BR112021001878A2

BR112021001878A2 - métodos de terapia genética para o controle da função do órgão

Info

Publication number: BR112021001878A2
Application number: BR112021001878-6A
Authority: BR
Inventors: Roberta Marongiu; Michael G. Kaplitt
Original assignee: Cornell University
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-04-27
Also published as: US20210301306A1; KR20210052450A; WO2020028466A1; MX2021001336A; SG11202101042SA; EP3829718A4; CA3108324A1; JP2024041871A; PH12021550243A1; EA202190358A1; EP3829718A1; JP2021533126A; IL280531A; AU2019315445A1; CN113301956A

Abstract

"MÉTODOS DE TERAPIA GENÉTICA PARA O CONTROLE DA FUNÇÃO DO ÓRGÃO" A presente invenção refere-se a métodos e composições para o controle da função do órgão visceral que são fornecidos. Por exemplo, os métodos e composições são úteis para prevenir, inibir ou tratar a doença como um resultado do controle, por exemplo, regulação, da função do órgão. Em uma modalidade, os vetores virais são liberados a um órgão, e o vírus infecta um nervo que regula uma função do órgão. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor retrógrado. Em uma modalidade, o vetor viral codifica um produto gênico, cuja atividade é controlada por um agente exogenamente liberado ou energia. A liberação do agente ou energia controla assim a função do órgão.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE TERAPIA GENÉTICA PARA O CONTROLE DA FUNÇÃO DO ÓRGÃO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do pedido U.S. No. 62/712.669, depositado em 31 de julho de 2018, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES

[0002] A terapia genética tem se mostrado uma grande promessa para uma variedade de doenças neurológicas. Recentemente, foi reconhecido que o controle neuronal da função do órgão representa uma oportunidade para a regulação terapêutica da função do órgão por meio da manipulação da atividade neuronal. Abordagens mecânicas para alterar a função neuronal estão atualmente disponíveis, incluindo estimuladores que podem estimular eletricamente o tronco principal ou os ramos de nervos tais como o nervo vago. No entanto, estes não influenciam especificamente todos os neurônios dentro do nervo que está sendo estimulado e envolvem implantes complexos que possuem complicações inerentes nos dispositivos mecânicos, incluindo migração e infecção de derivação, enquanto um gerador de pulso também deve ser regularmente carregado e/ou periodicamente substituído a fim de manter a função.

[0003] Agentes de terapia genética são capazes de direcionar neurônios para órgãos viscerais, mas a injeção de vetores virais em gânglios, cérebro ou regiões da medula espinhal que abrigam corpos celulares para esses neurônios não permitirá o controle de órgãos individuais, uma vez que estes são principalmente populações misturadas que enviam neurônios para muitos órgãos. Por exemplo, os neurônios sensoriais do nervo vago do estômago podem sentir alongamento e saciedade, enquanto que os neurônios sensoriais do nervo vago para o pulmão são responsáveis pelo reflexo da tosse. Portanto, a injeção de agentes de terapia genética para modular a função neuronal no gânglio nodoso teria como alvo ambas as populações de neurônios, influenciando assim a função de ambos os órgãos, o que seria indesejável no tratamento da tosse ou de um distúrbio metabólico isolado.

[0004] Consequentemente, existe uma necessidade com relação a uma abordagem para a modulação genética da função de subconjuntos de neurônios para órgãos específicos, a fim de regular a função do órgão para melhorar a doença.

SUMÁRIO

[0005] A divulgação fornece materiais e métodos úteis para o controle da função do órgão para prevenir, inibir ou tratar doenças. Em um aspecto, o método fornece a liberação de vetores virais a órgãos que são depois absorvidos pelos axônios dos nervos que regulam a função desses órgãos. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado (AAV). Em uma modalidade, uma forma retrógrada de vírus adeno-associado (AAV), quando injetada na parede do estômago, é especificamente absorvida em um subconjunto de neurônios sensoriais do nervo vago que respondem à distensão do estômago e causam saciedade. As moléculas que fornecem formas retrógradas de vetores são conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitadas a estas, proteínas virais nativas tais como proteína HSV, vírus da raiva G, glicoproteína tipo C, VSV G, B19G, proteína do vírus da pseudo-raiva, proteína da cápside de AAV e dineína. Isso representa um subconjunto específico de neurônios que emanam do gânglio nodoso, embora não afete outros neurônios nodosos que fornecem sensação a outros órgãos viscerais. O vetor viral também pode ser outras formas de vetores retrógrados, incluindo, mas não limitado a vetores lentivirais retrógrados (LV), vetores do vírus herpes simplex (HSV) ou vetores de adenovírus canino (CAV).

[0006] Em uma modalidade, um método é fornecido para liberar um ou mais genes às fibras nervosas que controlam a função de um órgão, por exemplo, um órgão visceral incluindo, mas não limitado a estômago, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, fígado, baço, vesícula biliar, pulmão, rim e coração. Em uma modalidade, um vetor de terapia genética viral é administrado em uma região de um órgão que é inervado por um nervo regulador, tal como um nervo vago, nervo cardiopulmonar, nervo esplâncnico torácico, nervo esplâncnico lombar, nervo esplâncnico sacro ou nervo esplâncnico pélvico. Em uma modalidade, o órgão é um estômago, intestinos, pâncreas, fígado, pulmão, coração, adrenal, rim, gônadas, bexiga, esfíncter anal ou esfíncter urinário. Em uma modalidade, o vetor viral é modificado para transporte retrógrado no sistema nervoso central. Em uma modalidade, o vetor viral é injetado no órgão. Em uma modalidade, a liberação do vetor previne, inibe ou trata uma doença. Em uma modalidade, o vetor viral é injetado no estômago e a expressão do gene controla a ingestão de alimentos. Em uma modalidade, o vetor viral é liberado ao pulmão, por exemplo, através de inalação, e a expressão do gene controla a tosse. Em uma modalidade, a expressão do gene ativa o nervo regulador. Em uma modalidade, a expressão do gene inibe o nervo regulador.

[0007] A presente invenção também fornece um vetor viral com propriedades melhoradas para absorção retrógrada em neurônios alvo. Este vetor contém uma cápside, que contém uma mistura de proteínas da cápside de um sorotipo de AAV, por exemplo, sorotipo de AAV 2, com mutações pontuais aumentando a captação retrógrada (retroAAV) (Tevro, et al., Neuron 92:372-378 (2016), que é aqui incorporado por referência) e proteínas da cápside de um sorotipo diferente de AAV, por exemplo, sorotipo rh10 de AAV. Essa combinação de cápside cria um vetor viral que aumentou drasticamente a captação retrógrada e a eficiência nos neurônios aferentes em comparação com as cápsides que contêm proteínas exclusivamente do retroAAV. Este vetor fornece controle eficiente da função do órgão.

[0008] A divulgação também fornece um método para o controle regulado da função do órgão. O método geralmente inclui a liberação de um gene por meio de um vetor retrógrado aos neurônios aferentes aos órgãos, cujo produto responde a um fármaco externo ou estímulo para controlar a função do órgão. Em um exemplo, este método pode ser utilizado para induzir a saciedade e reduzir a ingestão de alimentos a fim de controlar o peso corporal. Neste exemplo, o AAV retrógrado (retroAAV) expressando um Receptor de Designer Ativado Exclusivamente por Fármacos de Designer (DREADD) que ativa neurônios, é injetado na parede do estômago e é levado para os neurônios sensoriais vagos, aferentes ao estômago, que respondem ao estiramento do estômago e induzem a saciedade. Após a administração sistêmica de um ativador de DREADD, por exemplo, clozapina-N-óxido (CNO), a saciedade é induzida e a ingestão de alimentos é diminuída. Outros exemplos incluem a liberação de um canal iônico quimiogenético excitatório para esses neurônios, seguido pela ativação com o fármaco apropriado ou a liberação do canal iônico optogenético excitatório ChR2 seguido pela liberação de luz nas fibras nervosas para ativar o ChR2. Em outro exemplo, este método é utilizado para controlar a tosse intratável que não é provocada por uma doença tratável de outra forma. Em um exemplo, o AAV retrógrado que expressa um DREADD inibidor é aerossolizado e inalado para absorção em neurônios sensoriais vagos do pulmão, seguido por administração sistêmica de um ativador de DREADD, por exemplo, CNO, para inibir a atividade desses neurônios sensoriais para reduzir o reflexo de tosse. Em um exemplo, o AAV retrógrado que expressa, por exemplo, um DREADD inibidor, é injetado, por exemplo, no nervo vago ou gânglio nodoso, seguido pela administração sistêmica de um ativador de DREADD, por exemplo, CNO, para inibir a atividade desses neurônios sensoriais para reduzir o reflexo da tosse.

[0009] Em uma modalidade, o vetor viral codifica hM4Di, uma versão projetada do receptor muscarínico de acetilcolina M4 que, quando ligado por CNO, clozapina, perlapina ou composto 21 (ver Chen et al., ACS Chem. Neurosic., 6:476 (2015)), que é aqui incorporado por referência, resulta na hiperpolarização da membrana por meio de uma diminuição na sinalização de cAMP e aumento da ativação de canais de potássio retificadores internos. Isso produz uma supressão temporária da atividade neuronal semelhante à observada após a ativação endógena do receptor M4. O hM3Dq (hD3q) é uma versão projetada do receptor muscarínico M3, que quando ativado por CNO, leva à ativação da cascata de fosfolipase C, alterando o cálcio intracelular e levando ao disparo de neurônios em forma de explosão. Os rM3Ds resultam na despolarização neuronal com base na sinalização de proteína G (por exemplo, aumentos de cAMP) que pode modular a atividade neuronal através de processos de sinalização baseados em arrestina em vez de sinalização de proteína G. Outras opções para excitação neuronal são outros rM3Ds, que de forma semelhante resultam na despolarização neuronal com base na sinalização da proteína G (por exemplo, aumentos de cAMP) (ver, por exemplo, Dong, Allen, Farrell, & Roth, 2010; Ferguson, Phillips, Roth, Wess, & Neumaier, 2013), e Rq (R165L), que pode modular a atividade neuronal por meio de processos de sinalização baseados em arrestina em vez da sinalização de proteína G. Outro receptor é o receptor inibidor DREADD Pdi. Uma forma com mutação do receptor opioide capa acoplado a Gi (KORD) é ativada pela salvinorina B (SalB)

e, portanto, também pode ser empregada nos vetores virais.

[0010] A divulgação também fornece um método para prevenir a disseminação de proteínas tóxicas do trato gastrointestinal para o cérebro por meio da transferência de genes para o nervo vago que evita a transferência de proteínas tóxicas. Isso pode ocorrer por meio da injeção direta de vetores virais nos gânglios sensoriais do nervo vago, tal como o gânglio nodoso, ou injeção direta de vetores virais em corpos celulares eferentes vagais no cérebro, tal como o núcleo motor dorsal do vago, ou através de injeção de vetores virais na parede do trato gastrointenstinal ou através da administração oral, tais vetores sendo então absorvidos pelos axônios do nervo vago e transportados retrógrados para expressar um agente terapêutico dentro dos corpos celulares. Em um exemplo, um shRNA direcionado contra alfa- sinucleína, que impede a expressão da proteína alfa-sinucleína em neurônios alvo, é expresso a partir da forma retrógrada do vírus, por exemplo, um vetor retroAAV/rh10, liberado às fibras sensoriais vagais por meio de injeção na parede do estômago e/ou intestinos. A expressão resultante do shRNA dentro dos neurônios sensoriais do vago bloqueia a expressão da alfa-sinucleína endógena dentro desses neurônios, com a prevenção resultante da disseminação da patologia tóxica da sinucleína a partir de fibrilas patológicas no trato gastrointestinal que resulta em patologia cerebral generalizada observada na doença de Parkinson, uma vez que a expressão dentro dos neurônios é necessária para a propagação da sinucleína patológica. Em outro exemplo, o vetor retroAAV/rh10 dentro das fibras sensoriais vagais distribuídas através do trato gastrointestinal expressa um anticorpo direcionado contra a proteína alfa-sinucleína para prevenir a propagação da alfa-sinucleína. Em uma modalidade, o rAAV possui uma cápside com pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a SEQ ID NO: 5 ou 7.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 representa a expressão da proteína mCherry fluorescente em fibras aferentes (sensoriais) na região do núcleo motor dorsal do vago no cérebro após a injeção de vetores de AAV na parede do estômago. Um marcador retrógrado conhecido (subunidade B da toxina da cólera) foi injetado no estômago para marcar as fibras motoras aferentes. A injeção de um vetor misturado de sorotipos de AAV 2 e 1 (AAV2/1) não mostrou virtualmente nenhuma captação neuronal. A injeção de um retroAAV, que mostra captação retrógrada aumentada no cérebro, resultou na expressão da proteína mCherry dentro das fibras neuronais do núcleo motor dorsal, não nos corpos celulares, sugerindo que estas são fibras sensoriais que emanam do gânglio nodoso. O mesmo procedimento executado com um retroAAV híbrido e uma cápside de AAVrh10 mostrou um aumento no número de fibras que expressam mCherry na mesma região do cérebro.

[0012] A Figura 2 mostra a expressão da proteína mCherry dentro do gânglio nodoso, que abriga corpos celulares para neurônios sensoriais vagais, após a injeção de vetores de AAV na parede do estômago. O indicador de toxina da cólera mostra a marcação de um pequeno número de corpos celulares neuronais dentro do gânglio nodoso. Praticamente nenhum corpo celular positivo foi observado com AAV2/1, embora tenhamos observado alguma captação retrógrada em neurônios no cérebro. O retroAAV mostra um número aumentado de corpos celulares dentro do gânglio nodoso que expressa mCherry, indicando captação retrógrada eficaz, ainda que a captação seja seletiva, pois apenas um subconjunto de neurônios nodosos é marcado. O vetor híbrido retroAAV/rh10 demonstra mais marcação de corpos celulares neuronais no nodoso em comparação com retroAAV isoladamente, mesmo embora estes ainda representem um subconjunto de neurônios. A quantificação das contagens de células neuronais mostra um aumento de aproximadamente 3 vezes no número de neurônios positivos dentro do gânglio nodoso após a administração de retroAAV/rh10 na parede do estômago em comparação com retroAAV isoladamente.

[0013] A Figura 3 representa a resposta de camundongos em jejum normalmente alimentados injetados na parede do estômago com retroAAV/rh10 expressando um DREADD (hD3q) que ativa neurônios em resposta ao CNO. Os animais injetados com retroAAV/rh10 expressando o gene marcador mCherry alimentaram-se normalmente em resposta ao CNO. Os animais injetados com retroAAV/rh10 que expressam o DREADD, mas com solução salina em vez de CNO, tiveram alimentação normal idêntica durante 6 e 24 horas após a administração de solução salina em comparação com os animais de mCherry que receberam CNO. Os animais injetados com retroAAV/rh10 que expressam o DREADD e, em seguida, recebem CNO, apresentaram ingestão alimentar significativamente reduzida durante várias horas após a administração de CNO. Quando o CNO foi eliminado, o comportamento alimentar voltou ao normal, com a ingestão total de alimentos ao longo de 24 horas sendo reduzida em comparação com o controle devido a uma redução na ingestão de alimentos durante 4 a 6 horas após o CNO, enquanto que o período após o CNO passou de 6 a 24 horas apresentaram ingestão alimentar semelhante aos controles durante esse período.

[0014] As Figuras 4A-4B representam a resposta de camundongos injetados na parede do estômago com retroAAV/rh10 expressando um DREADD (hD3q) e subalimentados durante 24 horas antes da administração de CNO ou solução salina. Os animais injetados com retroAAV/rh10 expressando o gene marcador mCherry aumentaram a alimentação em comparação com os camundongos alimentados normalmente (comparar com a Figura 3) durante 6 horas e 24 horas após a administração de CNO. Os animais injetados com retroAAV/rh10 que expressam o DREADD, mas com solução salina em vez de CNO, tiveram alimentação idêntica durante 6 e 24 horas após a administração de solução salina em comparação com os animais de mCherry que receberam CNO. Os animais injetados com retroAAV/rh10 que expressam o DREADD e depois recebem CNO apresentaram ingestão alimentar significativamente reduzida durante várias horas após a administração de CNO, apesar dos animais terem passado fome nas 24 horas anteriores. O efeito foi tão profundo que a ingestão de alimentos durante 4 a 6 horas após a administração de CNO neste grupo subalimentado ainda foi menor do que os animais que foram normalmente alimentados antes do teste e, em seguida, receberam vetores de controle ou fármaco (ver a figura 3). Quando o CNO foi eliminado, o comportamento alimentar se recuperou neste grupo em comparação com o grupo normalmente alimentado, com os animais tendo aumento da ingestão de alimentos de 6 a 24 horas após o CNO ter sido eliminado, devido ao período de subalimentação que foi efetivamente prolongado pelo tratamento em comparação com controles. Isso foi diferente dos camundongos normalmente alimentados, onde a ingestão de alimento normal foi retomada após o CNO ser eliminado, mas não houve aumento da ingestão em comparação com os controles.

[0015] A Figura 5 ilustra uma abordagem exemplar para liberar a terapia genética para o controle da função do órgão.

[0016] A Figura 6 representa dados sobre o comportamento alimentar em camundongos em jejum com 3 mg/kg de CNO.

[0017] A Figura 7 mostra os dados com relação ao comportamento alimentar em camundongos normalmente alimentados com 3mg/kg de CNO.

[0018] As Figuras 8A-E representam dados de comportamento de alimentação em camundongos normalmente alimentados com 1 mg/kg de CNO.

[0019] As Figuras 9A-E mostram estabilidade de longo prazo do comportamento alimentar reduzido em camundongos normalmente alimentados com 1 mg/kg de CNO.

[0020] A Figura 10 mostra o ganho de peso reduzido em camundongos retro/rh10AAV HD3q (DREADD) na dieta com alto teor de gordura de 60% tratada com 1 mg/kg de CNO (C) diariamente em comparação com solução salina (S).

[0021] A Figura 11 representa o ganho de peso reduzido contínuo em camundongos retro/rh10AAV HD3q (DREADD) na dieta com alto teor de gordura de 60% tratada com 1 mg/kg de CNO (C) diariamente em comparação com solução salina (S).

[0022] As Figuras 12A-12M ilustram a sequência para pNLRep2_RETRO Cap2 (SEQ ID NO: 1).

[0023] As Figuras 13A-13B fornecem a sequência para pNLRep2_rh10Cap (SEQ ID NO: 2).

[0024] As Figuras 14A-14B mostram a sequência para AAV.CBA.flag-mCheryy.WPRE (SEQ ID NO: 3).

[0025] As Figura 15A-15P fornecem sequências exemplares para a cápside de AAVrh10 (SEQ ID Nos. 4 a 5) e retroAAV2 (SEQ ID Nos. 6 a 7).

[0026] As Figuras 16A-16B fornecem sequências para M3 e M4 humanos. DREADDs para hM3 podem ter uma substituição no resíduo 149 e/ou 239, por exemplo, Y149C ou A239G em mM3, e DREADDS para hM4 podem ter substituições no resíduo 113 e/ou 203, por exemplo, Y113C ou A203G em mM4 (SEQ ID NO: 12).

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0027] Um "vetor" refere-se a uma macromolécula ou associação de macromoléculas que compreende ou se associa a um polinucleotídeo e que pode ser utilizado para mediar a liberação do polinucleotídeo a uma célula, in vitro ou in vivo. Os vetores ilustrativos incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores virais, lipossomas e outros veículos de liberação de genes. O polinucleotídeo a ser liberado, às vezes referido como um "polinucleotídeo alvo" ou "transgene", pode compreender uma sequência de codificação de interesse na terapia genética (tal como um gene que codifica uma proteína de interesse terapêutico), uma sequência de codificação de interesse no desenvolvimento de vacina (tal como um polinucleotídeo que expressa uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo adequado para induzir uma resposta imune em um mamífero) e/ou um marcador selecionável ou detectável.

[0028] “Transdução”, “transfecção”, “transformação” ou “transdução”, como aqui utilizada, são termos que se referem a um processo para a introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira levando à expressão do polinucleotídeo, por exemplo, o transgene na célula, e inclui o uso de vírus recombinante para introduzir o polinucleotídeo exógeno na célula hospedeira. A transdução, transfecção ou transformação de um polinucleotídeo em uma célula pode ser determinada por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a expressão de proteína (incluindo níveis em estado estacionário), por exemplo, através de ELISA, citometria de fluxo e Western blot, medição de DNA e RNA através de ensaios de hibridização, por exemplo, Northern blots, Southern blots e ensaios de desvio da mobilidade de gel. Os métodos utilizados para a introdução do polinucleotídeo exógeno incluem técnicas bem conhecidas, tais como infecção ou transfecção viral, lipofecção, transformação e eletroporação, assim como outras técnicas de liberação de genes não virais. O polinucleotídeo introduzido pode ser estável ou transitoriamente mantido na célula hospedeira.

[0029] "Liberação de gene" refere-se à introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula para transferência de gene e pode abranger direcionamento, ligação, absorção, transporte, localização, integração e expressão do replicon.

[0030] "Transferência de gene" refere-se à introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula que pode abranger direcionamento, ligação, absorção, transporte, localização e integração de replicon, mas é distinto e não implica na expressão subsequente do gene.

[0031] "Expressão gênica" ou "expressão" refere-se ao processo de transcrição, translação e modificação pós-translação do gene.

[0032] Um vírus ou partícula viral "infecciosa" é aquele que compreende um componente de polinucleotídeo que é capaz de liberação dentro de uma célula para a qual a espécie viral é trófica. O termo não implica necessariamente qualquer capacidade de replicação do vírus.

[0033] O termo "polinucleotídeo" refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou seus análogos. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados ou capeados e análogos de nucleotídeos, e pode ser interrompido por componentes não nucleotídicos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polímero. O termo polinucleotídeo, como aqui utilizado, refere-se de modo trocável às moléculas de fita dupla e simples. A menos que especificado ou requerido de outra forma, qualquer modalidade da invenção aqui descrita que é um polinucleotídeo abrange tanto a forma de fita dupla quanto cada uma das duas formas de fita simples complementares conhecidas ou previstas de preparar a forma de fita dupla.

[0034] Um polinucleotídeo "isolado", por exemplo, plasmídeo, vírus, polipeptídeo ou outra substância, refere-se a uma preparação da substância desprovida de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde a substância ou uma substância semelhante naturalmente ocorre ou é inicialmente preparada. Assim, por exemplo, uma substância isolada pode ser preparada utilizando uma técnica de purificação para enriquecê-la a partir de uma mistura fonte. O ácido nucleico, peptídeo ou polipeptídeo isolado está presente em uma forma ou configuração diferente daquela em que é encontrada na natureza. Por exemplo, uma dada sequência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira na proximidade de genes vizinhos; sequências de RNA, tais como uma sequência específica de mRNA que codifica uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mistura com vários outros mRNAs que codificam uma infinidade de proteínas. A molécula de ácido nucleico isolada pode estar presente na forma de fita simples ou de fita dupla. Quando uma molécula de ácido nucleico isolada deve ser utilizada para expressar uma proteína, a molécula conterá, no mínimo, a fita senso ou de codificação (isto é, a molécula pode ser de fita simples), mas pode conter as fitas senso e antissenso (isto é, a molécula pode ser de fita dupla). O enriquecimento pode ser medido em uma base absoluta, tal como peso por volume de solução, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura fonte. Os enriquecimentos crescentes das modalidades desta invenção são cada vez mais preferidos. Assim, por exemplo, um enriquecimento de 2 vezes, enriquecimento de 10 vezes, enriquecimento de 100 vezes ou um enriquecimento de 1000 vezes.

[0035] Uma "sequência reguladora da transcrição" refere-se a uma região genômica que controla a transcrição de um gene ou sequência de codificação à qual está ligada de maneira operável. As sequências reguladoras da transcrição de uso na presente invenção geralmente incluem pelo menos um promotor da transcrição e também podem incluir um ou mais intensificadores e/ou dispositivos terminais da transcrição.

[0036] "Ligado de maneira operável" refere-se a uma disposição de dois ou mais componentes, em que os componentes assim descritos estão em uma conexão que permite que funcionem de uma maneira coordenada. A título de ilustração, uma sequência reguladora da transcrição ou um promotor está ligado de maneira operável a uma sequência de codificação se a TRS ou promotor promover a transcrição da sequência de codificação. Uma TRS ligada de maneira operável é geralmente unida em cis com a sequência de codificação, mas não é necessariamente de forma direta adjacente a ela.

[0037] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipicamente distinta da entidade com a qual é comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de engenharia genética em um tipo de célula diferente é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando expresso, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). Da mesma forma, um elemento regulador da transcrição tal como um promotor que é removido de sua sequência de codificação nativa e ligado de maneira operável a uma sequência de codificação diferente, é um elemento regulador da transcrição heterólogo.

[0038] Um "dispositivo terminal" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo que tende a diminuir ou prevenir a transcrição de leitura (isto é, diminui ou impede que a transcrição originada em um lado do dispositivo terminal continue até o outro lado do dispositivo terminal). O grau em que a transcrição é interrompida é tipicamente uma função da sequência de base e/ou do comprimento da sequência de dispositivo terminal.

Em particular, como é bem conhecido em vários sistemas biológicos moleculares, sequências de DNA particulares, geralmente referidas como "sequências de terminação da transcrição" são sequências específicas que tendem a interromper a transcrição de leitura pela RNA polimerase, presumivelmente fazendo com que a molécula de RNA polimerase pare e/ou desligue-se do DNA sendo transcrito.

Um exemplo típico de tais dispositivos terminais específicos da sequência incluem sequências de poliadenilação ("poliA"), por exemplo, SV40 poliA.

Além ou no lugar de tais dispositivos terminais específicos de sequência, as inserções de sequências de DNA relativamente longas entre um promotor e uma região de codificação também tendem a interromper a transcrição da região de codificação, geralmente em proporção ao comprimento da sequência interveniente.

Este efeito provavelmente surge porque existe sempre alguma tendência para uma molécula de RNA polimerase se desconectar do DNA sendo transcrito, e aumentar o comprimento da sequência a ser percorrida antes de atingir a região de codificação geralmente aumentaria a probabilidade de que o desengajamento ocorresse antes da transcrição da região de codificação ter sido concluída ou possivelmente até mesmo iniciada.

Os dispositivos terminais podem, assim, impedir a transcrição de apenas uma direção (dispositivos terminais "unidirecionais") ou de ambas as direções (dispositivos terminais "bidirecionais") e podem ser compostos de sequências de terminação específicas da sequência ou dispositivos terminais não específicos da sequência ou ambos.

Uma variedade de tais sequências de dispositivos terminais é conhecida na técnica; e o uso ilustrativo de tais sequências no contexto da presente invenção é fornecido abaixo.

[0039] "Células hospedeiras", "linhagens celulares", "culturas de células", "linhagem celular de acondicionamento" e outros termos significam células eucarióticas superiores, tais como células de mamíferos, incluindo células humanas, úteis na presente invenção, por exemplo, para produzir vírus recombinantes ou polipeptídeo de fusão recombinante. Essas células incluem a progênie da célula original que foi transferida. Entende-se que a progênie de uma única célula pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento genômico) à célula-mãe original.

[0040] "Recombinante", conforme aplicado a um polinucleotídeo significa que o polinucleotídeo é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição e/ou ligação e outros procedimentos que resultam em um construto que é distinto de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Um vírus recombinante é uma partícula viral que compreende um polinucleotídeo recombinante. Os termos incluem, respectivamente, réplicas do construto de polinucleotídeo original e descendência do construto de vírus original.

[0041] Um "elemento de controle" ou "sequência de controle" é uma sequência de nucleotídeo envolvida em uma interação de moléculas que contribui para a regulação funcional de um polinucleotídeo, incluindo replicação, duplicação, transcrição, junção, translação ou degradação do polinucleotídeo. A regulação pode afetar a frequência, velocidade ou especificidade do processo e pode ser de natureza intensificadora ou inibidora. Os elementos de controle conhecidos na técnica incluem, por exemplo, sequências reguladoras da transcrição, tais como promotores e intesificadores. Um promotor é uma região de DNA capaz, sob certas condições, de se ligar à RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma região de codificação geralmente localizada a jusante (na direção 3') do promotor. Os promotores incluem promotores de AAV, por exemplo, promotores P5,

P19, P40 e AAV ITR, assim como promotores heterólogos.

[0042] Um "vetor de expressão" é um vetor que compreende uma região que codifica um produto gênico de interesse e é utilizado para efetuar a expressão do produto gênico em uma célula alvo pretendida. Um vetor de expressão também compreende elementos de controle ligados de maneira operável à região de codificação para facilitar a expressão da proteína no alvo. A combinação de elementos de controle e um gene ou genes aos quais eles estão ligados de maneira operável para expressão é às vezes referida como um "cassete de expressão", um grande número dos quais são conhecidos e disponíveis na técnica ou podem ser facilmente construídos a partir de componentes que estão disponíveis na técnica.

[0043] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados de modo trocável nesta invenção para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, acetilação, fosforilação, lipidação ou conjugação com um componente de marcação.

[0044] O termo "exógeno", quando utilizado em relação a uma proteína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo em uma célula ou organismo refere-se a uma proteína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo que foi introduzido na célula ou organismo por meios naturais. Um ácido nucleico exógeno pode ser de um organismo ou célula diferente, ou pode ser uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucleico que ocorre naturalmente dentro do organismo ou célula. A título de exemplo não limitativo, um ácido nucleico exógeno está em uma localização cromossômica diferente daquela das células naturais, ou é flanqueado de outro modo por uma sequência de ácido nucleico diferente daquela encontrada na natureza, por exemplo, um cassete de expressão que liga um promotor de um gene a uma estrutura de leitura aberta com relação a um produto gênico de um gene diferente.

[0045] "Transformado" ou "transgênico" é aqui utilizado para incluir qualquer célula hospedeira ou linhagem celular, que foi alterada ou aumentada pela presença de pelo menos uma sequência de DNA recombinante. As células hospedeiras da presente invenção são tipicamente produzidas por transfecção com uma sequência de DNA em um vetor de expressão de plasmídeo, como uma sequência de DNA linear isolada, ou infecção com um vetor viral recombinante.

[0046] O termo "homologia de sequência" significa a proporção de correspondências de base entre duas sequências de ácido nucleico ou a proporção de correspondências de aminoácido entre duas sequências de aminoácido. Quando a homologia de sequência é expressa como uma porcentagem, por exemplo, 50%, a porcentagem significa a proporção de correspondências ao longo do comprimento de uma sequência selecionada que é comparada com alguma outra sequência. Intervalos (em qualquer uma das duas sequências) são permitidos para maximizar a correspondência; comprimentos de intervalo de 15 bases ou menos são geralmente utilizados, 6 bases ou menos são preferíveis com 2 bases ou menos mais preferíveis. Quando se utiliza oligonucleotídeos como sondas ou tratamentos, a homologia de sequência entre o ácido nucleico alvo e a sequência de oligonucleotídeo é geralmente não menor do que 17 correspondências de base alvo de 20 possíveis correspondências de pares de base de oligonucleotídeos (85%); não menos do que 9 correspondências entre 10 correspondências de pares de base possíveis (90%), ou não menos do que 19 correspondências de 20 correspondências de pares de base possíveis (95%).

[0047] Duas sequências de aminoácido são homólogas se houver uma identidade parcial ou completa entre suas sequências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências estão alinhadas para correspondência máxima. Intervalos (em qualquer uma das duas sequências sendo correspondidas) são permitidos para maximizar a correspondência; comprimentos de lacuna de 5 ou menos são preferidos com 2 ou menos sendo mais preferidos. Alternativa e preferivelmente, duas sequências de proteína (ou sequências de polipeptídeo derivadas delas de pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, como este termo é aqui utilizado, se elas tiverem uma pontuação de alinhamento de mais de 5 (em unidades de desvio padrão) utilizando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade para lacunas de 6 ou maior. As duas sequências ou partes das mesmas são mais homólogas se os seus aminoácidos forem maiores ou iguais a 50% idênticos quando alinhados de forma otimizada utilizando o programa ALIGN.

[0048] O termo "corresponde a" é utilizado nesta invenção para significar que uma sequência de polinucleotídeo está estruturalmente relacionada a toda ou uma parte de uma sequência de polinucleotídeo de referência, ou que uma sequência de polipeptídeo está estruturalmente relacionada a toda ou uma parte de uma sequência de polipeptídeo de referência, por exemplo, elas possuem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou mais, por exemplo, 99% ou 100%, de identidade de sequência. Na distinção por meio de contrastes, o termo "complementar a" é aqui utilizado para significar que a sequência complementar é homóloga a toda ou uma parte de uma sequência de polinucleotídeo de referência. Para ilustração, a sequência de nucleotídeo “TATAC” corresponde a uma sequência de referência “TATAC” e é complementar a uma sequência de referência “GTATA”.

[0049] O termo "identidade de sequência" significa que duas sequências de polinucleotídeo são idênticas (isto é, em uma base nucleotídeo a nucleotídeo) ao longo da janela de comparação. O termo

"porcentagem de identidade de sequência" significa que duas sequências de polinucleotídeo são idênticas (isto é, em uma base nucleotídeo a nucleotídeo) ao longo da janela de comparação. O termo "porcentagem de identidade de sequência" é calculado comparando duas sequências alinhadas de forma otimizada ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondidas, dividindo o número de posições correspondidas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Os termos "identidade substancial" como aqui utilizados significam uma característica de uma sequência de polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que possui pelo menos 85 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência, mais geralmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleotídeo, frequentemente ao longo de uma janela de pelo menos 20 a 50 nucleotídeos, em que a porcentagem de identidade de sequência é calculada através da comparação da sequência de referência com a sequência de polinucleotídeo que pode incluir supressões ou adições que totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência sobre a janela de comparação.

[0050] As substituições "conservativas" de aminoácido são, por exemplo, aspártico-glutâmico como aminoácidos polares acídicos; lisina/arginina/histidina como aminoácidos polares básicos; leucina/isoleucina/metionina/valina/alanina/glicina/prolina como aminoácidos não polares ou hidrofóbicos; serina/treonina como aminoácidos hidrófilos polares ou não carregados. A substituição conservadora de aminoácido também inclui agrupamentos baseados em cadeias laterais. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxila é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Por exemplo, é razoável esperar que a substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito maior nas propriedades do polipeptídeo resultante. Se uma alteração de aminoácido resulta em um polipeptídeo funcional, ele pode ser facilmente determinado pelo ensaio da atividade específica do polipeptídeo. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos; trp, tyr, phe.

[0051] A invenção também prevê polipeptídeos com substituições não conservativas. As substituições não conservativas envolvem a troca de um membro de uma das classes descritas acima por outra. Vetores de transferência de genes

[0052] A invenção fornece um vetor de transferência de gene, por exemplo, um vetor de transferência de gene viral, útil para liberar genes a neurônios ou fibras nervosas, ou a disseminação de um produto gênico que é tóxico, tal como proteína tóxica, a partir do trato gastrointestinal até o cérebro. Vários aspectos do vetor e método de transferência de genes são examinados abaixo. Consequentemente, qualquer combinação de parâmetros pode ser utilizada de acordo com o vetor de transferência de genes e o método.

[0053] Um "vetor de transferência de gene" é qualquer molécula ou composição que possui a capacidade de transportar uma sequência de ácido nucleico heteróloga para uma célula hospedeira adequada onde ocorre a síntese da proteína codificada. Tipicamente, um vetor de transferência de gene é uma molécula de ácido nucleico que foi projetada, utilizando técnicas de DNA recombinante que são conhecidas na técnica, para incorporar a sequência de ácido nucleico heteróloga. Desejavelmente, o vetor de transferência de genes é composto por DNA. Exemplos de vetores de transferência de genes baseados em DNA adequados incluem plasmídeos e vetores virais. No entanto, os vetores de transferência de genes que não são baseados em ácidos nucleicos, tais como lipossomas, também são conhecidos e utilizados na técnica. O vetor de transferência de gene da invenção pode ser baseado em um único tipo de ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo) ou molécula de ácido não nucleico (por exemplo, um lipídeo ou um polímero). O vetor de transferência de genes pode ser integrado no genoma da célula hospedeira ou pode estar presente na célula hospedeira na forma de um epissoma.

[0054] Em uma modalidade, o vetor de transferência de genes é um vetor viral. Os vetores virais adequados incluem, por exemplo, vetores retrovirais, vetores baseados no vírus herpes simplex (HSV), vetores baseados em parvovírus, por exemplo, vetores baseados em vírus adeno-associados (AAV), vetores quiméricos AAV-adenovirais e vetores baseados em adenovírus. Estes vetores virais podem ser preparados utilizando técnicas de DNA recombinante padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994).

[0055] Em uma modalidade, a invenção fornece um vetor de vírus adeno-associado (AAV). O vetor de AAV pode incluir um gene a ser expresso e componentes adicionais que não afetam materialmente o vetor de AAV (por exemplo, elementos genéticos tais como sequências poli(A) ou sítios de enzima de restrição que facilitam a manipulação do vetor in vitro). O vírus adeno-associado é um membro da família Parvoviridae e compreende um genoma de DNA linear de fita simples com menos de cerca de 5000 nucleotídeos. O AAV requer coinfecção com um vírus auxiliar (isto é, um adenovírus ou um vírus herpes), ou expressão de genes auxiliares, para replicação eficiente. Os vetores de AAV utilizados para administração de ácidos nucleicos terapêuticos tipicamente possuem aproximadamente 96% do genoma precursor anulado, de modo que apenas as repetições terminais (ITRs), que contêm sinais de reconhecimento para replicação e acondicionamento de DNA, permanecem. Isso elimina os efeitos colaterais imunológicos ou tóxicos devido à expressão de genes virais. Além disso, a liberação de proteínas específicas de AAV nas células produtoras permite a integração do vetor de AAV compreendendo as ITRs de AAV em uma região específica do genoma celular, se desejável (ver, por exemplo, as Patente U.S. 6.342.390 e 6.821.511). As células hospedeiras que compreendem um genoma de AAV integrado não apresentam nenhuma alteração no crescimento ou morfologia celular (ver, por exemplo, a Patente U.S. 4.797.368).

[0056] As ITRs de AAV flanqueiam as sequências de nucleotídeo de codificação únicas para as proteínas de replicação não estrutural (Rep) e as proteínas da cápside estrutural (Cap) (também conhecidas como proteínas de vírion (VPs)). Os 145 nucleotídeos terminais são autocomplementares e são organizados de modo que um duplex intramolecular energeticamente estável formando um grampo de cabelo em forma de T pode ser formado. Essas estruturas em forma de grampo de cabelo funcionam como uma origem para a replicação do DNA viral, servindo como iniciadores para o complexo celular de DNA polimerase. Os genes de Rep codificam as proteínas Rep Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. Rep78 e Rep68 são transcritas a partir do promotor p5, e Rep 52 e Rep40 são transcritas a partir do promotor p19. As proteínas Rep78 e Rep68 são proteínas de ligação ao DNA multifuncionais que executam funções de helicase e nickase durante a replicação produtiva para levar em conta a resolução de terminais de AAV (ver, por exemplo, Im et al., Cell, 61:447 (1990)). Estas proteínas também regulam a transcrição de promotores endógenos de AAV e promotores em vírus auxiliares (ver, por exemplo, Pereira et al., J. Virol., 71:1079 (1997)). As outras proteínas Rep modificam a função de Rep78 e Rep68. Os genes de cap codificam as proteínas da cápside VP1, VP2 e VP3. Os genes de cap são transcritos a partir do promotor p40.

[0057] O vetor de AAV pode ser gerado utilizando qualquer sorotipo de AAV conhecido na técnica. Vários sorotipos de AAV e mais de 100 variantes de AAV foram isolados de reservas de adenovírus ou de tecidos de primatas humanos ou não humanos (revisados em, por exemplo, Wu et al., Molecular Therapy, 14(3): 316 (2006)). Geralmente, os sorotipos de AAV possuem sequências genômicas de homologia significativa nos níveis de sequência de ácido nucleico e sequência de aminoácido, de tal modo que diferentes sorotipos possuem um conjunto idêntico de funções genéticas, produzem vírions que são essencialmente físicos e funcionalmente equivalentes, e se replicam e montam praticamente mecanismos idênticos. Os sorotipos de AAV 1 a 6 e 7 a 9 são definidos como sorotipos “verdadeiros”, em que eles não reagem de forma cruzada de forma eficiente com soros neutralizantes específicos para todos os outros sorotipos existentes e caracterizados. Em contraposição, os sorotipos de AAV 6, 10 (também referidos como Rh10) e 11 são considerados sorotipos “variantes”, pois não aderem à definição de um serótipo “verdadeiro”. O sorotipo 2 de AAV (AAV2) tem sido amplamente utilizado para aplicações de terapia genética devido à sua falta de patogenicidade, ampla faixa de possibilidade de infecção e capacidade de estabelecer a expressão do transgene de longo prazo (ver, por exemplo, Carter, Hum. Gene Ther., 16:541 (2005); e Wu et al., supra). As sequências genômicas de vários sorotipos de AAV e suas comparações são divulgadas, por exemplo, nos números de acesso do GenBank U89790, J01901, AF043303 e AF085716; Chiorini et al., J. Virol., 71:6823 (1997); Srivastava et al., J. Virol., 45:555 (1983); Chiorini et al., J. Virol., 73:1309 (1999); Rutledge et al., J. Virol., 72:309 (1998); e Wu et al., J. Virol., 74:8635 (2000)).

[0058] As sequências rep e ITR de AAV são particularmente conservadas na maioria dos sorotipos de AAV. Por exemplo, as proteínas Rep78 de AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4 e AAV6 são, de acordo com o relatado, de cerca de 89 a 93% idênticas (ver Bantel- Schaal et al., J. Virol., 73(2):939 (1999)). Foi relatado que os sorotipos 2, 3A, 3B e 6 de AAV compartilham cerca de 82% da identidade total da sequência de nucleotídeo no nível do genoma (Bantel-Schaal et al., supra). Além do mais, as sequências de rep e ITRs de muitos sorotipos de AAV são conhecidas de complementar de forma cruzada eficiente (por exemplo, substituir funcionalmente) as sequências correspondentes de outros sorotipos durante a produção de partículas de AAV em células de mamífero.

[0059] Geralmente, as proteínas cap, que determinam o tropismo celular da partícula de AAV, e sequências codificadoras de proteínas cap relacionadas, são significativamente menos conservadas do que os genes de Rep em diferentes sorotipos de AAV. Em vista da capacidade das sequências de Rep e ITR de complementar de forma cruzada as sequências correspondentes de outros sorotipos, o vetor de AAV pode compreender uma mistura de sorotipos e, assim, ser um vetor de AAV "quimérico" ou "pseudotipado". Um vetor de AAV quimérico tipicamente compreende proteínas da cápside de AAV derivadas de dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, etc.) diferentes sorotipos de AAV. Por outro lado, um vetor de AAV pseudotipado compreende uma ou mais ITRs de um sorotipo de AAV acondicionado em uma cápside de outro sorotipo de AAV. Os vetores de AAV quiméricos e pseudotipados são adicionalmente descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.723.551; Flotte, Mol. Ther., 13(1):1 (2006); Gao et al., J. Virol., 78:6381 (2004); Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:11854 (2002); De et al., Mol. Ther., 13:67 (2006); e Gao et al., Mol. Ther., 13:77 (2006).

[0060] Em uma modalidade, o vetor de AAV é gerado utilizando um AAV que infecta seres humanos (por exemplo, AAV2). Alternativamente, o vetor de AAV é gerado utilizando um AAV que infecta primatas não humanos, tais como, por exemplo, os grandes primatas (por exemplo, chimpanzés), macacos do Velho Mundo (por exemplo, macacos) e macacos do Novo Mundo (por exemplo, micos). Em uma modalidade, o vetor de AAV é gerado utilizando um AAV que infecta um primata não humano pseudotipado com um AAV que infecta seres humanos. Exemplos de tais vetores de AAV pseudotipados são divulgados em, por exemplo, Cearley et al., Molecular Therapy, 13:528 (2006). Em uma modalidade, um vetor de AAV pode ser gerado o qual compreende uma proteína da cápside de um AAV que infecta macacos resos pseudotipados com repetições terminais invertidas de AAV2 (ITRs). Em uma modalidade particular, o vetor de AAV da invenção compreende uma proteína da cápside de AAV10 (também referida como "AAVrh.10"), que infecta macacos resos pseudotipados com ITRs de AAV2 (ver, por exemplo, Watanabe et al., Gene Ther., 17(8):1042 (2010); e Mao et al., Hum. Gene Therapy, 22:1525 (2011)).

[0061] Além do gene a ser expresso, o vetor AAV pode compreender sequências de controle de expressão, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, dispositivos terminais de transcrição, sítios de entrada de ribossomo interno (IRES), e semelhantes, que fornecem a expressão da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Sequências de controle de expressão exemplares são conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990).

[0062] Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e reprimíveis, de uma variedade de fontes diferentes, é bem conhecido na técnica. Fontes representativas de promotores incluem, por exemplo, vírus, mamífero, inseto, planta, levedura e bactéria, e os promotores adequados dessas fontes são facilmente disponíveis ou podem ser produzidos sinteticamente, com base em sequências disponíveis publicamente, por exemplo, a partir de depósitos, tais como a ATCC, assim como outras fontes comerciais ou individuais. Os promotores podem ser unidirecionais (isto é, iniciam a transcrição em uma direção) ou bidirecionais (isto é, iniciam a transcrição em uma direção 3' ou 5'). Exemplos não limitativos de promotores incluem, por exemplo, o sistema de expressão bacteriana T7, sistema de expressão bacteriana pBAD (araA), o promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor SV40 e o promotor RSV. Os promotores induzíveis incluem, por exemplo, o sistema Tet (Patentes U.S. Nos. 5.464.758 e 5.814.618), o sistema induzível Ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:3346 (1996)), o sistema T-REXTM (Invitrogen, Carlsbad, CA), LACSWITCH™ System (Stratagene, San Diego, CA) e o sistema de recombinase induzível por tamoxifeno Cre- ERT (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27:4324 (1999); Nuc. Acid. Res., 28:e99 (2000); U.S. Patent No. 7,112,715; e Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308:123 (2005)).

[0063] O termo "intensificador" como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de DNA que aumenta a transcrição de, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico à qual está ligada de maneira operável. Os intensificadores podem estar localizados a muitos quilobases de distância da região codificadora da sequência de ácido nucleico e podem atuar como mediador da ligação de fatores reguladores, padrões de metilação do DNA ou alterações na estrutura do DNA. Um grande número de intensificadores de uma variedade de fontes diferentes é bem conhecido na técnica e está disponível como ou dentro de polinucleotídeos clonados (de, por exemplo, depositários tais como ATCC, assim como outras fontes comerciais ou individuais). Vários polinucleotídeos compreendendo promotores (tais como o promotor de CMV comumente utilizado) também compreendem sequências de intensificador. Os intensificadores podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante das sequências de codificação. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico está ligada de maneira operável a um intensificador de CMV/promotor de beta-actina de frango (também referido como um "promotor CAG") (ver, por exemplo, Niwa et al., Gene, 108:193 (1991); Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:2296 (1999); and Sondhi et al., Mol. Ther., 15:481 (2007)).

[0064] Tipicamente, os vetores de AAV são produzidos utilizando plasmídeos bem caracterizados. Por exemplo, células 293T de rim embrionário humano são transfectadas com um dos plasmídeos específicos do transgene e outro plasmídeo contendo o adenovírus auxiliar e genes rep e cap de AAV (específico para AAVrh.10, 8 ou 9 conforme necessário). Após 72 horas, as células são colhidas e o vetor é liberado das células por cinco ciclos de congelamento/descongelamento. A centrifugação subsequente e o tratamento com benzonase removem os resíduos celulares e o DNA não cercado por cápside. Gradientes de iodixanol e colunas de troca iônica podem ser utilizados para purificar ainda mais cada vetor de AAV. Logo depois, o vetor purificado é concentrado por uma coluna de centrifugação de exclusão por tamanho para a concentração requerida. Finalmente, o tampão é trocado para criar os produtos de vetor finais formulados (por exemplo) em solução salina tamponada com fosfato 1x. Os títulos virais podem ser medidos por PCR em tempo real TaqMan® e a pureza viral pode ser avaliada por SDS- PAGE. Composições farmacêuticas e liberação

[0065] A invenção fornece uma composição compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo no vetor de transferência de genes acima descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamente aceitável). Quando a composição consiste essencialmente no vetor de transferência de gene da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável, componentes adicionais podem ser incluídos que não afetam materialmente a composição (por exemplo, adjuvantes, tampões, estabilizantes, agentes anti-inflamatórios, solubilizantes, conservantes, etc.). Quando a composição consiste no vetor de transferência de gene da invenção e no veículo farmaceuticamente aceitável, a composição não compreende quaisquer componentes adicionais. Qualquer veículo adequado pode ser utilizado no contexto da invenção, e tais veículos são bem conhecidos na técnica. A seleção do veículo será determinada, em parte, pelo local particular ao qual a composição pode ser administrada e o método particular utilizado para administrar a composição. A composição opcionalmente pode ser estéril com exceção do vetor de transferência de genes aqui descrito. A composição pode ser congelada ou liofilizada para armazenamento e reconstituída em um veículo estéril adequado antes do uso. As composições podem ser geradas de acordo com técnicas convencionais descritas em, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

[0066] As formulações adequadas para a composição incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões e bacteriostáticos e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou múltiplas doses, tais como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) exigindo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente. Em uma modalidade, o veículo é uma solução salina tamponada. Em uma modalidade, o vetor de transferência de genes da invenção é administrado em uma composição formulada para proteger o vetor de transferência de genes de danos antes da administração. Por exemplo, a composição pode ser formulada para reduzir a perda do vetor de transferência de genes em dispositivos utilizados para preparar, armazenar ou administrar o vetor de transferência de genes, tais como artigos de vidro, seringas ou agulhas. A composição pode ser formulada para diminuir a sensibilidade à luz e/ou sensibilidade à temperatura do vetor de transferência de genes. Para este fim, a composição pode compreender um veículo líquido farmaceuticamente aceitável, tal como, por exemplo, aqueles descritos acima, e um agente estabilizante selecionado do grupo que consiste em polissorbato 80, L-arginina, polivinilpirrolidona, trealose, e suas combinações. O uso de tal composição irá estender a vida útil do vetor de transferência de genes, facilitar a administração e aumentar a eficiência do método da invenção. As formulações para composições contendo vetores de transferência de genes são ainda descritas em, por exemplo, Wright et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 6(2): 174- 178 (2003) and Wright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005)).

[0067] A composição também pode ser formulada para aumentar a eficiência de transdução. Além disso, uma pessoa versada na técnica irá observar que o vetor de transferência de genes da invenção pode estar presente em uma composição com outros agentes terapêuticos ou biologicamente ativos. Por exemplo, os fatores que controlam a inflamação, tais como ibuprofeno ou esteroides, podem fazer parte da composição para reduzir o inchaço e a inflamação associados à administração in vivo do vetor de transferência de genes. Estimuladores ou adjuvantes do sistema imunológico, por exemplo, interleucinas, lipopolissacarídeo e RNA de fita dupla, podem ser administrados para aumentar ou modificar a resposta imunológica. Antibióticos, isto é, microbicidas e fungicidas, podem estar presentes para tratar a infecção existente e/ou reduzir o risco de infecção futura, tal como infecção associada a procedimentos de transferência de genes.

[0068] As formas de depósito injetáveis são produzidas através da formação de matrizes de microencapsulação dos compostos em questão em polímeros biodegradáveis, tais como polilactídeo- poliglicolídeo. Dependendo da relação de fármaco para polímero, e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação do fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações injetáveis de depósito também são preparadas através da captura do fármaco em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com o tecido corporal.

[0069] Em certas modalidades, uma formulação da presente invenção compreende um polímero biocompatível selecionado do grupo que consiste em poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, polímeros de polivinila, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos e copolímeros dos mesmos, celuloses, polipropileno, polietilenos, poliestireno, polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidridos, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactídeo-co-caprolactona), polissacarídeos, proteínas, ácidos poli-hialurônicos, policianoacrilatos, e suas combinações, misturas ou copolímeros.

[0070] A composição pode ser administrada com ou em um dispositivo que permite a liberação controlada ou sustentada, tal como uma esponja, rede biocompatível, reservatório mecânico ou implante mecânico. Implantes (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.443.505), dispositivos (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.863.457), tais como um dispositivo implantável, por exemplo, um reservatório mecânico ou um implante ou um dispositivo composto de uma composição polimérica, são particularmente úteis para administração do vetor de transferência de genes da invenção. A composição também pode ser administrada na forma de formulações de liberação sustentada (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.378.475) que compreende, por exemplo, espuma de gel, ácido hialurônico, gelatina, sulfato de condroitina, um polifosfoéster, tal como bis-2-hidroxietil- tereftalato (BHET) e/ou um ácido polilático-glicólico.

[0071] A liberação das composições compreendendo os vetores de transferência de genes pode ser intracerebral (incluindo, mas não limitado a intraparenquimatoso, intraventricular ou intracisternal), intratecal (incluindo, mas não limitado a lombar ou cisterna magna) ou sistêmica, incluindo, mas não limitado a intravenosa, ou qualquer combinação dos mesmos, utilizando dispositivos conhecidos na técnica. A liberação também pode ser por meio de implantação cirúrgica de um dispositivo implantado.

[0072] A dose do vetor de transferência de genes na composição administrada ao mamífero dependerá de vários fatores, incluindo o tamanho (massa) do mamífero, a extensão de quaisquer efeitos colaterais, a via particular de administração e semelhantes. Em uma modalidade, o método da invenção compreende a administração de uma "quantidade terapeuticamente eficaz" da composição que compreende o vetor de transferência de genes da invenção aqui descrito. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para atingir um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais como patologia, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do vetor de transferência de genes para induzir uma resposta desejada no indivíduo. A dose do vetor de transferência de genes na composição necessária para atingir um determinado efeito terapêutico é tipicamente administrada em unidades de cópias do genoma do vetor por célula (gc/célula) ou cópias do genoma do vetor/por quilograma de peso corporal (gc/kg). Uma pessoa versada na técnica pode facilmente determinar uma faixa de dose de vetor de transferência de genes apropriada para tratar um paciente tendo uma doença ou distúrbio particular, com base nestes e outros fatores que são bem conhecidos na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz pode ficar entre 1 x 1010 cópias do genoma a 1 x 1013 cópias do genoma.

[0073] Em uma modalidade, o vetor é um vetor de adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), retrovírus ou lentivírus. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 ou cápside de AAV7. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com AAVrh.10, AAV8 ou AAV5. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10. É fornecida ainda uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade do vetor de terapia genética descrito acima. Uma dose do vetor viral pode ser cerca de 1 x 1011 a cerca de 1 x 1016 cópias do genoma, cerca de 1 x 1012 a cerca de 1 x 1015 cópias do genoma, cerca de 1 x 1011 a cerca de 1 x 1013 cópias do genoma ou cerca de 1 x 1013 a cerca 1 x 1015 cópias do genoma.

[0074] Em uma modalidade da invenção, a composição é administrada uma vez ao mamífero. Acredita-se que uma única administração da composição resultará na expressão persistente no mamífero com efeitos colaterais mínimos. No entanto, em certos casos, pode ser apropriado administrar a composição várias vezes durante um período terapêutico para garantir a exposição suficiente das células à composição. Por exemplo, a composição pode ser administrada ao mamífero duas ou mais vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 9 ou 10 ou mais vezes) durante um período terapêutico. Modalidades Exemplares

[0075] A invenção fornece materiais e métodos úteis para o controle da função do órgão para prevenir, inibir ou tratar doenças. Em um aspecto, o método fornece a liberação de vetores virais a órgãos que são depois absorvidos pelos axônios dos nervos que regulam a função desses órgãos. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado (AAV). Em uma modalidade, uma forma retrógrada de vírus adeno-associado (AAV), quando injetada na parede do estômago, é especificamente absorvida em um subconjunto de neurônios sensoriais do nervo vago que respondem à distensão do estômago e causam saciedade. Isso representa um subconjunto específico de neurônios que emanam do gânglio nodoso, embora não afete outros neurônios nodosos que fornecem sensação a outros órgãos viscerais. O vetor viral também pode ser outras formas de vetores retrógrados, incluindo, mas não limitado a vetores lentivirais retrógrados (LV), vetores de vírus herpes simplex (HSV) ou vetores de adenovírus canino (CAV).

[0076] A invenção também fornece um vetor viral com propriedades melhoradas para absorção retrógrada em neurônios alvo. Este vetor contém uma cápside, que contém uma mistura de proteínas da cápside de um sorotipo de AAV, por exemplo, AAV sorotipo 2, com mutações pontuais que aumentam a captação retrógrada (retroAAV) (Tevro, et al., Neuron 92: 372-378 (2016), que é aqui incorporado por referência) e proteínas da cápside de um sorotipo diferente de AAV, por exemplo, sorotipo rh10 de AAV. Essa combinação de cápside cria um vetor viral que aumentou drasticamente a captação retrógrada e a eficiência nos neurônios aferentes em comparação com as cápsides que contêm proteínas exclusivamente do retroAAV. Este vetor fornece controle eficiente da função do órgão.

[0077] A invenção também fornece um método para controle regulado da função do órgão. O método geralmente inclui a liberação de um gene por meio de um vetor retrógrado aos neurônios aferentes aos órgãos, cujo produto responde a um fármaco externo ou estímulo para controlar a função do órgão. Em um exemplo, este método pode ser utilizado para induzir a saciedade e reduzir a ingestão de alimentos a fim de controlar o peso corporal. Neste exemplo, o AAV retrógrado (retroAAV) que expressa um Receptor de Designer Ativado Exclusivamente por Fármacos de Designer (DREADD) que ativa neurônios, é injetado na parede do estômago e é absorvido nos neurônios sensoriais vagos, aferentes ao estômago, que respondem para esticar o estômago e induzir saciedade. Após a administração sistêmica de um ativador de DREADD, por exemplo, clozapina-N-óxido (CNO), a saciedade é induzida e a ingestão de alimentos é diminuída. Outros exemplos incluem a liberação de um canal iônico quimiogenético excitatório para esses neurônios, seguido pela ativação com o fármaco apropriado ou a liberação do canal iônico optogenético excitatório ChR2 seguido pela liberação de luz nas fibras nervosas para ativar o ChR2. Em outro exemplo, este método é utilizado para controlar a tosse intratável que não é provocada por uma doença tratável de outra forma. Neste exemplo, o AAV retrógrado que expressa um DREADD inibidor é aerossolizado e inalado para absorção dentro dos neurônios sensoriais vagos do pulmão, seguido pela administração sistêmica de um ativador de DREADD, por exemplo, CNO, para inibir a atividade desses neurônios sensoriais para reduzir o reflexo da tosse.

[0078] A divulgação também fornece um método para prevenir a disseminação de proteínas tóxicas do trato gastrointestinal para o cérebro por meio da transferência de genes para o nervo vago que evita a transferência de proteínas tóxicas. Isso pode ocorrer por meio da injeção direta de vetores virais nos gânglios sensoriais do nervo vago, tais como o gânglio nodoso, ou injeção direta de vetores virais em corpos celulares eferentes vagais no cérebro, tais como o núcleo motor dorsal do vago, ou através de injeção de vetores virais na parede do trato gastrointenstinal ou através da administração oral, tais vetores sendo então absorvidos pelos axônios do nervo vagal e transportados retrógrados para expressar um agente terapêutico dentro dos corpos celulares. Em um exemplo, um shRNA direcionado contra alfa-sinucleína, que impede a expressão da proteína alfa- sinucleína em neurônios alvo, é expresso a partir da forma retrógrada do vírus, por exemplo, um vetor retroAAV/rh10, liberado nas fibras sensoriais vagais por meio de injeção na parede do estômago e/ou intestinos. A expressão resultante do shRNA dentro dos neurônios sensoriais do vago bloqueia a expressão da alfa-sinucleína endógena dentro desses neurônios, com a prevenção resultante da disseminação da patologia tóxica da sinucleína a partir de fibrilas patológicas no trato gastrointestinal que resulta em patologia cerebral generalizada observada na doença de Parkinson, uma vez que a expressão dentro dos neurônios é necessária para a propagação da sinucleína patológica. Em outro exemplo, o vetor de retroAAV/rh10 dentro das fibras sensoriais vagais distribuídas através do trato gastrointestinal expressa um anticorpo direcionado contra a proteína alfa-sinucleína para prevenir a propagação.

[0079] Em uma modalidade, um método de liberação de genes nas fibras nervosas que controlam a função do órgão é fornecido, cujo método compreende a liberação de um vetor de terapia genética em regiões de órgãos alvo inervados pelos nervos reguladores. Em uma modalidade, as fibras nervosas são selecionadas a partir de um grupo que consiste em nervo vago, nervos cardiopulmonares, nervos esplâncnicos torácicos, nervos esplâncnicos lombares, nervos esplâncnicos sacrais e nervos esplâncnicos pélvicos. Em uma modalidade, o órgão é selecionado a partir de um grupo que consiste em estômago, intestinos, pâncreas, fígado, pulmão, coração, adrenal, rim, gônadas, bexiga, esfíncter anal e urinário. Em uma modalidade, o vetor de terapia genética é um vetor viral selecionado de um grupo que consiste em vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus, vírus herpes simplex. Em uma modalidade, o vetor de terapia genética é um vetor viral modificado selecionado para transporte retrógrado no sistema nervoso central, incluindo formas retrógradas de vírus adeno- associado e lentivírus e adenovírus canino.

[0080] Em uma modalidade, um método de regulação da função de um órgão para melhorar a doença, cujo método compreende a liberação de um gene capaz de modular a atividade neuronal para o nervo que controla o órgão através da injeção de um vetor de terapia genética no órgão para absorção e transporte retrógrado no neurônio. Em uma modalidade, a fibra nervosa é selecionada de um grupo que consiste em nervo vago, nervos cardiopulmonares, nervos esplâncnicos torácicos, nervos esplâncnicos lombares, nervos esplâncnicos sacrais e nervos esplâncnicos pélvicos. Em uma modalidade, o órgão é selecionado de um grupo que consiste em estômago, intestinos, pâncreas, fígado, pulmão, coração, adrenal, rim, gônadas, bexiga, esfíncter anal e urinário. Em uma modalidade, os vetores virais selecionados de um grupo que consiste em vírus adeno- associado, lentivírus, adenovírus, vírus herpes simplex. Em uma modalidade, vetores virais modificados selecionados para o transporte retrógrado no sistema nervoso central, incluindo formas retrógradas de vírus adeno-associado e lentivírus e adenovírus canino, são empregados. Em uma modalidade, o gene sendo liberado regula a atividade do nervo que controla o órgão em resposta a um agente exógeno ou estímulo. Em uma modalidade, o gene sendo liberado codifica um ou mais canais iônicos sensíveis à luz (optogenética), canais iônicos quimicamente responsivos (quimogenética), canais iônicos sensíveis a ultrassom (sonogenética), canais iônicos responsivos a campo magnético (magnetogenética) e receptores de designer exclusivamente ativados por fármacos sintéticos (DREADDs).

[0081] Em uma modalidade, um método para controlar a ingestão de alimentos é fornecido através da liberação de um vetor viral nas fibras do nervo vago através da injeção de vetores em órgãos viscerais para reduzir a ingestão de alimentos. Em uma modalidade, o órgão é o estômago, duodeno ou intestino delgado. Em uma modalidade, o gene sendo liberado regula a atividade do nervo que controla o órgão em resposta a um agente exógeno ou estímulo. Em uma modalidade, o gene a ser liberado é aquele que codifica um ou mais canais iônicos sensíveis à luz (optogenética), canais iônicos quimicamente responsivos (quimogenética), canais iônicos sensíveis a ultrassom (sonogenética), canais iônicos responsivos a campo magnético (magnetogenética) e receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs).

[0082] Em uma modalidade, um método de prevenção da tosse é fornecido através da liberação de um vetor viral nas fibras nervosas do pulmão por meio da inalação de vetores virais. Em uma modalidade, o gene sendo liberado regula a atividade do nervo que controla o órgão em resposta a um agente exógeno ou estímulo. Em uma modalidade, o gene codifica uma ou mais proteínas, incluindo um ou mais dos canais iônicos sensíveis à luz (optogenética), canais iônicos quimicamente responsivos (quimogenética), canais iônicos sensíveis a ultrassom (sonogenética), canais iônicos responsivos a campo magnético (magnetogenética) e receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs).

[0083] Em uma modalidade, um vetor viral para liberação retrógrada aprimorada e absorção em neurônios que controlam órgãos viscerais é fornecido. Em uma modalidade, o vetor compreende um vetor viral adeno-associado com uma cápside compreendendo uma mistura de cápsides, por exemplo, de AAV retro e AAVrh10.

[0084] Em uma modalidade, um método de prevenção da propagação de proteínas tóxicas do trato gastrointestinal para o cérebro através da liberação de vetores virais ao nervo vago que expressa genes capazes de bloquear a propagação de proteínas tóxicas é fornecido. Em uma modalidade, o vetor viral é absorvido retrógrado do sistema gastrointestinal. Em uma modalidade, a proteína tóxica sendo direcionada é selecionada a partir de um grupo que consiste em alfa-sinucleína, tau, beta-amiloide ou huntingtina. Em uma modalidade, o gene que está sendo expresso a partir do nervo vago para evitar a disseminação de proteínas tóxicas é selecionado a partir de um grupo que consiste em RNA em forma de grampo de cabelo pequeno (shRNA), microRNA (miRNA), CrispR/Cas9, anticorpos, anticorpos de cadeia única ou intracorpos.

[0085] Em uma modalidade, um método para prevenir, inibir ou tratar uma tosse em um mamífero é fornecido. O método inclui a liberação, por exemplo, injeção, de uma composição compreendendo um vetor viral que compreende um gene que codifica uma proteína, cuja atividade é inibida pela administração de um agente exógeno ou liberação de energia, indiretamente nas fibras nervosas parassimpáticas que inervam o pulmão do mamífero; e exposição do mamífero ao agente ou energia em uma quantidade eficaz para prevenir, inibir ou tratar a tosse no mamífero. Em uma modalidade, a composição é administrada por meio de inalação. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Em uma modalidade, o mamífero possui tosse idiopática ou tosse intratável. Em uma modalidade, o mamífero possui a doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) ou refluxo gástrico. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus ou vírus herpes simplex. Em uma modalidade, o vírus é uma forma retrógrada do vírus adeno-associado (AAV), lentivírus ou adenovírus canino. Em uma modalidade, o vírus é modificado para transporte retrógrado. Em uma modalidade, o AAV possui uma cápside compreendendo proteínas de mais de um sorotipo de AAV. Em uma modalidade, as proteínas da cápside são AAV2 e AAVrh10. Em uma modalidade, as proteínas da cápside são AAV5 e AAVrh10. Em uma modalidade, as proteínas da cápside são AAV2 e AAV5. Em uma modalidade, o gene codifica um canal iônico sensível à luz (optogenética), um canal iônico quimicamente responsivo (quimogenética), um canal iônico sensível a ultrassom (sonogenética), um canal iônico responsivo a campo magnético (magnetogenética) ou um receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs).

[0086] Em uma modalidade, um método de prevenção, inibição ou tratamento da tosse é fornecido compreendendo a liberação de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um vetor viral que compreende um gene, para fibras nervosas de um pulmão de mamífero. Em uma modalidade, a expressão do gene inibe a atividade neuronal. Em uma modalidade, o gene codifica um DREADD ou algum outro canal quimogenético, GAD para a produção de GABA para inibir um neurônio, ou um siRNA para bloquear uma proteína ou canal excitante. Em uma modalidade, a composição é administrada por meio de inalação ou injeção, por exemplo, diretamente no nervo vago ou gânglio nodoso. Em uma modalidade, o gene regula a atividade do nervo que controla o órgão em resposta a um agente ou estímulo exógeno. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Em uma modalidade, o mamífero possui tosse idiopática ou tosse intratável. Em uma modalidade, o mamífero possui COPD ou refluxo gástrico. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus ou vírus herpes simplex. Em uma modalidade, o vírus é uma forma retrógrada de vírus adeno-associado, lentivírus ou adenovírus canino. Em uma modalidade, o vírus é modificado para o transporte retrógrado. Em uma modalidade, o gene codifica um canal iônico sensível à luz (optogenética), um canal iônico quimicamente responsivo (quimogenética), um canal iônico sensível ao ultrassom (sonogenética), um canal iônico responsivo a campo magnético (magnetogenética) ou um receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs). Em uma modalidade, o vetor viral é um rAAV compreendendo uma cápside viral adeno-associada quimérica compreendendo dois ou mais sorotipos da cápside de AAV diferentes. Em uma modalidade, o vetor viral transfere os aferentes vagais. Em uma modalidade, um dos sorotipos de AAV compreende AAV2. Em uma modalidade, um dos sorotipos de AAV compreende AAVrh10.

[0087] Em uma modalidade, um método para a liberação de genes às fibras nervosas para controlar a função do órgão visceral em um mamífero é fornecido. Em uma modalidade, um órgão visceral não inclui cérebro ou músculo. O método inclui a liberação de uma composição compreendendo um vetor viral que compreende um gene que codifica uma proteína, a atividade da qual é inibida pela administração de um agente exógeno ou liberação de energia, a uma ou mais regiões de um órgão de mamífero inervado por um nervo regulador; e exposição do mamífero ao agente ou à energia em uma quantidade eficaz. Em uma modalidade, a fibra nervosa é o nervo vago, nervo cardiopulmonar, nervo esplâncnico torácico, nervo esplâncnico lombar, nervo esplâncnico sacral ou nervo esplâncnico pélvico. Em uma modalidade, o órgão de mamífero a ser controlado é um estômago, intestino, pâncreas, fígado, pulmão, coração, adrenal, rim, gônada, bexiga, esfíncter anal ou esfíncter urinário. Em uma modalidade, a composição é administrada a um estômago, intestino, pâncreas, fígado, pulmão, coração, adrenal, rim, gônada, bexiga, esfíncter anal ou esfíncter urinário, ou a um vaso sanguíneo, ducto ou outra cavidade.

Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus ou vírus herpes simplex.

Em uma modalidade, o vetor viral fornece o transporte retrógrado nos neurônios.

Em uma modalidade, o vírus é modificado para fornecer o transporte retrógrado no sistema nervoso central.

Em uma modalidade, o vírus é uma forma retrógrada de vírus adeno-associado, lentivírus ou adenovírus canino.

Em uma modalidade, o gene regula a atividade do nervo que controla o órgão em resposta a um agente exógeno ou estímulo.

Em uma modalidade, o gene codifica um canal iônico sensível à luz (optogenética), um canal iônico quimicamente responsivo (quimogenética), um canal iônico sensível ao ultrassom (sonogenética), um canal iônico responsivo ao campo magnético (magnetogenética) ou um receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs). Em uma modalidade, o gene codifica um canal rodopsina, por exemplo, TREK-1, receptor nicotínico de acetilcolina, gramicidina A, um canal de potássio ativado por voltagem, um canal de glutamato ionotrópico, NaV1.5, KCNQ1, KCNA, MEC-4, um canal iônico DEG/ENaC/ASIC ou um canal iônico mecanossensível (MscL) tal como TRPV4. Em uma modalidade, a composição é liberada ao nervo vago.

Em uma modalidade, a quantidade administrada leva em conta o controle da ingestão de alimentos no mamífero.

Em uma modalidade, o órgão visceral é um estômago, duodeno ou intestino delgado.

Em uma modalidade, o gene codifica um produto gênico capaz de bloquear a propagação de proteínas tóxicas no nervo vago do mamífero.

Em uma modalidade, o vetor viral é absorvido retrógrado do sistema gastrointestinal.

Em uma modalidade, a proteína tóxica compreende alfa-sinucleína, tau, beta-

amiloide ou huntingtina. Em uma modalidade, o gene codifica RNA em forma de grampo de cabelo (shRNA), microRNA (miRNA), CrispR/Cas9, um anticorpo, um anticorpo de cadeia única ou um intracorpo. Em uma modalidade, a quantidade administrada previne ou inibe a disseminação de uma proteína tóxica do trato gastrointestinal para o cérebro em um mamífero. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus ou vírus herpes simplex. Em uma modalidade, o vírus é modificado para fornecer transporte retrógrado no sistema nervoso central. Em uma modalidade, o vírus é uma forma retrógrada do vírus adeno-associado, lentivírus ou adenovírus canino. Em uma modalidade, um dos sorotipos de AAV compreende AAV2. Em uma modalidade, um dos sorotipos de AAV compreende AAVrh10. Em uma modalidade, o vetor viral é um rAAV compreendendo uma cápside viral adeno-associada quimérica compreendendo dois ou mais sorotipos diferentes da cápside de AAV. Em uma modalidade, a quantidade administrada previne, inibe ou trata doenças em um órgão visceral no mamífero.

[0088] Em uma modalidade, um rAAV compreendendo uma cápside formada por proteínas da cápside de dois ou mais sorotipos de AAV diferentes (uma cápside de AAV quimérico) é fornecido. Em uma modalidade, um dos sorotipos compreende AAV2. Em uma modalidade, um dos sorotipos compreende AAVrh10. Em uma modalidade, um dos sorotipos da cápside compreende AAV2 e o outro compreende AAVrh10. Em uma modalidade, um dos sorotipos da cápside compreende AAV2 e o outro compreende AAV1, AAV3, AAV5, AAV8 ou AAV9. Em uma modalidade, um dos sorótipos da cápside compreende AAVrh10 e o outro compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV8 ou AAV9. Em uma modalidade, um dos sorótipos da cápside compreende AAV5 e o outro compreende AAV1, AAV2, AAV3,

AAV8 ou AAV9. Em uma modalidade, um dos sorotipos da cápside compreende AAV9 e o outro compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV5 ou AAV8. Em uma modalidade, um dos sorotipos da cápside fornece a liberação retrógrada. Em uma modalidade, o rAAV codifica um produto gênico terapêutico, um produto gênico profilático ou proteína exogenamente ativada.

[0089] A invenção será ainda descrita pelos seguintes exemplos não limitativos. Exemplo 1

[0090] As figuras mostram um método para controlar o comportamento alimentar por meio de terapia regulada de genes. A obesidade está entre os problemas de saúde pública mais comuns. A prevalência de mais de 700 milhões de obesos em todo o mundo (IMC > 30kg/m2) dobrou nos últimos 25 anos (GBD obesity collaborators, Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries Over 25 years, NEJM 377:13, 2017). Mais de 78 milhões de obesos nos U.S. O IMC > 30 está associado à redução da longevidade e ao aumento do risco de inúmeras doenças incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer. A obesidade severa (> 40 kg/m2) representa uma população em rápido crescimento com fortes necessidades não atendidas. Aproximadamente 15 milhões U.S. em 2010, projetados para aumentar para 25 milhões U.S. até 2025 (Finkelstein, et al Obesity and Severe Obesity Forecasts through 2030, Am J Prev Med 42:563, 2012). A perda de 5 a 15% do excesso de peso corporal reduz os fatores de risco com relação às doenças cardiovasculares e outras doenças em ensaios clínicos randomizados (Office of Surgeon General, Call to Action to Prevent and Decrease Overweight and Obesity, 2001).

[0091] A cirurgia bariátrica é a principal opção atual para pacientes com obesidade grave. O procedimento mais popular é a gastrectomia vertical para reduzir o tamanho do estômago e induzir a saciedade precoce. 228.000 cirurgias bariátricas executadas nos U.S. em 2017, apesar de 15 a 25 milhões de pessoas atenderem aos critérios para cirurgia (IMC > 40 ou IMC 30 a 40 com graves problemas de saúde relacionados ao peso) (https://asmbs.org/resources/estimate-of- bariatric-surgery-numbers). Mais de 14% foram cirurgias de revisão. O regime pós-cirúrgico requer 1 a 3 dias no hospital, em seguida, líquidos apenas durante 7 dias, purê de alimentos durante 3 semanas antes de retornar à dieta regular (https://www.mayoclinic.org/tests- procedures/sleeve-gastrectomy/about/pac-20385183). Suplemento multivitamínico e de cálcio diário contínuo e injeção mensal de B12 necessários para a vida devido à má absorção. Cirurgia bariátrica associada com a taxa de complicações de 13 a 21%. A abordagem de terapia genética minimamente invasiva forneceria uma opção de procedimento ambulatorial sem necessidade de gerenciamento pós- procedimento e risco mínimo de complicações cirúrgicas.

[0092] A Figura 1 mostra os dados para a liberação de AAV no trato gastrointestinal para direcionar o núcleo dorsal do nervo vago: sinal mCherry no núcleo dorsal do nervo vago. Diferentes vetores de AAV foram injetados no corpo do estômago (1 x 1012 p/ml), assim como a subunidade B da toxina da cólera marcada com fluorescência (CTB-594) como um controle positivo. No dia da cirurgia, os camundongos também receberam uma injeção i.p. de retro-traçador Fluorogold para marcar a soma dos neurônios aferentes e eferentes no trato gastrointestinal. Quatro semanas após a cirurgia, gânglios nodosos e cérebro foram colhidos para análise histológica da proteína fluorescente vermelha mCherry, que é expressa como um cassete sob o promotor de beta-actina de frango pelos vetores de AAV (AAV.CBA.mCherry).

[0093] A Figura 2 ilustra a liberação de AAV no trato gastrointestinal para direcionar o núcleo dorsal do nervo vago: sinal mCherry no gânglio nodoso. Diferentes vetores de AAV foram injetados no corpo do estômago (1 x 1012 p/ml), assim como a subunidade B da toxina da cólera marcada com fluorescência (CTB- 594) como um controle positivo. No dia da cirurgia, os camundongos também receberam uma injeção i.p. de retro-traçador Fluorogold para marcar o soma dos neurônios aferentes e eferentes no trato gastrointestinal. Quatro semanas após a cirurgia, gânglios nodosos e cérebro foram colhidos para análise histológica da proteína fluorescente vermelha mCherry, que é expressa como um cassete sob o promotor de beta-actina de frango pelos vetores de AAV (AAV.CBA.mCherry).

[0094] A Figura 3 são os dados de comportamento alimentar de camundongos em jejum com 1 mg/kg de CNO e a Figura 4 são os dados de comportamento alimentar em camundongos normalmente alimentados com 1 mg/kg de CNO.

[0095] Uma abordagem para liberação de um vetor viral para controlar as funções do órgão é mostrada na Figura 5. Por exemplo, a composição tendo um rAAV que codifica hM3Dq, ver, por exemplo, SEQ ID Nos. 10 ou 11 na Figura 16 que é modificada para DREADD hM3Dq, pode ser administrada por via endoscópica ou laparoscópica, por exemplo, à grande curvatura do estômago, o que em uma modalidade leva em conta a liberação do vírus aos nervos aferentes vagais. Em algumas modalidades, a administração pode levar em conta a liberação aos nervos eferentes vagais ou neurônios motores. Em uma modalidade, a composição é liberada a um órgão visceral, incluindo, mas não limitado a coração, fígado, pulmão, adrenal, tireoide, pâncreas, intestino, rim, bexiga ou baço.

[0096] Em uma modalidade, a cápside de AAV quimérico compreende uma relação de 0,1:1, 0,5:1, 1:1, 1:3, 1:4, 1:5, 1:15, 1:20,

1:50, 1:100, 1:500 de um sorotipo de AAV, por exemplo, AAV2, com outro sorotipo de AAV, por exemplo, a cápside de AAVrh10. Exemplo 2

[0097] O reflexo da tosse normalmente é importante para expulsar potenciais agentes obstrutivos ou infecciosos das vias respiratórias do pulmão. A tosse intratável geralmente é tratada através da tentativa de abordar a causa subjacente da tosse, tal como refluxo gástrico, inflamação crônica por asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica ou malignidade. Para muitas pessoas, entretanto, a tosse crônica é o problema principal sem um irritante ou estimulante claro e contínuo que possa ser tratado. Isso é semelhante à dor intratável, que pode ser devido a uma patologia subjacente que precisa ser revertida, mas muitas vezes a própria dor precisa ser tratada, pois não há nenhuma anormalidade que possa ser revertida. Para pacientes com tosse intratável sem uma patologia reversível, existem poucas opções de tratamento. Os narcóticos podem ser utilizados para tentar suprimir a tosse, mas apresentam grande morbidade, especialmente com o uso crônico.

[0098] A fim de suprimir a tosse em um modelo animal, retroAAV2/rh10 que expressa o DREADD inibidor hM4Di (1 x 1012 p/ml) (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 12 para M4 na Figura 16 que é modificado para DREADD hM4Di) é aerossolizado e pulverizado na traquéia e vias aéreas superiores de cobaias. A cobaia é utilizada porque apresenta um reflexo de tosse robusto, enquanto que ratos e camundongos não têm um reflexo de tosse eficaz. Seis semanas após a exposição, a avaliação histológica utilizando imunocoloração confirma a expressão da opsina inibidora dentro de uma subpopulação de neurônios dentro do gânglio nodoso que fornece sensação à traqueia e às vias aéreas superiores. Um segundo grupo de porquinhos da índia é então dividido em duas coortes. Uma coorte recebe novamente o mesmo vetor aerossolizado retroAAV2/rh10.hM4Di pulverizado nas vias aéreas superiores, enquanto que a segunda coorte recebe retroAAV2/rh10 expressando mCherry como um controle negativo.

Seis semanas depois, os animais são colocados em uma câmara de plexiglass fechada.

A câmara contém um monitor de pressão para avaliar as mudanças na pressão do ar dentro da câmara devido à tosse, e também contém um microfone que pode capturar o som de uma tosse.

Isso permite o monitoramento contínuo da frequência, número geral e intensidade das tosses, e os monitores são travados no tempo para confirmar que uma tosse verdadeira ocorre quando o som e a pressão mudam.

Para induzir a tosse, a câmara é então carregada com ácido cítrico 2M nebulizado em uma taxa de 5L/min, que é suficientemente diluído para não provocar lesão permanente ao animal, mas irritará as vias aéreas e causará tosse.

Ambas as coortes são então expostas ao gás ácido e o número, frequência e intensidade das tosses em ambos os grupos são avaliados durante 10 minutos para confirmar que não há diferença entre os grupos na linha de base.

Um terceiro grupo de porquinhos da índia não tratados é exposto à câmara de ácido cítrico para confirmar que a presença do vetor retrógrado e a pulverização por aerossol não influenciam a tosse de base em comparação com animais puros.

Em uma segunda sessão, todas as coortes recebem então 1 mg/kg de CNO 30 minutos antes de serem colocadas na câmara de gás ácido.

O número, a frequência e a intensidade das tosses são então quantificados e comparados entre os grupos e dentro dos grupos sob condições tanto de veículo quanto de CNO.

Isso confirma que as cobaias que receberam o AAV com o DREADD inibidor reduziram a tosse quando expostas ao gás ácido após a administração do regulador CNO em comparação com antes da administração de CNO e em comparação com os grupos de controle mCherry e puros.

[0099] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes são aqui incorporadas por referência.

Embora no relatório descritivo anterior esta invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades do mesmo, e muitos detalhes tenham sido apresentados para propósitos de ilustração, será evidente para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que alguns dos detalhes aqui podem ser variados consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para prevenir, inibir ou tratar uma tosse em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a um mamífero tendo uma fibra nervosa parassimpática que inerva o pulmão que está infectado com um vetor viral que expressa um gene que codifica uma proteína, cuja atividade é inibida por um agente ou energia; e administrar o agente ou liberar a energia ao mamífero em uma quantidade eficaz para inibir a atividade da proteína, prevenindo, inibindo ou tratando assim a tosse no mamífero.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é administrado ao mamífero por meio de inalação ou injeção.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente é administrado por via intravenosa.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mamífero possui tosse idiopática ou tosse intratável.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mamífero possui doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) ou refluxo gástrico.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus ou vírus herpes simplex.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é uma forma retrógrada de vírus adeno-associado, lentivírus ou adenovírus canino.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 8, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é modificado para transporte retrógrado.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o gene codifica um canal iônico sensível à luz (optogenética), um canal iônico quimicamente responsivo (quimogenética), um canal iônico sensível ao ultrassom (sonogenética), um canal iônico responsivo a campo magnético (magnetogenética) ou um receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs).

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um rAAV compreendendo uma cápside viral adeno-associada compreendendo dois ou mais sorotipos diferentes da cápside do AAV.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo fato de que um dos sorotipos de AAV compreende AAV2.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que um dos sorotipos de AAV compreende AAVrh10.

14. Método de liberação de genes nas fibras nervosas que controlam a função de órgão visceral em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar um agente ou liberar energia a um mamífero, o nervo regulador do qual inerva o órgão visceral e é infectado com um vetor viral compreendendo um gene que codifica um produto gênico, cuja atividade da proteína é inibida ou ativada pela administração do agente ou pela liberação da energia, em que a quantidade do agente administrado ou da energia liberada é eficaz para controlar a função do órgão visceral.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fibra nervosa é o nervo vago, nervo cardiopulmonar, nervo esplâncnico torácico, nervo esplâncnico lombar, nervo esplâncnico sacral ou nervo esplâncnico pélvico.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o órgão de mamífero é um estômago, intestino, pâncreas, fígado, pulmão, coração, adrenal, rim, gônada ou bexiga.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor de vírus adeno-associado, lentivírus, adenovírus ou vírus herpes simplex.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o vetor viral fornece transporte retrógrado nos neurônios.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é modificado para fornecer transporte retrógrado no sistema nervoso central.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é uma forma retrógrada de vírus adeno-associado, lentivírus ou adenovírus canino.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que o produto gênico regula a atividade do nervo que controla o órgão em resposta à administração do agente.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que o gene codifica um canal iônico sensível à luz, um canal iônico quimicamente responsivo, um canal iônico sensível a ultrassom, um canal iônico responsivo a campo magnético ou um receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs).

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o gene codifica um canal de rodopsina, receptor nicotínico de acetilcolina, gramicidina A, um canal de potássio ativado por voltagem, um receptor ionotrópico de glutamato, alfa- hemolisina ou um canal mecanossensível.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 23, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é liberado ao nervo vago.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que o agente administrado ou a energia liberada leva em conta o controle da ingestão de alimentos, controle do esfíncter anal ou controle do esfíncter urinário no mamífero.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o órgão visceral é um estômago, duodeno ou intestino delgado.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 26, caracterizado pelo fato de que o produto gênico bloqueia a propagação de proteínas tóxicas no nervo vago do mamífero.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é absorvido retrógrado do sistema gastrointestinal.

29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a proteína tóxica compreende alfa- sinucleína, tau, beta-amiloide ou huntingtina.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 29, caracterizado pelo fato de que o produto gênico compreende ou codifica RNA em forma de grampo de cabelo pequeno (shRNA), microRNA (miRNA), CrispR/Cas9, um anticorpo, um anticorpo de cadeia única ou um intracorpo.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a quantidade administrada ou liberada evita ou inibe a disseminação de uma proteína tóxica do trato gastrointestinal para o cérebro em um mamífero.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 31, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 32, caracterizado pelo fato de que um dos sorotipos de AAV compreende AAV2.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 33, caracterizado pelo fato de que um dos sorotipos de AAV compreende AAVrh10.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 34, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um rAAV compreendendo uma cápside viral adeno-associada que compreende dois ou mais sorotipos diferentes da cápside de AAV.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 35, caracterizado pelo fato de que a quantidade administrada previne, inibe ou trata doenças em um órgão visceral no mamífero.

37. AAV recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende uma cápside formada por proteínas da cápside de dois ou mais sorotipos da cápside de AAV diferentes.

38. AAV recombinante de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que um dos sorotipos compreende AAV2.

39. AAV recombinante de acordo com a reivindicação 37 ou

38, caracterizado pelo fato de que um dos sorotipos compreende AAVrh10.

40. AAV recombinante de acordo com a reivindicação 37, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que fornece liberação retrógrada.

41. AAV recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizado pelo fato de que o rAAV codifica um produto gênico terapêutico, um produto gênico profilático ou uma proteína exogenamente controlável.

42. AAV recombinante de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que codifica um canal iônico sensível à luz (optogenética), um canal iônico quimicamente responsivo (quimogenética), um canal iônico sensível ao ultrassom (sonogenética), um canal iônico responsivo a campo magnético (magnetogenética) ou um receptor de designer ativado exclusivamente por fármacos de designer (DREADDs).

43. AAV recombinante de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de canal ou DREADD que é inibido pela administração exógena de um agente ou energia.

44. AAV recombinante de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que codifica hD3q.

45. AAV recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 43, caracterizado pelo fato de que a cápside compreende uma cápside tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência aminoácido com a SEQ ID NO: 5 ou 7.