CN114316071B

CN114316071B - 一种重组腮腺炎病毒颗粒、组合物及其用途

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Publication number: CN114316071B
Application number: CN202111643483.3A
Authority: CN
Inventors: 黄耀伟; 宗明瑞; 徐令东; 王斌; 杨永乐; 张雅晴
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114316071A

Abstract

本发明涉及一种重组腮腺炎病毒颗粒、组合物及其用途。本发明的重组腮腺炎病毒颗粒具有效率高、预防性好和安全性好的效果。因此，本发明的重组腮腺炎病毒颗粒和包含该重组腮腺炎病毒颗粒的组合物能够有效地预防和治疗新冠病毒。

Description

一种重组腮腺炎病毒颗粒、组合物及其用途

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及一种重组腮腺炎病毒颗粒、包含该重组腮腺炎病毒颗粒的组合物，以及该组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的疫苗中的用途，或该组合物在制备预防和/或治疗受试者中新冠病毒感染引起的疾病或病况的药物中的用途。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原。新冠病毒自爆发以来不断发生突变和变异，不同的变异株其传播的难易程度、相关疾病的严重程度或疫苗、治疗药物的效用等有较大差别。目前，世界卫生组织宣布了使用希腊字母表的新冠病毒变异株的新命名系统，包括五种“关切变异株”——阿尔法(Alpha)、贝塔(Beta)、德尔塔(Delta)、伽马(Gamma)和奥密克戎(Omicron)。其中，德尔塔株传播能力比阿尔法株高60％，疫苗针对德尔塔株使用效果也弱于阿尔法株，德尔塔株有望成为世界主要流行株。

预防性疫苗接种仍然是预防病毒感染最有效的方法。目前研发的新型冠状病毒疫苗主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗等。灭活疫苗是选用普遍流行的及免疫原性良好的毒株等进行人工培养，用化学或物理的方法将其灭活，使其丧失传染性，但仍保其留免疫原性。其优点是安全、不存在散毒的危险，便于贮存和运输，产生抗体水平高；其缺点是引起细胞介导免疫的能力较弱，免疫力产生较慢，通常在接种2周后才能获得良好的免疫力。减毒活疫苗的显著优势在于相对较小的病毒剂量足以诱导强力免疫，生产运输等成本较低，但与之相对的是仍存在一定传播风险，不能排除病毒毒力返强的可能。重组蛋白疫苗由体外收获和高度纯化的病毒蛋白抗原组成，被认为比减毒和灭活疫苗更安全，但通常重组蛋白未显示病毒的全部抗原复杂性，其免疫原性潜力和保护效力受到质疑。核酸疫苗采用遗传物质(DNA或RNA)被宿主细胞吸收并翻译成蛋白质以引发免疫反应，以mRNA疫苗为代表，具有高效率、高效益的优势，但其快速的开发速度以及与其相关的潜在长期不良反应的不确定性同样令人担忧，特别是此前没有任何获批使用的mRNA疫苗。病毒载体疫苗可分为复制型和非复制型，优点是宿主范围广，对人致病性低，人体免疫后能在体内持续增殖，安全性好，不整合到人的基因组中；缺点则是非复制型如腺病毒载体存在体内预存抗体而影响免疫效果。在人体中针对Ad5型腺病毒的预存抗体对以Ad5为载体的腺病毒载体疫苗诱导的免疫反应产生抑制。

由于新冠病毒感染的严重性，以及新冠病毒不断变异对有效预防和/或治疗新冠病毒感染带来的挑战，使得目前研发的新型冠状病毒疫苗无法有效地防治新冠病毒感染。因此亟需针对新冠病毒有效的治疗和预防措施。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提出一种重组腮腺炎病毒颗粒、包含该重组腮腺炎病毒颗粒的组合物及其用途。本发明的重组腮腺炎病毒颗粒具有效率高、预防性好和安全性好的效果。因此，本发明的重组腮腺炎病毒颗粒和包含该重组腮腺炎病毒颗粒的组合物能够有效地预防和治疗新冠病毒。

基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种重组腮腺炎病毒颗粒，其中，在腮腺炎病毒基因组负链RNA序列中包含与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列；

其中，与野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白相比，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体包含以下突变：

(a)消除或破坏了野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的S1亚基和S2亚基连接处存在的Furin蛋白酶酶切位点。

本发明的第二个方面提供了一种组合物，其包含上述重组腮腺炎病毒颗粒；

优选地，所述组合物为疫苗组合物。

本发明的第三个方面提供了上述重组腮腺炎病毒颗粒或上述组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的疫苗中的用途。

本发明的第四个方面提供了上述的重组腮腺炎病毒颗粒或上述组合物在制备预防和/或治疗受试者中新冠病毒感染引起的疾病或病况的药物中的用途。

本发明的第五个方面提供了一种新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体，其中，与野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白相比，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体包含以下突变：

本发明的第六个方面提供了一种多核苷酸序列，其编码上述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体；

优选地，所述多核苷酸序列是经过密码子优化的；

更优选地，所述多核苷酸序列是针对哺乳动物密码子优化的；

进一步优选地，所述多核苷酸序列为新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白变体的密码子优化后的多核苷酸序列和新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白变体的密码子优化后的多核苷酸序列，其分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

本发明的第七个方面提供了一种核酸构建体，其包含上述多核苷酸序列；

优选地，所述多核苷酸序列可操作地连接至编码腮腺炎病毒反基因组正链RNA的cDNA序列；

更优选地，所述多核苷酸序列可操作地连接至编码腮腺炎病毒反基因组正链RNA的cDNA序列的N末端；

进一步优选地，所述多核苷酸序列插入到编码腮腺炎病毒反基因组正链RNA的cDNA序列的P基因与M基因之间。

本发明的第八个方面提供了一种抗原表达质粒，其包含上述核酸构建体；

优选地，所述抗原表达质粒为真核抗原表达质粒；

更优选地，所述抗原表达质粒为酵母-大肠杆菌穿梭质粒；

进一步优选地，所述抗原表达质粒为pYES2-rMuV-SC2-WH质粒或pYES2-rMuV-SC2-Delta质粒。

本发明的第九个方面提供了一种宿主细胞，其通过用上述核酸构建体或上述抗原表达质粒转染获得。

本发明的第十个方面提供了一种反向遗传系统，其包含上述抗原表达质粒，以及辅助质粒或辅助细胞系；

优选地，所述辅助质粒包括：

1)含有编码腮腺炎病毒的核衣壳蛋白的基因的辅助质粒1；

2)含有编码腮腺炎病毒的磷蛋白的基因的辅助质粒2；和

3)含有编码腮腺炎病毒的RNA聚合酶的基因的辅助质粒3；

优选地，所述辅助细胞系为包含编码腮腺炎病毒的核衣壳蛋白的基因、编码磷蛋白的基因和编码RNA聚合酶的基因且能够表达这三种蛋白的细胞；

更优选地，所述抗原表达质粒和辅助质粒均为包含T7启动子的质粒；

进一步优选地，所述辅助质粒1、辅助质粒2和辅助质粒3分别为pT7-S79-N质粒、pT7-S79-P质粒和pT7-S79-L质粒。

本发明的第十一个方面提供了一种制备重组腮腺炎病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：

1)将上述反向遗传系统中的抗原表达质粒和辅助质粒共转染至第一细胞系；

或者将上述抗原表达质粒转染至辅助细胞系；

2)转染后收集细胞上清液，并将细胞上清液感染第二细胞系并培养；

3)收集细胞上清液并纯化，从而获得重组腮腺炎病毒颗粒；

优选地，所述抗原表达质粒与辅助质粒1、辅助质粒2和辅助质粒3的质量比为10:(3～4):(3～4):1；和/或

优选地，所述第一细胞系为BHK-T7细胞系，所述第二细胞系为Vero细胞系。

与新型冠状病毒灭活疫苗和腺病毒载体新冠疫苗相比，本发明的重组腮腺炎病毒载体新冠疫苗优势明显。

在本发明中，以腮腺炎病毒S79疫苗株作为重组疫苗载体平台，插入新冠病毒融合前的S三聚体蛋白基因，可以有效表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白，获得表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒颗粒以作为新冠病毒有效的候选疫苗株。本发明的重组腮腺炎病毒颗粒具有以下有益效果：

1)效率高：本发明的重组腮腺炎病毒颗粒出毒率高，稳定性也高，在生产过程中容易获得高滴度高质量的重组腮腺炎病毒颗粒。

2)预防性好：能够产生较高的中和抗体滴度，通过气雾吸入或鼻内接种途径可以诱导黏膜免疫，能够有效地预防和治疗新冠病毒；同时能用于防止腮腺炎病毒感染。

3)安全性好：本发明的重组腮腺炎病毒颗粒疫苗以腮腺炎病毒疫苗株rMuV-S79为骨架，S79株腮腺炎疫苗在中国已有30多年使用历史，有效地控制了我国腮腺炎的发病率，并于2008年被列入国家扩大免疫规划(EPI)。

附图说明

图1为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒感染性克隆质粒pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta的构建示意图。

图2为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒分段扩增示意图。

图3为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒分段扩增结果检测图。

图4为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒感染性克隆质粒pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta琼脂糖凝胶电泳验证结果图。

图5为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒拯救检测的致细胞病变效应(CPE)结果图，箭头处指示出现细胞合胞体病变。

图6为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒拯救传代至第15代(p15)检测的RT-PCR检测结果图，其中P5是指传代至第5代，P10是指传代至第10代，P15是指传代至第15代。

图7为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒拯救检测的间接免疫荧光法检测结果图。

图8为用非变性胶检测重组腮腺炎病毒感染Vero细胞后新冠病毒S三聚体蛋白的表达。

图9为表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒在Vero细胞中一步生长曲线测定结果图。

图10A为通过ELISA测定的MuV特异性抗体水平。

图10B为新冠病毒S三聚体蛋白特异性抗体水平。

图10C为抗新冠病毒类病毒中和抗体水平。

具体实施方式

需要说明的是，除非另外定义，本说明书实施例使用的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

定义

如本文所用，术语“融合前三聚体构象”是指包含三个S1亚基和三个S2亚基的三聚体构象，其中S1亚基未被切割。

如本文所用，术语“密码子优化的”是指为在特定细胞类型中表达而经密码子优化，特别是可以为人密码子使用而修饰。

如本文所用，术语“可操作地连接”在本发明中指核酸构建体或载体中的不同多核苷酸之间存在的功能性连接，由此所述不同的多核苷酸和核酸构建体有效转录，并且在适当的情况下翻译，特别是在细胞或细胞系中，尤其是在用作拯救系统的一部分产生本发明的重组感染性腮腺炎病毒颗粒的细胞或细胞系或宿主细胞中。

腮腺炎病毒的减毒株指在选取的细胞上经系列传代并且可能地，适应于其他细胞以产生适于制备疫苗株的种子毒株的毒株，其具有不允许回复到病原性也不整合入宿主染色体的稳定基因组。作为具体的“减毒株”，经确证的用于疫苗的毒株是适于本发明的减毒株，其满足FDA(美国食品和药物管理局)限定的规则，即经过对实验室和临床数据严格的审阅后，其满足安全性、效力、质量和重复性规则。腮腺炎病毒的“减毒株”定义为在相同宿主中无毒或比母株低毒的毒株，施用于宿主时保留免疫原性以及可能的佐剂性。

如本文所用，术语“重组腮腺炎病毒”或“重组腮腺炎病毒颗粒”可以互换使用，其意指腮腺炎病毒囊膜包裹的基因组负链RNA中含有异源多核苷酸，例如来自其他病毒的异源多核苷酸。

如本文所用，术语“负链RNA”，例如腮腺炎病毒基因组的负链RNA，是指不能作为mRNA起作用，必须先合成互补链(正链RNA)作为mRNA，再进行蛋白质翻译的RNA。相应地，其互补序列称为正链RNA序列。腮腺炎病毒基因组负链RNA对应的正链RNA又称为反基因组正链RNA。

在本文中，腮腺炎病毒的核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、小疏水蛋白、血凝素神经氨酸酶和RNA聚合酶大蛋白也可称为“N蛋白”、“P蛋白”、“M蛋白”、“F蛋白”、“SH蛋白”、“HN蛋白”和“L蛋白”。这些成分在现有技术中已经鉴定，并公开于Virologie(MourezT&Dina J，2018)中。蛋白HN、F和M构成病毒的包膜并且负责病毒附接、膜融合和病毒进入。在本文中，腮腺炎病毒的M基因是指编码M蛋白的基因，腮腺炎病毒的P基因是指编码P蛋白的基因，腮腺炎病毒的其他基因的定义依次类推。

在本文中，“成人”是指年满18岁或以上的人；“儿童”是指18岁以下的任何人。

在本发明中，序列比对、确定序列同一性百分比和对应序列位置可以根据本领域中已知的一些软件进行，例如BLAST程序、CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)、MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)或MUSCLE(Multiple Sequence Alignment)，以这些网站指示的缺省参数来探查(例如比对)获得的序列。如本文使用的，当关于比对氨基酸序列的特定对使用时，术语“同一性”或“百分比同一性”指氨基酸序列同一性百分比，其通过计数在比对中的相同匹配数目，并且将这样的相同匹配数目除以比对序列的长度来获得。

例如，可以通过Needleman-Wunsch总体比对和评分算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)计算同一性，如通过作为EMBOSS软件包的部分分配的“Needle”程序执行的(Rice，P.等人(2000)EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite，Trends in Genetics 16(6):276-277，在其他资源中，可在embnet.org/resource/emboss和emboss.sourceforge.net处从EMBnet获得的版本6.3.1)，使用默认缺口罚分和评分矩阵(用于蛋白质的EBLOSUM62和用于DNA的EDNAFULL)。

另外的数学算法是本领域中已知的并且可以用于比较两个序列。可以用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)执行BLAST蛋白质搜索，以获得与S蛋白同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述利用。可替代地，PSI-Blast可以用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系(参见Altschul等人，同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过检查手动执行。

关于与参考序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”在比对中与残基配对的参考序列中的位置。“位置”由数目指示，该数目基于其相对于N末端的位置依次鉴定参考序列中的每个氨基酸。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，一般而言，如通过从N末端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的数目相同。例如，在其中比对的测试序列中存在缺失的情况下，在缺失位点处没有氨基酸对应于参考序列中的位置。当比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可以存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。

本发明涉及新冠病毒不同变异株融合前S三聚体抗原蛋白、以腮腺炎病毒作为载体重组表达新冠病毒不同变异株(原型株和德尔塔株)融合前S三聚体抗原蛋白、产生融合前S三聚体抗原蛋白的重组腮腺炎病毒颗粒、包含此类重组腮腺炎病毒颗粒的组合物，特别是疫苗组合物，包括注射和气雾吸入接种途径，以及其在预防和/或治疗新冠病毒感染中的用途。具体地，本发明人基于现有的减毒腮腺炎病毒株的基因组序列，通过DNA重组克隆插入编码新冠病毒不同变异株融合前S三聚体抗原蛋白的多核苷酸序列，从而构建携带源自新冠病毒的一种或多种异源多核苷酸的腮腺炎病毒表达载体(即重组腮腺炎病毒颗粒)，以用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的疫苗。

新型冠状病毒SARS-Cov-2(也称为2019-nCoV，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，与其他冠状病毒一样，SARS-Cov-2病毒颗粒是球形的且具有在其表面呈刺突状的S蛋白(又称为刺突蛋白，Spike glycoprotein)。这些刺突粘附到人细胞上，引起允许病毒膜与细胞膜融合的结构变化，然后病毒基因可以进入宿主细胞进行复制，产生更多的病毒。

因此，S蛋白是新冠病毒的主要抗原，负责病毒与受体结合，具有良好的免疫原性。天然S蛋白包含跨膜区和胞内区以及在囊膜表面的胞外区，胞外区有两个亚基：S1和S2，其中S1亚基中包含受体结合位点(RBD)以介导S1亚基与受体(例如血管紧张素转化酶2(ACE2)受体)结合，S2亚基促进膜融合，从而有助于病毒进入细胞。

包括新冠病毒在内的所有冠状病毒的S蛋白在病毒表面均呈现三聚体结构，即S蛋白以三聚体形式存在，其包含三个S单体，每个S单体可以分为S1亚基和S2亚基。换而言之，S蛋白由三个S1亚基和三个S2亚基构成。天然的S蛋白三聚体有两种不同的构象：融合前的结构存在于成熟的病毒体上，呈丁香状，三个S1头位于三聚化S2茎的顶部；融合后结构为膜融合状态，呈哑铃状，三个S2亚基重排，形成一个六个螺旋束的结构。来自不同冠状病毒属的S2的结构在融合前和融合后状态均相似，但来自不同属的S1亚基在结构上存在差异，并且识别多种宿主细胞受体。S蛋白三聚体形式是其天然形态，如果阻断S蛋白与受体的结合，新冠病毒将无法入侵细胞。

在野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白中，S1亚基和S2亚基的连接处存在Furin蛋白酶酶切位点(如SEQ ID NO:1所示的S蛋白第682-685位的氨基酸残基，RRAR，“RRAR”序列符合Furin蛋白酶酶切位点的识别模式“RXXR”)，在通过RBD(受体结合区域)结合易感细胞表面后，细胞膜表面Furin蛋白酶剪切该酶切位点，使得S蛋白的S1结构域解离脱落，剩下的S2结构域负责病毒膜与细胞膜的膜融合作用，即为融合后构象。

1.重组腮腺炎病毒颗粒

野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白包含S1亚基和S2亚基，且S1亚基和S2亚基连接处存在Furin蛋白酶酶切位点。通过破坏野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的S1亚基和S2亚基连接处存在的Furin蛋白酶酶切位点以防止S1亚基被剪切，保留了S1亚基且因此保持S蛋白融合前构象，形成包含三个S1亚基和三个S2亚基的S蛋白三聚体。如本发明所验证的，保持S蛋白融合前构象有利于免疫后中和抗体的产生，在重组腮腺炎病毒中表达S蛋白三聚体可以诱导产生强烈、有针对性的免疫反应，进而起到良好的保护效果。

因此，本发明的第一个方面提供了一种重组腮腺炎病毒颗粒，其中，在腮腺炎病毒基因组负链RNA序列中包含与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列；

与野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白相比，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体包含以下突变：

本发明的新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体在表达后能够形成包含三个S1亚基和三个S2亚基的S蛋白三聚体。

在本发明的一些实施方案中，所述Furin蛋白酶酶切位点位于：如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第682位至第685位，本发明可以对如SEQ IDNO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第682位至第685位的一个或多个氨基酸残基进行添加、删除和/或取代；

优选地，如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第682位至第685位的多个氨基酸残基的取代，例如保守性取代；

更优选地，如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第682位、第683位和/或第685位的氨基酸残基的取代；

进一步优选地，如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第682位、第683位和/或第685位的氨基酸残基发生R682G/R683S/R685S取代，具体为：

第682位的氨基酸残基由R取代为G；

第683位的氨基酸残基由R取代为S；

第685位的氨基酸残基由R取代为S；

即由原始的RRAR突变为GSAS。

在本发明的一些实施方案中，与野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白相比，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体还包含以下突变：

(b)促进新冠病毒融合前S三聚体蛋白的构象稳定化的突变；

优选地，所述促进新冠病毒融合前S三聚体蛋白的构象稳定化的突变包括：

如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第986位、第987位、第817位、第892位、第899位和/或第942位的一个或多个氨基酸残基的添加、删除和/或取代；

更优选地，如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第986位、第987位、第817位、第892位、第899位和/或第942位的多个氨基酸残基的取代；

如本领域中技术人员所理解的，所述突变也可以是取代为其他氨基酸，只要也能实现S蛋白融合前三聚体构象稳定化并且不干扰S蛋白的正常折叠。

进一步优选地，如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的第986位、第987位、第817位、第892位、第899位和/或第942位发生K986P/V987P/F817P/A892P/A899P/A942P取代，具体为：

第986位的氨基酸残基由K取代为P；

第987位的氨基酸残基由V取代为P；

第817位的氨基酸残基由F取代为P；

第892位的氨基酸残基由A取代为P；

第899位的氨基酸残基由A取代为P；

第942位的氨基酸残基由A取代为P。

将第986位、第987位、第817位、第892位、第899位和第942位的氨基酸残基全部突变为脯氨酸，突变后的六个脯氨酸能够稳定S蛋白融合前的三聚体构象，在不影响其抗原性的同时增加其表达量。

在一些实施方案中，其中，与野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白相比，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体还包含以下突变：

(c)促进新冠病毒融合前S三聚体蛋白的释放的突变；

优选地，所述促进新冠病毒融合前S三聚体蛋白的突变包括：

在如SEQ ID NO:1所示的野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的C末端添加基序序列；

如本领域技术人员所理解的，所述基序序列不限定为具体的序列，只要能提供期望的功能即可。优选地，所述基序序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，与野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白相比，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体可以只包含突变(a)、也可以包含突变(a)和(b)、也可以包含突变(a)和(c)，优选地，同时包含突变(a)、(b)和(c)。

在本发明的一些实施方案中，提供了两种新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体，分别为新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白变体和新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白变体，这两种新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体同时包含突变(a)、(b)和(c)，但由于新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白的原始氨基酸序列与新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白的原始氨基酸序列不同，其区别在于：L452R/T478K/D614G，具体为：新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白的第452位、第478位和第614位的氨基酸残基分别为Leu、Thr和Asp，新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白的第452位、第478位和第614位的氨基酸残基分别为Arg、Lys和Gly，这导致新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白和新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白的原始氨基酸序列经过相同的突变(a)、(b)和(c)后，分别得到的新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白变体和新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白变体的氨基酸序列不同。

在本发明的一些实施方案中，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；

优选地，新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白变体和新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白变体在被表达后形成包含三个S1亚基和三个S2亚基的融合前三聚体构象。

SEQ ID NO:1野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白(天然S蛋白胞外区)

SEQ ID NO:2新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白

SEQ ID NO:3新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白

/>

在SEQ ID NOs:1-3中，方框内的氨基酸残基表示第682位、第683位和第685位的氨基酸残基，SEQ ID NO:2和3的第682位、第683位和/或第685位的氨基酸残基由SEQ ID NO:1中的原始氨基酸残基RRR取代为GSS；带深灰色阴影的氨基酸残基表示第986位、第987位、第817位、第892位、第899位和第942位的氨基酸残基，SEQ ID NO:2和3的上述位置的氨基酸残基由SEQ ID NO:1中的原始氨基酸残基KVFAAA取代为PPPPPP。在SEQ ID NO:2和3中的斜体表示在C末端添加的基序。在SEQ ID NO:3中带浅灰色阴影且带删除线的氨基酸残基表示该位置的氨基酸残基(RKG)与SEQ ID NO:2(LTD)不同。

在本发明的一些实施方案中，新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白的密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO:5所示，大小为3714bp；新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白的密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO:6所示，大小为3714bp。与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列可为与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6完全互补的RNA序列。

优选地，所述腮腺炎病毒基因组负链RNA序列来自或衍生自减毒腮腺炎病毒疫苗株的腮腺炎病毒的全长基因组负链RNA；

更优选地，所述减毒腮腺炎病毒疫苗株选自S79株、Jeryl-Lynn株、Leningrad-Zagreb株、Urabe株和RIT 4385株中的一种；所有这些毒株均已在现有技术中记载并可获得，特别是用作商业化疫苗。在中国广泛使用的腮腺炎病毒株是S79株，它是中国第一株腮腺炎减毒活株，为1979年上海生物制品研究所通过国际交流从美国引进腮腺炎病毒株(Jeryl-Lynn株)，在实验室通过原代鸡胚细胞传代培养后所得，反应适中，免疫性良好，且具有较好的免疫持久性。因此，进一步优选地，所述减毒腮腺炎病毒疫苗株为S79株，即其基因组与S79株完全相同。

在本发明中，与初始腮腺炎病毒(例如S79株中包含的腮腺炎病毒)相比，重组腮腺炎病毒在其RNA基因组中包含来自新冠病毒的异源多核苷酸，例如与新冠病毒抗原蛋白编码序列互补的负链RNA序列。

在一些实施方案中，编码上述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列是经过密码子优化的；优选地是针对哺乳动物密码子优化的，以提供在哺乳动物中更高的蛋白表达。

在一些实施方案中，互补的负链RNA序列的核苷酸数目符合腮腺炎病毒的6倍规则。如本领域已知的，腮腺炎病毒的“6倍规则”是指来自腮腺炎病毒负链RNA基因组的负链RNA序列和/或插入的异源多核苷酸中存在的核苷酸数目是6的倍数。“6倍规则”已被本领域认为是腮腺炎病毒基因组中有关核苷酸总数的要求，其使得MuV基因组RNA有效或优化复制。

在一些实施方案中，与编码上述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列和腮腺炎病毒基因组负链RNA序列可操作地连接，优选地，与编码上述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列插入到腮腺炎病毒基因组负链RNA序列中的基因之间，包括N基因与P基因之间、P基因与M基因之间、M基因与F基因之间、F基因与SH基因之间、SH基因与HN基因之间或HN基因与L基因之间；优选地，P基因与M基因之间。

在一些实施方案中，当几种不同的多核苷酸存在于重组腮腺炎病毒颗粒中时，这些对应于新冠病毒抗原蛋白的多核苷酸的每一个可以插入腮腺炎病毒载体的不同位点中，例如一个多核苷酸位于P和M基因之间，另一个多核苷酸位于H和L基因之间。在一些优选的实施方案中，与编码至少一种新冠病毒抗原蛋白的正链RNA互补的负链RNA序列插入腮腺炎病毒载体的P和M基因之间的基因间区域中。

在一些实施方案中，本文公开的重组腮腺炎病毒颗粒包含对应于以下基因转录单元的负链RNA序列，从3’到5’(对应于正链RNA的5’到3’)依次包含：编码MuV的N蛋白的多核苷酸，编码MuV的P蛋白的多核苷酸，编码至少一种新冠病毒抗原蛋白(例如融合前S三聚体蛋白)的多核苷酸，编码MuV的M蛋白的多核苷酸，编码MuV的F蛋白的多核苷酸，编码MuV的SH蛋白的多核苷酸，编码MuV的HN蛋白的多核苷酸和编码MuV的L蛋白的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸可操作地连接到腮腺炎病毒cDNA中编码MuV的P蛋白与编码MuV的M蛋白的多核苷酸之间，并且受病毒复制和转录调控序列例如MuV前导序列和尾随序列控制。

在某些情况下，所述重组腮腺炎病毒颗粒可以另外包含用于控制表达的多个元件对应的负链RNA序列，所述元件包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、polyA序列、选择元件和报告基因。这些调控元件可以是与腮腺炎病毒编码序列同源或异源的。

包含重组腮腺炎病毒颗粒的组合物、疫苗及其用途

新冠病毒自然感染会诱导粘膜抗体反应(分泌性免疫球蛋白A(IgA))和全身抗体反应(IgG)。上呼吸道被认为主要是由分泌型IgA保护，而下呼吸道被认为主要是由IgG的保护。目前已开发的肌肉注射或皮内注射的新冠病毒疫苗主要诱导IgG，不诱导分泌IgA。研究表明许多中和抗体虽然能较低肺部病毒载量，但不能显著预防上呼吸道中的新冠病毒感染。因此，注射类疫苗无法解决群体中无症状感染者的隐形传播问题，需要更多设计用于诱导粘膜免疫的疫苗开发研究。

本发明的第二个方面提供了一种组合物，其包含如上文公开的重组腮腺炎病毒颗粒，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。这些组合物诱导针对新冠病毒的免疫应答，特别是保护性免疫应答，并特别引发针对新冠病毒抗原蛋白的抗体产生和/或引发针对新冠病毒感染的细胞免疫应答。这些组合物相应地可包含对宿主、尤其是人宿主施用的适合的载体，例如药学上可接受的载体，并且可进一步包含但非必须的佐剂以增强宿主中的免疫应答。

在一些实施方案中，所述组合物是免疫原性组合物，特别是疫苗组合物。所述组合物或疫苗用于在预防疗法中防止新冠病毒感染，以及任选地，同时防止腮腺炎病毒感染。

本发明的第三个方面提供了上述组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的疫苗中的用途。疫苗的施用对象可以是哺乳动物受试者，例如猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔和人(包括成人和儿童)等。

本发明的第四个方面提供了上述组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒感染引起的疾病或病况的药物中的用途。所述疾病或病况包括但不限于，发热、肌肉酸痛、周身乏力、呼吸困难、以及新冠病毒传染的并发症，例如急性呼吸拮据综合征、脓毒症、休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍、多器官衰竭、消化道症状及神经系统症状等。

上述疫苗或药物的接种方式，可以是注射接种，也可以是气雾吸入。本发明的疫苗和药物能够诱导分泌IgA，能显著预防上呼吸道中的新冠病毒感染。

在一些实施方案中，单剂量施用所述组合物或疫苗。任选地，可以在免疫-加强方案中多剂量施用。考虑到关于适于已知人MV疫苗的剂量的可用知识，目前已知的人MuV疫苗剂量为10³至10⁴pfu，可以以约0.1-1000ng的有效剂量施用本文提供的重组腮腺炎病毒颗粒。在这些实施方案的某些中，以约100ng或更少的剂量施用本文提供的重组腮腺炎病毒颗粒，并且在这些实施方案的某些中，剂量是50ng或更少，10ng或更少，5ng或更少，或0.1ng或更少。在某些实施方案中，施用剂量可以在预防或治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在预防或治疗过程中变化可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答。例如，可以施用单剂量，或者可以随时间施用数个分开的剂量。

在一些实施方案中，本发明提供将上述重组腮腺炎病毒颗粒或组合物与其他治疗或预防新冠病毒感染的药物联合使用。所述其他药物包括目前已知或常规使用的新冠治疗药物，包括但不限于抗感染的抗生素类药物以及瑞德西韦、利巴韦林、阿比多尔、干扰素等。

新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体、编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、抗原表达质粒和宿主细胞

优选地，所述多核苷酸序列是经过密码子优化的；

更优选地，所述多核苷酸序列是针对哺乳动物密码子优化的；经过密码子优化使得重组感染性颗粒在细胞中的产生效率增加，而不影响表达的蛋白。优选地，该多核苷酸序列的核苷酸数目符合腮腺炎病毒的6倍规则。

进一步优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示，其中SEQID NO:5对应新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白的密码子优化后的基因序列，大小为3714bp；SEQ ID NO:6对应新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白的密码子优化后的基因序列，大小为3714bp。

腮腺炎病毒(MuV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)风疹病毒亚科(Rubulavirinae)，是一种具有不分节段的单股负链RNA基因组(长度约15.4kb)的包膜病毒。由于其基因组是负链RNA基因组，在体内或体外均不翻译，不具有感染性。腮腺炎病毒RNA基因组编码7个转录单元：核蛋白(N)、V/P/I蛋白、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、小疏水蛋白(SH)、血凝素神经氨酸酶(HN)和依赖RNA的RNA聚合酶大蛋白(L)。V、磷蛋白(P)和I蛋白由同一基因通过RNA编辑机制编码，该机制允许在mRNA合成过程中插入额外的G核苷酸，这三种蛋白质中的每一种都以一个共同的部分开始，然后在mRNA中添加两个或四个额外的G核苷酸会改变阅读框，分别产生末端不同的I和P蛋白。腮腺炎病毒基因组中可以插入外源遗传材料片段。

已有研究表明腮腺炎病毒可作为良好的外源基因表达载体平台，开发“即插即用”技术平台(Ammayappan A等人，Molecular therapy oncolytics，2016；316019)。外源基因插入不会影响MuV复制和生长，且传代稳定性良好，表明腮腺炎病毒是一种很有前景的候选疫苗载体。此外有研究表明腮腺炎病毒疫苗鼻内给药可以诱导高血清IgG和粘膜IgA滴度，引起强烈的血清中和抗体反应(Young KR等人，Vaccine，2014；32(2):238-245)，在应对呼吸道病毒应用方面具有巨大前景。

因此，本发明的第七个方面提供了一种核酸构建体，其包含上述多核苷酸序列；

所述腮腺炎病毒反基因组正链RNA是指与腮腺炎病毒基因组负链RNA互补的正链RNA序列。所述多核苷酸序列可以插入cDNA序列中，例如插入ATU(额外转录单元)中，腮腺炎病毒的ATU是本领域技术人员已知的。所述多核苷酸序列优选地定位于cDNA分子的N末端序列中，并且尤其定位于例如插入cDNA序列的P基因与M基因之间。

所述多核苷酸可以位于同源或异源表达控制序列的控制下。在一些实施方案中，所述核酸构建体中除了S蛋白编码序列之外，还包含表达控制序列，例如转录启动子和终止序列以及可能的增强子和其他顺式作用元件，这些调控元件可以是与腮腺炎病毒编码序列同源或异源的。任选地，所述多核苷酸中不包含另外的表达控制序列，而是使用腮腺炎病毒自身的调控元件驱动S蛋白表达。

可以通过将编码一种或多种新冠病毒抗原蛋白的多核苷酸克隆到编码腮腺炎病毒全长反基因组正链RNA的cDNA分子中来制备所述核酸构建体。例如，可以使用核酸片段合成或通过由模板聚合(包括通过PCR)的步骤来制备该核酸构建体。

在一些实施方案中，将腮腺炎病毒基因组序列与新冠病毒融合前S蛋白编码序列以及质粒分为几个片段转染到酵母菌中，通过同源重组得到包含新冠病毒融合前S蛋白基因的腮腺炎病毒全长cDNA克隆质粒。由此，上述核酸构建体包含在所得腮腺炎病毒全长cDNA克隆质粒中。

本发明的第八个方面提供了一种抗原表达质粒，其包含上述表达构建体。该质粒在本文中又称为抗原表达质粒，优选地，其为真核抗原表达质粒，更优选地为酵母-大肠杆菌穿梭质粒。在本发明的一些实施方案中，该质粒是基于pYES2质粒构建的，所述抗原表达质粒为pYES2-rMuV-SC2-WH质粒或pYES2-rMuV-SC2-Delta质粒。

本发明的第九个方面提供了一种宿主细胞，其通过用上述核酸构建体或上述抗原表达质粒转染获得。任选地，所述宿主细胞还经过提供辅助功能和蛋白的其他多核苷酸转染。所述其他多核苷酸可以是编码腮腺炎病毒N蛋白、P蛋白和L蛋白的一种或多种的基因。在一些实施方案中，所述其他多核苷酸包含在相应的辅助质粒中，或由已经整合到细胞基因组中。在一些实施方案中，所述N蛋白、P蛋白和L蛋白来自相同或不同的病毒株。优选地，所述宿主细胞为真核细胞。

包含抗原表达质粒的反向遗传系统

病毒学中的反向遗传系统，通常是指通过克隆病毒的全长基因组cDNA至载体上并在细胞中复制出经过修饰过的子代病毒，从而达到能改造病毒遗传特性的目的。反向遗传系统已经用于开发基于病毒减毒形式的疫苗和产生携带报告基因以追踪病毒感染的重组病毒。由于反向遗传的众多优点，例如快速生产和突变病毒(包括重排列)，它是病毒学和疫苗制造的有效工具。

本发明的第十个方面提供了用于拯救表达新型冠状病毒抗原蛋白的重组腮腺炎病毒颗粒的反向遗传系统，其包含上述抗原表达质粒，以及辅助质粒或辅助细胞系。具体地，所述辅助质粒可以为分别包含编码腮腺炎病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)的基因、编码磷蛋白(P蛋白)的基因和编码RNA聚合酶蛋白(L蛋白)的基因的三种辅助质粒，辅助质粒均为包含T7启动子的质粒，可以使用载体pT7构建，例如所述辅助质粒可以分别为pT7-S79-N、pT7-S79-P和pT7-S79-L，其中辅助质粒pT7-S79-N含有编码腮腺炎病毒的N蛋白的基因，辅助质粒pT7-S79-P含有编码腮腺炎病毒的P蛋白的基因，辅助质粒pT7-S79-L含有编码腮腺炎病毒的L蛋白的基因。任选地，可以不使用辅助质粒而采用辅助细胞系，所述辅助细胞系经过在细胞中导入腮腺炎病毒的核衣壳蛋白N、磷蛋白P以及RNA聚合酶L的编码序列而获得，能够稳定地表达这些蛋白，在用抗原抗原表达质粒转染后即能组装出重组腮腺炎病毒颗粒。优选地，所述辅助细胞也能表达RNA聚合酶，例如T7噬菌体聚合酶。关于辅助细胞的例子，可参见Radecke F等人(1995)Rescue of measles viruses from clonedDNA.EMBO J 14(23):5773–5784中提到的293-3-46细胞系。在一些实施方案中，新型冠状病毒抗原蛋白是新冠病毒融合前S三聚体蛋白。

或者将上述抗原表达质粒转染至所述辅助细胞系；

3)收集细胞上清液并纯化，从而获得重组腮腺炎病毒颗粒；

优选地，所述抗原表达质粒与辅助质粒1、辅助质粒2和辅助质粒3的质量比为10:(3～4):(3～4):1。

优选地，抗原表达质粒和辅助质粒都是基于真核抗原表达质粒而构建的，且所述反向遗传系统用于在真核细胞中表达。在一些实施方案中，第一细胞系是稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-T7细胞。优选地，第二细胞系是Vero细胞。Vero细胞是世界卫生组织(WHO)和《中国药典》认可的疫苗生产细胞系。

本发明的重组腮腺炎病毒颗粒可通过上述方法制备得到。

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1：分别构建表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒感染性克隆质粒pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta

在本实施例中，构建了两种表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒感染性克隆质粒，分别为pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta，这两种质粒的构建步骤基本相同，区别仅在于融合前S三聚体蛋白密码子优化序列不同。实验中使用的S79株全长基因组(GenBank:MT732483.1)以及新冠病毒原型株(GenBank:NC_045512.2)和德尔塔株(GenBank:OL336792.1)的融合前S三聚体蛋白密码子优化序列由金唯智生物科技有限公司合成，其中新冠病毒原型株的融合前S三聚体蛋白密码子优化序列如SEQ ID NO:5所示，新冠病毒德尔塔株的融合前S三聚体蛋白密码子优化序列如SEQ ID NO:6所示。

构建表达新冠病毒融合前S三聚体蛋白的重组腮腺炎病毒感染性克隆质粒pYES2-rMuV-SC2(分别为pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta)的示意图如图1和图2所示，具体为：

使用无缝克隆技术将腮腺炎全长基因组插入pYES2载体(购自武汉淼灵生物科技有限公司)得到含腮腺炎S79株全长cDNA的质粒pYES2-rMuV。以pYES2-rMuV质粒为模板使用9对引物分段扩增相互有重叠的S79疫苗株全长基因组和载体片段，9个片段分别是N、P、M、F、SH-HN、L1、L2、Y1、Y2。以新冠病毒融合前S三聚体蛋白密码子优化序列(如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示)为模板设计引物分2段在融合前S三聚体蛋白基因两端分别加上5’和3’同源序列，分别为WH-ST1和WH-ST2；Delta-ST1和Delta-ST2，以插入到腮腺炎病毒P和M之间(引物序列见表1)。

表1

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各片段的扩增结果参见图3，根据图3的扩增结果可知，成功扩增了片段N、P、M、F、SH-HN、L1、L2、Y1、Y2、WH-ST1、WH-ST2、Delta-ST1和Delta-ST2。

实施例2：pYES2-rMuV-SC2全长感染性克隆的拼接

利用酵母转化的方法，将实施例1扩增的多个片段在酵母中完成拼接，具体为将片段N、P、ST1、ST2、M、F、SH-HN、L1、L2、Y1、Y2、WH-ST1和WH-ST2在酵母中完成拼接；将片段N、P、ST1、ST2、M、F、SH-HN、L1、L2、Y1、Y2、Delta-ST1和Delta-ST2在酵母中完成拼接。具体为：反应体系如下：

随后通过酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，随即电转到DH10B大肠杆菌感受态细胞中。

实施例3：pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta全长感染性克隆的验证

随机挑取单个克隆，分别接种到5mL含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB液体培养基中，37℃摇床中培养12h，按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明书提取所挑取的克隆，进而获得pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta全长感染性克隆质粒，对全长感染性克隆进行PCR扩增，通过核酸电泳验证PCR产物分子量大小是否符合预期；当PCR产物分子量大小正确后，通过基因测序验证序列的正确性。

PCR测序引物采用表1中相同的引物，取5μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳检测，pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta全长感染性克隆全部基因片段均可检测到(结果如图4所示)。阳性克隆质粒送往尚亚生物技术有限公司测序。保存测序正确的全长感染性克隆甘油菌，分别得到pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta全长感染性克隆质粒。

实施例4：病毒拯救及空斑纯化

辅助质粒的构建。简言之，将pT7CFE1-CMyc载体质粒用NdeI、XhoI于37℃酶切消化1h，得到线性片段。使用GeneArt TM Seamless Cloning and Assembly Kit将S79株的N蛋白编码序列(如SEQ ID NO:7所示)与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段、P蛋白编码序列(如SEQID NO:8所示)与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段、L蛋白的两个编码序列(如SEQ ID NO:9所示)与pT7CFE1-CMyc线性化载体片段分别进行连接并转化，表达获得N、P、L的3种辅助质粒，分别为pT7-S79-N、pT7-S79-P和pT7-S79-L。

分别用pYES2-rMuV-SC2-WH和pYES2-rMuV-SC2-Delta全长感染性克隆质粒6.5μg，以及其辅助质粒pT7-S79-N 1.9μg、pT7-S79-P 1.9μg和pT7-S79-L 0.65μg共转染BHK-T7细胞。转染4天后收集细胞上清混合物感染Vero细胞(ATCC)，逐日观察，直到出现细胞合胞体病变(如图5所示)，细胞反复冻融后离心后收集拯救病毒上清液，拯救的病毒命名为rMuV-SC2-WT和rMuV-SC2-Delta。

拯救病毒感染6孔板中的单层Vero细胞，1h后换液，加入含2％FBS，2％低熔点琼脂糖的MEM，48h后加入0.33％中性红，2％FBS，2％低熔点琼脂糖的MEM进行染色。37℃培养6天后挑取噬斑至铺有Vero细胞的96孔板获得纯化的重组拯救病毒。

实施例5：rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta的RT-PCR鉴定结果及测序验证

对纯化后rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta在Vero细胞中连续传代至第15代，每隔5代取感染细胞的上清液和细胞样品提取总RNA，反转录成cDNA。分别在腮腺炎病毒P和M基因上设计引物扩增新冠病毒融合前S三聚体蛋白基因片段，其中，上游引物rMuV-SC2-F：5’-GAGATATCATACGGAACGCC-3’；下游引物rMuV-SC2-R：5’-CTTTGGAAGAGGAATTTTG-3’，PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，可以检测到rMuV-SC2的新冠病毒融合前S三聚体蛋白基因片段(结果如图6所示)，将新冠病毒融合前S三聚体蛋白基因PCR产物送往尚亚生物技术有限公司测序。测序结果与基因设计一致，表明成功拯救获得能够稳定传代的带有新冠病毒融合前S三聚体蛋白基因的重组腮腺炎病毒rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta。

实施例6：间接免疫荧光(IFA)检测验证rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta中新冠病毒融合前S三聚体蛋白的表达

在12孔板铺Vero细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右进行感染，感染48h后使用MuV-N蛋白鼠单克隆抗体(abcam，ab9876)和SARS-CoV-2-S蛋白兔多克隆抗体(义翘神州，40590-T62)，通过间接免疫荧光检测检测rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta中新冠病毒融合前S三聚体蛋白的表达情况。结果显示感染重组腮腺炎病毒的Vero细胞，荧光显微镜下能够明显的观察到红色荧光信号(针对MuV-N蛋白)以及绿色荧光信号(针对SARS-CoV-2-S蛋白)(如图7所示)，表明重组病毒rMuV-SC2能够表达SARS-CoV-2的S蛋白。

实施例7：rMuV-SC2感染Vero细胞后检测新冠病毒S蛋白三聚体的表达

在6孔板中铺Vero细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右进行感染。rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta感染Vero细胞96h后，通过添加300μl非变性细胞裂解液来裂解细胞，然后以12000rpm离心5min以去除细胞碎片，取上清，该上清即为需要的蛋白质样品。通过Western Blot检测新冠病毒S蛋白三聚体的表达，蛋白样品首先跑非变性的PAGE胶，接着转膜，孵育一抗(SARS-CoV-2-S蛋白兔多克隆抗体，义翘神州，40590-T62)。通过显影检测到有特异性的条带(如箭头所示)。蛋白分子量大小与新冠病毒S三聚体蛋白一致，表明S三聚体蛋白表达成功(如图8所示)。

实施例8：rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta在Vero细胞中一步生长曲线测定

在6孔板中铺Vero细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右以MOI＝0.01进行感染，孵育1h后，弃去病毒并用DMEM洗两次，后加入含2％FBS的DMEM培养。在感染后不同时间点收集细胞上清和细胞裂解物并混合，在Vero细胞中通过噬斑试验测定病毒滴度。结果显示rMuV-SC2-WH和rMuV-SC2-Delta在Vero细胞中生长良好，相对于亲本毒rMuV表现出延迟的生长特性，表明该重组毒进一步致弱，最高滴度可达10⁷PFU/ml，可满足于疫苗生产需要(如图9所示)。

实施例9：在I型干扰素受体缺失A129小鼠(IFNAR1-/-)中施用rMuV-SC2-WT和rMuV-SC2-Delta后产生的抗体的滴度测定

9.1动物实验

约3-4周龄的A129小鼠(无特定病原体(SPF))由武汉大学陈宇馈赠。接种前，通过ELISA试剂盒(ab108752，Abcam)确认动物中MuV的抗体呈阴性。所有动物实验均严格按照浙江大学实验动物伦理委员会规定依照动物研究和体内实验报告(ARRIVE)指南进行。每个接种组分别置于动物生物安全等级2(rMuV为BSL-2)下的动物笼中。

40只小鼠随机分为八组，每组5只：每四组分别腹腔内(IP)或者鼻内(IN)接种DMEM(空白对照，n＝5)，rMuV(不表达新冠病毒S三聚体蛋白的腮腺炎病毒颗粒本身)(n＝5)，rMuV-SC2-WH(n＝5)或rMuV-SC2-Delta(n＝5)。每只小鼠接种的重组腮腺炎病毒量为4×10⁵PFU，各对照小鼠间接种体积一致。三周后，再次腹腔(IP)或鼻内(IN)接种同种10⁶PFU的病毒。在接种后0、3和7周收集血清样品并分别测试MuV的特异性抗体、SARS-CoV-2S三聚体蛋白的特异性抗体和SARS-CoV-2类病毒的中和抗体。接种后7周将仓鼠安乐死。

9.2 MuV抗体ELISA

通过使用人抗腮腺炎病毒IgG ELISA试剂盒(ab108752，Abcam)以及兔抗小鼠IgGH&L(HRP)(ab6728，Abcam)来测量MuV特异性抗体。结果显示于图10A。同一时间点各组间MuV抗体水平无显著差异，表明外源基因插入不影响MuV特异性抗体产生。

9.3 SARS-CoV-2抗体ELISA

通过BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime Biotechnology，中国上海)测定SARS-CoV-2S三聚体蛋白的浓度。利用杆状病毒表达系统(pFastBac，购自ThermoFisher)表达的SARS-CoV-2S三聚体蛋白包被Elisa板子。用含0.05％Tween的PBS(PBST)将板洗涤3次，然后在37℃下于5％牛血清白蛋白中封闭1h。用PBST洗涤3次后，将板与血清样品(2的倍比稀释)在37℃孵育1小时。以小鼠三聚体蛋白的高免疫血清作为阳性对照(实施例9中制备)。用PBST洗涤3次后，在37℃下加入抗HRP标记的仓鼠IgG或HRP标记的小鼠IgG(1：25000稀释)。用PBST洗涤3次后，添加1x TMB(四甲基联苯胺)底物(Invitrogen)并在37℃下孵育15分钟，然后通过添加2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪对450nm处的吸光度进行定量。样品与阴性OD₄₅₀的比率大于0.3被认为是阳性，以此判定血清样品最低稀释倍数。结果显示于图10B。表明rMuV-SC2-WT和rMuV-SC2-Delta在小鼠体内成功诱导针对新冠病毒S蛋白特异性抗体，且腹腔注射与鼻内接种无显著差异。

9.4类病毒-血清中和试验

使用清华大学丁强馈赠的SARS-CoV-2类病毒系统(详见Ju X等，PLoS pathogens，2021；17(3):e1009439)评价血清样品中和活性。将血清样品稀释后与SARS-CoV-2GFP/ΔNtrVLP在37℃共孵育2小时后感染内源性表达SARS-CoV-2N蛋白的Caco-2细胞，48小时后收集细胞并通过流式细胞术分析量化GFP荧光即代表病毒感染量，以使GFP荧光强度降低50％的最低血清稀释度作为其中和效价，结果显示于图10C。表明单次免疫rMuV-SC2-WT和rMuV-SC2-Delta即可使小鼠体内中和抗体效价显著高于阴性对照组和空白对照组，鼻内接种组与腹腔注射组无显著性差异，也可诱导强烈中和抗体活性(****，p<0.0001；**，p<0.01；*，p<0.05，Student’s t test)。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种重组腮腺炎病毒颗粒、组合物及其用途

<130> CP1211359/CB

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1208

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 野生型新冠病毒融合前S三聚体蛋白的氨基酸序列

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<223> 新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白的氨基酸序列

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1145 1150 1155

Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys

1160 1165 1170

Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

1175 1180 1185

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn

1190 1195 1200

Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu

1205 1210 1215

Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro

1220 1225 1230

Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu

1235 1240 1245

Leu Ser Thr Phe Leu Gly

1250

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 基序的氨基酸序列

<400> 4

Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val

1 5 10 15

Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly

20 25 30

<210> 5

<211> 3714

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白的密码子优化后的序列

<400> 5

atgttcgtgt tcctggtgct cctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

cgaacccagc tcccaccagc ctacaccaac agctttacac ggggcgtgta ctaccctgac 120

aaggtgttca gatctagcgt cctgcacagc actcaggacc tcttcctgcc gttcttcagc 180

aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg agcggcacaa acggaaccaa gcggtttgat 240

aaccccgtcc tgccattcaa tgatggagtt tacttcgcca gtaccgagaa gagtaacatc 300

atccggggct ggatcttcgg caccaccctg gatagcaaaa cacagagcct cctgatcgtg 360

aacaatgcca cgaacgtcgt gatcaaggtg tgcgagttcc agttttgcaa tgatcctttc 420

ctgggtgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt cagagtctac 480

agcagcgcca acaactgcac attcgagtac gtctctcagc cttttctgat ggaccttgag 540

gggaaacaag gcaacttcaa gaacctgaga gaattcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600

ttcaaaatct actccaagca cacacccatc aacctggtcc gggacctccc tcagggcttc 660

agcgccctgg aacccctggt cgacctgccc ataggcatca acataacgcg gttccaaacc 720

ctgctggccc tgcatagatc ctacctgact cctggcgaca gcagcagcgg atggaccgcc 780

ggagctgcag cctactatgt gggctacctg caacctagaa ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaacggca caatcacaga cgccgtcgac tgcgccctgg accctctctc tgagacaaag 900

tgcaccctga agtccttcac cgtggaaaag ggcatctacc agaccagcaa cttccgggtg 960

cagcctacag agagcatcgt gcgatttcca aacattacca acctctgccc cttcggcgag 1020

gtgtttaacg ccacaagatt tgcctccgtt tacgcctgga atagaaagag aatcagcaat 1080

tgtgtggccg actactccgt gctgtataac agcgcctctt tcagcacctt caagtgctac 1140

ggcgtttccc caacaaagct gaatgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc 1200

gtaattagag gcgatgaggt gcggcagatc gcaccaggcc agaccggtaa gatcgctgac 1260

tacaactata agctgcctga tgattttaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320

ctggatagca aggtgggcgg caactacaac tacctgtacc ggctgtttcg caagtctaac 1380

ctgaaacctt tcgagagaga catctccaca gagatctacc aggccggttc tacaccttgt 1440

aacggggtgg aaggcttcaa ctgttacttc cctctgcaaa gctacggctt ccagcctacc 1500

aatggagtcg gctaccagcc ataccgggtg gtcgtgctgt ccttcgagtt actccacgcc 1560

cccgccaccg tctgcggtcc taagaagtcc accaatctgg ttaagaacaa atgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctgac cgggaccggc gtgctgaccg aaagcaacaa aaagttcctc 1680

cccttccagc agttcggccg tgatatcgct gacaccacag atgccgtcag agatccacag 1740

accctggaaa tcctggatat tacaccctgc tccttcggag gagtttctgt gatcaccccc 1800

gggaccaata ccagcaacca ggtggctgtg ctgtaccaag atgttaactg caccgaggtt 1860

cctgtggcca tccacgccga tcagctgaca cctacttgga gagtgtactc cactggctcc 1920

aatgtgttcc agaccagggc cggatgtctg atcggcgccg agcacgtgaa taacagttac 1980

gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgccagct accagaccca gacaaacagc 2040

cctgggtctg cttcctctgt agctagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100

gcagagaaca gcgtggccta ttccaacaac tctatcgcca ttcccaccaa ctttacaatt 2160

agcgtcacaa cagagatcct gcccgtgagc atgaccaaga ccagcgtgga ctgtacaatg 2220

tacatctgtg gcgacagcac tgaatgcagc aacctgctgc tgcaatacgg ctccttttgc 2280

acccaactga accgggcgct gaccggaatc gccgtggaac aggacaaaaa tacccaggag 2340

gtgttcgccc aagtgaagca gatctacaag accccaccta tcaaggactt cggcggcttt 2400

aactttagcc agattctccc tgatccttct aagcctagca agcggagccc tatcgaggat 2460

ctgctgttca acaaggtcac cctggccgat gccggcttta tcaaacagta tggcgattgc 2520

ctgggcgaca tagccgccag agatctgatc tgcgcccaga aattcaacgg cctgacagtt 2580

ctcccacctc tgctgaccga cgagatgatc gctcagtaca cctctgccct gctggctggc 2640

accatcacat ctgggtggac atttggcgcc ggccccgccc tgcagatccc ctttcccatg 2700

cagatggcct atagattcaa cggaatcggc gtgacccaga acgtgctgta tgaaaaccag 2760

aagctgatcg ctaaccagtt caattctgcc atcggcaaga tccaggactc cctctcctct 2820

acccccagcg ccctgggcaa actgcaggac gtggtgaatc agaacgccca agccctgaac 2880

accctggtga agcagctcag cagcaatttt ggcgccatca gctctgtgct gaacgatatc 2940

ctgtctagac tggaccctcc agaagccgaa gtccagatcg atagactgat cacaggcaga 3000

ctgcagtccc tgcaaaccta cgtgacccaa cagctgatca gggccgctga aataagagcc 3060

agcgccaatc tcgccgctac caagatgtcc gagtgtgtgc tgggacagtc taaacgcgtt 3120

gacttctgcg gcaaaggcta tcacctgatg agcttccccc agagcgcgcc gcacggcgtg 3180

gtgttcctgc atgtgacata cgtgcctgcc caagagaaga atttcacaac cgcccctgcc 3240

atctgccacg acggcaaggc ccacttccca agagagggcg ttttcgtttc caatggcaca 3300

cactggttcg tgacacaaag aaacttctac gaaccccaga ttatcaccac cgacaacacc 3360

ttcgtgagtg gcaattgtga cgtggtcatc ggaatcgtga acaacacagt gtacgaccct 3420

ctgcaacctg agctggactc ttttaaggaa gagctggaca agtactttaa aaaccacacc 3480

agccccgatg tggacctggg cgacatcagt ggcattaacg ccagcgtggt gaacatccaa 3540

aaggaaatcg acagactgaa cgaggtggcc aagaacctga acgagtccct gatcgacctg 3600

caggagctcg gcaaatacga gcagggatcc ggatacatcc ccgaggcccc cagagatggc 3660

caggcctacg tgcggaagga cggcgagtgg gtactgctga gcacattcct gggc 3714

<210> 6

<211> 3714

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白的密码子优化后的序列

<400> 6

atgttcgtgt tcctggtgct cctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60

cgaacccagc tcccaccagc ctacaccaac agctttacac ggggcgtgta ctaccctgac 120

aaggtgttca gatctagcgt cctgcacagc actcaggacc tcttcctgcc gttcttcagc 180

aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg agcggcacaa acggaaccaa gcggtttgat 240

aaccccgtcc tgccattcaa tgatggagtt tacttcgcca gtaccgagaa gagtaacatc 300

atccggggct ggatcttcgg caccaccctg gatagcaaaa cacagagcct cctgatcgtg 360

aacaatgcca cgaacgtcgt gatcaaggtg tgcgagttcc agttttgcaa tgatcctttc 420

ctgggtgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt cagagtctac 480

agcagcgcca acaactgcac attcgagtac gtctctcagc cttttctgat ggaccttgag 540

gggaaacaag gcaacttcaa gaacctgaga gaattcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600

ttcaaaatct actccaagca cacacccatc aacctggtcc gggacctccc tcagggcttc 660

agcgccctgg aacccctggt cgacctgccc ataggcatca acataacgcg gttccaaacc 720

ctgctggccc tgcatagatc ctacctgact cctggcgaca gcagcagcgg atggaccgcc 780

ggagctgcag cctactatgt gggctacctg caacctagaa ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaacggca caatcacaga cgccgtcgac tgcgccctgg accctctctc tgagacaaag 900

tgcaccctga agtccttcac cgtggaaaag ggcatctacc agaccagcaa cttccgggtg 960

cagcctacag agagcatcgt gcgatttcca aacattacca acctctgccc cttcggcgag 1020

gtgtttaacg ccacaagatt tgcctccgtt tacgcctgga atagaaagag aatcagcaat 1080

tgtgtggccg actactccgt gctgtataac agcgcctctt tcagcacctt caagtgctac 1140

ggcgtttccc caacaaagct gaatgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc 1200

gtaattagag gcgatgaggt gcggcagatc gcaccaggcc agaccggtaa gatcgctgac 1260

tacaactata agctgcctga tgattttaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320

ctggatagca aggtgggcgg caactacaac taccggtacc ggctgtttcg caagtctaac 1380

ctgaaacctt tcgagagaga catctccaca gagatctacc aggccggttc taaaccttgt 1440

aacggggtgg aaggcttcaa ctgttacttc cctctgcaaa gctacggctt ccagcctacc 1500

aatggagtcg gctaccagcc ataccgggtg gtcgtgctgt ccttcgagtt actccacgcc 1560

cccgccaccg tctgcggtcc taagaagtcc accaatctgg ttaagaacaa atgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctgac cgggaccggc gtgctgaccg aaagcaacaa aaagttcctc 1680

cccttccagc agttcggccg tgatatcgct gacaccacag atgccgtcag agatccacag 1740

accctggaaa tcctggatat tacaccctgc tccttcggag gagtttctgt gatcaccccc 1800

gggaccaata ccagcaacca ggtggctgtg ctgtaccaag gtgttaactg caccgaggtt 1860

cctgtggcca tccacgccga tcagctgaca cctacttgga gagtgtactc cactggctcc 1920

aatgtgttcc agaccagggc cggatgtctg atcggcgccg agcacgtgaa taacagttac 1980

gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgccagct accagaccca gacaaacagc 2040

cctgggtctg cttcctctgt agctagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100

gcagagaaca gcgtggccta ttccaacaac tctatcgcca ttcccaccaa ctttacaatt 2160

agcgtcacaa cagagatcct gcccgtgagc atgaccaaga ccagcgtgga ctgtacaatg 2220

tacatctgtg gcgacagcac tgaatgcagc aacctgctgc tgcaatacgg ctccttttgc 2280

acccaactga accgggcgct gaccggaatc gccgtggaac aggacaaaaa tacccaggag 2340

gtgttcgccc aagtgaagca gatctacaag accccaccta tcaaggactt cggcggcttt 2400

aactttagcc agattctccc tgatccttct aagcctagca agcggagccc tatcgaggat 2460

ctgctgttca acaaggtcac cctggccgat gccggcttta tcaaacagta tggcgattgc 2520

ctgggcgaca tagccgccag agatctgatc tgcgcccaga aattcaacgg cctgacagtt 2580

ctcccacctc tgctgaccga cgagatgatc gctcagtaca cctctgccct gctggctggc 2640

accatcacat ctgggtggac atttggcgcc ggccccgccc tgcagatccc ctttcccatg 2700

cagatggcct atagattcaa cggaatcggc gtgacccaga acgtgctgta tgaaaaccag 2760

aagctgatcg ctaaccagtt caattctgcc atcggcaaga tccaggactc cctctcctct 2820

acccccagcg ccctgggcaa actgcaggac gtggtgaatc agaacgccca agccctgaac 2880

accctggtga agcagctcag cagcaatttt ggcgccatca gctctgtgct gaacgatatc 2940

ctgtctagac tggaccctcc agaagccgaa gtccagatcg atagactgat cacaggcaga 3000

ctgcagtccc tgcaaaccta cgtgacccaa cagctgatca gggccgctga aataagagcc 3060

agcgccaatc tcgccgctac caagatgtcc gagtgtgtgc tgggacagtc taaacgcgtt 3120

gacttctgcg gcaaaggcta tcacctgatg agcttccccc agagcgcgcc gcacggcgtg 3180

gtgttcctgc atgtgacata cgtgcctgcc caagagaaga atttcacaac cgcccctgcc 3240

atctgccacg acggcaaggc ccacttccca agagagggcg ttttcgtttc caatggcaca 3300

cactggttcg tgacacaaag aaacttctac gaaccccaga ttatcaccac cgacaacacc 3360

ttcgtgagtg gcaattgtga cgtggtcatc ggaatcgtga acaacacagt gtacgaccct 3420

ctgcaacctg agctggactc ttttaaggaa gagctggaca agtactttaa aaaccacacc 3480

agccccgatg tggacctggg cgacatcagt ggcattaacg ccagcgtggt gaacatccaa 3540

aaggaaatcg acagactgaa cgaggtggcc aagaacctga acgagtccct gatcgacctg 3600

caggagctcg gcaaatacga gcagggatcc ggatacatcc ccgaggcccc cagagatggc 3660

caggcctacg tgcggaagga cggcgagtgg gtactgctga gcacattcct gggc 3714

<210> 7

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 腮腺炎病毒S79株N蛋白编码基因序列

<400> 7

atgttgtctg tgctcaaagc attcgagcgg ttcacgatag aacaggaact tcaagacagg 60

ggtgaggagg gttcaattcc gccggagact ttaaagtcag cagtcaaagt cttcgttatt 120

aacacaccca atcccaccac acgctatcag atgctaaact tttgcctaag aataatctgc 180

agtcaaaatg ctagggcatc tcacagggta ggtgcattga taacattatt ctcacttccc 240

tcagcaggca tgcaaaatca tattagatta gcagatagat cacctgaagc tcagatagaa 300

cgctgcgaga ttgatggttt tgaacctggt acatataggc tgattccaaa tgcacgcgcc 360

aatcttactg ccaatgaaat tgctgcctat gctttgcttg cagatgacct ccctccaacc 420

ataaataatg gaactcctta cgtacatgca gatgttgaag gacagccatg cgatgagatt 480

gagcaattcc tggatcggtg ttacagtgta ctaatccagg cttgggtaat ggtctgtaaa 540

tgtatgacag cgtacgacca acctgctgga tctgctgatc ggcgattcgc gaaataccag 600

cagcaaggtc gccttgaagc aagatacatg ctgcagccgg aggcccaaag gttgattcaa 660

actgccatca ggaaaagtct tgttgttaga cagtacctta ccctcgaact ccagttggcg 720

agacggcagg ggttgctatc aaacagatac tatgcaatgg tgggtgacat cgggaagtac 780

attgagaatt caggacttac tgccttcttt ctcactctca aatatgcact agggaccaaa 840

tggagtcctc tatcattggc tgcattcacc ggtgaactca ctaaactccg atccttgatg 900

atgttatatc gagatctcgg agaacaagcc agataccttg ctctgttaga ggctccccaa 960

ataatggact ttgcacccgg gggctaccca ttaatattca gttatgctat gggagtcggt 1020

acagtcctgg atgtccaaat gcgaaattac acttatgcac gacctttcct aaacggttat 1080

tatttccaga ttggggttga gaccgcacga aggcaacaag gcactgttga caacagagta 1140

gcagatgatc tgggcctgac tcctgagcaa agaactgagg ttactcagct tgttgacagg 1200

cttgcaaggg gaagaggtgc tgggatacca ggtgggcctg tgaatccttt tgttcctcca 1260

gttcaacagc aacaacctgc tgccgtatat gaggacattc ctgcattaga ggaatcagat 1320

gacgatggtg atgaagatag aggcgcagga ttccaaaatg gagtacaagt accagctgta 1380

agacagggag gtcaaactga ctttagagca cagcctttac aagatccaat tcaagcacag 1440

cttttcatgc cattatatcc tcaagtcagc aacatcccaa ataatcagaa tcatcagatc 1500

aatcgcatcg gggggctgga aaaccaagat ttattacgat acaacgagaa tggtgattct 1560

caacaagatg caaggggcga acacggaaac actttcccaa acaatcccaa tcaaaacgca 1620

cagctgcaag tgggtgactg ggatgagtga 1650

<210> 8

<211> 1174

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 腮腺炎病毒S79株P蛋白编码基因序列

<400> 8

atggatcaat ttataaaaca ggatgagact ggtgatttaa ttgagacagg aatgaatgtt 60

gcaaaccatt tcctatccgc ccccattcag ggaaccaact cgctgagcaa ggcttcaatc 120

atccctggcg ttgcacctgt actcattggc aatccagagc aaaagaacat tcagcaccct 180

accgcatcac atcagggatc caagtcaaag ggcagaggct caggggtcag gtccatcaca 240

gtcccgcccc ccgaagcagg caatggaggg actcagattc ctgagcccct ttttgcacaa 300

acaggacagg gtggcatagt caccacagtc caccaggatc caaccatcca accaacaggt 360

tcataccgaa gtgtggaatt ggcgaagatc ggaaaagaga gaatgattaa tcgatttgtt 420

gagaaaccta gaacctcaac gccggtgaca gaatttaaga ggggggccgg gagcggctgc 480

tcaaggccag acaatccaag aggagggcat agacgggaat ggagcctcag ctgggtccaa 540

ggagaggtcc gggtctttga gtggtgcaac cctatatgct cacctatcac tgccgcagca 600

agattccact cctgcaaatg tgggaattgc cccgcaaagt gcgaccagtg cgaacgagat 660

tatggacctc cttaggggga tggatgctcg cctgcaacat cttgagcaaa aggtggacaa 720

ggtgcttgca cagggcagca tggtgaccca aataaagaat gaattatcaa cagtaaagac 780

aacattagca acaattgaag ggatgatggc aacagtaaaa atcatggatc ctggaaatcc 840

gacaggggtc ccagttgatg agcttagaag aagttttagt gatcatgtga caattgttag 900

tggaccagga gatgtgtcgt tcagctccag tgaagaaccc acactgtatt tggatgagct 960

ggcgaggccc gtctccaagc ctcgtcctgc aaagcagaca aaaccccaac cagtaaagga 1020

tttggcagga cgaaaagtga tgatcaccaa aatgattact gattgtgtgg ctaaccctca 1080

aatgaagcag gcgttcgaac aacgattggc aaaggccagc accgaggatg ctctgaacga 1140

catcaagaga gatatcatac ggaacgccat atga 1174

<210> 9

<211> 6786

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 腮腺炎病毒S79株L蛋白编码基因序列

<400> 9

atggcgggcc taaatgagat actcctaccc gaagtacatt taaactcccc catcgttaga 60

tataagcttt tctactatat attgcatggc cagttaccaa atgatttgga gccagatgac 120

ttgggcccat tagcaaatca taattggaag gcaattcgag ctgaggaatc ccaggttcat 180

gcacgattaa aacagatcag agtagaactc attgcaagga ttcctagtct ccggtggacc 240

cgctctcaaa gagagattgc catactcatt tggccaagaa tacttccaat actgcaagca 300

tatgatcttc ggcaaagtat gcaattgccc acagtgtggg agaaattgac tcaatccacg 360

gttaatctta taagtgatgg tctagaacgg gttgtattac acatcagcaa tcaattaaca 420

ggcaagccta acttgtttac cagatctcga gctggacaag acacaaaaga ttactcaatt 480

ccatccacta gagagctatc tcaaatatgg tttaacaatg agtggagtgg gtctgtgaag 540

acctggctta tgattaaata tagaatgagg cagctaatca caaatcaaaa gacaggtgag 600

ttaacagatt tagtaaccat tgtggatact aggtctactc tatgcattat taccccagaa 660

ttagtcgctt tatactccaa tgagcacaaa gcattaacgt acctcacctt tgaaatggta 720

ttaatggtca ctgatatgtt agagggaaga ctgaatgttt cttctctgtg cacagctagt 780

cattatctgt cccctttaaa gaagcgaatc gaagttctcc tgacattagt tgatgacctt 840

gctctactca tgggggataa agtatacggt attgtctctt cacttgagag ttttgtttac 900

gcccaattac agtatggtga tcctgttata gacattaaag gtacattcta tggatttata 960

tgtaatgaga ttctcgacct actgactgaa ggcaacatct ttactgaaga agaggcaaac 1020

aaggttcttc tggacttgac gtcacagttt gacaatctat cccctgattt aacagctgag 1080

ctcctctgca ttatgagact ttggggccat cccaccttaa ctgccagcca agcagcatcc 1140

aaggtccgag agtccatgtg cgctcctaag gtgttagatt tccaaacaat aatgaaaacc 1200

ctggctttct ttcacgcaat cctaattaac ggttatagga ggagccataa tggaatctgg 1260

ccgcctacta ctcttcatgg caatgccccc aaaagcctca ttgagatgcg gcatgataat 1320

tcagagctta agtatgagta tgtcctcaag aattggaaaa gtatatctat gttaagaata 1380

cacaaatgct ttgatgcatc acctgatgaa gatctcagca tattcatgaa ggataaggca 1440

ataagctgtc caaagcaaga ctggatggga gtatttagga ggagcctgat taaacagcgc 1500

tatcgtgacg tgaatcggcc tctaccacaa ccatttaacc ggagactgct gttgaatttc 1560

ctagaggatg accgattcga tcctagtaaa gagcttgagt atgtcaccag tggagaatat 1620

cttagggacc ctgaattttg tgcatcttac tctctcaaag agaaagagat aaaggctaca 1680

ggtcgtatat ttgcaaaaat gacaaagaga atgagatcgt gccaagtaat tgcagaatca 1740

ttgttagcca atcacgcagg taaattaatg agagagaatg gagttgtctt agaccagttg 1800

aaattaacaa aatctttatt aactatgaac caaattggca ttatatcaga gcacagccga 1860

agatccactg ccgacaacat gaccttggca cactccggtt caaataagca caggattaac 1920

aatagtcaat tcaagaagaa taaagacaac aaacatgaga tgcctgatga tgggtttgag 1980

atagcagcct gcttcctaac aactgacctc acaaaatact gcttaaattg gaggtaccaa 2040

gtcatcatcc cctttgcgcg tacattgaat tcaatgtacg gtatacccca cctgtttgaa 2100

tggatacatt taaggctgat gcgaagcact ctctatgtcg gtgatccctt caatcctcca 2160

tcagatccta cccaacttga ccttgatacc gcactcaacg atgatatatt tatagtttcc 2220

cctcgtggcg gaatcgaggg tttatgtcaa aaattatgga ctatgatttc catctcaaca 2280

atcatattat ccgcaactga ggcaaacact agagtaatga gcatggttca gggcgataac 2340

caagcaattg caatcaccac tagagtagtg cgctcgctca gtcattccga gaagaaagag 2400

caagcttata aagcaagtaa attattcttt gaaagactta gagctaacaa ccatggaatt 2460

ggacaccact taaaagaaca agaaacaatc cttagttctg atttcttcat atacagtaag 2520

agggtgtttt acaaaggtcg aatcttgact caagcgttaa agaacgtgag caagatgtgc 2580

ttaacagctg atatactggg ggattgttca caagcatcat gttccaattt agctaccact 2640

gtaatgcgtc ttactgagaa tggggtcgag aaagatttgt gttatttcct aaatgcattc 2700

atgacaatta gacaattatg ttatgatcta gtatttcccc aaactaaatc tcttagtcag 2760

gacattacta atgcttatct taatcatcca atacttatct caagattgtg tctattacca 2820

tctcaattgg ggggcttaaa ctttctttca tgtagccgcc tgtttaatag aaacatagga 2880

gatccactag tgtctgcaat tgctgatgtg aaacgattaa ttaaagcggg ctgtctagat 2940

atctgggtcc tgtacaacat ccttggaagg aggcctggaa agggcaagtg gagcactctg 3000

gcagctgatc cctatacttt aaacatagat tatttagtcc cttcaacaac ttttttaaag 3060

aaacatgccc aatatacact gatggaacgg agtgttaatc ccatgctccg tggagtattt 3120

agcgaaaatg cagctgagga ggaagaggaa ctcgcacagt atctattaga tcgcgaagta 3180

gtcatgccca gggttgcaca tgttatactt gcccagtcta gttgcggtag aagaaaacag 3240

atccaaggtt acttggattc tactagaact attatcaggt attcactgga ggtgagacca 3300

ctgtcagcaa agaagctgaa tacggtaata gaatacaact tgttgtatct gtcctacaat 3360

ttggagatta ttgaaaaacc caatatagtc caaccttttt tgaatgcaat caatgttgat 3420

acttgtagca tcgatatagc taggtccctt agaaaactat cctgggcaac tttacttaat 3480

ggacgtccca tcgagggatt agaaacacct gatcctattg aattggtaca tgggtgttta 3540

ataatcgggt cagatgagtg tgagcattgc agtagtggtg atgacaaatt cacctggttt 3600

ttcctcccca aggggataag gttagatgat gatccggcat ctaacccacc catcagagta 3660

ccttatatcg gatctaaaac agatgaacga agggttgcat caatggctta tatcaaaggg 3720

tcatcagtat cacttaaatc agcactcagg ttggcggggg tatatatctg ggctttcgga 3780

gatacagagg aatcatggca ggatgcctat gagttagctt ccactcgtgt taatctcaca 3840

ctagagcaat tgcaatcgct tactccttta ccaacatctg ccaacctagt ccacagattg 3900

gatgatggca ctactcaatt aaaatttacc cctgcaagct cctatgcatt ctctagcttt 3960

gttcatatat ctaacgactg tcaaattctt gagatcgatg atcaggtaac ggattctaac 4020

ctgatttacc agcaagttat gattactggc cttgctttaa ttgagacatg gaataatcct 4080

ccaatcaact tctccgttta tgaaactaca ttacacttgc atacaggctc atcttgctgt 4140

ataaggcctg tcgagtcttg tgtagtaaat ccgcctttac ttcctgtccc tttcattaat 4200

gttcctcaaa tgaataaatt tgtatatgac cctgaaccac ttagtttgct agaaatggaa 4260

aaaattgagg atattgctta tcaaaccaga attggtggtt tagatcaaat cccgcttctg 4320

gaaaaaatac ccttactagc tcaccttacc gccaaacaga tggtgaatag catcactggg 4380

cttgatgaag caacatctat aatgaatgat gctgtagttc aagcagacta tactagcaat 4440

tggattagtg aatgctgcta cacttacatt gactctgtgt ttgtttactc tggctgggca 4500

ttgttattgg aactttcata ccaaatgtat tacctaagaa ttcaaggcat acaaggaatt 4560

ctagactatg tgtatatgac cttgaggagg ataccaggaa tggccataac aggcatctca 4620

tccacaatta gtcaccctcg tatactcaga agatgcatca atttggatgt catagcccca 4680

atcaattctc cacacatagc ttcactggat tacacaaaat tgagcataga tgcagtaatg 4740

tggggaacca agcaggtgtt gaccaacatt tctcaaggta tcgattatga gatagttgtt 4800

ccttctgaaa gccaacttac actcagtgat agagtcctaa atctagttgc tcgaaaacta 4860

tcactactgg caatcatctg ggccaattac aactatcctc cgaaggttaa aggtatgtca 4920

cctgaggaca aatgtcaggc tttaactata catctactcc agactgtcga atatgttgag 4980

tacattcaga gtgaaaagac aaacatcagg aggatgatta ttgaaccaaa attaactgcc 5040

taccctagta atttgtttta tctctctcga aagctgctta atgctattcg agactctgaa 5100

gaaggacaat tcctgattgc atcctattat aacagttttg gatatctgga accgatatta 5160

atggaatcta aagtattcaa tctaagttca tccgaatcag catctcttac agaattcgat 5220

ttcatcctca acttggaatt gtccgacgcc agacttgaga aatactctct cccaagtttg 5280

cttatgacgg ctgagaatat ggataaccca tttcctcaac ccccacttca tcacgttctc 5340

agaccactag gtttgtcatc cacctcatgg tataaaacaa tcagtgtttt gaattatatt 5400

agccatatga agatatctga cggtgcccat ctatacttgg cagagggaag tggagcctct 5460

atgtcactta tagagacttt cttgcccggg gaaaccatat ggtacaacag cctgttcaat 5520

agtggtgaga atccccctca acgtaatttc gcccctttgc ccacccagtt tattgaaagt 5580

gtcccctata gattgattca agcaggtata gcagcaggaa atggtatagt gcaaagtttc 5640

tatccactct ggaacggaaa cagcgatata actgacttaa gcactaaaac tagtgttgaa 5700

tacattatcc acaaggtagg agctgatact tgtgcattag ttcatgtgga tttggaaggt 5760

gtccctggct caatgaacag catgttggag agagctcaag tacacgcact actaatcaca 5820

gtcactgtac tgaaaccagg cggcttacta atcttgaaag cttcatggga accctttaat 5880

cgattttcct ttttactcac agtactctgg caattctttt ccacaataag gatcttgcga 5940

tcttcatact ccgacccgaa taatcacgag gtttacataa tagccacatt ggcagttgat 6000

cccactacat cctcctttac aactgctctg aatagggcac gcaccctgaa tgaacagggc 6060

ttttcactca tcccacctga attagtaagt gagtactgga ggaagcgtgt tgaacaagga 6120

cagattatac aggactgtat agataaagtt atatcagagt gtgtcagaga tcaatatctg 6180

gcagacaaca acattatcct ccaggcggga ggtactccaa gcacaagaaa atggttggat 6240

ctgcctgact attcttcgtt caatgaacta caatctgaaa tggccagact cataacaatt 6300

catcttaaag aggtaataga aatcctaaag ggccaagcat cagatcatga caccctatta 6360

tttacttcat acaatgtagg tcccctcgga aaaataaata caatactcag attgattgtt 6420

gagagaattc ttatgtatac tgtgaggaac tggtgtatct tgcctaccca aactcgtctc 6480

accttacgac aatctatcga gcttggagag tttagactaa gagatgtgat aacacccatg 6540

gagattctaa aactatcccc caacaggaaa tatctaaagt ctgcattaaa tcaatcgaca 6600

ttcaaccatc taatgggaga aacatctgac atattgttaa accgagctta tcagaagaga 6660

atttggaaag ccattgggtg tgtaatctat tgctttggtt tgctcacccc ggatgttgaa 6720

gattctgagc gcattgatat tgacaatgac atacccgatt atgatattca cggggacata 6780

atttga 6786

Claims

1.一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸的序列为如SEQ ID NO:5所示的新冠病毒原型株融合前S三聚体蛋白变体的密码子优化后的多核苷酸序列或为如SEQ ID NO:6所示的新冠病毒德尔塔株融合前S三聚体蛋白变体的密码子优化后的多核苷酸序列。

2.一种新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体，其编码核酸为权利要求1所述的多核苷酸。

3.一种重组腮腺炎病毒颗粒，其中，在腮腺炎病毒基因组负链RNA序列中包含与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列，所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体为权利要求2所述新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体。

4.根据权利要求3中所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述腮腺炎病毒基因组负链RNA序列来自或衍生自减毒腮腺炎病毒疫苗株的腮腺炎病毒的全长基因组负链RNA。

5.根据权利要求4所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述减毒腮腺炎病毒疫苗株选自S79株、Jeryl-Lynn株、Leningrad-Zagreb株、Urabe株和RIT 4385株中的一种。

6.根据权利要求5所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述减毒腮腺炎病毒疫苗株为S79株。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列是经过密码子优化的。

8.根据权利要求7所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列是针对哺乳动物密码子优化的。

9.根据权利要求3-6中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列的核苷酸数量是6的倍数。

10.根据权利要求3-6中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列插入到腮腺炎病毒基因组负链RNA序列中的基因之间，包括N基因与P基因之间、P基因与M基因之间、M基因与F基因之间、F基因与SH基因之间、SH基因与HN基因之间或HN基因与L基因之间。

11.根据权利要求3-6中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述与编码新冠病毒融合前S三聚体蛋白变体的正链RNA序列互补的负链RNA序列插入到腮腺炎病毒基因组负链RNA序列中的P基因与M基因之间。

12.根据权利要求3-6中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其还包含:与选自以下的一种或多种调控元件的编码序列互补的负链RNA序列：启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、polyA序列和报告基因。

13.根据权利要求12所述的重组腮腺炎病毒颗粒，其中，所述调控元件相对于腮腺炎病毒是同源或异源的。

14.一种组合物，其包含权利要求3-13中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述组合物为疫苗组合物。

16.权利要求3-13中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒或权利要求14或15所述的组合物在制备预防新冠病毒的疫苗中的用途。

17.权利要求3-13中任一项所述的重组腮腺炎病毒颗粒或权利要求14或15所述的组合物在制备预防和/或治疗受试者中新冠病毒感染引起的疾病的疫苗中的用途。

18.根据权利要求16或17所述的用途，其中，所述疫苗的接种途径为注射或气雾吸入。

19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述受试者是人。

20.根据权利要求18所述的用途，其中，所述受试者为成人或儿童。

21.一种核酸构建体，其包含权利要求1所述的多核苷酸。

22.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中，所述多核苷酸可操作地连接至编码腮腺炎病毒反基因组正链RNA的cDNA序列。

23.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中，所述多核苷酸可操作地连接至编码腮腺炎病毒反基因组正链RNA的cDNA序列的N末端。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的核酸构建体，其中，所述多核苷酸插入到编码腮腺炎病毒反基因组正链RNA的cDNA序列的P基因与M基因之间。

25.一种抗原表达质粒，其包含权利要求21-24中任一项所述的核酸构建体。

26.根据权利要求25所述的抗原表达质粒，其中，所述抗原表达质粒为真核抗原表达质粒。

27.根据权利要求25所述的抗原表达质粒，其中，所述抗原表达质粒为酵母-大肠杆菌穿梭质粒。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的抗原表达质粒，其中，所述抗原表达质粒为pYES2-rMuV-SC2-WH质粒或pYES2-rMuV-SC2-Delta质粒。

29.一种宿主细胞，其通过用权利要求21-24中任一项所述的核酸构建体或权利要求25-28中任一项所述的抗原表达质粒转染获得。

30.一种反向遗传系统，其包含权利要求25-28中任一项所述的抗原表达质粒，以及辅助质粒或辅助细胞系。

31.根据权利要求30所述的反向遗传系统，其中，所述辅助质粒包括：

1)含有编码腮腺炎病毒的核衣壳蛋白的基因的辅助质粒1；

2)含有编码腮腺炎病毒的磷蛋白的基因的辅助质粒2；和

3)含有编码腮腺炎病毒的RNA聚合酶的基因的辅助质粒3。

32.根据权利要求30或31所述的反向遗传系统，其中，所述辅助细胞系为包含编码腮腺炎病毒的核衣壳蛋白的基因、编码磷蛋白的基因和编码RNA聚合酶的基因且能够表达这三种蛋白的细胞。

33.根据权利要求30或31所述的反向遗传系统，其中，所述抗原表达质粒和辅助质粒均为包含T7启动子的质粒。

34.根据权利要求33所述的反向遗传系统，其中，所述辅助质粒1、辅助质粒2和辅助质粒3分别为pT7-S79-N质粒、pT7-S79-P质粒和pT7-S79-L质粒。

35.一种制备重组腮腺炎病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：

1)将权利要求30-34中任一项所述的反向遗传系统中的抗原表达质粒和辅助质粒共转染至第一细胞系；

或者将权利要求25-28中任一项所述的抗原表达质粒转染至辅助细胞系；

3)收集细胞上清液并纯化，从而获得重组腮腺炎病毒颗粒。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述抗原表达质粒与辅助质粒1、辅助质粒2和辅助质粒3的质量比为10:(3～4):(3～4):1。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述第一细胞系为BHK-T7细胞系，所述第二细胞系为Vero细胞系。