｌのＰＢＳに再び けんだくされ３７℃で３０分間ＲＮＡｓｅで処理された。細胞は氷上で冷却され 、プロピシジウムイオダイドを加えられた。蛍光はＦＡＣＳＣＡＮですぐに測定 された。そのデータはＣｅｌｌＦｉｔソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて 分析された。 細胞生存力アッセイ： IL-3を含有する培地に24時間、細胞3x10₅/mLを入れ、血清を含まない培地で３ 回洗浄し、次いで24ウェルプレートで5%FBS(2ml/ウェル)を含有するIMDM中に5xl 0₅細胞/mLを入れた。IGF-I(50ng/mL)またはIL-3(WEHI CM，10%）を３回反復で培 地に加えた。示された時点で200μｌアリコートを各ウェルから除き、次いでト リパンブルー染色後、生細胞と死細胞を計数することにより生存力を求めた。ウ ェル当たりの細胞総数および各条件についての３回反復の全てのデータの平均％ から生存能力のある細胞のパーセンテージを算出した。 IGF-IR B鎖断片構築体および改良体： IGF-IRまたはその断片の細胞質ドメインをコードする一連のヌクレオチド配列 は全長IGF-IRからのPCR増幅によって構築した。各配列は3'末端で７個のアミノ 酸のフラッグ抗原性タグに関する配列(International Biotechnologies，Inc．N ew Haven，CT)で融合させた。第二のタイプとしては、また、各配列をミリスチル化 (My)および可能性ある膜の足場に関する部位として働くＮ末端へ融合させた16個 のアミノ酸のSRFをコードする配列と5'末端にて融合させた(Resh，1994 Cell 76 :411)。さらに、IGF-IR B鎖(MyBF)の全細胞質ドメインを包含する、またはキナ ーゼドメインおよびＣ末端(MyKCF)が含まれる構築体を作製した。免疫グロブリ ンκ軽鎖配列から誘導したCF(MyV4BKF)およびIGF-IRキナーゼドメイン(MyKC20) から誘導した断片と同サイズの断片を対照として作製した。 Myおよびフラッグタグ配列を含むタイプについて、含有されるIGF-IRアミノ酸 を示す種々のIGF-IR B鎖構築体を図６に示している。 また、Yl250/1251変異体、H1293F/K1294R変異体、S1280-1283A変異体を用いて 、またY1250F/1251FおよびH1293F/K1294Rでの突然変異を組み合わせてCFおよびM yCFを構築した。CF-NおよびMyCF-NもY1250F/1251F変異を用いて作出した。全て のＣ末端構築体は、その蛋白質の細胞内での一時的、構成的または誘導的発現の ための、またin vitro翻訳のための真核生物発現ベクターpcDNA3およびレトロウ イルスpBabeベクター内で発現させた。またそれらは原核生物グルタチオンS-ト ランスフェラーゼ遺伝子融合ベクターpGEX-2TK(Pharmacia，Uppsala．Sweden)中 へクローン化し、次いでGST融合蛋白質として発現させ、精製した。また、これ らいくつかの構築体をマイクロインジェクション研究および蛋白質相互作用研究 のためのチロシンでの修正を用いて、あるいは用いずにペプチドとして合成した 。 一過性トランスフェクトアッセイ： ２種の細胞系統を用いて、CFおよびMyCF構築体を一過性トランスフェクトアッ セイによる機能に関して試験した：胸部癌細胞系統MCF-7およびIGF-IRヌルマウ スから誘導し、ヒトIGF-IRでトランスフェクトした繊維芽細胞であるR+細胞(Sel lら，1994)。一過性トランスフェクションは従前に記載したごとくに行った(Miu raら，1993)。24ウェルプレートの10%FBSを含有するダルベッコの修正必須培地( DMEM)中に18時間、4x10₄細胞／ウェルの細胞を入れた。Ｃ末端断片発現プラスミ ド(400ng)またはpcDNA3ベクター単独を、リポフェクタミン法(Gibco/BRL，Life Technologies)によりβ−ガラクトシダーゼを含有するマーカープラスミド(160n g)でトランスフェクトした。トランスフェクション後４時間で、該細胞に10%FBS 、または IGF-I(50ng/mL)を含有する培地を加え、24または48時間インキュベーションを継 続した。次いで細胞を固定し、X-galで染色してプラスミドを受容した細胞中の β−ガラクトシダーゼを検出した。青色の細胞数を顕微鏡観察により計数し、生 （平らな青色細胞）または死（丸い青色細胞）として評価した。また、このアッ セイにおける細胞死滅は得られた青色細胞の数の減少によって明らかにする(Chi ttendenら，1995)。、トランスフェクトは全て３回反復して行い、データは３回 の培養の平均および標準偏差で示した。 IGF-IはwtIGF-IRで安定してトランスフェクトされたFL5.12でのアポトーシスを 阻害する： FL5.12細胞はネズミBリンパ芽球腫から誘導し、これは培養中の増殖および生 存に関するIL-3に依存する。IGF-I/IGF-RI対のIL-3の投与中止により誘導される アポトーシスを阻害する能力を試験するため、CMVエンハンサー／プロモーター の制御下にあるプロモーターを含有するヒトIGF-IRでFL5.12細胞をトランスフェ クトした。IGF-IRを発現する細胞は、抗−IGF-IR mAb(Ab-1)を用いた間接的免疫 蛍光染色により選択した。FACS分析により異なるレベルでIGF-IRを発現する細胞 を選別し、通常条件下で培養した。興味深いことに、１週間後、あるいはかかる 培養中、より発現の低い細胞についてのIGF−IRのレベルは、全てのクローンが 同等レベルを発現するまでに増加した（図３）。次いで、5%FBS、または5%FBS+I GF-Iを含有する培地の存在下で、FL5.12/IGF-IR細胞をIL-3投与中止に際するそ れらの生存能力に関して分析した。新生発現細胞は、IL-3の投与中止（図１Ａ） および最小生存結果をもたらすIGF-Iに対して、恐らくは内生IGF-IRのレベルが 低いために急速に死滅した。FL5.12/IGF-IR細胞は、新生細胞と比較して5%FBS単 独の存在下でより高い生存力を示し、また、IGF-Iの存在下で、これらの細胞は 該アッセイの期間にわたってIL-3の存在下におけるそれに匹敵する生存力を示し た（図１Ｂ）。FBSの生存シグナルは恐らくはFBS中に存在するIGF-IまたはIGF-I Iにより提供される。FL5.12/IGF-IR細胞におけるIGF-I保護効果は、IL-3の投与 中止に対してFL5.12細胞でのBcl-2過剰発現によって提供される抗アポトーシス シグナルと同等の大きさのものである。IL-3の投与中止の対するBcl-2保護につ いては、FL5.12/新生細胞と比較して図１Ｃに示されている。 FL5.12細胞でIGF-Iは増殖シグナルではなく生存シグナルを提供する 次に発明者らは、IGF-IがFL5.12細胞に対する分裂促進因子としてIL-3と置き 換えられるかどうか、またはそれが抗アポトーシスシグナルだけを提供するかど うかを検討した。FL5.12/IGF-IR細胞の増殖は、生存アッセイのために用いたも のと同濃度のIGF-IまたはIL-3の存在下で、1x10⁵細胞/mLで植え付けた培養物中 の細胞総数を計数することにより測定した。IGF-I中の細胞は、IL-3の存在下で 植え付け細胞に比べ、IGF-Iの存在下での細胞数の顕著な増加は示さなかった（ 図１Ｄ）。前記アッセイ条件で維持したFL5.12/IGF-IR細胞の細胞サイクル分布 を求めるため、ヨウ化プロピジウムによりＤＮＡ含量を分析した（図２）。細胞 サイクルの各ステージにおける細胞のパーセンテージを前記ヒストグラムピーク に示している。IL-3の投与中止24時間に、IGF-Iの存在下のFL5.12/IGF-IR細胞は Ｓ期からＧ２／Ｍ期へと進行するが、新たにＳ期に入る細胞は認められないこと を示している（図２Ａ）。48時間までに、87%の細胞がＧ₀／Ｇ₁期にあり、Ｓま たはＧ₂／Ｍ期にある細胞は10%に満たない（図２Ｂ）。48時間におけるFL5.12/I GF-IR細胞は、IL-3なしで培養されたFL5.12/Bcl-2細胞の48時間におけるそれと 同様の分布を有する（図２Ｃ）。これは、48時間におけるIL-3の存在下で培養さ れたFL5.12/IGF-IR細胞との比較であり、それらは細胞サイクルのあらゆるステ ージを通じて分布している。全体的に見て、細胞死がIL-3の投与中断により誘導 される場合、これら２つのアッセイはFL5.12細胞中のIGF-IRの発現の結果、分裂 促進因子の刺激によってではなく、抗アポトーシス刺激でIGF-Iに応答する細胞 が生じることを示す。FL5.12細胞におけるIGF-IRの点突然変異の発現およびそれ らのIL-3の投与中止からのFL5.12細胞を保護する能力の分析 発明者らはIGF-IRの特定ドメインがIGF-Iの抗アポトーシス効果を仲介する任 を負うかどうかを調べた。発明者らは特に抗アポトーシスシグナルが、その形質 転換機能または増殖機能に必要とされることが従前に示された領域とは異なる受 容体の領域によって仲介されるかどうかを調べることに興味を持った。IGF-IRに おける種々の突然変異の位置を図３に示している。突然変異を含むIGF-IRの構築 体をFL5.12細胞中へトランスフェクトし、mAb Ab-1を用いた間接的免疫蛍光分析 によってこれらの受容体を発現するクローンを選択した。図４Ａに示されたほぼ 同 等レベルに該変異受容体を発現する細胞を選抜し、IGF-IのIL-3の投与中止によ って誘導されたアポトーシスを阻害する能力に関する生存アッセイで分析した。 図１でwt IGF-IRに関して記載されたものと類似の方法にて、該培養物の生存力 を７2時間にわたってモニターした。全てのIGF-IR変異体データに関する生存デ ータを、表Ｉにまとめた。そこでは、それらは該変異体の増殖機能および形質転 換機能に関して公表された結果と比較されている。 チロシン950はIRS-1およびSHCとの結合に必要とされるので、変異型Y950F(Miu raら，1995a)をFL5.12細胞における生存機能に関して試験した(Gustafsonら，19 95，Tartate-Deckertら，1995)。Y950F発現細胞は、wt IGF-IRを発現するFL5.12 細胞のそれに全く匹敵するIGF-I存在下での生存を示した（図４Ｂ）。このこと はこのチロシン950を介したIRS-1またはSHCとの相互作用がIGF-IRのアポトーシ ス阻害に必要とされないことを示唆するものである。 キナーゼドメイン機能に対する要求を評価するため、キナーゼドメインにおけ る２つの突然変異を試験した：一方はATP結合リシン残基、K1003Rにおけるもの( Katoら，1993)、他方はその３つのチロシン残基1131、1135および1136がフェニ ルアラニンに変異しているチロシンクラスターにおけるもの(Liら，1994)。リシ ンK1003で変異した受容体を発現するFL5.12細胞が備えていたIL-3投与中止から のIGF-Iにより仲介される保護は無視できるものであった（図４Ｂ）。該チロシ ンクラスター変異体は48時間で、K1003R変異体での生存力を維持する細胞20%に 比べ、65%と、良好なIGF-I保護効果を示す。しかしながら、72時間では、この効 果は生存力18%までかなり低下する。この変異体は繊維芽細胞において増殖能力 または形質転換能力を全く持たないことが示されている(Liら，1994)が、wtまた はY950F受容体により提供されたものに比べた場合に低下してはいるが、それは 明らかに抗アポトーシス機能を示している。 IGF-IRのＣ末端に変異を有する５つの変異体を分析した。チロシン1250および 1251を単独でまたはフェニルアラニンと共に変異させた(Miuraら，1995b)。Y125 0F受容体を発現する細胞は、wt受容体により提供されるそれと同レベルで、IL-3 投与中断からのIGF-I仲介保護を示した（表Ｉ）。これに対し、Y1251F変異また はY1250F/1251F二重変異を発現する細胞はIL-3投与中止からのIGF-I保護をかな り低 下させ、その効果は二重変異体でより強く示された（図４Ｂ）。このことはY125 1が生存機能に必要とされないことを示している。 1280-1283の４つのセリン全てをアラニンに置換することにより得られた変異 体は従前に形質転換機能を持たないことが示されており、IGF-Iにより仲介され る生存を維持した受容体を提供した（図４Ｂ）。変異型H1293F/K1294RはIL-3投 与中止における生存シグナルを集会することができなかった（図４Ｂ）。この変 異体は塩基性残基の８個のアミノ酸鎖の開始部位に位置する２つのアミノ酸、す なわちインスリン受容体を分かち合えない配列を置換している。生存曲線（図４ Ｂ）は48時間でおよそ30%の生存が維持され、72時間でゼロまで低下することを 示している。このことはこれらの残基がIGF-IRにより仲介されるアポトーシス阻 害の一因となっていることを示唆している。Ｃ末端において分析される最後の点 突然変異体はY1316Fであった。この変異体は、それがIL-3投与中止からの保護を 維持した仲介効果を備えていたが、その保護程度はwt受容体のそれから著しく低 下していた。 全体的に見て、FL5.12細胞におけるＣ末端変異体の分析は、アポトーシスに必 要なドメインが形質転換に必要なドメインとは別のものではあるが、部分的に重 複していることを示唆している。 FL5.12細胞におけるIGF-IRの切断変異体の発現およびそれらのIL-3投与中止から 保護する能力の分析 IGF-IRの一連のＣ末端切断変異体も、IL-3投与中止からFL5.12細胞を保護する 能力に関して、FL5.12細胞で発現させた。変異体をキナーゼドメイン(1229d)の すぐ後ろで、Y1251残基のアミノ酸６個手前で(1245d)、およびH1293/K1294残基 の直前(1293d)で切断した。切断受容体1229dおよび1245dは、他の全ての変異体 またはwt受容体より定レベルで発現させる（図５Ａと図５Ｂを比較のこと）。前 記したごとくに、IGF-Iにより仲介されるアポトーシスからの保護のレベルはwt IGF-IRに対する受容体の発現レベルと相関している。トランスフェクションまた はサブクローニングによる1229dおよび1245d変異体のより高レベルの発現を得る 努力は成功しなかった。しかしながら、各切断受容体を発現するFL5.12細胞のい くつかのクローンはIGF-Iにより仲介されるIL-3投与中止からの保護に関して分 析された。 IL-3投与中止アッセイは前記したごとくに行い、その生存曲線は図５に示され ている。３つの切断受容体は全て、IGF-Iにより仲介されるIL-3投与中からの保 護を示した。これは、それぞれ1245dおよび1293d IGF-IRの欠失部分内に位置し 、アポトーシス阻害に必要とされると考えられるY1251FおよびH1293F/K1294R点 突然変異体を用いた前記結果の観点からは予期されない結果であった（図５）。 興味深いことに、前記で分析されたwtまたは点突然変異体を発現する細胞に比べ 、IGF-IRのレベルが極めて低いことにより特徴付けられる1229dおよび1245d変異 体を発現する細胞は、受容体変異Y1250Fまたはチロシンクラスター変異体を発現 する細胞より、5%FBS単独中での細胞死が少なく、より高いIL-3からのIGF-I保護 を示す。従って、切断変異型1229dおよび1245dはwt IGF-IRに比べ抗アポトーシ ス機能を向上させたと考えられる。 表Ｉ IGF-IR変異体の分裂促進、形質転換および抗アポトーシス機能の要約 _a参照文献から導いたデータ(Coppolaら，1994，Liら，1994，Surtnaczら，1995, Miuraら，1995aおよびb．Hongoら，1996，Liら，submined)_b FL5.12細胞を用いたIL-3投与中止におけるIGF-IR変異体によって与えられたIGF -Iにより仲介される保護から要約したデータ 一時的に細胞内へトランスフェクトした場合、IGF-IRのＣ末端断片には細胞毒性 がある： 前記結果は、IGF-IRがＣ末端で切断された場合、抗アポトーシス機能を促進す ることを示しており、このことは該Ｃ末端がIGF-Iにより仲介される生存に対す る調節的役割もしくは阻害効果を有することを示唆している。この可能性を更に 検討するために、７個のアミノ酸フラッグタグをコードするＤＮＡに融合させた Ｃ末端のＤＮＡ断片をIGF-IRからPCR増幅し、細胞へのトランスフェクションの ためのpcDNA-3発現プラスミドへクローン化した。機能のための、膜の足場要求 に関する潜在的な要求を容易にするために、ミリスチル化のための部位をコード するSRC由来の15個のアミノ酸配列をCF断片のＮ末端に付加した(MyCF)。第三の 断片は、キナーゼドメイン(MyKCF)を含んでいた。これらの構築体を、β−ガラ クトシダーゼをコードするマーカープラスミドと共にMCF-7細胞およびR+細胞中 に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間および48時間 に、該細胞をX-galで染色し、顕微鏡観察により青色の細胞数を計数し、生死を 評価した。トランスフェクション後48時間で、IGF-I存在下で培養されたMCF-7細 胞のデータは図７に示してあり、MyCF断片のトランスフェクションは、pcDNA-3 ベクター単独を用いたトランスフェクションもしくはCFおよびMyKCF含有ベクタ ーを用いたトランスフェクションより、生存細胞数が75%少ない結果となった。 このことは、該MCF-7細胞への毒性を示しており、さらに、この毒性を誘起する ためにはＣ末端断片が膜に足場をつくる必要があることを示唆している。これら の蛋白質の細胞内での発現を確立させるために、トランスフェクト後24時間にMC F-7細胞由来の抗フラッグタグmAb用いて免疫沈降を行い、次いで同抗体を用いる ウエスタンブロッティング法により検出した。CFおよびMyCFは、図７Ｂに見るこ とができる。これらの条件下で、-50KDにおいて該MyKCFはIgと共に移動し、検出 できなかった。トランスフ ェクション後、その細胞がFBSまたはIGF-Iの存在下で培養されるR+細胞における 一時的トランスフェクションの結果は図８に示されている。MyCFは、その細胞が FBSまたはIGF-I何れかの存在下で培養された場合に毒性を示したが、CFはIGF-I 存在下で培養された細胞に対しては、より強い毒性を示す。このことは、CF断片 が生存のためにIGF-Iに依存する細胞を特異的に阻害することを示唆している。 全体的に見てこれらのデータは、IGF-IRのＣ末端が一時的に細胞へトランスフェ クトされた場合、細胞に対する直接的な細胞毒性作用を有していることを示して いる。 全長MyCF分子と比べ、MyKC20、MyCF-N、MyCF-mid、およびMyCF-Nを用いた同様 の一時的トランスフクションアッセイでは、MyCF-N断片が親MyCF断片とほとんど 同じ毒性を有することが示された。これに対し、MyCF-midおよびMyF-C断片は全 長MyCF分子よりかなり低い毒性を持ち、またこの点では、MyKC20断片に対する毒 性に匹敵する（図９）。Y1250F/1251F突然変異を有するMyCF-N断片は、MyCF-Nに 比べてごくわずかながら毒性の逆転現象を有する。また、Y1250FY1251F、H1293F /K1294RまたはS1280-1283Aに突然変異を含む全長MyCFでの一時的トランスフェク ションでは、部分的な細胞毒性の逆転も認められた。２つもしくは３つのこれら 突然変異を一緒に含む構築体を作出する実験が、それらの期待される殺傷機能の 不活性化を確認するために進められている。 Ｃ末端断片の作用のメカニズムにはいくつかの可能性があり、Ｃ末端で切断さ れたIGF-IRが抗アポトーシス機能を促進させており、このことはこの機能におい てＣ末端が負の調節作用を有することを示唆している。該Ｃ末端は（フォスファ ターゼのごとき）蛋白質を組み込むか、またはそれと相互作用して、受容体の抗 −アポトーシス機能を弱める可能性がある。何れの特定の理論によって拘束され るつもりもないが、細胞におけるＣ末端断片の過剰発現の結果、組み込みの増加 もしくはこれらの負の調節分子の活性化が起こり、それにより内生の受容体の抗 アポトーシス機能の不活性化が起こる。Ｃ末端断片の細胞毒性作用のその他の可 能性としては、それらが結合して、正の抗アポトーシスシグナリング分子が内生 IGF-IRと相互作用することを防止することが含まれる。 R+細胞に一時的にトランスフェクトしたCFまたはMyCF断片の免疫沈降反応、そ れに続く、抗−ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングでは、こ れらの分子がチロシンにおいてリン酸化されたことを証明した。しかしながら、 リン酸化がそれらの作用に必要とされるどうかは現時点では判っていない。起こ り得るセリンのリン酸化およびこれら分子がキナーゼ活性、R+細胞中の内生IGF- IRSのチロシンもしくはセリンリン酸化に及ぼすであろう作用は、研究が現在進 行中である。それに加え、それらが内生IGF-IRもしくは他の蛋白質と相互作用を するかどうかを免疫沈降反応により検討する実験が現在進行中である。 細胞膜を通過するＣ末端蛋白質の輸送を容易にするために、それらをショウジ ョウバエホモドメインの第三ドメインに融合させた(Derossi，D．E．ら，1994， J.Biol．Chem．269:1044)。これらの構築体は(My)(SRC配列断片)、フラッグタグ およびショウジョウバエ(Ap)配列をクローニング領域に挿入することによるpGEX -2TKの修飾によって作出した。次いで、種々のIGF-IR断片に対する配列を(My)お よびフラッグに対する配列の間でクローン化した。得られたプラスミドは、GST がMy（Ｉ）Ｎ末端に融合し、かつApがフラッグのＣ末端に融合したＣ末端断片を 生産した。GSTおよび融合ドメインの間のリンカー領域は、トロンビン切断部位 および構成物の₃₂P標識のためのプロテインキナーゼA部位を包含する。かかるMy CFAp構築体は図１０に示してあり、当業者ならばこのテンプレートベクターを用 い、何れかのＤＮＡ配列を挿入して、My、フラッグまたはApを有する、または持 たない修飾蛋白質を便宜に生産することができる。 限定されるものではないが、その他のこれらの蛋白質の意図される修飾として は、ファルネシル化のためのCAAX配列のごとき異なる膜局在化配列、もしくはBc 1-2またはこのファミリーの他のメンバーのＣ末端由来の推定される膜局在化配 列の付加が挙げられる。GST-融合蛋白質のチロシンリン酸化は、ELK蛋白質由来 の誘導性蛋白質チロシンキナーゼを発現するイー・コリ(E.coli)株TKXI(Stratag ene)における発現により達成することができる(Letwin,Kら，1988 Oncogene3:62 1)。かかる融合蛋白質は、細胞への送達のため、もしくは相互作用蛋白質を精製 するためのアフィニティーカラムにおけるリガンドとして利用するために、モノ クローナル抗体または他の抗体に結合させることができた。また、ペプチドのGS T融合蛋白質も、アフィニティーカラムに使用することができた。また、種々の 精製蛋白質も、相互作用蛋白質の機能や細胞から免疫沈降させた全長IGF-IRに対 する効 果を測定するための、キナーゼおよびホスファターゼアッセイのごときin vitro アッセイのために有用である。 IGF-IRC末端に対するモノクローナル抗体の産生： そのＣ末端においてフラッグタグに融合したアミノ酸1225ないし1337から成る IGF-IRＣ末端断片(CF)を、原核生物GST融合ベクター中へクローン化し、その結 果、CFのＮ末端に融合したグルタチオンｓ−トランスフェラーゼ(GST)から成る 蛋白質が発現する。GST-CFは、GSHアフィニティークロマトグラフィーを用いて イー・コリ(E．coli)から精製した。８週齢のCAFI/Jマウスに30μｇのGST-CFのP BS溶液の腹腔内投与(IP)、追加免疫として４日目および６日目に50μｇのGST-CF 、およびさらに追加免疫として、１３日目および１７日目に２回の100μｇのGST -CFの静脈内投与を行い免疫感作させた。２０日目にマウスの脾臓細胞を骨髄腫 細胞株p3X63/AG8.653と融合させ、HAT培地中でハイブリドーマを選択し、制限希 釈法によりサブクローニングした。生存細胞からの上清をGSTとの、もしくはGST -CFとの反応性に関してELISAアッセイにかけた。GSTと反応しなかったものは、A b-1モノクローナル抗体を用いてFL5.12/IGF-IR細胞から免疫沈降させた内生天然 IGF-IRとの反応性に関するウエスタンブロットでさらに試験した。ハイブリドー マ上清もまた、F15.12/IGF-IR細胞からの細胞ライゼートに対して試験した。お よそ95KDにおけるバンドと反応することが判明したものを(PAGE還元条件下のIGF -IR Bサブユニット移動)さらにサブクローニングのために選抜した。これらの分 析のために、アミノ酸1347-1366に一致する合成ペプチドに対して構築された市 販のポリクローナル抗血清(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA)を、陽 性対照としてウエスタンブロットに用いた。CFに向けられたmAbsもまた、細胞か らの天然IGF-IRの免疫沈降物中のGST-CF蛋白質もしくはin vitro翻訳CF蛋白質の ウエスタンブロットで試験した。MyKC20構築体は、IGF-IRキナーゼドメインの一 部分と交差反応する抗体の陰性対照として用いられる。これらのモノクローナル 抗体のパネルは、現在整理中である。 CFのより小さい断片（CF-N、CF-mid、CF-C、CF29およびCF62）との、および変 異型CF断片(Y1250F/Y1251F、S1280-1283AおよびH1293F/K1294R)との反応性に関 して抗体を試験することにより、またGST融合として精製されたこれらの蛋白質 のウエ スタンブロッティング、もしくは一時的なトランスフェクションにより細胞内に 発現したこれらの構築体の抗フラッグタグ免疫沈降物のウエスタンブロッティン グによりCFmAbsのエピトープマッピングが行われている。これらの分析法により 、IGF-IRＣ末端抗体のどの部分が活性のある生存ドメインと反応しているのかが 決定され、また、活性のある生存ドメインと反応するモノクローナル抗体を同定 されるであろう。 CFの特異的領域と反応する抗体は、CFおよび内生IGF-IRもしくは相互作用蛋白 質を用いた生化学的研究におけるCF検出に有用である。また、これらの抗体は、 凍結またはパラフィン包埋組織切片を始めとする細胞および組織標本中のIGF-IR もしくはIGF-IRの活性生存ドメインの検出のための免疫組織化学的研究に有用で ある。抗-CF mAbsはまた、細胞中のCFもしくは内生IGF-IRの機能を変調するため のマイクロインジェクション法によっても試験される。生存ドメイン反応性mAbs は、細胞の生存を阻害もしくは活性化する可能性がある。 IGF-IRＣ末端断片は、卵巣癌細胞で安定して発現させた場合、in vitroで形質転 換を阻害し、かつin vivoでアポトーシスを誘導する 卵巣癌細胞系統CaOV-3をCF、MyCFまたはMyKCF構築体で安定してトランスフェ クトした。液体培地中での増殖は正常であった。細胞を軟性寒天中で単一細胞と して平板培養し、２週間増殖させた後、コロニーを計数した。 IGF-IRＣ末端断片を発現するCaoV-3細胞を生物拡散チャンバー中でインキュベ ートし(5xl0₅)、ウサギの皮下組織に移植した(Rescinoff，M.，ら，Cancer Res. 55:3739-3741(1995b))。24時間で、該チャンバーを取り除き、次いでその細胞を 回収し、計数した。データは植え付けた細胞のパーセンテージで示している。 表III in vivoにおける生物拡散チャンバー中のCaOV-3細胞の生存 CaOV-3細胞のCFおよびMyCF阻害のメカニズムが進行中の研究の課題である。何 れの特定の理論に拘束されるつもりもないが、可能性あるメカニズムとしては、 細胞がこれらのシグナルに依存する条件下で培養される場合、IGF-IRＣ末端シグ ナリングの特異的阻害が挙げられる。 酵母のツーハイブリッド分析によるIGF-IRＣ末端と相互作用する蛋白質の同定： IGF-IR細胞質ドメイン（アミノ酸931位で始まる）および突然変異Y950Fを含む 同一構築体を酵母ツーハイブリッドおとりベクタ−pAS2中へクローン化した(O'N eillら，1994 Mol．Cell Biol．14:6433)。このベクター中にクローン化した構 築体はGAL-4ＤＮＡ結合ドメインとへマグルチニン(HA)エピトープタグとの融合 蛋白質として発現する。変異したY950を持つIGF-IR細胞質領域を用いて、該おと りとの相互作用から既知の物質(IRS-1およびSHC)の相互作用を排除した。これら キナーゼドメイン含有構築体の双方は、抗−HAモノクローナル抗体を用いた免疫 沈降およびリンチロシンに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによっ て決定されたごとくに酵母で発現する場合、リン酸化され得る。それらのＣ末端 でフラッグタグ抗原性エピトープと融合させた（アミノ酸1225位で始まる）IGF- IRＣ末端断片(wtもしくはY1250/1251FまたはH1293F/K1294R突然変異を伴う）も 、pAS-2ベクター中へクローン化した。pAS-2ベクター構築体は全て図１Ｉに示し ている。 GAL 4活性化ドメイン配列を含むpGAD GHベクター中へクローン化したＢ細胞ラ イブラリーを、Y2H 950と相互作用する蛋白質に関してスクリーニングし、HERA 細胞ライブラリーはY2H CFおよびY2H CF 50/51おとりを用いてスクリーニングし た。これによりY2HCFと相互作用する２１個のHELA細胞ライブラリー由来クロー ンと、Y2HCF 50/51と相互作用する３１個のHELA細胞ライブラリー由来クローン が得られた。これらクロンの各々をベクタ−Y2H CFまたはY2H CF(50/51)と再び 結合させた。 また進行中の実験において、これらクローンの各々をY2H CF(93/94)、Y2H(128 0-83)、Y2H wtおよびY2H 950とも結合させる。得られた異なる相互作用蛋白質の 異なるおとりと相互作用する能力を比較することで、おとりの相互作用ドメイン へのさらなる洞察が得られる。例えば、ある相互作用蛋白質が変異構築体(CF 50 /51、CF1280-83またはCF 93/9)とは相互作用するがwt構築体とは相互作用しなけ れば、次いで、この結果は変異した残基に対する相互作用の部位をマッピングす る。Y2H CF構築体とは相互作用するが、Y2H wt構築体とはしないと考えられる蛋 白質は、不活性キナーゼ、またはそれらの相互作用に関する鍵となる残基の脱リ ン酸化を要求する。一方、Y2H wtおとりと相互作用するが、Y2H CFおとりとはし ない蛋白質に関するHELAライブラリーのさらなるスクリーニングは、IGF-IRのキ ナーゼ活性およびＣ末端における可能性ある残基の自己リン酸化を要求する相互 作用蛋白質を示す相互作用蛋白質の同定を可能にすると考えられる。本発明の異 なるIGF-IR構築体を用いたかかる遺伝子分析は、さらに相互作用部位および該相 互作用蛋白質の活性生存ドメインの機能との、またはＣ末端断片の細胞毒性に対 する生物学的関連を決定する一助となろう。 おとりY2H CFおよびY2H CF 50/51を用いて得られた相互作用クローンから精製 した酵母ＤＮＡをイー・コリ(E．coli)へ形質転換し、配列決定のためプラスミ ドＤＮＡを調製した。データに対して同定された相同な遺伝子の一覧を表IVに示 している。 表IV 酵母ツーハイブリッド分析によって同定されたIGF-IRＣ末端相互作用蛋白 質遺伝子の相同性 _aY2H CF 50/51と相互作用することが独自に判ったクローン_b Y2H CFと相互作用することが独自に判ったクローン 進行中の実験では、未知の機能を有する表IVで同定されたCFと相互作用する遺 伝子がキナーゼまたはホスファターゼ活性に関係する公知の配列との相同性、プ ロテアーゼのごとき酵素活性に関係するSH2またはSH3結合ドメイン、配列のごと き蛋白質相互作用モチーフ、または公知のシグナル形質導入蛋白質との相同性に 関して調査されている。カルシニューリンのごとき公知の機能を有する遺伝子は 、それらの生存ドメイン活性の機能要求に関して試験されている。これにはこれ ら遺伝子の細胞内での誘導的または構成的発現のための発現ベクターへの導入、 それに続く、該細胞の抗アポトーシス機能に対するこの発現の効果に関するアッ セイが含まれる。またこれらの蛋白質は、IGF-IRキナーゼ活性の変調やその受容 体における鍵残基の脱リン酸化のごときin vitro生化学アッセイのために、細菌 中で発現させる。これらの研究は活性を有する生存ドメインの作用およびその鍵 となる相互作用蛋白質に対する依存関係のメカニズムを明らかにするはずである 。これらの実験から発明者らはIGF-IR生存機能に必要な１以上の鍵となる相互作 用蛋白質の活性を変調する、またはIGF-IR中の鍵となる残基とのその相互作用、 もしくはその残基に対する活性を変調すると考えられる生化学アッセイを計画で き るであろうとの期待を持っている。 本明細書に記載した全ての刊行物は、個々の刊行物が特に、また個々に出典明 示して本明細書の一部とみなされることが示されている場合でも、同等の範囲ま で、出典明示して本明細書の一部とみなされる。本発明はさらに改良することが でき、この出願は、本発明が属する技術の範囲内にある公知の、または通例の実 施の範囲内に達するごとき、本開示からのかかる試みを含む、本発明の如何なる 改変、用途または採用をも包含することを意図し、さらに添付の請求の範囲によ ってのみ限定されることを意図していることが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ (72)発明者 オコーナー，ローズマリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174，アーリントン，ロナルド ロード ５ (72)発明者 バセルガ，レナト エル. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19003, アードモア，ブレッディン ロード 125

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端アミノ酸配列の一部が削除されたＩＧＦ−ＩＲの削除 変異株を含む組成物。 ２．削除変異株１２２９ｄ、１２４５ｄ及び１２９３ｄからなる群から選択され たものである請求項１の組成物。 ３．ＩＧＦ−ＩＲの１０８、９２及び４４アミノ酸Ｃ末端ペプチドからなる群か ら選択されたＩＧＦ−ＩＲのＣ末端ペプチドを含む組成物。 ４．Ｙ１２５１Ｆ、Ｙ１２５０Ｆ／Ｙ１２５１Ｆ及びＨ１２９３Ｆ／Ｋ１２９４ Ｒからなる群から選択されたＩＧＦ−ＩＲの点変異株を含む組成物。 ５．ａ．ＩＧＦ−ＩＲをコードするｃＤＮＡにより安定にトランスフェクトされ たサイトカイン依存性細胞の母集団中にアポトーシス調整剤候補薬剤を導入 し； ｂ．上記薬剤を導入し該サイトカインを除去した後に、ＩＧＦ−ＩＲリガン ドの存在下に、該母集団中の生存細胞数を測定し；そして ｃ．段階（ｂ）で得られた測定結果を対照測定結果と対比する 工程を含むアポトーシス調整剤の同定方法において、段階（ｃ）で得られた測定 結果と対比して、段階（ｂ）で得られた測定結果における減少又は増加により、 該候補薬剤をアポトーシス調整剤として同定することを特徴とする同定方法。 ６．該サイトカイン依存性細胞がＦ１５．１２細胞であり、該サイトカインがＩ Ｌ−３であり、そして該リガンドがＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II及びインスリンから なる群から選択されたものである請求項５の方法。 ７．請求項５又は６の方法により同定されたアポトーシス調整剤。 ８．ａ．ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端削除変異株をコードするｃＤＮＡで安定にトラン スフェクトしたサイトカイン依存性の母集団中に候補薬剤を導入し； ｂ．該薬剤を導入し該サイトカインを除去した後に、ＩＧＦ−ＩＲリガンド 及びＩＧＦ−ＩＲのＣ末端ペプチドの存在下に、該母集団中の生存細胞数を 測定し；そして ｃ．段階（ｂ）で得られた測定結果を対照測定結果と対比する 工程を含む、ＩＧＦ−ＩＲを発現する脊椎動物細胞の抗アポトーシス応答を高め ることのできる薬剤の同定方法において、段階（ｃ）で得られた測定結果に対比 して、段階（ｂ）で得られた測定結果における増加により、該候補薬剤をＩＧＦ −ＩＲを発現する脊椎動物細胞の抗アポトーシス応答を高めることのできる薬剤 であると同定することを特徴とする方法。 ９．該サイトカイン依存性細胞がＦ１５．１２細胞であり、該サイトカインがＩ Ｌ−３であり、そして該リガンドがＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II及びインスリンから なる群から選択されたものであり、該ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端削除変異種が１２２ ９ｄ、１２４５ｄ及び１２９３ｄからなる群から選択されたものであり、そして 該ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端ペプチドが１０８、９２及び４４アミノ酸Ｃ末端ペプチ ドからなる群から選択されたものである請求項８の方法。 １０．請求項８又は９の方法により同定された薬剤。 １１．ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端１０８アミノ酸を含むペプチドを含有する細胞毒性 組成物。 １２．標的細胞を殺すための請求項１１の組成物の使用。