ES2337853T3

ES2337853T3 - Transduccion de mioblastos por vaa.

Info

Publication number: ES2337853T3
Application number: ES96921468T
Authority: ES
Inventors: Xiao Xiao; Richard J. Samulski
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2010-04-29
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: DE69638103D1; EP0844887A1; US20020192189A1; JPH11507915A; CA2223837C; EP0844887A4; US20090298922A1; ATE452981T1; AU6268696A; EP0844887B1; JP4002605B2; IL122206A0; WO1996040272A1; CA2223837A1

Abstract

UN METODO PARA EXPRESAR UN PRODUCTO GENICO EN EL TEJIDO MUSCULAR DE UN ANIMAL, QUE COMPRENDE LA ADMINISTRACION DE UN VECTOR AAV RECOMBINANTE AL TEJIDO MUSCULAR DEL ANIMAL, EN EL QUE EL VECTOR COMPRENDE UN GEN DE INTERES NO DE AAV LIGADO EN UN GENOMA DE VECTOR AAV.

Description

Transducción de mioblastos por VAA.

Campo técnico

Esta invención está en el campo de la expresión génica y se dirige especialmente a la expresión de productos génicos en el músculo de un animal.

Antecedentes

Los vectores de virus adenoasociados (VAA) se han propuesto y patentado como vectores para la expresión de productos génicos en animales. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.193.941, publicada el 18 de agosto de 1992, los documentos WO 9413788 y 08/227.319, la última solicitud procedente del laboratorio de los presentes inventores. En varias patentes y otras publicaciones se describen numerosos vectores VAA y sus usos, estando los usos generalmente relacionados con la expresión de productos génicos in vitro (normalmente en cultivos tisulares) o in vivo (normalmente en pulmones o mucosa nasal, los sitios normales de infección de VAA, aunque la solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/227.319 se refiere a la expresión en el sistema nervioso central).

Las investigaciones realizadas en los laboratorios de los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los vectores de VAA pueden actuar como sistemas eficaces de expresión a largo plazo en el tejido muscular de animales después de una inyección intramuscular. Este descubrimiento proporciona un nuevo procedimiento de expresión de productos génicos deseables y de elementos de control en el tejido muscular de animales, incluido humanos.

Resumen de la invención

En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar nuevos usos para los vectores de VAA que ya han sido desarrollados para otros fines.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar nuevos vectores recombinantes de VAA que contengan sistemas de expresión génica dirigidos al tejido muscular.

Estos y otros objetos de la invención se han logrado proporcionando un procedimiento de expresión de un producto génico en el tejido muscular de un animal, lo que comprende la administración de un vector de VAA recombinante al tejido muscular del animal, en el que el vector comprende un gen de interés que no es de VAA ligado a un vector de VAA.

Descripción de las realizaciones específicas

La presente invención es bastante sencilla: antes de esta invención, los vectores de VAA recombinantes se conocían bien y se sabía que eran capaces de transducirse en diversas células y tejidos, pero no se habían usado, ni se sugirió su uso, en la expresión de productos génicos en el tejido muscular de animales. La invención además comprende administrar al tejido muscular de un animal objetivo un vector recombinante de VAA que contiene un gen cuya expresión es deseable (junto con los elementos de control apropiados, si se desea o es necesario de forma normal para los vectores). No es necesario ningún vector nuevo puesto que se ha demostrado que los vectores de VAA previamente conocidos funcionan bien para la expresión en tejido muscular. De este modo, la invención es en parte un descubrimiento que no requiere ninguna adaptación en especial de los vectores de VAA para la expresión en tejido muscular, lo que es sorprendente en vista de los estrictos requisitos de reproducción de los VAA (es decir, la presencia de un virus auxiliar) y la normal asociación de los VAA con pulmones y fosas nasales.

En diversas publicaciones científicas y patentes se describe el estado de la técnica en el campo de los vectores de VAA. Puesto que no se requiere ninguna adaptación especial de los vectores de la técnica previa para la práctica de la presente invención, no hay necesidad de detallar aquí en extensión el estado de la técnica ya bien conocida. Sin embargo, las siguientes publicaciones se incorporan en este documento por referencia, como lo son la patente y las solicitudes de patente (y sus equivalentes publicadas) identificadas en la sección de Introducción de esta descripción, ya que estos materiales pueden ser útiles para aquellos con menos experiencia en el campo de los VAA:

1. Samulski, R.J. y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79:2077-2081 "Cloning of Adeno-Associated Virus into pBR322: Rescue of Intact Virus from Recombinant Plasmid in Human Cells"

2. Samulski, R.J. y col. (1983) Cell 33:l35-143 "Rescue of Adeno-Associated Virus from Recombinant Plasmids: Gene Correction within the Terminal Repeats of AAV"

3. Laughlin y col. (1983) Gene 23:65-73 "Cloning of Infectious Adeno-Associated Virus Genomes in Bacterial Plasmids"

\newpage

4. Hermanot, P.L. y Muzycka, N. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6466-6470 "Use of Adeno-Associated Virus as a Mammalian DNA Cloning Vector: Transduction of Neomycin Resistance into Mammalian Tissue Culture Cells"

5. Senepathy, P. y col. (1984) J. Mol. Biol. 178, 179:1-20 "Replication of Adeno-Associated Virus DNA Complementation of Naturally Occurring rep^{-} Mutants by a Wild-type Genome or an ori^{-} Mutant and Correction of Terminal Palindrome Deletions"

6. Tratschin y col. (1984) J. Virol. 51:611-619 "Genetic Analysis of Adeno-Associated Virus: Properties of Deletion Mutants Constructed In Vitro and Evidence for an Adeno-Associated Virus Replication Function"

7. Tratschin y col. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 "A Human Parvovirus, Adeno-Associated Virus, as a Eukaryotic Vector: Transient Expression and Encapsidation of the Prokaryotic Gene for Chloramphenicol Acetyltransferase"

8. Miller y col. (1986) Somatic Cell and Molecular Genetics 12:175-183 "Factors Involved in Production of Helper Virus-Free Retrovirus Vectors"

9. Bosselman y col. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1797-1806 "Replication-Defective Chimeric Helper Proviruses and Factors Affecting Generation of Competent Virus: Expression of Moloney Murine Leukemia Virus Structural Genes via the Metallothionein Promoter"

10. Ohi y col. (1988) J. Cell. Biol. 107:304A "Construction and Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Genome Containing \beta-globin cDNA"

11. McLaughlin y col. (1988) J. Virol. 62:1963-1973 "Adeno-Associated General Transduction Vectors: Analysis of Proviral Structures"

12. Lebkowski y col. (1988) Mol. Cell Biol. 8:3988-3996 "Adeno-Associated Virus: a Vector System for Efficient Introduction and Integration of DNA into a Variety of Mammalian Cell Types"

13. Samulski y col. (1989) J. Virol. 63:3822-3828 "Helper-Free Stocks of Recombinant Adeno-Associated Viruses: Normal Integration Does not Require Viral Gene Expression"

14. Srivastava y col. (Octubre 1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:20, 8078-82 "Construction of a recombinant human parvo virus-B19: adeno-associated virus-2 (AAV) DNA inverted terminal repeats are functional is an AAV-B19 hybrid virus -vector construction; potential application gene cloning in bone marrow cell culture and gene therapy"

15. Ohi, S. y col. (1990) J. Cell.Biochem. (Supl.14A,D422) "Construction of recombinant adeno-associated virus that harbors human beta-globin cDNA - vector construction for potential application in hemoglobinopathy gene therapy; gene cloning and expression in 293 cell culture"

16. Ohi, S. y col. (1990) Gene 89 2:279-82 "Construction and replication of an adeno-associated virus expression vector that contains human beta-globin cDNA - plasmid PAVh-beta-GHP11 and plasmid PAVh-beta-G-psi-1 construction; potential application in gene therapy of e.g. sickle cell anemia or thalassemia"

17. Ohi, S. y col. (1990) FASEB J. 4:7, A2288) "Production and expression of recombinant adeno-associated viruses harboring human beta-globin cDNA - adeno-associated virus expression in 293 cell culture; potential gene therapy for hemoglobinopathy disease"

18. Samulski y col. (1991) Embo J. 10:3941-3950 "Targeted Integration of Adeno-associated virus AAV Into human chromosome 19"

19. Ruffing y col. (Dic. 1992) J. Virol. 66:6922-6930 "Assembly of Viruslike Particles by Recombinant Structural Proteins of Adeno-Associated Virus Type 2 in Insect Cells"

20. Sitaric y col. (1991) FASEB 5:A1550 "Production of a Helper-free Recombinant Adeno-Associated Virus That Harbors Human \beta-globin cDNA"

21. Walsh y col. (1991) Clin. Res. 2:325 "Gene Transfer and High-level Expression of a human \gamma-globin Gene Mediated by a Novel Adeno-Associated Virus Promoter"

22. Carter, B.J. (Octubre 1992) Curr. Opinion in Biotechnol. 3:533-539 "Adeno-Associated Virus Vectors"

23. Ohi y col. (1992) (Junio 21-22, 1991) EXP Hematol 20 119 "Synthesis of a human beta globin in the recombinant adeno-associated virus-infected cells towards gene therapy of hemoglobinopathies"

\newpage

24. Flotte y col. (1993) J.B.C. 268:3781-3790 "Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator from a Novel Adeno-Associated Virus Promoter"

25. Wong y col. (1993) Blood 82:302A. "High efficiency gene transfer into growth arrested cells utilizing an adeno-associated virus (AAV)-based vector"

26. Shaughnessey y col. (1994) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:373 "Adeno-associated virus vectors for MDR1 gene therapy - multidrug-resistance gene cloning and gene transfer into hematopoietic stem cell culture using adeno-associated virus vector CWRSP for potential gene therapy"

27. Tenenbaum, L. y col. (1994) Gene Ther. (1, Supl.1, S80) "Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Transfer into Glial Cells of the Human Central Nervous System - Potential Gene Therapy"

28. Friedmann, T. (1994) Gene Ther. (1, Supl. 1, S47-S48) "Gene Therapy for Disorders of the CNS - Parkinson Disease Alzheimer Disease Therapy by Gene Transfer Using Herpes Simplex Virus, Adeno Virus and Adeno-Associated Virus Vector"

29. DE 42 19626 A1

Cesionario: Wehling, P.

Presentada: 16 de junio de 1992

Publicación: 23 de diciembre de 1993

"Methods for Introducing Therapeutically Relevant Genes into Cells"

\vskip1.000000\baselineskip

30. WO 91/18088

Cesionario: Nat. Inst. Health-Bethesda

Presentada: 17 de mayo de 1991 (prioridad: 23 de mayo de 1990)

Inventores: Chatterjee y Wong

Publicación: 28 de noviembre de 1991

"Adeno-Associated Virus (AAV)-based Eukaryotic Vectors"

\vskip1.000000\baselineskip

31. EP 0 592 836 A1

Cesionario: American Cyanamide Co.

Presentada: 16 de septiembre de 1993 (prioridad: 17 de septiembre de 1992 US 947127)

Publicación: 20 de abril de 1994

"Human Adeno-Associated Virus Integration Site DNA and use thereof"

\vskip1.000000\baselineskip

32. WO 93/24641

Cesionario: U.S. Dept. Health-Human-Serv.

Presentada: 2 de junio de 1993 (prioridad 2 de junio de 1992)

Publicación: 20 de abril de 1994

"Adeno-Associated Virus with Inverted Terminal Repeat Sequences as Promoter"

\vskip1.000000\baselineskip

33. WO 93/09239

Cesionario: Res. Corp. Technol.

Presentada: 6 de noviembre de 1992 (prioridad en EE.UU. 8 de noviembre de 1991)

Publicación: 13 de mayo de 1993

"Adeno-Associated Virus-2 Basal Vectors"

\vskip1.000000\baselineskip

34. EP 0 488 528 A1

Cesionario: Appl. Immune Sci.

Presentada: 29 de octubre de 1991 (prioridad en EE.UU.: 30 de octubre de 1990)

Publicación: 3 de junio de 1992

"Recombinant adeno-associated Virus Vectors"

\vskip1.000000\baselineskip

35. USPN 4.797.368

Cesionario: U.S. Dept. Health-Human-Serv.

Presentada: 15 de marzo de 1985

Publicada: 10 de enero de 1989

"Adeno-associated Virus as Eukaryotic Expression Vector"

\vskip1.000000\baselineskip

Dos artículos de revisión recientes proporcionan una visión general especialmente completa del estado reciente de la terapia génica usando virus de VAA e incluyen una serie de publicaciones científicas recientes adicionales en este campo.

36. Samulski, R. J.

"Adeno-Associated Viral Vectors"

Capítulo 3 de "Viruses in Human Gene Therapy"

Chapman y Hall, J.-M. H. Vos., ed. 1994

\vskip1.000000\baselineskip

37. Samulski, R. J.

"Adeno-associated Virus-based Vectors for Human Gene Therapy"

Capítulo 11 de "Gene Therapy: From Laboratory to the Clinic"

World Scientific, K. M. Hui, ed. 1994

\vskip1.000000\baselineskip

La administración real se realiza utilizando cualquiera de los procedimientos físicos que transportan el vector recombinante de VAA al tejido muscular de un animal hospedador. En esta discusión sobre administración, "vectores de VAA" significa tanto un vector recombinante desnudo como un vector de ADN empaquetado dentro de proteínas de la cubierta viral, como es bien conocido para la administración de VAA. Se ha demostrado que disolver simplemente un vector de VAA en solución salina tamponada con fosfato es suficiente para proporcionar un vehículo útil para la expresión en tejido muscular y no existen limitaciones conocidas en los vehículos u otros componentes que puedan administrarse conjuntamente con el vector (aunque deben evitarse composiciones que degradan el ADN de forma normal con los vectores). Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse como formulaciones inyectables o como formulaciones tópicas para ser administradas a los músculos mediante transporte transdérmico. Previamente, se han desarrollado numerosas formulaciones tanto para inyección intramuscular como para transporte transdérmico y pueden usarse en la práctica de la invención. Los vectores pueden usarse con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para su fácil administración y manipulación.

Para los propósitos de la inyección intramuscular, pueden emplearse soluciones en un adyuvante como aceite de sésamo o de cacahuete, o en propilénglicol acuoso, así como una solución acuosa estéril. Estas soluciones acuosas pueden estar tamponadas, si se desea, y primero puede hacerse isotónico el diluyente líquido isotónico con solución salina o glucosa. Pueden prepararse soluciones del vector de VAA como un ácido libre (ADN que contiene grupos fosfato ácidos) o una sal farmacológicamente aceptable en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo como hidroxipropilcelulosa. También puede prepararse una dispersión de partículas virales de VAA en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de estos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. En relación con esto, los medios acuosos estériles empleados pueden obtenerse todos fácilmente mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. En todos los casos, la forma debería estar estéril y debe ser fluida en tal grado que pueda cargarse fácilmente en una jeringa. Debería ser estable en las condiciones de fabricación y conservación, y debería estar protegida de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilénglicol, polietilénglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como la lecitina, manteniendo el tamaño requerido de partícula en el caso de una dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorbutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación del vector de VAA en la cantidad necesaria en el solvente apropiado con varios de los otros componentes enumerados anteriormente, según los requisitos, seguido por la esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás componentes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son la desecación al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración de la misma.

Para los fines de administración tópica, se preparan soluciones acuosas estériles diluidas (normalmente a una concentración del 0,1 al 5% aproximadamente), por otro lado similar a las soluciones parenterales anteriores, en recipientes adecuados para su incorporación a un parche transdérmico y puede incluir transportadores conocidos, como dimetilsulfóxido (DMSO) de grado farmacéutico.

Los compuestos terapéuticos de esta invención pueden administrarse a un mamífero solos o en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se destaca anteriormente, las proporciones relativas del principio activo y vehículo están determinadas por la solubilidad y naturaleza química del compuesto, la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica convencional.

La dosis de los agentes terapéuticos de la presente invención que será más adecuada para profilaxis o tratamiento variará con la forma de administración, el compuesto elegido en particular y las características fisiológicas del paciente en particular en tratamiento. En general, inicialmente se usarán pequeñas dosis y, si es necesario, se aumentará en pequeños incrementos hasta alcanzar el efecto óptimo según las circunstancias. En el siguiente ejemplo se describen ejemplos de dosis.

Puesto que se ha mostrado en el pasado que los VAA tienen una amplia variedad de hospedadores (para la expresión pulmonar) y ahora se ha demostrado que pueden funcionar en tejido muscular, no se conocen límites con respecto a los animales en los que puede tener lugar la expresión en tejido muscular, especialmente en mamíferos, aves, peces y reptiles, especialmente mamíferos y aves domesticados, como vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros, gatos, pollos y pavos. Son especialmente preferidos los usos veterinario y humano.

El gen que se expresa puede ser un segmento de ADN que codifica una proteína, con cualquier elemento de control (p. ej., promotores y operadores) que desee el usuario, o un segmento de ADN no codificador, cuya transcripción produce toda o parte de alguna molécula que contiene ARN (como un elemento de control de la transcripción, ARN+ o la molécula complementaria). Puesto que la presente invención está dirigida a una ruta de administración y al vector, antes que al material que se está administrando, no existen limitaciones sobre el ADN extraño (ADN que no es del VAA) que está administrando el vector. El gen no tiene por qué estar limitado a aquellos estrictamente útiles en músculo, puesto que la capacidad del sistema vascular del hospedador para distribuir el producto génico a otras partes del cuerpo del hospedador será fácilmente aparente.

El tejido muscular es una diana muy atractiva para la administración génica in vivo y para terapia génica puesto que no es un órgano vital y es de fácil acceso. Si un producto génico defectuoso que es necesario producir o secretar causa una enfermedad, como hemofilia, diabetes, enfermedad de Gaucher, etc., el músculo será un buen candidato para suministrar el producto génico siempre que el gen apropiado pueda administrarse eficazmente dentro de las células.

Se han utilizado diferentes vectores, como ADN desnudo, adenovirus y retrovirus, para administrar directamente diversos transgenes al tejido muscular. Sin embargo, ningún sistema puede ofrecer tanto una alta eficacia como una expresión a largo plazo. En el caso de ADN plasmídico desnudo administrado directamente al tejido muscular, la eficacia no es alta. Hay solo unas pocas células cerca del sitio de inyección que puedan mantener la expresión génica. Asimismo, el ADN plasmídico en las células se mantiene como episomas que no se replican, es decir en la forma no integrada. Por tanto, finalmente se perderá. En el caso de un vector de adenovirus, pueden infectarse las células que no están en división y, por consiguiente, puede administrarse directamente a los tejidos maduros como el músculo. Sin embargo, los transgenes administrados por los vectores de adenovirus no son útiles para mantener una expresión a largo plazo por las siguientes razones. Primero, puesto que los vectores de adenovirus siguen conservando la mayoría de los genes virales, no son muy seguros. Además, la expresión de esos genes puede hacer que el sistema inmunitario destruya las células que contienen los vectores (véase, por ejemplo, Yang y col. 1994, Proc. Natl Acad. Sci. 91:4407-4411). Segundo, puesto que el adenovirus no es un virus de integración, su ADN finalmente se diluirá o degradará en la célula. Tercero, debido a la respuesta inmunitaria, el vector de adenovirus no puede administrarse repetidas veces. En el caso de enfermedades de por vida esto sería una limitación importante. En vectores de retrovirus, aunque puede conseguirse una integración estable dentro de los cromosomas del hospedador, su uso es muy limitado porque sólo pueden infectar células en división, mientras que la gran mayoría de las células del músculo no están en división.

Los vectores de virus adenoasociados presentan ciertas ventajas sobre los sistemas de vectores mencionados anteriormente. Primero, como los adenovirus, los VAA pueden infectar eficazmente células que no están en división. Segundo, se han eliminado del vector todos los genes virales de VAA. Puesto que la reacción inmunitaria inducida por la expresión de genes virales ya no es un problema, los vectores de VAA son más seguros que los vectores de Ad. Tercero, el VAA es un virus de integración por naturaleza y su integración en el cromosoma del hospedador mantendrá estable su transgén en las células. Cuarto, el VAA se integra en una región específica del cromosoma 19 humano. Por tanto, tiene una ventaja en cuanto a seguridad sobre los retrovirus, los cuales se insertan más al azar en el cromosoma del hospedador. Quinto, el VAA es un virus extremadamente estable, resistente a muchos detergentes, cambios de pH y al calor (estable a 56ºC durante más de una hora). También puede liofilizarse y disolverse de nuevo sin que pierda su actividad. Por tanto, es un vehículo de administración muy prometedor para terapia génica.

Los inventores han demostrado el principio de la invención usando vectores de VAA que contienen un gen indicador LacZ como sistema modelo para explorar la posible aplicación del vector de VAA en tejido muscular mediante la inyección directa del vector en los músculos de la pata de ratones. Al mismo tiempo, hemos comparado un vector de adenovirus, Ad-LacZ, con el vector VAA-LacZ en los experimentos in vivo.

Ejemplo

Preparación de un vector viral de VAA

Se obtuvieron partículas virales de VAA-LacZ cotransfectando el plásmido vector pAB-11 con el plásmido auxiliar pAAV/Ad en células 293 infectadas con adenovirus (Samulski y col. J. Virol. 63:3822, 1989). El vector pAB11 se preparó como se describe en Goodman y col. Blood 1994, 84:1492-1500. Brevemente, se transfectaron 25 \mug de ADN plasmídico (6 \mug de vector más 19 \mug de auxiliar) mediante precipitación con fosfato cálcico en células 293 con una confluencia del 80% en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de suero de ternera fetal (STF). El medio se sustituyó después de 8 a 12 horas de transfección por DMEM nuevo más 2% de STF. Se añadió adenovirus 5 a las células a 1 m.d.i. (multiplicidad de infección). Después de dos días y medio, las células se recogieron y, a continuación, se congelaron y descongelaron tres veces. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad.

El sobrenadante que contiene VAA-LacZ se extrajo con cuidado 2 ó 3 veces con un volumen igual de cloroformo. Los restos de cloroformo se eliminaron mediante inflado con gas nitrógeno. Se añadió al sobrenadante un tercio del volumen de solución saturada de sulfato amónico hasta obtener una saturación del 25%. La muestra se puso en hielo durante 10 minutos y se centrifugó a 10.000 g durante otros 10 minutos. El sobrenadante se recuperó y se añadió solución saturada de sulfato amónico hasta una saturación del 50%. A continuación, la muestra se puso en hielo durante 10 minutos y se centrifugó a 15.000 g durante otros 10 minutos. El sedimento se volvió a disolver en solución de CsCl-PBS (densidad: 1,38 g/ml) y se centrifugó a 40.000 rpm en un rotor SW41 (Beckman) durante 48 horas. La banda de VAA se recogió, se dializó frente a DMEM y se calentó a 56ºC durante 15 a 30 minutos. Los valores del virus VAA-LacZ se determinaron infectando células 293 a diferentes diluciones. Las células se fijaron y tiñeron con X-gal (Dhawan y col. 1991 Science 254:1509-1512).

El vector Ad-LacZ se preparó como describen Yang y col. (J. Virol. 1995, 69:2004-2015; Proc. Natl Acad. Sci, 1994, 91:4407-4411) y las referencias incluidas en ésta.

Inyección del vector viral de VAA en tejido muscular

En detalle, los ratones de 3 semanas de edad procedentes de dos camadas se dividieron al azar en dos grupos. Antes de la inyección, los animales se anestesiaron por vía i.p. con 0,018 ml de Avertin al 2,5% por gramo de peso corporal. En el primer grupo se inyectaron 30 \mul de VAA-LacZ (3x10^{6} unidades infecciosas) en la pata trasera izquierda y 30 \mul de Ad-LacZ (3x10^{6} unidades infecciosas) en la pata derecha. En el segundo grupo se inyectaron 30 \mul de VAA-LacZ (3x10^{6} unidades) en la pata izquierda y 30 \mul de una mezcla de VAA-LacZ más Ad-LacZ (3x10^{6} unidades infecciosas de cada uno) en la pata derecha. La \beta-galactosidasa codificada por VAA-LacZ contiene una señal de localización nuclear, mientras que la \beta-galactosidasa codificada por Ad-LacZ es citoplásmica. Por tanto, puede diferenciarse la expresión génica en las células musculares de los dos vectores.

Detección de la expresión transgénica de los vectores en el músculo

Los ratones se sacrificaron a diversos tiempos y se tomaron muestras del tejido muscular. Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se realizaron cortes con criostato de 20 \mum de grosor. A continuación los cortes se fijaron, se lavaron con PBS y se tiñeron con solución de X-gal durante una noche.

Análisis de resultados

Después de la inyección de 30 \mul(3x10^{6} unidades infecciosas) de virus VAA-LacZ y/o Ad-LacZ, los ratones se sacrificaron a diferentes tiempos y los tejidos se tiñeron para ver la expresión de LacZ. VAA-LacZ y Ad-LacZ empezaban a expresar su transgén ya 48 horas después de la administración del virus (datos no mostrados). Se observó una fuerte respuesta inmunitaria en forma de infiltración linfocitaria en los sitios de inyección de Ad-LacZ y Ad-LacZ + VAA-LacZ, mientras que se observó una reacción mucho menor en el sitio de inyección de VAA-LacZ solo. En el punto temporal de las tres semanas, la infiltración linfocitaria había desaparecido en su mayor parte. Sin embargo, en este punto temporal sólo unas pocas células seguían siendo positivas para la tinción con X-gal en el sitio inyectado con Ad-LacZ. No obstante, cientos de miotubos del músculo seguían siendo positivos para la tinción con X-gal tanto en el sitio inyectado solo con VAA-LacZ como en el inyectado con VAA-LacZ + Ad-LacZ. La tinción nuclear distintiva indica que la expresión del transgen LacZ en estas células procedía del vector VAA-LacZ y no del vector Ad-LacZ. Estos resultados demostraban que el vector VAA puede transportar con eficacia el transgén dentro de las células musculares y que el vector Ad-LacZ puede provocar una reacción inmunitaria más fuerte que la del vector VAA-LacZ. Esto parece ser debido a que el vector de adenovirus contiene no sólo el transgén, sino también numerosos genes virales, mientras que el vector de VAA solo posee el transgén. La probable expresión génica viral parece inducir una fuerte respuesta inmunitaria del hospedador que, finalmente, eliminará las células transducidas con el adenovirus, pero no las células transducidas con VAA.

El vector de VAA puede tener una expresión del transgén a largo plazo

Desde los 4 días hasta los 5 meses, no se observó reducción evidente de la expresión del gen LacZ a partir del vector VAA-LacZ. Sin embargo, en el caso de Ad-LacZ, la tinción de LacZ casi no era visible después de tres semanas. En los sitios de inyección con adenovirus, la tinción citoplásmica de LacZ desaparecía junto con la desaparición de la infiltración de linfocitos. Sin embargo, en las muestras de VAA-LacZ, la tinción nuclear de LacZ persistía, mientras que la infiltración había desaparecido completamente (o casi; ocasionalmente podían verse algunos linfocitos alrededor de algunas de las células azules).

Los resultados anteriores conducen a las siguientes conclusiones:

Primero, el vector de VAA puede transportar con eficacia un transgén al tejido muscular de ratón. A la concentración usada aquí, el vector de VAA es más eficaz que el vector de Ad.

Segundo, la transducción de VAA en células musculares no requiere la división celular. Esto viene respaldado por el alto porcentaje de transducción (próximo al 100% en determinadas zonas) de las células musculares, puesto que la mayoría de ellas no están en división a las tres semanas de edad, cuando se inyectaron los virus.

Tercero, el vector de VAA puede ofrecer una expresión del transgén a largo plazo en células musculares, hasta 5 meses, lo que indica que el promotor usado en el vector de VAA no se silencia y que las células transducidas con VAA no son eliminadas por el sistema inmunitario del hospedador.

Finalmente, hemos demostrado que los VAA pueden usarse como vectores para terapia génica eficaz, segura y práctica, inyectando directamente en tejidos musculares el gen diana incluido en el vector de VAA. Como resultado, muchas enfermedades metabólicas como la enfermedad de Gaucher, enfermedades endocrinas como la diabetes y coagulopatías como la hemofilia A y B, así como ciertas enfermedades musculares, serán candidatos idóneos para la terapia génica mediada con vectores de VAA.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan a este documento por referencia en el mismo grado que si cada publicación por separado estuviera específica e individualmente indicada para su incorporación por referencia.

Será aparente para un experto normal en la materia que pueden realizarse muchos cambios y modificaciones de la invención descrita ahora sin alejarse por completo del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Uso de un vector recombinante de VAA que comprende un gen que no es de VAA capaz de expresar un producto génico, ligado en un vector de VAA, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad causada por una deficiencia de dicho producto génico, que requiere ser producido y/o secretado en un animal, en el que la composición se administra en el tejido muscular de un animal.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha composición que comprende dicho vector se administra disuelta o resuspendida en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho vehículo líquido comprende una solución acuosa.

4. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho gen comprende un segmento de ADN que codifica una proteína ligado de forma operativa a un promotor operativo en dicho tejido muscular.

5. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha administración es mediante inyección intramuscular.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha administración es mediante transporte transdérmico.

7. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho vector de VAA comprende ADN que no es de VAA, ligado a un genoma de VAA en lugar o además de una secuencia de ADN del VAA que excluye los primeros y últimos 145 pares de bases de dicho genoma de VAA o ADN que no es de VAA operativamente ligado a un vector que comprende un segmento genómico D doble de VAA que consiste en 165 pares de bases incluyendo una repetición terminal interna con segmentos D en ambos extremos.

8. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho gen comprende un segmento de ADN que es capaz de transcribirse para producir una molécula de ARN que codifica una proteína y que tienen señales de iniciación y parada de la traducción para dicha proteína.

9. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho animal es un ave o un mamífero.

10. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho animal es un humano.

11. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho gen de interés que no es de VAA codifica, \beta-galactosidasa.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la enfermedad es una coagulopatía como la hemofilia, una enfermedad endocrina como la diabetes o una enfermedad metabólica como la enfermedad de Gaucher.