CN113301956A - 控制器官功能的基因治疗方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于控制内脏器官功能的方法和组合物。例如，所述方法和组合物由于控制例如调节器官功能而可用于预防、抑制或治疗疾病。在一个实施例中，病毒介体被递送至器官，并且病毒感染调节器官功能的神经。在一个实施例中，病毒介体是逆行介体。在一个实施例中，病毒介体编码基因产物，基因产物的活性由外源递送的药剂或能量控制。因此，药剂或能量的递送控制器官功能。

Description

控制器官功能的基因治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2018年7月31日提出申请的美国申请号62/712,669申请日的权益，所述申请的公开内容通过引用并入本文中。
背景技术
基因治疗对多种神经疾病显示出巨大的前景。最近已经认识到，器官功能的神经元控制代表通过操纵神经元活性来治疗性调节器官功能的机会。改变神经元功能的机械途径目前是可用的，包含可以电刺激神经例如迷走神经的主干或分支的刺激器。然而，这些非特异性地影响被刺激的神经内的所有神经元，并且它们涉及复杂的植入物，这些植入物具有机械装置所固有的复杂性，包含引线迁移和感染，同时脉冲发生器也必须定期充电和/或定期更换以维持功能。
基因治疗剂能够将神经元靶向内脏器官，然而将病毒介体注射至拥有这些神经元细胞体的神经节、大脑或脊髓区将不容许控制单个器官，因为这些大多是将神经元发送至许多器官的混合群体。例如，来自胃的迷走神经的感觉神经元可以感知伸展和饱腹感，而从迷走神经至肺的感觉神经元负责咳嗽反射。因此，将调节神经元功能的基因治疗剂注射至结状神经节中将会靶向两种神经元群体，从而影响两种器官的功能，这在单独治疗咳嗽或代谢障碍时是不希望的。
因此，需要一种途径来对特定器官的神经元子集的功能进行遗传调节，以便调节器官功能来改善疾病。
发明内容
本公开提供适用于控制器官功能以预防、抑制或治疗疾病的材料和方法。一方面，所述方法提供将病毒介体递送至器官，然后所述病毒介体由调节那些器官的功能的神经轴突摄取。在一个实施例中，病毒介体是腺相关病毒(AAV)介体。在一个实施例中，逆行形式的腺相关病毒(AAV)当被注射至胃壁中时，被特异性地摄取至迷走神经感觉神经元的子集中，所述迷走神经感觉神经元对胃的膨胀作出反应并引起饱腹感。提供逆行形式介体的分子是本领域已知的，并且包含但不限于天然病毒蛋白，例如HSV蛋白、狂犬病病毒G、糖蛋白C型、VSV G、B19G、假狂犬病病毒蛋白、AAV衣壳蛋白和动力蛋白。这代表从结状神经节发出而不影响向其它内脏器官提供感觉的其它结状神经元的神经元的特定子集。病毒介体也可以是其它形式的逆行介体，包含但不限于逆行慢病毒(LV)介体、单纯疱疹病毒(HSV)介体或犬腺病毒(CAV)介体。
在一个实施例中，提供将一种或多种基因递送至控制器官例如内脏器官的功能的神经纤维的方法，内脏器官包含但不限于胃、小肠、大肠、胰腺、肝、脾、胆囊、肺、肾和心脏。在一个实施例中，将病毒基因治疗介体递送至由调节神经(例如迷走神经、心肺神经、胸内脏神经、腰内脏神经、骶内脏神经或骨盆内脏神经)进行神经支配的器官区。在一个实施例中，器官是胃、肠、胰腺、肝、肺、心脏、肾上腺、肾、性腺、膀胱、肛门括约肌或尿道括约肌。在一个实施例中，病毒介体被修饰以在中枢神经系统中进行逆行运输。在一个实施例中，将病毒介体注射至器官中。在一个实施例中，递送介体会预防、抑制或治疗疾病。在一个实施例中，将病毒介体注射至胃中，并且基因的表达会控制食物摄入。在一个实施例中，病毒介体例如通过吸入被递送至肺，并且基因的表达会控制咳嗽。在一个实施例中，基因的表达激活调节神经。在一个实施例中，基因的表达抑制调节神经。
本公开还提供一种具有用于逆行摄取至靶神经元中的改进性质的病毒介体。此介体含有衣壳，所述衣壳含有来自点突变增加逆行摄取的一种AAV血清型例如AAV血清型2(retroAAV)(Tevro等人,Neuron 92:372-378(2016)，其通过引用并入本文中)的衣壳蛋白与来自不同AAV血清型例如AAV血清型rh10的衣壳蛋白的混合物。这种衣壳混合物产生与含有只来自retroAAV的蛋白的衣壳相比，显著增强向传入神经元的逆行摄取和效率的病毒介体。此介体提供对器官功能的高效控制。
本公开还提供一种用于器官功能的调节控制的方法。所述方法通常包含通过逆行介体将基因递送至器官的传入神经元，所述基因的产物对外部药物或刺激作出反应以控制器官功能。在一个实例中，此方法可用于诱导饱腹感和减少食物摄入，以控制体重。在此实例中，表达激活神经元的只由设计药物激活的设计受体(DREADD)的逆行AAV(retroAAV)被注射至胃壁，并被摄取至胃的传入迷走神经感觉神经元，其对胃伸展作出反应并诱导饱腹感。在全身施用DREADD激活剂例如氯氮平-N-氧化物(CNO)后，诱导饱腹感，并且减少食物摄入。其它实例包含向这些神经元递送兴奋性化学遗传离子通道，随后用适当的药物激活，或者递送兴奋性光遗传离子通道ChR2，随后向神经纤维递送光以激活ChR2。在另一个实例中，这种方法用于控制不是由于原本可治疗的疾病而引起的顽固性咳嗽。在一个实例中，将表达抑制性DREADD的逆行AAV雾化并吸入，以摄取至肺的迷走神经感觉神经元中，随后全身施用DREADD激活剂例如CNO，以抑制这些感觉神经元的活性从而减少咳嗽反射。在一个实例中，将表达例如抑制性DREADD的逆行AAV注射至例如迷走神经或结状神经节，随后全身施用DREADD激活剂例如CNO，以抑制这些感觉神经元的活性从而减少咳嗽反射。
在一个实施例中，病毒介体编码hM4Di，hM4Di是M4毒蕈碱乙酰胆碱受体的工程版本，当被CNO、氯氮平、哌拉平或化合物21(参见Chen等人,ACSChem.Neurosic.,6:476(2015))(其通过引用并入本文中)结合时，其通过减少cAMP信号传导和增加内向整流钾通道的激活而引起膜超极化。这会产生类似于内源激活M4受体后所见的神经元活性的暂时抑制。hM3Dq(hD3q)是M3毒蕈碱受体的工程版本，当被CNO激活时，其引起磷脂酶C级联的激活，改变细胞内钙并导致神经元的爆发样放电。rM3D引起基于G蛋白信号传导(例如，cAMP增加)的神经元去极化，其可以通过基于抑制蛋白的信号传导过程而不是G蛋白信号传导来调节神经元活性。神经元兴奋的其它选项是其它rM3D，其类似地引起基于G蛋白信号传导(例如，cAMP增加)的神经元去极化(参见例如Dong,Allen,Farrell和Roth,2010；Ferguson,Phillips,Roth,Wess和Neumaier,2013)；和Rq(R165L)，它们可以通过基于抑制蛋白的信号传导过程而不是G蛋白信号传导来调节神经元活性。另一种受体是抑制性DREADD受体Pdi。Gi偶联κ阿片受体(KORD)的突变形式被萨尔维诺林B(SalB)激活，且因此也可用于病毒介体。
本公开还提供一种通过将防止毒性蛋白转移的基因转移至迷走神经来防止毒性蛋白从胃肠道散布至大脑的方法。这可以通过将病毒介体直接注射至迷走神经的感觉神经节(例如结状神经节)中，或者将病毒介体直接注射至大脑中的迷走神经传出细胞体(例如迷走神经背侧运动核)中，或者通过将病毒介体注射至胃肠道壁中或者通过口服施用，然后这些介体被摄取至迷走神经轴突中并逆行运输以在细胞体中表达治疗剂来进行。在一个实例中，针对α-突触核蛋白的shRNA(其防止靶神经元中α-突触核蛋白的表达)是从病毒的逆行形式例如retroAAV/rh10介体表达的，通过注射至胃和/或肠的壁而被递送至迷走神经感觉纤维。迷走神经感觉神经元中shRNA的最终表达阻断这些神经元中内源性α-突触核蛋白的表达，从而防止毒性突触核蛋白病理从胃肠道中的病理原纤维散布，导致在帕金森氏病中观察到的广泛的脑病理，因为病理突触核蛋白的繁殖需要神经元中的表达。在另一个实例中，通过胃肠道递送的迷走神经感觉纤维内的retroAAV/rh10介体表达针对α-突触核蛋白的抗体，以防止α-突触核蛋白的散布。在一个实施例中，rAAV具有与SEQ ID NO:5或7具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的衣壳。
附图说明
图1描绘在向胃壁注射AAV介体后，大脑中迷走神经背侧运动核区中传入(感觉)纤维中的荧光mCherry蛋白的表达。已知的逆行示踪剂(霍乱毒素亚基B)被注射至胃中以标记传入运动纤维。注射AAV血清型2和1的混合介体(AAV2/1)显示出实际上没有神经元摄取。注射retroAAV(显示大脑中逆行摄取增加)引起在背侧运动核的神经元纤维中的mCherry蛋白表达，而不是在细胞体中表达，这表明这些是从结状神经节发出的感觉纤维。用retroAAV和AAVrh10混杂衣壳进行的相同程序显示，在同一脑区表达mCherry的纤维数量增加。
图2A描绘在向胃壁注射AAV介体后，在结状神经节内选择性表达mCherry蛋白，结状神经节为迷走神经感觉神经元提供细胞体。霍乱毒素示踪剂显示标记结状神经节内的少量神经元细胞体。事实上，在AAV2/1的情况下没有观察到阳性细胞体，但我们观察到一些逆行摄取至大脑中的神经元。retroAAV显示表达mCherry的结状神经节内细胞体数量增加，这表明有效的逆行摄取，但这种摄取是选择性的，因为只有结状神经元的子集被标记。与单独的retroAAV相比，retroAAV/rh10混杂介体证明更多标记结状神经元细胞体，但这些仍然代表神经元的子集(图2B)。神经元细胞计数的量化显示，与单独的retroAAV相比，在向胃壁施用retroAAV/rh10后，结状神经节内阳性神经元的数量增加了约3倍。
图3描绘向胃壁注射retroAAV/rh10以对1mg/kg CNO作出反应的正常摄食的禁食小鼠的反应，retroAAV/rh10表达激活神经元的DREADD(hD3q)。注射表达标记基因mCherry的retroAAV/rh10的动物正常摄食以对CNO作出反应。注射表达DREADD的retroAAV/rh10但给予盐水而不是CNO的动物，与给予CNO的mCherry动物相比，在施用盐水后6小时和24小时具有相同的正常摄食。注射表达DREADD的retroAAV/rh10并接着给予CNO的动物在CNO施用后的几个小时内显示出食物摄入显著减少。当CNO被清除后，摄食行为恢复正常，与对照相比，24小时内的总食物摄入减少，这是因为在CNO之后的4-6小时内食物摄入减少，而在CNO被清除后的6-24小时内，显示出与所述时间的对照相似的食物摄入。
图4A-4B描绘在施用CNO或盐水之前，将表达DREADD(hD3q)的retroAAV/rh10注射至胃壁并饥饿24小时的小鼠的反应。与正常摄食的小鼠相比(与图3相比)，注射表达标记基因mCherry的retroAAV/rh10的动物在施用CNO后的6小时和24小时具有增加的摄食。注射表达DREADD的retroAAV/rh10但给予盐水而不是CNO的动物，与给予CNO的mCherry动物相比，在施用盐水后6小时和24小时具有相同的摄食。尽管动物在之前的24小时内一直处于饥饿状态，但在施用CNO后的几个小时内，注射表达DREADD的retroAAV/rh10并给予CNO的动物显示出食物摄入显著减少。这种影响如此深远，以至于在施用CNO后的4-6小时内，此饥饿组的食物摄入仍然低于测试前正常摄食并接着接受对照介体或药物的动物(参见图3)。当CNO被清除后，与正常摄食组相比，此组的摄食行为有所反弹，在CNO被清除后6-24小时，动物的食物摄入增加，这是由于与对照相比，通过治疗有效地延长了饥饿期。这与正常摄食的小鼠不同，正常摄食的小鼠在CNO被清除后恢复正常食物摄入，但与对照相比没有增加摄入。
图5示出递送基因治疗以控制器官功能的示例性途径。
图6描绘在3mg/kg CNO情况下的禁食小鼠的摄食行为的数据。
图7显示在3mg/kg CNO的情况下正常摄食小鼠的摄食行为的数据。
图8A-8E描绘1mg/kg CNO情况下的正常摄食小鼠的摄食行为的数据。
图9A-9E显示在1mg/kg CNO情况下的正常摄食小鼠中减少摄食行为的长期稳定性。
图10显示与盐水(S)相比，在用每天1mg/kg CNO(C)处理的60％高脂肪饮食下，肠道retro/rh10AAV HD3q(DREADD)小鼠的体重增加减少。
图11描绘与盐水(S)相比，在用每天1mg/kg CNO(C)处理的60％高脂肪饮食下，肠道retro/rh10AAV HD3q(DREADD)小鼠的体重增加连续减少。X轴显示药物治疗开始后的顺序天数，第33天在先前的图中是第24天。
图12A-12M示出pNLRep2_RETRO Cap2(SEQ ID NO:1)的序列。
图13A-14B提供pNLRep2_rh10Cap(SEQ ID NO:2)的序列。
图14A-14B示出AAV.CBA.flag-mCheryy.WPRE(SEQ ID NO:3)的序列。
图15A-15P提供AAVrh10(SEQ ID Nos.4-5)和retroAAV2(SEQ ID Nos.6-7)衣壳的示例性序列。
图16A-16B提供人M3和M4的序列。hM3的DREADD可以在残基149和/或239处具有取代，例如，mM3中的Y149C或A239G，且hM4的DREADDS可以在残基113和/或203处具有取代，例如，mM4中的Y113C或A203G(SEQ ID NO:12)。
具体实施方式
定义
“介体”是指包括多核苷酸或与多核苷酸相关且可用于在体外或体内介导多核苷酸向细胞的递送的大分子或大分子相关体。说明性介体包含例如质粒、病毒介体、脂质体和其它基因递送介体。待递送的多核苷酸，有时被称为“靶多核苷酸”或“转基因”，可以包括适于在哺乳动物中引发免疫反应的基因多肽或肽中的目标编码序列，和/或可选择或可检测的标记。
本文所用的“转导(transduction)”、“转染”、“转化”或“转导(transducing)”是指如下过程的术语：将外源多核苷酸引入宿主细胞从而引起多核苷酸，例如转基因在细胞中的表达，并包含使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。细胞中多核苷酸的转导、转染或转化可以通过本领域众所周知的方法来确定，包含但不限于例如通过ELISA、流式细胞术和蛋白印迹法测量蛋白表达(包含稳态水平)，通过杂交测定法，例如RNA印迹法、DNA印迹法和凝胶迁移率测定法测量DNA和RNA。用于引入外源多核苷酸的方法包含众所周知的技术，例如病毒感染或转染、脂转染、转化和电穿孔，以及其它非病毒基因递送技术。引入的多核苷酸可以在宿主细胞中稳定或瞬时保持。
“基因递送”是指将外源多核苷酸引入细胞中进行基因转移，并且可囊括靶向、结合、摄取、运输、定位、复制子整合和表达。
“基因转移”是指将外源多核苷酸引入细胞，其可囊括靶向、结合、摄取、运输、定位和复制子整合，但不同于且不意味着基因的后续表达。
“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。
“传染性”病毒或病毒颗粒是包括多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒，它能够将多核苷酸组分递送至病毒物种提供营养的细胞中。所述术语不一定意味着病毒的任何复制能力。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或封端的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在修饰，则可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。本文使用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本文所述的关于多核苷酸的本发明的任何实施例囊括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
“分离的”多核苷酸，例如质粒、病毒、多肽或其它物质是指所述物质的一种制剂，其不含至少一些其它组分，这些组分也可能存在于所述物质或类似物质天然存在或最初制备的地方。因此，例如，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集所述物质来制备分离的物质。分离的核酸、肽或多肽以不同于在自然界中发现的形式或环境存在。例如，给定的DNA序列(例如，基因)发现于邻近基因附近的宿主细胞染色体上；RNA序列，例如编码特定蛋白的特定mRNA序列，是在细胞中发现的，作为与编码许多蛋白的许多其它mRNA的混合物。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。当分离的核酸分子用于表达蛋白时，所述分子将至少含有有义链或编码链(即，分子可以是单链的)，但是可以含有有义链和反义链两者(即，分子可以是双链的)。富集可以在绝对基础上进行测量，例如每体积溶液的重量，或者其可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物质进行测量。本发明的实施例越来越多地富集，越优选。因此，例如，2倍富集、10倍富集、100倍富集或1000倍富集。
“转录调节序列”是指控制与其可操作地连接的基因或编码序列的转录的基因组区。用于本发明的转录调节序列通常包含至少一个转录启动子，并且还可以包含一个或多个转录增强子和/或转录终止子。
“可操作地连接”是指两个或更多个组分的布置，其中如此描述的组分处于允许它们以协调的方式运行的关系中。举例来说，如果TRS或启动子促进编码序列的转录，则转录调节序列或启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的TRS通常与编码序列顺式连接，但其不一定与编码序列直接相邻。
“异源”意指来源于与进行比较的实体在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且当表达时，可以编码异源多肽)。类似地，从其天然编码序列中去除并可操作地连接至不同编码序列的转录调节元件例如启动子是异源转录调节元件。
“终止子”是指倾向于减少或阻止通读转录的多核苷酸序列(即它减少或阻止起始于终止子一侧的转录持续到终止子的另一侧)。转录被破坏的程度通常随碱基序列和/或终止子序列长度而变。具体地说，正如在许多分子生物学系统中众所周知的，通常被称为“转录终止序列”的特定DNA序列是倾向于破坏RNA聚合酶的通读转录的特定序列，推测是通过使RNA聚合酶分子停止和/或脱离被转录的DNA。这种序列特异性终止子的典型实例包含聚腺苷酸化(“polyA”)序列，例如SV40 polyA。除了或代替这种序列特异性终止子，在启动子和编码区之间插入相对长的DNA序列也倾向于破坏编码区的转录，通常与插入序列的长度成比例。这种效应可能是因为RNA聚合酶分子总是存在某种程度上从被转录的DNA中脱离的趋势，并且增加在到达编码区之前要穿越的序列的长度通常将会增加在编码区转录完成之前或甚至可能开始之前发生脱离的可能性。因此，终止子可以阻止仅从一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)的转录，并且可以由序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或两者构成。各种这样的终止子序列在本领域是已知的；并且下面提供了这些序列在本发明上下文中的说明性用途。
“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“包装细胞系”和其它此类术语表示可用于本发明例如以产生重组病毒或重组融合多肽的高等真核细胞，例如包含人细胞在内的哺乳动物细胞。这些细胞包含被转导的原始细胞的后代。应了解，单细胞的后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组互补方面)。
应用于多核苷酸的“重组”是指所述多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤以及产生不同于自然界中发现的多核苷酸的构建体的其它程序的各种组合的产物。重组病毒是包括重组多核苷酸的病毒颗粒。这些术语分别包含原始多核苷酸构建体的复制和原始病毒构建体的后代。
“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能调节，包含多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。所述调节可能影响过程的频率、速度或特异性，并且可能在本质上是增强的或抑制的。本领域已知的控制元件包含例如转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是在一定条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区转录的DNA区。启动子包含AAV启动子，例如P5、P19、P40和AAV ITR启动子，以及异源启动子。
“表达介体”是包括编码目标基因产物的区的介体，并用于在预期的靶细胞中实现基因产物的表达。表达介体还包括与编码区可操作地连接的控制元件，以促进蛋白在靶中的表达。控制元件和它们可操作地连接以进行表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中大量是本领域已知和可获得的，或者可以容易地由本领域可获得的组分构建。
术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换地用来指任何长度的氨基酸聚合物。所述术语还囊括已被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、脂质化或与标记组分共轭。
术语“外源”，当结合细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸使用时，是指通过人工或天然手段引入细胞或生物体的蛋白、基因、核酸或多核苷酸。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个附加拷贝。作为非限制性的实例，外源核酸位于不同于天然细胞的染色体位置，或者侧接不同于自然界中发现的核酸序列，例如，将启动子从一个基因连接至不同基因的基因产物的开放阅读框的表达盒。
“转化的”或“转基因的”在本文中用于包含已经因至少一种重组DNA序列的存在而改变或扩增的任何宿主细胞或细胞系。本发明的宿主细胞通常通过用质粒表达介体中的DNA序列转染，作为分离的线性DNA序列，或用重组病毒介体感染来产生。
术语“序列同源性”意指两个核酸序列之间碱基匹配的比例或两个氨基酸序列之间氨基酸匹配的比例。当序列同源性以百分比表示时，例如50％，百分比表示与其它序列相比，选定序列长度上的匹配比例。允许有间隙(在两个序列中的任何一个中)以最大化匹配；通常使用15个碱基或更少的间隙长度，优选6个碱基或更少，更优选2个碱基或更少。当使用寡核苷酸作为探针或治疗时，靶核酸与寡核苷酸序列之间的序列同源性一般如下：20个可能的寡核苷酸碱基对匹配中不少于17个靶碱基匹配(85％)；10个可能的碱基对匹配中不少于9个匹配(90％)；或者20个可能的碱基对匹配中不少于19个匹配(95％)。
如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则它们是同源的。例如，85％同源性意味着当两个序列为了最大匹配而比对时，85％的氨基酸是相同的。在最大化匹配时，允许有间隙(两个匹配序列中的任何一个)；优选5或更小的间隙长度，更优选2或更小。另选地且优选地，如果使用具有突变数据矩阵的程序ALIGN以及6或更大的间隙罚分，两个蛋白序列(或源自它们的长度至少为30个氨基酸的多肽序列)具有大于5(以标准偏差单位计)的比对分数，则它们是同源的(如这个术语在本文所用)。当使用ALIGN程序进行最佳比对时，如果两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50％相同，则它们更同源。
术语“对应于”在本文中用于表示多核苷酸序列在结构上与参考多核苷酸序列的全部或一部分相关，或者多肽序列在结构上与参考多肽序列的全部或一部分相关，例如它们具有至少80％、85％、90％、95％或更多，例如99％或100％的序列同一性。相反，术语“互补”在本文中用于表示互补序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分同源。举例来说，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”，并且与参考序列“GTATA”互补。
术语“序列同一性”意指在比较窗口内两个多核苷酸序列是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”意指在比较窗口内两个多核苷酸序列是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过以下来计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)出现在两个序列中的位置数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。本文所用的术语“基本相同”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包括在至少20个核苷酸位置的比较窗口内，通常在至少20-50个核苷酸的窗口内，与参考序列相比，具有至少85％序列同一性，优选至少90％至95％序列同一性，更通常地，至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性百分比是通过将参考序列与多核苷酸序列进行比较来计算的，所述多核苷酸序列可以包含在比较窗口内总计达参考序列20％或更少的缺失或添加。
“保守”氨基酸取代是例如作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电荷的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守氨基酸取代还包含基于侧链的分组。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸，用谷氨酸替代天冬氨酸，用丝氨酸替代苏氨酸，或者用结构相关的氨基酸类似替代氨基酸，将不会对所得多肽的性质产生重大影响。氨基酸变化是否导致功能性多肽可以通过测定多肽的比活性来容易地确定。根据常见的侧链性质，天然存在的残基被分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香族的；trp、tyr、phe。
本公开还设想具有非保守取代的多肽。非保守取代需要将上述类别中的一个成员替换为另一个。
基因转移介体
本公开提供一种基因转移介体，例如病毒基因转移介体，其可用于将基因递送至神经元或神经纤维，或将有毒基因产物(例如有毒蛋白)从胃肠道散布至大脑。下面讨论基因转移介体和方法的各个方面。因此，根据基因转移介体和方法，可以使用任何参数组合。
“基因转移介体”是能够将异源核酸序列携带至合适的发生编码蛋白的合成的宿主细胞中的任何分子或组合物。典型地，基因转移介体是已经使用本领域已知的重组DNA技术工程化以掺入异源核酸序列的核酸分子。理想地，基因转移介体由DNA构成。合适的基于DNA的基因转移介体的实例包含质粒和病毒介体。然而，不基于核酸的基因转移介体，例如脂质体，也是本领域已知和使用的。本发明的基因转移介体可以基于单一类型的核酸(例如质粒)或非核酸分子(例如脂质或聚合物)。基因转移介体可以整合至宿主细胞基因组中，或者可以附加体的形式存在于宿主细胞中。
在一个实施例中，基因转移介体是病毒介体。合适的病毒介体包含例如逆转录病毒介体、基于单纯疱疹病毒(HSV)的介体、基于细小病毒的介体，例如基于腺相关病毒(AAV)的介体、AAV腺病毒嵌合介体和基于腺病毒的介体。这些病毒介体可以使用在例如以下文献中描述的标准重组DNA技术来制备：Sambrook等人,Molecular Cloning,aLaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons,New York,N.Y.(1994)。
在一个实施例中，本发明提供腺相关病毒(AAV)介体。AAV介体可以包含待表达的基因和对AAV介体没有实质性影响的附加组分(例如遗传元件，例如有助于介体的体外操纵的poly(A)序列或限制性酶位点)。腺相关病毒是细小病毒科的一员，且包括少于约5,000个核苷酸的线性单链DNA基因组。AAV进行高效复制需要辅助病毒(即，腺病毒或疱疹病毒)的协同感染或辅助基因的表达。用于施用治疗性核酸的AAV介体通常具有约96％的亲本基因组被删除，因此只剩下含有用于DNA复制和包装的识别信号的末端重复序列(ITR)。这消除了由病毒基因表达引起的免疫或毒副作用。此外，需要时，将特定的AAV蛋白递送至生产细胞能够将包括AAV ITR的AAV介体整合至细胞基因组的特定区中(参见例如美国专利6,342,390和6,821,511)。包括整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态上没有变化(参见例如美国专利4,797,368)。
AAV ITR位于非结构复制(Rep)蛋白和结构衣壳(Cap)蛋白(也称为病毒体蛋白(VP))的独特编码核苷酸序列的侧翼。末端145个核苷酸是自互补的，并且被组织成使得可以形成能量稳定的形成T形发夹的分子内双链体。这些发夹结构通过充当细胞DNA聚合酶复合物的引物而用作病毒DNA复制的起点。Rep基因编码Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68由p5启动子转录而来，并且Rep 52和Rep40由p19启动子转录而来。Rep78和Rep68蛋白是多功能DNA结合蛋白，其在生产性复制期间执行解旋酶和切口酶功能，以允许AAV末端的消除(参见例如Im等人,Cell,61:447(1990))。这些蛋白还调节内源AAV启动子和辅助病毒内的启动子的转录(参见例如Pereira等人,J.Virol.,71:1079(1997))。其它Rep蛋白修饰Rep78和Rep68的功能。cap基因编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。cap基因由p40启动子转录而来。
可以使用本领域已知的任何AAV血清型来产生AAV介体。已从腺病毒储备或从人或非人灵长类组织中分离出几个AAV血清型和超过100个AAV变体(在例如Wu等人,Molecular Therapy,14(3):316(2006)中所评论)。通常，AAV血清型在核酸序列和氨基酸序列水平上具有显著同源性的基因组序列，使得不同血清型具有相同的一组遗传功能，产生在物理和功能上基本等同的病毒体，并通过实际上相同的机制进行复制和组装。AAV血清型1-6和7-9被定义为“真正的”血清型，因为它们不能高效地与对所有其它现有的和特征化的血清型具有特异性的中和血清发生交叉反应。相比之下，AAV血清型6、10(也称为Rh10)和11被认为是“变体”血清型，因为它们不符合“真正”血清型的定义。AAV血清型2(AAV2)由于其缺乏致病性、广泛的传染性和建立长期转基因表达的能力而被广泛用于基因治疗应用(参见例如Carter,Hum.Gene Ther.,16:541(2005)；和Wu等人(见上))。各种AAV血清型的基因组序列及其比较公开在例如GenBank登记号U89790、J01901、AF043303和AF085716；Chiorini等人,J.Virol.,71:6823(1997)；Srivastava等人,J.Virol.,45:555(1983)；Chiorini等人,J.Virol.,73:1309(1999)；Rutledge等人,J.Virol.,72:309(1998)；和Wu等人,J.Virol.,74:8635(2000)中。
AAV rep和ITR序列在大多数AAV血清型中特别保守。例如，AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4和AAV6的Rep78蛋白据报道约89％-93％相同(参见Bantel-Schaal等人,J.Virol.,73(2):939(1999))。据报道，AAV血清型2、3A、3B和6在基因组水平上共有约82％的总核苷酸序列同一性(Bantel-Schaal等人(见上))。此外，已知许多AAV血清型的rep序列和ITR能高效地交叉互补(例如，功能性取代)在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒期间来自其它血清型的对应序列。
一般来说，决定AAV颗粒的细胞趋性的cap蛋白和相关的cap蛋白编码序列在不同AAV血清型中的保守性明显低于Rep基因。鉴于Rep和ITR序列交叉互补其它血清型的对应序列的能力，AAV介体可以包括血清型的混合物，且因此是“嵌合”或“假型”AAV介体。嵌合AAV介体通常包括来源于两种或更多种(例如2、3、4等)不同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。相反，假型AAV介体包括包装在另一种AAV血清型的衣壳中的一种AAV血清型的一个或多个ITR。嵌合和假型AAV介体在以下文献中进一步描述：例如美国专利号6,723,551；Flotte,Mol.Ther.,13(1):1(2006)；Gao等人,J.Virol.,78:6381(2004)；Gao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:11854(2002)；De等人,Mol.Ther.,13:67(2006)；和Gao等人,Mol.Ther.,13:77(2006)。
在一个实施例中，AAV介体使用感染人的AAV(例如，AAV2)来产生。另选地，AAV介体使用感染非人灵长类动物(例如类人猿(例如黑猩猩)、旧世界猴(例如猕猴)和新世界猴(例如狨猴))的AAV来产生。在一个实施例中，AAV介体是使用用感染人的AAV假型包装的感染非人灵长类动物的AAV产生的。这种假型AAV介体的实例公开在例如Cearley等人,Molecular Therapy,13:528(2006)中。在一个实施例中，可以产生一种AAV介体，其包括来自用AAV2反向末端重复序列(ITR)假型包装的感染恒河猴的AAV的衣壳蛋白。在特定实施例中，本发明的AAV介体包括来自用AAV2 ITR假型包装的感染恒河猴的AAV10(也称为“AAVrh.10”)的衣壳蛋白(参见例如Watanabe等人,GeneTher.,17(8):1042(2010)；和Mao等人,Hum.GeneTherapy,22:1525(2011))。
除了待表达的基因之外，AAV介体还可以包括表达控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等，所述表达控制序列提供核酸序列在宿主细胞中的表达。示例性的表达控制序列在本领域中是已知的，并在例如以下文献中描述：Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,第185卷,Academic Press,San Diego,CA.(1990)。
来自各种不同来源的大量启动子，包含组成型、诱导型和抑制型启动子，在本领域是众所周知的。启动子的代表性来源包含例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适的启动子是容易获得的，或者可以基于例如从保藏中心例如ATCC以及其它商业或个体来源公开获得的序列进行合成。启动子可以是单向的(即，在一个方向上启动转录)或双向的(即，在3'或5'方向上启动转录)。启动子的非限制性实例包含例如T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子和RSV启动子。诱导型启动子包含例如Tet系统(美国专利号5,464,758和5,814,618)、蜕皮激素诱导系统(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:3346(1996))、T-REXTM系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)、LACSWITCHTM系统(Stratagene,San Diego,CA)和Cre-ERT三苯氧胺诱导重组酶系统(Indra等人,Nuc.Acid.Res.,27:4324(1999)；Nuc.Acid.Res.,28:e99(2000)；美国专利号7,112,715；和Kramer和Fussenegger,Methods Mol.Biol.,308:123(2005))。
本文使用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于离核酸序列编码区几千个碱基的地方，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自各种不同来源的大量增强子在本领域中是众所周知的，并且可以作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(来自例如保藏中心，例如ATCC以及其它商业或个体来源)。许多包括启动子(例如常用的CMV启动子)的多核苷酸也包括增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。在一个实施例中，核酸序列可操作地连接至CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(也称为“CAG启动子”)(参见例如Niwa等人,Gene,108:193(1991)；Daly等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:2296(1999)；和Sondhi等人,Mol.Ther.,15:481(2007))。
典型地，AAV介体是使用良好表征的质粒生产的。例如，用一种转基因特异性质粒和另一种含有腺病毒辅助基因和AAV rep和cap基因(根据需要对AAVrh.10、8或9具有特异性)的质粒转染人胚胎肾293T细胞。72小时后，收获细胞，并且通过五次冷冻/解冻循环从细胞中释放介体。随后的离心分离和全能核酸酶(benzonase)处理去除细胞碎片和未用蛋白壳体包裹的DNA。可使用碘克沙醇(Iodixanol)梯度和离子交换柱来进一步纯化每个AAV介体。接下来，通过大小排阻离心旋转柱将纯化的介体浓缩至所需浓度。最后，交换缓冲剂以产生在(例如)1x磷酸盐缓冲盐水中配制的最终介体产物。可通过
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实时PCR来测量病毒滴度，并且可通过SDS-PAGE来评估病毒纯度。
药物组合物和递送
本发明提供一种组合物，其包括上述基因转移介体和药学上可接受的(例如生理上可接受的)载体、基本上由这些组分组成或由这些组分组成。当所述组合物基本上由本发明的基因转移介体和药学上可接受的载体组成时，可以包含对组合物没有实质性影响的附加组分(例如佐剂、缓冲剂、稳定剂、消炎剂、增溶剂、防腐剂等)。当所述组合物由本发明的基因转移介体和药学上可接受的载体组成时，所述组合物不包括任何附加组分。在本发明的上下文中可以使用任何合适的载体，并且这种载体在本领域中是众所周知的。载体的选择将部分地由组合物可能施用的特定部位和用于施用组合物的特定方法决定。除了本文所述的基因转移介体之外，所述组合物任选可以是无菌的。所述组合物可以冷冻或冻干存储，并在使用前在合适的无菌载体中复原。所述组合物可以根据在例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)中描述的常规技术来产生。
适用于所述组合物的制剂包含水溶液和非水溶液，可含有抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂的等渗无菌溶液，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。所述制剂可以呈现于单位剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和小瓶中，并且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用时加入无菌液体载体，例如水。临时溶液和悬浮液可以由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。在一个实施例中，载体是缓冲盐水溶液。在一个实施例中，本发明的基因转移介体以组合物的形式施用，所述组合物被配制成在施用前保护基因转移介体免受破坏。例如，所述组合物可以被配制成减少基因转移介体在用于制备、存储或施用基因转移介体的装置例如玻璃器皿、注射器或针上的损失。所述组合物可以被配制成降低基因转移介体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，所述组合物可包括药学上可接受的液体载体，如例如上述那些，和稳定剂，所述稳定剂选自由聚山梨酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合组成的群组。使用这种组合物将延长基因转移介体的保存期，便于施用，并提高本发明方法的效率。包含基因转移介体的组合物的制剂进一步在例如以下文献中描述：Wright等人,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,6(2):174-178(2003)和Wright等人,Molecular Therapy,12:171-178(2005))。
所述组合物还可以被配制成增强转导效率。此外，本领域普通技术人员将理解，本发明的基因转移介体可以与其它治疗剂或生物活性剂一起存在于组合物中。例如，控制炎症的因子，例如布洛芬(ibuprofen)或类固醇，可以是组合物的一部分，以减少与体内施用基因转移介体相关的肿胀和炎症。免疫系统刺激物或佐剂，例如白细胞介素、脂多糖和双链RNA可用于增强或改变免疫反应。抗生素，即杀微生物剂和杀真菌剂可用于治疗现有感染和/或降低未来感染例如与基因转移过程相关的感染的风险。
可注射长效形式是通过在生物可降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题化合物的微胶囊基质来制成的。根据药物与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备长效注射制剂。
在某些实施例中，本发明的制剂包括选自由以下组成的群组中的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯及其掺合物、混合物或共聚物。
所述组合物可以在允许受控释放或缓释的装置例如海绵、生物相容性网、机械贮存器或机械植入物中或装置上施用。植入物(参见例如美国专利号5,443,505)、装置(参见例如美国专利号4,863,457)例如可植入装置(例如机械贮存器或植入物)或由聚合组合物构成的装置对于本发明基因转移介体的施用特别有用。所述组合物也可以缓释制剂的形式施用(参见例如美国专利号5,378,475)，包括例如凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、聚磷酸酯，例如对苯二甲酸双-2-羟乙酯(BHET)和/或聚乳酸-乙醇酸。
包括基因转移介体的组合物的递送可以是使用本领域已知的装置，脑内的(包含但不限于脑实质内、脑室内或脑池内)、鞘内的(包含但不限于腰椎或枕大池)或全身性的，包含但不限于静脉内或其任意组合递送。递送也可以通过手术植入被植入的装置。
对哺乳动物施用的组合物中的基因转移介体的剂量将取决于许多因素，包含哺乳动物的大小(质量)、任何副作用的程度、特定的施用途径等。在一个实施例中，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的本文所述的包括本发明基因转移介体的组合物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间内达到所需治疗效果的有效量。治疗有效量可根据例如个体的病理、年龄、性别和体重以及基因转移介体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。实现特定治疗效果所需的组合物中基因转移介体的剂量通常以每细胞介体基因组拷贝数(gc/cell)或每千克体重介体基因组拷贝数(gc/kg)为单位施用。本领域普通技术人员可以基于本领域众所周知的这些和其它因素，容易地确定适当的基因转移介体剂量范围以治疗患有特定疾病或病症的患者。治疗有效量可以在1×1010个基因组拷贝至1×1013个基因组拷贝之间。
在一个实施例中，介体是腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒介体。在一个实施例中，AAV介体是假型的。在一个实施例中，AAV介体是用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳假型包装的。在一个实施例中，AAV介体是用AAVrh.10、AAV8或AAV5假型包装的。在一个实施例中，AAV介体是用AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10假型包装的。进一步提供包括一定量的上述基因治疗介体的药物组合物。病毒介体的剂量可以是约1×1011至约1×1016个基因组拷贝，约1×1012至约1×1015个基因组拷贝，约1×1011至约1×1013个基因组拷贝，或约1×1013至约1×1015个基因组拷贝。
在本发明的一个实施例中，所述组合物对哺乳动物施用一次。据信，所述组合物的单次施用将引起在哺乳动物中的持续表达，且副作用最小。然而，在某些情况下，在治疗期间多次施用所述组合物以确保细胞充分暴露于所述组合物可能是合适的。例如，所述组合物可以在治疗期间对哺乳动物施用两次或更多次(例如2、3、4、5、6、6、8、9或10次或更多次)。
示例性实施例
本公开提供用于控制器官功能以预防、抑制或治疗疾病的材料和方法。一方面，所述方法提供将病毒介体递送至器官，然后所述病毒介体由调节这些器官功能的神经轴突摄取。在一个实施例中，病毒介体是腺相关病毒(AAV)介体。在一个实施例中，逆行形式的腺相关病毒(AAV)当被注射至胃壁中时，被特异性地摄取至迷走神经感觉神经元的子集中，所述迷走神经感觉神经元对胃的膨胀作出反应并引起饱腹感。这代表从结状神经节发出而不影响向其它内脏器官提供感觉的其它结状神经元的神经元的特定子集。病毒介体也可以是其它形式的逆行介体，包含但不限于逆行慢病毒(LV)介体、单纯疱疹病毒(HSV)介体或犬腺病毒(CAV)介体。
本公开还提供一种具有用于逆行摄取至靶神经元中的改进性质的病毒介体。此介体含有衣壳，所述衣壳含有来自点突变增加逆行摄取的一种AAV血清型例如AAV血清型2(retroAAV)(Tevro,等人,Neuron 92:372-378(2016)，其通过引用并入本文中)的衣壳蛋白与来自不同AAV血清型例如AAV血清型rh10的衣壳蛋白的混合物。这种衣壳混合物产生与含有只来自retroAAV的蛋白的衣壳相比，显著增强向传入神经元的逆行摄取和效率的病毒介体。此介体提供对器官功能的高效控制。
本公开还提供一种用于器官功能的调节控制的方法。所述方法通常包含通过逆行介体将基因递送至器官的传入神经元，所述基因的产物对外部药物或刺激作出反应以控制器官功能。在一个实例中，此方法可用于诱导饱腹感和减少食物摄入，以控制体重。在此实例中，表达激活神经元的只由设计药物激活的设计受体(DREADD)的逆行AAV(retroAAV)被注射至胃壁，并被摄取至胃的传入迷走神经感觉神经元，其对胃伸展作出反应并诱导饱腹感。在全身施用DREADD激活剂例如氯氮平-N-氧化物(CNO)后，引起饱腹感，并且减少食物摄入。其它实例包含向这些神经元递送兴奋性化学遗传离子通道，随后用适当的药物激活，或者递送兴奋性光遗传离子通道ChR2，随后向神经纤维递送光以激活ChR2。在另一个实例中，这种方法用于控制不是由于原本可治疗的疾病而引起的顽固性咳嗽。在本实例中，将表达抑制性DREADD的逆行AAV雾化并吸入，以摄取至肺的迷走神经感觉神经元中，随后全身施用DREADD激活剂例如CNO，以抑制这些感觉神经元的活性从而减少咳嗽反射。
本公开还提供一种通过将防止毒性蛋白转移的基因转移至迷走神经来防止毒性蛋白从胃肠道散布至大脑的方法。这可以通过将病毒介体直接注射至迷走神经的感觉神经节(例如结状神经节)中，或者将病毒介体直接注射至大脑中的迷走神经传出细胞体(例如迷走神经的背侧运动核)中，或者通过将病毒介体注射至胃肠道壁中或者通过口服施用，然后这些介体被摄取至迷走神经轴突中并逆行运输以在细胞体中表达治疗剂来进行。在一个实例中，针对α-突触核蛋白的shRNA(其防止靶神经元中α-突触核蛋白的表达)是从病毒的逆行形式例如retroAAV/rh10介体表达的，通过注射至胃和/或肠的壁而被递送至迷走神经感觉纤维。迷走神经感觉神经元中shRNA的最终表达阻断这些神经元中内源性α-突触核蛋白的表达，从而防止毒性突触核蛋白病理从胃肠道中的病理原纤维散布，导致在帕金森氏病中观察到的广泛的脑病理，因为病理突触核蛋白的繁殖需要神经元中的表达。在另一个实例中，通过胃肠道递送的迷走神经感觉纤维内的retroAAV/rh10介体表达针对α-突触核蛋白的抗体，以防止散布。
在一个实施例中，提供一种将基因递送至控制器官功能的神经纤维的方法，所述方法包括将基因治疗介体递送至由调节神经进行神经支配的靶器官区。在一个实施例中，神经纤维选自由迷走神经、心肺神经、胸内脏神经、腰内脏神经、骶内脏神经和骨盆内脏神经组成的群组。在一个实施例中，器官选自由胃、肠、胰腺、肝、肺、心脏、肾上腺、肾、性腺、膀胱、肛门括约肌和尿道括约肌组成的群组。在一个实施例中，基因治疗介体是选自由腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒组成的群组中的病毒介体。在一个实施例中，基因治疗介体是被选择用于在中枢神经系统中逆行运输的经修饰的病毒介体，包含逆行形式的腺相关病毒和慢病毒以及犬腺病毒。
在一个实施例中，一种调节器官功能以改善疾病的方法，所述方法包括通过将基因治疗介体注射至器官中而将能够调节神经元活性的基因递送至控制所述器官的神经，以在神经元中摄取和逆行运输。在一个实施例中，神经纤维选自由迷走神经、心肺神经、胸内脏神经、腰内脏神经、骶内脏神经和骨盆内脏神经组成的群组。在一个实施例中，器官选自由胃、肠、胰腺、肝、肺、心脏、肾上腺、肾、性腺、膀胱、肛门括约肌和尿道括约肌组成的群组。在一个实施例中，病毒介体选自由腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒组成的群组。在一个实施例中，采用被选择用于在中枢神经系统中逆行运输的经修饰的病毒介体，包含逆行形式的腺相关病毒和慢病毒以及犬腺病毒。在一个实施例中，被递送的基因调节控制器官的神经对外源药剂或刺激的反应的活性。在一个实施例中，被递送的基因编码一个或多个光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)和只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
在一个实施例中，提供一种控制食物摄入的方法，通过将介体注射至内脏器官而将病毒介体递送至迷走神经纤维，以减少食物摄入。在一个实施例中，所述器官是胃、十二指肠或小肠。在一个实施例中，被递送的基因调节控制器官的神经对外源药剂或刺激的反应的活性。在一个实施例中，被递送的基因编码一个或多个光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)和只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
在一个实施例中，提供一种通过吸入病毒介体将病毒介体递送至肺的神经纤维来预防咳嗽的方法。在一个实施例中，被递送的基因调节控制器官的神经对外源药剂或刺激的反应的活性。在一个实施例中，所述基因编码一种或多种蛋白，包含一个或多个光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)和只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
在一个实施例中，提供一种用于改善逆行递送和摄取至控制内脏器官的神经元的病毒介体。在一个实施例中，介体包括腺相关病毒介体，所述腺相关病毒介体带有包括例如来自AAV retro和AAVrh10的衣壳混合物的衣壳。
在一个实施例中，提供一种通过向迷走神经递送表达能够阻断毒性蛋白散布的基因的病毒介体来防止毒性蛋白从胃肠道散布至大脑的方法。在一个实施例中，病毒介体从胃肠系统逆行摄取。在一个实施例中，被靶向的毒性蛋白选自由α-突触核蛋白、τ蛋白、β-淀粉样蛋白或亨廷顿蛋白组成的群组。在一个实施例中，从迷走神经表达以防止毒性蛋白散布的基因选自由小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、CrispR/Cas9、抗体、单链抗体或胞内抗体组成的群组。
在一个实施例中，提供一种预防、抑制或治疗哺乳动物中的咳嗽的方法。所述方法包含将包括病毒介体的组合物间接递送(例如注射)至使哺乳动物的肺受神经支配的副交感神经纤维，所述病毒介体包括编码蛋白的基因，所述蛋白的活性通过施用外源药剂或递送能量来抑制；以及将哺乳动物暴露于有效预防、抑制或治疗哺乳动物中的咳嗽的量的药剂或能量。在一个实施例中，所述组合物是通过吸入来施用。在一个实施例中，哺乳动物是人。在一个实施例中，哺乳动物患有特发性咳嗽或顽固性咳嗽。在一个实施例中，哺乳动物患有慢性阻塞性肺病(COPD)或胃反流。在一个实施例中，病毒介体是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒介体。在一个实施例中，病毒是腺相关病毒(AAV)、慢病毒或犬腺病毒的逆行形式。在一个实施例中，病毒被修饰用于逆行运输。在一个实施例中，AAV具有包括来自多于一种AAV血清型的蛋白的衣壳。在一个实施例中，衣壳蛋白是AAV2和AAVrh10。在一个实施例中，衣壳蛋白是AAV5和AAVrh10。在一个实施例中，衣壳蛋白是AAV2和AAV5。在一个实施例中，所述基因编码光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)或只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
在一个实施例中，提供一种预防、抑制或治疗咳嗽的方法，包括将包括有效量的组合物的组合物递送至哺乳动物肺的神经纤维，所述组合物包括包括有基因的病毒介体。在一个实施例中，基因的表达抑制神经元活性。在一个实施例中，所述基因编码DREADD或一些其它化学遗传通道、用于产生GABA以抑制神经元的GAD或用于阻断兴奋性蛋白或通道的siRNA。在一个实施例中，组合物通过吸入或注射施用，例如直接递送至迷走神经或结状神经节。在一个实施例中，所述基因调节控制器官的神经对外源药剂或刺激的反应的活性。在一个实施例中，哺乳动物是人。在一个实施例中，哺乳动物患有特发性咳嗽或顽固性咳嗽。在一个实施例中，哺乳动物患有COPD或胃反流。在一个实施例中，病毒介体是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒介体。在一个实施例中，病毒是腺相关病毒、慢病毒或犬腺病毒的逆行形式。在一个实施例中，病毒被修饰用于逆行运输。在一个实施例中，所述基因编码光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)或只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。在一个实施例中，所述病毒介体是包括嵌合腺相关病毒衣壳的rAAV，所述嵌合腺相关病毒衣壳包括两种或更多种不同的AAV衣壳血清型。在一个实施例中，生命介体转导迷走神经传入。在一个实施例中，AAV血清型之一包括AAV2。在一个实施例中，AAV血清型之一包括AAVrh10。
在一个实施例中，提供一种将基因递送至神经纤维以控制哺乳动物中内脏器官功能的方法。在一个实施例中，内脏器官不包含大脑或肌肉。所述方法包含将包括病毒介体的组合物递送至由调节神经进行神经支配的哺乳动物器官的一个或多个区，所述病毒介体包括编码蛋白的基因，所述蛋白的活性通过施用外源药剂或递送能量来抑制；以及将哺乳动物暴露于有效量的药剂或能量。在一个实施例中，神经纤维是迷走神经、心肺神经、胸内脏神经、腰内脏神经、骶内脏神经或骨盆内脏神经。在一个实施例中，待控制的哺乳动物器官是胃、肠、胰腺、肝、肺、心脏、肾上腺、肾、性腺、膀胱、肛门括约肌或尿道括约肌。在一个实施例中，将所述组合物施用于胃、肠、胰腺、肝、肺、心脏、肾上腺、肾、性腺、膀胱、肛门括约肌或尿道括约肌，或血管、导管或其它空腔。在一个实施例中，病毒介体是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒介体。在一个实施例中，病毒介体在神经元中提供逆行运输。在一个实施例中，病毒被修饰以在中枢神经系统中提供逆行运输。在一个实施例中，病毒是腺相关病毒、慢病毒或犬腺病毒的逆行形式。在一个实施例中，所述基因调节控制器官的神经对外源药剂或刺激的反应的活性。在一个实施例中，所述基因编码光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)或只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。在一个实施例中，所述基因编码光敏感通道蛋白(例如TREK-1)、烟碱乙酰胆碱受体、短杆菌肽A、电压门控钾通道、离子型谷氨酸通道、NaV1.5、KCNQ1、KCNA、MEC-4、DEG/ENaC/ASIC离子通道或机械敏感离子通道(MscL)，例如TRPV4。在一个实施例中，组合物被递送至迷走神经。在一个实施例中，施用的量允许控制哺乳动物中的食物摄入。在一个实施例中，内脏器官是胃、十二指肠或小肠。在一个实施例中，所述基因编码能够阻断毒性蛋白散布至哺乳动物迷走神经的基因产物。在一个实施例中，病毒介体从胃肠系统逆行摄取。在一个实施例中，毒性蛋白包括α-突触核蛋白、τ蛋白、β-淀粉样蛋白或亨廷顿蛋白。在一个实施例中，所述基因编码小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、CrispR/Cas9、抗体、单链抗体或胞内抗体。在一个实施例中，施用的量防止或抑制哺乳动物中毒性蛋白从胃肠道散布至大脑。在一个实施例中，哺乳动物是人。在一个实施例中，病毒介体是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒介体。在一个实施例中，病毒被修饰以在中枢神经系统中提供逆行运输。在一个实施例中，病毒是腺相关病毒、慢病毒或犬腺病毒的逆行形式。在一个实施例中，AAV血清型之一包括AAV2。在一个实施例中，AAV血清型之一包括AAVrh10。在一个实施例中，所述病毒介体是包括嵌合腺相关病毒衣壳的rAAV，所述嵌合腺相关病毒衣壳包括两种或更多种不同的AAV衣壳血清型。在一个实施例中，施用的量预防、抑制或治疗所述哺乳动物中内脏器官中的疾病。
在一个实施例中，提供包括由来自两种或更多种不同AAV血清型的衣壳蛋白形成的衣壳(嵌合AAV衣壳)的rAAV。在一个实施例中，血清型之一包括AAV2。在一个实施例中，血清型之一包括AAVrh10。在一个实施例中，一种衣壳血清型包括AAV2，并且另一种包括AAVrh10。在一个实施例中，一种衣壳血清型包括AAV2，并且另一种包括AAV1、AAV3、AAV5、AAV8或AAV9。在一个实施例中，一种衣壳血清型包括AAVrh10，并且另一种包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV8或AAV9。在一个实施例中，一种衣壳血清型包括AAV5，并且另一种包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV8或AAV9。在一个实施例中，一种衣壳血清型包括AAV9，并且另一种包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV5或AAV8。在一个实施例中，一种衣壳血清型提供逆行递送。在一个实施例中，rAAV编码治疗性基因产物、预防性基因产物或可外源激活的蛋白。
本发明将通过以下非限制性实例进一步描述。
实例1
图中显示通过调节基因治疗来控制摄食行为的方法。肥胖是最常见的公共健康问题之一。在过去的25年里，全球有超过7亿肥胖人群(BMI>30kg/m2)，患病率翻了一番(GBDobesity collaborators,Health Effects of Overweight and Obesity in195Countries Over 25years,NEJM 377:13,2017)。在美国，超过7800万的BMI>30的肥胖人群与寿命缩短和多种疾病，包含糖尿病、心血管疾病和癌症的风险增加有关。重度肥胖(>40kg/m2)代表具有强烈未得到满足的需求的快速增长的人口。2010年美国约为1500万，预计到2025年将增加至2500万(Finkelstein等人,Obesity and Severe Obesity Forecaststhrough2030,Am J Prev Med 42:563,2012)。在随机试验中，减掉5％-15％的超重体重可以降低心血管和其它疾病的风险系数(Office of Surgeon General,Call to Action toPrevent and Decrease Overweight and Obesity,2001)。
减肥手术是目前重度肥胖患者的主要选择。最流行的手术是袖状胃切除术，以减小胃的大小并诱导早期饱腹感。尽管有1500-2500万人符合手术标准(BMI>40或BMI 30-40伴有严重的体重相关健康问题)，但2017年美国仅进行了228,000例减肥手术(https:// asmbs.org/resources/estimate-of-bariatric-surgery-numbers)。超过14％是翻修手术。手术后的治疗方案需要住院1-3天，然后只需7天的流质，3周的食物泥，然后恢复正常饮食(https://www.mayoclinic.org/tests-procedures/sleeve-gastrectomy/about/pac- 20385183)。由于吸收不良，需要每天补充多种维生素和钙，并且每月注射B12。肥胖手术与13％-21％的并发症率相关。微创基因治疗方法将提供门诊手术选择，不需要术后管理，并且手术并发症风险最小。
图1显示向胃肠道递送AAV以靶向迷走神经背核的数据：迷走神经背核中的mCherry信号。将不同的AAV介体注入胃体(1×1012p/ml)以及荧光标记的霍乱毒素亚基B(CTB-594)作为阳性对照。手术当天，这些小鼠还接受了腹腔注射逆行示踪剂荧光金以标记胃肠道传入和传出神经元胞体。手术四周后，收获结状神经节和大脑，用于对mCherry红色荧光蛋白进行组织学分析，所述蛋白通过AAV介体(AAV.CBA.mCherry)在鸡β-肌动蛋白启动子下表达为盒。
图2示出向胃肠道递送AAV以靶向迷走神经背核：结状神经节中的mCherry信号。将不同的AAV介体注入胃体(1×1012p/ml)以及荧光标记的霍乱毒素亚基B(CTB-594)作为阳性对照。手术当天，这些小鼠还接受了腹腔注射逆行示踪剂荧光金以标记胃肠道传入和传出神经元胞体。手术四周后，收获结状神经节和大脑，用于对mCherry红色荧光蛋白进行组织学分析，所述蛋白通过AAV介体(AAV.CBA.mCherry)在鸡β-肌动蛋白启动子下表达为盒。
图3是在1mg/kg CNO情况下的禁食小鼠的摄食行为数据，并且图4是在1mg/kg CNO情况下的正常摄食小鼠的摄食行为数据。
一种递送病毒介体来控制器官功能的途径示于图5中。例如，具有编码hM3Dq的rAAV(参见例如图16中的SEQ ID No.10或11，其被修改成DREADD hM3Dq)的组合物可以通过内窥镜或腹腔镜递送至例如胃大弯，在一个实施例中，这允许将病毒递送至迷走神经传入神经。在一些实施例中，施用可以允许递送至迷走神经传出神经或运动神经元。在一个实施例中，组合物被递送至内脏器官，包含但不限于心脏、肝、肺、肾上腺、甲状腺、胰腺、肠、肾、膀胱或脾。
在一个实施例中，嵌合AAV衣壳包括一种AAV血清型(例如AAV2)与另一种AAV血清型(例如AAVrh10)衣壳的比率为0.1:1、0.5:1、1:1、1:3、1:4、1:5、1:15、1:20、1:50、1:100、1:500。
实例2
咳嗽反射通常对排出肺气道内潜在的阻塞物或传染物很重要。顽固性咳嗽通常通过试图解决咳嗽的潜在原因来治疗，例如胃反流、哮喘或慢性阻塞性肺病或恶性肿瘤引起的慢性炎症。然而，对于许多人来说，慢性咳嗽是主要问题，且没有可以解决的明确的持续刺激物或兴奋剂。这类似于顽固性疼痛，这可能是由需要逆转的潜在病理造成的，但通常疼痛本身需要解决，因为没有可以逆转的异常。对于没有可逆病理的顽固性咳嗽患者，几乎没有治疗选项。麻醉剂可以用来试图抑制咳嗽，但这些具有重大发病率，特别是长期使用。
为了在动物模型中抑制咳嗽，表达抑制性DREADD hM4Di(1×1012p/ml)(参见例如图16中M4的SEQ ID NO:12，其被修改成DREADD hM4Di)的retroAAV2/rh10被雾化并喷入豚鼠的气管和上气道。使用豚鼠是因为它们表现出强烈的咳嗽反射，而大鼠和小鼠没有有效的咳嗽反射。暴露后六周，使用免疫染色的组织学评估证实结状神经节内为气管和上气道提供感觉的神经元亚群中抑制性视蛋白的表达。然后将第二组豚鼠分成两个小组。一个小组再次接受相同的retroAAV2/rh10。hM4Di雾化介体喷入上气道，而第二小组接受表达mCherry的retroAAV2/rh10作为阴性对照。六周后，将动物放入封闭的有机玻璃室。所述室含有压力监测器，用于测定由于咳嗽引起的室内气压变化，并且还含有可以捕捉咳嗽声的麦克风。这些允许连续监测咳嗽的频率、总次数和强度，并且监测器被时间锁定，以确认当声音变化和压力变化两者匹配时才发生真正的咳嗽。为了诱发咳嗽，然后以5L/min的速率向室中填充雾化的2M柠檬酸，其被充分稀释，使得其不会对动物造成永久性伤害，但将会刺激气道并引起咳嗽。然后将两个小组都暴露在酸性气体，并在10分钟内评估两组的咳嗽的次数、频率和强度，以确认两组之间在基线时没有差异。将第三组未经处理的豚鼠暴露于柠檬酸室中，以证实与未试验过的动物相比，逆行介体和雾化喷雾的存在不影响基线咳嗽。在第二节段，然后在放入酸性气体室前对所有小组施用1mg/kg CNO 30分钟。然后量化咳嗽的次数、频率和强度，并在介体条件和CNO条件两者下在小组之间和组内进行比较。这证实在施用CNO调节剂后，与施用CNO之前相比以及与mCherry和未试验过的对照组相比，接受具有抑制性DREADD的AAV的豚鼠在暴露于酸性气体时减少了咳嗽。
所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文中。虽然在前面的说明书中，本发明已经结合其特定实施例进行了描述，并且为了说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说将显而易见的是，本发明容许具有另外的实施例，并且在不脱离本发明的基本原理下，本文的某些细节可以有相当大的变化。

Claims (45)

1.一种预防、抑制或治疗哺乳动物中的咳嗽的方法，包括：提供具有使肺受神经支配的副交感神经纤维的哺乳动物，所述副交感神经纤维被表达编码蛋白的基因的病毒介体感染，所述蛋白的活性被药剂或能量抑制；以及以有效抑制所述蛋白的活性的量对所述哺乳动物施用所述药剂或向其递送所述能量，从而预防、抑制或治疗所述哺乳动物中的咳嗽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒介体通过吸入或注射对所述哺乳动物施用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述药剂通过静脉施用。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有特发性咳嗽或顽固性咳嗽。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有慢性阻塞性肺病(COPD)或胃反流。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述病毒介体是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒介体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述病毒介体是腺相关病毒、慢病毒或犬腺病毒的逆行形式。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述病毒介体被修饰用于逆行运输。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述基因编码光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)或只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述病毒介体是包括腺相关病毒衣壳的rAAV，所述腺相关病毒衣壳包括两种或更多种不同的AAV衣壳血清型。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述AAV血清型之一包括AAV2。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其中所述AAV血清型之一包括AAVrh10。
14.一种将基因递送至控制哺乳动物中内脏器官功能的神经纤维的方法，包括：对哺乳动物施用药剂或向其递送能量，所述哺乳动物的调节神经使所述内脏器官受神经支配并被包括编码基因产物的基因的病毒介体感染，所述基因产物的蛋白的活性通过施用所述药剂或所述能量的所述递送而被抑制或激活，其中施用的所述药剂或递送的所述能量的量有效地控制所述内脏器官功能。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述神经纤维是迷走神经、心肺神经、胸内脏神经、腰内脏神经、骶内脏神经或骨盆内脏神经。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述哺乳动物器官是胃、肠、胰腺、肝、肺、心脏、肾上腺、肾、性腺或膀胱。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述病毒介体是腺相关病毒、慢病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒介体。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述病毒介体在神经元中提供逆行运输。
19.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述病毒介体被修饰以在中枢神经系统中提供逆行运输。
20.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述病毒介体是腺相关病毒、慢病毒或犬腺病毒的逆行形式。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述基因产物响应于所述药剂的所述施用来调节控制所述器官的所述神经的活性。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的方法，其中所述基因编码光敏离子通道、化学响应离子通道、超声敏感离子通道、磁场响应离子通道或只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述基因编码光敏感通道蛋白、烟碱乙酰胆碱受体、短杆菌肽A、电压门控钾通道、离子型谷氨酸受体、α溶血素或机械敏感通道。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其中所述病毒介体被递送至所述迷走神经。
25.根据权利要求14至24中任一项所述的方法，其中施用的所述药剂或递送的所述能量允许在所述哺乳动物中控制食物摄入、控制肛门括约肌或控制尿道括约肌。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述内脏器官是胃、十二指肠或小肠。
27.根据权利要求14至26中任一项所述的方法，其中所述基因产物阻断毒性蛋白散布至所述哺乳动物的所述迷走神经。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述病毒介体从胃肠系统逆行摄取。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述毒性蛋白包括α-突触核蛋白、τ蛋白、β-淀粉样蛋白或亨廷顿蛋白。
30.根据权利要求14至29中任一项所述的方法，其中所述基因产物包括或编码小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、CrispR/Cas9、抗体、单链抗体或胞内抗体。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中施用或递送的所述量防止或抑制哺乳动物中毒性蛋白从胃肠道散布至大脑。
32.根据权利要求14至31中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
33.根据权利要求17至32中任一项所述的方法，其中所述AAV血清型之一包括AAV2。
34.根据权利要求17至33中任一项所述的方法，其中所述AAV血清型之一包括AAVrh10。
35.根据权利要求17至34中任一项所述的方法，其中所述病毒介体是包括腺相关病毒衣壳的rAAV，所述腺相关病毒衣壳包括两种或更多种不同的AAV衣壳血清型。
36.根据权利要求14至35中任一项所述的方法，其中施用的所述量预防、抑制或治疗所述哺乳动物中内脏器官中的疾病。
37.一种重组AAV(rAAV)，包括由来自两种或更多种不同的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白形成的衣壳。
38.根据权利要求37所述的重组AAV，其中所述血清型之一包括AAV2。
39.根据权利要求37或38所述的重组AAV，其中所述血清型之一包括AAVrh10。
40.根据权利要求37、38或39所述的重组AAV，其提供逆行递送。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的重组AAV，其中所述rAAV编码治疗性基因产物、预防性基因产物或外源可控蛋白。
42.根据权利要求41所述的重组AAV，其编码光敏离子通道(光遗传学)、化学响应离子通道(化学遗传学)、超声敏感离子通道(声遗传学)、磁场响应离子通道(磁遗传学)或只由设计药物激活的设计受体(DREADD)。
43.根据权利要求41或42所述的重组AAV，其编码通过外源施用药剂或能量而抑制的通道蛋白或DREADD。
44.根据权利要求43所述的重组AAV，其编码hD3q。
45.根据权利要求37至43中任一项所述的重组AAV，其中所述衣壳包括与SEQ ID NO:5或7具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的衣壳。
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