ES2219011T3 - Vector viral adeno-asociado recombinante que codifica alfa-1 antitripsina para terapia genica. - Google Patents
Vector viral adeno-asociado recombinante que codifica alfa-1 antitripsina para terapia genica.Info
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Abstract
Vector viral adeno-asociado recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de alfa-1 antitripsina o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo unido de forma operativa a un promotor seleccionado del conjunto formado por un promotor CMV, un promotor beta-actina, un activador híbrido CMV/promotor /beta-actina, un promotor EF1, un promotor U1a, un promotor U1b, un promotor inducible Tet y un promotor VP16-LexA que expresa el polinucleótido mencionado para producir dicho polipéptido alfa-1 antitripsina, fragmento o o variante en una célula huésped de mamífero.
Description
Vector viral adeno-asociado
recombinante que codifica \alpha-1 antitripsina
para terapia génica.
La carencia de
Alfa-1-antitripsina (AAT) es la
segunda enfermedad de pulmón monogénica más común en el hombre, que
representa aproximadamente el 3% de las muertes tempranas causadas
por enfermedad pulmonar obstructiva. La proteína AAT se produce
normalmente en el hígado, se secreta al suero y circula hasta el
pulmón donde protege la fina red de soporte de fibras de elastina de
la degradación causada por elastasa neutrófila. Un tratamiento
actual para la carencia de AAT consiste en evitar la exposición al
humo de tabaco y en infusiones intravenosas semanales de la proteína
humana recombinante AAT (hAAT). Los intentos de inventar estrategias
de terapia génica para reemplazar AAT tanto en el pulmón como en
cualquiera de los otros tejidos que son capaces de secretar AAT han
sido limitados por la corta duración de la expresión a partir de
algunos vectores y por los niveles relativamente altos de AAT que se
necesitan para el efecto terapéutico. Se han descrito métodos de
terapia génica en la patente U.S.A.
nº 5.399.346.
nº 5.399.346.
Recientemente se ha demostrado que los vectores
de virus adeno-asociado (AAV) son capaces de la
expresión in vivo estable y pueden ser menos inmunogénicos
que otros vectores virales (Flotte y otros, 1996; Xiao y otros,
1996; Kessler y otros, 1996; Jooss y otros, 1998). AAV es un
parvovirus humano no patógeno cuyo ciclo de vida incluye
naturalmente un mecanismo para un largo período de latencia. En el
caso del tipo salvaje de AAV (wtAAV), esta persistencia se debe a la
integración sitio específica en un sitio del cromosoma humano 19 (el
sitio AAVSI) en la mayoría de las células (Kotin y otros, 1990),
mientras que con los vectores recombinantes de AAV (rAAV), la
persistencia parece que se debe a la combinación de persistencia
episomal y a la integración en posiciones que no son el cromosoma 19
(Afione y otros, 1996; Kearns y otros, 1996). La latencia del AAV
recombinante también se diferencia de la del wtAAV en que wtAAV se
convierte rápidamente en ADN de doble cadena en ausencia de
infección de virus colaborador (por ejemplo, adenovirus), mientras
que con rAAV, la síntesis de la cadena conductora se retrasa en
ausencia del virus colaborador (Fisher y otros, 1996; Ferrari
y otros 1996). La patente U.S.A. nº 5.658.785 describe
vectores de virus adeno-asociados y métodos para la
transferencia de genes a células.
Kessler y otros (1996) demostraron que las
miofibras esqueléticas murinas transducidas por un vector de rAAV
eran capaces de provocar una secreción sostenida de eritropoyetina
humana (hEpo) biológicamente activa, aparentemente sin provocar una
respuesta inmune significativa contra la hEpo secretada. Ver también
la patente U.S.A. nº 5.858.351 publicada por Podsakoff y otros.
Asimismo, Murphy y otros (1997) han observado la expresión y
secreción de niveles sostenidos de leptina en ratones ob/ob
después de la transducción de AAV en músculo. Brantly y otros
(Patente U.S.A. nº 5.439.824) describieron métodos para incrementar
la expresión de AAT mediante vectores que contenían el intrón II del
gen humano de AAT. Sin embargo, el nivel de expresión de leptina
observado sólo estuvo entre 2 y 5 ng/ml. La terapia para la
deficiencia de AAT requiere niveles en suero de al menos 800
\mug/ml. Por ello, sigue existiendo la necesidad de encontrar
medios que proporcionen una proteína a niveles terapéuticamente
beneficiosos para una persona que necesita dicho tratamiento.
La presente invención da a conocer materiales y
sus usos en terapia génica. Un aspecto de la invención se refiere a
vectores que pueden ser usados para proporcionar a animales y
humanos que tienen algún desorden genético una terapia génica en la
que se requieren niveles relativamente altos de expresión de una
proteína para tratar el desorden. Los vectores de la invención se
basan en virus adeno-asociado (AAV). Los vectores
son diseñados para proporcionar niveles altos de expresión de ADN
heterólogo contenido en el vector. En una realización, los vectores
incluyen secuencias de repetición AAV terminales invertidas y
promotores constitutivos o regulables para conducir a elevados
niveles de expresión de genes. La invención también da a conocer
métodos para tratar animales y humanos que necesitan terapia génica,
por ejemplo, para corregir un desorden de deficiencia genética.
En un primer aspecto de la presente invención, se
proporciona un vector viral adeno-asociado
recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un
polipéptido de \alpha-1 antitripsina o un
fragmento biológicamente activo o una variante de éste, unido de
forma operativa a un promotor elegido del conjunto formado por un
promotor CMV, un promotor \beta-actina, un híbrido
activador CMV/promotor \beta-actina, un promotor
EF1, un promotor U1a, un promotor U1b, un promotor inducible Tet y
un promotor VP16-LexA que expresa el polinucleótido
mencionado para producir el polipéptido \alpha-1
antitripsina , el fragmento o la variante en una célula huésped de
mamífero.
En un segundo aspecto, se da a conocer un
compuesto que comprende el vector de virus
adeno-asociado recombinante, la partícula viral o la
célula huésped para usar en terapia.
En un tercer aspecto, se da a conocer el uso de
un vector de virus adeno-asociado recombinante, la
partícula viral, la célula huésped, o la composición de la presente
invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de la deficiencia o ausencia de \alpha-1
antitripsina en un mamífero.
La figura 1 muestra los cassettes del vector
rAAV-AAT usados según la presente invención. Las
construcciones A-AT y B-AT contienen
los promotores de los genes del ARN pequeño nuclear, U1a y U1b,
respectivamente. La construcción C-AT contiene el
promotor CMV, mientras que el vector E-AT utiliza el
promotor del factor de elongación 1-\alpha humano
(en la figura, ELF). ITR se refiere a la repetición terminal
invertida de AAV; An se refiere a la señal poliA; Tk se refiere al
promotor de timidina quinasa HSV; neo se refiere al gen de la
neomicina fosfotransferasa Tn5.
La figura 2 muestra las proporciones de secreción
de hAAT in vitro de la línea celular de mioblasto murino
C2C12 transfectada en forma transitoria usando vectores de expresión
según la presente invención. C-AT no difiere
significativamente de E-AT, pero ambas difieren de
A-AT B-AT (p<0,05). La expresión
de AAT se detectó usando un ensayo ELISA específico para AAT
humana.
La figura 3 muestra las proporciones de secreción
de hAAT in vitro de la línea celular de mioblasto murino
C2C12 transducida de forma estable usando partículas virales que
contenían vectores de expresión según la presente invención. Se
muestran las proporciones medias de secreción de los cultivos
resistentes a G418 1 mo después de la transducción tanto con el
vector empaquetado E-AT como el vector empaquetado
C-AT. En cada ejemplo, se realizó una transducción
de "baja" multiplicidad (4x10^{5} partículas/célula) y una
transducción de alta multiplicidad (4x10^{6} partículas/célula).
E-AT "baja" y "alta" son mayores que la
multiplicidad "alta" de C-AT (P=0,02) pero no
son significativamente diferentes una de la otra (n=3). La expresión
de AAT se detectó usando un ensayo ELISA específico para AAT
humana.
La figura 4 muestra las construcciones
adicionales evaluadas para la expresión de hAAT. Las células de
mioblasto murino C2C12 se hicieron crecer en pozos de 35mm con
aproximadamente 4x10^{5} células por pozo y fueron transfectadas
con 5 \mug del ADN plasmídico apropiado utilizando la transfección
Superfect (Qiagen Inc., CA). La secreción de hAAT al medio fue
medida 2 días después de la transfección utilizando un ELISA de
captura de antígeno. Cada barra representa el promedio de resultados
de tres experimentos (triplicados en cada experimento).
Los datos de los experimentos de transfección
indican que la expresión a partir de p43CB-AT fue
por lo menos tres veces superior a correspondiente de
C-AT in vitro.
Las figuras 5A y 5B muestran la secreción
sostenida de niveles terapéuticos de hAAT utilizando tanto el vector
C-AT como el E-AT tanto en ratones
SCID como C57BL. La figura 5A muestra los niveles séricos totales
promedio de hAAT observados en grupos de ratones SCID (cuadrados) o
C57BL (círculos), recibiendo tanto dosis bajas (5x10^{11}
partículas) (símbolos vacíos) como dosis altas (1,4x10^{13}
partículas) (símbolos llenos) mediante inyecciones únicas del vector
C-AT en el músculo, medidas a tiempos que oscilan
entre la semana 1 y la 16 después de la inyección. Para cada linaje,
la curva de la dosis alta es significativamente diferente a la de la
dosis baja (P=0,009 para SCID, P=0,02 para C57BL), pero los linajes
no difieren el uno del otro. La figura 5B muestra datos análogos con
el vector E-AT. Ninguna de estas diferencias fue
significativa.
La figura 5C muestra la secreción a largo plazo
de hAAT a partir de músculo murino transducido con
C-AT. Los ratones C57B1/6 ó
C57B1/6-SCID recibieron 3,5x10^{10} UI,
1,4x10^{13} partículas/ratón. Un año después de la inyección, los
niveles séricos de hAAT fueron todavía de 400 \mug/ml en los
ratones C57B1/6-SCID y 200 \mug/ml en los ratones
C57B1/6. Este nivel es comparable con los niveles pico observados
(800 ó 400 \mug/ml, respectivamente).
La figura 6 muestra un inmunoblot de suero tomado
de varios de los ratones tratados con vector C-AT a
las 11 semanas después de la administración del vector. Diez
microlitros de una dilución de suero 1:100 se analizaron por
electroforesis mediante SDS/PAGE 10%, se transfirieron, y se
incubaron con una dilución 1:1.500 de conjugado de
anti-hAAT de cabra con peroxidasa de rábano picante
(Cappel/ICN). Se incluyeron muestras de tres SCID de dosis alta
(h1-h3), una de C57BL de dosis alta (h3) y tres de
C57BL de dosis baja (lo1-lo3), junto con un suero de
control negativo (inyectado con salino = sal) para indicar el nivel
de reactividad con mAAT endógeno. Como patrón, se añadió hAAT tanto
al suero C57BL de control negativo (primer carril de hAAT) como a
PBS (segundo carril de hAAT) hasta concentración de suero
equivalente final de 100 \mug/ml.
Las figuras 7A y 7B muestran que algunos ratones
BALB/c aumentan las respuestas inmunes humorales a hAAT, lo que se
correlaciona con niveles más bajos de suero pero ninguna toxicidad
observable. La figura 7A muestra niveles séricos de hAAT y la figura
7B muestra niveles séricos de anticuerpos anti-hAAT
determinados mediante ELISA desarrollado en suero tomado de ratones
inyectados con 1x10^{11} partículas del vector
C-AT. Cada grupo de símbolos representa un animal
individual (\boxempty, nº 1; \Delta, nº 2; \medcirc, nº. 3).
Nótese la correlación inversa entre la presencia de anticuerpos y la
presencia de hAAT circulante.
La figura 8 muestra la persistencia del ADN del
vector rAAV-AAT en forma de alto peso molecular.
Los productos PCR fueron amplificados a partir del ADN preparado por
extracción Hirt a partir de 3 ratones SCID inyectados 16 semanas
antes con 5x10^{11} partículas resistentes de
C-AT y analizados mediante transferencia Southern.
La pastilla Hirt de alto peso molecular (carriles de ADN genómico) y
el sobrenadante de bajo peso molecular (carriles de ADN episomal) se
analizaron separadamente. Los carriles de control incluyen una
muestra en la que un plásmido de ADNc hAAT fue el ADN plantilla (+)
y un control en el que el agua era la plantilla (-). En esta
reacción PCR interna, se espera un producto de
500-pb independientemente de si el genoma del vector
es integrado o no.
La figura 9 muestra hAAT sérica en ratones
C57B1/6 transducidos con C-AT y
p43CB-AT. Los ratones C57B1/6 fueron inyectados en
músculo con C-AT (3,5x10^{10} UI/ratón),
(1x10^{12} partículas/ratón) o p43CB-AT
(6x10^{9} IU, 1x10^{12} partículas/ratón). El nivel de hAAT a
partir de p43CB-AT se estimó en base a una
estimación de la dosis de C-AT equivalente (unidad
infecciosa).
La figura 10 muestra el aumento de la actividad
del promotor CMV mediante un activador sintético en células C2C12.
Las células murinas C2C12 de mioblasto se cultivaron en pozos de 35
mm con aproximadamente 4x10^{5} células por pozo y fueron
transfectadas con 5 \mug de ADN del vector p.43rms
ENC-AT usando la transfección SUPERFECT (Qiagen
Inc, CA). La secreción de hAAT al medio se determinó 2 días después
de la transfección usando un ELISA de captura de antígeno. Cada
barra representa el promedio de resultados de un experimento
(triplicado).
(triplicado).
La figura 11 muestra la secreción de hAAT por
parte de células de hígado de ratón (HO15) transfectadas con
diferentes construcciones. Las células de hígado murinas (HO15) se
cultivaron en pozos de 35 mm con aproximadamente 4x10^{5} células
por pozo y fueron transfectadas con 5 \mug del ADN plasmídico
usando reactivos LIPOFECTAMINA (Life Technologies Inc, MD). La
secreción de hAAT al medio se determinó 2 días después de la
transfección usando un ELISA de captura de antígenos. Cada barra
representa el promedio de resultados de 2 experimentos
(triplicado).
(triplicado).
La figura 12 muestra la secreción de hAAT a
partir de células de hígado de ratón (HO15) transfectadas usando
diferentes métodos. Las células de hígado murinas (HO15) se
cultivaron en pozos de 35 mm con aproximadamente 4x10^{5} células
por pozo y fueron transfectadas con 5 \mug del vector
p43CB-AT mediante los reactivos Superfect (Qiagen
Inc., CA), FuGENE (Boheringer Mannhem Co, IN), Lipofectina,
LipofectAMINA (Life Technologies Inc, MD) y transfección de fosfato
de calcio (CaPO4). La secreción de hAAT al medio fue determinada a
los 2 días después de la trasfección mediante un ELISA de captura de
antígenos. Cada barra representa el promedio de resultados de un
experimento (triplicado).
La figura 13 muestra la secreción de hAAT por
parte de hígado de ratón transducido con rAAV. Los ratones C57B1/6
fueron inyectados tanto con los vectores p43CB-AT,
como C-AT o E-AT por inyección en
vena portal o vena caudal. PV=inyección vena portal. TV=inyección
vena caudal.
La figura 14 muestra los niveles séricos de hAAT
en ratones C57B1/6 después de inyección intratraqueal (IT) de vector
C-AT o p43CB-AT. Los ratones
recibieron tanto 10^{9} UI de C-AT (círculos
vacíos), como 10^{9} UI de p43CB-AT (triángulos
vacíos) o 10^{10} UI de p43CB-AT (cuadrados
vacíos).
La figura 15 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
C-AT.
La figura 16 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
E-AT.
La figura 17 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
dE-AT.
La figura 18 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43C-AT.
La figura 19 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43C-AT-IN. Este vector incluye el
intrón II del gen humano AAT para activar la transcripción.
La figura 20 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43CB-AT.
La figura 21 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
C-AT2.
La figura 22 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43msENC-AT. Este vector es similar a
p43C-AT pero también incluye una secuencia de
activador arriba del promotor CMV.
La figura 23 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43rms
ENC-AT. Este vector es igual que el vector p43msENC-AT excepto en que la secuencia de activador se encuentra orientada en sentido opuesto.
ENC-AT. Este vector es igual que el vector p43msENC-AT excepto en que la secuencia de activador se encuentra orientada en sentido opuesto.
La figura 24 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43ms
ENCB-AT. Este vector es similar al p43CB-AT pero también incluye una secuencia de activador corriente arriba del promotor CMV.
ENCB-AT. Este vector es similar al p43CB-AT pero también incluye una secuencia de activador corriente arriba del promotor CMV.
La figura 25 muestra un mapa y secuencia
nucleotídica del vector de la presente invención denominado
p43rms
ENCB-AT. Este vector es igual al p43msENCB-AT excepto en que la secuencia de activador se encuentra orientada en sentido opuesto.
ENCB-AT. Este vector es igual al p43msENCB-AT excepto en que la secuencia de activador se encuentra orientada en sentido opuesto.
La presente invención se refiere a nuevos
materiales y utilización de los mismos para proporcionar terapia
génica a mamíferos y humanos que tienen una enfermedad o desorden,
tal como desórdenes de deficiencia genética, donde se requieren
elevados niveles de expresión de una proteína para tratar el
desorden o enfermedad. En un método descrito, un vector viral es
introducido en las células de un animal donde la proteína
terapéutica es producida, proporcionando de este modo al animal
terapia génica. En una realización, un método descrito comprende la
introducción en una célula o tejido animal de una cantidad efectiva
de partículas o vectores virales que comprenden un genoma
recombinante que incluye un polinucleótido heterólogo codificante de
una proteína útil en terapia génica y que puede ser expresada por la
célula o tejido. La expresión del polinucleótido heterólogo se
traduce en la producción de la proteína. Preferentemente, la
proteína terapéutica codificada por el polinucleótido heterólogo es
más bien una proteína de suero. En una realización preferente,
material del vector que comprende el polinucleótido heterólogo es
integrado en un cromosoma de la célula del animal huésped.
En una realización, se deriva de virus
adeno-asociado (AAV) un vector polinucleotídico
recombinante de la presente invención que comprende un promotor
constitutivo o regulable capaz de dirigir suficientes niveles de
expresión del ADN heterólogo en el vector viral. Preferentemente, un
vector recombinante de la invención comprende secuencias terminales
repetidas de AAV invertidas, tales como las descritas en WO
93/24641. En una realización preferente, un vector de la presente
invención comprende secuencias polinucleotídicas del plásmido
pTR-UF5. El plásmido pTR-UF5 es una
versión modificada de las series de plásmidos
pTR_{BS}-UF/UF1/UF2/UFB (Zolotukhin y otros,
1996). El plásmido pTR-UF5 contiene modificaciones
de la secuencia codificante de la proteína verde fluorescente
(GFP).
Entre los promotores útiles para la presente
invención se incluyen, por ejemplo, el promotor inmediato temprano
de citomegalovirus (CMV), el promotor del factor de elongación
humano 1-alfa (EF1), los promotores del ARN pequeño
nuclear (U1A y U1b), el promotor de la cadena pesada de
\alpha-miosina , el promotor del virus simio 40
(SV40), el promotor del virus de sarcoma Rous (RSV), el promotor
principal tardío de adenovirus, el promotor
\beta-actina y el elemento híbrido regulatorio que
comprende un activador CMV/promotor \beta-actina.
Se ha demostrado que estos promotores son activos en un amplio rango
de células de mamífero. Además de los promotores naturales descritos
anteriormente, en la presente invención se pueden utilizar
promotores sintéticos. Por ejemplo, un activador sintético
ensamblado al azar de elementos derivados de Spc5-12
incluyendo elementos específicos de músculo, el elemento de unión
del factor de respuesta a suero (SER), el factor 1 activador
específico de miocito (MEF-1), el factor 2 activador
específico de miocito (MEF-2), el factor 1 activador
de transcripción (TEF-1) y SP-1 (Li
y otros, 1999; Deshpande y otros, 1997; Stewart y otros, 1996;
Mitchell y otros, 1989; Briggs y otros, 1986; Pitluk y otros, 1991)
pueden ser utilizados en vectores de la invención.
Los promotores están unidos de forma operativa
con ADN heterólogo que codifica la proteína de interés. Por "unido
de forma operativa" se pretende indicar que el elemento promotor
está posicionado con respecto a la secuencia codificante para ser
capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificante.
Promotores particularmente útiles para la
expresión de una proteína en células de músculo pueden ser, por
ejemplo, promotores híbridos CMV/\beta-actina,
promotores CMV, promotores sintéticos y el promotor EF1. Promotores
particularmente útiles para la expresión de una proteína en células
de hígado pueden ser, por ejemplo, los promotores híbridos
CMV/\beta-actina y los promotores EF1.
También se puede contar con promotores inducibles
y específicos de tipo celular para usar con los vectores de la
presente invención. Por ejemplo, promotores inducibles Tet
(Clontech, Palo Alto, CA) y promotores VP16-Lex A
(Nettelbeck y otros, 1998) pueden ser utilizados en la presente
invención.
Los vectores pueden incluir también intrones
insertados dentro de la secuencia de polinucleotídica del vector
como medio para incrementar la expresión de ADN heterólogo
codificante de una proteína de interés. Por ejemplo, un intrón puede
ser insertado en el vector entre una secuencia de promotor y la
región que codifica la proteína de interés. Los intrones pueden se
insertados también en las regiones codificadoras. También se pueden
incluir en los vectores de la invención elementos activadores de la
transcripción que pueden servir para incrementar los niveles de
transcripción a partir de un promotor dado. Los activadores pueden
ser situados en general en cualquier orientación, 3' o 5', con
respecto a las secuencias de promotores.
El polinucleótido heterólogo en el vector
recombinante puede incluir, por ejemplo, polinucleótidos
codificantes de proteínas normales y funcionales, las cuales
proporcionan una sustitución terapéutica de la función biológica
normal en animales afectados por desórdenes genéticos que provocan
que el animal produzca una proteína defectuosa, o niveles anormales
o deficientes de esa proteína. Las proteínas, y las secuencias de
polinucleótidos que las codifican, que pueden ser suministradas por
terapia génica utilizando la invención, incluyen, aunque no se
limita sólo a éstas, antiproteasas, enzimas, proteínas
estructurales, factores coagulasa, interleuquinas, citoquinas,
factores de crecimiento, interferones, y linfoquinas. En una
realización a título de ejemplo, ADN heterólogo en un vector AAV
recombinante codifica la proteína humana
alfa-1-antitripsina.
Los métodos de terapia génica de la invención se
pueden llevar a cabo por tratamiento de las células o tejidos de los
pacientes ex vivo o in vivo. Las células y tejidos
contemplados por el alcance de la invención incluyen, por ejemplo,
músculo, hígado, pulmón, piel y otras células y tejidos que son
capaces de producir y secretar proteínas séricas. Los vectores de la
invención pueden ser introducidos dentro de células, líneas
celulares y tejidos apropiados usando métodos conocidos en este
campo. Las partículas virales y los vectores pueden ser introducidos
dentro de células o tejidos in vitro o in vivo. Los
métodos contemplados incluyen la transfección, transducción,
inyección e inhalación. Por ejemplo, los vectores pueden ser
introducidos en las células por medio de liposomas que contienen los
vectores en cuestión, por transfección directa con vectores
solamente, electroporación o por bombardeo de partículas. En una
realización a título de ejemplo, células de músculo se infectan
in vivo por inyección de partículas virales que incluyen
vector recombinante en el tejido muscular de un animal. En otra
realización, células de hígado se infectan in vivo por
inyección con virus recombinante en vena portal o venas
periféricas.
Los materiales de la presente invención pueden
ser utilizados para proporcionar terapia génica para algunas
afecciones o enfermedades tratables mediante infusión de proteína o
citoquina tales como, por ejemplo, la deficiencia de
alfa-1-antitripsina, hemofilia,
deficiencia de adenosina deaminasa, y diabetes. Los materiales de la
presente invención pueden también ser utilizados para proporcionar
terapia génica para el tratamiento de afecciones tales como, por
ejemplo, cáncer, enfermedades autoinmunes, desórdenes neurológicos,
enfermedades de inmunodeficiencia, e infecciones virales y
bacterianas. La presente invención, por ejemplo, puede ser usada
para proporcionar terapia génica a un paciente en el que sus células
son transformadas para expresar y producir interleuquinas tales
como
interleuquina-2.
interleuquina-2.
Los animales que pueden ser tratados con los
materiales de la invención incluyen mamíferos tales como mamíferos
bovinos, porcinos, equinos, ovinos, felinos y caninos. Los mamíferos
son preferentemente primates tales como chimpancés y humanos.
La presente invención se refiere también a
células que contienen vectores recombinantes de dicha invención. Las
células pueden ser, por ejemplo, células animales tales como células
de mamífero. Preferentemente, las células son de humano. Más
preferentemente, las células son miofibras o mioblastos, hepatocitos
o células de pulmón humano. En una realización preferente, un vector
recombinante de la presente invención es integrado de forma estable
dentro del genoma de la célula huésped. Las líneas celulares que
contienen los vectores recombinantes están también dentro del ámbito
de aplicación de la invención.
En una realización a título de ejemplo, se
construyeron y empaquetaron mediante técnicas estándar, vectores
recombinantes AAV que contenían el gen AAT humano (hAAT), usando
tanto el promotor CMV (AAV-C-AT)
como el promotor (AAV-E-AT) del
factor de elongación humano 1-alfa (EF1) para
conducir la expresión. Una línea celular de mioblasto murina, C2C12,
fue transducida con cada vector y se midió la expresión de hAAT en
el medio mediante ELISA. In vitro, la construcción de
promotor EF1 resultó en una expresión de hAAT 10 veces superior a la
de la construcción de promotor CMV. La transducción in vivo
se llevó a cabo inyectando dosis de hasta 1,4x10^{13} partículas
resistentes a DNasa de cada vector en músculos esqueléticos de
varios linajes celulares de ratones (incluyendo C57B1/6, Balb/c, y
SCID). In vivo, la construcción de promotor CMV resultó en
niveles de expresión más elevados, con niveles séricos sostenidos de
hasta 800 \mug/ml en ratones SCID, aproximadamente 10.000 veces
más altos que aquellos observados previamente con proteínas
secretadas por vectores AAV en músculo. A dosis más bajas tanto en
ratones C57B1/6 como en SCID, la expresión se retrasó varias
semanas, pero fue mantenida por encima de 10 semanas sin disminuir.
De este modo, dosis crecientes de vector AAV vía transducción de
músculo esquelético proporciona un medio para reemplazar AAT u otras
proteínas séricas.
La transducción de músculo usando los vectores de
la invención presenta varias ventajas en cuanto a que es estable, no
tóxica, y relativamente no inmunogénica. Además, ciertos promotores
de transcripción, tales como el promotor CMV, que parecen estar
regulados hacia abajo en otros contextos, se ha encontrado que
permanecen activos durante un tiempo tal como se usa en la presente
invención. Usando los materiales y métodos de la presente invención,
se pueden alcanzar niveles séricos de proteína terapéutica de
microgramo/ml. En una realización a título de ejemplo, los niveles
de expresión de proteína alcanzados in vivo representan un
incremento de 10.000 veces o más respecto a los resultados
publicados previamente. Además, se demostró una relación
dosis-efecto dentro del rango de dosis utilizado,
proporcionando incrementos de los niveles de expresión a medida que
la dosis de vector es incrementada.
En otra realización de la invención, se
construyeron y empaquetaron mediante técnicas estándar, vectores AAV
recombinantes, es decir, C-AT,
p43C-AT, P43CB-AT,
E-AT y dE-AT que comprendían el gen
de AAT humano (hAAT). Una línea celular de hígado murina, HO15, fue
transfectada con cada vector y la expresión de hAAT al medio fue
medida mediante ELISA. In vitro, la transducción con el
vector p43CB-AT mostró el nivel de expresión de hAAT
más alto. In vivo, el vector p43CB-AT también
dio niveles de expresión más altos. La administración por vena
portal pareció ser la ruta más eficiente de administración ya que
los ratones inyectados de esta forma mostraron niveles de expresión
superiores que aquellos que recibieron inyecciones en venas
periféricas. La transducción de hígado ofrece las mismas ventajas
que la de músculo, pero los hepatocitos parecen ser más eficientes
en la secreción de proteína.
La dosis de vector recombinante o de virus que
debe ser administrada a un animal que necesite dicho tratamiento
puede ser determinada por médicos cualificados basándose en varios
parámetros tales como el modo de administración, duración de
tratamiento, enfermedad, estado o afección de qué se trata, y
similares. Típicamente, el virus recombinante de la invención es
administrado en dosis entre 10^{5} y 10^{14} unidades
infecciosas. Los vectores recombinantes y virus de la presente
invención pueden ser preparados con formulaciones usando métodos y
materiales conocidos en la materia. Se pueden encontrar numerosas
formulaciones en "Remington's Pharmaceutical Sciences",
15^{a} Edición (1975).
Construcción de plásmidos rAAV. Los
plásmidos vector rAAV-AAT usados para estos
experimentos son representados esquemáticamente (Figura 1).
Brevemente, el plásmido pN2FAT (Garver y otros (1987)) fue digerido
con XhoI para liberar un fragmento de 1,8 kb que contenía el ADNc de
AAT humano junto con el promotor de SV40 y una señal de
poliadenilación. Este fragmento fue subclonado en un plásmido,
pBlueScript (Stratagene) y, después de la eliminación del promotor
SV40 mediante digestión con Hind III y religación, el ADNc de hAAT
con su señal poliA fue liberado por digestión con XbaI y XhoI. Este
fragmento XbaI-XhoI de 1,4 kb fue entonces clonado
en el plásmido pTR-UF5 (un vector que contiene una
repetición terminal invertida de AAV) (Zolotukhin y otros, 1996)
entre el sitio XbaI 3' al promotor CMV y el sitio XhoI 5' al
cassette activador del virus polioma/promotor de HSV timidina
quinasa, que conduce neo en esa construcción. Esto dio lugar
a la construcción pAAV-CMV-AAT
(C-AT). Se realizaron construcciones análogas usando
el promotor de las proteínas del ARN pequeño nuclear, U1a y U1b,
(para dar las construcciones A-AT y
B-AT, respectivamente) y el promotor del factor
humano de elongación 1-alfa (EF1) (para dar la
construcción E-AT), substituyendo cada uno de estos
casettes de promotor en lugar del promotor CMV, entre los sitios
KpnI y XbaI.
La construcción dE-AT se obtuvo a
partir de E-AT por eliminación del silenciador (352
kb) mediante el corte SAC II (Wakabayashi-Ito y
otros, 1994). C-AT2 es similar a
C-AT excepto en que hay el intrón SV40 y secuencias
poli(A) contiguos al ADNc de hAAT. El p43C-AT
fue construido por inserción de ADNc de hAAT a un plásmido vector
AAV (p43), que tiene el promotor CMV, el intrón y las secuencias
poli(A). El p43CB-AT se obtiene por reemplazo
del promotor CMV con secuencias de activador CMV y de promotor de
\beta-actina de pollo. El
p43C-AT-IN se obtiene a partir de
p43C-AT por inserción de secuencias del intrón II
del gen de hAAT al ADNc de hAAT (Brantly y otros, 1995).
Empaquetamiento de vectores rAAV. Los
vectores se empaquetaron usando una modificación del método descrito
por Ferrari y otros (1997). Brevemente, los plásmidos que contenían
los genes rep y cap de AAV (Li y otros, 1997) y los
genes Ad (E2a, E4 y VA-ARN) fueron cotransfectados
junto con el plásmido vector AAV-AAT apropiado en
293 células cultivadas en Fábricas de Células (Nunc). Las células
fueron recolectadas por tripsinización y rotas por lisis de
congelación-deshielo para liberar los viriones del
vector que fueron entonces purificados por ultracentrifugación en
gradiente de iodixanol seguido de una purificación mediante una
columna de afinidad de heparina sefarosa. Alternativamente, un virus
recombinante se puede preparar de acuerdo con métodos descritos por
Zolotukhin y otros (1999).
Se cuantificó el título físico de los preparados
de vector, medido mediante PCR competitivo cuantitativo, y su título
biológico, por ensayo de centro infeccioso. La presencia del tipo
salvaje de AAV fue medida mediante los mismos ensayos con las sondas
internas de AAV adecuadas. El C-AT de dosis alta dio
un título de partícula de 2,0x10^{14} partículas/ml y un título
infeccioso de 5,0x10^{11} unidades infecciosas (u.i.)/ml
(proporción partícula-u.i.=400:1). El
C-AT de dosis baja midió 8x10^{12} partículas/ml y
1,2x10^{10} u.i./ml (relación partícula- u.i.=667:1). Para los
experimentos de E-AT, los títulos fueron de
1x10^{13} partículas/ml y 2,5x10^{10} u.i/ml (partícula a
u.i.=400:1). El C-AT de baja dosis tuvo un título de
partícula AAV semejante al tipo salvaje (es decir, AAV positivo en
PCR de genoma) igual a 0,1 veces el título recombinante pero ninguna
infección detectable de wtAAV. Las otras dos preparaciones tuvieron
títulos de partícula AAV semejante al tipo salvaje
<10^{-5}veces el título recombinante y ningún wtAAV
infeccioso
detectable.
detectable.
Experimentos de transfección in vivo y
transducción. La línea de mioblasto murino C2C12 fue utilizada
para los experimentos de transfección in vitro y de
transducción. Las células fueron cultivadas en pozos de 35 mm con
aproximadamente 4x10^{5} células por pozo y transfectadas con 5
\mug de cada ADN plasmídico usando Superfect (Qiagen Corp.). La
secreción de hAAT al medio fue medida a los 2 días después de la
transfección usando un ensayo ELISA de captura de antígeno con
estándares (Brantly y otros, 1991). Un plásmido promotor SV40 de
expresión de luciferasa, pGL2 (Promega), fue utilizado como control
interno. Para los experimentos de transducción, las células fueron
cultivadas bajo condiciones similares y fueron transducidas con
vector a multiplicidades de infección que oscilaban entre 4x10^{5}
a 4x10^{6} partículas por célula. Las células fueron entonces
seleccionadas en presencia de sulfato de geneticina (350 \mug/ml)
y se aislaron clones resistentes a geneticina para estudios de
secreción de hAAT.
Inyección in vivo de vectores
AAV-C-AT y
AAV-E-AT en músculo murino. Los
linajes de ratones (C57B1/6, SCID, Y Balb/c) fueron obtenidos de los
Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME) y fueron manipulados bajo
condiciones específicas libres de patógenos según un protocolo
aprobado por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal de la
Universidad de Florida. Los animales fueron anestesiados por
inhalación de metafano y se les inyectaron de forma percutánea
alícuotas de vector en los músculos cuádriceps femorales de ambos
miembros traseros. El volumen de vector osciló de 50 a 100 \mul
por sitio de inyección y la cantidad total de virus inyectado por
animal estuvo en el intervalo de 5x10^{10} a 1,4x10^{13}
partículas resistentes a DNasa.
Ensayo ELISA de captura de antígeno para la
expresión de hAAT. Se cubrieron placas de microtitulación
(Immulon 4, Dynex Technologies, Chantilly, VA) con 100 \mul de una
dilución 1:200 de AAT antihumano de cabra (CAPPEL/ICN) en tampón
Vollers (Na2CO3=2,76 g, NaHCO3=1,916 g, NaN3=0,2 g, d.H2O=1 litro,
Ajuste pH=9,6) toda la noche a 4ºC. Después de lavar, los estándares
y las muestras desconocidas que contenían hAAT fueron incubadas en
las placas a 37ºC durante 1 hora. Después del bloqueo con BSA 3% en
PBS-Tween 20 a 37ºC durante 1 hora, un segundo
anticuerpo (dilución 1:1000 de AAT antihumano de conejo, Boehringer
Mannheim) se hizo reaccionar con el antígeno capturado a 37ºC
durante 1 hora. La detección se llevó a cabo usando un la incubación
con un tercer anticuerpo (dilución 1:800 de conjugado IgG anti
conejo de cabra con peroxidasa, 37ºC) seguido de la detección
mediante o-fenilendiamina (OPD, Sigma) y medición
de la absorbancia a 490 nm.
Ensayo ELISA para los anticuerpos
anti-hAAT y anti-AAV VP3. Los
pozos se cubrieron con antígeno (1 \mug de hAAT o 100 ng de VP3) a
4ºC toda la noche, se bloquearon con BSA 3% y reaccionaron a
continuación con diluciones tanto de suero de prueba o con
anticuerpos de control positivo a 37ºC durante 1 hora. Después de
lavar, se usó un conjugado de IgG anti-ratón de
cabra con peroxidasa como segundo anticuerpo (dilución 1:1500) para
detectar el enlace anti-AAT anticuerpo, usando una
reacción OPD estándar, tal como se ha descrito anteriormente. Los
niveles de anticuerpo fueron cuantificados por comparación con una
curva estándar generada haciendo reaccionar las diluciones de los
anticuerpos monoclonales positivos conocidos contra VP3 y hAAT.
Ensayos de proliferación de linfocitos para
detectar respuestas inmunes mediadas por células. Los ensayos de
proliferación de linfocitos fueron desarrollados con el fin de
detectar las respuestas de células T a los antígenos hAAT y VP3. Se
cultivaron esplenocitos aislados frescos en cultivo primario en
placas de 96 pozos cubiertas con 0, 0,1, 1, y 10 \mug de hAAT o
VP3 en medio RPMI-C+. En el día tres, se añadió un
pulso de ^{3}H-timidina, y las células se
recolectaron en el día 4 mediante lisis y contaje por escintilación.
Se usó fitohemaglutinina (PHA) como mitógeno para pozos de control
positivo. Para cada nivel de dosis de antígeno se calculó un índice
de estimulación, dividiendo las cuentas por minuto (cpm) de
^{3}H-timidina incorporada en las células
estimuladas con antígeno entre las cpm en pozo de control (no
estimulado).
A continuación hay ejemplos que ilustran
procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no
deberían ser interpretados como restrictivos. Todos los porcentajes
son en peso y todas las proporciones de las mezclas de disolventes
son en volumen, a menos que se indique lo contrario.
Para determinar la fuerza relativa de algunos
promotores constitutivamente activos en el contexto de vectores
AAV-AAT, se construyeron vectores de expresión
AAV-AAT empaquetables, que contuvieran uno de los
promotores CMV, EF1, U1a o U1b (Figura 1). Cada una de estas
construcciones se transfectó en la línea celular de mioblasto murino
C2C12. Tanto EF1 y el promotor CMV fueron activos para las expresión
de AAT, con la construcción EF1
(AAV-E-AT) que expresó 850
ng/10^{5} células/día y la construcción CMV
(AAV-C-AT) que expresó
aproximadamente 670 ng/10^{5} células/día, medidas mediante ensayo
ELISA específico humano para AAT (Figura 2). Esta diferencia no fue
estadísticamente significativa. Los niveles de expresión a partir de
las construcciones U1a y U1b fueron
indetectables.
indetectables.
Con el fin de caracterizar mejor el nivel y
duración de la expresión en el marco de la transducción del vector,
los cultivos de células C2C12 fueron transducidos tanto con
AAV-E-AT como con
AAV-C-AT a multiplicidades de
infección del orden de 4x10^{5} a 4x10^{6} partículas
resistentes a DNasa por célula. Las células fueron entonces elegidas
para la expresión del gen neo (presente en cada una de las
construcciones AAV) mediante el cultivo en un medio que contenía
G418. Varios clones de células y poblaciones de células agrupadas
fueron analizados independientemente para la expresión de AAT a las
4 semanas post-transducción (Figura 3). Hubo una
clara tendencia hacia niveles de expresión más altos a
multiplicidades de infección más altas, y la construcción
E-AT expresó cantidades al menos 10 veces más
grandes bajo todas las condiciones en estos cultivos a largo plazo.
El clon E-AT más activo expresó hAAT a un ritmo de
más de 1400 ng/10^{5} células/día.
Con el fin de determinar si las construcciones
AAV-AAT serían activas in vivo en músculo
esquelético, se inyectaron dosis de vector en el músculo cuádriceps
femoral de ratones. Los niveles de hAAT circulante en suero fueron
medidos de 11 a 15 semanas después de la inyección inicial. Cuatro
animales de cada linaje de ratón, inyectados con solución salina,
sirvieron como controles. En el caso del vector C-AT
(figura 5A), los niveles de expresión fueron suficientes para
alcanzar los niveles séricos en exceso de 800 \mug/ml en ratones
SCID después de una única inyección de 1,4x10^{13} partículas. Se
observó una relación dosis-efecto, con niveles de
expresión en SCID que fueron por lo menos 20 veces inferiores a la
dosis de 5x10^{11} partículas. Los niveles de expresión se
incrementaron durante las primeras semanas después de la inyección y
fueron estables desde entonces hasta el momento del sacrificio. Como
hAAT tiene una vida media de menos de 1 semana, esto indicó
expresión continuada. Los niveles en ratones C57B1/6 fueron
comparables, y también alcanzaron valores cercanos al rango
terapéutico. En estudios similares, dos de tres ratones Balb/c
inyectados con 1x10^{11} partículas del vector
C-AT no expresaron hAAT a niveles detectables. En
ambos se encontró que habían desarrollado elevados niveles de
anticuerpos anti-hAAT.
De forma sorprendente, los niveles de expresión a
partir del vector AAV-E-AT después
de la inyección in vivo fueron modestamente inferiores que
los observados con el vector C-AT (Figura 5B), con
niveles máximos de aproximadamente 250 ng/ml a la dosis de
5x10^{11} a las 7 semanas y a partir de entonces, en ratones SCID.
Cuando la dosis fue incrementada por encima de 1x10^{12}
partículas, se observaron niveles de aproximadamente 1200 ng/ml.
Estos niveles fueron estables durante un año
post-inyección (Figura 5C). Los niveles observados
en los ratones SCID y los inmunocompetentes C57B1/6 fueron
similares.
En estudios en ratones Balb/c, los niveles de
anticuerpo contra hAAT fueron altos en 2 de los 3 animales
inyectados. El que no tuvo anti-hAAT circulante fue
el único animal con niveles de expresión de hAAT similares a los de
los grupos C57B1/6 y SCID. El grupo de inyección de alta dosis de
C57-C-AT tenía niveles detectables
de anticuerpo dirigido contra VP3, pero no contra hAAT.
Con el fin de determinar si algunas respuestas
inmunes mediadas por células eran aumentadas, se desarrollaron
ensayos de proliferación de linfocitos usando tanto hAAT como
AAV-VP3 para la estimulación antigénica de los
linfocitos esplénicos primarios recogidos en el momento del
sacrificio del animal, 16 semanas post-inyección del
vector. Usando este método, no se detectó respuesta inmune en
ninguno de los ratones.
Con el fin de determinar si había alguna
toxicidad, inflamación o cambio neoplástico directo asociado con la
inyección del vector, se les practicaron a los animales necropsias
completas. El examen histopatológico se llevó a cabo en secciones de
5 \mum tomadas del sitio de la inyección del vector y de una lista
de otros órganos, incluyendo el cerebro, corazón, pulmones, tráquea,
páncreas, bazo, hígado, riñón, y jejuno. No se observó ninguna
anormalidad histológica en ninguno de estos sitios, incluso entre
aquellos ratones que desarrollaron respuestas inmunes humanas contra
hAAT.
Para confirmar la presencia de ADN del vector, se
desarrolló un PCR específico de vector (cebadores neo
5'-TATGGGATCGGCCATTGAAC-3', y
5'-CCTGATGCTCTTC-GTCCAGA-3')
en ADN extraído de 3 ratones SCID 16 semanas después de la inyección
con el vector C-AT, y los productos de PCR fueron
analizados mediante transferencia de tipo Southern con una sonda
específica de vector etiquetada ^{32}P (figura 8). El estado del
ADN del vector fue analizado mediante el procedimiento Hirt (Carter
y otros, 1983) para separar el ADN episomal de bajo peso molecular
de la fracción de alto peso molecular, que contendría formas
integradas y extensos concatámeros. En cada caso, el ADN del vector
estuvo presente en la fracción de ADN de alto peso molecular,
mientras que sólo en uno de los animales hubo una señal en la
fracción episomal. Este resultado indica que en 16 semanas la mayor
parte del ADN del vector en los animales estaba integrada o en
extensos concatámeros.
Las inyecciones en vena portal o vena caudal se
realizaron en 18 hembras de ratones C57BL/6 de 8-10
semanas de vida. El volumen de inyección fue de 100 \mul por
ratón.
Cada grupo tenía los siguientes parámetros:
- 1.
- Grupo 1: 100 \mul de PBS n=4.
- 2.
- Grupo 2: 100 \mul de p43CB-AT (3x10^{10} UI/animal) n=3.
- 3.
- Grupo 3: 100 \mul de p43CB-AT (4x10^{9} UI/animal) n=4.
- 4.
- Grupo 4: 100 \mul de C-AT (4x10^{9} UI/animal) n=2.
- 5.
- Grupo 5: 100 \mul de E-AT (4x10^{9} UI/animal) n=4.
- 6.
- Grupo 6: EATM TV=100 \mul mediante inyección de E-AT en vena caudal (4x10^{9} UI/animal) n=3.
- 7.
- Grupo 0: 100 \mul de PBS mediante inyección en vena caudal n=2.
Se utilizaron un total de 22 animales en este
estudio.
Todos los animales fueron anestesiados con
2,2,2-tribromoetanol (Avertin) usando una solución
de trabajo de 20 mg/ml con una dosificación de 0,5 mg/g IP. Se hizo
una incisión en la línea media abdominal ventral de 2 cm desde la
sínfisis púbica extendiéndose de forma cranial hasta el proceso
xifoides a través de las capas de piel y músculo. La vena portal fue
descubierta retirando los intestinos y el mesenterio asociado hacia
la parte izquierda del animal. Adicionalmente, los lóbulos medios
cuadrado y derecho del hígado fueron retirados de forma cranial. Los
intestinos y la cavidad peritoneal fueron lavados continuadamente
con NaCl al 0,9%.
El virus o PBS fue liberado en la vena portal
usando una aguja de 30 g sujetada por una pipeta capilar de 100
\mul usando suministro en boca vía tubo de goma y un filtro
Drummond de 0,8 \mum de doble capa con auto cierre. Se aplicó un
pequeño trozo de Gel-Foam (0,5x0,5 cm) en el lugar
de la inyección antes de que la aguja fuese retirada de la vena
portal. La aguja se retiró por debajo del Gel-Foam y
el trozo se mantuvo con pinzas en el sitio mientras los intestinos
se volvían a colocar en la cavidad peritoneal.
El músculo y la piel se cerraron en una capa
usando 2 suturas de nylon 3-0 simples interrumpidas
sobre una aguja de corte FS-1. Las cirugías se
realizaron en una mesa de operaciones termoregulada diseñada para
mantener la temperatura a 37ºC. Para recuperarlos de la anestesia,
los animales fueron colocados debajo de una lámpara de calor
ajustada para mantener una temperatura ambiente de aproximadamente
37ºC y se les suministró fluido subcutáneo si había habido una
pérdida significativa de sangre durante la operación.
Los niveles séricos de hAAT en los ratones fueron
medidos 2 semanas después de la inyección. Se detectaron niveles
séricos de 200-150 \mug/ml de hAAT en ratones que
habían recibido el vector p43CB-AT (figura 13). Los
estudios que emplearon el vector E-AT muestran que
la inyección del vector en vena portal condujo a niveles superiores
de secreción de hAAT comparados con el E-AT
administrado por inyección en vena caudal.
Se les inyectó a los ratones por vía
intratraqueal los vectores C-AT o
p43CB-AT. Los niveles séricos de hAAT en el ratón
fueron medidos el día 3, día 14 y 31 después de la inyección (figura
14). El vector p43CB-AT medió altos niveles de
expresión de hAAT en pulmón.
Debería entenderse que los ejemplos y
realizaciones descritos en la presente invención sólo tienen un
propósito ilustrativo y que serán sugeridas modificaciones o cambios
a personas especializadas en la materia y se incluirán en el alcance
de esta solicitud y en el de las reivindicaciones adjuntas.
Patente U.S.A. nº 5.399.346
Patente U.S.A. nº 5.439.824
Patente U.S.A. nº 5.658.785
Patente U.S.A. nº 5.858.351
Afione, S.A., Conrad, C.K.,
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
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<220>
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artificial: PLÁSMIDO dE-AT
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artificial: p43C-AT
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artificial: PLÁSMIDO p43CB-AT
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artificial: PLÁSMIDO C-AT2
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artificial: PLÁSMIDO p43msENC-AT
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artificial: CEBADOR SINTÉTICO
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\hskip-.1em\dddseqskipcctgatgctc ttcgtccaga
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Claims (19)
1. Vector viral adeno-asociado
recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un
polipéptido de \alpha-1 antitripsina o un
fragmento biológicamente activo o variante del mismo unido de forma
operativa a un promotor seleccionado del conjunto formado por un
promotor CMV, un promotor \beta-actina, un
activador híbrido CMV/promotor \beta-actina, un
promotor EF1, un promotor U1a, un promotor U1b, un promotor
inducible Tet y un promotor VP16-LexA que expresa el
polinucleótido mencionado para producir dicho polipéptido
\alpha-1 antitripsina, fragmento o variante en una
célula huésped de mamífero.
2. Vector viral, de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el vector mencionado comprende además un activador.
3. Vector viral, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el promotor mencionado es un
promotor \beta-actina.
4. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el vector mencionado
comprende además un activador CMV, un activador sintético, o un
activador específico de músculo.
5. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el vector mencionado incluye
además una secuencia de intrón.
6. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el vector mencionado es
p43C-AT-IN.
7. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que el vector mencionado
se selecciona entre un conjunto que consiste en
dE-AT, E-AT, C-AT,
C-AT2, p43C-AT,
p43CB-AT, p43msENC-AT,
p43rmsENC-AT, p43msENCB-AT, y
p43rmsENCB-AT.
8. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polinucleótido mencionado
codifica un polipéptido de \alpha-1 antitripsina
humana o un fragmento biológicamente activo o variante del
mismo.
9. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, comprendido dentro de un vehículo
farmacéutico.
10. Vector viral, de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, formulado para la administración a
un humano.
11. Partícula viral
adeno-asociada que comprende el vector viral
adeno-asociado, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
12. Partícula viral, de acuerdo con la
reivindicación 11, comprendida dentro de un vehículo
farmacéutico.
13. Célula huésped que comprende el vector viral
adeno-asociado recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, o la partícula viral según las
reivindicaciones 11 ó 12.
14. Célula huésped, de acuerdo con la
reivindicación 13, en la que la célula huésped mencionada es una
célula humana.
15. Célula huésped, de acuerdo con las
reivindicaciones 13 ó 14, en la que la célula huésped mencionada es
una miofibra, mioblasto, hepatocito o célula de pulmón humanos.
16. Composición que comprende el vector viral
adeno-asociado recombinante según cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 10, la partícula viral según las
reivindicaciones 11 ó 12, o la célula huésped según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 15 para usar en terapia.
17. Uso de un vector viral
adeno-asociado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, la partícula viral de acuerdo con las
reivindicaciones 11 ó 12, la célula huésped de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, o la composición de
acuerdo con la reivindicación 16 para la fabricación de un
medicamento para tratar la deficiencia o defecto en un mamífero de
\alpha-1 antitripsina.
18. Uso, de acuerdo con la reivindicación 17, en
el que el vector mencionado, la partícula mencionada, la célula
huésped mencionada o la composición mencionada son adecuados para
suministrar al mamífero mencionado mediante inyección, infección o
inhalación.
19. Uso, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 17 ó 18, en el que el mamífero mencionado es
humano.
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