ES2883358T3 - Gen Dgkk recombinante para terapia génica del síndrome de X frágil - Google Patents

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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

Un ácido nucleico que codifica una proteína DGKk (diacilglicerol cinasa kappa) humana funcional que carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional, en donde el ácido nucleico tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y en donde la región rica en prolina es la región nucleotídica entre los nucleótidos 70 y 132 de SEQ ID NO: 1, y en donde la región repetida de EPAPE es la región nucleotídica entre los nucleótidos 142 y 539 de SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Gen Dgkk recombinante para terapia génica del síndrome de X frágil
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular al síndrome del cromosoma X frágil. Propor­ ciona nuevos tratamientos del síndrome de X frágil.
Antecedentes de la invención
El síndrome de X frágil (FXS) es un trastorno genético que causa discapacidad intelectual, problemas de aprendizaje y de comportamiento y diversas características físicas. Aunque el síndrome de X frágil se presenta en ambos sexos, los hombres (1 de cada 4.000) se ven afectados con más frecuencia que las mujeres (1 de cada 8.000) y, en general, con mayor gravedad.
Los individuos afectados por lo general tienen un retraso en el desarrollo del habla y el lenguaje a los 2 años de edad. La mayoría de los hombres con síndrome de X frágil tienen una discapacidad intelectual de leve a moderada, mientras que alrededor de un tercio de las mujeres afectadas tienen discapacidad intelectual. Los niños con síndrome de X frágil también pueden tener ansiedad y comportamiento hiperactivo, como ser inquieto o acciones impulsivas. Pueden tener un trastorno por déficit de atención (TDA), que incluye una capacidad insuficiente para mantener la atención y dificultad para concentrarse en tareas específicas. Aproximadamente un tercio de los individuos con síndrome de X frágil tienen características de trastornos del espectro autista que afectan a la comunicación y las interacciones socia­ les. Las convulsiones ocurren en aproximadamente un 15 por ciento de los hombres y aproximadamente un 5 por ciento de las mujeres con síndrome de X frágil.
La mayoría de los hombres y aproximadamente la mitad de las mujeres con síndrome de X frágil tienen rasgos físicos característicos que se vuelven más evidentes con la edad. Esos rasgos incluyen una cara larga y estrecha, orejas grandes, mandíbula y frente prominentes, dedos inusualmente flexibles, pies planos y, en los hombres, testículos agrandados (macroorquidismo) después de la pubertad.
El síndrome de X frágil está causado por una expansión de la repetición del trinucleótido CGG que afecta al gen 1 del retraso mental de X frágil (FMR1) en el cromosoma X, lo que da lugar a un fallo en la expresión de la proteína del retraso mental de X frágil (FMRP), que es necesaria para un desarrollo neuronal normal.
En el ratón, la falta de FMRP se asocia con una traducción excesiva de cientos de proteínas neuronales, incluyendo en particular las proteínas postsinápticas. Se propone que esta falta de regulación de la síntesis de proteínas local subyace a los defectos observados en la maduración y función de la sinapsis glutamatérgica, y que afecta preferente­ mente a cientos de especies de ARNm sobre las que se ha descrito que se unen a FMRP.
Actualmente no existe ningún tratamiento que haya mostrado beneficios específicamente para el síndrome de X frágil. Las tendencias actuales en el tratamiento del trastorno solo incluyen medicamentos para tratamientos basados en los síntomas que tienen como objetivo minimizar las características secundarias asociadas con el trastorno, tales como síntomas de déficit de atención e hiperactividad, ansiedad y agresión. También se ha desarrollado un tratamiento de apoyo para optimizar el funcionamiento de los individuos con síndrome de X frágil, incluyendo terapia del habla, terapia ocupacional y programas educativos y conductuales individualizados.
En la base de datos del EMBL, los números de orden JV642685 y JV052157 describen secuencias de Macaca Mulatta. El número de orden BC075627 de EMBL DATABASE describe la secuencia de la diacilglicerol cinasa kappa de Mus musculus. Tabet et al. (PNAS, 2016, 113, E3619-E3628) se refieren al control de la diacilglicerol cinasa kappa me­ diante la proteína de retraso mental de X frágil en las neuronas.
Por lo tanto, todavía existe actualmente una gran necesidad en la ciencia médica de innovar tratamientos nuevos y eficaces del síndrome de X frágil. La presente invención busca satisfacer estas y otras necesidades.
Compendio de la invención
El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre dentro de las reivindicaciones, se proporciona únicamente a título informativo.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que la expresión de un ácido nucleico de Dgkk (diacilglicerol cinasa kappa) truncado en su región codificante 5', es capaz de corregir las anomalías de las espinas dendríticas de neuronas piramidales Fmr1-KO del hipocampo CA1. Los inventores también han mostrado que, en esa región codifi­ cante 5', dos dominios tienen una importancia decisiva, un dominio rico en prolina y un dominio repetido EPAPE.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína DGKk humana que carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional.
Preferiblemente, esta proteína DGKk humana carece de una región rica en prolina funcional y de una región repetida de EPAPE funcional.
En particular, la proteína DGKk humana de acuerdo con la descripción puede carecer de una región rica en prolina y/o de una región repetida de EPAPE.
Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene al menos aproximadamente un 85% de identi­ dad, preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, más preferiblemente al menos aproximada­ mente un 95% de identidad, con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modificaciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 70­ 132 y/o 142-539 de SEQ ID No: 1, y opcionalmente una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modifi­ caciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 4-69 y/o 133-141 y/o 540-648 de SEQ ID No: 1.
Más preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene al menos aproximadamente un 85% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, más preferiblemente al menos aproxima­ damente un 95% de identidad, con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1, las secuencias en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 70-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-142 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-539 de SEQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4-648 de SEQ ID No: 1.
Incluso más preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 y comprende una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posi­ ciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1, las secuencias en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4-539 de SEQ ID No: 1.
La descripción también se refiere, en un segundo aspecto, a un casete de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción y un promotor. Preferiblemente, el promotor es un promotor específico de neurona, más preferiblemente el promotor del gen de la sinapsina-1 humana.
La descripción también se refiere, en un tercer aspecto, a un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción o un casete de expresión de acuerdo con la descripción. Preferiblemente, el vector de expresión es un virus adenoasociado, más preferiblemente el virus adenoasociado 2/9 o el virus adenoasociado 2/10, incluso más preferiblemente el virus adenoasociado 2/9.
En un cuarto aspecto, la descripción se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, a un casete de expresión de acuerdo con la descripción o a un vector de expresión de acuerdo con la descripción, para uso como fármaco.
La descripción también se refiere, en un quinto aspecto, a una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción o un vector de expresión de acuerdo con la descripción.
En un sexto aspecto, la descripción también se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, a un casete de expresión de acuerdo con la descripción, a un vector de expresión de acuerdo con la descripción o a una compo­ sición farmacéutica de acuerdo con la descripción para uso en el tratamiento del síndrome de X frágil en un paciente que lo necesite.
Preferiblemente, el ácido nucleico, el vector de expresión o la composición farmacéutica se usa en combinación con un agonista de PPAR gamma, preferiblemente un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferiblemente pioglitazona.
La descripción también se refiere, en un séptimo aspecto, a un kit que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción, un vector de expresión de acuerdo con la des­ cripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción y a medios para la administración de dicho ácido nucleico o dicho casete de expresión o dicho vector de expresión o dicha composición farmacéutica y opcional­ mente un prospecto que proporciona pautas para el uso de ese kit.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Mapa de estructuras artificiales de Dgkk de ratón, representado a escala. Se indican dos dominios principales de la región codificante 5’ de Dgkk: Pro, que se refiere a la región rica en prolina, y (EPAPE)10 que se refiere a la región repetida de EPAPE. HA se refiere al marcador de hemaglutinina, GFP se refiere a la proteína verde fluorescente y CMV se refiere al promotor de citomegalovirus. El símbolo A significa que falta la siguiente región de ADN o proteína. La expresión "región 5’" se refiere a la región codificante 5' de Dgkk que comprende la región rica en prolina y la región repetida de EPAPE y la UTR 5’ de Dgkk. La expresión "N-ter" se refiere a la región proteica correspondiente a la región codificante 5’ del gen Dgkk. El término "FL" se refiere a longitud completa y el vector Dgkk-FL es portador de una secuencia que comprende todos los exones de Dgkk, su región UTR 5’, su región UTR 3’ y un marcador de HA. Las barras grises representan 1 kb.
Figura 2: Impacto de FMRP sobre la expresión de Dgkk en células Cos-1. A: Transferencia Western representativa del análisis de células Cos-1 transfectadas con control de ARNsi (siCtlr) o ARNsi contra Fmr1 (siFmr1) 24 horas antes de la transfección con plásmidos que son portadores de las estructuras artificiales de Dgkk indicadas (Dgkk-FL o A5'reg-Dgkk) o un control de la transfección (TC). Los anticuerpos utilizados están indicados: anticuerpo anti-HA (HA), anti­ cuerpo anti-FMRP (FMRP) y anticuerpo anti-GAPDH (GAPDH). B: Densitogramas de la transferencia Western para las estructuras artificiales presentadas en A. La abscisa representa unidades arbitrarias de la señal de la proteína indicada (HA o FMRP) normalizada frente a GAPDH establecida en 100 para la condición siCtrl. ***p <0,001, **p <0,01, *p <0,1, NS: no significativo, el valor de p se calcula con la prueba de Student, n = 6.
Figura 3: Comparación de la expresión de las diferentes estructuras artificiales de Dgkk en células Cos-1. A: Transfe­ rencia Western representativa del análisis de células Cos-1 no transfectadas con una estructura artificial de Dgkk (NT) o transfectadas con plásmidos que son portadores de las estructuras artificiales de Dgkk indicadas. Los anticuerpos utilizados están indicados: anticuerpo anti-HA (HA) y anticuerpo anti-GAPDH (GAPDH). B: Densitogramas de la trans­ ferencia Western para las estructuras artificiales presentadas en A. La abscisa representa unidades arbitrarias de la señal de la proteína HA normalizada frente a GAPDH.
Figura 4: Impacto de la región 5’ de Dgkk sobre el control de su expresión a través de FMRP. A: Transferencia Western representativa del análisis de células Cos-1 no transfectadas con una estructura artificial de Dgkk (NT) o transfectadas con plásmidos que son portadores de las estructuras artificiales de Dgkk indicadas (indicadas a la izquierda). Veinti­ cuatro horas antes de la transfección con las estructuras artificiales, las células se transfectaron con ARNsi control (siCtlr) o con ARNsi contra Fmr1 (siFmr1). Los anticuerpos utilizados están indicados: anticuerpo anti-HA (HA), anti­ cuerpo anti-FMRP (FMRP) y anticuerpo anti-GAPDH (GAPDH). B: Densitogramas de la transferencia Western para las estructuras artificiales presentadas en A. La abscisa representa unidades arbitrarias de la señal de la proteína indicada (HA o FMRP) normalizada frente a GAPDH establecida en 100 para la condición siCtrl. ***p <0,001, **p <0,01, *p <0,1, NS: no significativo; El valor de p se calcula con la prueba de Student, n = 6.
Figura 5: Alteraciones de la espina dendrítica y corrección con una modulación de la expresión de A5'-Dgkk. A: Ilus­ tración de los cambios en la morfología de la espina inducidos por la expresión de shRNA-scramble (arriba a la iz­ quierda), shRNA-DgkK (abajo a la izquierda), Fmr1-/y (arriba a la derecha), Fmr1-/y A5'-Dgkk (abajo a la derecha), en neuronas piramidales CA1 transfectadas con pAAV-EGFP-shRNA-scramble, pAAV-EGFP-shRNA-DgkK, pAAV-EGFP, pAAV-A5'-DgkK, respectivamente. Nótese la presencia de espinas de múltiples cabezas (estrellas) así como espinas muy largas y delgadas (flechas; barra: 2 pm). B: cambios en la espina (nuevas espinas, , y espinas perdidas, -) que se producen en las neuronas piramidales que expresan shRNA-scramble (barra: 2 pm). C: Ausencia de cambios en la densidad de espinas con las cuatro condiciones. D: Aumento de espinas de múltiples cabezas y disminución de espinas fungiformes en shRNA-Dgkk (sh-Dgkk) (n = 10) frente a células transfectadas con shRNA-scramble (sh-scrbl) (n = 8) y en Fmr1-/y ( FMRKO) (n = 8) frente a células transfectadas con Fmr1-/y A5'-Dgkk (FMRKO a 5'-DGKK) (n = 8; *p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001, ANOVA de 2 vías con prueba posterior de Bonferroni). E: Distribución de las longitudes de las espinas en células transfectadas con shRNA-Dgkk (n = 342 espinas), shRNA-scramble (n = 297 espinas), Fmr1 -/y (n = 359 espinas), Fmr1 -/y A5'-Dgkk (n = 377 espinas) (p = 0,13, prueba de Kolgomorov-Smirnov). F: Disminución de la estabilidad de las espinas con el tiempo (*p <0,05, ANOVA de 2 vías con prueba posterior de Bonferroni), G: Alteraciones en la dinámica y la morfología de las espinas dendríticas inducidas por la expresión de shRNA-DgkK (derecha) o un shRNA-scramble (izquierda) en neuronas piramidales CA1. Se indica el tiempo (h). Las imágenes corresponden a imágenes confocales repetidas, tomadas en los momentos indicados de cultivos organotípicos de hipocampo de ratón transfectados por el método biolístico (materiales y métodos) con vectores plasmídicos que expresan shRNA-DgkK o shRNA-scramble. H: Aumento de la formación de nuevas espinas cada 24 h en células transfectadas con shRNA-Dgkk (n = 10) frente a shRNA-scramble (n = 8) (**p <0,01, prueba t no apareada). I: Aumento de la pérdida de espinas cada 24 h (*p <0,05, prueba t no apareada).
Figura 6: Transducción de AAV A5ransductK in vitro e in vivo, e impacto sobre el comportamiento de ratones Fmr1-KO. A) Las neuronas corticales disociadas (14 días in vitro) se transducen eficazmente con AAV9-A5'reg-Dgkk. Dgkk se visualiza mediante inmunomarcado utilizando un anticuerpo primario anti-HA. AAV-GFP se muestra como un control positivo de la transducción. Map2 es un marcador de neuronas. B) La fosforilación del factor de iniciación 4E (eIF4E) aumenta en las neuronas Fmr1 -/y. El análisis de la transferencia Western se realizó con 10 pg de extracto de proteína de neuronas corticales (14 DIV) con el anticuerpo primario indicado. Se muestran tres duplicados biológicos. C) La expresión de A5'reg-Dgkk desde AAV9 reduce la fosforilación de eIF4E en neuronas Fmr1-/y, 7 días después de la infección. Los datos corresponden a la transferencia Western realizada como en B. Se indica el título de virus (copias del genoma). El análisis del densitograma de la transferencia Western se presenta a la derecha. Valor de p, ***p <0,001, **p <0,01, con la prueba T de Student n = 4. D) Marcado inmunofluorescente de A5'reg-Dgkk con el anticuerpo anti-HA (verde) de regiones hipocampales de ratones a los que se han inyectados los vectores indicados. E) Cuantificación de las copias del genoma del virus/célula mediante qRT-PCR en el hipocampo de ratones tratados como en D (AAV9 y AAV10 se corresponden con AAV9-A5'reg-Dgkk y AAV10-A5'reg-Dgkk, respectivamente). F) Se sometió a ensayo el rendimiento físico de los ratones tratados con una prueba de varilla giratoria que se acelera. Los datos corresponden a la latencia hasta la caída (min) durante sesiones de 4 días (1-4), la media se trata como en D (AAV9 y AAV10 se corresponden con grupos de errores de AAV9 (prueba T). Wt Ctr, solución salina tratada con Fmr1 y/+; A, solución salina tratada con Fmr1Y/-; B, AAV9-A5'reg-Dgkk tratado con Fmr1Y/-; C, B AAV9-A5'reg-Dgkk tratado con Fmr1Y/-. G) Interacción social directa. Se indica el número de toques entre 2 ratones del mismo genotipo (media. Datos coP< 0,05 prueba T, n = 10). Control Wt, solución salina tratada con Fmr1 y/+; Control KO, solución salina tratada con Fmr1Y/-; KO-AAV9, AAV9-A5'reg-Dgkk tratado con Fmr1Y/-; KO-AAV10, AAV9-A5'reg-Dgkk tratado con Fmr1Y/-. H) Prueba de reconocimiento de objetos novedosos. El % de tiempo de olfateo está indicado para un objeto nuevo (NO) y un objeto familiar (FO) el segundo día de la prueba. Los datos son medias ± SEM, *** P< 0,001 prueba T, n = 10. Nombre de los grupos como en G. I) Prueba de actimetría. Los datos son medias ± SEM de la interrupción del haz de luz durante un período de 24 h, los grupos de animales se marcaron como en F, *P < 0,05 con la prueba T, n > 9, ns no significativo. J) Detalle de las mediciones de actimetría. Los datos son medias ± SEM de la interrupción del haz de luz como en I. Se muestran los valores de P para cada período de tiempo.
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Descripción detallada de la invención
Recientemente, los inventores han mostrado, en las neuronas corticales, que FMRP está asociada principalmente con un ARNm único: diacilglicerol cinasa kappa (Dgkk), un regulador maestro que controla el cambio entre las rutas de señalización del diacilglicerol y del ácido fosfatídico (véase, Tabet R et al., 2016, Proc Natl Acad Sci USA, pii: 201522631). La ausencia de FMRP en las neuronas conduce a una pérdida de expresión de Dgkk. Los inventores han demostrado que una reducción de la expresión de Dgkk en las neuronas es suficiente para provocar anomalías de la espina dendrítica, alteraciones en la plasticidad sináptica y trastornos de comportamiento similares a los observados en el modelo de ratón con síndrome de X frágil. En consecuencia, una sobreexpresión de Dgkk en las neuronas puede corregir la ausencia de FMRP. En conjunto, estos datos sugieren que una mala regulación de Dgkk contribuye a la patología del síndrome de X frágil y apoyan un modelo en el que FMRP, al controlar la traducción de Dgkk, controla indirectamente la traducción de proteínas sinápticas y las propiedades de la membrana mediante una señalización que afecta a los lípidos en la espina dendrítica.
Los inventores han descubierto que, en ausencia de FMRP en un modelo celular, una sobreexpresión de un ácido nucleico de Dgkk de longitud completa no conduce a una expresión de la proteína DGKk. Por consiguiente, una so­ breexpresión del ácido nucleico de Dgkk de longitud completa no puede corregir los efectos de la ausencia de FMRP. Sin embargo, han observado sorprendentemente que una sobreexpresión de un Dgkk truncado en la región codificante 5’, anula el control de FMRP y conduce a una expresión de la proteína DGKk. Se mostró que la expresión de este ácido nucleico truncado de Dgkk podía corregir las anomalías de las espinas dendríticas de neuronas Fmr1-KO pira­ midales CA1 del hipocampo. Los inventores también han mostrado que en esa región codificante 5’ del ácido nucleico de Dgkk, dos dominios tenían una importancia decisiva: un dominio rico en prolina y un dominio repetido EPAPE. La ausencia de un dominio rico en prolina funcional o de un dominio repetido EPAPE funcional era de hecho suficiente para anular el control de FMRP.
Por tanto, en un primer aspecto, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína DGKk humana que carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica una proteína DGKk humana carece de una región rica en prolina funcional y de una región repetida de EPAPE funcional.
Definiciones
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "síndrome de X frágil", "síndrome fra(X)", "FXS", "síndrome de FRAXA", "síndrome del marcador X", "síndrome de Martin-Bell", "retraso mental ligado al cromosoma X y macroorquidismo" y "síndrome de Escalante", son equivalentes y pueden usarse de forma intercambiable en la presente solicitud. Tal y como se usa en el presente documento, "síndrome de X frágil" se refiere a un trastorno genético que causa discapacidad intelectual, problemas de comportamiento y aprendizaje y diversas características físicas. El síndrome de X frágil es el resultado de una incapacidad para expresar la proteína de retraso mental de X frágil.
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "discapacidad intelectual (DI)", "discapacidad general para el aprendizaje" o "retraso mental (RM)" son equivalentes y se pueden usar de forma intercambiable en la presente soli­ citud. Tal y como se usa en el presente documento, "discapacidad intelectual" se refiere a un trastorno del neurodesarrollo generalizado, caracterizado por un funcionamiento intelectual y/o adaptativo significativamente deteriorado.
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "proteína de retraso mental de X frágil" o "FMRP" se refieren a una proteína (secuencia de referencia del NCBI: NP_001172004.1; Uniprot KB: QO6787) codificada por el gen 1 de retraso mental de X frágil (FMR1, Gene ID: 2332) ubicado en el cromosoma X. Esta proteína es necesaria para un desarrollo neuronal normal.
En general, el síndrome de X frágil se produce como resultado de un aumento en el número de repeticiones del trinucleótido CGG en la región no traducida 5’ de FMR1. Dependiendo de la longitud de la repetición CGG, un alelo de FMR1 se puede clasificar como:
- normal, entre 6 y 54 repeticiones de CGG, el portador no se ve afectado por el síndrome;
- una premutación, entre 55 y aproximadamente 200 repeticiones de CGG, el portador tiene riesgo de otros trastornos relacionados con FMR.
- una mutación completa, más de aproximadamente 200 repeticiones de CGG, el portador generalmente se ve afectado por el síndrome de X frágil.
Las mutaciones con pérdida de función y/o la metilación anormal de genes de FMR1 también pueden estar involucra­ das en el síndrome de X frágil.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "diacilglicerol cinasa kappa" o "DGKk" se refiere a una proteína (secuencia de referencia del NCBI: NP_001013764.1; Uniprot KB: Q5KSL6; s Eq ID NO: 9) codificada por el gen Dgkk (Gene ID: 139189) ubicado en el cromosoma X. DGKk es una enzima capaz de convertir el diacilglicerol en ácido fosfatídico.
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico" se refieren a un oligonucleótido o a un polinucleótido. Una molécula de ácido nucleico puede incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o análogos de nucleótidos en cualquier combinación.
Tal y como se usa en este documento, el término "nucleótido" se refiere a un resto químico que tiene un azúcar (modificado, sin modificar o un análogo del mismo), una base de nucleótido (modificada, sin modificar o un análogo de la misma) y un grupo fosfato (modificado, sin modificar o un análogo del mismo). Los nucleótidos incluyen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos de nucleótidos modificados que incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos bloqueados ("LNAs"), ácidos nucleicos peptídicos ("PNAs"), L-nucleótidos, ácidos nucleicos con puentes de etileno ("ENAs"), arabinósido, y análogos de nucleótidos (incluidos los nucleótidos abásicos).
Tal y como se usa en este documento, la expresión "corte y empalme" se refiere a una modificación de un transcrito de pre-ARN en el que se eliminan los intrones y se unen los exones.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "intrón" o la expresión "secuencia intrónica" se refieren a cualquier secuencia de nucleótidos dentro de un gen que se elimina mediante corte y empalme del ARN durante la maduración del producto final de ARN. Las secuencias que se unen en el ARN maduro final después del corte y empalme del ARN, son los "exones" o "secuencias exónicas". Los términos "intrón" y "exón" se refieren tanto a las secuencias de ADN dentro de un gen como a las secuencias correspondientes en transcritos de ARN.
En particular, un ácido nucleico de acuerdo con la descripción es preferiblemente un polinucleótido de ADN que se ha aislado a partir de un gen natural y/o que se ha modificado para contener segmentos de ácidos nucleicos que se han combinado o yuxtapuesto de una manera que de otra forma no existirían en la naturaleza, preferiblemente mediante la eliminación de las secuencias intrónicas presentes originalmente en el gen natural.
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "UTR 5’", "región no traducida 5'", "secuencia líder" o "ARN líder" son equivalentes y pueden usarse de forma intercambiable. Se refieren a la región de un ARNm que está direc­ tamente aguas arriba del codón de iniciación. Esa región es importante para la regulación de la traducción de un transcrito. El término "UTR 5’" se refiere tanto a la secuencia de ADN dentro de un gen como a las secuencias corres­ pondientes en los transcritos de ARN.
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "identidad de secuencia" o "identidad" se refieren a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido entre dos polinucleótidos. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas, alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100.
La identidad de secuencia se puede determinar mediante la alineación de dos secuencias de nucleótidos usando algoritmos de alineación global o local, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitu­ des similares se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineación global (por ejemplo, Needleman Wunsch) que alinea las secuencias de manera óptima a lo largo de toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineación local (por ejemplo, Smith Waterman). Entonces se indica que las secuencias son "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" (cuando se alinean de manera óptima, por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT usando parámetros predeterminados) cuando comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia. GAP utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias a lo largo de toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. Una alineación global se usa adecuadamente para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares. Generalmente, se utilizan los parámetros predeterminados de GAP, con una penalización por creación de hueco = 50 (nucleótidos) y una penalización por extensión de hueco = 3 (nucleótidos). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada utilizada es nwsgapdna (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS, 89: 915-919). Las alineacio­ nes de secuencias y las puntuaciones del porcentaje de identidad de secuencia se pueden determinar utilizando pro­ gramas informáticos, tales como GCG Wisconsin Package, versión 10.3, disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EE.UU., o utilizando un programa informático de código abierto, como el programa "needle" (usando el algoritmo global de Needleman Wunsch) o "water" (usando el algoritmo local de Smith Waterman) en EmbossWIN versión 2.10.0, usando los mismos parámetros que para GAP más arriba, o usando la configuración predeterminada (para "needle" y para "water", la penalización predeterminada por apertura de hueco es 10,0 y la penalización predeterminada por extensión de huecos es 0,5; las matrices de puntuación predeterminadas son Blossum62 para proteínas y DNAFull para ADN). Cuando las secuencias tienen longitudes generales sustancialmente diferentes, se prefieren las alineaciones locales, como las que utilizan el algoritmo de Smith Waterman. Alternativa­ mente, el porcentaje de similitud o de identidad se puede determinar mediante una búsqueda en bases de datos públicas, utilizando algoritmos tales como FASTA, BLAST, etc.
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "dominio rico en prolina", "región rica en prolina", "se­ cuencia rica en prolina", "segmento rico en prolina" y "PRR", son equivalentes y se pueden usar de forma intercam­ biable. Se refieren a una porción de una proteína que comprende principalmente prolina. La expresión "región rica en prolina" se refiere tanto a una porción de proteína que comprende principalmente prolinas, como a la secuencia de ADN dentro de un gen que la codifica. DGKk humano presenta una región rica en prolinas N-terminal (correspondiente a la región de nucleótidos entre los nucleótidos 70 y 132 en SEQ ID No: 1).
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "dominio repetido EPAPE", "región repetida de EPAPE", "secuencia repetida de EPAPE", "segmento repetido EPAPE" son equivalentes y se pueden usar de forma intercam­ biable. Se refieren a una porción de una proteína que comprende varias repeticiones del motivo EPAPE, es decir, la sucesión de ácido glutámico, prolina, alanina, prolina y ácido glutámico. La expresión "región repetida de EPAPE" se refiere tanto a una porción de la proteína que comprende varias repeticiones del motivo EPAPE, como a la secuencia de ADN dentro de un gen que la codifica. DGKk humano presenta una región repetida de EPAPE N-terminal (corres­ pondiente a la región de nucleótidos entre los nucleótidos 142 y 539 en SEQ ID No: 1).
En las secuencias de péptidos o proteínas descritas en este documento, los aminoácidos están representados por su código de una letra, de acuerdo con la siguiente nomenclatura: A: Alanina; C: cisteína; D: ácido aspártico; E: ácido glutámico; F: fenilalanina; G: glicina; H: histidina; I: isoleucina; K: lisina; L: leucina; M: metionina; N: asparagina; P: prolina; Q: glutamina; R: arginina; S: serina; T: treonina; V: valina; W: triptófano e Y: tirosina.
Tal y como se usa en este documento, el término "mutación" se refiere a la alteración de la secuencia de nucleótidos de un gen. El término mutación incluye, sin limitarse a ellas, sustituciones, deleciones e inserciones.
Tal y como se usa en este documento, el término "sustitución" o "mutación puntual" son equivalentes y se refieren a una mutación que consiste en el intercambio de un solo nucleótido por otro. Preferiblemente, la sustitución de acuerdo con la descripción es una mutación de sentido erróneo. En una mutación de sentido erróneo, el nucleótido que se intercambia forma parte de un triplete de nucleótidos que codifica, después de la mutación, un aminoácido diferente al triplete original. Preferiblemente, la mutación no es una mutación silenciosa o una mutación sin sentido. En una mutación silenciosa, el nucleótido que se intercambia forma parte de un triplete de nucleótidos que codifica, después de la mutación, el mismo aminoácido que el triplete original. En una mutación sin sentido, el nucleótido que se inter­ cambia forma parte de un triplete de nucleótidos que codifica, después de la mutación, un codón de terminación y, por lo tanto, puede truncar la proteína.
Tal y como se usa en este documento, el término "deleción" se refiere a una mutación que consiste en la eliminación de uno o varios nucleótidos del ADN. Las deleciones de acuerdo con la descripción no conducen a un cambio en el marco de lectura (cambio de marco). Por tanto, el número de nucleótidos delecionados es múltiplo de tres.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "inserción" se refiere a una mutación que consiste en la adición de uno o varios nucleótidos adicionales al ADN. Las inserciones de acuerdo con la descripción no conducen a un cambio en el marco de lectura. Por tanto, el número de nucleótidos insertados es múltiplo de tres.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "modificación epigenética" se refiere a cambios funcional­ mente relevantes en el genoma que no implican un cambio en la secuencia de nucleótidos. Ejemplos de mecanismos que producen tales cambios son metilaciones del ADN y modificaciones de histonas.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "casete de expresión" se refiere a una estructura artificial de ácido nucleico que comprende una región codificante y regiones reguladoras necesarias para la expresión, ligadas funcio­ nalmente a la región codificante. La expresión "ligadas funcionalmente" indica que los elementos se combinan de tal manera que la expresión de la región codificante está bajo el control de las regiones reguladoras. Típicamente, una región reguladora está ubicada aguas arriba de la región codificante, a una distancia compatible con el control de su expresión. La región reguladora puede incluir promotores, potenciadores, silenciadores, atenuadores y sitios internos de entrada a ribosomas (IRES). Las secuencias espaciadoras también pueden estar presentes entre los elementos reguladores y la región codificante, siempre que no impidan su expresión. Un casete de expresión también puede incluir un codón de inicio delante de un gen que codifica una proteína, señales de corte y empalme para intrones y codones de parada, terminadores de la transcripción, secuencias de poliadenilación.
Tal y como se usa en el presente documento, los términos "promotor" y "promotor transcripcional" son equivalentes y se refieren a una región de ADN que forma parte de la región reguladora de un casete de expresión. El promotor es el elemento regulador que inicia la transcripción de un gen en particular. Los promotores se encuentran cerca del sitio de inicio de la transcripción de genes, en la misma hebra y aguas arriba en el ADN (hacia la región 5’ de la hebra sentido). Tal y como se usa en este documento, la expresión "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo en la mayoría de los tejidos y en la mayoría de las circunstancias en la célula. Las expresiones "promotor regulado" o "promotor inducible", tal y como se usan en este documento, son equivalentes y se refieren a promotores que se activan o reprimen en las células, solo como respuesta a estímulos físicos o químicos específicos. La expresión "promotor específico" se refiere a promotores que solo se pueden activar en un órgano o un tejido específico, como el cerebro, o en un tipo celular específico, como las neuronas.
Tal y como se usa en este documento, el término "potenciador" se refiere a una región corta (50-1500 pb) de ADN que forma parte de la región reguladora. Un potenciador es un elemento regulador que se puede unir a proteínas (activa­ dores) para aumentar la probabilidad de que se produzca la transcripción en un gen. Los potenciadores generalmente actúan en cis, ubicados hasta 1 Mbp (1.000.000 pb) lejos del gen y pueden estar aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio, y en la dirección hacia adelante o hacia atrás.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "terminador de la transcripción" se refiere a una sección de una secuencia de ácido nucleico que puede formar parte de un casete de expresión y que marca el final de un gen durante la transcripción. Esa secuencia media en la terminación de la transcripción, proporcionando señales en el ARNm recién sintetizado que desencadenan procesos que liberan el ARNm del complejo transcripcional.
Tal y como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, típicamente ADN o ARN que sirve para transferir una secuencia de ácido nucleico que se transporta, es decir, ADN o ARN, a una célula hospedadora. Un vector puede comprender un origen de replicación, un marcador seleccionable y un sitio ade­ cuado para la inserción de un gen, tal como el sitio de clonación múltiple. Existen varios tipos comunes de vectores que incluyen plásmidos, fagos, fagémidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Preferiblemente, el vector de la descripción es un vector vírico de ADN.
Un "vector vírico", tal y como se usa en este documento, se refiere a un vector que comprende algunos o todos entre los siguientes: genes víricos que codifican un producto génico, secuencias de control y secuencias de empaqueta­ miento vírico.
Un "vector parvovírico", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un parvovirus o a una partícula parvovírica producidos de manera recombinante que comprenden un polinucleótido que se va a entregar a una célula hospedadora, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Ejemplos de vectores parvovíricos incluyen, por ejemplo, vectores de virus adenoasociados (AAV), por ejemplo AAV1, a Av 2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 y AAV-PHP.B (Devernam et al., 2016, Nature Biotechnology, 34, 204-206). En este documento, un vector parvovírico también se refiere al polinucleótido que comprende el genoma vírico o parte del mismo, y un ácido nucleico de interés. En particular, las secuencias de AAV modificadas también se pueden usar en el contexto de la presente descripción. Esas secuencias modificadas incluyen AAVs en donde se pueden usar partes de otro AAV, en lugar de secuencias ITR (repeticiones terminales invertidas), Rep (proteína de replicación) o VP (proteína vírico) de AAVs de tipo silvestre. Se sabe que las proteínas VP de AAV determinan la tropicidad celular del virión AAV. Las secuencias que codifican la proteína VP están significativamente menos conservadas que las proteínas y genes de ITR y Rep entre los diferentes serotipos de AAV. La capacidad de las secuencias de Rep e ITR para complementar de forma cruzada las secuencias correspondientes de otros serotipos, permite la producción de partículas de AAV seudotipificadas que comprenden las proteínas de la cápside con un serotipo (por ejemplo, AAV5) y las secuencias ITR con otro serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2). Se puede hacer referencia a esas partículas de AAV seudotipificadas como que son del tipo "x/y", en donde "x" indica la fuente de las secuencias de ITR e "y" indica el serotipo de la cápside, por ejemplo, una partícula de AAV 2/9 tiene secuencias ITR de AAV2 y una cápside de AAV5.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a un vector diseñado para una expresión génica en células. Un vector de expresión permite introducir un gen específico en una célula diana y puede controlar el mecanismo de síntesis de proteínas de la célula para producir la proteína codificada por el gen. Un vector de expresión comprende elementos de expresión que incluyen, por ejemplo, un promotor, la secuencia de inicio de la traducción correcta, tal como un sitio de unión al ribosoma y un codón de inicio, un codón de terminación y una se­ cuencia de terminación de la transcripción. Un vector de expresión también puede comprender otras regiones regula­ doras tales como potenciadores, silenciadores y elementos de frontera/aislantes para dirigir el nivel de transcripción de un gen dado. El vector de expresión puede ser un vector para una expresión estable o transitoria de un gen. Tal y como se usa en el presente documento, "expresión estable" se refiere a una expresión génica que se conserva a lo largo del tiempo, incluso después de que las células hospedadoras se repliquen. Para una expresión estable, el ma­ terial genético introducido se debe integrar en el genoma del hospedador. Un vector de expresión integrador es un vector de expresión adecuado para una expresión estable. Tal y como se usa en este documento, "expresión transi­ toria" se refiere a una expresión génica que está limitada en el tiempo, preferiblemente entre 1 día y 1 año, más preferiblemente entre 10 días y 8 meses, aún más preferiblemente entre 1 mes y 6 meses, e incluso más preferible­ mente entre 2 meses y 4 meses. Para una expresión génica transitoria, el material genético introducido no se debe integrar en el genoma del hospedador.
Tal y como se usa en este documento, el término "tratamiento", "tratar" o "tratando" se refiere a cualquier acto desti­ nado a mejorar el estado de salud de los pacientes, como una terapia y prevención de la enfermedad.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un ácido nucleico, una casete de expresión, un vector de expresión o una composición farmacéutica que evita, retrasa, elimina o reduce los efectos deletéreos del síndrome de X frágil.
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "principio activo", "ingrediente activo" e "ingrediente farmacéu­ tico activo" son equivalentes y se refieren a un componente de una composición farmacéutica que tiene un efecto terapéutico.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "efecto terapéutico" se refiere a un efecto inducido por un ingre­ diente activo o por una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción, capaz de evitar o retrasar la aparición del síndrome de X frágil, o curar o atenuar los efectos del síndrome de X frágil.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier ingrediente, excepto los ingredientes activos, que está presente en una composición farmacéutica. Su adi­ ción puede tener como objetivo conferir una consistencia particular u otras propiedades físicas o gustativas al producto final. Un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable debe estar desprovisto de cualquier interacción, en par­ ticular química, con los ingredientes activos.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "terapia génica" se refiere a una técnica que emplea genes para tratar, atenuar, retrasar o prevenir enfermedades, como el síndrome de X frágil. En particular, la terapia génica puede ser una terapia por aumento de genes y se puede referir a la introducción de un gen Dgkk humano modificado en el cuerpo para ayudar a combatir el síndrome de X frágil. Alternativamente, la terapia génica puede ser una terapia génica por deleción y se puede referir a la deleción de partes de Dgkk humano en el genoma de las células para ayudar a combatir el síndrome de X frágil.
Tal y como se usa en el presente documento, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" son intercambiables y se refieren a un animal, preferiblemente a un mamífero, incluso más preferiblemente a un ser humano, incluyendo adultos, niños, recién nacidos y seres humanos en el estadio prenatal.
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "moléculas de la familia de las tiazolidindionas", "tiazolidindionas" o "glitazonas" son intercambiables y se refieren a una clase de moléculas que contienen un grupo funcional en el que la tiazolidina sirve como diona. Las tiazolidindionas son capaces de unirse al receptor nuclear PPAR-Gamma (receptor gamma activado por el proliferador de peroxisoma). La tiazolidindiona de acuerdo con la descripción se puede seleccionar a partir del grupo constituido por pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona. Preferiblemente, la tiazolidindiona de acuerdo con la descripción es pioglitazona.
Tal y como se usa en este documento, el término "mGluR" y la expresión "receptor de glutamato metabotrópico" son intercambiables y se refieren a miembros de la familia del grupo C de receptores acoplados a la proteína G que se pueden unir al glutamato. Los mGluRs se activan a través de un proceso metabotrópico indirecto. El ligando de mGluR de acuerdo con la descripción puede ser cualquier molécula capaz de unirse a mGluR. El ligando de mGluR de acuerdo con la descripción puede ser un agonista de mGluR.
En el presente documento, el término «aproximadamente» se refiere a un intervalo de valores de ± 10% del valor especificado. Por ejemplo, "aproximadamente 50" comprende valores de ± 10% de 50, es decir, valores en el intervalo entre 45 y 55. Preferiblemente, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores de ± 5% del valor especificado.
Ácido nucleico
La descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína DGKk humana. El ácido nucleico de acuerdo con la descripción carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional. Una "región funcional" o un "dominio funcional", tal y como se usa en este documento, son equivalentes y se refieren a una región implicada en el control de la expresión del gen Dgkk humano a través de FMRP. La ausencia de una región rica en prolina funcional o de una región repetida de EPAPE funcional en un gen Dgkk humano, anula o reduce el control de FMRP sobre la expresión de este gen. La ausencia de una región rica en prolina funcional o de una región repetida de EPAPE funcional en un gen Dgkk humano permite la expresión de este gen Dgkk independientemente de FMRP. El ácido nucleico de acuerdo con la descripción puede carecer de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional porque una o ambas de estas regiones no son funcionales o se han eliminado.
En un aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que comprende una región rica en prolina no funcional y/o una región repetida de EPAPE no funcional.
En otro aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína que carece de una región rica en prolina y/o una región repetida de EPAPE. En particular, se ha eliminado la región rica en prolina y/o una región repetida de EPAPE.
En algún aspecto, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana cuya expresión es independiente de FMRP.
Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción comprende una o varias mutaciones en su secuencia, dando como resultado un ácido nucleico que carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional. Las mutaciones de acuerdo con la descripción pueden ser sustituciones, deleciones y/o inser­ ciones. Las mutaciones pueden estar en o dentro de las regiones en cuestión. Alternativamente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción comprende una o varias modificaciones epigenéticas que dan como resultado un ácido nucleico que carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional.
En un aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción comprende una deleción de al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% de la región rica en prolina y/o de una región repetida de EPAPE.
El ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una "proteína DGKk" funcional. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "proteína funcional" se refiere a una proteína DGKk humana que es capaz de llevar a cabo las mismas funciones en una célula que una proteína DGKk normal. Preferiblemente, se somete a las mismas regulaciones que una proteína DGKk normal, excepto que se anula la regulación de su expresión a través de FMRP. En particular, la función catalítica de la proteína DGKk se conserva en la proteína codificada por el ácido nucleico de acuerdo con la descripción. En particular, la función catalítica es la capacidad de fosforilar diacilglicerol (DAG) para generar ácido fosfatídico (PA). En particular, una proteína DGKk funcional comprende un dominio de homología de Pleckstrin (dominio PH) y un dominio catalítico. El dominio PH está entre las posiciones 216 y 309 y el dominio catalítico está entre las posiciones 487 y 622 de la proteína DGKk humana (tal y como se describe en la secuencia de referencia del NCBI: NP_001013764.1; Uniprot KB: Q5KSL6; véase también s Eq ID NO: 9).
Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción comprende solo secuencias exónicas.
Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción está desprovisto de UTR 5'.
En un aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que carece de una región rica en prolina funcional. Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que carece de una región rica en prolina. Alternativamente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que comprende una región rica en prolina no funcional.
En un aspecto preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que carece de una región repetida de EPAPE funcional. Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que carece de una región repetida de EPAPE. Alternativamente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que comprende una región repetida de EPAPE no funcional.
En un aspecto más preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que carece de una región rica en prolina funcional y de una región repetida de EPAPE funcional. Preferiblemente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que carece de una región rica en prolina y de una región repetida de EPAPE. Alternativamente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción codifica una proteína DGKk humana que comprende una región rica en prolina no funcional y una región repetida de EPAPE no funcional.
En un aspecto preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional debido a mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modificaciones epigenéticas en su secuencia. Por consiguiente, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción puede ser un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modificaciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 70-132 y/o 142-539 de SEQ ID No: 1, y opcionalmente una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modificaciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 4-69 y/o 133-141 y/o 540-648 de SEQ ID No: 1.
En otro aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más pre­ feriblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una se­ cuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modi­ ficaciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 70-132 y/o 142-539 de SEQ ID No: 1.
En otro aspecto particular adicional, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximada­ mente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modificaciones epigenéticas en la secuencia de nucleótidos en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1.
En otro aspecto particular adicional, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, todavía preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una se­ cuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modi­ ficaciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1.
En un aspecto particular preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximada­ mente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una o varias mutaciones, preferiblemente deleciones y/o modificaciones epigenéticas en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1.
Preferiblemente, cuando las mutaciones son deleciones, la tasa de deleción total en la secuencia 70-132 y/o en la secuencia 142-539 es de al menos aproximadamente un 20%, preferiblemente al menos aproximadamente un 30%, más preferiblemente de al menos aproximadamente un 40%, aún más preferiblemente de al menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente un 99% de la secuencia de nucleótidos correspondiente.
En otro aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más pre­ feriblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una se­ cuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende la deleción de los nucleótidos 70-132 y/o 142-539 de SEQ ID No: 1, y opcionalmente una o varias deleciones en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 4-69 y/o 133-141 y/o 540-648 de SEQ ID No: 1.
En un aspecto preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más pre­ feriblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una se­ cuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1, las secuencias en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 70-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-142 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-539 de SEQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4-648 de SEQ ID No: 1.
En un aspecto más preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de identidad, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, más pre­ feriblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad, con una se­ cuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 y comprende una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4­ 539 de SEQ ID No: 1.
En un aspecto aún más preferido, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción es un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 y comprende una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1,las secuencias en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 70-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-142 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-539 de SEQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4-648 de SEQ ID No: 1.
En un aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 en la que se han eliminado los nucleótidos en las posiciones 70-132.
En otro aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 en la que se han eliminado los nucleótidos en las posiciones 142-539.
En otro aspecto particular adicional, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 en la que se han eliminado los nucleótidos en las posiciones 70-132 y 142-539.
En otro aspecto particular adicional, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 en la que se han eliminado los nucleótidos en las posiciones 4-539.
En otro aspecto particular, el ácido nucleico de acuerdo con la descripción tiene al menos aproximadamente un 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos en las posiciones 648-3816, preferiblemente 539-3816, más preferiblemente 4-69 y 539-3816, e incluso más preferiblemente en las posiciones 4-69, 133-141 y 539-3816 de SEQ ID No: 1.
Casete de expresión
La descripción también se refiere, en un segundo aspecto, a un casete de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, ligado funcionalmente a una región reguladora.
Preferiblemente, la región reguladora del casete de expresión comprende un promotor que permite la expresión del ácido nucleico en la célula hospedadora, incluso más preferiblemente, la región reguladora es un promotor. La región reguladora también puede comprender otros elementos reguladores, preferiblemente, la región reguladora comprende al menos un potenciador ligado funcionalmente con el promotor. También pueden estar presentes secuencias espa­ dadoras en el casete de expresión entre los elementos reguladores y entre la región reguladora y el ácido nucleico.
El experto en la técnica puede seleccionar fácilmente una gran variedad de promotores adecuados para la expresión del ácido nucleico de acuerdo con la descripción en células u organismos. Ejemplos de promotores adecuados para uso en células de mamíferos se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
El promotor puede ser el promotor asociado de forma natural con el gen Dgkk.
El promotor también puede ser un promotor constitutivo o inducible, heterólogo del gen Dgkk. Preferiblemente, el promotor es un promotor constitutivo.
El promotor de acuerdo con la descripción también puede ser específico de un órgano o tejido, preferiblemente espe­ cífico del cerebro. Preferiblemente, el promotor de acuerdo con la descripción es específico de un tipo celular, preferi­ blemente específico de neuronas.
Ejemplos de un promotor adecuado de acuerdo con la presente descripción comprenden, sin limitación, el promotor del gen de la sinapsina-1 humana, el promotor del gen de la proteína cinasa II dependiente de calcio/calmodulina humana, el promotor del gen del neuropéptido somatostatina (SST), el promotor del gen de tubulina alfa I humana, el promotor del gen de la enolasa específica de neurona humana (NSE), el promotor del gen de la cadena beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano, el promotor del gen de la preproencefalina humana, el promotor del gen de la hidroxilasa de dopamina b humana (dbH), el promotor del gen de la prolactina humana, el promotor del gen de la proteína ácida fibrilar glial humana (GFAP), el promotor del gen de la descarboxilasa de ácido glutámico humana (GAD67), el promotor del gen de la homeobox humana Dlx5/6, el promotor del gen del receptor 1 de glutamato humano (GluR1), el promotor del gen de la preprotaquicinina 1 (Tac1) humana, el promotor del gen del receptor 1 dopaminérgico humano (Drd1a), el promotor del gen de la descarboxilasa de L-aminoácido aromático humano (AADC), el pro­ motor del gen del neurofilamento, un fragmento de promotor del gen de la proteína 2 de unión a metil CpG (MeCP2) (en particular, el fragmento -677/+56 del mismo, tal y como se describe en Adachi et al., Hum Mol Genet. 2005 14, 3709-22) y el promotor del gen del receptor de serotonina.
Preferiblemente, el promotor de acuerdo con la descripción es el promotor del gen de la sinapsina-1 humana.
El casete de expresión puede comprender además un terminador de la transcripción, seguido opcionalmente por una repetición terminal invertida 3' (3'ITR), ligada funcionalmente al ácido nucleico de acuerdo con la descripción. El ex­ perto en la técnica puede elegir fácilmente un terminador de la transcripción. Por ejemplo, un terminador de la trans­ cripción adecuado es el terminador de la transcripción de la p-globina o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana.
Vector de expresión
La descripción también se refiere, en un tercer aspecto, a un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción o un casete de expresión de acuerdo con la descripción.
Preferiblemente, el vector de expresión es un vector de expresión vírico de ADN.
Preferiblemente, el vector de expresión es adecuado para la transformación de células de mamífero, preferiblemente de células humanas.
Los vectores de expresión se pueden construir mediante técnicas clásicas de biología molecular, bien conocidas por los expertos en la técnica.
Preferiblemente, el vector de expresión de la descripción comprende elementos reguladores tales como promotores y/o potenciadores, preferiblemente un promotor, en particular el promotor del gen de la sinapsina-1 humana. Los mé­ todos para seleccionar estos elementos de acuerdo con la célula hospedadora en la que se desea la expresión, son bien conocidos por el experto en la técnica.
El vector de expresión de acuerdo con la descripción puede ser un vector para una expresión estable o transitoria.
En un aspecto particular, el vector de expresión es un vector integrador adecuado para una expresión estable. Ese vector comprende una o varias secuencias que permiten la inserción dirigida del vector de expresión, del casete de expresión o del ácido nucleico, en el genoma de una célula hospedadora.
En un aspecto preferido, el vector de expresión es un vector para una expresión transitoria.
Preferiblemente, el vector de expresión es un vector que se dirige específicamente a células cerebrales. Incluso más preferiblemente, el vector de expresión es un vector que se dirige específicamente a las neuronas.
En un aspecto preferido, el vector de expresión de acuerdo con la descripción se selecciona a partir del grupo que consiste en vectores lentivíricos, virus herpes simple (HSV), vectores de HSV recombinantes y un vector parvovírico, preferiblemente vectores parovíricos, incluso más preferiblemente un vector de virus adenoasociado (AAV).
En un aspecto aún más preferido, el vector de expresión de acuerdo con la descripción es un vector de virus adenoasociado seleccionado a partir del grupo que consiste en el virus adenoasociado 1, el virus adenoasociado 2, el virus adenoasociado 5, el virus adenoasociado 9, el virus adenoasociado rh.10, el virus adenoasociado 2/1, el virus adenoasociado 2/5, el virus adenoasociado 2/9, el virus adenoasociado 2/rh.10, preferiblemente el vector de expresión de acuerdo con la descripción es el virus adenoasociado 2/9 o el virus adenoasociado 2/rh.10, incluso más preferible­ mente el virus adenoasociado 2/9.
En un aspecto particularmente preferido, el vector de expresión de acuerdo con la descripción es un virus adenoasociado 2/9 o un virus adenoasociado 2/rh.10 que comprende el promotor del gen de la sinapsina-1 humana, preferible­ mente un virus adenoasociado 2/9 que comprende el promotor del gen de la sinapsina-1 humana.
En un aspecto particular, el vector de expresión de acuerdo con la descripción es un vector de virus adenoasociado en el que se han añadido entre 1 y aproximadamente 50 alaninas, preferiblemente entre aproximadamente 5 y apro­ ximadamente 25 alaninas, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 alaninas, incluso más preferiblemente 19 alaninas a una proteína de la cápside VP, preferiblemente a la proteína de la cápside VP2. Por ejemplo, un vector de ese tipo puede ser el vector AAV-AS (Choudhury et al., 2016, Mol Ther. 2016, 24, 726-35).
En otro aspecto particular, el vector de expresión de acuerdo con la descripción se dirige específicamente a neuronas glutamatérgicas. Preferiblemente, ese vector es un vector modificado para expresar un ligando de mGluR en su cápside. El ligando de mGluR de acuerdo con la descripción puede ser un agonista de mGluR.
Alternativamente, los péptidos que imitan los dominios de unión para la dineína citoplásmica y/o los péptidos obtenidos a partir de un antagonista del receptor de NMDA, se pueden insertar en la cápside (Xu et al., 2005, Virology, 341,203­ 214).
Uso como fármaco
En un cuarto aspecto, la descripción también se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción o un vector de expresión de acuerdo con la descripción para su uso como fármaco.
La descripción también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción o un vector de expresión de acuerdo con la descripción.
La composición farmacéutica de acuerdo con la descripción también puede comprender otro ingrediente activo. En particular, la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción puede comprender además un agonista de PPAR gamma, preferiblemente un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferiblemente pioglitazona. De hecho, los in­ ventores han demostrado que los agonistas de PPAR gamma, en particular la pioglitazona, aumentan o mejoran la actividad de DgK. Se puede encontrar una orientación sobre la coadministración de agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, en el “Compendium of Pharmaceutical and Specialties” (CPS) de la Canadian Pharmacists Association.
Preferiblemente, la composición farmacéutica también comprende al menos un excipiente o un vehículo farmacéuti­ camente aceptable, preferiblemente seleccionado a partir del grupo que consiste en disolventes, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, agentes antiadherentes, aglutinantes, revestimientos, colorantes, desintegrantes, aro­ mas, agentes deslizantes, lubricantes, conservantes, sorbentes, edulcorantes y vehículos.
En un aspecto preferido, la descripción se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción, un vector de expresión de acuerdo con la descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción, para su uso en el tratamiento del síndrome de X frágil o en el tratamiento de otra discapacidad intelectual asociada con una disminución de la expresión de Dgkk en las neuronas, preferible­ mente en el tratamiento del síndrome de X frágil, en un sujeto que lo necesite. Opcionalmente, se puede usar en combinación con otro ingrediente activo. En un aspecto, el otro ingrediente activo es un agonista de PPAR gamma, preferiblemente un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, ne­ toglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferiblemente pioglitazona.
La descripción también se refiere a un método de tratamiento del síndrome de X frágil u otra discapacidad intelectual asociada con una disminución de la expresión de Dgkk en las neuronas, preferiblemente el síndrome de X frágil, en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, de un casete de expresión de acuerdo con la descripción, de un vector de expresión de acuerdo con la descripción o de una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción al sujeto. Opcionalmente, el método puede comprender además la administración de otro ingrediente activo. En un aspecto, el otro ingrediente activo es un agonista de PPAR gamma, preferiblemente un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferiblemente pioglitazona.
La descripción también se refiere al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, de un casete de expresión de acuerdo con la descripción, de un vector de expresión de acuerdo con la descripción, en la preparación de un fármaco para el tratamiento del síndrome de X frágil u otra discapacidad intelectual asociada con una disminución de la expresión de Dgkk en las neuronas, preferiblemente el síndrome de X frágil, en un sujeto que lo necesite. Opcional­ mente, se puede usar en combinación con otro ingrediente activo. En un aspecto, el otro ingrediente activo es un agonista de PPAR gamma, preferiblemente un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferiblemente pioglitazona.
Sujeto, régimen y administración
El sujeto de la descripción es un ser humano, preferiblemente un recién nacido o un niño. Alternativamente, el sujeto puede ser un ser humano adulto.
En un aspecto preferido, el sujeto ha sido diagnosticado con el síndrome de X frágil. Los expertos en la técnica conocen bien el método de diagnóstico del síndrome de X frágil. En particular, la identificación de una mutación con pérdida de función en el gen FMR1 es suficiente para diagnosticar el síndrome de X frágil en un individuo que presenta un retraso en el desarrollo o una discapacidad intelectual. El diagnóstico del síndrome de X frágil se puede resumir en tres etapas: 1) Historial médico y evaluación del desarrollo, comportamiento y función cognitiva; 2) Antecedentes familiares espe­ cíficos para las características de la afección y trastornos de FMR1 relacionados; 3) Pruebas genéticas moleculares, es decir, análisis de una mutación dirigida en la región de repetición de trinucleótidos de FMR, mediante transferencia Southern o PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
En un aspecto alternativo, el sujeto no ha sido diagnosticado con el síndrome de X frágil pero presenta otra discapa­ cidad intelectual asociada con una disminución de la expresión de Dgkk, preferiblemente en las neuronas. Esa dismi­ nución de la expresión de Dgkk puede ser consecuencia de mutaciones en la región rica en prolina y/o en la región rica en EPAPE del gen Dgkk.
Preferiblemente, el tratamiento del sujeto comienza menos de un año después del diagnóstico, preferiblemente menos de un mes después del diagnóstico.
El ácido nucleico de acuerdo con la descripción, el casete de expresión de acuerdo con la descripción, el vector de expresión de acuerdo con la descripción o la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción, se pueden administrar por cualquier vía de administración convencional, preferiblemente por vía parenteral, incluso más preferi­ blemente por vía intravenosa. En un aspecto particular, la vía de administración es intracraneal, por ejemplo, en la corteza o en las áreas del hipocampo. La vía de administración también puede ser intratecal, es decir, una adminis­ tración dentro del líquido cefalorraquídeo a cualquier nivel del eje cerebroespinal, incluida la inyección en los ventrícu­ los cerebrales (véase también "Route of Administration''. 25 Data Standards Manual. Food and Drug Administration. Consultado el 11 de marzo de 2011).
En un aspecto preferido, el sujeto es tratado con una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión transitorio. Por lo tanto, el tratamiento se debe administrar regularmente, preferiblemente entre aproximadamente cada semana y aproximadamente un año, más preferiblemente entre aproximadamente 2 semanas y entre aproximada­ mente 9 meses, aún más preferiblemente entre aproximadamente cada mes y aproximadamente cada 6 meses, in­ cluso más preferiblemente entre aproximadamente cada 2 meses y aproximadamente cada 4 meses.
Preferiblemente, el vector de expresión de acuerdo con la descripción se administra con una dosis comprendida entre 1010 y 1013, preferiblemente entre 1011 y 1012, genomas de vector (VG) por cada inyección. La dosis de vector que se va a administrar puede ser ajustada por el experto en la técnica según el tipo de vector, de paciente, en particular su edad, peso y estado físico general, y la gravedad de la enfermedad.
En un aspecto particularmente preferido, el sujeto se trata con una composición farmacéutica que comprende un virus adenoasociado 2/9 o un virus adenoasociado 2/rh.10 que comprende el promotor del gen de la sinapsina-1 humana, ligado funcionalmente a un ácido nucleico de la descripción.
Kit y uso de un kit
La descripción también se refiere, en un quinto aspecto, a un kit para el tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto, en donde el kit comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción, un vector de expresión de acuerdo con la descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción, y los medios para su administración y, opcionalmente, un prospecto que proporciona pautas para usar ese kit.
En un aspecto adicional, la descripción también se refiere a un kit que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción, un casete de expresión de acuerdo con la descripción, un vector de expresión de acuerdo con la des­ cripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción y un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferi­ blemente pioglitazona, como una preparación combinada para uso simultáneo, por separado o secuencial, para su uso en el tratamiento del síndrome de X frágil u otra discapacidad intelectual asociada con una disminución de la expresión de Dgkk en las neuronas, preferiblemente el síndrome de X frágil, en un sujeto que lo necesite.
La descripción también se refiere al uso de un kit tal y como se ha descrito anteriormente en el tratamiento del síndrome de X frágil u otra discapacidad intelectual asociada con una disminución de la expresión de Dgkk en las neuronas, preferiblemente el síndrome de X frágil, en un sujeto que lo necesite.
Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
Terapia génica mediante deleción
En un sexto aspecto, la descripción también se refiere a medios para la recombinación dirigida del gen Dgkk humano en el genoma de células, en donde el gen Dgkk recombinado resultante carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional. La modificación o la deleción de la región rica en prolina y/o de la región repetida de EPAPE se puede introducir mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, el sistema Crispr/Cas9 se puede utilizar para modificar el gen.
En un aspecto preferido, los medios para la recombinación dirigida del gen Dgkk humano comprenden un ácido nu­ cleico que codifica los ARNs guías específicos de ese gen. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "ARN guía" se refiere a un ARN que comprende una estructura de ARN de fijación para la enzima Crispr/Cas9 y una secuencia de ARN complementaria a la secuencia diana del gen Dgkk. Tal y como se usa en este documento, la expresión "enzima Crisp/Cas9" se refiere a una endonucleasa de ADN guiada por ARN que escinde el sustrato de ADN complementario a su ARN guía y, por tanto, permite la recombinación del gen Dgkk humano.
Preferiblemente, los ARNs guías se dirigen a una o a varias secuencias de nucleótidos comprendidas en las secuen­ cias con las posiciones 70-132 y/o 142-539 de SEQ ID No: 1.
Preferiblemente, los medios para la recombinación dirigida del gen Dgkk humano comprenden además un ácido nu­ cleico que codifica la enzima Crispr/Cas9. Preferiblemente, el mismo ácido nucleico codifica los ARNs guías y la en­ zima Crispr/Cas9.
En un aspecto preferido, la descripción consiste en un vector de expresión que comprende un promotor ligado funcio­ nalmente al gen que codifica la enzima Crispr/Cas9 y a los genes que codifican los ARNs guías que se dirigen espe­ cíficamente a la recombinación del gen Dgkk humano, en donde el gen Dgkk recombinado resultante carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional.
Preferiblemente, el vector de expresión es el virus adenoasociado 2/9 o el virus adenoasociado 2/rh.10, incluso más preferiblemente, el virus adenoasociado 2/9.
Preferiblemente, el promotor es específico de un tipo celular, preferiblemente específico de las neuronas.
Preferiblemente, el promotor es el promotor del gen de la sinapsina-1 humana.
En un aspecto particular, los ARNs guía se dirigen a la deleción de los nucleótidos 70-132 de SEQ ID No: 1.
En otro aspecto particular, los ARNs guías se dirigen a la deleción de los nucleótidos 142-539 de SEQ ID No: 1.
En otro aspecto particular adicional, los ARNs guías se dirigen a la deleción de los nucleótidos 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1.
En todavía otro aspecto particular adicional, los ARNs guías se dirigen a la deleción de los nucleótidos 4-539 de la SEQ ID No: 1.
La descripción también se refiere a medios para la recombinación dirigida del gen Dgkk humano de la descripción para su uso como fármaco. Preferiblemente, la descripción se refiere a un vector de expresión que comprende un promotor ligado funcionalmente con el gen que codifica la enzima Crispr/Cas9 y los genes que codifican los ARNs guías de la descripción, para su uso como fármaco, preferiblemente en el tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto que lo necesita.
La descripción también se refiere a una composición farmacéutica que comprende medios para la recombinación dirigida del gen Dgkk humano. Preferiblemente, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que com­ prende un vector de expresión que comprende un promotor ligado funcionalmente con el gen que codifica la enzima Crispr/Cas9 y los genes que codifican los ARNs guías de la descripción, preferiblemente en el tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
La descripción también se refiere a un método de tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto que lo necesita que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un vector de expresión que comprende un pro­ motor ligado funcionalmente con el gen que codifica la enzima Crispr/Cas9 y los genes que codifican los ARNs guías de la descripción, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
La descripción también se refiere al uso de un vector de expresión que comprende un promotor ligado funcionalmente con el gen que codifica la enzima Crispr/Cas9 y los genes que codifican los ARNs guías de la descripción, en la preparación de un fármaco para el tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
Aunque tienen diferentes significados, las expresiones "que comprende", "que tiene", "que consiste en" y "que con­ tiene" se pueden reemplazar entre sí en toda la solicitud.
En los siguientes ejemplos se describirán aspectos y ventajas adicionales de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de las regiones implicadas en el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP en células Cos-1.
Materiales y métodos
Cultivo celular: Se cultivaron células COS (ATCC® CRL-1650™) en DMEM complementado con suero de ternera fetal al 10%, 1 g/l de glucosa en presencia de antibióticos a 37°C en CO2 al 5%. El día antes de la transfección, 4x104 células se sembraron en placas con formato de 24 pocillos en 500 pl de medio exento de antibióticos.
Estructuras artificiales de plásmidos: Se subclonó DgkK de ratón a partir del clon IMAGE IRAVp968H03163D. La región de DgkK UTR 3' que faltaba se clonó mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón, con los cebadores GCAGCTAGCTCCTTGAAAGCTGGAAGGAGA (SEQ ID No: 2) y AATAGAATGCGGCCGCCAGCTTCAACA-GCACTTGTAG (SEQ ID No: 3) y se introdujo en los sitios XbaI y NotI del vector pYX-DgkK para proporcionar pYX DgkKFull. El plásmido pCI-DgkK-FL (véase la Figura 1, Tabla 1 anterior y SEQ ID No: 8) se obtuvo subclonando con PCR usando pCI-DgkKFull como molde (obtenido mediante la subclonación de Dgkk en el vector pCI de GenBank U47119) con la adición de la secuencia HA antes del codón STOP, utilizando los cebadores sentido (TTCTCAACTA-TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAGTCCTTGAAAGCTGGAAGG, SEQ ID No: 4) y antisentido (TCAAG-GACTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATAGTTGAGAACTTGAAGGTGTTG, SEQ ID No: 5).
El plásmido A5'reg-Dgkk (véase la Figura 1) se obtuvo subclonando pYX-mDgkk en pEGF-N1 (U55762) y se completó mediante una digestión enzimática de pCi-mDgkk-3'UTR y mutagénesis dirigida para insertar el marcador HA y elimi­ nar la región 5’.
El plásmido 5'reg-Dgkk (véase la Figura 1) se obtuvo insertando el fragmento de la región 5’ previamente clonado en un vector pEGFP-C1 (U55763) y e completó mediante mutagénesis dirigida para insertar el marcador HA.
Los plásmidos A5'UTR-5'reg-Dgkk, APro-5'reg-Dgkk, AEPAPE-5'regDgkk, AEPAPE I-5'reg-Dgkk y AEPAPE II-5'reg-Dgkk se obtuvieron mediante mutagénesis directa de los plásmido pEGF-C1 5'reg, de modo que se eliminan las se­ cuencias deseadas (véase la Figura 1).
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Tabla 1: Posiciones de los principales dominios relevantes de las estructuras artificiales del plásmido DgkK-FL
(la numeración comienza con la UTR 5' del gen Dgkk)
* en la estructura artificial AEPAPE II-5'reg-Dgkk, las cinco últimas repeticiones (de un total de diez) del motivo EPAPE se han delecionado correspondiéndose a la secuencia 531-857 en el plásmido Dgkk-FL
Transfecciones y análisis de la transferencia Western: Las transfecciones de los ARN-sh se realizaron por triplicado con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en 60.000 células según las indicaciones del fabricante, con 20 pmol de ARNsi (Control o FMR1 de ratón On Target plus Smart Pool, Thermo) en un volumen final de 600 pl. Veinti­ cuatro horas más tarde, se cotransfectaron 0,6 pg de una estructura artificial de plásmido y 20 pmol de ARNsh como se ha descrito anteriormente. Cuarenta y ocho horas después, las células lavadas dos veces en PBS se lisaron direc­ tamente en el tampón de carga (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS al 4%, glicerol al 30%, p-mercaptoetanol 1,4 M y azul de bromofenol) durante 3 min a 95°C. Las proteínas se analizaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se inmunotransfirieron a PVDF (Millipore) en tampón Tris-glicina-SDS/etanol al 20% durante 1 hora a 200 mA. Las membranas se incubaron durante una noche a 4°C con anti-FMRP 1C3 de ratón 1:10000, anti-HA de ratón 1:1000 o anti-GAPDH de ratón 1:10000 y se incubaron a temperatura ambiente con anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con peroxidasa (1/5000). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL).
Resultados
Los inventores han investigado el impacto de FMRP sobre la expresión de Dgkk en células Cos-1. Las células Cos-1 se transfectaron con plásmidos que expresaban una estructura artificial de Dgkk de longitud completa (Dgkk-FL, véase la Figura 1), una estructura artificial de Dgkk que carecía de su región codificante 5’ y su UTR 5' (A5'reg-Dgkk, véase la Figura 1) o un plásmido de control. Ambas estructuras artificiales de Dgkk comprenden una marcador HA, lo que permite su detección con un anticuerpo específico. Antes de la transfección del plásmido, las células Cos-1 se trataron con ARNsi dirigidos a Fmr1, o mediante un ARNsi de control.
Los resultados de la transferencia Western con anticuerpos anti-FMRP muestran que el ARNsi que se dirige a Fmr1 es eficaz para reducir la expresión de FMRP, en comparación con la condición de ARNsi de control (véase la Figura 2A). La expresión de FMRP se reduce en aproximadamente un 70% (véase la Figura 2B o 2C).
Cuando se reduce la expresión de FMRP, el nivel de expresión de Dgkk-FL también se reduce en aproximadamente un 70%, en comparación con las condiciones de control (véase la Figura 2A y 2B, con anticuerpo para HA). Estos resultados demuestran que FMRP controla positivamente la expresión de Dgkk.
Por el contrario, la expresión de la estructura artificial A5'reg-Dgkk no se ve afectada por la reducción de la expresión de FMRP (véase la Figura 2A y 2C), lo que demuestra que la expresión de A5'reg-Dgkk no está controlada por FMRP. Estos resultados señalan que la región A5’, que comprende la región codificante 5' y la UTR 5’ de Dgkk, tienen una importancia decisiva para el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP. Por tanto, la estructura artificial A5'reg-Dgkk, al contrario que el gen Dgkk de longitud completa, se puede expresar en células que carecen de FMRP.
Además, la comparación de la intensidad del marcado con HA entre A5'reg-Dgkk y Dgkk-FL parece indicar que, inde­ pendientemente del control de FMRP, el nivel basal de expresión de A5'reg-Dgkk podría ser superior al nivel de ex­ presión basal de Dgkk-FL. En el experimento de la Figura 3, las células Cos-1 se transfectaron con diferentes estruc­ turas artificiales de Dgkk, incluyendo Dgkk-FL y A5'reg-Dgkk, y luego se analizó su expresión mediante transferencia Western en el mismo gel. Se encontró una diferencia significativa en la expresión entre las estructuras artificiales Dgkk-FL y A5'reg-Dgkk, lo que confirma que la región 5’ de Dgkk ejerce una acción supresora sobre el nivel de expresión de Dgkk.
Por tanto, la supresión de la región 5’ de Dgkk suprime el control positivo ejercido por FMRP sobre la expresión de Dgkk y mejora la expresión de Dgkk.
En una segunda serie de experimentos, los inventores se proponían determinar qué parte de la región 5’ de Dgkk es importante en el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP. Para lograr ese objetivo, los inventores prepararon diferentes estructuras artificiales en donde todas ellas comprendían un marcador GFP y HA para su detección (véase la Figura 1). La primera estructura artificial, 5'reg-Dgkk, comprende la secuencia que se había eliminado en la estruc­ tura artificial A5'reg-Dgkk: la región codificante 5’ de Dgkk y la UTR 5' de Dgkk. A continuación, en todas las demás estructuras artificiales, se eliminó una parte de la secuencia 5'reg-Dgkk: la UTR 5' en la estructura artificial A5'UTR-5'reg-Dgkk, la región rica en prolina en la estructura artificial APro-5'reg-Dgkk, la región repetida de EPAPE y el resto de 5'reg-Dgkk en la estructura artificial AEPAPE-5'reg-Dgkk, la región repetida de EPAPE en la estructura artificial AEPAPE I-5'reg-Dgkk, y la segunda mitad de la región repetida de EPAPE en la estructura artificial AEPAPE II-5'reg-Dgkk. Luego, como se ha descrito previamente, las células Cos-1 fueron transfectadas con esas estructuras artificiales en presencia o ausencia de ARNsi de Fmr1 y la expresión de las estructuras artificiales se analizó mediante transfe­ rencia Western.
En los experimentos con la estructura artificial 5'reg-Dgkk, el nivel de expresión de FMRP se reducía en aproximada­ mente un 80% en las células transfectadas con ARNsi de Fmr1, en comparación con la condición de control (Figura 4A y B, primer gráfico). El nivel de expresión de la estructura artificial 5'reg-Dgkk también se reducía en aproximada­ mente un 45% cuando se reducía el nivel de expresión de FMRP. Estos resultados demuestran que la región 5’ de Dgkk es suficiente para permitir un control positivo de la expresión a través de FMRP.
En los experimentos con la estructura artificial A5'UTR-5'reg-Dgkk, el nivel de expresión de FMRP se reducía en apro­ ximadamente un 60% en las células transfectadas con ARNsi de Fmr1, en comparación con la condición de control (Figura 4A y B, segundo gráfico). El nivel de expresión de la estructura artificial A5'UTR-5'reg-Dgkk se reducía en aproximadamente un 25% cuando se reducía el nivel de expresión de FMRP. Estos resultados indican que se conserva un control de la expresión a través de FMRP en ausencia de la UTR 5' en la región 5’ de Dgkk. Por lo tanto, la UTR 5' no parece tener una importancia primordial en el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP. Además, la aparente disminución del control de la expresión a través de FMRP desde un 50% a un 30% en este experimento, en comparación con el precedente, podría ser una consecuencia de la menor extinción de FMRP (50% en lugar del 80% en el experimento precedente).
En el experimento con la estructura artificial APro-5'reg-Dgkk, el nivel de expresión de FMRP se reducía en aproxima­ damente un 80% en las células transfectadas con ARNsi de Fmr1, en comparación con la condición de control (Figura 4A y B, tercer gráfico). El nivel de expresión de la estructura artificial APro-5'reg-Dgkk no se vio afectado por la reduc­ ción del nivel de expresión de FMRP. Estos resultados demuestran que FMRP no puede controlar la expresión de la región 5’ de Dgkk, cuando la región rica en prolina se elimina de su secuencia, lo que demuestra que la región rica en prolina tiene una importancia decisiva en el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP.
En el experimento con la estructura artificial AEPAPE-5'reg-Dgkk, el nivel de expresión de FMRP se reducía en apro­ ximadamente un 70% en las células transfectadas con ARNsi de Fmr1, en comparación con la condición de control (Figura 4A y B, cuarto gráfico). El nivel de expresión de la estructura artificial AEPAPE-5'reg-Dgkk no se vio afectado por la reducción del nivel de expresión de FMRP. Estos resultados demuestran que FMRP no puede controlar la expresión de la región 5’ de Dgkk cuando la región repetida de EPAPE se elimina de su secuencia, lo que demuestra que la región repetida de EPAPE tiene una importancia decisiva en el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP.
En el experimento con la estructura artificial AEPAPE I-5'reg-Dgkk o con la estructura artificial AEPAPE II-5'reg-Dgkk, el nivel de expresión de FMRP se reducía en aproximadamente un 60% en las células transfectadas con Fmr1, en comparación con la condición de control (Figura 4A y B, quinto y sexto gráficos). Los niveles de expresión de la es­ tructura artificial AEPAP I-5'reg-Dgkk y AEPAPE II-5'reg-Dgkk no se vieron afectados por la reducción del nivel de expresión de FMRP. Estos resultados demuestran que FMRP no puede controlar la expresión de la región 5’ de Dgkk cuando la totalidad o la mitad de la región repetida de EPAPE se elimina de su secuencia, lo que demuestra que una región repetida de EPAPE incompleta no es suficiente para permitir un control de la expresión de Dgkk a través de FMRP.
Además, la comparación de la expresión de las estructuras artificiales 5'reg-Dgkk, A5'UTR-5'reg-Dgkk, APro-5'reg-Dgkk, AEPAPE-5'reg-Dgkk, AEPAPE I-5'reg-Dgkk y AEPAPE II-5'reg-Dgkk en el mismo gel, muestra que el nivel de expresión de la estructura artificial APro-5'reg-Dgkk y especialmente el nivel de expresión de las estructuras artificiales AEPAPE-5'reg-Dgkk, AEPAPE I-5'reg y AEPAPE II-5'reg-Dgkk es superior al nivel de expresión de 5'reg-Dgkk, lo que confirma que la región rica en prolina y la región repetida de EPAPE ejercen una acción represiva sobre la expresión de Dgkk.
En conjunto, estos resultados demuestran la importancia de la región rica en prolina y de la región repetida de EPAPE de Dgkk en el control positivo de la expresión de Dgkk a través de FMRP. La supresión de la región codificante 5’ de Dgkk, y en particular de la región rica en prolina y/o de la región repetida de EPAPE, es suficiente para anular el control de la expresión de Dgkk a través de FMRP, por lo que un gen Dgkk modificado de ese tipo se puede expresar en células, independientemente del nivel de expresión de FMRP.
Ejemplo 2: Alteraciones de las espinas dendríticas y corrección con modulación de la expresión de A5'-DgkK.
Materiales y métodos
Estructura artificial de vectores AAV: Un ARN corto de horquilla diseñado para dirigirse a Dgkk (shRNA Dgkk, 5'-GGAATGCACTACTGGTATTCC, SEQ ID No: 6) y la secuencia de shRNA-scramble seleccionada (5'-GCGCT-TAGCTGTAGGATTC, SEQ ID No: 7) que no tiene coincidencias in silico en el genoma de ratón, se clonó bajo el control del promotor mU6 en un plásmido obtenido a partir de pAAV-MCS que expresaba la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) bajo el control de un promotor CMV. La sobreexpresión de Dgkk se logró clonando A5'reg-Dgkk marcado con HA bajo el control del promotor del gen de la sinapsina-1 humana que reemplazaba a EGFP en el plásmido de control pENN.AAV.hSynapsin1.EGFP.RBG (proporcionado por Penn Vector Core en la Universidad de Pensilvania). Se generaron virus adenoasociados recombinantes de serotipo 9 (AAV9) que coexpresaban EGFP y shRNA (AAV9-EGFP-shRNA-Dgkk y control AAV9-EGFP-shRNA-scramble) así como AAV9 que expresaban HA-Dgkk o EGFP (AAV9-hSynapsin1-HA-Dgkk y control AAV9-hSynapsin1 -EGFP). La producción de AAV se llevó a cabo utili­ zando el sistema AAV Helper-Free (Agilent Technologies) con algunas modificaciones. Los vectores de AAV9 se ge­ neraron mediante una transfección triple de la línea celular 293T/17 usando pAAV-EGFP-shRNA-Dgkk o pAAV-EGFP-shRNA-scramble, pAAV-hSynapsin1-HA-A5'reg-Dgkk o pENN.AAV.hSynapsin1.EGFP.RBG junto con pAAV2/9 (Penn Vector Core) que contenía genes cap del serotipo 9 de AAV y pHelper. Dos días después de la transfección, las células se recogieron, se lisaron mediante tres ciclos de congelación/descongelación con hielo seco-etanol y baños a 37°C, se trataron adicionalmente con 100 U/ml de Benzonasa (Novagen) durante 30 min a 37°C y se clarificaron por centri­ fugación. Los vectores víricos se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de iodixanol (OptiprepTM, Axis Shield) seguida de diálisis y concentración frente a PBS que contenía MgCl2 0,5 mM usando filtros de centrífuga (Amicon Ultra-15 100 K). Las partículas víricas se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando un plásmido estándar linealizado pAAV-EGFP. Para lograr concentraciones de trabajo comparables, los virus se diluyeron hasta una concentración final de 5 x 1012 genomas víricos por ml (vg/ml) y se almacenaron a -80°C hasta el uso.
Transfección de cultivos de cortes y formación de imágenes: Se prepararon cultivos de cortes organotípicos de hipo­ campo (400 pm de espesor) a partir de ratones C57BL/6 Fmr1+/y posnatales de 5-6 días de edad o de compañeros de camada Fmr1-/y, utilizando un protocolo aprobado por la oficina veterinaria de Ginebra y se conservaron las con­ diciones de cultivo descritas (De Roo M et al., 2008, Cereb Cortex, 18(1): 151-161). La transfección se llevó a cabo en DIV7 con un método biolístico (Helios Gene Gun, Bio-Rad) usando perlas de oro recubiertas con mRFP y pAAV-EGFP-shRNA-Dgkk, pAAV-EGFP-shRNA-scramble, pAAV-hSynapsin1-EGFP o pAAV-hSynapsin1-HA-A5'reg-Dgkk. La for­ mación de imágenes confocales repetitivas se realizó como se ha descrito previamente (De Roo M et al., 2008, Cereb Cortex, 18(1): 151-161). Brevemente, se obtuvieron imágenes de segmentos dendríticos de neuronas transfectadas CA1 (30-40 pm de longitud) a partir de DIV12 a DIV15 (a las 0, 5, 24, 48 y 72 horas) utilizando un sistema Olympus Fluoview 300 y el análisis de las imágenes apiladas en forma de Z así obtenidas se realizó utilizando el programa informático Osirix.
Resultados
Los inventores examinaron el impacto de la pérdida de función de Dgkk sobre la morfología y la dinámica de las espinas dendríticas. El silenciamiento de Dgkk en la región CA1 de los cortes organotípicos del hipocampo de ratón provoca un fuerte aumento de espinas anormalmente largas y con múltiples cabezas y una marcada disminución de la proporción de espinas maduras (véase la Figura 5A-D), mientras que la densidad de las espinas permanece sin cambios (véase la Figura 5C). Además, hay un aumento significativo de la renovación de las espinas, como indica el aumento de la tasa de formación y eliminación de espinas, asociado con una inestabilidad de las espinas (véase la Figura 5G-I). Estos datos indican que Dgkk es necesario para la maduración y el mantenimiento de las espinas y que su pérdida conduce a defectos estructurales similares a los previamente observados en los ratones Fmr1-/y (Comery TA et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA, 94(10): 5401-5404; He CX y Portera-Cailliau C, 2013, Neuroscience, 251: 120-128). Para establecer un vínculo funcional entre Dgkk y FMRP, los inventores sometieron a ensayo si la sobreex­ presión de A5'reg-Dgkk dentro de neuronas Fmr1-/y podía corregir el fenotipo de las espinas dendríticas. Sorprenden­ temente, las neuronas Fmr1-/y transducidas con AAV9 que expresaba A5'reg-Dgkk, tienen sus defectos corregidos en las espinas (véase la Figura 5A-F Fmr1-/y+A5'reg-Dgkk), lo que indica que una sobreexpresión de A5'reg-Dgkk es capaz de compensar la falta de FMRP.
Ejemplo 3: Transducción de AAV A5'reg-DgkK in vitro e in vivo, e impacto sobre el comportamiento de ratones Fmr1-KO
Materiales y métodos
Estructura artificial de vectores AAV: El virus adenoasociado recombinante de serotipo 9 (AAV9) y RH10 (AAV10) que expresa A5'reg-Dgkk marcado con HA bajo el control del promotor del gen de la sinapsina-1 humana (AAV9-A5'reg-Dgkk y AAV10-A5'reg-Dgkk) se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Cultivos primarios de neuronas corticales: Se diseccionaron córtex de embriones de ratón C57BL/6J Fmr1 /y o Fmr1-/y [día del embrión (E17.5)] en 1xPBS, 2,56 mg/ml de D-glucosa, 3 mg/ml de BSA y MgSO4 1,16 mM; se incubaron durante 20 min con 0,25 mg/ml de tripsina y 0,08 mg/ml de ADNasa I; y se disociaron mecánicamente después de una complementación del medio con 0,5 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja, 0,08 mg de ADNasa I y MgSO4 1,5 mM. Las células se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos recubiertas con bromhidrato de poli-L-lisina durante 8 días en medio neurobasal (GIBCO) complementado con B27, penicilina/estreptomicina y L-glutamina 0,5 pM.
Cirugía estereotáxica e inyecciones de AAV: Los ratones (C57BL/6J) se anestesiaron profundamente con ketamina/xilazina (Virbac/Bayer, 100/10 mg/kg, 10 ml/kg, intraperitoneal) disuelta en solución salina isotónica estéril (NaCl al 0,9%) y se acoplaron a una estructura estereotáxica (Unimecanique). AAV9-A5'reg-Dgkk, AAV10-A5'reg-Dgkk o AAV9-EGFP (5x1012 genomas víricos por mL) se inyectaron bilateralmente tanto en el cuerpo estriado como en el hipocampo, de acuerdo con las coordenadas del atlas de cerebro del ratón. Se administró bilateralmente un volumen de 1,5 pl de vectores de AAV en cada sitio de inyección, con una tasa de inyección lenta (0,1 pl/min) a través de una cánula de acero inoxidable de calibre 30 conectada con una bomba de infusión. Después de completar cada inyección, el inyector se dejó en su lugar durante 10 minutos adicionales para asegurar una difusión óptima y minimizar el reflujo mientras se retiraba el inyector. Los experimentos de comportamiento se realizaron 4 semanas después de las inyec­ ciones de AAV para dejar un tiempo suficiente para la transducción vírica y la expresión de DgkK. La expresión génica eficaz se evaluó mediante qRT-PCR y mediante inmunofluorescencia.
Experimentos de comportamiento: Las pruebas de comportamiento se realizaron a ciegas en una serie de ratones tratados con AAV9-A5'reg-Dgkk, AAV10-A5'reg-Dgkk o AAV9-EGFP, 4 semanas después de la inyección en el cuerpo estriado. La interacción social directa y NOR se realizaron en cuatro campos cuadrados iguales (50x50 cm) separados por paredes de plexiglás gris opaco de 35 cm de altura sobre una plataforma de plexiglás blanca (View Point).
Interacción social directa: El día 1, los ratones se colocaron en cada campo durante 15 minutos para la habituación. El día 2, se introdujo una pareja de animales (la misma condición, no eran compañeros de jaula) en cada campo durante 10 min. El tiempo total que pasaban en contacto cercano (contactos de la nariz y las patas), el número y la duración de los contactos de la nariz y las patas (arrastrando, montando, pisando y empujando), y lavándose, así como el número de episodios de seguimiento, crianza y dar vueltas, se puntuaron en grabaciones de video.
No observamos ningún comportamiento agresivo (ataques, mordeduras o movimientos rápidos de la cola) entre los protagonistas durante esa prueba.
Condición física: El rendimiento físico se evaluó con una varilla giratoria (Bioseb) acelerando de 4 a 40 rpm en 5 min. La varilla se cubrió con una capa aislante para un mejor agarre, cuyo perímetro externo era de 5 cm (40 1x). El día 1, los ratones se habituaron a la rotación sobre la varilla a 4 rpm, hasta que pudieron permanecer >180 s. Desde el día 2 al 5, los ratones se sometieron a la prueba con tres ensayos diarios (60 s entre los ensayos). Cada prueba comen­ zaba colocando a los ratones sobre la varilla y comenzando la rotación a una velocidad constante de 4 rpm durante 60 s. Después se introducía el programa de aceleración y la prueba terminaba cuando un ratón en particular se caía de la varilla. El tiempo sobre la varilla se registraba automáticamente.
Reconocimiento de objetos novedosos (NOR): La prueba NOR se realizó como se ha descrito (Le Merrer et al. (2013) Neuropsychopharmacology 38(6):1050-1059). Brevemente, el día 1, los animales se colocaron en un campo para una habituación durante 15 minutos con dos copias de un objeto no familiar. El día 2, la prueba de reconocimiento consistía en tres ensayos de 10 min separados por dos intervalos entre ensayos de 5 min. En la fase de familiarización, a los ratones se les presentaban dos copias de un objeto no familiar. En la fase de reconocimiento, una de las dos copias se desplazaba a una nueva ubicación en el campo. En la fase del ensayo, la copia que no se había movido en el ensayo anterior se reemplazaba por un objeto nuevo. Los objetos de los estímulos tenían un tamaño de 1,5-3 x 2-3 cm. La identidad de los objetos y su ubicación espacial se equilibraron entre los sujetos. El número de acercamientos y el tiempo dedicado a explorar cada objeto se puntuaron en grabaciones de vídeo. Se calculó un porcentaje de discriminación para el número de visitas y el tiempo de exploración de los objetos, de la siguiente manera: exploración de un objeto desplazado o novedoso/exploración total x100. El patrón de cruzamientos de los cuadrantes se valoró en grabaciones de video. Se puntuaron exploraciones completas (FE; es decir, cruzamientos sucesivos de los cuatro cuadrantes que forman conjuntos cuádruples superpuestos, p. ej., ABCD), retornos a los cuadrantes (QR; p. ej., ABCB) y alternancia en los cuadrantes (QA; p. ej., ABAB), y el porcentaje de FE, QR y QA se calculó de la siguiente manera: FE o QR o QA/(cruzamientos totales) x 100.
Actividad espontánea: La medición de la actividad espontánea y la ingesta de alimentos/agua se evaluó en jaulas automatizadas (Imetronic, Pessac, Francia) para evaluar el ritmo biológico y las anomalías del sueño durante períodos de 24 h. Las jaulas se iluminaron 12 horas al día a partir de las 7 a.m. El bastidor se conectó a una interfaz electrónica para comunicarlo con un ordenador para el almacenamiento automático de datos. Cada ratón se introdujo en una jaula de actividades a las 6 p.m. y se le dejó tranquilo durante las siguientes 25 horas. La actividad locomotora se evaluó en función del número de veces que cruzó el haz de infrarrojos. La primera hora de la prueba se analizó por separado en periodos de 10 minutos, con el fin de evaluar la respuesta locomotora y la habituación a un entorno nuevo. Las 24 horas restantes se analizaron en bloques de 1 hora con la fase de luz/oscuridad de 12 horas como un factor adicional del ensayo, con el fin de evaluar la modulación circadiana de la actividad locomotora.
Análisis estadístico: Todos los datos fueron analizados mediante ANOVA con fondo genético B6 y genotipo Fmr1 (y/+ o y/-) como factores entre sujetos. Se incluyeron factores intrasujetos si era necesario. Las comparaciones post-hoc se realizaron utilizando la prueba LSD de Fisher. Los datos se presentan como media ± SEM.
Resultados
Los inventores examinaron el impacto de la expresión de A5'reg-Dgkk procedente de virus adenoasociado de serotipo 9 (AAV9) o rh10 (AAV10) en cultivos de neuronas disociadas o in vivo en ratones C57BL/6 Fmr1+/y o sus compañeros de camada Fmr1 -/y. Las neuronas corticales de C57BL/6 Fmr1 /y o sus compañeros de camada Fmr1 -/y se transujeron de manera eficaz (± 100%) a los 14 días in vitro y el transgén A5'reg-Dgkk se expresaba bien tal como se visuali­ zaba con el marcador HA (Figura 6A). Se ha mostrado previamente que la fosforilación del factor de iniciación 4E (eIF4E) aumenta en las neuronas Fmr1-/y y en los pacientes (Gantois et al. Nat Med. Junio de 2017; 23(6): 674-677, Figura 6B) y se propone que la fosforilación de eIF4E es el resultado de la sobreactivación de la señalización del receptor de glutamato metabotrópico (mGluR) en el trastorno de X frágil. Los inventores mostraron que la expresión de A5'reg-Dgkk procedente de AAV9 (Figura 6C) o AAV10 (datos no mostrados), reduce la fosforilación de eIF4E en neuronas Fmr1-/y, 7 días después de la infección. Estos datos indican que los vectores AAV9-A5'reg-Dgkk o AAV10-A5'reg-Dgkk tienen potencial para corregir la fosforilación anormal de eIF4E en las neuronas Fmr1-/y. Los inventores examinaron a continuación la capacidad de expresión de A5'reg-Dgkk procedente de AAV9 o AAV10 para corregir comportamientos de un ratón Fmr1-/y. Los ratones C57BL/6J Fmr1+/y o Fmr1-/y recibieron inyecciones de AAVs (2x10E10 GC/sitio de inyección) tanto en la región estriatal como en el hipocampo a las 4 semanas de edad. Cuatro semanas después de la inyección, se evaluó la expresión génica eficaz mediante qRT-PCR y mediante inmunofluorescencia (Figura 6D, E). La expresión de A5'reg-Dgkk procedente de AAV9 o AAV10 no tenía un efecto sobre las condiciones físicas de los ratones, independientemente del genotipo (Figura). Los ratones Fmr1-/y tenían un tiempo de interacción incrementado con ratones extraños (ansiedad reducida) en comparación con los Fmr1+/y de tipo sil­ vestre (Figura 6A). La expresión de A5'reg-Dgkk procedente de AAV9 o AAV10 corrige este fenotipo (Figura 6A). Los ratones Fmr1-/y tenían menos memoria en la prueba de reconocimiento de objetos nuevos (NOR) en comparación con los Fmr1+/y de tipo silvestre (Bhattacharya et al., 2012). Mientras que los ratones Fmr1-/y carecen de la capacidad para discriminar entre un objeto nuevo y un objeto familiar, el animal tratado con AAV9-A5'reg-Dgkk muestra capacidad de discriminar entre un objeto familiar y uno nuevo (Figura 6H). Estos datos sugieren una eficacia parcial del trata­ miento sobre la memoria de los animales. Dirigir AAV hacia regiones diana específicas del cerebro podría explicar una recuperación parcial. Los ratones Fmr1-/y tienen una actividad incrementada durante un período de 24 horas (hiperactividad), en comparación con los ratones Fmr1+/y de tipo silvestre (Figura 6I). La expresión de A5'reg-Dgkk proce­ dente de AAV9 o AAV10 corrige ese fenotipo (Figura 6I). En conjunto, estos datos sugieren que la expresión de A5'reg-Dgkk tiene la capacidad de mejorar los fenotipos del modelo de ratón Fmr1 -/y de X frágil.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico que codifica una proteína DGKk (diacilglicerol cinasa kappa) humana funcional que carece de una región rica en prolina funcional y/o de una región repetida de EPAPE funcional, en donde el ácido nucleico tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y en donde la región rica en prolina es la región nucleotídica entre los nucleótidos 70 y 132 de SEQ ID NO: 1, y en donde la región repetida de EPAPE es la región nucleotídica entre los nucleótidos 142 y 539 de SEQ ID NO: 1.
2. El ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde la proteína DGKk humana carece de dicha región rica en prolina funcional y de dicha región repetida de EPAPE funcional.
3. El ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, en donde la proteína DGKk humana carece de dicha región rica en prolina y/o de dicha región repetida de EPAPE.
4. El ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ácido nucleico tiene al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 con una o varias deleciones en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 70-132 y/o 142-539 de SEQ ID No: 1, y opcionalmente una o varias deleciones en las secuencias de nucleótidos en las posiciones 4-69 y/o 133-141 y/o 540-648 de SEQ ID No: 1.
5. El ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido nucleico tiene al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de identidad con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1 con una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1, las secuencias en las posiciones 70-132 y 142-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 70-539 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-142 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 4-539 de SEQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4-648 de SEQ ID No: 1.
6. El ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico tiene la secuencia de SEQ ID No: 1 con una deleción de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia en las posiciones 70-132 de SEQ ID No: 1, la secuencia en las posiciones 142-539 de SEQ ID No: 1, las secuencias en las posiciones 70-132 y 142-539 de SeQ ID No: 1 y la secuencia en las posiciones 4-539 de SEQ ID No: 1.
7. Un casete de expresión que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un promotor.
8. El casete de expresión según la reivindicación 7, en donde el promotor es un promotor específico de neuronas, preferiblemente el promotor del gen de la sinapsina-1 humana.
9. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un casete de expresión según la reivindicación 7 u 8.
10. El vector de expresión según la reivindicación 9, en donde el vector de expresión es un virus adenoasociado, preferiblemente el virus adenoasociado 2/9 o el virus adenoasociado 2/10, más preferiblemente el virus adenoasociado 2/9.
11. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, casete de expresión según la reivindicación 7 u 8, o vector de expresión según la reivindicación 9 o 10, para uso como fármaco.
12. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un casete de expresión según la reivindicación 7 u 8, o un vector de expresión según la reivindicación 9 o 10.
13. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, casete de expresión según la reivindicación 7 u 8, vector de expresión según la reivindicación 9 o 10, o composición farmacéutica según la reivindicación 12, para uso en el tratamiento del síndrome de X frágil en un paciente que lo necesita.
14. Ácido nucleico, vector de expresión o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 13, en donde se usa en combinación con un agonista de PPAR gamma, preferiblemente un agonista de PPAR gamma de la familia de las tiazolindionas, más preferiblemente una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en pioglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona y troglitazona, e incluso más preferi­ blemente pioglitazona.
15. Un kit que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un casete de expresión según la reivindicación 7 u 8, un vector de expresión según la reivindicación 9 o 10, o una composición farmacéutica según la reivindicación 12, y medios para la administración de dicho ácido nucleico o dicho casete de expresión o dicho vector de expresión o dicha composición farmacéutica, y opcionalmente un prospecto que proporciona pautas para usar un kit de ese tipo.
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