DE69920930T2

DE69920930T2 - Methoden und zusammensetzungen für die expression von heterologen genen in leberzellen unter verwendung von vektoren, die von hepadnaviren abgeleitet sind

Info

Publication number: DE69920930T2
Application number: DE69920930T
Authority: DE
Inventors: Heinz Schaller; Ulrike Protzer; Michael Nassal
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-26
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2019-08-27
Also published as: EP1108050B1; WO2000012739A1; EP1108050A1; US20050009185A1; ATE278793T1; DE69920930D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die chronische Hepatitis B ist eine der am weitesten verbreiteten und schwerwiegendsten Virus Infektionen; die Anzahl chronischer Virusträger wird auf über 3 50 Millionen geschätzt (WHO (1996) WHO Communicable, 1:1-26). Diese Individuen haben ein hohes Risiko eine Leberzirrhose und letztendlich ein primäres Leberzellkarzinom zu entwickeln (Lau et al., (1993) Lancet 342:1335-1340). Obwohl es eine Vakzine gibt, führt die derzeit eingesetzte systemische Behundlung mit hochdosiertem Interferon alpha (IFNα) nur in ca. einem Drittel der behundelten Patienten zur HBeAg/anti-HBe Serokonversion, und nur in 10-25% der behundelten Patienten zur Virus-Eliminierung (Hoofnagle et al. (1997) J. Viral Hepat. 1:41-50; Lau et al. (1997) Gastroenterology 113:1660-1667). Darüberhinaus ist die gegenwärtig genutzte Behundlung kostenintensiv und hat oft Nebenwirkungen.
Erreger der Hepatitis B Krankheit ist das Hepatitis B Virus (HBV), ein Mitglied der Hepadnavirus-Familie. Diese kleinen, DNA-enthaltenden Viren replizieren über Reverse Transkription, wie Retroviren, sie integrieren aber für die Replikation nicht ins Wirtszellgenom. Eine charakteristische Eigenschaft der Hepadnaviren ist ihre ausgeprägte Spezies- und Gewebsspezifität. HBV repliziert nur in der Leber des Menschen und höherer Primaten, und infiziert in vitro nur primäre Hepatozyten dieser Wirte.
Bis heute basierten die meisten klinischen Gen-Transfer-Studien auf rekombinanten retroviralen oder adenoviralen Vektoren für den Gen-Transfer, obwohl sowohl die retrovirale wie die adenovirale Technologie Einschränkungen unterliegt. So kann z.B. bei adenoviralen Vektoren die hohe "multiplicity of infection" (MOI) cytotoxische Effekte in den Zielzellen hervorrufen (Kay et al., (1993) Cell Biochem, 17E, 207), und die Wirts-Immunantwort gegen "späte" Genprodukte, z.B. das Pentonprotein, verursacht eine Entzündungsreaktion und die Zerstörung des infizierten Gewebes, das die Vektoren erhalten hat. (Yang et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 4407-4411). In WO 98/09524 betonen Srivastava et al., dass Zytokine und andere Immunmodulatoren für die Behandlung von Leber-Erkrankungen oder-Defekten nützlich sein können, wenn sie von einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektor exprimiert werden.
Von den retroviralen Vektoren wird am häufigsten das murine Leukämie-Virus (MLV) benutzt.
Es ist jedoch schwierig, Virus in ausreichender Titern zu produzieren, um spezifische Zelltypen oder Gewebe durch direktes Ausliefern in vivo mit MLV-basierten Vektoren zu erreichen (Kasahara et al., (1994) Science, 266, 1373-1376), und MLV-Vektoren, verpackt in murinen Verpackungszelllinien, sind nicht in der Lage, ein gewünschtes Gen in sich nicht teilende Zellen wie Hepatozyten einzubringen. Ein weiterer Nachteil sowohl retroviraler wie adenoviraler Technologien resultiert aus ihrer Fähigkeit zur Infektion eines breiten Spektrums von Zelltypen. Damit sind diese Gentherapie-Vektoren nicht ideal für den spezifischen Gentransfer in Hepatozyten geeignet.
Hepadnaviren sind kleine umhüllte DNA-Viren, die zur Genom-Replikation einen Reverse-Transkriptions-Weg benutzen, der keine Integration in das Wirtsgenom erfordert. Wie am Beispiel ihres prototypischen Vertreters, dem humanen Hepatitis B Virus, gezeigt, das ausschließlich Hepatozyten aus Menschen und Menschenaffen infiziert, sind Hepatitis B Viren ausgeprägt spezies- und gewebs-spezifisch, lebergerichtet, und in der Lage, sich nicht teilende Hepatozyten zu infizieren. Aufgrund dieser Eigenschaften wurden sie als attraktive Kandidaten für den therapeutischen, Lebergerichteten Gen-Transfer angesehen.
Frühe Studien im Enten Hepatitis B Virus (duck HBV; DHBV) Tiermodell, hatten nahegelegt, dass dies grundsätzlich möglich sei, obwohl ein effizientes Gentransfersystems noch entwickelt werden muss. DHBV Genome mit kurzen Deletionen, oder kleinen Insertionen nicht-kodierender DNA, konnten "in trans" komplementiert werden, um die Bildung infektiöser, defekter DHBV Partikel zu ermöglichen (Horwich, A.L. et al. (1990) J. Virol. 64:542-550). Diese Daten zeigten jedoch auch schwerwiegende Einschränkungen bezüglich der Insert-Größe auf. Neuere Versuche zur Herstellung von HBV-Rekombinanten sind in Einklang mit diesen Beobachtungen: selbst die Insertion eines kleinen Marker-Gens (HIV-1 tat, 276 bp) reduzierte die Ausbeute an umhüllten Viruspartikeln sehr deutlich. Chaisomchit, S. et al. (1997) Gene Ther. 4:1330-1340) beschreiben die Konstruktion eines replikations defizienten humanen Hepatitis B Virus (HBV), in dem ein heterologes Gen In-Phase mit der viralen Polymerase inseriert ist. Die Insertions-Stelle berührt das wichtige RC Signal im HBV Genom, und durch diese Insertion werden Cis-aktive Sequenzen zerstört, und der Großteil des POL offenen Leseahmens im HBV Genom wurde zerstört. Chaisomchit et. Al waren nicht in der Lage, die Produktion rekombinanter HBV zu zeigen, die von einer Hülle umgeben sind und fähig, eine Infektion zu vermitteln. Offensichtlich erhielten Chaisomchit et al. keine reifen, umhüllten Virus Partikel, die infektiös waren. Die Titer an Partikeln, die sie erhalten haben, waren weit unter denen, die sie bei parallelen Transfektionen eines Wildtyp-HBV Plasmids erhalten haben und würden für einen Gentransfer-Vektor insgesamt nicht ausreichen.
Insertion einer 800 bp Kassette mit dem Neomycin Resistenz-Gen an verschiedenen Stellen im Virusgenom erforderte Kompensation durch vergleichbar große Deletionen (Chiang, P. W. (1992) Doktorarbeit, Universität Heidelberg). In beiden Studien konnte die Transgen-Expression ausschließlich durch transiente Transfektions-Experimente gezeigt werden, nicht aber durch eine Infektion durch rekombinante Viruspartikel. Folglich gibt es derzeit keine experimentelle Evidenz, die die Eignung von Hepadnaviren nachweist, als Gentransfer-Vektoren zu fungieren.
In Anbetracht dessen werden Methoden und Zusammensetzungen für den Transfer eines heterologen Gens (z.B. eines therapeutischen Gens) in Hepatozyten durch Infektion mit einem rekombinanten Hepadnavirus weiterhin so benötigt, dass eine Expression des heterologen Gens in Hepatozyten erreicht wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt Methoden und Zusammensetzungen bereit für einen effizienten hepatozyten-spezifischen Transfer und für eine hepatozyten-spezifische Expression heterologer Gene, sowohl in vitro wie auch in vivo, mittels hepadnaviraler Vektoren.
Hepatitis B Viren sind hepatotrope DNA-Viren, die extrachromosomal replizieren. Die vorliegende Erfindung beruht, zumindest teilweise, auf Experimenten mit dem Enten-Hepatitis B Virus (DHBV) Modell, die demonstrieren, dass rekombinante Hepadnaviren für den Leber-gerichteten Gentransfer geeignet sind. Grünfluoreszierendes Protein (GFP) als intrazellulärer Marker, und ein Typ-1-Interferon als sekretorisches Protein mit therapeutischem Potential, wurden mittels DHBV Gentransfer hepatozytenspezifisch und dosisabhängig exprimiert. Zellen mit vor-bestehender DHBV Infektion konnten mit rekombinantem Virus überinfiziert werden, und eine Interferon-Expression unterdrückte effizient die Wildtyp-Virus Replikation. Vergleichbare HBV Vektoren wurden präpariert, und waren ebenso wirksam für den Transfer heterologer Gene in Hepatozyten. Somit bieten HBV-basierte Vektoren einen neuartigen Ansatz für die Behandlung von Leber-Erkrankungen, inklusive chronischer Virus-Infektionen.
Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Expression heterologer Gene in Hepatozyten. Diese Methode beinhaltet:
Die Bereitstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einem Titer, der zur Infektion von Hepatozyten ausreicht, wobei eine Region von mindesten ca. 200 Nukleotiden des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms ersetzt wurde durch ein heterologes Gen von ca. 200 bis zu ca. 1200 Nukleotiden, so dass die Expression des Fremdgen durch die regulatorischen Sequenzen des S-Gens reguliert wird; und
eine Infektion von Hepatozyten mit dem Hepadnavirus, so dass das heterologe Gen in die Hepatozyten eingebracht wird und in den Hepatozyten exprimiert wird.
Vorzugsweise sind die replikations-defekten Hepadnavirus-Partikel Human-Hepatitis B Virus Partikel.
In einer Ausführungs-Variante, ist das heterologe Gen so in eine Region des S-Gens inseriert, dass Nukleotide, die mindestens eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, in-Phase mit dem 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. In einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens an einer Position, die der KpnI-Schnittstelle von DHBV an Position 1290 äquivalent ist. In noch einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens an einer Position, die der KpnI-Schnittstelle von DHBV an Position 1290 äquivalent ist, und das heterologe Gen ist derart inseriert, dass Nukleotide, die für mindestens eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, in Phase an das 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. In noch einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens, und das heterologe Gen ist derart inseriert, dass Nukleotide, die mindestens eine Aminosäure des S-Gens kodieren, in Phase an das 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. In noch einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen das S-Gen. In noch einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen das S-Gen und mindestens einen Teil der PräS-Region.
Bevorzugte heterologe Gene für eine Expression in Hepatozyten sind solche Gene, die für modulierende Agenzien kodieren (d.h. Agenzien, die eine Virus-Infektion der Hepatozyten, oder die Krankheit der Hepatozyten modulieren). Bevorzugte modulierende Agenzien sind Zytokine. Ein besonders bevorzugtes Zytokin ist IFNα (Typ I IFN).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Behandlung einer Person mit einer Leber-Erkrankung. Die Methode beinhaltet:
Die Bereitstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einem Titer, der zur Infektion von Hepatozyten einer Person mit einer Lebererkrankung ausreicht, wobei eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein therapeutisches Gen derart ersetzt wurde, dass die Expression des therapeutischen Gens durch die regulatorischen Sequenzen des S Gens reguliert wird; und
die Infektion der Hepatozyten der Person mit den Hepadnavirus-Partikeln, so dass das Therapeutische Gen in die Hepatozyten eingebracht wird und in den Hepatozyten exprimiert wird in einem Ausmaß, das ausreicht, die Lebererkrankung zu behandeln.
Bevorzugte hepatische Erkrankungen, die durch die Methode behandelt werden sollen, schließen die Hepatitis B, die Hepatitis C, das hepatozelluläre Karzinom, Zirrhose, Steatose, Hämochromatose, und erbliche Leber-Erkrankungen ein.
Bevorzugte Therapeutische Gene schließen Gene ein, die für modulierende Agenzien kodieren wie z.B. Zytokine. Bevorzugte Zytokine schließen IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-18 und TNFα ein.
In einer Ausführungs-Variante wird der Hepadnavirus-Partikel direkt der Person verabreicht. In einer weiteren Ausführungs-Variante werden das Hepadnavirus-Konstrukt und ein Helfervirus-Konstrukt in vitro kultiviert, und die von der Kultur erzeugten infektiösen Partikel werden der Person verabreicht. In einer weiteren Ausführungs-Variante werden rekombinante Hepadnavirus-Partikel durch eine Helfer-Zelllinie produziert, und der Person verabreicht.
Die Erfindung beinhaltet auch eine Methode zur Behandlung einer Person mit einer Hepatitis Infektion. Die Methode schließt ein:
Die Bereitstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einem Titer, der ausreicht zur Infektion von Hepatozyten einer Person mit Hepatitis, wobei eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein zytokin-kodierendes Gen derart ersetzt wurde, dass die Expression des zytokin-kodierenden Gens durch die regulatorischen Sequenzen des S-Gens reguliert wird; und
die Infektion von Hepatozyten der Person mit dem Hepadnavirus, so dass das zytokin-kodierende Gen in die Hepatozyten eingebracht wird und in den Hepatozyten exprimiert wird in einem Ausmaß, das ausreicht, die Hepatitis zu behandeln.
Vorzugsweise ist das Zytokin IFNα. Alternativ kann das Zytokin sein z.B. TNFα, IFNα, IL-18 oder IFNγ.
In einer besonders bevorzugten Ausführungs-Variante ist die Hepatitis Infektion Hepatitis B und das Zytokin ist IFNα.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein replikations-defektes Hepadnavirus Partikel, worin eine Region von mindestens ca. 200 Nukleotiden des S-Gens des Hepadnavirus Genoms durch ein Therapeutisches Gen (z.B. ein Zytokin Gen, wie INFα) von ca. 200 bis ca. 1200 Nukleotiden ersetzt wurde, so dass die Expression des Therapeutischen Gens durch regulatorische Sequenzen des S-Gens reguliert wird. Pharmazeutische Kompositionen, die replikations-defekte Hepadnavirus Partikel und einen pharmazeutisch vertretbaren Träger, oder den replikations-defekten Hepadnavirus Partikel und ein Helfer-Virus beinhalten, sind ebenso von der Erfindung umfasst.
Ein noch anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Herstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einer Titer-Höhe, die für Therapeutische Anwendung geeignet ist. Die Methode beinhaltet:
die Ko-Transfektion von Zellen einer Hepatom-Zellinie mit:

(i) replikations-defekten Hepadnavirus Konstrukten, in denen eine Region von mindestens ca. 200 Nukleotiden des S-Gens der Hepadnavirus-DNA durch ein Gen von ca. 200 bis ca. 1200 Nukleotiden ersetzt wurde, das für ein Therapeutisches Gen kodiert, so dass die Expression des Gens, das für ein Zytokin kodiert, durch die regulatorischen Sequenzen des S-Gens reguliert ist; und
(ii) ein Helfer Konstrukt;

Kurzbeschreibung der Abbildungen
1A ist ein schematisches Diagramm, welches das Wildtyp-DHBV exprimierende Plasmid pCD16, prägenomische DHBV RNA mit wichtigen cis-Elementen, und DHBV Proteine zeigt.
1B ist ein schematisches Diagramm, welches drei DHBV rekombinante Transfer Plasmide zeigt. Im ersten Plasmid, rDHBV-S-GFP (rDHBV-S-GFP/IFN), ersetzt das Transgen das S-Gen von DHBV. Im zweiten Plasmid, rDHBV-core-GFP (rDHBV-core-GFP/IFN), ersetzt das Transgen das Core-Gen von DHBV. Das dritte Plasmid ist das verpackungs-defiziente pCD4 DHBV Helfer Plasmid. Virale Genprodukte, die dem ersten und zweiten Plasmid fehlen, werden bereitgestellt durch Ko-Transfektion mit dem dritten, dem Helfer-Plasmid.
2 zeigt Plasmid-Konstrukte für die Herstellung rekombinanter Hepadnaviren. Die Ausgangs-Plasmide pCH-9/3091 (HBV) und pCD16 (DHBV) basieren auf terminal redundanten Hepadnavirus Genom (fette schwarze Linien), die funktionell die zirkulären DNA Genom nachahmen, welche durch Reverse Transkription der RNA Prä-Genom (Wellenlinien mit A(n), das die Poly(A)-Schwänze repräsentiert). Zahlen geben Nukleotid Positionen an. Die Replikations-Kontrollregionen (fette schwarze Linien), die HBV Nukleotide 2360 bis 40 und DHBV Nukleotide 2100 bis 2800 umfassen, schließen cis-Signale für Synthese und Reifung des RNA Prä-Genom, und RNA Verpackung und Reverse Transkription ein. Diese sind auf den authentischen zirkulären Virusgenom durchgängig, und sind hier partiell dupliziert, um die terminalen Elemente zu erzeugen, die für die Replikation der linearisierten Genom erforderlich sind. Transkriptions-Startstellen sind durch die verbundenen Pfeile gekennzeichnet, authentische Virusgene durch offene Balken mit den zugehörigen Gen-Bezeichnungen. Die Positionen der Transgene in den rekombinanten Plasmiden sind durch die schraffierten Rechtecke angezeigt. Die Synthese der prägenomischen RNA wird durch ein Cytomegalie-Virus IE Enhancer/Promoter Element (gekennzeichnet als CMV) getrieben, während subgenomische RNAs, welche für die PräS/S und S Hüllproteine kodieren, sowie bei HBV für das X Protein, mittels interner Promotoren produziert werden. In den RNA Prä-Genomen bezeichnet ε eine 5'-proximate Haarnadelstruktur, die – bei DHBV zusammen mit einer zweiten Region (gekennzeichnet als RII) – als Verpackungssignal wirkt. Der 5'-terminate Teil von ε (HBV bis Nt 3142, DHBV bis Nt 2579) ist delektiert in den Helferkonstrukten, welche zur Bereitstellung der fehlenden Genprodukte in trans benutzt werden. In pCH-S-GFP wurde ein Fragment, welches das S-Gen umfasst, durch ein DNA-Fragment ersetzt, welches für GFP fusioniert an die ersten 3 Aminosäuren von S kodiert. In pCD-16-S-GFP und pCD-16-S-IFN ersetzen DNA-Fragmente, welche für GFP bzw. Enten-IFN kodieren, das KpnI bis BstEII Fragment, welches das DHBV S Gen einschließt.
3 ist eine Dot-Blot Analyse, die die Virion Bildung nach Ko-Transfektion von DHBV Transfer- und Helfer-Plasmiden in LMH Zellen zeigt. Ko-Transfektion des rekombinanten rDHBV-S-GFP-Plasmids, in dem das S-Gen durch das GFP-Gen ersetzt ist, mit dem Helfer-Plasmid, welches die fehlenden Virus-Hüll- und P-Proteine in die LMH-Zellen trans-komplementiert, führte zur Virion-Bildung. Umhüllte Virionen wurden auf einer Dot-Blot Membran mit DHBV- bzw. GFP-spezifischen Sonden analysiert.
4A-D sind Fotografien von Hepatozyten, welche die Transduktion primärer Hepatozyten durch rekombinante Hepadnaviren zeigen. Primäre Enten-Hepatozyten wurden mit unterschiedlichen MOIs mit rDHBV-GFP infiziert, einem rekombinanten DHBV, welches ein GFP-Gen unter Kontrolle des DHBV S-Promotors trägt. Die GFP-Expression ist gezeigt (200-fache Vergrößerung) an Tag 6 nach Infektion, nach Infektion für 6 Stunden bei einer MOI von 6 (4A), 25 (4B), oder 100 (4C), bzw. bei einer MOI von 100 für 24 Stunden (4D).
5 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, welches demonstriert, dass rekombinantes DHBV, das ein IFN Gen transferiert, mit der Etablierung der DHBV Infektion in vivo interferiert. Primäre Enten-Hepatozyten wurden mit replikationskompetentem Wildtyp-DHBV infiziert, und ko-infiziert mit einem rekombinanten DHBV, welches ein Gen für ein Enten-Homolog von alpha-Interferon (rDHBV-IFN) trägt, oder mit rDHBV-GFP als Negativkontrolle. Infektionserfolg wurde verfolgt bezüglich Freisetzung von Nachkommen DHBV mittels DNA Dot-Blot und bezüglich DHBV Strukturproteinen in Zellysaten mittels Western Blot. 5C ist eine Grafik, welche eine quantitative Auswertung des Zeitverlaufs der DHBV Produktion zeigt (DHBV-DNA-Äquivalente). Ko-Infektion mit rDHBV-IFN interferierte mit der Etablierung einer produktiven DHBV-Infektion genauso effektiv wie zugesetztes Interferon-Protein in einer Dosierung, die maximale Inhibition zeigte.
6A-C sind Fotografien, welche demonstrieren, dass rekombinantes DHBV DHBV-infizierte Zellen überinfiziert. Produktiv DHBV-infizierte Zellen wurden mit rDHBV-GFP (MOI 50) inkubiert. Nach 6 Tagen wurden die Zellen auf GFP Fluoreszenz hin untersucht (6A), und auf DHBV S-Protein gefärbt mittels eines rot-fluoreszenten TRITC-markierten Sekundär-Antikörpers (6B). Wie durch die Überlagerung bestätigt (6C), wurden GFP-exprimierende Zellen auch positiv auf DHBV S-Protein gefärbt. Da S-Protein ausschließlich von Wildtyp-DHBV exprimiert wird, aber nicht von rDHBV-GFP, beweist die Ko-Expression von GFP und S die Doppelinfektion mit beiden Viren.
7 ist eine Grafik, welche Therapeutischen Gentransfer mit rekombinantem DHBV demonstriert. Mit DHBV vorinfizierte Hepatozyten wurden bei verschiedenen MOIs mit rDHBV-IFN überinfiziert, oder mit rDHBV-GFP als Negativ-Kontrolle. Der Zeitverlauf der Freisetzung von Nachkommen-DHBV ist gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Methoden und Zusammensetzungen hinsichtlich des Transfers eines Fremdgens (d.h. heterologen Gens) in Hepatozyten mittels eines replikations-defekten Hepadnavirus-Partikel. Die Erfindung beruht, zumindest teilweise, auf der Entdeckung, dass der Austausch von Nukleotid-Sequenzen in der S-Genregion eines Hepadnavirus gegen ein Fremdgen zu einem replikations-defekten Hepadnavirus-Partikel führt, welcher zur Infektion und Expression des Fremdgens in Hepatozyten in einem Ausmaß in der Lage ist, das ausreicht, mit dem Verlauf einer viralen Infektion in den Hepatozyten zu interferieren. Die hier beschriebenen Daten weisen nach, dass das replikations-defekte Hepadnavirus-Partikel als ein effektiver Transfer-Vektor für ein Therapeutisches Gen zur Behandlung hepatischer Erkrankungen funktioniert.
Das gut etablierte Enten Hepatitis B Virus (DHBV) wurde eingesetzt, das ein leicht verfügbares System für Infektionsstudien mit primären Hepatozyten wie auch in ganzen Tieren darstellt, und die Wirksamkeit in diesem Modellsystem ist prädiktiv für Wirksamkeit in der humanen Hepatitis B Virus Infektion. Rekombinante DHBV Genoms wurden erzeugt, in denen virale kodierende Information ersetzt wurde durch das grün fluoreszierende Protein (GFP) als ein sensitiver intrazellulärer Marker, oder durch ein Typ-I Interferon (IFN) als ein sekretiertes Protein mit potentieller therapeutischer Anwendbarkeit. Mittels dieser rekombinanten Konstrukte wurde hier die erfolgreiche hepatozyten-spezifische Transduktion und Expression der Transgene in vitro und in vivo demonstriert (siehe die Beispiele).
Gewebsspezifität, und besonders Leberspezifität, ist ein Haupt-Ziel in der Gentherapie. Hepadnaviren haben spezielle Eigenheiten, die sie für diesen Zweck zu attraktiven Kandidaten machen. Im Gegensatz zu den meisten Retrovirus-Vektoren infizieren sie effizient ruhende Leberzellen. Unsers als bei Adeno-, Herpes-, Retro- und Parvoviren, ist die Virusaufnahme, wie auch die Genexpression von hepadnaviralen Promotor/Enhancer-Elementen hepatozyten-spezifisch. Darüber hinaus kodieren Hepadnaviren nur für wenige Genprodukte, welche eine Anti-Vektor-Immunantwort induzieren könnten, was eines der Hauptprobleme mit Adeno- und Herpesvirus-Vektoren ist. Schließlich integriert die hepadnavirale DNA nicht obligat in das Wirtszellgenom, was besonders wichtig ist für die transiente Expression eines Effektor-Gens wie dies für die Behandlung erworbener Leberkrankheiten bevorzugt ist.
Die hier offenbarten Daten stellen eine starke experimentelle Evidenz für die Praktikabilität eines Hepadnavirus-basierten, leber-gerichteten Gentransfersystems zur Verfügung. Sie zeigen erstmalig: (1) dass es möglich ist, nach Ersatz von viraler kodierender Information hohe Titer rekombinanter Viruspartikel zu generieren, die ein funktionelles Transgen tragen; (2) dass die Partikel ihre Zielzellen mit derselben hohen Leberspezifität infizieren wie das parentale Virus, was zur starken Expression des Fremdgens in vitro und in vivo führt; und (3) dass die Transduktion eines Interferon-Gens die Etablierung einer Hepadnavirus-Infektion blockiert und zusätzlich die Virusproduktion von vor-infizierten Hepatozyten substantiell reduziert. Mit Titern über 10⁸ umhüllter Viruspartikel pro ml Zellkultur-Überstand und der Möglichkeit zur weiteren Konzentrierung der Virus-Stocks ohne Verlust der Infektiosität vergleichen sich die hier beschriebenen rekombinanten Hepadnaviren vorteilhaft mit unieren Vektorsystemen wie Retro- oder Parvoviren.
Der hepadnavirale Gentransfer wurde als hepatozyten-spezifisch nachgewiesen; darüber hinaus konnten alle Hepatozyten in vitro transduziert werden. Obwohl die Transduktionsrate bei vor-infizierten Hepatozyten verringert war, konnte dennoch ein signifikanter Anteil der produktiv DHBV-infizierten Zellen durch rDHBV-GFP transduziert werden. Diese Daten wurden weiter bestätigt durch die eindeutige Inhibition der DHBV-Replikation mittels rDHBV-IFN in co-infizierten, und noch wichtiger, auch in DHBV vor-infizierten Leberzellen. Diese letztere Tatsache belegt, dass es keine grundsätzliche Barriere für die Anwendung rekombinanter Hepadnaviren zur Behandlung infektiöser Leber-Erkrankungen gibt. Aufgrund ihrer molekularen Eigenschaften erscheinen Hepadnaviren besonders geeignet für die transiente Leber-spezifische Expression von Fremdgenen. Mehrere wichtige erworbene Leber-Erkrankungen könnten durch hepadnavirale Vektoren gerichtet angegangen werden, einschließlich chronischer Infektionen durch HBV oder Hepatitis C Virus, die zu den häufigsten und schwerwiegendsten Virusinfektionen des Menschen weltweit gehören. Obwohl die Größe der Fremd-DNA, die in rekombinante Hepadnaviren integriert werden kann, limitiert ist (z.B. auf ungefähr 800 bp inserierter DNA, obwohl zusätzliche DNA akzeptiert werden könnte, wenn uniere nicht-essentielle virale DNA Sequenzen anderswo im Genom deletiert werden), passen zahlreiche wichtige Effektor-Gene in den begrenzten Platz auf dem hepadnaviralen Genom. Dazu gehören Gene, die für spezifische antisense-RNA oder trans-dominante Proteine kodieren, wie auch die meisten Zytokin-Gene.
Systemische Behandlung mit IFN alpha ist derzeit die einzige zugelassene Therapie für chronische Hepatitis B und C. Andere Zytokine wie IFN gamma oder TNF alpha supprimieren hochwirksam Leberinfektionen mit viralen und nicht-viralen Agenzien, wie die hepatischen Zwischenstufen von Malaria, aber schwerwiegende Nebenwirkungen verbieten die systemische Hochdosis-Applikation. Daher könnte die lokale Expression nach leber-gerichtetem Gentransfer mittels hepadnaviraler Vektoren, die hier vorgesehen ist, eine effizientere und besser tolerierbare Alternative bieten.
In einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Methode zur Expression eines heterologen Gens in Hepatozyten Diese Methode beinhaltet:
Das Bereitstellen replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einer Titer-Höhe, die zur Infektion von Hepatozyten in der Lage ist, wobei eine Region von mindestens ca. 200 Nukleotiden des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein heterologes Gen von ca. 200 bis ca. 1200 Nukleotiden so ersetzt wurde, dass die Expression des heterologen Gens durch regulatorische Sequenzen des S-Gens reguliert wird; und
die Infektion von Hepatozyten mit dem Hepadnavirus derart, dass das heterologe Gen in Hepatozyten eingebracht wird und in Hepatozyten exprimiert wird.
Vorzugsweise sind die replikations-defekten Hepadnavirus-Partikel humane Hepatitis B Virus Partikel.
In einer Ausführungs-Variante, ist das heterologe Gen so in eine Region des S-Gens inseriert, dass Nukleotide, die mindestens eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, In-Phase mit dem 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. In einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens an einer Position, die der KpnI-Schnittstelle von DHBV an Position 1290 äquivalent ist. In einer weiteren Ausführungs-Variante, ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens an einer Position, die der KpnI-Schnittstelle von DHBV an Position 1290 äquivalent ist, und das heterologe Gen ist derart inseriert, dass Nukleotide, die für mindestens eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, in Phase an das 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. In noch einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens, und das heterologe Gen ist derart inseriert, dass Nukleotide, die mindestens eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, in Phase an das 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. In noch einer weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen das S-Gen. In einem noch weiteren Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen das S-Gen und mindestens einen Teil der PräS-Region.
Bevorzugte heterologe Gene für die Expression in Hepatozyten sind solche Gene, die für modulierende Agenzien kodieren (d.h. Agenzien, die eine Virus-Infektion der Hepatozyten, oder die Krankheit der Hepatozyten modulieren). Bevorzugte modulierende Agenzien sind Zytokine. Ein speziell bevorzugtes Zytokin ist IFNα (Typ I IFN).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Behandlung einer Person mit einer hepatischen Erkrankung. Die Methode beinhaltet:
Die Bereitstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einem Titer, der ausreicht zur Infektion von Hepatozyten der Person mit einer Lebererkrankung, wobei eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein therapeutisches Gen derart ersetzt wurde, dass die Expression des therapeutischen Gens durch die regulatorischen Sequenzen des PräS-/S-Gens reguliert wird; und
die Infektion von Hepatozyten der Person mit den Hepadnavirus-Partikeln, so dass das therapeutische Gen in die Hepatozyten eingebracht wird und in den Hepatozyten exprimiert wird in einem Ausmaß, das ausreicht, die hepatische Erkrankung zu behandeln.
Bevorzugte hepatische Erkrankungen, die durch die Methode behandelt werden sollen, schließen die Hepatitis B, die Hepatitis C, das hepatozelluläre Karzinom, Zirrhose, Steatose, Hämochromatose, und erbliche Leber-Erkrankungen ein.
Bevorzugte Therapeutische Gene schließen Gene ein, die für modulierende Agenzien kodieren wie z.B. Zytokine. Bevorzugte Zytokine schließen ein IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-18 und TNFα.
In einer Ausführungs-Variante wird das Hepadnavirus-Partikel direkt der Person verabreicht. In einer weiteren Ausführungs-Variante werden das Hepadnavirus-Konstrukt und ein Helfervirus-Konstrukt in vitro kultiviert, und die von der Kultur erzeugten infektiösen Partikel werden der Person verabreicht. In einer weiteren Realisierung werden rekombinante Hepadnavirus-Partikel durch eine Helfer-Zelllinie produziert, und der Person verabreicht.
Die Erfindung beinhaltet auch eine Methode zur Behandlung einer Person mit einer Hepatitis Infektion. Die Methode schließt ein:
Die Bereitstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einem Titer, der ausreicht zur Infektion von Hepatozyten einer Person mit Hepatitis, wobei eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein zytokin-kodierendes Gen derart ersetzt wurde, dass die Expression des zytokin-kodierenden Gens durch regulatorische Sequenzen des PräS/S-Gens reguliert wird; und
das Infizieren von Hepatozyten der Person mit dem Hepadnavirus, so dass das zytokin-kodierende Gen in die Hepatozyten eingebracht wird und in den Hepatozyten exprimiert wird in einem Ausmaß, das ausreicht, die Hepatitis zu behandeln.
Vorzugsweise ist das Zytokin IFNα. Alternativ kann das Zytokine z.B. TNFα, IFNβ, IL-18 oder IFNγ sein.
In einer besonders bevorzugten Realisierung ist die Hepatitis Infektion Hepatitis B und das Zytokin ist IFNα.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen replikations-defekten Hepadnavirus Partikel, wobei eine Region von mindestens ca. 200 Nukleotiden des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein therapeutisches Gen (z.B. ein Zytokin Gen, wie INFα) so ersetzt wurde, dass die Expression des therapeutischen Gens durch regulatorische Sequenzen des S-Gens reguliert wird. Pharmazeutische Kompositionen, die das replikations-defekte Hepadnavirus-Partikel und einen pharmazeutisch vertretbaren Träger, oder das replikations-defekte Hepadnavirus-Partikel und ein Helfer-Virus beinhalten, sind ebenso von der Erfindung umfasst.
Ein noch anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Herstellung replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel mit einem Titer-Höhe, die für therapeutische Anwendung geeignet ist. Die Methode beinhaltet:
die Ko-Transfektion einer Hepatom-Zellinie mit:

(i) replikations-defekten Hepadnavirus Konstrukten, in denen eine Region von mindestens ca. 200 Nukleotiden des S-Gens der Hepadnavirus-DNA durch ein therapeutisches Gen von ca. 200 bis ca. 1200 Nukleotiden ersetzt wurde, bevorzugt ein Zytokin, das durch die regulatorischen Sequenzen des S-Gens reguliert ist; und
(ii) ein Helfer Konstrukt;

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden zuerst bestimmte Begriffe definiert.
Wie hier benutzt, bezieht sich der Terminus "Hepadnavirus" auf ein Mitglied der Hepadnaviridae Virusfamilie, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, humanes Hepatitis B Virus, Wollaffen Hepatitis B Virus (WMHBV; Lanford et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 5757-5761), Enten/duck Hepatitis B Virus (DHBV; Mundart et al., (1984) J. Virol. 49: 782-792; Mason et al., (1978) J. Virol. 36: 829-836), Reiher/heron Hepatitis B Virus (Sprengel et al., (1988) J. Virol. 62: 3832-3839), Waldmurmeltier/woodchuck Hepatitis Virus (Summers et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4533-4537), und Erdhörnchen/ground squirrel Hepatitis Virus (Marion et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2941-2945). Beispiele unserer Hepadnaviren, die zum Umfang der Erfindung gehören, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, HBV Stämme, die unterschiedliche menschliche Organe infizieren, einschließlich Hepatozyten, exokrine und endokrine Zellen, tubuläres Epithel der Niere, Milzzellen, Leukozyten, Lymphozyten, z.B. aus Milz, peripherem Blut, B oder T Lymphozyten, und Zellen der Lymphknoten und des Pankreas (siehe z.B. Mason et al., (1989) Hepatology. 9: 635-645). Die Erfindung betrifft auch Hepadnaviren, die nicht-humane Säugerspezies wie Zuchtvieh oder Haustiere infizieren.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus "heterologes Gen" oder "Fremdgen" auf jegliches Gen bzw. DNA-Sequenz, die nicht natürlicherweise im Hepadnavirus-Genom vorkommt, und welche in das Hepadnavirus-Genom eingeführt wird. Der Terminus "heterologes Gen" oder "Fremdgen" wird auch gebraucht, um ein DNA Molekül aus einer vollständig anderen Spezies einzuschließen, z.B. eine menschliche DNA Sequenz, z.B. das für humanes INFα kodierende Gen, welches in das hepadnavirale Genom inkorporiert ist.
Wie hier benutzt, bezieht sich der Terminus "replikations-defektes hepadnavirales Partikel" auf ein Hepadnavirus mit einem Verpackungssignal (ε), in welchem ein Teil des Hepadnavirus-Genoms durch ein heterologes Gen ersetzt ist. Das heterologe Gen ersetzt einen Teil des Hepadnavirus Genoms, der für Proteinprodukte kodiert, die für die Replikation essentiell sind, und macht somit das Hepadnavirus unfähig zu replizieren. Replikation des replikations-defekten Hepadnavirus-Partikel ist ermöglicht mittels eines "Helfer-Virus", das die Proteinprodukte erzeugen kann, die das replikations-defekte Hepadnavirus-Partikel nicht produzieren kann. Besonders bezieht sich der Terminus "replikations-defektes hepadnavirales Partikel" auf ein Hepadnavirus, in dem zumindest ein Teil des S-Gens, das für die Hüllproteine kodiert, ersetzt ist.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus eine "Region" oder "Teil" eines Gens (z.B. das hepadnavirale S-Gen) auf einen Abschnitt von Nukleotid-Sequenz des Hepadnavirus-Genoms, die durch ein heterologes Gen ersetzt ist. Vorzugsweise ist die Länge der ersetzten Nukleotid-Sequenz mindestens ungefähr 200, besser mindestens ungefähr 300 oder 400, und sogar noch besser ungefähr 500 oder 600 Basenpaare lang. Der Ersatz von bis 800 Nukleotiden wurde nachgewiesen.
Wie hier gebraucht, ist der Terminus "regulatorische Sequenzen" technisch anerkannt, und soll Promotoren, Enhancer, und uniere Expressions-Kontroll-Elemente (z.B. Polyadenylierungs-Signale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind Personen mit einer speziellen Ausbildung bekannt, und sind beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Der Terminus "Titer-Höhe, die in der Lage ist zu infizieren" bezieht sich auch auf eine Menge (z.B. Anzahl viraler Partikel in einem bestimmten Volumen), die bei Anwendung auf Hepatozyten ausreicht, diese zu infizieren. Geeignete Titer-Höhen sind zum Beispiel mindestens 3 × 10⁷/ml bis 2 × 10⁸/ml Kulturüberstand.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus "S-Gen" auf ein hepadnavirales Gen, welches für das S Protein kodiert, ein Oberflächenbestundteil der Hepadnavirus Hülle (env). Die Expression des S-Gens ist unter Kontrolle des SP2 Promotors. Zwei zusätzliche Oberflächenproteine, die ebenfalls Bestandteile der Hülle sind, sind das (große) Large (L) und (mittlere) Middle (M) Protein (diese leiten sich von alternativen Startstellen ab). Das L Protein ist durch den SP1 Promotor reguliert. Die "PräS-Region umfasst die genetische Region 5' vom S-Gen, einschließlich des Promotors und unserer transkriptions-regulatorischen Regionen.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus "modulierendes Agens" auf eine Verbindung, die den Status des Hepatozyten ändert, wie Agenzien, die eine virale Infektion des Hepatozyten oder eine andere Erkrankung verändern oder mit ihr interferieren. Beispiele modulierender Agenzien, die den Zustand des Hepatozyten ändern können, schließen Verbindungen ein, die eine Erkrankung der Leber eliminieren oder abschwächen können, zum Beispiel Zytokine wie INFα, IFNβ, INFγ, TNF und IL-18. Andere Beispiele modulierender Agenzien schließen solche ein, die die Funktion von Hepatozyten beeinflussen, z.B. zur Verbesserung des Enzym-Stoffwechsels.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus "Behandlung" auf eine Verringerung, Abschwächung oder Verbesserung von mindestens einer unerwünschten Neben-Wirkung oder eines Symptoms einer Krankheit oder Störung, z.B. eine Erkrankung oder Störung, die mit einer Hepatitis B Virus Infektion assoziiert ist, z.B. Hepatitis B, Zirrhose, oder hepatozelluläres Karzinom.
Wie hier gebraucht, soll der Terminus "Person" Organismen einschließen, die durch Hepadnaviren infiziert werden können, einschließlich Säugern und Vögeln. Bevorzugte „Personen" sind Säuger. Beispiele für Personen schließen ein Menschen, Enten, Waldmurmeltiere, Hörnchen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Kühe, Ziegen und Schafe.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus Leber-Erkrankung auf jegliche mit der Leber assoziierte Krankheit. Beispiele von Krankheiten im Bereich/Umfang der Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Hepatitis B, Hepatitis C, hepatozelluläres Karzinom, Zirrhose, Steatose, Hämochromatose, und erbliche Leber-Störungen/Erkrankungen.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus "therapeutisches Gen" auf ein Gen, das für ein therapeutisches Polypeptid kodiert, welches zumindest eine unerwünschte/schädliche Wirkung oder Symptom einer hepatischen Erkrankung oder Störung reduziert, abschwächt oder verbessert. Beispiele für therapeutische Gene im Rahmen der Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Zytokine wie INFα, IFNβ, INFγ, TNF, IL-18, Antisense Oligonukleotide, oder inhibitorische Peptide.
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Terminus "Helfer-Konstrukt" oder "Helfer-Virus" auf ein Virus, welches Protein-Produkte erzeugen kann, die das replikationsdefekte Hepadnavirus-Partikel nicht produzieren kann. Das "Helfer-Virus" stellt jeglichen Faktor bereit, der für die Replikation essentiell ist und befähigt das replikations-defekte Hepadnavirus-Partikel zur Replikation. Ein Beispiel eines Helfer-Konstruktes im Rahmen der Erfindung schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, ein Hepadnavirus Konstrukt dem das Verpackungssignal (ε) fehlt, sowie das Hepatitis B Virus. Ein Beispiel für ein Helfer-Konstrukt für HBV ist pCH3142, und für DHBV pCD4 (näher beschrieben in Beispiele).
Die Molekularbiologie der Hepadnaviren und ihr Infektionszyklus sind gut charakterisiert (für Übersichten s. z.B. Nassal et al., (1993) Trends Microbiol. 1:221-228; Nassal, et al., (1996) J. Viral Hepat. 3:217-226). Infektiöse Virionen enthalten ein partiell doppelsträngiges zirkuläres DNA Genom von nur 3-3,2 kb Länge, wobei das virale Replikationsenzym, P-Protein, kovalent mit dem 5'-Ende des langen DNA-Stranges verknüpft ist. Nach Eintritt in die Wirtszelle wird das Genom in den Zellkern gebracht und in eine kovalent geschlossene zirkuläre DNA cccDNA [nach Englisch: covalently closed circular] umgewandelt, die als Matrize für vier Klassen von subgenomischen und genomischen RNAs dient. All diese RNAs werden in Protein translatiert; die mRNA für das Kapsidprotein und P-Protein wird zusätzlich mit P-Protein zusammen in neu entstehende Nukleokapside verpackt, wo sie durch das Enzym in DNA revers transkribiert wird. Sie wird daher als RNA Prägenom bzw. prägenomische RNA bezeichnet. Eine Reihe von cis-Elementen wurden identifiziert, die notwendig sind, um die effiziente Produktion von genomischen und subgenomischen Transkripten, und die Verpackung und reverse Transkription der prägenomischen RNA zu gewährleisten. Dazu gehören Promotoren und Enhacer (Hirsch et al. (1991) J. Virol. 65:3309-3316; Schaller et al. (1991) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 168:21-39), das Polyadenylierungssignal, das RNA Verpackungssignal ε (Hirsch et al. (1991) J. Virol. 65:3309-3316; Junker Niepmann et al., (1990) Embo J. 9:3389-3396), ein weniger gut definiertes DHBV-spezifisches zweites Element, Region II (Calvert et al., (1994) J. Virol. 68:2084-2090), und mehrere Kopien einer direkten Sequenzwiederholung ([direct repeat] DR1, DR2 und DR1*) (Lien et al., (1987) J. Virol. 61.3832-3840; Molnar Kimber et al., (1984) J. Virol. 51:181-191; Seeger et al., (1991) J. Virol. 65:5190-5195). Weitere cis-Elemente, z.B. das PET-Element, (Huang, et al. (1994) J. Virol. 68:1564-1572), sind in transkriptioneller Regulation und intrazellulärem Transport involviert.
Zwei Haupt-Tiermodelle werden gegenwärtig als Infektionssysteme für HBV benutzt: das Waldmurmeltier Hepatitis B Virus ([woodchuck hepatitis virus] WHV; (Roggendorf et al., (1995) Intervirology 38:100-112)) und das Enten Hepatitis B Virus ([duck hepatitis B virus] DHBV; (Schodel et al., (1991). Besonders Enten stellen ein gut zugängliches System für Infektionsstudien in Ganztieren wie auch in primären Leberzellen dar.
Gentransfer mittels eines hepadnaviralen Vektors erfordert die Generierung von infektiösen, aber vorzugsweise replikations-defekten rekombinanten Viruspartikeln. Für die Erzeugung infektiöser Viruspartikel muss die rekombinante prägenomische RNA einige Voraussetzungen erfüllen, welche die Möglichkeiten zur Insertion zusätzlicher Fremdsequenzen einschränken. Die wichtigsten Einschränkungen sind die geringe Größe und die kompakte Organisation des hepadnaviralen Genoms, die die einfache Insertion zusätzlicher Sequenzen verbietet. Eine Insertion könnte mit einem oder mehreren der zahlreichen cis-Elemente interferieren, die ungefähr 15% des viralen Genoms ausmachen. Demnach könnte der Ersatz von kodierender Information durch ein Fremdgen geeignet sein, um ein replikations-defizientes rekombinantes Virus zu erzeugen.
In einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Methode zur Expression eines heterologen Gens in Hepatozyten durch Bereitstellen von replikations-defekten Hepadnavirus-Partikeln mit einer Titer-Höhe, die zur Infektion von Hepatozyten in der Lage ist, wobei eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein heterologes Gen so ersetzt wurde, dass die Expression des heterologen Gens durch regulatorische Sequenzen des S-Gens reguliert wird, und das Infizieren von Hepatozyten mit dem Hepadnavirus, so dass das heterologe Gen in Hepatozyten eingebracht und in Hepatozyten exprimiert wird.
Die Molekularbiologie der Hepadnaviren und ihr Infektionszyklus sind gut charakterisiert (für Übersichten s. z.B. Nassal et al., (1993) Trends Microbiol. 1:221-228; Nassal, et al., (1996) J. Viral Hepat. 3:217-226). Infektiöse Virionen enthalten ein partiell doppelsträngiges zirkuläres DNA Genom von nur 3-3,2 kb Länge, wobei das virale Replikationsenzym, P-Protein, kovalent mit dem 5'-Ende des langen DNA-Stranges verknüpft ist. Nach Eintritt in die Wirtszelle wird das Genom in den Zellkern gebracht und in eine kovalent geschlossene zirkuläre DNA cccDNA [nach Englisch: covalently closed circular] umgewandelt, die als Matrize für vier Klassen von subgenomischen und genomischen RNAs dient.
Für die Erzeugung infektiöser Viruspartikel muss die rekombinante prägenomische RNA einige Voraussetzungen erfüllen, welche die Möglichkeiten zur Insertion zusätzlicher Fremdsequenzen einschränken. Die wichtigsten Einschränkungen sind die geringe Größe und die kompakte Organisation des hepadnaviralen Genoms, die die einfache Insertion zusätzlicher Sequenzen verbietet. Eine Insertion könnte mit einem oder mehreren der zahlreichen cis-Elemente interferieren, die ungefähr 15% des viralen Genoms ausmachen.
Viele Strategien sind nach dem technischen Stund bekannt, um Konstrukte des Hepadnavirus Genoms zu erzeugen. Die relevanten Sequenzen des hepadnaviralen Genoms und des heterologen Gens können an geeigneten Stellen mit Restriktions-Endonukleasen geschnitten, isoliert und in vitro ligiert werden, mittels Techniken die nach dem technischen Stund bekannt sind. In der Methode der Erfindung wird eine Region des S-Gens des Hepadnavirus durch ein heterologes Gen ersetzt. In der bevorzugten Ausführungs-Variante ist das heterologe Gen in eine Region des PräS/S-Gens so inseriert, dass Nukleotide, welche für mindestens eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, In-Phase an das 5'-Ende des heterologen Gens fusioniert sind. Vorzugsweise ist das heterologe Gen funktionell mit mindestens einer Aminosäure des S-Proteins verknüpft. Noch bevorzugter ist das heterologe Gen mit bis zu 5-10 Aminosäuren des S Proteins funktionell verknüpft. Noch bevorzugter ist das heterologe Gen mit 1, 2, oder 3 Aminosäuren des S-Proteins funktionell verknüpft. Am bevorzugtesten ist das heterologe Gen mit 4 Aminosäuren des S-Proteins funktionell verknüpft. Beispiel 1 zeigt das Konstrukt, welches die Effizienz einer funktionellen Verknüpfung von 4 Aminosäuren des S-Proteins mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) zeigt. Wenn dieses Konstrukt in Hühner-Hepatomzelllinien (LMH) Zellen transfiziert wurde, ließ sich 48 Stunden nach Transfektion eine helle, grüne Fluoreszenz detektieren, was eine effiziente Expression von GFP demonstriert.
In der bevorzugten Ausführungs-Variante ersetzt das heterologe Gen eine Region des S-Gens an einer Position, die der KpnI-Schnittstelle des Enten-Hepadnavirus an Position 1290 äquivalent ist. In anderen bevorzugten Ausführungs-Varianten ist das heterologe Gen in das PräS/S-Gen hinter dem authentischen AUG inseriert. Entsprechend kann die Nukleotid-Sequenz jedes Hepatitis Virus, wie z.B. des humanen Hepatitis B Virus eingesetzt werden, und die äquivalente KpnI Stelle kann zur Klonierung des heterologen Gens benutzt werden. Alternativ kann die Nukleotid-Sequenz jedes Hepatitis Virus, wie z.B. des humanen Hepatitis B Virus eingesetzt werden und das heterologe Gen kann hinter dem authentischen AUG entweder im PräS oder im S Gen inseriert werden.
Die Größe des heterologen Gens, das zum Ersatz des S-Gens benutzt wird, ist vorzugsweise ungefähr 200 bis hin zu ungefähr 1200 Nukleotiden. Bevorzugter ist die Größe des heterologen Gens, das zum Ersatz des S-Gens benutzt wird, ungefähr 300 bis hin zu ungefähr 800 Nukleotiden. Am bevorzugtesten ist die Größe des heterologen Gens, das zum Ersatz des S-Gens benutzt wird, ungefähr 600 Nukleotide.
In der bevorzugten Ausführungs-Variante kodiert das heterologe Gen für ein modulierendes Agens, das den Status der Leber moduliert, wenn der replikations-defekte Hepadnavirus-Partikel, welcher das heterologe Gen enthält, in der Leber exprimiert wird. Beispiele für modulierende Agenzien schließen ein Verbindungen, welche den Zustand der Leber ändern können, einschließlich solcher, welche eine Lebererkrankung eliminieren, mildern oder verbessern können. Weitere Beispiele von Modulation beinhalten jene, welche die Funktion von Hepatozyten beeinflussen, z.B. zur Verbesserung des Enzym-Stoffwechsels. Modulierende Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Zytokine, Blutfaktoren, Enzyme, antisense-Nukleinsäuren und trans-dominante Proteine. In der bevorzugten Ausführungs-Variante ist das modulierende Agens ein Zytokin. In noch bevorzugteren Ausführungs-Varianten ist das Zytokin INFα.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung eine Methode zur Behandlung einer Person mit einer hepatischen Störung, indem sie replikations-defekte Hepadnavirus Partikel mit einer Titer-Höhe zur Verfügung stellt, der in der Lage ist, Hepatozyten der Person mit der hepatischen Störung zu infizieren, wobei eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch ein therapeutisches Gen ersetzt ist, so dass die Expression des therapeutischen Gens durch regulatorische Sequenzen des PräS/S-Gens reguliert ist; und das Infizieren von Hepatozyten der Person mit den Hepadnavirus Partikeln dergestalt, dass das therapeutische Gen in die Hepatozyten eingebracht und in den Hepatozyten in einer Menge exprimiert wird, die ausreicht, die hepatische Störung zu behandeln. Wie in den Beispielen gezeigt, ist die intravenöse Injektion infektiöser replikations-defekter Hepadnavirus-Partikel hinreichend, um die Partikel in vivo in Hepatozyten einzubringen und die Expression des heterologen Gens in den Hepatozyten zu erreichen.
Hepatische Störungen, die durch modulierende Agenzien beeinflusst werden können, schließen transiente hepatische Störungen ein, die die Behandlung mit replikations-defekten Hepadnavirus-Partikeln, in denen eine Region des S-Gens des Hepadnavirus-Genoms durch das therapeutische Gen ersetzt ist, nur so lange erfordern, bis die hepatische Störung gemildert ist. Beispiele für transiente hepatische Störungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, die Hepatitis B, die Hepatitis C, Zirrhose, hepatozelluläres Karzinom, und Malaria. Wundere hepatische Störungen, welche durch die Methode der Erfindung behandelt werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Hyperammonämie, infantile Cholestase und Hepatomegalie.
Zum direkten Nachweis des Potentials von hepadnaviralen Vektoren für den Leber-spezifischen Gentransfer wurden rekombinante DHBV und HBV Partikel, welche Fremdgene tragen, generiert und zur Infektion primärer Enten- und Human-Hepatozyten eingesetzt. Unter Benutzung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Marker wurden mehrere rekombinante DHBV und HBV Genom konstruiert, von denen einige substantielle Titer an sekretierten rekombinanten Viren erzielten (rDHBV oder rHBV). Diese Viren infizierten primäre Enten- oder Human-Hepatozyten in spezies-spezifischer Weise und transferierten effizient das Fremdgen, wie durch die GFP-Fluoreszenz demonstriert. Als Kandidat für ein therapeutisches Agens wurde ein homologes rekombinantes DHBV generiert, welches das Enten-Typ-I-Interferon (DuIFN (Schultz et al., (1995) Virology 212:641-649) trägt. Infektion primärer Hepatozyten endogen infizierter Enten mit dieser Rekombinante reduzierte die DHBV Replikation zu mehr als 90%.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird weiter illustriert durch die folgenden Beispiele.
Methoden und Reagenzien, die in den folgenden Beispielen benutzt sind, werden nachfolgend beschrieben:
I. DHBV Methodik
DHBV Plasmid Konstrukte. Alle DHBV Konstrukte basieren auf dem Plasmid pCD16, das ein terminal redundantes DHBV Genom (Subtype 16) (Mundart, E. et al. (1984) J. Virol. 49:782-792) (3317 bp, Nukleotide 2520 to 2816) unter Kontrolle eines CMV Immediate Early Promoter/Enhancer enthält (1A-B und 2)(Obert, S. et al. (1996) EMBO J. 15:2565-2574; Bartenschlager, R. (1990) Doktorarbeit, Universität Heidelberg). Dem Helfer Plasmid pCD4 fehlt ein Teil des 5' Verpackungssignal ε (1A-B und 2) und es ist daher verpackungs-defizient (Bartenschlager, R. (1990) Doktorarbeit, Universität Heidelberg). Das Marker Konstrukt pCD16-S-GFP wurde erhalten, indem ein DHBV-DNA Fragment, dass das S Gen (von KpnI, Nukleotid Position 129D, bis BstEII, Nukleotid Position 1847; siehe 1A-B und 2) durch ein PCR Fragment (733 Nukleotide), das ein Fluoreszenz-verstärktes nach rot verschobenes GFP, das aus dem Plasmid pTR-UF5 (Zolotukhin, S., et al. (1998) J. Virol. 70:4646-4654) mit Primern, die terminal KpnI und BstEII Schnittstellen einführten, präpariert wurde, enthält. pCD16-S-IFN wurde analog gewonnen durch Präparation eines PCR-generierten Fragment (591 Nukleotide) das das komplette Enten Typ I IFN Gen umfasst (Schultz, U. et al. (1995) J. Virol. 70:4646-4654). Für die Produktion von rekombinantem Enten IFN Protein, wurde das IFN Gen in einen pUC basierenden, CMV-IE Promoter kontrollierten Expressions-Vektor kloniert (pCD IFN).
Produktion rekombinanter DHBV Stocks. Hühner Hepatom LMH Zellen (Condreay, L.D. et al. (1990) J. Virol. 64:3249-3258) wurden bei 30-40% Konfluenz mit der Calcium-Phosphat Methode ko-transfiziert mit 50μg des rekombinanten Plasmid pCD16 plus 25μg pCD4 pro 15 cm Schale. Das Zellkultur Medium, das rekombinante Virionen enthielt, wurde von Tag 3 to 5 nach der Transfektion gesammelt, die Virionen 10- bis 50-fach konzentriert durch Präzipitation mit 6.5% Polyethylen-Glykol 20.000/0.9% NaCl bei 0°C, und bis zur weiteren Nutzung in PBS/10% Glycerol bei –20° C gelagert. Virus Titer, gemessen als umhüllte DNA-haltige Partikel, wurden nach Dichte-Gradienten-Zentrifugation und anschließender Dot Blot Analyse relativ zu einem DHBV-DNA Standard bestimmt (Obert, S. et al. (1996) EMBO J. 15:2565-2574).
Isolation primärer Hepatozyten für DHBV Experimente. Primäre Enten-Hepatozyten (primary duck hepatocytes, PDH) wurden aus 2- bis 3-Wochen alten Peking Enten isoliert durch eine Standard Zwei-Schritt Kollagenase Perfusion über die Portal-Vene mit anschließender differentieller Zentrifugation (50 × g), in einer Dichte von 2.5 × 10⁵ Zellen/cm² ausgesät und kultiviert wie beschrieben (Hild, M. et al. (1998) J. Virol. 72:2600-2606). DHBV-positive PDH wurden analog gewonnen aus Enten, die am ersten Tag nach dem Schlüpfen experimentell mit 100 μl Enten Serum infiziert waren, das 10⁹ DHBV16-Virionen enthielt. Primäre Maus Hepatozyten wurden aus 16 bis 20-Wochen alten CH57BL/6 Mäusen isoliert, auf Kollagen Typ I beschichteten Platten (Sigma Aldrich, Irvine, CA, USA) in "Maintenance Medium"/10% FCS in einer Dichte von 4 × 10⁵ Zellen/cm² ausgesät, und weiter kultiviert ohne FCS wie beschrieben (Hild, M. et al. (1998) J. Virol. 72:2600-2606). Endothel-Zellen und Kupffer Zellen in den Hepatozyten-Kulturen wurden auf der Basis der Aufnahme von TRITC markiertem, acethyliertem Low-Density Lipoprotein identifiziert (Dil-Ac-LDL; Paesel & Lorel, Duisburg, Germany (Irving, M.G. et al. (1984) Gastroenterology 87:1233-1247)), bzw. durch Phagozytose von 1 μm großen Amin-modifizierten gelb-grün fluoreszierenden Latex Kügelchen (Sigma Aldrich Chemie, Deisenhofen, Germany).
DHBV Infektion und Gentransfer durch rekombinantes DHBV (rDHBV). Primäre Hepatozyten wurden am zweiten Tag nach der Isolierung für 24 Stunden inkubiert mit rDHBV, oder Wildtyp DHBV aus einem DHBV16 positiven Enten Serum, verdünnt in "Maintenance Medium" in der gewünschten "Multiplicity of infection (MOI)". GFP Expression wurde durch Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem Standard FITC Filter bei Exzitation durch blaues Licht (488 nm) beobachtet. Für die in vivo Infektionen wurde Enten-Küken am Tag nach dem Schlüpfen mit 10⁹ rDHBV-GFP Virionen inokuliert. Am Tag 7 nach der Infektion wurden die Enten anästhesiert und über die Portalvene mit kaltem 4% Paraformaldehyd/0.25% Glutaraldehyd perfundiert. Die Lebern wurden entnommen, in der Perfusions-Lösung für 24 Std. nachfixiert, in 30% Saccharose gesättigt und in einem Kryostat-Mikrotom seriell geschnitten (10-15μm). Zusätzlich wurden primäre Hepatozyten isoliert und wie oben beschrieben analysiert.
Ko-Infektion DHBV-positiver PDH mit rDHBV-IFN. DHBV-negative PDH wurden gleichzeitig mit aus dem Serum stammendem DHBV (MOI von 25) sowie rDHBV-IFN (MOI von 50) oder rDHBV-GFP (MOI von 50) infiziert. DHBV-positive PDH wurden analog infiziert. Zell-Lysate wurden auf intrazelluläre DHBV Proteine mittels Western Blot Analyse (unten beschrieben) untersucht, und die Freisetzung von Nachkommen-DHBV Virus wurde quantitative mittels Dot Blot Analyse des Zellkultur-Mediums bestimmt. Als Positiv-Kontrolle wurden DHBV-infizierte PDH mit einer Verdünnung eines rekombinanten Enten-IFN, das aus dem Zellkultur-Medium von LMH Zellen präpariert wurde, die mit dem Plasmid pCD-IFN transfiziert worden waren, in einer Dosis inkubiert, die sich in vorausgehenden Experimenten als ausreichend erwiesen hatte, die DHBV Vermehrung maximal zu inhibieren. IFN Protein wurde am Tag 3 zugegeben, da zu diesem Zeitpunkt eine Genexpression von rDHBV-GFP erstmals detektiert wurde.
Immunfluoreszenz Färbung und Western Blot Analyse intrazellulärer DHBV Antigene. Für die Immunfärbung intrazellulärer DHBV Antigene wurden entweder ein polyklonales Kaninchen Antiserum gegen das DHBV Core-Protein (Schlicht, H.J. et al. (1987) J. Virol. 61:3701-3709), oder der monoklonale Antikörper MAb 7C.12 (Pugh, J.C. et al. (1995) J. Virol. 59:4814-4822), der das DHBV S-Protein erkennt, benutzt, und diese wurden mit einem entsprechenden Fluoreszenz-markierten Zweit-Antikörper detektiert. Für die direkte Detektion intrazellulärer Proteine wurden 10⁶ PDH durch die Zugabe von 250 μl Protein Probenpuffer lysiert (Hild, M. et al. (1998) J. Virol. 72:2600-2606) nachdem das Zellkultur-Medium entfernt war. Zusätzlich wurden zytoplasmatische Lysate von 10⁷ transfizierten LMH Zellen mit einem Kaninchen-Antiserum gegen DHBV Prä-S-Protein inkubiert (Schlicht, H.J. et al. (1987) J. Virol. 61:2280-2285) oder mit einem Kaninchen-Antiserum gegen GFP (Clontech, Palo Alto, CA, USA), und immunpräzipitierte Proteine wurden durch Kochen in 50 μl Probenpuffer freigesetzt (Schlicht, H.J. et al., supra). Jeweils 25 μl wurden mittels 10% SDS-PAGE separiert, auf eine positiv geladene Nylon Membran geblottet, mit einem polyklonalen Antiserum gegen DHBV Core- (Schlicht, H.J. et al., supra), S- (Schlicht, H.J. et al., supra) und Prä-S-Proteine (Schlicht, H.J. et al., supra) oder gegen GFP immungefärbt, und mithilfe des ECL-Systems sichtbar gemacht (Amersham, Clevelund, Ohio, USA) wie beschrieben (Hild, M. et al. (1998) J. Virol. 72:2600-2606).
II. HBV Methodik
HBV Plasmid Konstrukte. HBV Konstrukte enthalten unter Kontrolle des CMV Immediate Early Promoter/Enhancer ein terminal redundantes Genom von HBV, Subtyp ayw 1 (pCH-9/3091, HBV Nukleotide 3091 to 84, Nummerierung ab dem Core Start-Codon) (Nassal, M., et al. (1990) Cell 63: 1357-1363). Dem Helfer Konstrukt pCH3142 (Bartenschlager, R. (1990) Doktorarbeit, Universität Heidelberg) fehlen Teile des 5' Verpackungs-Signal ε und es ist daher verpackungs-defizient (2).
Das Marker Konstrukt pCH-S-GFP wurde gewonnen, in dem DNA Fragmente, die das S Gen enthalten (von XhoI, Nukleotid Position 1409, bis NsiI, Nukleotid Position 2347), durch ein PCR Fragment (733 Nukleotide), das ein Fluoreszenz-verstärktes nach rot verschobenes GFP, das aus dem Plasmid pTR-UF5 (Zolotukhin, S., et al. (1998) J. Virol. 70:4646-4654) präpariert wurde, enthält, so dass die Expression durch den S Promotor gesteuert werden sollte (siehe 2).
Produktion rekombinanter HBV Stocks. Humane HuH7 Hepatomzellen (Chang, C.M. et al. EMBO J. 6: 675-680) wurden ko-transfiziert mit dem rHBV- und dem Helfer-Konstrukt unter Verwendung derselben Methode, die zur Herstellung rekombinanter DHBV Stocks oben verwendet wurde. Wildtyp HBV wurde durch Transfektion von HuH7 Zellen mit dem Plasmid pCH-9/3091 gewonnen.
Isolation primärer Hepatozyten für HBV Experimente. Humane Leber-Biopsien wurden im Rahmen von operativen Eingriffen nach Einverständnis durch den Spender gewonnenen und über einen großen Ast der Portalvene perfundiert nachdem kleinere Gefäße verschlossen worden waren. Primäre Hepatozyten wurden nach einer Standard-Kollagenase Perfusion und anschließender differenzieller Zentrifugation (bei 50 × g) gewonnen, wie oben beschrieben in der Prozedur für die Isolation primärer Hepatozyten für DHBV-Experimente.
HBV Infektion und Gentransfer durch rekombinantes HBV. Primäre humane Hepatozyten wurden am Tag 1 nach der Plattierung für 24 Stunden mit rHBV-S-GFP oder Wildtyp HBV inkubiert, verdünnt in "Maintenance Medium" so dass eine MOI von 500 erreicht wurde. Die GFP Expression wurde beobachtet wie in den Infektions-Experimenten beschrieben (oben).
Immunfluoreszenz Färbung und Western Blot Analyse intrazellulärer HBV Antigene. Für die Immundetektion intrazellulärer HBV Antigene wurde ein polyklonales Kaninchen Antiserum gegen das HBV Core-Protein verwendet, und detektiert durch einen geeigneten fluoreszenz-markierten Zweit-Antikörper. Für die direkte Detektion intrazellulärer HBV Proteine wurden infizierte humane Hepatozyten lysiert und einer Western-Blot Analyse unterzogen unter ähnlichen Bedingungen wie sie für die DHBV-infizierten PDH benutzt wurden (oben).
Beispiel 1: Herstellung von Enten Hepatitis B Virus (DHBV) Plasmid Konstrukten
Plasmid Konstrukte, die zur Transfektion von Zellen benutzt wurden, wurden aus dem parentalen Plasmid pCD 16 hergestellt, das ein Überlängen DHBV 16-Genom enthält (Nukleotid 2520 bis 3021/1 bis 2816) unter Kontrolle des CMV Immediate Early Promotor (Bartenschlager, R. et al. (1990) J. Virol. 64:5324-5332). Nach Transfektion des Plasmid in die Hühner Hepatom-Zellinie LMH (Condreay et al., (1990) J. Virol. 64:3249-3258) wurden genomische Transkripte produziert, die an der Position 2529 starteten und um das Nukleotid 2800 aufhörten (1A), die die Formation infektiöser DHBV Partikel hervorrufen (Obert et al., (1996) EMBO J. 15:2565-2574). pCD4 (Bartenschlager, R. et al. (1990) J. Virol. 64:5324-5332) ist ein Derivat des pCD16, das ein Überlängen DHBV-Genom enthält (Nukleotide 2589 to 2845), dem das 5' Verpackungs-Signal Dε fehlt (1B); es stellt alle Genprodukte in trans zur Verfügung, aber es ist selbst verpackungs-defizient und deshalb replikations-defizient (analoge HBV Konstrukte wurden beschrieben (Junker Niepmann et al., (1990) EMBO J. 9:3389-3396).
Als Marker wurde die fluoreszenz-verstärkte Variante (S65T/F64L, humanisierter Codon Gebrauch) des grün fluoreszierenden Protein (GFP), das im Plasmid pTR-UF5 vorhanden ist (Zolotukhin et al., (1996) J. Virol. 70:4646-4654), verwendet. Durch die Verwendung entsprechender Primer wurde das GFP Gen mittels PCR modifiziert, damit es terminal Restriktions-Schnittstellen bekam. Das erlaubte die Klonierung des GFP Gen zwischen die KpnI (Nukleotid Position 1290) und die BstEII (Nukleotid Position 1847) Schnittstelle im Plasmid pCD16, wodurch das S-Gen ersetzt wurde (1B). Mit 3196 Basenpaaren (bp) ist das resultierende rDHBV-S-GFP Genom 175 bp länger als das authentische DHBV (3021 bp). Alternativ wurde das Core- Gen Fragment von XbaI (Nukleotid Position 2662) bis HincII (Nukleotid Position 141), oder XbaI (Nukleotid Position 2662) bis BglII (Nukleotid Position 391) ersetzt; das linke Dε Signal und das PET Element blieben intakt. Um ein funktionelles Polyadenylierungs-Signal zu erhalten, wurde das kanonische AAUAAA Motiv sowie und die nachfolgende GU-reiche Sequenz beibehalten. Das Fremd-Protein, das durch das resultierende rDHBV-core-GFP Genom von 3299 bp und 3049 bp Länge kodiert wird, ist eine Fusion von GFP an die N-terminalen Aminosäuren 1 bis 5 und 39 bis 56 des Core Proteins.
Im Plasmid Konstrukt, rDHBV-S-GFP, ersetzt das GFP Gen im Wesentlichen das gesamte S-Gen mit Ausnahme der ersten vier Codons. Die Transkription einer subgenomischen mRNA vom rekombinanten DHBV Genom wie auch vom pCD16-S-GFP Expressions- Konstrukt erfolgt vom S- und möglicherweise auch vom Prä S-Promotor (Buscher et al., (1985) Cell 40:717-724); im letzteren Fall würde ein PräS-GFP Fusionsprotein produziert. In dem Konstrukt, in dem das Core-Gen ersetzt ist, wird eine GFP kodierende, in diesem Fall genomische mRNA vom starken CMV-IE Promotor im pCD16-core-GFP Plasmid getrieben, und vom genomischen HBV Promotor nach Formation rekombinanter Viren. Um entscheidende cis-Elemente im 5'-Anteil des Prä-Genomen zu erhalten, kodiert das Konstrukt, in dem das Core Gen ersetzt ist, eine N-terminale Fusion des GFP an die Aminosäuren 1 bis 5 und 39 bis 56 des DHBV Core Proteins.
Um zu testen, ob ausreichend funktionelles GFP exprimiert wird, wurden die Konstrukte pCD16-S-GFP und pCD 16-core-GFP in LMH Zellen transfiziert und die GFP Fluoreszenz beobachtet. Dies resultierte in einer hellen Grün-Fluoreszenz, die in den Core Ersatz-Konstrukten nach 24 Stunden und in den S-Ersatz-Konstrukten nach 48 Stunden leicht detektierbar war. Dieses Ergebnis zeigte, dass funktionelle mRNA sowie GFP Proteine unter dem CMV-IE Promotor (pCD 16-core-GFP) sowie unter dem endogenen PräS-/S-Promotor (pCD16-S-GFP) exprimiert wurden. Eine GFP-spezifische Western Blot Analyse von Extrakten pCD16-S-GFP transfizierter Zellen zeigte zwei nahe beieinander liegende Banden von etwas 30 kDa. Höchst wahrscheinlich entsprach das dem GFP Protein und einer Fusion des GFP an die ersten 4 Aminosäuren des S offenen Leserahmens, die von der Initiation der Translation am authentischen Start-Codon des S-Gen hervorgingen. Keine größeren Produkte wurde detektiert, die eine mögliche PräS-GFP-Fusion darstellen könnten.
Als ein Gen von potentiellem therapeutischen Nutzen wurde ein PCR-generiertes Fragment, das das gesamte Enten Typ-I IFN (DuIFN)(Schultz et al., (1995) Virology 212: 641-649) Gen kodieret, wurde in die gleiche Stelle in das S-Gen oder in das Core Gen in das DHBV Plasmid inseriert. Die entsprechenden rekombinanten Genome sind 3055 bp (rDHBV-S-IFN), und 3158 bp der 2908 bp (rDHBV-core-IFN) lang.
Um rekombinantes DuIFN zu produzieren, wurde das komplette DuIFN Gen in einen Expressions-Vektor unter Kontrolle des CMV-IE Promotor kloniert.
Im Folgenden ist eine weitere Beschreibung der Konstruktion und Produktion von rekombinantem DHBV:
Als Basis für die Konstruktion rekombinanter DHBV (rDHBV) Genome wurde das Plasmid pCD16 verwendet, das nach Transfektion infektiöse DHBV Partikel hervorbringt (Obert, S. et al. (1996) EMBO J. 15:2565-2574)(siehe 2). Es wurde darauf geachtet, keine Teile des DHBV Genoms zu beeinflussen, die cis-aktive Kontroll-Elemente beherbergen so wie die gut charakterisierte Replikations-Kontroll-Stelle (replication control region), die die Synthese, Verpackung und reverse Transkription des RNA Prä-Genom steuert (Seeger, C. & Hu, J. (1997) Trends in Microbiol. 5:447-450; Nassal, M. & Schaller, H. (1996) J. Viral. Hepat. 3:217-226; Ganem, D., Hepadnaviridae: The Viruses and Their Replication, in Fields Virology (eds. Fields, B.N., Knipe, D.M & Howley, P.M), pp. 2703-2737 (Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)) und andere weniger gut definierte Kontroll-Elemente, die vorwiegend an der RNA Reifung beteiligt sind (Obert, S., supra; Huang, J. & Liang, T.J. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:7476-7486; Huang, M. & Summers, J. (1994) J. Virol. 68:1564-1572; Clavert, J. & Summers, J. (1994) J. Virol. 65:2084-2090) (siehe 2). Initiale Untersuchungen zeigten an, dass der Ersatz des kleinen Hüllprotein (S) Gens durch Fremd-Sequenzen unter Erhalt der Länge des Wildtyp-Genome den vielversprechendsten Ansatz darstellten. Zwei analoge Konstrukte- in denen das Core Gen ersetzt wurde, brachten keine umhüllten DHBV-Partikel hervor, obwohl sich die Gesamt-Genom-Länge innerhalb der gleichen Grenzen befand und keine bekannten cis-aktiven Elemente beeinträchtigt wurden. In den Konstrukten, die für die weitere Verwendung ausgewählt wurden, wurden entsprechende an den Enden modifizierte Fragmente, die GFP (Zolotukhin, S. et al. (1998) J. Virol. 70:4646-4654)(pCD16-S-GFP) und Enten IFN Typ 1 (Schultz, U. et al. (1995) Virology 212:641-649)(pCD16-S-IFN) kodieren, an die ersten vier Codons des DHBV S-Gens fusioniert, so dass erwartet wurde, dass die Expression vom vorangehenden S-Promotor ausging (2).
Nach Transfektion des Plasmid pCD16-S-GFP wurde 48 Stunden nach Transfektion eine helle GFP Fluoreszenz erkennbar. Eine GFP-spezifische Western Blot Analyse von Extrakten pCD16-S-GFP transfizierter LMH Zellen zeigte zwei nahe beieinander Banden von etwa 30 kDa, die vermutlich GFP und eine DHBV-S/GFP-Fusion darstellten. Eine zusätzliche RNA, die vom DHBV PräS-Promotor initiieren könnte, könnte der Expression eines PräS/GFP-Fusions-Proteins dienen. Es wurden allerdings keine größeren Produkte detektiert, die einer solchen Fusion entsprechen könnten.
Ein Ersatz des S Gens zerstört den offenen Leserahmen für S, L und Polymerase. Für die Herstellung von rekombinantem Virus in transfizierten Hühner Hepatomzellen (Condreay et al., (1990) J. Virol. 64:3249-3258) wurden die korrespondierenden Proteine trans-komplementiert durch Transfektion des verpackungs-defizienten Helfers pCD4 (Schlicht et al., (1989) Cell 56:85-92; Bartenschlager, R. et al. (1990) J. Virol. 64:5324-5332). Das resultierte in der Produktion umhüllter rekombinanter DHBV (rDHBV), wie durch CsCl Dichte-Gradienten-Zentrifugation bestätigt wurde (Obert et al., (1996) EMBO J. 15:2565-2574). Virus Titer von rDHBV-GFP und rDHBV-IFN variierten zwischen 3 × 10⁷ und 2 × 10⁸/ml in verschiedenen Experimenten und waren vergleichbar zu denen von Wildtyp DHBV, das durch Transfektion von LMH Zellen hergestellt wurde (Obert et al., (1996) EMBO J. 15:2565-2574). Das Virus konnte durch Präzipitation mit Polyäthylenglykol ohne Verluste bis zu 50-fach konzentriert werden. Diese Daten zeigten, dass umhüllte, rekombinante Virionen, in denen virale Sequenzen durch fremde Gene ersetzt waren, effizient hergestellt werden können.
Beispiel 2: Herstellung Rekombinanter Enten Hepatitis B Virus (DHBV) Stocks
Hohe Titer viraler Stocks rekombinanter DHBV wurden durch die Transfektion des rekombinanten pCD 16 Plasmid in LMH Zellen produziert. Da der Ersatz des S und Core Gens essentielle virale Gene zerstört, wurde zur Transkomplemetation der entsprechenden Gen-Produkte des DHBV Transfer Plasmid (Horwich et al., (1990) J. Virol. 64:642-650; Schlicht et al., (1989) Cell 56:85-92) das verpackungs-defiziente Helfer-Plasmid pCD4 benutzt (1B), in dem Teile des Dε Signal am 5' -Ende deletiert waren. Konfluente LMH Zellen wurden am Tag vor der Transfektion 1:8 gesplittet, um zur Transfektion eine 30-40% Konfluenz zu erreichen. 50 μg des jeweiligen rekombinanten pCD16 Plasmid und 25 μg des Helfer Plasmid pCD4, das die fehlenden DHBV Proteine trans-komplementierte, pro 15 cm Schale wurden mittels der Standard Calcium-Phosphat Methode ko-transfiziert. Die DNA-Präzipitate wurden nach Über-Nacht-Inkubation (am Tag 1 nach Transfektion) herunter gewaschen, und das Zellkultur-Medium wurde am darauf folgenden Tag erneut ausgetauscht (Tag 2). Zellkultur-Medium, das rekombinante DHBV enthält, wurde am Tag 5 und Tag 8 abgesammelt. Virus Stocks wurden durch Präzipitation mit Polyäthylenglykol 20.000 (Endkonzentration 6.5%) bei 0°C konzentriert und in PBS/10% Glycerol bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren wurde vermieden.
Die Ko-Transfektion der pCD 16-core-GFP Konstrukte und des Helfer Plasmid pCD4 in LMH Zellen resultierte in einer hellen grünen Fluoreszenz, die 24 Stunden nach Transfektion leicht zu erkennen war. Mit den Konstrukten pCD16-S-GFP und dem pCD4 Helfer Plasmid dauerte die Entwicklung einer starken Fluoreszenz ungefähr 48 Stunden.
Die Formation rekombinanter Virionen wurde durch die Sedimentation in einen CsCl Gradienten festgestellt, der nackte DNA-haltige DHBV Core-Partikel von umhüllten Virionen abtrennt. 2 ml Aliquots der Zellkultur-Medien oder 200 μl Aliquots der konzentrierten Virus-Stocks, die in 1.8 ml PBS verdünnt waren, wurden auf einen CsCl Schritt-Gradienten aufgelagert (von unten nach oben : je 0.5 ml CsCl Lösung mit einer Dichte von 1.4, 1.3 und 1.2 sowie 20% Saccharose in H₂O) und ultrazentrifugiert (3.5 h bei 4°C, 58000 r.p.m. in einem SW60 Rotor), um umhüllte Virus Partikel von nackten Core-Partikeln zu separieren (Obert et al., (1996) EMBO J. 15:2565-2574). Zwölf 180 μl Fraktionen (unten nach oben) wurden abgesammelt und DNA wurde festgestellt durch Dot Blot Hybridisierung mit einer ³²P markierten Voll-Längen DHBV- oder GFP-Sonde (spezifische Aktivität ~10⁸ c.p.m./μg).
Zellkultur-Medium wurde am Tag 5 und am Tag 8 abgesammelt und einer Sedimentation in einem CsCl Schritt-Gradienten unterzogen, der nackte DNA-haltige DHBV Core-Partikel (Fraktionen 1 bis 4, unten nach oben) von umhüllten Virionen (Fraktionen 6 bis 8) abtrennt wie in 3 gezeigt (Obert et al., (1996) EMBO J. 15:2565-2574). Danach wurden individuelle Fraktionen mittels DNA Dot Blot analysiert unter Verwendung DHBV und GFP spezifischer Sonden. Im Falle des rDHBV-S-GFP war eine DNA Hybridisierung sowohl mit der GFP Sonde las auch mit der DHBV Sonde in den Fraktionen, die typisch für umhüllte Virionen sind, klar erkennbar (3), was anzeigte, dass rekombinante Virionen generiert worden waren. Im Gegensatz dazu generierte keines der beiden Core-GFP-Konstrukte ein eindeutig erkennbares Signal in den entsprechenden Fraktionen, und sie wurden daher in den weiteren Untersuchungen nicht mehr verwendet.
Virus Titer, gemessen als umhüllte DNA-haltige Partikel, wurden bestimmt durch den quantitativen Vergleich mit einer Verdünnungsreihe eines DHBV-DNA Standards auf dem gleichen Blot mithilfe eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Ca., USA). Für das rekombinante rDHBV-S-GFP Virus wurden Titer an DNA-haltigen umhüllten Partikeln zwischen 3 × 10⁷ und 2 × 10⁸ ml in verschiedenen Experimenten bestimmt durch Quantifizierung der Signal Intensität relativ zu einer Verdünnungs-Serie eines pCD 16 DNA Standards auf dem selben Blot. Somit waren die Titer rekombinanter Viren, die durch Trans-Komplementation erreicht wurden, vergleichbar zu denen von Wildtyp Virus aus transfizierten LMH Zellen (Obert et al., supra). Eine weitere Konzentration der Virus-Stocks konnte einfach durch eine Polyäthylenglykol-Präzipitation erreicht werden. Diese Experimente zeigen, dass der Ersatz eines 550 bp DHBV Fragmentes durch ein Fremd-Gen von 750 bp nicht mit der Bildung umhüllter Partikel interferiert. Die negativen Ergebnisse mit dem Core-GFP Konstrukt andererseits bestärken die Bedeutung der Auswahl einer geeigneten Stelle für den Ersatz eines Gens.
Beispiel 3: Isolation Primärer Enten-Hepatoryten
Primäre Enten-Hepatozyten (PDH) wurden nach Standard Methoden isoliert. Kurzgefasst, wurden die Lebern von zwei bis vier Wochen alten Enten-Küken unter Verwendung der Zwei-Schritt Kollagenase-Perfusion über die Pfortader perfundiert, Hepatozyten wurden drei Mal bei 50g sedimentiert und in einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml (2.5 × 10⁵/cm²) in 6- oder 12-well-Scahlen ausgesät (Galle et al., (1989) Hepatology 10:459-465). Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ in supplementviertem Williams E Medium (50 μg/ml Gentamycin, 50 μg/ml Streptomycin, 50 IU/ml Penicillin, 2.25 mM L-Glutamin, 0.06% Glucose, 23 mM HEPES- pH7.4, 4.8 μg/ml Hydrocortisone, 1 μg/ml Inosine, 1.5% DMSO) gehalten. DHBV positive PDH wurden von Küken gewonnen, die am ersten Tag nach dem Schlüpfen mit 100 μl DHB V 16 positivem Entenserum (10¹⁰ DNA Genom Äquivalente/ml) infiziert worden waren und von denen Serumproben, die am Tag 7 und am Tag 14 abgenommen waren, In einer DNA Dot Blot Analyse DHBV-positive getestet waren.
Es wurde berichtet, dass Nicht-Parenchymzellen der Leber (insbesondere Kupffer Zellen und Sinusoidale Endothel-Zellen) 3-20% aller Zellen in Kultur nach Kollagenase-Perfusion und differentieller Sedimentation von Hepatozyten stellen (Johnston et al., (1994) Hepatology 20:436-444). Endothel-Zellen und einige Kupffer-Zellen in den PDH Kulturen wurden auf der Basis der rezeptor-vermittelten Aufnahme von Dil-Ac-LDL (Paesel & Lorei, Duisburg, Germany (Irving et al., (1984) Gastroenterology 87:1233- 1247) nach Inkubation für 1 bis 2 Stunden identifiziert, das ist azethyliertes Low-Density Lipoprotein markiert mit einem rot fluoreszierenden Farbstoff.
Entsprechend dem beschriebenen Protokoll wurden primäre Hepatozyten von 16 bis 20-Wochen alten CH57BU6 Mäusen isoliert, auf Kollagen Typ I (Sigma Aldrich, Irvine, Ca., USA) beschichteten Zellkultur-Platten in "Maintenance Medium"/10% FCS in einer Dichte von 4-5 × 10⁵ Zellen/ml (10⁵/cm²) ausgesät und kultiviert wie oben beschrieben.
Beispiel 4: Infektion isolierter primärer Enten-Hepatozyten mit rekombinanten Enten Hepatitis B Virus (DHBV) Partikeln
Um die Infektiosität der rekombinanten Virionen zu untersuchen, wurden primäre Enten-Hepatozyten mit dem rDHBV in den ersten Tagen in Kultur infiziert (normalerweise Tag 2 nach Plattierung), rDHBV wurde in "Maintenance Medium" bis zur erwünschten MOI (gemessen als DNA-haltige umhüllte DHBV Partikel/Zelle) und auf PDH 24 Stunden inkubiert. Als Infektions-Kontrolle wurde Enten-Serum, das 10¹⁰/ml DNA Genom Äquivalente enthält, von einer 4-Wochen alten DHBV-positiven Ente gewonnen, die mit einem Standrad DHBV16 Stock infiziert worden war. Eine erfolgreiche Infektion mit Wildtyp DHBV wurde mittels Immunfluoreszenz-Färbung intrazellulärer viraler Antigene mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren gegen DHBV Proteine bestimmt (D084, das die PräS-Domäne des DHBV L-Protein detektiert, oder D087, das denaturiertes DHBV Core Protein erkennt) und einem DTAF-markierten Ziege-Anti-Kaninchen Zweit-Antikörper. Zudem wurde das Zellkultur-Medium auf Nachkommen-Virus mittels DNA Dot-Blot Analyse untersucht wie oben beschrieben.
Nach Infektion mit rDHBV-GFP wurden die kultivierten Zellen täglich nach grüner Fluoreszenz untersucht durch Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem Standard FITC Filter Satz und Exzitation bei blauem Licht (488 nm). Die GFP Expression wurde auch mittels Western Blot Analyse untersucht. Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Zellen deutlich grün fluoreszierten, wurden 10⁶ primäre Hepatozyten in 250μl Protein Proben-Puffer lysiert (200 mM Tris-HCl pH 8.8, 10% Glucose, 5 mM EDTA, 0.1% Bromophenol Blau, 3% SDS, 2%, β-Mercaptoethanol). Zusätzlich wurden Proteine aus Lysaten (in 10 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40) von 10⁷ transfizierten LMH Zellen mit polyklonalen Kaninchen Anti-PräS (D087) oder Anti-GFP-(Clontech, Palo Alto, Ca., USA)-Antikörpern und Protein A Sepharose immunpräzipitiert. Nach dem Waschen wurde das Pellet in 50 μl Protein Probenpuffer aufgenommen. 25 μl von jedem Lysat wurden in einer 10% SDS-PAGE separiert, auf eine PVDF Membran geblottet, mit polyklonalen Antiseren D084, D087 oder D188 gegen DHBV Proteine (D188 erkennt das DHBV S-Protein) oder mit einem polyklonalen Kaninchen Anti-GFP Antikörper immunmarkiert und mithilfe des ECL-Systems visualisiert (Amersham, Clevelund, Ohio, USA).
Die Infektiosität der rekombinanten Virionen wurde getestet, indem primäre Enten-Hepatozyten mit rDHBV-S-GFP mit unterschiedlichen MOIs (multiplicity of infection, gemessen als DNA-haltige umhüllte DHBV Partikel/primäre Zelle) von 2 bis 250 für 16 bis 24 Stunden infiziert wurden. Drei Tage nach der Infektion wurde eine schwache grüne Fluoreszenz sichtbar, die bis Tag 5 deutlich zunahm und am Tag 8 nach Infektion ein Maximum erreichte. Der Anteil grün fluoreszierender Zellen hing von der Höhe der MOI ab (siehe 4). Hohe MOIs von größer oder gleich 200 resultierten in bis zu 90% GFP positiven Zellen.
Eine stabile Expression des Fremdgens wurde so lange beobachtet, so lange lebende Hepatozyten in Kultur gehalten werden konnten mit einiger Variation der Intensität der grünen Fluoreszenz zwischen verschiedenen Hepatozyten. Eine Synthese von DHBV Core Protein durch rDHBV konnte, wie erwartet, durch Immunfluoreszenz Co-Färbung der GFP-positiven Hepatozyten sowie auch durch Western Blot Analyse von Hepatozyten-Lysaten nachgewiesen werden. GFP-spezifische Antikörper zeigten zwei nahe beieinander liegende Banden von etwa 30 kDa auf, die vermutlich das GFP und eine DHBV-S/GFP-Fusion darstellten. Es wurden jedoch keine größeren Produkte, die einem solchen Fusions-Protein entsprechen, detektiert.
Die Anzahl fluoreszierender Zellen war strikt dosis-abhängig. Da die rekombinanten Viren replikations-defizient sind, kann die Anzahl GFP-positiver Zellen als Maß für den infektiösen Titer der eindringenden Partikel genommen werden. Bei einer MOI von weniger als 5, zeigten nur einzelne Zellen eine grüne Fluoreszenz. Steigende MOIs von 20 bis 200 resultierten in 5-10% bis zu >90% GFP positiven Hepatozyten.
Die Intensität der grünen Fluoreszenz variierte zwischen benachbarten primären Hepatozyten. Western Blot des Zell-Lysates mit Anti-GFP Antikörpern zeigte wiederum zwei immunreaktive Banden um 30 kDa wie in transfizierten Zellen. Diese Daten beweisen einen effizienten Transfer und eine DHBV S-Promotor kontrollierte Expression eines Transgen durch ein rekombinantes Hepadnavirus.
Um zu untersuchen, ob hepadnavirale Vektoren selektiv auf Hepatozyten zielen, wurde die Zelltyp-Spezifität in vitro analysiert. Man weiß, dass primäre Hepatozyten Kulturen, die mittels Kollagenase-Perfusion und differentieller Sedimentation präpariert wurden, zwischen 3 und 20% Nicht-Parenchymzellen der Leber enthalten, hauptsächlich sinusoidale Endothel-Zellen und Kupffer Zellen (Johnston, D.E. & Jasuja, R. (1994) Hepatology 20:435-444). Diese können von Hepatozyten durch ihre rezeptor-vermittelte Aufnahme von azethyliertem LDL sowie durch ihre Fähigkeit zu phagozytieren abgegrenzt werden (Irving, M. et al. (1984) Gastroenterology 87:1233-1247; McCuskey, R. S. et al. (1984) Infect. Immun. 45:278-280). Keine dieser Nicht-Parenchym-Zellen, die etwa 15% der Gesamt-Zell-Population, die in den Experimenten verwendet wurden, ausmachten, zeigte eine GFP Expression, nicht einmal nach einer Infektion mir rDHBV-GFP in einer MOI von 250-500. In ähnlicher Weise wurde keine GFP Expression detektiert, wenn Maus-Hepatozyten (präpariert wie in Beispiel 3 beschrieben) mit einer hohen MOI infektiöser rDHBV-GFP inkubiert wurden. Diese Daten weisen darauf hin, dass der Transfer eines Transgenes durch rDHBV sowohl Hepatozyten- als auch Speziesspezifisch ist.
Um zu beweisen, dass rDHBV für einen lebergerichteten Gentransfer in vivo geeignet ist, wurden Enten-Küken am Tag nach dem Schlüpfen mit 10⁹ rDHBV-GFP Partikeln mittels intravenöser Injektion infiziert. Am Tag 7 nach der Infektion wurden fixierte Leber-Gewebsschnitte und isolierte Hepatozyten dieser Tiere mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie analysiert. GFP-fluoreszierende Hepatozyten konnten in beiden Proben detektiert werden (1 GFP-positive Zelle pro 10⁴ to 10⁵ Hepatozyten) und zeigten einen erfolgreichen in vivo Gentransfer durch rDHBV-GFP an.
Beispiel 5: Ein IFN Gentransfer durch rekombinante DHBV interferiert mit der Etablierung einer DHBV Infektion
Eine IFN-α Behandlung ist zur Zeit die Therapie der Wahl für die chronische Hepatitis B und C. Ein homologes Typ I Interferon aus Enten wurde kürzlich kloniert und es wurde gezeigt, dass die Zugabe des rekombinanten Proteins zu kultivierten fetalen PDH die DHBV Replikation hemmt (Schultz et al., (1995) Virology 212:641-649). Das Enten-Interferon wurde daher ausgewählt um zu untersuchen, ob ein potentiell therapeutisches Gen von einem hepadnaviralen Vektor ausgebracht werden kann, und ob das sekretierte Protein funktionell ist. Der Einschluss der authentischen DuIFN Signal Sequenz würde eine IFN Sekretion erlauben, die dann einen ähnlichen Effekt auf die DHBV Replikation ausüben sollte wie das extern zugegebene Zytokin.
Primäre Enten-Hepatozyten wurden mit rDHBV-IFN, oder rDHBV-GFP als Negativ-Kontrolle, und einem replikations-fähigen, aus Serum gewonnenen Wildtyp DHBV infiziert. Als Positiv-Kontrolle wurde IFN Protein am Tag 3 nach Infektion zu Wildtyp DHBV infizierten Hepatozyten gegeben, d.h. zu dem Zeitpunkt an dem man den Beginn der IFN Expression vermutete. Die Freisetzung von Nachkommen-Virus in das Zellkultur-Medium, resultierend aus einer produktiven Infektion mit Wildtyp DHBV, wurde durch eine DHBV-DNA Dot Blot Analyse belegt.
Unbehandelte Wildtyp DHBV infizierte Zellen und Zellen ko-infiziert mit rDHBV-GFP produzierten die gleichen Mengen an Nachkommen DHBV wie man in der Dot Blot Analyse abschätzte (siehe 5A). Im Gegensatz dazu wurde von Zellen, die mit rDHBV-IFN ko-infiziert wurde, etwa 20-mal weniger Nachkommen-DHBV (14- bis 24-fach in verschiedenen Experimenten) freigesetzt (5A). Ähnliche Reduktionen (16- to 25-fold) wurden bei der Behandlung mit rekombinantem IFN erhalten (5A). Gleichfalls wurde eine starke Unterdrückung der Mengen an intrazellulärem DHBV Core- und L-Protein detektiert mittels Western-Blot Analyse von Zell-Lysaten, die am Tag 7 nach Infektion präpariert wurden (5B). 5C zeigt eine quantitative Evaluation des Zeitablaufs der DHBV Produktion (DHBV-DNA Äquivalente). Diese Daten zeigen, dass ein funktionelles Zytokin, das nach hepadnaviralem Gentransfer exprimiert wird, mit der Etablierung einer hepadnaviralen Infektion in vitro interagiert.
Beispiel 6: Rekombinantes DHBV überinfiziert DHBV-infizierte Hepatozyten
Für eine Gentherapie-Anwendung bei der Behandlung einer chronisch viralen Hepatitis müssen rekombinante Hepadnaviren in der Lage sein, eine Leber mit einer etablierten viralen Infektion zu überinfizieren. Um zu zeigen, dass sogar eine Überinfektion mit dem homologen Virus möglich ist, wurden primäre Hepatozyten aus produktiv mit DHBV infizierten Enten benutzt, die alle auf DHBV S-Protein angefärbt werden konnten, was eine produktive Infektion indiziert. Eine Inkubation mit rDHBV-GFP in MOIs, die von 25 bis 100 reichten, erzielte 1-4% GFP-positive Hepatozyten (siehe 6). Obwohl diese Transduktions-Effizienz etwa 20-fach niedriger ist als die, die man in Hepatozyten-Kulturen beobachten konnte, die nicht mit DHBV vorinfiziert waren, bewies die Ko-Expression von GFP in S-positiven Zellen, dass Zellen mit einer etablierten Wildtyp DHBV Infektion mit rDHBV-GFP überinfiziert werden können.
Beispiel 7: Ein IFN Gentransfer unterdrückt eine etablierte DHBV Infektion
Um zu testen, ob ein hepadnaviraler Zytokin Gentransfer prinzipiell für eine Gentherapie der chronischen Hepatitis B geeignet ist, wurden DHBV-positive Hepatozyten mit rDHBV-IFN überinfiziert und die Freisetzung von Nachkommen-DHBV überwacht wie oben beschrieben. Wie in 7 gezeigt ist, war die DHBV Produktion im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle in einer Dosis-abhängigen Weise zwischen 1.7 (bei einer MOI von 25) und 4.5-fach (bei einer MOI von 75) vermindert, und ein ähnlicher Effekt wurde bei einer Behandlung mit dem Zytokin Protein beobachtet in der Dosis, die einen maximalen Effekt hat (4.1-fache Reduktion). Keine Veränderung der DHBV Nachkommen-Produktion wurde bei einer Überinfektion mit rDHBV-GFP gesehen, was indiziert, dass die Inhibition durch das transduzierte IFN Gen verursacht war.
Beispiel 8. Produktion von Rekombinantem HBV
Als Basis für die Konstruktion rekombinanter Hepatitis B Virus Genome, die ein GFP Gen tragen, haben wir das Plasmid pCH-9/3091 verwendet, das nach Transfektion zur Produktion infektiöser HBV Partikel führt (Obert, S. et al. (1996) EMBO J. 15: 2565-2574) (2). Wie bei der Konstruktion der rekombinanten DHBV wurde darauf geachtet, weder die authentische Genom Länge zu überschreiten noch cis-aktive Kontroll-Elemente zu beeinträchtigen (Ganem, D. (1996) in Hepadnaviridae: The Viruses und Their Replication, eds. Fields, B.N., Knipe, D.M., und Howley, P.M., Lippincott: Philadelphia, vol. 2: 2703-2737; Nassal, M. und Schaller, H. (1996) J. Viral. Hepat. 3:217-226); und Seeger, C. & Hu, J. (1997) Trends in Microbiol. 5: 447-450), und ähnlich zu den Befunden der DHBV Experimente stellte sich heraus, dass nur die Substitution des kleinen Hüllprotein (S) Gens durch Fremd-Sequenzen (2) erfolgreich ist.
Das Plasmid pCH-S-GFP brachte 36 bis 38 Stunden nach Transfektion in geeignete Hepatomzellen eine starke GFP Fluoreszenz hervor, was eine funktionelle Insertion des Fremd-Gens zeigte. Da der Ersatz des S-Gens sowohl die Hüllprotein- als auch die Polymerase-Leserahmen zerstörte, wurden für die Herstellung rekombinanter Viren die korrespondierenden Genprodukte in trans komplementiert (Condreay, L.D. et al. (1990) J. Virol. 64:3249-3258; Schlicht, H.J. et al. (1989) Cell 56: 85-92) durch die Ko-Transfektion des verpackungs-defizienten Helfer Konstruktes pCH3142 (Schlicht, H.J. et al. (1989) Cell 56: 85-92, Bartenschlager, R. et al. (1990) J. Virol. 64: 5324-5332). Das resultierte in der Produktion umhüllter rekombinanter HBV (rHBV) in Titern zwischen 10⁸ und 10⁹/ml. Das Virus konnte durch Polyäthylenglykol-Präzipitation bis zu 50-fach konzentriert werden ohne Einbuße an Infektiosität.
Beispiel 9: Erfolgreicher Gentransfer in humane Hepatozyten mittels rekombinanter HBV Vektoren.
Die Infektiosität der rekombinanten Virus-Partikel wurde durch die Inkubation primärer humaner Hepatozyten mit gleichen Mengen von rHBV-GFP und Wildtyp HBV gezeigt. Hierbei fand man, dass mit jedem der beiden Viren eine von 10² Hepatozyten infiziert war, wenn man eine spezifische Immunfluoreszenz-Färbung für HBV Core- Protein als Assay für infizierte Zellen benutzt. Man nahm an, dass die Infektiosität des rekombinanten Virus vergleichbar mit der des Wildtyp Virus ist. Eine von 10⁴ Hepatozyten zeigte eine deutlich erkennbare GFP Fluoreszenz, die ein Maximum am Tag 12 nach Infektion ereichte. Bedingt durch den hohen Fluoreszenz-Hintergrund humaner Leberzellen konnte eine schwache GFP Fluoreszenz nicht eindeutig identifiziert werden. Durch diese technische Limitation bei der Detektion des GFP wurden für die Messung der Transduktions-Effizienz Assays bevorzugt, die das HBV Core Protein nachweisen.
Beispiel 10. Der hepadnavirale Gentransfer durch HBV ist spezies- und hepatozyten-spezifsch
Um zu testen, ob HBV selektiv auf Hepatozyten zielen, haben wir die Zelltyp-Spezifität in vitro analysiert. Die Inkubation von Enten-Hepatozyten mit rHBV-GFP oder von Maus-Hepatozyten mit rHBV-GFP führte nicht zur Expression von GFP. In Kombination mit den Daten (Beispiel 9), die zeigen, dass GFP nach Infektion humaner Hepatozyten mit rHBV-GFP exprimiert ist, weisen diese Daten darauf hin, dass das Ausbringen eines Transgen mittels rHBV spezies-spezifisch ist. Kombiniert mit den Daten (Beispiel 4), die zeigen, dass weder sinusoidale Endothel-Zellen noch Kupffer-Zellen GFP exprimieren, weisen diese Daten darauf hin, dass das Ausbringen des Transgen durch hepadnavirale Vektoren spezies- und hepatozyten-spezifisch ist.

Claims

Eine in-vitro Methode zur Expression eines heterologen Gens in Hepatozyten, die folgendes umfasst: – Bereitstellung replikationsdefizienter hepadnaviraler Partikel, in denen eine Region von mindestens etwa 200 Nukleotiden des S-Gens des hepadnaviralen Genoms durch ein heterologes Gen von etwa 200 bis etwa 1200 Nukleotiden ersetzt ist, so dass die Expression des heterologen Gens unter Kontrolle regulatorischer Sequenzen des S-Gens steht, in einem Titer, der ausreicht, um Hepatozyten zu infizieren; und – die Infektion von Hepatozyten mit dem Hepadnavirus, so dass das heterologe Gen in die Hepatoyzyten eingebracht wird und in den Hepatozyten exprimiert wird.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei die replikationsdefekten hepadnaviralen Partikel humane Hepatitis B Virus Partikel sind.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen so in das S-Gen eingefügt ist, dass Nukleotide, die für mindesten eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, an das 5' Ende des Leserahmens des heterologen Gens fusioniert sind.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen die Sequenz des S-Gens ersetzt.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen nach dem authentischen AUG Triplet des S-Gens inseriert ist, und das heterologe Gen so inseriert ist, dass Nukleotide, die für mindesten eine Aminosäure des S-Proteins kodieren, an das 5' Ende des Leserahmens des heterologen Gens fusioniert sind.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen für ein modulierendes Agens kodiert.
Die Methode nach Anspruch 6, wobei das modulierende Agens ein Zytokin ist.
Die Methode nach Anspruch 7, wobei der das modulierende Agens aus der Gruppe bestehend aus IFNβ, IFN-γ, TNFα, IL-18 and IL-12 ausgewählt ist.
Die Methode nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen ein therapeutisches Gen ist.
Ein replikationsdefizientes hepadnavirales Partikel, in dem eine Region von mindestens etwa 200 Nukleotiden des S-Gens des hepadnaviralen Genoms durch ein therapeutisches Gen von etwa 200 bis etwa 1200 Nukleotiden ersetzt ist, so dass die Expression des therapeutischen Gens unter Kontrolle regulatorischer Sequenzen des S-Gens steht.
Das replikationsdefiziente hepadnavirale Partikel nach Anspruch 10, bei dem das therapeutische Gen für ein Zytokin kodiert.
Das replikationsdefiziente hepadnavirale Partikel nach Anspruch 11, bei dem das Zytokin aus der Gruppe TNFα, IFNβ, IL-18 und IFN-γ und IFNα ausgewählt ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das replikationsdefiziente hepadnavirale Partikel nach Anspruch 10 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Eine pharmazeutische Komposition, die das replikationsdefiziente hepadnavirale Partikel nach Anspruch 10 und einen Helfervirus umfasst.
Eine Methode zur Herstellung therapeutischer replikationsdefizienter hepadnaviraler Partikel in einem Titer, der ausreicht, um Hepatozyten zu infizieren, die folgendes umfasst: – Ko-Transfektion von Zellen einer Hepatom-Zelllinie mit (i) replikationsdefizienten hepadnaviralen Konstrukten, in denen eine Region von mindestens etwa 200 Nukleotiden des S-Gens des hepadnaviralen Genoms durch ein therapeutisches Gen von etwa 200 bis etwa 1200 Nukleotiden unter Kontrolle regulatorischer Sequenzen des S-Gens ersetzt ist; und (ii) einem Helfer Konstrukt – Kultivierung dieser Zellen, bis infektiöse virale Partikel produziert werden, und – Aufreinigung der infektiösen viralen Partikel.
Die Methode nach Anspruch 15, wobei das therapeutische Gen für ein Zytokin kodiert.
Die Methode nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Hepatom-Zelllinie eine Helfer-Zelllinie ist, die stabil mit einem Helfer-Konstrukt transfiziert ist.
Eine in-vitro Methode zur Herstellung replikationsdefizienter rekombinanter Hepadnavirus Partikel mit der Fähigkeit, ein heterologes Gen von etwa 200 bis etwa 1200 Nukleotiden in Hepatozyten zu exprimieren, die folgendes umfasst: – das Ersetzen von mindestens etwa 200 Nukleotiden des S-Gens in einem Hepatitis B Virus Genom durch ein heterologes Gen, so dass die Expression des heterologen Gens durch den S-Promotor reguliert ist; – Transkomplementation eines replikationsdefizienten Hepadnavirus mit Hilfe eines Helfer-Plasmids, dass die fehlenden hepadnaviralen Genprodukte exprimiert; – Infektion von Hepatozyten mit dem Hepadnavirus, wobei das heterologe Gen in die Hepatozyten eingebracht und in den Hepatozyten exprimiert wird.
Ein rHBV Genom, in dem mindestens etwa 200 Nukleotide eines S-Gens im HBV Genom deletiert und durch ein heterologes Gen von etwa 200 bis zu etwa 1200 Nukleotiden unter Kontrolle des endogenen S Promotors ersetzt sind, und in dem die Sequenzen, die für die reverse Transkription notwendig sind, erhalten sind.
Das rHBV Genom nach Anspruch 19, wobei das heterologe Gen für ein Zytokin kodiert.
Das rHBV Genom nach Anspruch 20, wobei das Zytokin aus der Gruppe bestehend aus IFNα, IFNβ, IFN-γ, TNFα, IL-18 oder IL-12 ausgewählt ist.